特許 6138815 補体経路およびＶＥＧＦ経路に対するタンパク質インヒビターおよびそれらの使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6138815

(24)【登録日】2017年5月12日

(45)【発行日】2017年5月31日

(54)【発明の名称】補体経路およびＶＥＧＦ経路に対するタンパク質インヒビターおよびそれらの使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20170522BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20170522BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20170522BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170522BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170522BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170522BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170522BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170522BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20170522BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170522BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20170522BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C07K14/705

   C07K14/47

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/02 Z

   A61K37/02

   A61K45/00

   A61P29/00

   A61P37/02

   A61P27/02

   A61P35/00

   A61P19/02

   A61P17/06

   A61P9/10

【請求項の数】29

【全頁数】80

(21)【出願番号】特願2014-544968(P2014-544968)

(86)(22)【出願日】2012年11月30日

(65)【公表番号】特表2015-500811(P2015-500811A)

(43)【公表日】2015年1月8日

(86)【国際出願番号】US2012067489

(87)【国際公開番号】WO2013082563

(87)【国際公開日】20130606

【審査請求日】2015年11月24日

(31)【優先権主張番号】61/629,932

(32)【優先日】2011年12月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517015786

【氏名又は名称】エーピー バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】514136716

【氏名又は名称】イノベント バイオロジックス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ハー， ジェン−ホーン

(72)【発明者】

【氏名】チェン， フアン−ツ

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５４０８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１１４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５２３８２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１５０９２６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５１２３２５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ末端からＣ末端の順序で、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、免疫グロブリンＦｃ領域、および補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）を含む融合タンパク質であって、該ＣＩＤが、ヒト補体調節タンパク質ＣＲ１の少なくともショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）１−３を含み、該融合タンパク質が補体活性化およびＶＥＧＦ活性を阻害する、融合タンパク質。

【請求項2】

前記ＣＩＤが、配列番号１〜４および６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜４および６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＶＩＤがヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＶＩＤがヒトＶＥＧＦＲ−１の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメイン３を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記ＶＩＤが、配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列、または配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒトＦｃである、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記Ｆｃ領域が、配列番号７もしくは３９のアミノ酸配列、または配列番号７もしくは３９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記融合タンパク質がドメイン間にペプチドリンカーをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記ペプチドリンカーが、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記融合タンパク質が、配列番号１２もしくは４０のアミノ酸配列、または配列番号１２もしくは４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

融合タンパク質であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養し、該宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収することによって産生された融合タンパク質。

【請求項12】

各融合タンパク質が請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質。

【請求項13】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。

【請求項14】

前記融合タンパク質が二量体形態である、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項16】

請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。

【請求項17】

請求項１５に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項18】

融合タンパク質の産生方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養する工程、および該宿主細胞によって産生された該融合タンパク質を回収する工程を含む、方法。

【請求項19】

前記融合タンパク質が細胞培養培地から回収され、そして精製される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記宿主細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項１８または１９に記載の方法。

【請求項21】

回収された前記融合タンパク質が二量体である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

炎症性疾患、自己免疫疾患、眼の疾患または癌を有する被験体の処置のための組成物であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含み、有効量の該組成物が該被験体に投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項23】

前記被験体が、関節リウマチ、乾癬、黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞、または角膜移植を有する、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記黄斑変性が湿性加齢性黄斑変性または乾性加齢性黄斑変性である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記被験体が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、または網膜芽細胞腫を有する、請求項２２に記載の組成物。

【請求項26】

前記組成物が、前記疾患処置のための第２の治療剤と併せて投与されることを特徴とする、請求項２２に記載の組成物。

【請求項27】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含むキット。

【請求項28】

被験体の炎症性疾患、自己免疫疾患、眼の疾患または癌の処置のための融合タンパク質の使用説明書を含む添付文書をさらに含む、請求項２７に記載のキット。

【請求項29】

薬学的に許容され得るキャリアをさらに含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の引用
本願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、２０１１年１２月１日に出願した米国仮出願第６１／６２９，９３２号に対する優先権の利益を主張する。

【0002】

発明の分野
本発明は、補体経路および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）経路の活性化を阻害する二重特異性融合タンパク質、これらの融合タンパク質を含む組成物、ならびにその産生および使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
補体系は、多数の血漿タンパク質および細胞膜タンパク質からなる先天性免疫系の機能的エフェクターである。補体の活性化により、一連のプロテアーゼ活性化カスケードがサイトカインの放出および活性化カスケードの増幅を誘発する。補体活性化の最終的な結果は、細胞殺傷性の膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の活性化、アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａに原因する炎症、および病原体のオプソニン化である。ＭＡＣは、侵入病原体および損傷細胞、壊死細胞、ならびにアポトーシス細胞の排除に不可欠である。

【0004】

病原体に対する防御と過剰な炎症の回避との間の微妙なバランスは、補体系によって達成されなければならない（Ｒｉｃｋｌｉｎ，Ｄ．ら、（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（１１）：１２６５−１２７５（非特許文献１））。多数の炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、および感染症は、過剰な補体活性に関連することが示されている。例えば、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害に起因する病理発生は、補体活性化が多数の疾患（急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、卒中、出血性ショックおよび敗血症性ショック、ならびに冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術の合併症が含まれる）における炎症誘発性損傷を誘導することが示されている（Ｍａｒｋｉｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｍ．ら、（２００７）．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７１：７１５−７２７（非特許文献２））。さらに、補体活性化は、多数の自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス（Ｍａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｐ．ら、（２００４）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４３１−４５６（非特許文献３））、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、および喘息（Ｇｕｏ，Ｒ．Ｆ．ら、（２００５）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：８２１−８５２（非特許文献４））が含まれる）の主因である。補体活性化はまた、アルツハイマー病（Ｂｏｎｉｆａｔｉ，Ｄ．Ｍ．ら、（２００７）．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：９９９−１０１０（非特許文献５））および他の神経変性疾患（ハンチントン病、パーキンソン病、および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（Ｇｅｈｒｓ，Ｋ．Ｍ．，（２０１０）．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１２８（３）：２４９−２５８）（非特許文献６）など）の病理学に相関している。

【0005】

補体系を、３つの異なる経路：古典的経路、第二経路、およびレクチン経路によって活性化することができる。３つ全ての経路は、それぞれ補体成分Ｃ３およびＣ５を切断するＣ３−コンバターゼおよびＣ５−コンバターゼの重要なプロテアーゼ複合体を経る。古典的経路は、抗体ＩｇＭまたはＩｇＧへのＣ１ｑの結合を開始し、それによってＣ１複合体の活性化が起こり、補体成分Ｃ２およびＣ４を切断してＣ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ４ａ、およびＣ４ｂを産生する。次いで、Ｃ４ｂおよびＣ２ｂは古典的経路Ｃ３−コンバターゼを形成し、これがＣ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの切断を促進する。次いで、Ｃ３ｂはＣ４ｂＣ２ｂ（Ｃ３−コンバターゼ）への結合によってＣ５−コンバターゼを形成する。レクチン経路は、Ｃ３−コンバターゼの古典的経路下流と同一であり、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）の病原体表面上のマンノース残基への結合によって活性化される。次いで、ＭＢＬ結合セリンプロテアーゼＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２はＣ４およびＣ２を切断して古典的経路と同一のＣ３−コンバターゼを形成し得る。抗原を必要とする特異的免疫応答である古典的経路およびレクチン経路と異なり、第二経路は低レベルで継続して活性な非特異的免疫応答である。自発的に、Ｃ３の加水分解によってＣ３ａおよびＣ３ｂが誘導される。Ｃ３ｂはＢ因子に結合し、次いで、Ｂ因子をＢａおよびＢｂに切断してＤ因子を促進することができる。Ｐ因子（プロパージン）の結合によって安定化することができるＣ３ｂＢｂ複合体は、Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに切断する第二経路のＣ３−コンバターゼである。Ｃ３ｂは、Ｃ３ｂＢｂ複合体に結合して第二経路のＣ５−コンバターゼであるＣ３ｂＢｂＣ３ｂ複合体を形成することができる。３つ全ての経路由来のＣ５−コンバターゼは、Ｃ５をＣ５ａおよびＣ５ｂに切断することができる。次いで、Ｃ５ｂが動員されてＣ６、Ｃ７、Ｃ７、Ｃ８および、複数のＣ９分子とＭＡＣをアセンブリする。これにより、膜内に穴または孔を開けられ、病原体または細胞を死滅させるか、ダメージを与えることができる。補体系は、以下の２つの機構によって強く制御される：崩壊促進作用（ＤＡＡ）および補因子作用（ＣＡ）。ＤＡＡは、Ｃ３−コンバターゼまたはＣ５−コンバターゼの解離を促進する能力をいう。ＣＡは、Ｉ因子がＣ３ｂまたはＣ４ｂの不活性フラグメントの切断を促進する能力をいう。補体系の概説については、Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．ら、（２０１０），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，９（１）：４３−５６（非特許文献７）を参照のこと。

【0006】

ヒト補体受容体１型（ＣＲ１）は、古典的および第二経路のＣ３−コンバターゼおよびＣ５−コンバターゼの両方のためのＤＡＡならびにＣ３ｂおよびＣ４ｂのためのＣＡを有する唯一の補体調節因子であり、したがって、治療的適応において興味が持たれている（Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．ら、（２００１），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１８０：１１２−１２２（非特許文献８））。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを欠く天然に存在する可溶性ヒトＣＲ１（ｓＣＲ１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび動物研究における種々のｉｎ ｖｉｖｏで補体系を阻害することが示されている（Ｍｏｌｌｎｅｓ，Ｔ．Ｅ．ら、（２００６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４３：１０７−１２１（非特許文献９））。ｓＣＲ１はまた、心筋梗塞（Ｐｅｒｒｙ，Ｇ．Ｊ．ら、（１９９８），Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３１：４１ １Ａ（非特許文献１０））、成人呼吸急迫症候群（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｌ．ら、（２０００），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．，２８（９）：３１４９−３１５４（非特許文献１１））、および肺移植（Ｚａｍｏｒａ，Ｍ．Ｒ．ら、（１９９９），Ｃｈｅｓｔ，１１６：４６ｓ（非特許文献１２））における組織損傷を軽減するためのヒト臨床試験で試験されている。ｉｎ ｖｉｖｏでの補体作用の阻害の観点から安全、非免疫原性、および有効であることが見出されている。しかし、その分子構造によってｓＣＲ１から治療剤を生成することが困難である。欠失変異誘発は、最初の３つのＳＣＲ（ＳＣＲ１−３）がＣ３−コンバターゼのためのＤＡＡを伝達するのに十分であったが、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂのためのＣＡはそうではなかったと同定されている（Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，（１９９９），Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７４（４４）：３１１６０−３１１６８（非特許文献１３））。ＣＲ１と同様に、補体調節タンパク質ＤＡＦ、ＭＣＰ、Ｈ因子、およびＣ４ＢＰは、Ｃ３ｂまたはＣ４ｂの結合部位および補体インヒビターの活性部位がマッピングされている多数のＳＣＲを含む（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，（１９９８），Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５０（１）：５９−８７（非特許文献１４））。ＭＣＰ、ＤＡＦ、およびプロテクチンの可溶性形態が産生されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび種々の動物モデルで補体を阻害するのに有用であることが示されている（Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．ら、（２０１０），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，９（１）：４３−５６（非特許文献７））。しかし、これらは比較的効力が低く、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が短い。

【0007】

血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、強く制御された既存の血管網からの血管新生過程である血管形成を促進するもっとも重要なタンパク質のうちの１つである（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，（２００４），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２５（４）：５８１−６１１（非特許文献１５））。血管形成は発生過程および正常な生理学的過程（創傷治癒など）の間で必要であり、多数の疾病病因（ＡＭＤ、ＲＡ、糖尿病性網膜症、腫瘍の成長および転移が含まれる）にも関与する。血管形成の阻害は、治療的適用において有効であることが示されている。

【0008】

ＶＥＧＦ経路および補体経路は共に類似の病因を有する疾患の形成に寄与する。したがって、ＶＥＧＦ経路および補体経路の両方を標的とする治療剤の開発が必要である。補体経路およびＶＥＧＦ経路の両方の活性化を阻害する融合タンパク質を本明細書中に提供する。本発明の融合タンパク質を、補体およびＶＥＧＦに関連する疾患の処置で用いる治療剤として使用することができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｒｉｃｋｌｉｎ，Ｄ．ら、（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（１１）：１２６５−１２７５

【非特許文献2】Ｍａｒｋｉｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ｍ．ら、（２００７）．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７１：７１５−７２７

【非特許文献3】Ｍａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｐ．ら、（２００４）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４３１−４５６

【非特許文献4】Ｇｕｏ，Ｒ．Ｆ．ら、（２００５）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：８２１−８５２

【非特許文献5】Ｂｏｎｉｆａｔｉ，Ｄ．Ｍ．ら、（２００７）．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：９９９−１０１０

【非特許文献6】Ｇｅｈｒｓ，Ｋ．Ｍ．，（２０１０）．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１２８（３）：２４９−２５８）

【非特許文献7】Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．ら、（２０１０），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，９（１）：４３−５６

【非特許文献8】Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．ら、（２００１），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１８０：１１２−１２２

【非特許文献9】Ｍｏｌｌｎｅｓ，Ｔ．Ｅ．ら、（２００６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４３：１０７−１２１

【非特許文献10】Ｐｅｒｒｙ，Ｇ．Ｊ．ら、（１９９８），Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３１：４１ １Ａ

【非特許文献11】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｌ．ら、（２０００），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．，２８（９）：３１４９−３１５４

【非特許文献12】Ｚａｍｏｒａ，Ｍ．Ｒ．ら、（１９９９），Ｃｈｅｓｔ，１１６：４６ｓ

【非特許文献13】Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，（１９９９），Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７４（４４）：３１１６０−３１１６８

【非特許文献14】Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，（１９９８），Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５０（１）：５９−８７

【非特許文献15】Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，（２００４），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２５（４）：５８１−６１１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明の概要
本明細書中に提供した発明は、とりわけ、補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含む融合タンパク質、融合タンパク質を含む組成物、融合タンパク質の作製方法、および補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）のためのこれらの融合タンパク質の使用方法を開示する。

【0011】

したがって、１つの態様では、本発明は、補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含む融合タンパク質であって、融合タンパク質が補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）、融合タンパク質を提供する。１つの実施形態では、ＣＩＤは、ＣＲ１、Ｈ因子、Ｃ４−ＢＰ、ＤＡＦ、およびＭＣＰからなる群から選択されるヒト補体調節タンパク質の少なくとも１つのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を含む。さらなる実施形態では、ＣＩＤは、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中の任意の実施形態では、ＶＩＤはヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部を含む。１つの実施形態では、ＶＩＤは、ヒトＶＥＧＦＲ−１の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメイン３を含む。さらなる実施形態では、ＶＩＤは、配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列、または配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中の任意の実施形態では、半減期延長ドメインは免疫グロブリンＦｃ領域を含む。１つの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒトＦｃである。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中の任意の実施形態では、融合タンパク質は、ドメイン間にペプチドリンカーをさらに含む。１つの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中の任意の実施形態では、融合タンパク質は、（１）ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ；（２）ＣＩＤ、Ｆｃ、ＶＩＤ；（３）ＣＩＤ、ＶＩＤ、Ｆｃ；（４）ＶＩＤ、ＣＩＤ、Ｆｃ；（５）Ｆｃ、ＶＩＤ、ＣＩＤ；および（６）Ｆｃ、ＣＩＤ、ＶＩＤからなる群から選択されるＮ末端からＣ末端への順序でＶＩＤ、ＣＩＤ、およびＦｃを含む。

【0012】

別の態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端への順序で、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、免疫グロブリンＦｃ領域、および補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）を含む融合タンパク質であって、融合タンパク質が補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）、融合タンパク質を提供する。１つの実施形態では、ＣＩＤは、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中の任意の実施形態では、ＶＩＤはヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部を含む。１つの実施形態では、ＶＩＤは、ヒトＶＥＧＦＲ−１の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメイン３を含む。さらなる実施形態では、ＶＩＤは、配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列、または配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中の任意の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒトＦｃである。１つの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中の任意の実施形態では、融合タンパク質は、ドメイン間にペプチドリンカーをさらに含む。１つの実施形態では、ペプチドリンカーはＦｃ領域とＣＩＤとの間に存在する。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0013】

別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、融合タンパク質を産生する条件下で培養し、宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収することによって産生された融合タンパク質を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に配列番号９、１０、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、宿主細胞によって産生された回収融合タンパク質は、Ｎ末端で部分的に切断されたシグナルペプチドを含むことができる。１つの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。

【0014】

別の態様では、本発明は、各融合タンパク質が本明細書中に開示の任意の融合タンパク質を含む、２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質（例えば、二量体Ｆｃ融合タンパク質）を提供する。１つの実施形態では、二量体融合タンパク質は２つの同一の融合タンパク質を含む。別の実施形態では、二量体融合タンパク質は２つの異なる融合タンパク質を含む。別の実施形態では、二量体融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの融合タンパク質を含む。

【0015】

１つの態様では、本発明はまた、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、融合タンパク質は二量体形である。さらなる実施形態では、二量体融合タンパク質は２つの同一の融合タンパク質を含む。別のさらなる実施形態では、二量体融合タンパク質は２つの異なる融合タンパク質を含む。別のさらなる実施形態では、二量体融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの融合タンパク質を含む。

【0016】

別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。１つの実施形態では、核酸は補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含む融合タンパク質をコードし、ここで、融合タンパク質は補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）。１つの実施形態では、核酸は、ＣＲ１、Ｈ因子、Ｃ４−ＢＰ、ＤＡＦ、およびＭＣＰからなる群から選択されるヒト補体調節タンパク質の少なくとも１つのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を含むＣＩＤをコードする。さらなる実施形態では、核酸は、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＩＤをコードする。本明細書中の任意の実施形態では、核酸は、ヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部を含むＶＩＤをコードする。１つの実施形態では、核酸は、ヒトＶＥＧＦＲ−１の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメイン３を含むＶＩＤをコードする。さらなる実施形態では、核酸は、配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列、または配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＩＤをコードする。本明細書中の任意の実施形態では、核酸は、免疫グロブリンＦｃ領域を含む半減期延長ドメインをコードする。１つの実施形態では、核酸は、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｃ領域をコードする。本明細書中の任意の実施形態では、核酸は、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドリンカーをさらにコードする。本明細書中の任意の実施形態では、核酸は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。

【0017】

別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含み、ここで、融合タンパク質は補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）。本明細書中の任意の実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載の融合タンパク質をコードする本明細書中に開示の任意の核酸を含む。１つの実施形態では、ベクターは、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸を含む。任意の態様では、本発明は、本明細書中に記載の融合タンパク質をコードする本明細書中に開示の任意の核酸を含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸を含む。

【0018】

さらに別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、融合タンパク質を産生する条件下で培養する工程、および宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収する工程を含む、融合タンパク質の産生方法を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質を細胞培養培地から回収し、精製する。さらなる実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞または酵母細胞である。本明細書中の任意の実施形態では、回収された融合タンパク質は二量体である。本明細書中の任意の実施形態では、回収された融合タンパク質は、本明細書中に記載の部分的に切断された融合タンパク質である。

【0019】

別の態様では、本発明は、有効量の本明細書中に開示の任意の融合タンパク質を被験体に投与する工程を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患、眼の疾患または癌を有する被験体の処置方法を提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含み、ここで、融合タンパク質は、補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、被験体は、関節リウマチ、乾癬、黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞、または角膜移植を有する。さらなる実施形態では、黄斑変性は、湿性加齢性黄斑変性または乾性加齢性黄斑変性である。１つの実施形態では、被験体は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、または網膜芽細胞腫を有する。別の実施形態では、本方法は、疾患処置のための第２の治療剤を投与する工程をさらに含む。

【0020】

さらなる態様では、本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質を含むキットを提供する。１つの実施形態では、融合タンパク質は、補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含み、ここで、融合タンパク質は補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）。１つの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、キットは、被験体の炎症性疾患、自己免疫疾患、眼の疾患または癌の処置のための融合タンパク質の使用説明書を含む添付文書をさらに含む。

【0021】

本明細書中に記載の種々の実施形態の特徴の１つ、いくつか、または全てを組み合わせて本発明の他の実施形態を形成することができると理解すべきである。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者に明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1A】図１は、融合タンパク質の概略図を提供する。Ａ）抗補体タンパク質（ＡＣＰ）、ＡＣＰ−１〜ＡＣＰ−１０。ＣＩＤ−ＷＴはヒト野生型ＣＲ１ ＳＣＲ１−３であり、ＣＩＤ−ＫＮはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｎ２９Ｋ／Ｄ１０９Ｎであり、ＣＩＤ−ＹＤはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｓ３７Ｙ／Ｇ７９Ｄであり、ＣＩＤ−ＫＹＤＮはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｎ２９Ｋ／Ｓ３７Ｙ／Ｇ７９Ｄ／Ｄ１０９Ｎであり、ＣＩＤ−ＮＴはヒト野生型ＣＲ１ ＳＣＲ８−１０であり、ＦｃはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。Ｂ）二重特異性抗補体／ＶＥＧＦタンパク質（ＡＣＶＰ）、ＡＣＶＰ−１〜ＡＣＶＰ−６。ＣＩＤはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｎ２９Ｋ／Ｓ３７Ｙ／Ｇ７９Ｄ／Ｄ１０９Ｎであり、ＶＩＤはＶＥＧＦＲ１の第２のＩｇ様ドメインとＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇ様ドメインとの融合物であり、ＦｃはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。

【図1B】図１は、融合タンパク質の概略図を提供する。Ａ）抗補体タンパク質（ＡＣＰ）、ＡＣＰ−１〜ＡＣＰ−１０。ＣＩＤ−ＷＴはヒト野生型ＣＲ１ ＳＣＲ１−３であり、ＣＩＤ−ＫＮはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｎ２９Ｋ／Ｄ１０９Ｎであり、ＣＩＤ−ＹＤはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｓ３７Ｙ／Ｇ７９Ｄであり、ＣＩＤ−ＫＹＤＮはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｎ２９Ｋ／Ｓ３７Ｙ／Ｇ７９Ｄ／Ｄ１０９Ｎであり、ＣＩＤ−ＮＴはヒト野生型ＣＲ１ ＳＣＲ８−１０であり、ＦｃはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。Ｂ）二重特異性抗補体／ＶＥＧＦタンパク質（ＡＣＶＰ）、ＡＣＶＰ−１〜ＡＣＶＰ−６。ＣＩＤはヒトバリアントＣＲ１ ＳＣＲ１−３＿Ｎ２９Ｋ／Ｓ３７Ｙ／Ｇ７９Ｄ／Ｄ１０９Ｎであり、ＶＩＤはＶＥＧＦＲ１の第２のＩｇ様ドメインとＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇ様ドメインとの融合物であり、ＦｃはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。

【図2A】図２は、精製融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ａ）精製した融合タンパク質ＡＣＰ−１０（レーン１）、ＡＣＰ−９（レーン２）、ＡＣＰ−８（レーン３）、ＡＣＰ−７（レーン４）、およびＡＣＰ−６（レーン５）。Ｂ）非還元条件下（レーン１）および還元条件下（レーン３）の精製融合タンパク質ＡＣＶＰ−１；ならびに非還元条件下（レーン２）および還元条件下（レーン４）の精製融合タンパク質ＡＣＰ−９。

【図2B】図２は、精製融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ａ）精製した融合タンパク質ＡＣＰ−１０（レーン１）、ＡＣＰ−９（レーン２）、ＡＣＰ−８（レーン３）、ＡＣＰ−７（レーン４）、およびＡＣＰ−６（レーン５）。Ｂ）非還元条件下（レーン１）および還元条件下（レーン３）の精製融合タンパク質ＡＣＶＰ−１；ならびに非還元条件下（レーン２）および還元条件下（レーン４）の精製融合タンパク質ＡＣＰ−９。

【図3A】図３は、融合タンパク質ＡＣＰによる補体経路の阻害を証明する一連のグラフである。Ａ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＰ−６、ＡＣＰ−７、ＡＣＰ−９、およびＡＣＰ−１０による抗体感作したヒツジ赤血球における古典的補体経路の阻害。Ｂ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＰ−６、ＡＣＰ−７、ＡＣＰ−９、およびＡＣＰ−１０によるウサギ赤血球における第二補体経路の阻害。Ｆｃ融合物Ｌｏｇ［ｎＭ］は、表示の融合タンパク質（ｎＭ）のｌｏｇ濃度である。

【図3B】図３は、融合タンパク質ＡＣＰによる補体経路の阻害を証明する一連のグラフである。Ａ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＰ−６、ＡＣＰ−７、ＡＣＰ−９、およびＡＣＰ−１０による抗体感作したヒツジ赤血球における古典的補体経路の阻害。Ｂ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＰ−６、ＡＣＰ−７、ＡＣＰ−９、およびＡＣＰ−１０によるウサギ赤血球における第二補体経路の阻害。Ｆｃ融合物Ｌｏｇ［ｎＭ］は、表示の融合タンパク質（ｎＭ）のｌｏｇ濃度である。

【図4A】図４は、ＥＬＩＳＡによって検出した場合の融合タンパク質によるＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を証明する一連のグラフである。Ａ）ＡＣＶＰ−１による動員されたＶＥＧＦの直接ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。Ｂ）ＡＣＶＰ−１による可溶性ＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。Ｃ）ＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはアバスチンによるＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。

【図4B】図４は、ＥＬＩＳＡによって検出した場合の融合タンパク質によるＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を証明する一連のグラフである。Ａ）ＡＣＶＰ−１による動員されたＶＥＧＦの直接ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。Ｂ）ＡＣＶＰ−１による可溶性ＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。Ｃ）ＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはアバスチンによるＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。

【図4C】図４は、ＥＬＩＳＡによって検出した場合の融合タンパク質によるＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を証明する一連のグラフである。Ａ）ＡＣＶＰ−１による動員されたＶＥＧＦの直接ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。Ｂ）ＡＣＶＰ−１による可溶性ＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。Ｃ）ＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはアバスチンによるＶＥＧＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合。

【図5A】図５は、融合タンパク質ＡＣＶＰによる補体経路の阻害を証明する一連のグラフである。Ａ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＶＰ−１による補体感作したヒツジ赤血球における古典的補体経路の阻害。Ｂ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＶＰ−１によるウサギ赤血球における第二補体経路の阻害。Ｆｃ融合物Ｌｏｇ［ｎＭ］は、表示の融合タンパク質（ｎＭ）のｌｏｇ濃度である。

【図5B】図５は、融合タンパク質ＡＣＶＰによる補体経路の阻害を証明する一連のグラフである。Ａ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＶＰ−１による補体感作したヒツジ赤血球における古典的補体経路の阻害。Ｂ）種々の濃度の融合タンパク質ＡＣＶＰ−１によるウサギ赤血球における第二補体経路の阻害。Ｆｃ融合物Ｌｏｇ［ｎＭ］は、表示の融合タンパク質（ｎＭ）のｌｏｇ濃度である。

【図6】図６は、ＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはＣＩＤ融合タンパク質によるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ誘導増殖の阻害を証明するグラフである。全アッセイを三連で行った。^＊＊ＤＭＥＭ＋ＶＥＧＦコントロールと比較してｐ＜０．０１。

【図7】図７は、融合タンパク質ＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはＣＩＤによるＶＥＧＦＲ２経路活性化の阻害を証明するウェスタンブロットである。

【図8】図８は、レーザー誘導ＣＮＶサルモデル由来の眼の一連の写真である。５３２ｎｍダイオードレーザー光凝固を黄斑周囲に送達させた２１日後、サルの硝子体内にＡ）ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）；Ｂ）ＡＣＶＰ−１；Ｃ）ＶＩＤ；またはＤ）ＣＩＤを表示濃度で注射し、投与１４日後に処置眼の写真を撮影して斑の漏出を測定した。

【発明を実施するための形態】

【0023】

詳細な説明
本発明は、とりわけ、補体経路および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）経路を阻害する融合タンパク質およびその組み合わせを提供する。本明細書中に記載の本発明の融合タンパク質は、補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含み、ここで、融合タンパク質は補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）。融合タンパク質の産生方法ならびに自己免疫疾患、補体関連疾患、炎症性疾患、眼疾患、および／または癌の処置における融合タンパク質の使用方法も本明細書中に提供する。

【0024】

Ｉ．一般的な技術
本明細書中に記載されているか本明細書中で引用されている技術および手順は、当業者によって従来の方法論を使用して一般に十分に理解されており、一般的に使用されている（例えば、以下に記載の広範に利用されている方法論など：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995);およびCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)。

【0025】

ＩＩ．定義
「単離された」分子（例えば、核酸またはタンパク質）または細胞は、同定されており、且つその自然環境の成分から分離および／または回収されているものである。

【0026】

本明細書中で使用する場合、「実質的に純粋」は、少なくとも純度５０％（すなわち、夾雑物を含まない）、より好ましくは少なくとも純度９０％、より好ましくは少なくとも純度９５％、より好ましくは少なくとも純度９８％、より好ましくは少なくとも純度９９％である材料をいう。

【0027】

「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」（本明細書中で互換的に使用される）は、２つ以上の共有結合部分を有し、各共有結合部分が異なるタンパク質に由来するポリペプチドをいう。２つ以上の部分を、単一のペプチド結合によって直接連結するか、１つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結することができる。一般に、２つの部分およびリンカーは、相互に読み枠中に存在し、組換え技術を使用して産生されるであろう。

【0028】

基準ポリペプチドまたは核酸配列に関する「アミノ酸またはヌクレオチド配列同一率（％）」は、配列のアラインメントおよび必要に応じて配列同一率を最大にするためのギャップの導入後に配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに基準ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一の候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの百分率と定義する。アミノ酸または核酸配列の同一率決定のためのアラインメントを、当業者の技術の範囲内の種々の方法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど）またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００９）に記載の方法を使用して行うことができる。当業者は、配列アラインメントのための適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムが含まれる）を決定することができる。例えば、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）プログラムは、異なる方法（例えば、ｃｌｕｓｔａｌ法）にしたがって２以上の配列間のアラインメントを作製することができる。例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｒｐ．（１９８８）．Ｇｅｎｅ．７３：２３７−２４４を参照のこと。ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズムは、全対間の距離の試験によって配列をクラスターにグループ分けする。クラスターを対でアラインメントし、次いで、グループでアラインメントする。２つのアミノ酸配列（例えば、配列Ａおよび配列Ｂ）の間の配列類似性を、（配列Ａの長さ−配列Ａ中のギャップ残基数−配列Ｂ中のギャップ残基数）÷配列Ａと配列Ｂとの間の残基マッチ数の和×１００によって計算する。２アミノ酸配列間で低いか類似性のないギャップを類似率の決定に含めない。核酸配列間の同一率を、当該分野で公知の他の方法（例えば、Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法）によって計数または計算することもできる。例えば、Ｈｅｉｎ，Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６−６４５を参照のこと。

【0029】

用語「ベクター」は、本明細書中で使用する場合、連結される別の核酸を増殖することができる核酸分子をいう。本用語には、自己複製核酸構造としてのベクターおよび導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。一定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。かかるベクターを本明細書中で「発現ベクター」という。

【0030】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞（かかる細胞の子孫が含まれる）をいう。宿主細胞には「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞および継代数と無関係のこれらに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてよいが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同一の機能または生物学的活性を有する変異子孫が本明細書中に含まれる。

【0031】

本明細書中で使用する場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、有益または所望の結果（好ましくは臨床結果が含まれる）を得るためのアプローチである。本発明のために、有益または所望の結果には、１つ以上の以下が含まれるが、これらに限定されない：疾患に起因する症状の軽減、患者の生活の質の向上、疾患の処置に必要な他の薬物の用量の軽減、疾患の進行の遅延、および／または個体の寿命の延長。

【0032】

本明細書中で使用する場合、「疾患の発症の遅延」は、疾患（癌など）の発症の延期、妨害、減速、遅滞、安定化、および／または延長を意味する。この遅延は、病歴および／または治療を受ける個体に応じて、種々の時間の遅延であり得る。当業者に明白であるように、十分または有意な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で、防止を含むことができる。

【0033】

「個体」または「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類（サルなど））、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、個体または被験体はヒトである。

【0034】

用語「薬学的処方物」は、処方物中に含まれる有効成分の生物学的活性を有効にし、処方物を投与される被験体が容認できない毒性を有するさらなる成分を含まない形態などの調製物をいう。

【0035】

「薬学的に許容され得るキャリア」は、有効成分以外の被験体に無毒な薬学的処方物中の成分をいう。薬学的に許容され得るキャリアには、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0036】

薬剤（例えば、薬学的処方物）の「有効量または有効投薬量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な投薬量および時間で有効な量をいう。有効投薬量を、１回以上の投与で投与することができる。本発明のために、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効投薬量は、直接または間接的な予防的処置または治療上の処置を達成するのに十分な量である。臨床的文脈で理解されるように、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効投薬量を、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と併せて達成してもしなくてもよい。したがって、「有効量または有効投薬量」を、１つ以上の治療剤を投与する状況で考慮することができ、単一の薬剤を、１つ以上の他の薬剤と併せて所望の結果を達成することができるか、達成する場合に有効量で投与されると見なすことができる。

【0037】

本明細書中で使用する場合、「〜と併せて」は、別の治療法に加えた１つの治療法の実施をいう。そのようなものとして、「〜と併せて」は、個体への他の治療法の実施前、実施中、または実施後の１つの治療法の実施をいう。

【0038】

用語「添付文書」を、治療薬の商業上の包装に慣習的に含まれるかかる治療薬の使用に関する適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む説明書をいうために使用する。

【0039】

本明細書中および添付の特許請求の範囲内で使用する場合、文脈上他の意味が明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれる。例えば、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」という言及は、１つから多数の融合タンパク質または融合ポリペプチド（モル量など）をいい、当業者に公知のその等価物などが含まれる。

【0040】

本明細書中の値またはパラメーターに対する「約」という言及には、その値またはパラメーター自体を指す実施形態が含まれる（そして、記載される）。例えば、「約Ｘ」に関する記載には、「Ｘ」の記載が含まれる。

【0041】

本明細書中に記載の発明の実施形態、態様、および変形形態には、実施形態、態様、および変形形態「からなる」および／または「から本質的になる」が含まれると理解される。

【0042】

ＩＩＩ．融合タンパク質
本発明は、補体経路およびＶＥＧＦ経路の活性化を阻害する融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質によって阻害される補体経路は、古典的補体経路、第二補体経路、および／またはレクチン経路であり得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質によって阻害されるＶＥＧＦ経路は、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３）によって媒介される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質によって阻害されるＶＥＧＦ経路は、ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰｌＧＦによって媒介される。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の融合タンパク質は、補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）。本明細書中に記載の融合タンパク質は、補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含む。

【0043】

補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）
本発明は、本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドの成分であり得る補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）を提供する。ＣＩＤは、補体活性化調節因子（ＲＣＡ）および補体制御タンパク質（ＣＣＰ）のメンバーが含まれる補体経路に関与する補体制御タンパク質のポリペプチドフラグメントを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、補体調節化タンパク質（補体受容体１（ＣＲ１）、Ｈ因子、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、およびＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）が含まれるが、これらに限定されない）のフラグメントを含む。本明細書中の任意の実施形態では、補体調節タンパク質は、哺乳動物（ヒト、ヒヒ、チンパンジー、マウス、またはラットなど）に由来する。いくつかの実施形態では、補体調節タンパク質はヒトタンパク質である。補体調節化タンパク質は、補体経路の成分（Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ１ｑ、およびＭＢＰが含まれるが、これらに限定されない）に結合する。いくつかの実施形態では、補体調節化タンパク質のフラグメントは、補体成分（Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ１ｑ、およびＭＢＰなど）に結合し、補体経路（古典的経路、第二経路、および／またはレクチン経路など）の活性化を阻害する。任意の補体経路を阻害するタンパク質の試験方法は当該分野で公知であり、実施例（実施例２、３、および６など）に記載の方法が含まれる。例えば、Ｓｃｅｓｎｅｙ Ｓ．Ｍ．ら、（１９９６）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２６：１７２９−１７３５（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、ＣＲ１、Ｈ因子、ＤＡＦ、ＭＣＰ、およびＣ４ＢＰからなる群から選択されるヒト補体調節タンパク質の少なくとも１つのＳＣＲを含む。

【0044】

ＣＩＤは、補体成分に結合して補体活性化を阻害する補体調節化タンパク質の一部を含むことができる。例えば、ヒトＣＲ１（アロタイプＡ）は、３０の反復相同ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）（それぞれ、６０〜７０アミノ酸の範囲）を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインからなる巨大な糖タンパク質（約２００ｋＤ）である。最初の２８個のＳＣＲは、それぞれ７個のＳＣＲの４つの長い相同反復（ＬＨＲ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、および−Ｄ）を組織する。最初のＬＨＲ（ＬＨＲ−Ａ）の最初の３個のＳＣＲ（ＳＣＲ１−３）は、Ｃ４ｂと中程度の親和性で結合し、Ｃ３ｂと低親和性で結合する。第２のＬＨＲ（ＬＨＲ−Ｂ）の最初の３個のＳＣＲ（ＳＣＲ８−１０）および第３のＬＨＲ（ＬＨＲ−Ｃ）の最初の３個のＳＣＲ（ＳＣＲ１５−１７）はほぼ同一である。これらの両方はＣ３ｂと高親和性で結合し、Ｃ４ｂと中程度の親和性で結合する。ＬＨＲ−Ａは、古典的経路および第二経路のＣ３−コンバターゼの両方について高い崩壊促進作用（ＤＡＡ）を有するが低い補因子作用（ＣＡ）を有するのに対して、ＬＨＲ−ＢおよびＬＨＲ−ＣはＣ３−コンバターゼについて高ＣＡを有するが低ＤＡＡを有する。適切な間隔を有するＬＨＲ−ＡおよびＬＨＲ−Ｂの両方は、Ｃ５−コンバターゼについてＤＡＡが必要である。少なくとも１つの補体調節タンパク質のＳＣＲを含むＣＩＤを本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９であるが、３０個を超えない補体調節タンパク質のＳＣＲを含む。いくつかの態様では、ＣＩＤは、１〜３０、１〜２９、１〜２８、１〜２７、１〜２６、１〜２５、１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のいずれか１つの補体調節タンパク質のＳＣＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、ＣＲ１、Ｈ因子、ＤＡＦ、ＭＣＰ、およびＣ４ＢＰからなる群から選択されるが、これらに限定されない１つ以上の補体調節タンパク質のＳＣＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のＣＲ１、Ｈ因子、ＤＡＦ、ＭＣＰ、またはＣ４ＢＰのＳＣＲを含む。２つ以上の補体調節タンパク質の少なくとも１つのＳＣＲを含むＣＩＤも意図される。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、ＣＲ１、Ｈ因子、ＤＡＦ、ＭＣＰ、およびＣ４ＢＰからなる群から選択される２つ以上の補体調節タンパク質由来の少なくとも１つのＳＣＲを含む。

【0045】

本明細書中に示した任意の補体調節タンパク質の少なくとも１つのＳＣＲを含むＣＩＤを本明細書中に提供する。本明細書中に明確に記載されない限り、ＳＣＲを、補体調節タンパク質のＮ末端からＣ末端の方向で連続的にナンバリングする。例えば、ヒトＣＲ１は、１〜３０にナンバリングされた３０個のＳＣＲを含む（ヒトＣＲ１タンパク質のＮ末端のＳＣＲ１およびヒトＣＲ１タンパク質Ｃ末端のＳＣＲ３０）。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、ＣＲ１のＳＣＲ１−１０を含む（配列番号６のアミノ酸配列など）。他の実施形態では、ＣＩＤはＣＲ１のＳＣＲ１−３を含む（配列番号１のアミノ酸配列など）。さらに他の実施形態では、ＣＩＤはＣＲ１のＳＣＲ８−１０を含む（配列番号５のアミノ酸配列など）。いくつかの実施形態では、ＣＩＤはＤＡＦのＳＣＲ２−４を含む（配列番号１３のアミノ酸配列など）。他の実施形態では、ＣＩＤはＭＣＰのＳＣＲ２−４を含む（配列番号１４のアミノ酸配列など）。さらに他の実施形態では、ＣＩＤはＨ因子のＳＣＲ１−４を含む。いくつかの態様では、ＣＩＤはＨ因子のＳＣＲ１−４を含む（配列番号１５のアミノ酸配列など）。さらに他の実施形態では、ＣＩＤはＣ４ＢＰＡのＳＣＲ１−３を含む（配列番号１６のアミノ酸配列など）。本明細書中の任意の態様では、ＣＩＤは、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。Ｈ因子ＳＣＲ１−４は、第二経路と特異的にターゲティングするが、古典的経路はそうではないＣＩＤである。古典的補体経路が抗体依存性の病原体クリアランスに必要であるので、第二経路のみを阻害するＨ因子ＳＣＲ１−４を含むＣＩＤを含む融合タンパク質の治療的適用は、重篤な感染の潜在的な副作用を制限するための好ましい融合タンパク質であり得る。

【0046】

本発明に記載のＣＩＤは、Ｂ因子、またはＤ因子、またはＰ因子、またはＣ３、またはＣ５に対する任意のペプチドインヒビターまたはオリゴヌクレオチドインヒビターであり得る。ＣＩＤはまた、Ｂ因子、またはＤ因子、またはＰ因子、またはＣ３、またはＣ５に対する抗体由来の抗体の全長またはフラグメント、または抗体可変領域（ＶＨまたはＶＫ）、またはｓｃＦｖ抗体であり得る。

【0047】

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供したＣＩＤのアミノ酸配列バリアントを意図する。例えば、ＣＩＤの結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいかもしれない。ＣＩＤのアミノ酸配列バリアントを、ＣＩＤをコードするヌクレオチド配列への適切な修飾の導入またはペプチド合成によって調製することができる。かかる修飾には、例えば、ＣＩＤのアミノ酸配列の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴（例えば、補体成分への結合および補体経路活性化の阻害）を保有することを条件として、欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて最終構築物まで到達することができる。本明細書中に開示の任意の融合タンパク質の成分であるＣＩＤのバリアントを本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0048】

いくつかの態様では、ＣＩＤバリアントは、Ｎ２９、Ｓ３７、Ｇ７９、およびＤ１０９からなる群から選択されるアミノ酸残基に１つ以上の置換を含み、ここで、アミノ酸残基の位置は配列番号１に対応する。特定の実施形態では、ＣＩＤバリアントは、アミノ酸残基Ｎ２９およびＤ１０９に置換を含み、ここで、アミノ酸残基の位置は配列番号１に対応する。別の特定の実施形態では、ＣＩＤバリアントは、アミノ酸残基Ｓ３７およびＧ７９に置換を含み、ここで、アミノ酸残基の位置は配列番号１に対応する。さらに別の特定の実施形態では、ＣＩＤバリアントは、アミノ酸残基Ｎ２９、Ｓ３７、Ｇ７９、およびＤ１０９に置換を含み、ここで、アミノ酸残基の位置は配列番号１に対応する。いくつかの実施形態では、ＣＩＤバリアントは、アミノ酸残基Ｎ２９Ｋ、Ｓ３７Ｙ、Ｇ７９Ｄ、およびＤ１０９Ｎに置換を含み、ここで、アミノ酸残基の位置は配列番号１に対応する。いくつかの態様では、ＣＩＤバリアントは、表１に示すように配列番号１に対応した任意のアミノ酸の位置に置換を含む。

【表1】

【0049】

ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）
本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質の成分であり得るＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）を提供する。ヒトＶＥＧＦ遺伝子ファミリーは、以下の５つのメンバーを含む：ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、および胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＰｌＧＦの複数のイソ型を、オルタナティブＲＮＡスプライシングによって生成する（Ｓｕｌｌｉｖａｎ Ｌ．Ａ．ら、（２０１０），ＭＡｂｓ，２（２）：１６５−７５）。ＶＥＧＦファミリーの全メンバーは、細胞表面ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）への結合によって細胞応答を刺激する。例えば、ＶＥＧＦ−Ａは、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激し、細胞の生存および増殖を促進し、細胞遊走を誘導し、微小血管透過性を増大させることが示されている。ＶＥＧＦＲ受容体は、７個の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインからなる細胞外領域を有するチロシンキナーゼ受容体である。ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）はＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、およびＰＩＧＦに結合し、ＶＥＧＦのデコイ受容体またはＶＥＧＦＲ−２の調節因子として機能することができる。ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）は全てのＶＥＧＦイソ型に結合し、ＶＥＧＦ誘導血管形成シグナル伝達の主なメディエーターである。ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）はＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合するがＶＥＧＦ−Ａに結合せず、リンパ脈管新生のメディエーターとして機能する。

【0050】

本明細書中に開示の発明の任意の態様では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３が含まれるが、これらに限定されない）のポリペプチドフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３が含まれるが、これらに限定されない）の細胞外ドメインの一部を含む。本明細書中の任意の実施形態では、ＶＥＧＦＲは、哺乳動物（ヒト、ヒヒ、チンパンジー、マウス、またはラットなど）に由来する。本明細書中の任意の態様では、細胞外ドメインの一部は、免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメインである。例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−１は、細胞外ドメインのＮ末端のＩｇ様ドメイン１および細胞外ドメインのＣ末端のＩｇ様ドメイン７を有する１、２、３、４、５、６、および７とナンバリングした７個のＩｇ様ドメインを含む。本明細書中に明確に記載されない限り、Ｉｇ様ドメインを、ＶＥＧＦＲタンパク質のＮ末端からＣ末端に連続的にナンバリングする。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３からなる群から選択される１つ以上のＶＥＧＦＲの少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの態様では、ＶＩＤは、少なくとも１、２、３、４、５、６個であるが、７個を超えないＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインを含む。さらなる態様では、ＶＩＤは、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のＶＥＧＦＲのＩｇ様ドメインを含む。

【0051】

２つ以上のＶＥＧＦＲの少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含むＶＩＤを本明細書中で意図する。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３からなる群から選択される２つ以上のＶＥＧＦＲ由来の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む。いくつかの態様では、ＶＩＤは、少なくとも２つ以上のＶＥＧＦＲの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個であるが、２１個を超えないＩｇ様ドメインを含む。さらなる態様では、ＶＩＤは、少なくとも２つ以上のＶＥＧＦＲの１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のＩｇ様ドメインを含む。各ＶＥＧＦＲの７個のＩｇ様ドメインの任意の組み合わせを含むＶＩＤを本明細書中で意図する。例えば、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ−１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−１）のＩｇ様ドメイン２およびＶＥＧＦＲ−２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−２）のＩｇ様ドメイン３を含むことができる。別の例では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ−１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−１）のＩｇ様ドメイン１〜３、ＶＥＧＦＲ−１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−１）のＩｇ様ドメイン２〜３、ＶＥＧＦＲ−２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−２）のＩｇ様ドメイン１〜３、ＶＥＧＦＲ−１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−１）のＩｇ様ドメイン２、およびＶＥＧＦＲ−２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−２）の様ドメイン３〜４、またはＶＥＧＦＲ−１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−１）のＩｇ様ドメイン２およびＶＥＧＦＲ−３（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−３）のＩｇ様ドメイン３を含むことができる。ＶＩＤの一部として使用することができるこれらのＩｇ様ドメインおよび他のＩｇ様ドメインのさらに詳細な記述については、米国特許第７，５３１１７３号、Ｙｕ、Ｄ．ら、（２０１２）．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（３）：９３８−９４７、およびＨｏｌａｓｈ、Ｊ．ら、（２００２）．ＰＮＡＳ．９９（１７）：１１３９３−１１３９８（これら全文献の全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。いくつかの態様では、ＶＩＤは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＶＩＤは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰ１ＧＦからなる群から選択される血管内皮成長因子に結合する。本明細書中に提供する場合、血管内皮成長因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰ１ＧＦ）に結合するか、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３）に結合してＶＥＧＦ経路の活性化を阻害するポリペプチドまたはペプチドはＶＩＤである。例えば、ＶＩＤは、血管内皮成長因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、およびＰ１ＧＦ）に結合してＶＥＧＦＲとのその相互作用を遮断する抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ’）_２）、天然ペプチド、または合成ペプチドを含むことができる。いくつかの態様では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３）に結合してＶＥＧＦとのその相互作用を遮断する抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ’）_２）、天然ペプチド、または合成ペプチドである。いくつかの態様では、ＶＩＤはアセチル化されている。本明細書中の任意の実施形態では、ＶＩＤは、哺乳動物（ヒト、ヒヒ、チンパンジー、マウス、またはラットなど）に由来する。

【0052】

本発明のＶＩＤは、ＶＥＧＦＲの任意の細胞外ドメイン、ＶＥＧＦファミリーメンバーのドミナント（ｄｏｍｉｎａｔｅ）ネガティブ形態、ＶＥＧＦファミリーメンバーに対する抗体、ＶＥＧＦＲに対する抗体、ＶＥＧＦファミリーメンバーまたはＶＥＧＦＲに対するペプチドインヒビター、ＶＥＧＦファミリーメンバーまたはＶＥＧＦＲに対するオリゴヌクレオチドインヒビターであり得る。

【0053】

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した任意のＶＩＤのアミノ酸配列バリアントを意図する。例えば、ＶＩＤの結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいかもしれない。ＶＩＤのアミノ酸配列バリアントを、ＶＩＤをコードするヌクレオチド配列への適切な修飾の導入またはペプチド合成によって調製することができる。かかる修飾には、例えば、ＶＩＤのアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴（例えば、ＶＥＧＦへの結合およびＶＥＧＦ経路の活性化の阻害）を保有することを条件として、欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて最終構築物まで到達することができる。本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドの成分であり得るＶＩＤのバリアントを本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ−１（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−１）のＩｇ様ドメイン１、２、３、４、５、６、または７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ−２（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−２）のＩｇ様ドメイン１、２、３、４、５、６、または７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ−３のＩｇ様ドメイン１、２、３、４、５、６、または７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、配列番号１１および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0054】

半減期延長ドメイン
本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質の成分であり得る半減期延長ドメインを提供する。例えば、免疫グロブリン由来のＦｃ領域を融合ポリペプチドに組み込んでｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させることができる。半減期延長ドメインは、任意の免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、またはアロタイプ由来のＦｃ領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＩｇＥからなる群から選択される免疫グロブリンアイソタイプ由来のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは免疫グロブリンＦｃ領域を含む。いくつかの態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒトＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２のヒトＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃ領域はＩｇＤのヒトＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃ領域はＩｇＥのヒトＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃ領域はＩｇＭのヒトＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃ領域はグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書中に提供した任意の態様では、半減期延長ドメインは、抗体、アルブミン、またはプロテアーゼインヒビター（例えば、α１−抗トリプシン）からなる群から選択されるが、これらに限定されないポリペプチドまたはそのフラグメントであり得る。本明細書中に提供した任意の態様では、半減期延長ドメインは、グリシンリッチアミノ酸配列、ＰＥＳＴＡＧ配列、またはＰＡＳ配列からなる群から選択されるが、これらに限定されないアミノ酸配列であり得る。半減期延長ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの半減期を増大させることが当該分野で公知の任意のポリペプチド配列またはアミノ酸配列であり得る。Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．（Ｅｄ．）（２０１１）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅｉｒ Ｐｌａｓｍａ Ｈａｌｆ−ｌｉｖｅｓ（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本明細書中の任意の実施形態では、半減期延長ドメインは、哺乳動物（ヒト、ヒヒ、チンパンジー、マウス、またはラットなど）に由来する。

【0055】

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した半減期延長ドメインのアミノ酸配列バリアントを意図する。例えば、半減期延長ドメインの生物学的性質を改善することが望ましいかもしれない。半減期延長ドメインのアミノ酸配列バリアントを、半減期延長ドメインをコードするヌクレオチド配列への適切な修飾の導入またはペプチド合成によって調製することができる。かかる修飾には、例えば、半減期延長ドメインのアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴（例えば、融合タンパク質の半減期の延長）を保有することを条件として、欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて最終構築物まで到達することができる。本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドの成分であり得る半減期延長ドメインのバリアントを本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインバリアントはＦｃ領域バリアントである。Ｆｃ領域のバリアントは当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２４９３８５２号および米国特許出願公開第２００６／０１３４１１０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される））。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾を本明細書中に提供した融合ポリペプチドのＦｃ領域に導入し、それにより、Ｆｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域バリアントはグリコシル化されている。

【0056】

融合ペプチドリンカー
本発明は、本明細書中に開示の任意の融合タンパク質の成分であり得るリンカーを提供する。例えば、短い可動性ペプチドを融合ポリペプチドのドメイン（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、および半減期延長ドメイン）の間に使用して、各ドメインの正確な折りたたみを確実にし、立体障害を最小にすることができる。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、アラニン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸から構成されるペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカーは２〜１００個のアミノ酸を含む。他の実施形態では、リンカーは１００個以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは２０個以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１５個以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは１０個以下のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは６個以下のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９個であるが、１００個を超えないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーを、ＣＩＤと半減期延長ドメインとの間で使用する。いくつかの実施形態では、リンカーをＶＩＤと半減期延長ドメインとの間で使用する。他の実施形態では、リンカーをＶＩＤとＣＩＤとの間で使用する。さらに他の実施形態では、リンカーをＶＩＤと半減期延長ドメインとの間およびＣＩＤと半減期延長ドメインとの間の両方で使用する。他の実施形態では、リンカーを、ＶＩＤとＣＩＤとの間およびＣＩＤと半減期延長ドメインとの間の両方で使用する。いくつかの実施形態では、リンカーを、ＣＩＤとＶＩＤとの間およびＶＩＤと半減期延長ドメインとの間の両方で使用する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも１つのリンカーであるが、４個を超えないリンカーを含む。例えば、融合ポリペプチドは、ＣＩＤ、ＶＩＤ、Ｆｃ領域（Ｆｃ）、および少なくとも１つのリンカーを、以下からなる群から選択されるＮ末端からＣ末端への方向で含むことができる：（１）ＶＩＤ、Ｆｃ、リンカー、ＣＩＤ；（２）ＣＩＤ、リンカー、Ｆｃ、リンカー、ＶＩＤ；（３）ＣＩＤ、リンカー、ＶＩＤ、Ｆｃ；（４）ＶＩＤ、リンカー、ＣＩＤ、リンカー、Ｆｃ；（５）Ｆｃ、リンカー、ＶＩＤ、リンカー、ＣＩＤ；および（６）Ｆｃ、リンカー、ＣＩＤ、リンカー、ＶＩＤ。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＣＩＤ、ＶＩＤ、Ｆｃ、およびリンカーを、ＶＩＤ、Ｆｃ、リンカー、ＣＩＤのＮ末端からＣ末端への順序で含む。

【0057】

融合タンパク質
本明細書中に開示のように、融合タンパク質は、２つの異なる標的結合パートナーに対して結合特異性を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ヒトポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、補体経路の成分（例えば、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ１ｑ、またはＭＢＰ）に対する第１の結合特異性およびＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＰ１ＧＦ）に対する第２の結合特異性を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、ヒト）の補体経路の成分に対する第１の結合特異性および哺乳動物（例えば、ヒト）ＶＥＧＦに対する第２の結合特異性を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の任意の補体調節化タンパク質と同一の補体経路の成分に結合する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＣＲ１、Ｈ因子、ＤＡＦ、ＭＣＰ、またはＣ４ＢＰのいずれか１つと同一の補体経路の成分に結合する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の任意のＣＩＤの少なくとも１つのＣＩＤを含む。いくつかの態様では、融合ポリペプチドは、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＩＤを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の任意のＶＥＧＦＲと同一のＶＥＧＦ経路の成分に結合する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、またはＶＥＧＦＲ−３のいずれか１つと同一のＶＥＧＦ経路の成分に結合する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の任意のＶＩＤの少なくとも１つのＶＩＤを含む。いくつかの態様では、融合ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＩＤを含む。他の態様では、融合ポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＩＤを含む。ＣＩＤおよびＶＩＤを含む本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドは、半減期延長ドメインをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメイン（＊＊）はＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＤ、ＶＩＤ、および半減期延長ドメインを含む融合ポリペプチドは、補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）。ＣＩＤ、ＶＩＤ、および半減期延長ドメインを含む本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドは、リンカーをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、少なくとも１つの哺乳動物（例えば、ヒト）補体調節タンパク質の短いＳＣＲを含む。さらなる実施形態では、ＶＩＤは、哺乳動物（例えば、ヒト）ＶＥＧＦＲの細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、少なくとも１つのヒト補体調節タンパク質の短いＳＣＲを含むＣＩＤおよびヒトＶＥＧＦＲの細胞外ドメインの一部を含むＶＩＤを含む。１つの態様では、本発明は、以下を含む融合ポリペプチドを提供する：
ａ）以下のアミノ酸配列を含むＣＩＤ：

【化1】

;
ｂ）以下のアミノ酸配列を含むＶＩＤ：

【化2】

;および
ｃ）以下のアミノ酸配列を含む半減期延長ドメイン：

【化3】

。

【0058】

別の態様では、本発明は、以下を含む融合ポリペプチドを提供する：
ａ）以下のアミノ酸配列を含むＣＩＤ：

【化4】

;
ｂ）以下のアミノ酸配列を含むＶＩＤ：

【化5】

;および
ｃ）以下のアミノ酸配列を含む半減期延長ドメイン：

【化6】

。

【0059】

ＣＩＤ、ＶＩＤ、および半減期（ｈａｌｆ−ｌｏｎｇ）延長ドメインを任意の順序で含む融合ポリペプチドを本明細書中に提供する。例えば、融合ポリペプチドは、（１）ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ；（２）ＣＩＤ、Ｆｃ、ＶＩＤ；（３）ＣＩＤ、ＶＩＤ、Ｆｃ；（４）ＶＩＤ、ＣＩＤ、Ｆｃ；（５）Ｆｃ、ＶＩＤ、ＣＩＤ；および（６）Ｆｃ、ＣＩＤ、ＶＩＤからなる群から選択されるＮ末端からＣ末端への順序でＣＩＤ、ＶＩＤ、およびＦｃ領域（Ｆｃ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤのＮ末端からＣ末端への順序でＣＩＤ、ＶＩＤ、およびＦｃを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：

【化7】

。

【0060】

他の実施形態では、融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：

【化8】

。

【0061】

さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：

【化9】

。

【0062】

さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：

【化10】

。

【0063】

他の実施形態では、融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：

【化11】

。

【0064】

他の実施形態では、融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：

【化12】

。

【0065】

さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：

【化13】

。

【0066】

少なくとも２つ以上のＣＩＤ、２つ以上のＶＩＤ、および／または２つ以上の半減期延長ドメインを含む融合タンパク質も意図する。例えば、融合タンパク質は、２つのＣＩＤ、ＶＩＤ、およびＦｃ領域を、ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ、ＣＩＤ、またはその任意の他の組み合わせのＮ末端からＣ末端への順序で含むことができる。１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＩＤ、２つのＶＩＤ、およびＦｃ領域を、ＶＩＤ、ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ、またはその任意の他の組み合わせのＮ末端からＣ末端への順序で含むことができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＩＤ、ＶＩＤ、および２つのＦｃ領域を、ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ、Ｆｃ、またはその任意の他の組み合わせのＮ末端からＣ末端への順序で含むことができる。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも２つのＣＩＤ、少なくとも２つのＶＩＤ、および少なくとも２つのＦｃ領域を、ＶＩＤ、Ｆｃ、ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ、ＣＩＤ、またはその任意の他の組み合わせのＮ末端からＣ末端への順序で含むことができる。各組み合わせが本明細書中で明確に記述されているかのように、少なくとも１つのＶＩＤ、少なくとも１つのＣＩＤ、および少なくとも１つの半減期延長ドメイン（＊）の任意の組み合わせを本明細書中に提供する。

【0067】

本発明に記載の融合タンパク質は、ＣＩＤの化学修飾形態を含むことができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させるためにＣＩＤをＰＥＧ化するかポリマーと結合体化することができ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させるためにＣＩＤを抗体、抗体のフラグメント、Ｆｃ領域、ＨＳＡ、または他のヒトタンパク質に化学的に架橋することができ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの抗補体活性を延長するためにＣＩＤを任意の長期徐放形式で処方することができる。

【0068】

本発明に記載の融合タンパク質は、ＶＩＤの化学修飾形態を含むことができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させるためにＶＩＤをＰＥＧ化するかポリマーと結合体化することができ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させるためにＶＩＤを抗体、抗体のフラグメント、Ｆｃ領域、ＨＳＡ、または他のヒトタンパク質に化学的に架橋することができ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの抗補体活性を延長するためにＶＩＤを任意の長期徐放形式で処方することができる。

【0069】

本発明に記載の融合タンパク質は、ＣＩＤおよびＶＩＤの化学修飾形態を含むことができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させるためにＣＩＤおよびＶＩＤをＰＥＧ化するかポリマーと結合体化することができ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増大させるためにＣＩＤおよびＶＩＤを抗体、抗体のフラグメント、Ｆｃ領域、ＨＳＡ、または他のヒトタンパク質に化学的に架橋することができ、またはｉｎ ｖｉｖｏでの抗補体活性を延長するためにＣＩＤおよびＶＩＤを任意の長期徐放形式で処方することができる。

【0070】

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントを意図する。例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、および／または半減期延長ドメインの結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいかもしれない。融合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントを、ＣＩＤ、ＶＩＤ、および／または半減期延長ドメインをコードするヌクレオチド配列への適切な修飾の導入またはペプチド合成によって調製することができる。かかる修飾には、例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、および／または半減期延長ドメインのアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴（例えば、補体成分への結合、ＶＥＧＦへの結合、補体経路活性の阻害、ＶＥＧＦ経路活性の阻害、および／または半減期の延長）を保有することを条件として、欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて最終構築物まで到達することができる。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、（１）ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ；（２）ＣＩＤ、Ｆｃ、ＶＩＤ；（３）ＣＩＤ、ＶＩＤ、Ｆｃ；（４）ＶＩＤ、ＣＩＤ、Ｆｃ；（５）Ｆｃ、ＶＩＤ、ＣＩＤ；および（６）Ｆｃ、ＣＩＤ、ＶＩＤからなる群から選択されるＮ末端からＣ末端への順序で本明細書中に開示の任意のＣＩＤ、ＶＩＤ、およびＦｃを含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。

【0071】

本明細書中に開示のアミノ酸残基置換基には、保存的置換基も含まれる。保存的置換基を、「好ましい置換基」の表題で以下の表２に示す。かかる置換基によって生物学的活性が変化する場合、表２中で「例示的置換基」と命名したか、アミノ酸クラスに関して以下にさらに記載したより実質的な変化を導入し、産物をスクリーニングすることができる。表２に示したか、アミノ酸クラスに関して以下に記載のアミノ酸置換基を、本明細書中に提供した任意の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）に導入することができる。

【表2】

【0072】

タンパク質またはポリペプチドの生物学的性質の実質的な修飾を、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造（例えば、シート高次構造またはヘリックス高次構造としての構造）、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高性を維持する効果が有意に異なる置換基の選択によって行う。以下の共通側鎖の性質にしたがって、アミノ酸をグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；
（７）巨大で疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ．

【0073】

非保存的置換は、これらのクラスの１つの別のクラスへのメンバーの交換を伴う。

【0074】

好ましい変異誘発の位置である融合タンパク質の一定の残基または領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載のように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の１残基または群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸の標的結合パートナーとの相互作用に影響を及ぼすために中性または負電荷のアミノ酸（より好ましくはアラニンまたはポリアラニン）と置換する。次いで、置換に対する機能的感受性が証明されているこれらのアミノ酸の位置を、置換部位でまたは置換部位の代わりにさらなるまたは他のバリアントを導入することによって精巧にする。したがって、アミノ酸配列異形の導入部位を予め決定するが、変異の性質自体は予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異のパフォーマンスを分析するために、標的コドンまたは領域でａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発を行い、発現された融合ポリペプチドバリアントを所望の活性についてスクリーニングする。

【0075】

融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の適切な高次構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を一般にセリンと置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することもできる。逆に、システイン結合を、融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）に付加してその安定性を改善することができる。

【0076】

さらなる実施形態では、本発明のペプチドまたはポリペプチドは、１つ以上の天然に存在しないか修飾されたアミノ酸を含むことができる。「天然に存在しないアミノ酸残基」は、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基に共有結合することができる上記列挙の天然に存在するアミノ酸残基以外の残基をいう。非天然アミノ酸には、ホモ−リジン、ホモ−アルギニン、ホモ−セリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸（３−ａｍｉｎｏｉｓｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、２−アミノピメリン酸、第三級ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフサラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、シトルリン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリンが含まれるが、これらに限定されない。修飾アミノ酸には、そのＮ末端アミノ基またはその側鎖基上で可逆的または不可逆的に化学的にブロッキングされたか修飾された天然および非天然のアミノ酸（例えば、Ｎ−メチル化ＤおよびＬアミノ酸、別の官能基に対して化学修飾された側鎖官能基）が含まれる。例えば、修飾アミノ酸には、メチオニンスルホキシド；メチオニンスルホン；アスパラギン酸−（β−メチルエステル）、アスパラギン酸の修飾アミノ酸；Ｎ−エチルグリシン、グリシンの修飾アミノ酸；またはアラニンカルボキサミドおよびアラニンの修飾アミノ酸が含まれる。さらなる非天然アミノ酸および修飾アミノ酸、これらのタンパク質およびペプチドへの組み込み方法は当該分野で公知である（例えば、Ｓａｎｄｂｅｒｇら、（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：２４８１−９１；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：５４８−５５４；Ｈｏｄｇｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３３：４２２−４３０を参照のこと。

【0077】

アミノ酸配列挿入物には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ−（「Ｎ」）および／またはカルボキシ−（「Ｃ」）末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する融合ポリペプチドまたは細胞傷害性ポリペプチドに融合した融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチド分子の他の挿入バリアントには、融合ポリペプチド（例えば、半減期延長（ｐｒｏｌｏｎｉｎｇ）ドメイン）の血清半減期を増大させる酵素またはポリペプチドとの融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の融合物が含まれる。

【0078】

本発明は、本明細書中に提供した任意の融合ポリペプチドの成分であり得るシグナルペプチドを提供する。例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、および半減期延長ドメインを含む融合ポリペプチドは、異種ポリペプチド、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断を有するシグナル配列または他のポリペプチドをさらに含むことができる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、真核生物宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。未変性の哺乳動物シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、真核生物（すなわち、哺乳動物）シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ遺伝子由来のリーダー配列からなる群から選択される原核生物シグナル配列と置換する。酵母分泌のために、未変性シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ファクターリーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ−ファクターリーダーが含まれる）、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ第９０／１３６４６号に記載のシグナルと置換することができる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列と同様にウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスウイルスｇＤシグナル）も利用可能である。いくつかの実施形態では、ＶＩＤ、ＣＩＤ、および半減期延長ドメインを含む融合ポリペプチドは、配列番号９、１０、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをさらに含む。シグナルペプチドを、宿主細胞から産生されるように融合ポリペプチドから完全に切断することができるか、部分的に切断することができる。融合ポリペプチドの混合集団を宿主細胞から産生することができ、ここで、融合ポリペプチドは、完全に切断されたシグナル配列（例えば、シグナル配列なし）、部分的に切断されたシグナル配列（例えば、シグナル配列の一部）、および／または非切断シグナル配列（例えば、完全なシグナル配列）を含む。例えば、そのＮ末端に配列番号９、１０、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをさらに含む本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドを、Ｎ末端で部分的に切断することができる。１つの実施形態では、そのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含む融合ポリペプチドのＮ末端を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個のアミノ酸残基のいずれか１つまでで切断することができる。別の実施形態では、Ｎ末端にシグナルペプチドをさらに含む融合ポリペプチドをＮ末端で切断して、シグナルペプチド由来の１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基のいずれか１つを含む融合ポリペプチドを産生することができる。いくつかの実施形態では、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをさらに含む。他の実施形態では、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドは、配列番号１０または４３のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをさらに含む。

【0079】

本発明は、各融合タンパク質が本明細書中に開示の任意の融合タンパク質を含む、２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質を提供する。１つの実施形態では、二量体融合タンパク質は２つの同一の融合タンパク質を含む。別の実施形態では、二量体融合タンパク質は２つの異なる融合タンパク質を含む。別の実施形態では、二量体融合タンパク質は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つの融合タンパク質を含む。別の実施形態では、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端から除去された１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基を有し得る。１つの実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質融合二量体として前記融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞から回収される。

【0080】

ＩＶ．核酸、ベクター、および宿主細胞
核酸
本明細書中に記載の任意のＣＩＤをコードする単離核酸を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、配列番号１７〜２２および２９〜３２からなる群から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。この開示は、単離核酸分子をさらに提供し、ここで、この核酸分子は、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＩＤをコードする。本明細書中に記載の任意のＶＩＤをコードする単離核酸も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、ＶＩＤは、配列番号２７の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。単離核酸分子を本明細書中にさらに提供し、ここで、この核酸分子は、配列番号１１および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＩＤをコードする。本明細書中に記載の任意の半減期延長ドメインをコードする単離核酸も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインはＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号２３の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。単離核酸分子を本明細書中にさらに提供し、ここで、この核酸分子は、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を封組む半減期延長ドメインをコードする。本明細書中に記載の任意の融合ポリペプチドをコードする単離核酸を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２８の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。単離核酸分子を本明細書中にさらに提供し、ここで、この核酸分子は、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする。

【0081】

本明細書中に記載の任意のポリペプチド（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン、リンカー、融合ポリペプチドなど）をコードするポリヌクレオチド配列を、標準的な合成技術および／または組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列を適切なソース細胞から単離し、配列決定することができる。抗体、ペプチド、および／またはポリペプチドのソース細胞には、抗体、ペプチド、および／またはポリペプチド産生細胞（ハイブリドーマ細胞など）が含まれるであろう。あるいは、ポリヌクレオチドを、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。

【0082】

ベクター
一旦得られると、ペプチドおよび／またはポリペプチドをコードする配列を、宿主細胞中で異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクターに挿入する。当該分野で利用可能であり、且つ公知である多数のベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸のサイズおよびベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現またはその両方）およびベクターが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて種々の成分を含む。ベクター成分には、一般に、以下が含まれるが、これらに限定されない：複製起点（特に、ベクターが原核細胞に挿入される場合）、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、および転写終結配列。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＩＤアミノ酸配列をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、ベクターは、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＩＤをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＶＩＤアミノ酸配列をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、ベクターは、配列番号１１および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＩＤをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、半減期延長ドメインアミノ酸配列をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、半減期延長ドメインはＦｃ領域である。適切なＦｃ領域配列は当該分野で周知である。例えば、１つ以上のＦｃ領域をコードする多数の発現ベクターは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から利用可能である。いくつかの態様では、ベクターは、配列番号７、３９、４１、および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃ領域をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、融合ポリペプチドアミノ酸配列をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、ベクターは、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターは、シグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。シグナルペプチドをコードする核酸を、読み取り枠（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒｏｍ）で融合ポリペプチドをコードする核酸にライゲーションする。いくつかの態様では、融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、配列番号９、１０、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様では、ベクターは、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸ならびに配列番号９、配列番号１０、または配列番号４３のアミノ酸配列を含むシグナル配列をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、ベクターは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸ならびに配列番号９、配列番号１０、または配列番号４３のアミノ酸配列を含むシグナル配列をコードする核酸を含む。他の態様では、ベクターは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸ならびに配列番号９、配列番号１０、または配列番号４３のアミノ酸配列を含むシグナル配列をコードする核酸を含む。当該分野で周知のベクターおよび本明細書中に開示のベクター（例えば、ｐＣＩ−ｎｅｏ）を、宿主細胞内での本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）をコードするポリヌクレオチドの複製および発現に使用することができる。

【0084】

（１）シグナル配列成分
いくつかの実施形態では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を横切る発現されたポリペプチドの転位置を指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分であり得るか、ベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドを起源とするシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列と置換する。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号２５および２６からなる群から選択される核酸によってコードされる。

【0085】

（２）複製起点
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方は、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することができる核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡから独立して複製することができ、且つ複製起点または自己複製配列を含む配列である。かかる配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適切であり、２μプラスミド起点は酵母に適切であり、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（「ＶＳＶ」）、またはウシ乳頭腫ウイルス（「ＢＰＶ」））は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターに必要ない（初期プロモーターを含むので、典型的には、ＳＶ４０起点をのみを使用することができる）。

【0086】

（３）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターはまた、形質転換細胞における表現型選択が可能な選択マーカーとして公知の選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性の欠損を補完し、または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素（例えば、ＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）を供給するタンパク質をコードする。選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与されたタンパク質を産生し、したがって、選択レジメンを生き抜く。かかる優性選択ストラテジーの例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの別の例は、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドフラグメントをコードする核酸（ジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ＤＨＦＲ」）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、およびオルニチンデカルボキシラーゼなど）を取り込む能力を有する細胞を同定することが可能な選択マーカーである。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞を、メトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培養培地中での全形質転換体の培養によって最初に同定する。野生型ＤＨＦＲと共に使用するための宿主細胞株の例は、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）である。あるいは、ＧＳ（グルタミンシンテターゼ）遺伝子で形質転換された細胞を、Ｌ−メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）（ＧＳのインヒビター）を含む培養培地中での形質転換体の培養によって同定する。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の同時形質転換核酸と共に増幅される。ＧＳ選択／増幅系を、上記のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用することができる。

【0087】

別の例のために、大腸菌を、典型的には、ｐＢＲ３２２（大腸菌種由来のプラスミド）を使用して形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含み、従って、形質転換された細胞の容易な同定手段が得られる。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドまたはバクテリオファージも含むことができるか、内因性タンパク質発現のために微生物によって使用することができるプロモーターを含むように改変することができる。

【0088】

酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンを含む培地中で成長する能力を欠く酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）のための選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１の破壊は、トリプトファンの非存在下での成長による形質転換の検出に有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（例えば、ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）を、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドによって補完することができる。さらに、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換のために使用することができる。あるいは、組換え仔牛キモシンの大量産生のための発現系は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告されていた。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用菌株による成熟組換えヒト血清アルブミン分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。

【0089】

さらに、宿主微生物と適合するレプリコンおよび調節配列を含むファージベクターを、これらの宿主と関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、バクテリオファージ（λＧＥＭ．ＴＭ．−１１など）を、感受性宿主細胞（大腸菌ＬＥ３９２など）を形質転換するために使用することができる組換えベクターの作製で利用することができる。

【0090】

（４）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、且つ融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主との使用に適切なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファンプロモーター系、およびハイブリッドプロモーター（ｔａｃプロモーターなど）が含まれる。しかし、細菌で機能的な他のプロモーター（他の公知の細菌プロモーターまたはファージプロモーターなど）も適切である。

【0091】

当業者によって確認することができる特定の状況のニーズにしたがって、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかを本発明で使用することができる。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターは周知である。選択されたプロモーターを、制限酵素消化を介したソースＤＮＡからのプロモーターの除去および単離プロモーター配列の最適なベクターへの挿入によって本明細書中に記載のポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。未変性プロモーター配列および多数の異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅および／または発現を指示することができる。しかし、異種プロモーターは、一般に、未変性の標的ポリペプチドプロモーターと比較してより多くを転写し、発現した標的遺伝子の収率がより高いので、異種プロモーターが好ましい。

【0092】

真核生物のプロモーター配列が公知である。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に維持するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始配列から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの全ての配列を、真核生物発現ベクターに挿入することができる。

【0093】

酵母宿主との使用に適切なプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素（エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど）のためのプロモーターが含まれる。

【0094】

酵母内の誘導性プロモーターは、成長条件によって転写が調節されるというさらなる利点を有する。例示的な誘導性プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のためのプロモーター領域が含まれる。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターと共に有利に使用される。

【0095】

哺乳動物宿主細胞中のベクター由来の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）をコードする核酸の転写を、例えば、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉種ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）、および熱ショック遺伝子プロモーター（但し、かかるプロモーターが所望の宿主細胞系と適合することを条件とする）によって調節することができる。

【0096】

ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合良い。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合良い。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用する哺乳動物宿主におけるＤＮＡ発現系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修正形態は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞内でのヒトインターフェロンｃＤＮＡの発現方法に関してはＲｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。

【0097】

（５）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、エンハンサー配列のベクターへの挿入によって増加する。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が、現在、公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。しかし、典型的には、当業者は、真核生物ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例には、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）も参照のこと。エンハンサーを、ベクター内の融合タンパク質または融合タンパク質フラグメントのコード配列の５’または３’の位置にスプライシングすることができるが、プロモーターの５’側に配置することが好ましい。

【0098】

（６）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトの細胞、または他の多細胞生物由来の有核細胞）中で使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含むであろう。かかる配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、時折、３’非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、抗体またはそのフラグメントをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ第９４／１１０２６号およびこれに開示の発現ベクターを参照のこと。

【0099】

宿主細胞
本明細書中に記載のベクター中の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）をコードするＤＮＡのクローニングまたは発現に適切な宿主細胞には、上記の原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞が含まれる。この目的に適切な原核生物には、真正細菌（グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、大腸菌）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、ネズミチフス菌）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａなど）、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（枯草菌およびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開の旧東ドイツ特許第２６６，７１０号に開示のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ４１Ｐ）など）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（緑膿菌など）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなど）が含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、他の株（大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７，３２５）など）も適切である。これらの例は、本発明を制限するよりもむしろ例示している。

【0100】

融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）を、特に、グリコシル化が必要ない場合（融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）が細胞毒性薬（例えば、毒素）に結合体化している場合など）に細菌内で産生することができる。大腸菌内での産生は、より迅速且つ費用効果が高い。細菌内での融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の発現については、例えば、発現および分泌を最適にするための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら）、および米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照のこと。発現後、融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）を、可溶性画分中の大腸菌細胞ペーストから単離し、例えば、融合ポリペプチドの結合部分（Ｆｃ領域アイソタイプなど）に応じてプロテインＡまたはＧによって精製することができる。例えば、ＣＨＯ細胞中で発現した融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）を精製するために使用したプロセスと同一のプロセスによって最終精製を行うことができる。

【0101】

原核生物に加えて、真核微生物（糸状菌または酵母など）も融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）をコードするベクターのための適切なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母、すなわち一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の間で最も一般的に使用されている。しかし、多数の他の属、種、および株が一般に利用可能であり、本明細書中で有用である（分裂酵母；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど）；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなど）；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびクロコウジカビなど）など）など）。治療タンパク質産生のための酵母および糸状菌の使用を考察している概説については、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照のこと。

【0102】

グリコシル化経路が「ヒト化」されており、それによって部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを有する融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）が産生される一定の真菌および酵母株を選択することができる。例えば、Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるグリコシル化経路のヒト化について記載）；およびＧｅｒｎｇｒｏｓｓら、前出を参照のこと。

【0103】

グリコシル化された融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。ヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、およびカイコガ（ガ）などの宿主由来の多数のバキュロウイルス株およびバリアントならびに対応する許容性宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の種々のウイルス株が公的に利用可能である（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびカイコガ ＮＰＶのＢｍ−５株）。かかるウイルスを、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのための本発明のウイルスとして使用することができる。

【0104】

綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。

【0105】

しかし、脊椎動物細胞が最も興味深く、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が日常的手順となりつつある。有用な哺乳動物宿主−細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または懸濁培養での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））が含まれる）；および骨髄腫細胞株（ＮＳ０およびＳｐ２／０など）が含まれる。ポリペプチド産生に適切な一定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照のこと。

【0106】

本明細書中に開示の任意のタンパク質を発現することができる哺乳動物細胞の例を、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、およびヒト細胞からなる群から選択することができる。別の実施形態では、動物細胞は、神経系細胞（末梢神経系細胞または中枢神経系細胞などであるが、これらに限定されない）、筋肉細胞（心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞など）、配偶子（精子細胞または卵母細胞など）、癌細胞、免疫細胞（マクロファージ、Ｔ細胞、またはＢ細胞などであるが、これらに限定されない）、幹細胞（胚性幹細胞または成体幹細胞などであるが、これらに限定されない）、または内分泌細胞（甲状腺細胞、視床下部細胞、下垂体細胞、副腎細胞、精巣細胞、卵巣細胞、膵臓細胞（β細胞など）、胃細胞、または腸細胞などであるが、これらに限定されない）である。いくつかの実施形態では、細胞は細胞培養におけるヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞培養における非ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。

【0107】

宿主細胞を、融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の産生のための上記発現ベクターまたはクローニングベクターを使用して形質転換またはトランスフェクションし、必要に応じてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増殖のために改変した従来の栄養培地中で培養する。

【0108】

トランスフェクションは、任意のコード配列が実際に発現されるかどうかと無関係な宿主細胞による発現ベクターの取り込みをいう。多数のトランスフェクション法が当業者に公知である（例えば、ＣａＰＯ_４沈殿およびエレクトロポレーション）。一般に、このベクターの任意の操作が宿主細胞内で示された場合に首尾の良いトランスフェクションと認識される。

【0109】

形質転換は、ＤＮＡが染色体外エレメントとしてか染色体組み込み体によって複製可能であるような原核生物宿主へのＤＮＡの導入を意味する。使用した宿主細胞に応じて、形質転換を、かかる細胞に適切な標準的技術を使用して行う。塩化カルシウムを使用したカルシウム処理を、一般に、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために使用する。別の形質転換法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを使用する。使用することができる別の技術はエレクトロポレーションである。

【0110】

Ｖ．融合ポリペプチドおよびそのフラグメントの産生方法
本明細書中に開示の本発明の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の産生方法を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、融合ポリペプチドを産生する条件下で培養する工程および宿主細胞によって産生された融合ポリペプチドを回収する工程を含む本明細書中に開示の任意の融合ポリペプチドの産生方法。いくつかの態様では、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、融合ポリペプチドを産生する条件下で培養する工程および宿主細胞によって産生された融合ポリペプチドを回収する工程を含む融合ポリペプチドの産生方法。

【0111】

（１）宿主細胞の培養
本発明の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）を産生するために使用した原核細胞を、当該分野で公知であり、且つ選択された宿主細胞の培養に適切な培地中で成長させる。適切な培地の例には、ルリア培地（ＬＢ）＋必要な栄養補助物質が含まれる。好ましい実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構造に基づいて選択される発現ベクターを含む原核細胞を選択的に成長させるための選択剤を含む。例えば、アンピシリンを、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成長培地に添加する。炭素、窒素、および無機リン酸源の他に必要な任意の補助物質を、単独または別の補助物質または培地（複合窒素源など）との混合物として適切な濃度で含むこともできる。任意選択的に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコラート、ジチオエリスリトール、およびジチオトレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含むことができる。真核生物宿主細胞を、適切な温度で培養する。大腸菌成長のために、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲、さらにより好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。大腸菌のために、ｐＨは、約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。誘導性プロモーターを発現ベクター内で使用する場合、タンパク質発現をプロモーターの活性化に適切な条件下で誘導する。例えば、ＰｈｏＡプロモーターを転写調節のために使用する場合、形質転換された宿主細胞を、誘導用のリン酸制限培地中で培養することができる。当該分野で公知のように、使用したベクター構築物にしたがって種々の他の誘導物質を使用することができる。

【0112】

本明細書中に記載の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）を産生するために使用した宿主細胞を、種々の培地中で培養することができる。市販の培地（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）など）が宿主細胞培養に適切である。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ第９０／０３４３０号；ＷＯ第８７／００１９５号；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の任意の培地を、宿主細胞の培養培地として使用することができる。任意のこれらの培地に、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（通常はマイクロモル範囲にて最終濃度で存在する無機化合物と定義する）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補足することができる。任意の他の必要な補助物質を、当業者に公知の適切な濃度で含めることもできる。培養条件（温度およびｐＨなど）は発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用した培養条件であり、当業者に明らかであろう。

【0113】

（２）融合ポリペプチドおよびそのフラグメントの精製
組換え技術を使用する場合、本明細書中に記載の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）を、細胞内、細胞周辺腔内に産生するか、培地中に直接分泌することができる。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、第１の工程として、タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による微生物の破壊を含む。一旦細胞が破壊されると、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれか由来の粒状デブリを、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌されたポリペプチドの単離手順を記載している。簡潔に述べれば、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたって解凍した。細胞デブリを遠心分離によって除去することができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、かかる発現系由来の上清を、一般に、最初に濾過し、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して濃縮する。タンパク質分解の阻害のためにプロテアーゼインヒビター（ＰＭＳＦなど）を前述のいずれかの工程に含めることができ、外来性の夾雑物の成長防止に抗生物質を含めることができる。

【0114】

かかる細胞から調製した融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。いくつかの実施形態では、プロテインＡまたはプロテインＧをアフィニティクロマトグラフィで用いるアフィニティリガンドとして使用する。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの安定性は、融合ポリペプチドまたはそのフラグメント中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに依存する（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３）。１つの好ましい実施形態では、プロテインＡを、本明細書中に記載の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の単離および精製のためのアフィニティリガンドとして使用する。いくつかの実施形態では、プロテインＧを、本明細書中に記載の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の単離および精製のためのアフィニティリガンドとして使用する。アフィニティリガンドが結合するマトリックスは、殆どの場合アガロースであるが、他のマトリックスを利用可能である。機械的に安定なマトリックス（コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンなど）により、アガロースを使用して達成できるよりも迅速な流速および短い処理時間が可能である。他のタンパク質精製技術（イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ、ヘパリン、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、または陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィ、ならびにクロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿など）も、回収すべき融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）に応じて利用可能である。いくつかの実施形態では、回収した融合タンパク質は実質的に純粋である。さらなる実施形態では、回収した融合タンパク質は、純度９０％、９１％、９２．％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の少なくともいずれかである。

【0115】

任意の予備精製工程後、目的の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）および夾雑物を含む混合物を、約２．５と４．５との間のｐＨの溶離緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供することができ、好ましくは、低塩濃度（例えば、塩濃度約０〜０．２５Ｍ）で行うことができる。

【0116】

一般に、研究、試験、および臨床適用で用いる融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）の種々の調製方法論は当該分野で十分に確立されており、これらは上記方法論と一致し、そして／または当業者は目的の特定の融合ポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、ＣＩＤ、ＶＩＤ、半減期延長ドメイン（＊）など）に適切と見なしている。

【0117】

（３）融合ポリペプチドおよびそのフラグメントの生物学的活性
ポリペプチドを、一般的に知られている方法（イムノアフィニティカラムまたはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたは陽イオン交換樹脂（ＤＥＡＥなど）によるクロマトグラフィ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用したゲル濾過；疎水性アフィニティ樹脂、マトリックス上に固定した適切な結合パートナーを使用したリガンドアフィニティ、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ、ウェスタンブロットアッセイ、アミノ酸および核酸配列決定、ならびに生物学的活性など）を使用して精製および同定することができる。

【0118】

本明細書中に開示の融合タンパク質を、生物学的活性（標的結合パートナー（例えば、ＶＥＧＦまたは補体タンパク質）に対する親和性、競合的結合（例えば、補体調節タンパク質またはＶＥＧＦＲに対する標的結合パートナーの遮断）、阻害活性（例えば、補体活性化またはＶＥＧＦ活性化の阻害）、半減期または融合タンパク質、細胞増殖の阻害、腫瘍成長の阻害、および血管形成（例えば、脈絡膜血管新生）の阻害が含まれるが、これらに限定されない）について特徴付けるか評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の融合タンパク質を、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的活性について評価することができる。本明細書中に記載の任意のアッセイでは、４℃、２０〜２８℃（例えば、２５℃）、または３７℃でアッセイを行う。

【0119】

本明細書中に開示の融合タンパク質を、結合パートナー（補体タンパク質（例えば、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ１ｑ、またはＭＢＰ）など）に対する親和性について評価することができる。多数の結合親和性の評価方法が当該分野で公知であり、これらを結合パートナーに対する融合タンパク質の結合親和性を同定するために使用することができる。結合親和性を、解離定数（Ｋｄ）値または半数効果濃度（ＥＣ５０）値として示すことができる。結合親和性（例えば、Ｋｄ値）の決定技術は当該分野で周知である（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＢＩＡｃｏｒｅなど）。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＮＹ（１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００９）；Ａｌｔｓｃｈｕｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１：６２９８（１９９２）；およびＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒによって開示のＢＩＡｃｏｒｅ法（その全てが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。例えば、結合パートナーに対する融合タンパク質の結合親和性を、ＥＬＩＳＡを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＣ３ｂまたはＣ４ｂへの結合を、ＥＬＩＳＡを使用してアッセイする。この例示的アッセイでは、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに、１００ｎｇ／ウェルのＣ３ｂまたはＣ４ｂをコーティングする。約０〜１μＭの精製した融合タンパク質を各ウェルに添加し、１時間インキュベーション後、洗浄して非結合のＣ３ｂまたはＣ４ｂを除去する。５０００倍希釈の抗Ｆｃ ＨＲＰ結合体（例えば、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ０１７０−１ＭＬ）をその後に各ウェルに添加し、１時間インキュベーションする。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＴＭＢ基質のための停止試薬（例えば、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５８１４−１００ＭＬ）を添加する。サンプルの吸収を４５０ｎｍで測定し、計算ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｓｍ４）を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析して、Ｃ３ｂまたはＣ４ｂへの融合タンパク質の結合についてのＫｄ値および／またはＥＣ５０値を得る。さらなる例では、融合タンパク質のＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＰｌＧＦ）への結合を、ＥＬＩＳＡを使用してアッセイする。例示的アッセイでは、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、約０〜１０ｎＭの精製融合タンパク質を各ウェルに添加後、１時間インキュベーションする。洗浄後、５０００倍希釈の抗Ｆｃ ＨＲＰ結合体を各ウェルに添加して１時間インキュベーション後、洗浄し、ＴＭＢ基質のための停止試薬を各ウェルに添加する。サンプルの吸収を４５０ｎｍで測定し、計算ソフトウェアを使用したＳ字カーブフィッティングによって分析して、融合タンパク質のＶＥＧＦ−Ａへの結合についてのＫｄ値および／またはＥＣ５０値を得る。さらなる例示的アッセイでは、融合タンパク質の可溶性ＶＥＧＦへの結合を、ヒトＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＶＥ００）を使用したＥＬＩＳＡによってアッセイする。

【0120】

本明細書中に開示の融合タンパク質を、補体経路（例えば、古典的経路、第二経路、および／またはレクチン経路）の阻害活性について評価することができる。多数の阻害活性の評価方法が当該分野で公知であり、これらを融合タンパク質の阻害活性を同定するために使用することができる。結合親和性を、半数効果濃度（ＥＣ５０）値として示すことができる。例えば、融合タンパク質による古典的補体経路またはレクチン経路の阻害活性を、総溶血（ＣＨ５０）アッセイを使用して決定することができる。この例示的アッセイでは、３７℃で１時間のインキュベーション後に１×１０^７抗体感作ヒツジ赤血球／ｍｌの９０％が溶解する正常ヒト血清の希釈物を最初に決定する。本アッセイを、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む緩衝液中で行った。古典的補体経路の阻害を、９０％の抗体感作したヒツジ赤血球を溶解することができる正常ヒト血清の希釈物を０〜５００ｎＭの融合タンパク質と３７℃で１時間混合することによって活性化する。次いで、抗体感作したヒツジ赤血球の溶血を、１時間のインキュベーション後、５４１ｎｍでの吸収測定後に計算ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｓｍ４）を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析して融合タンパク質による古典的補体経路またはレクチン経路の阻害活性についてのＥＣ５０値を得ることによってアッセイする。さらなる例示的アッセイでは、融合タンパク質による第二経路の補体の阻害活性を、ＣＨ５０アッセイで使用した緩衝液中でのカルシウムイオンのキレート化のためにエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を含めることによって決定する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質による補体経路の阻害活性は、第二経路Ｃ３−コンバターゼについての崩壊促進活性（ＤＡＡ）の阻害である。別の実施形態では、融合タンパク質による補体経路の阻害活性は、第二経路Ｃ３−コンバターゼについての崩壊促進活性（ＤＡＡ）の阻害である。融合タンパク質によるＤＡＡの阻害を、当該分野で公知の方法ならびに本明細書中に開示の任意の方法（例えば、実施例７）によって決定することができる。例示的なＣＨ５０アッセについては、Ｃｏｓｔａｂｉｌｅ，Ｍ．，（２０１０）．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２９（３７）：１９２３（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【0121】

本明細書中の任意の実施形態では、融合タンパク質のＥＣ５０は、活性阻害（例えば、補体活性および／またはＶＥＧＦ活性の阻害）について≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）である。本明細書中の任意の実施形態では、融合タンパク質のＫｄは、結合パートナー（例えば、補体タンパク質および／またはＶＥＧＦ）について、約１．０ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、 ２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ，９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１２．５ｐＭ、６．２５ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭまたは３ｐＭのいずれか未満（これらの数値の両端および間の任意の値を含む）である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の融合ポリペプチドバリアントは、本明細書中に記載の野生型融合ポリペプチドの結合と比較して高い親和性で結合パートナーに結合する。いくつかの態様では、融合ポリペプチドバリアントは、配列番号１２、３３〜３７、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドによる結合パートナーの結合と比較して１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１０，０００倍の親和性の少なくともいずれか（これらの数値の両端および間の任意の値を含む）で結合パートナーに結合する。

【0122】

いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の融合タンパク質を、抗増殖活性（細胞増殖または腫瘍成長の減少など）について評価することができる。多数の融合タンパク質の抗増殖性の評価方法が当該分野で公知である。１つの例示的なアッセイでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して、ＶＥＧＦ依存性細胞増殖の阻害を証明することができる。このアッセイでは、ＨＵＶＥＣを、２％ＦＢＳを有する内皮細胞成長培地（例えば、Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）中に維持する。約５０μｌの１ｎＭのＶＥＧＦ−Ａを、コラーゲンおよび種々の濃度の融合タンパク質でコーティングした９６ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。約５０μｌの１×１０^５細胞／ｍｌのＨＵＶＥＣを含むＭｅｄｉｕｍ−１９９（例えば、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２を使用して３７℃で７２時間インキュベーションする。インキュベーション後、細胞増殖を、１０μｌのＣＣＫ−８（例えば、Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、次いで、４５０／６５０ｎｍでＯＤ吸収を測定して融合タンパク質による細胞増殖の阻害を決定することによってアッセイする。例示的なｉｎ ｖｉｖｏアッセイでは、腫瘍成長の阻害を、一定の癌型（例えば、肝細胞癌、結腸直腸癌など）由来の腫瘍を保有する異種移植マウスにおいて評価する。このアッセイでは、種々の濃度の融合タンパク質を、特定の投薬レジメンでマウスに投与し、腫瘍成長を期間中に少なくとも２回測定して融合タンパク質による腫瘍成長の阻害を決定する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の抗血管新生性を、当該分野で周知の技術を使用して測定する。１つの例示的なアッセイでは、湿性加齢性黄斑変性の動物モデルを使用して、融合タンパク質による眼内の血管新生の阻害をアッセイする。このアッセイでは、レーザー光凝固を動物（例えば、マウス、サルなど）の網膜に送達させて脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を得、融合タンパク質を投与する。動物（例えば、マウス、ラット、およびサル）の眼内のＣＮＶ病変を、当該分野で公知の技術および本明細書中に開示の技術（例えば、実施例１１および１２）を使用して、融合タンパク質の投与によってＣＮＶ病変が減少するかどうかを測定する。Ｌｉｕ，Ｊ．ら、（２０１１）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６（２３）：２０９９１−２１００１；Ｎｏｒｋ，Ｔ．Ｍ．，（２０１１）．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２９（８）：１０４２−１０５２；およびＬｉｃｈｔｌｅｎ，Ｐ．（２０１０）．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１５（９）：４７３８−４７４５（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【0123】

ＶＩ．融合ポリペプチドおよびそのフラグメントを使用した処置方法
本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、補体関連疾患、眼疾患、および癌の処置または防止方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患、補体関連疾患、眼疾患、および／または癌を有する被験体の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載の任意の融合タンパク質を被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、下記の治療剤）を個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明は、補体タンパク質の補体調節化タンパク質への結合の阻害で用いる融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、有効量の融合タンパク質を被験体に投与して補体タンパク質の補体調節化タンパク質への結合を阻害する工程を含む、被験体における補体タンパク質の補体調節化タンパク質への結合の阻害で用いる融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合の阻害で用いる融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、有効量の融合タンパク質を被験体に投与してＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合を阻害する工程を含む、被験体におけるＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合の阻害で用いる融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、有効量の融合タンパク質を被験体に投与して補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）工程を含む、被験体における補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）で用いる融合タンパク質を提供する。上記の任意の実施形態の「被験体」は、好ましくはヒトである。

【0124】

本明細書中に記載の融合タンパク質によって処置または防止することができる炎症性疾患には、黄斑変性（例えば、加齢性黄斑変性）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、喘息、および多発性硬化症が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載の融合タンパク質によって処置または防止することができる自己免疫疾患には、アルツハイマー病、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、成人呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、真性糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、ＣＮＳ炎症性障害、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自己免疫性血小板減少症が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載の融合タンパク質によって処置または防止することができる補体関連疾患には、動脈瘤、非定型溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑、特発性血小板減少性紫斑、ＡＭＤ、自発性胎児消失、再発性胎児消失、外傷性脳損傷、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、遺伝性血管浮腫、卒中、出血性ショック、敗血症性ショック、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術などの手術由来の合併症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの肺合併症、虚血−再灌流傷害、移植臓器拒絶、および多臓器不全が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の融合タンパク質によって処置または防止することができる癌には、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、リンパ腫、白血病、腺癌、膠芽細胞腫、腎臓癌、胃癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、卵巣癌、子宮内膜癌、および乳癌が含まれる。さらなる実施形態では、本明細書中に記載の融合タンパク質によって処置または防止することができる本明細書中に開示の任意の癌は転移性である。本明細書中に記載の融合タンパク質によって処置または防止することができる眼疾患には、湿性加齢性黄斑変性、乾性加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、水晶体後線維増殖、網膜中心閉塞、網膜静脈閉塞、虚血性網膜症、高血圧性網膜症、ブドウ膜炎（例えば、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または汎ブドウ膜炎）、ベーチェット病、ビエッティ結晶状変性症、眼瞼炎、緑内障（例えば、開放隅角緑内障）、血管新生緑内障、角膜の血管新生、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜下血管新生、角膜の炎症、および角膜移植由来の合併症が含まれるが、これらに限定されない。

【0125】

本明細書中に記載の融合タンパク質および組成物は、黄斑変性（ＡＭＤなど）の処置に特に有用である。ＡＭＤは、米国および他の先進国の高齢者（５０歳超）における失明および視力障害の主因である（Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｃ．，（２０１０）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０（９）：３０３３−３０４１）。ＡＭＤは、大まかに２つの型（湿性および乾性）に分類され、乾性が全ＡＭＤ症例の８０〜９０％までを構成する。乾性ＡＭＤ（非滲出性）は、ドルーゼンと呼ばれる細胞片が網膜と脈絡膜との間に蓄積するＡＭＤ型である。乾性ＡＭＤは３つの病期（初期、中期、および進行期）を有し、黄斑ドルーゼンの存在によって特徴付けられる。進行性乾性ＡＭＤでは、中心地図状委縮が起こり、それにより、眼の中心部の視力が失われる。ＡＭＤの湿性（滲出性または血管新生）形態は、異常な血管（脈絡膜血管新生、ＣＮＶ）が脈絡膜から黄斑後部のブルッフ膜まで成長し、それにより、急速に視力喪失するより重篤な形態である。近年、補体活性化がＡＭＤの病理発生で主な役割を果たすという証拠が増加しつつある（Ｉｓｓａ，Ｐ．Ｃ．ら、（２０１１），Ｇｒａｅｆｅｓ．Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，２４９：１６３−１７４）。例えば、高レベルの補体タンパク質がドルーゼン中に検出されている。さらに、遺伝学研究により、ＡＭＤリスクとＨ因子（ＣＦＨ）、ＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ３、Ｃ２、Ｃ３、Ｂ因子、Ｉ因子を含む補体タンパク質遺伝子の多形との関連が確認されている。特に、ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ対立遺伝子はＡＭＤリスクと高度に相関する。最後に、補体活性化産物レベルの増加もＡＭＤ患者の血漿内で見出されている。ＡＭＤを、視力検査、眼底検査、アムスラーグリッド、フルオレセイン血管造影図を用いるか、ＡＭＤ関連バイオマーカーについての遺伝子検査によって被験体において検出することができる。乾性ＡＭＤから湿性ＡＭＤに進行し得ることが一般に認められている。本発明は、有効量の本明細書中に記載の融合タンパク質を含む組成物の投与によるＡＭＤ（湿性または乾性ＡＭＤ形態など）の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＭＤの１つ以上の様相または症状（眼のドルーゼンの形成、眼または眼組織の炎症、光受容体細胞の喪失、視力（例えば、視力および視野が含まれる）の喪失、血管新生、網膜下出血、網膜剥離、血管漏出、および任意の他のＡＭＤ関連様相が含まれるが、これらに限定されない）の処置または防止方法を提供する。

【0126】

さらなる態様では、本発明は、医薬の製造または調製における融合タンパク質の使用を提供する。いくつかの実施形態では、医薬は、炎症性疾患、自己免疫疾患、補体関連疾患、眼疾患、および癌の処置用である。いくつかの実施形態では、本発明は、補体タンパク質の補体調節化タンパク質への結合の阻害で用いる医薬の製造のための融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合の阻害で用いる医薬の製造のための融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、有効量の融合タンパク質を被験体に投与して補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）工程を含む、被験体における補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）で用いる医薬の製造のための融合タンパク質を提供する。上記の任意の実施形態の「被験体」は好ましくはヒトである。いくつかの実施形態では、医薬を、炎症性疾患（黄斑変性（例えば、加齢性黄斑変性）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、喘息、および多発性硬化症が含まれるが、これらに限定されない）の処置のために使用する。いくつかの実施形態では、医薬を、自己免疫疾患（アルツハイマー病、自己免疫性ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、成人呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）、多発性硬化症、真性糖尿病、ハンチントン病、パーキンソン病、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、ＣＮＳ炎症性障害、重症筋無力症、糸球体腎炎、および自己免疫性血小板減少症が含まれるが、これらに限定されない）の処置のために使用する。いくつかの実施形態では、医薬を、補体関連疾患（動脈瘤、非定型溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑、特発性血小板減少性紫斑、ＡＭＤ、自発性胎児消失、再発性胎児消失、外傷性脳損傷、乾癬、自己免疫性溶血性貧血、遺伝性血管浮腫、卒中、出血性ショック、敗血症性ショック、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術などの手術由来の合併症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの肺合併症、虚血−再灌流傷害、移植臓器拒絶、および多臓器不全が含まれるが、これらに限定されない）の処置のために使用する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の融合タンパク質によって処置または防止することができる癌には、結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌、非小細胞肺癌、リンパ腫、白血病、腺癌、膠芽細胞腫、腎臓癌、転移性腎臓癌、胃癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、卵巣癌、子宮内膜癌、および乳癌が含まれる。他の実施形態では、医薬を、眼疾患（湿性加齢性黄斑変性、乾性加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、水晶体後線維増殖、網膜中心閉塞、網膜静脈閉塞、虚血性網膜症、高血圧性網膜症、ブドウ膜炎（例えば、前部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または汎ブドウ膜炎）、ベーチェット病、ビエッティ結晶状変性症、眼瞼炎、緑内障（例えば、開放隅角緑内障）、血管新生緑内障、角膜の血管新生、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜下血管新生、角膜の炎症、および角膜移植由来の合併症が含まれるが、これらに限定されない）の処置のために使用する。

【0127】

薬学的投薬量
本発明の薬学的組成物の投薬量および所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて変化し得る。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分に当業者の範囲内である。動物実験により、ヒト治療のための有効用量の決定のための信頼できるガイダンスが得られる。有効用量の種間スケーリングを、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，” Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら、Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２−４６に記載の原理に従って行うことができる。

【0128】

本明細書中に記載の融合ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ投与のために、通常の投薬量は、投与経路に応じて約１０ｎｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ個体体重／日以上、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で変化し得る。数日間以上にわたる反復投与のために、処置すべき疾患または障害の重症度に応じて、所望の症状の抑制が達成されるまで処置を継続する。

【0129】

例示的な投与レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初回量、その後の隔週に約１ｍｇ／ｋｇの維持量の融合タンパク質の投与を含む。医師が達成を望む薬物動態学的減衰パターンに応じて他の投薬レジメンが有用であり得る。例えば、１〜２１回／週の個体への投与が本明細書中で意図される。一定の実施形態では、約３μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（約３μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２／ｍｇ／ｋｇなど）の範囲の投与を使用することができる。一定の実施形態では、投与頻度は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに１回、１週間に１回、２週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回、７週間毎に１回、８週間毎に１回、９週間毎に１回、１０週間毎に１回、または１ヶ月に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、またはそれより長期の間隔である。治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投与レジメン（融合タンパク質の投与を含む）は、使用される用量と独立して期間に応じて変化し得る。

【0130】

特定の融合タンパク質の投薬量を、融合タンパク質を１回以上投与されている被験体において経験的に決定することができる。個体に漸増用量の融合タンパク質を投与する。融合タンパク質の有効性を評価するために、炎症性疾患（ＡＭＤなど）の臨床症状をモニタリングすることができる。

【0131】

例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的または予防的のいずれであるか、および当業者に公知の他の要因に応じて、本発明の方法にしたがって融合タンパク質を継続的または間欠的に投与することができる。融合タンパク質を、例えば、炎症性疾患（ＡＭＤなど）の発症中または発症後のいずれかに予め選択された期間にわたって継続的に投与するか、一定間隔を開けて投与することができる。

【0132】

特定の投薬量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されている（例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；同第５，２０６，３４４号；または同第５，２２５，２１２号を参照のこと）。異なる処置および異なる疾患または障害に異なる処方物が有効であり、特定の器官または組織の処置を意図する投与が別の器官または組織と異なる様式での送達が必要であり得ることは本発明の範囲内である。さらに、投薬量を、１回以上の個別の投与または連続注入によって投与することができる。数日間以上にわたる反復投与のために、条件に応じて、所望の病徴の抑制が得られるまで処置を維持する。しかし、他の投薬レジメンが有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。

【0133】

処方物の投与
本発明の融合タンパク質（および任意のさらなる治療剤）を、任意の適切な手段（非経口、肺内、および鼻腔内、局所処置が望ましい場合、病巣内投与が含まれる）によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投与が短期間か慢性かに一部依存して、任意の適切な経路（例えば、注射（静脈内または皮下注射など））によって投与することができる。種々の投与計画（単回投与または種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入が含まれるが、これらに限定されない）が本明細書中で意図される。いくつかの実施形態では、組成物を、眼または眼組織に直接投与する。いくつかの実施形態では、組成物を、例えば、点眼薬で眼に局所的に投与する。いくつかの実施形態では、組成物を、眼（眼内注射）または眼に関連する組織への注射によって投与する。組成物を、例えば、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、サブコンジェクトバル注射、結膜下注射、テノン間隙下注射、球後注射、眼球周囲注射、または後強膜近傍送達によって投与することができる。組成物を、例えば、硝子体、視神経、眼房水、強膜、結膜、強膜と結膜との間の領域、網脈絡膜組織、黄斑、または個体の眼内または眼近傍の他の領域に投与することもできる。いくつかの実施形態では、組成物を、眼移植片として個体に投与する。

【0134】

本発明の融合タンパク質を、良好な医療行為と調和する様式で処方、服用、および投与するであろう。この文脈で考慮すべき要因には、処置される特定の疾患または障害、処置される特定の哺乳動物、各患者の臨床症状、疾患または障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者に公知の他の要因が含まれる。融合タンパク質は、問題の疾患または障害を防止または処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤を必要としないが、任意選択的にこれらとともに処方する。かかる他の薬剤の有効量は、処方物中の融合タンパク質の存在量、疾患、障害、または処置の型、および上記で考察した他の要因に依存する。これらを、一般に、本明細書中に記載のものと同一の投薬量および投与経路、または本明細書中に記載の投薬量の約１〜９９％、または経験的／臨床的に適切と決定された任意の投薬量および任意の経路で使用する。

【0135】

併用処置
本発明の融合タンパク質を、単独または１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて使用することができる。かかる併用療法は、組み合わせ投与（２つ以上の治療剤が同一または個別の処方物中に含まれる場合）、および個別投与（この場合、本発明の融合タンパク質をさらなる治療剤および／またはアジュバントの投与前、同時、および／または投与後に投与することができる）を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質を、治療剤（補体インヒビター（例えば、ＡＲＣ１９０５、ＴＴ３０、コンプスタチン、および／またはＰＯＴ−４）、補体に対する抗体（例えば、エクリズマブ、ＦＣＦＤ４５１４Ｓ、ＴＮＸ−５５８、および／またはＴＮＸ−２３４）、ＶＥＧＦＲインヒビター（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、バタラニブ、および／またはバンデタニブ）、ＶＥＧＦＲ抗体（例えば、ラムシルマブ）、またはＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、および／またはペガプタニブ）が含まれるが、これらに限定されない）と組み合わせて投与する。例示的な補体タンパク質に対する薬剤については、Ｅｈｒｎｔｈａｌｌｅｒ，Ｃ．ら、（２０１１），Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１７：３１７−３２９を参照のこと。さらなる実施形態では、融合タンパク質を、薬剤（抗酸化剤（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、ルテイン、および／またはゼアキサンチン）、長鎖ω−３脂肪酸（例えば、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｍｏｉｃ ａｃｉｄ）および／またはエイコサペンタエン酸）、亜鉛、または銅が含まれるが、これらに限定されない）と組み合わせて投与する。さらなる実施形態では、融合タンパク質を、神経保護サイトカイン（毛様体神経栄養因子が含まれるが、これに限定されない）と組み合わせて投与する。さらなる実施形態では、融合タンパク質を、ＡＭＤの場合にレーザー処置（例えば、光力学療法）と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、有効量の融合タンパク質の１つ以上のさらなる治療剤との組み合わせは、有効量の融合タンパク質または他の治療剤のみと比較して有効である。

【0137】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質を、１つ以上のさらなる治療剤と異なる投与経路によって投与する。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる治療剤を、非経口（例えば、中心静脈ライン、動脈内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下注射）、経口、胃腸、局所、鼻咽頭、および肺（例えば、吸入または鼻腔内）で投与する。

【0138】

ＶＩＩ．組成物
本明細書中に記載の融合タンパク質の薬学的処方物を、かかる所望の純度を有する融合タンパク質を１つ以上の任意選択的な薬学的に許容され得るキャリアと凍結乾燥処方物または水溶液の形態で混合することによって調製する。薬学的に許容され得るキャリア、賦形剤、または安定剤は本明細書中に記載されており、当該分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００））。薬学的に許容され得るキャリアは、一般に、使用される投薬量および濃度でレシピエントに非毒性を示し、以下が含まれるが、これらに限定されない：緩衝液（リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液など）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる）；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）。例示的な本明細書中の薬学的に許容され得るキャリアには、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの間隙薬物分散剤（例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）など））がさらに含まれる。１つの態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ（コンドロイチナーゼなど）と組み合わせる。

【0139】

本明細書中の処方物はまた、処置される特定の適応症に必要な１つを超える有効成分、好ましくは、相互に悪影響を与えない補完的活性を有する有効成分を含むことができる。例えば、ＶＥＧＦ抗体または補体インヒビターをさらに提供することが望ましいかもしれない。かかる有効成分は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。

【0140】

有効成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリラート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に封入することができる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0141】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む薬学的処方物は非経口投与に適切である。そのうち、許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌固定油が、溶媒または懸濁化剤として従来より使用されている。この目的のために、任意のブランドの硬化鉱油または非鉱油（合成モノまたはジグリセリドが含まれる）を使用することができる。さらに、脂肪酸（オレイン酸など）は、注射剤の調製での用途がある。いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む薬学的処方物は、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内送達に適切である。

【0142】

徐放調製物を調製することができる。徐放調製物の適切な例には、融合タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは造形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。薬学的組成物は、種々の薬物送達系での使用に適切である。本発明の薬物送達法の簡潔な概説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−３３（１９９０）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【0143】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用すべき処方物は、一般に無菌である。無菌性を、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成することができる。

【0144】

ＶＩＩＩ．製品またはキット
別の態様では、融合タンパク質処方物を含む製品またはキットを提供する。製品またはキットは、本発明の方法におけるその使用説明書をさらに含むことができる。したがって、一定の実施形態では、製品またはキットは、有効量の融合タンパク質を個体に投与する工程を含む、個体における炎症性疾患（加齢性黄斑変性など）、補体関連疾患、および／または癌の処置または防止方法における融合タンパク質の使用説明書を含む。一定の実施形態では、個体はヒトである。

【0145】

製品またはキットは容器をさらに含むことができる。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、シリンジ（シングルまたはデュアルチャンバーシリンジなど）および試験管が含まれる。容器を、種々の材料（硝子またはプラスチックなど）から形成することができる。容器は処方物を保持する。製品またはキットは、容器上または容器と一体になっており、且つ処方物の再構成および／または使用についての指示を示すことができるラベルまたは添付文書をさらに含むことができる。ラベルまたは添付文書は、処方物が個体における炎症性疾患（加齢性黄斑変性など）、補体関連疾患、および／または癌の処置または防止のための皮下投与または他の投与様式に有用であるか意図することをさらに示すことができる。処方物を保持する容器は、再構成した処方物の単回使用バイアルまたは反復投与（例えば、２〜６回の投与）が可能な複数回使用バイアルであり得る。製品またはキットは、適切な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ）を含む第２の容器をさらに含むことができる。希釈剤および凍結乾燥処方物の混合の際、再構成処方物中のタンパク質、ポリペプチド、または小分子の最終濃度は、一般に、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌであろう。製品またはキットは、商業的、治療的、および使用者の観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および添付文書が含まれる）を使用説明書と共にさらに含むことができる。

【0146】

本明細書中の製品またはキットは、任意選択的に、第２の医薬を含む容器をさらに含み、ここで、融合ポリペプチドが第１の医薬であり、製品は有効量の第２の医薬で被験体を処置するための説明を添付文書上にさらに含む。第２の医薬は上記のいずれかであり得、例示的な第２の医薬は、融合タンパク質を加齢性黄斑変性の処置のために使用する場合、補体インヒビター（例えば、ＡＲＣ１９０５、ＴＴ３０、コンプスタチン、および／またはＰＯＴ−４）、補体に対する抗体（例えば、エクリズマブ、ＦＣＦＤ４５１４Ｓ、ＴＮＸ−５５８、および／またはＴＮＸ−２３４）、ＶＥＧＦＲインヒビター（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、バタラニブ、および／またはバンデタニブ）、ＶＥＧＦＲ抗体（例えば、ラムシルマブ）、またはＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、および／またはペガプタニブ）である。

【0147】

別の実施形態では、自動注入デバイスでの投与のための本明細書中に記載の処方物を含む製品またはキットを本明細書中に提供する。自動注入器を、活性化の際に患者または管理者がさらなる必要とされる作業を行うこと無くその内容物を送達させる注射デバイスと説明することができる。これらは、送達速度が一定でなければならず、且つ送達時間が数秒よりも長い場合の治療処方物の自己投薬に特に適切である。

【0148】

炎症性疾患（加齢性黄斑変性など）、補体関連疾患、および／または癌の処置および／または防止のための単位投薬形態も提供し、投薬形態は、本明細書中に記載の融合タンパク質または処方物のいずれか１つを含む。

【0149】

本発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかし、実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。本開示を通した全引用は、明確に本明細書中で参考として援用される。
ＶＩＩＩＩ．例示的な実施形態
１．融合タンパク質が補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含む、補体活性化およびＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する融合タンパク質；
２．実施形態１中の半減期延長ドメインは免疫グロブリンＦｃ領域であり、ここで、Ｆｃ領域は野生型のＦｃ領域または任意のヒト免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、アロタイプのバリアントである；
３．実施形態２中のＦｃ領域は、配列番号７中の配列を有するＦｃ領域である；
４．実施形態１中の半減期延長ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長い抗体、抗体のフラグメント、ヒト血清アルブミン、または任意の他のヒトタンパク質である；
５．実施形態２中のＣＩＤおよびＶＩＤは、Ｆｃ領域のいずれかの末端またはＦｃ領域の同一の末端に存在し得る（すなわち、ＶＩＤ−Ｆｃ−ＣＩＤ、ＣＩＤ−Ｆｃ−ＶＩＤ、ＶＩＤ−ＣＩＤ−Ｆｃ、ＣＩＤ−ＶＩＤ−Ｆｃ、Ｆｃ−ＶＩＤ−ＣＩＤ、またはＦｃ−ＣＩＤ−ＶＩＤ）；
６．実施形態１中のＣＩＤはヒト補体受容体１型（ＣＲ１）細胞外領域の一部であり、ここで、ＣＩＤの配列は配列番号１〜６に由来する；
７．実施形態１中のＣＩＤはヒトＤＡＦ、ＭＣＰ、Ｈ因子、Ｃ４ＢＰの一部であり、ここで、ＣＩＤの配列は配列番号１３〜１６に由来する；
８．実施形態１中のＣＩＤは、Ｂ因子、またはＤ因子、またはＰ因子、Ｃ３、またはＣ５に対する抗体の抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ、または可変領域（ＶＨまたはＶＫ）である；
９．実施形態１中のＣＩＤは、Ｂ因子、またはＤ因子、またはＰ因子、Ｃ３、またはＣ５に対するペプチドインヒビターまたはオリゴヌクレオチドインヒビターである；
１０．実施形態１中のＣＩＤは、実施形態５〜８中のＣＩＤのバリアントまたは組み合わせである；
１１．実施形態１中のＶＩＤは、ＶＥＧＦＲの細胞外ドメインの一部を含む；
１２．実施形態１中のＶＩＤは、配列番号１１中の配列を有するＶＥＧＦＲ−１の第２の細胞外ドメインおよびＶＥＧＦＲ−２の第３の細胞外ドメインである。；
１３．実施形態１中の融合タンパク質は、配列番号１２中の配列を有する。
１４．補体活性化を阻害する融合タンパク質、ここで、融合タンパク質はＣＩＤおよび半減期延長ドメインを含む；
１５．実施形態１４中の半減期延長ドメイン（＊＊）は免疫グロブリンＦｃ領域であり、ここで、Ｆｃ領域は野生型のＦｃ領域または任意のヒト免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、およびアロタイプのバリアントである；
１６．実施形態１５中のＦｃ領域は、配列番号７中の配列を有するＦｃ領域である；
１７．実施形態１４中の半減期延長ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長い抗体、抗体のフラグメント、ヒト血清アルブミン、または任意の他のヒトタンパク質である；
１８．実施形態１４中のＣＩＤは、Ｆｃ領域のいずれかの末端に存在し得る（すなわち、ＣＩＤ−ＦｃまたはＦｃ−ＣＩＤ）；
１９．実施形態１４中のＣＩＤはヒト補体受容体１型（ＣＲ１）細胞外領域の一部であり、ここで、ＣＩＤの配列は配列番号１〜６に由来する；
２０．実施形態１４中のＣＩＤはヒトＤＡＦ、またはＭＣＰ、またはＨ因子、またはＣ４ＢＰの一部であり、ここで、ＣＩＤの配列は配列番号１３〜１６に由来する；
２１．実施形態１４中のＣＩＤは、Ｂ因子、またはＤ因子、またはＰ因子、またはＣ３、またはＣ５に対する抗体の抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ、または可変領域（ＶＨまたはＶＫ）である；
２２．実施形態１４中のＣＩＤは、Ｂ因子、またはＤ因子、またはＰ因子、Ｃ３、またはＣ５に対するペプチドインヒビターまたはオリゴヌクレオチドインヒビターである；
２３．実施形態１４中のＣＩＤは、実施形態１９〜２２中のＣＩＤのバリアントまたは組み合わせである；
２４．実施形態５〜８中のＣＩＤの少なくとも１つ、バリアント、または組み合わせを含む改変タンパク質、ここでペプチドは半減期延長ドメインと結合体化している；
２５．実施形態２４中の改変タンパク質は実施形態１１〜１２中のＶＩＤを含む；
２６．実施形態２４中の半減期延長ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長いＰＥＧまたは別のポリマーである；
２７．実施形態２４中の半減期延長ドメインは免疫グロブリンＦｃ領域であり、ここで、Ｆｃ領域は野生型のＦｃ領域または任意のヒト免疫グロブリンアイソタイプ、サブクラス、アロタイプのバリアントである；
２８．実施形態２４中の半減期延長ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長い抗体、抗体のフラグメント、ヒト血清アルブミン、または任意の他のヒトタンパク質である。

【実施例】

【0150】

実施例１：抗補体タンパク質（ＡＣＰ）の発現および精製
補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）およびＦｃドメインを含む一連の融合タンパク質を産生するために、種々のＣＩＤをコードするｃＤＮＡを合成し、ＩｇＧ１ ＦｃドメインのＮ末端（図１Ａ中のＡＣＰ−１〜ＡＣＰ−５を参照のこと）またはＣ末端（図１Ａ中のＡＣＰ−６〜ＡＣＰ−１０を参照のこと）に融合した。ＣＩＤは、ヒトＣＲ１の細胞外領域の一部である。特に、ＡＣＰ−１およびＡＣＰ−６のＣＩＤ−ＷＴは野生型ヒトＣＲ１ ＳＣＲ１−３であり；ＡＣＰ−２およびＡＣＰ−７のＣＩＤ−ＫＮはアミノ酸置換変異Ｎ２９ＫおよびＤ１０９Ｎを有するヒトＣＲ１ ＳＣＲ１−３であり；ＡＣＰ−３およびＡＣＰ−８のＣＩＤ−ＹＤはアミノ酸置換変異Ｓ３７ＹおよびＧ７９Ｄを有するヒトＣＲ１ ＳＣＲ１−３であり；ＡＣＰ−４およびＡＣＰ−９のＣＩＤ−ＫＹＤＮはアミノ酸置換変異Ｎ２９Ｋ、Ｓ３７Ｙ、Ｇ７９Ｄ、およびＤ１０９Ｎを有するヒトＣＲ１ ＳＣＲ１−３であり；ＡＣＰ−５およびＡＣＰ１０のＣＩＤ−ＮＴはヒトＣＲ１ ＳＣＲ８−１０であった（図１Ａ）。合成ＣＩＤ ｃＤＮＡおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメインを、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＣＩ−ｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ１８４１）にライゲーションした。６グリシン残基の短い可動性ペプチドを、ＣＩＤとＦｃドメインとの間で使用した。全Ｆｃ融合タンパク質は、ＡＣＰの細胞外分泌を可能にするためにＮ末端にシグナルペプチドＳＰ２を含んでいた。

【0151】

構築されたＡＣＰ−１〜ＡＣＰ−１０のプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ一過性にトランスフェクションした。ＡＣＰが分泌された細胞培養培地をトランスフェクションの７２時間後に採取し、各ＡＣＰをプロテインＡクロマトグラフィによって精製した。簡潔に述べれば、分泌されたＡＣＰを含む培養上清を、プロテインＡアガロースビーズと一晩混合後、ポリプロピレンカラムにアプライした。ビーズを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で洗浄後、溶離緩衝液（０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．５）でＡＣＰを溶離し、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。溶離されたＡＣＰを濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析後、ＢＣＡアッセイによって最終タンパク質濃度を決定した。各単離ＡＣＰの純度は９０％超と決定された。各精製ＡＣＰ−６（レーン５）、ＡＣＰ−７（レーン４）、ＡＣＰ−８（レーン３）、ＡＣＰ−９（レーン２）、およびＡＣＰ−１０（レーン１）タンパク質の２μｇサンプルを、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした（図２Ａ）。二量体Ｆｃ融合タンパク質の分子量は約９４ｋＤであった。

【0152】

ＤＡＦ ＳＣＲ２−４、ＭＣＰ ＳＣＲ２−４、Ｈ因子ＳＣＲ１−４、またはＣ４ＢＰＡ ＳＣＲ１−３がＣＩＤとしてＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合されたＡＣＰを、類似の様式で構築し、発現し、精製した。

【0153】

実施例２：ＡＣＰによる古典的補体経路の阻害
ＣＨ５０アッセイを使用して、古典的補体経路の活性度を定量した。このアッセイは、古典的経路の血清補体成分（すなわち、サンプル中に存在する）がウサギ抗ヒツジ赤血球抗体でプレコーティングされたヒツジ赤血球（ＥＡ、抗体感作ヒツジ赤血球、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号Ｂ２００）を溶解する機能を決定する。ＥＡを、例えば、試験血清、マグネシウムイオン、およびカルシウムイオンとインキュベーションする場合、補体の古典的経路が活性化され、溶血する。固定容積の最適に感作されたＥＡを各血清希釈物に添加する。インキュベーション後、混合物を遠心分離し、溶血度を、上清中に放出されたヘモグロビンの約５４０ｎｍの吸光度の測定によって定量する。補体活性量を、試験血清の種々の希釈物がＥＡを溶解する能力の試験によって決定する。アッセイの結果を、標準的な条件下で所定数の赤血球の５０％を溶解するのに必要な血清希釈物の逆数として示す。

【0154】

ＣＨ５０アッセイは、古典的補体経路の任意の成分の減少、非存在、および／または不活性に感受性を示すので、このアッセイを使用してＡＣＰ−６、−７、−９、および−１０が古典的経路の補体活性化を阻害する能力を評価した。このアッセイのために、３７℃で１時間のインキュベーション後に１×１０^７ＥＡ／ｍｌの９０％を溶解した正常ヒト血清の希釈物（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号ＮＨＳ）を最初に決定した。アッセイを、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むＧＶＢ^＋＋緩衝液（０．１％ゼラチン、５ｍＭベロナール、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＮａＮ_３（ｐＨ７．３））中で行った。古典的補体経路の阻害を、ＥＡの９０％を溶解することができる正常ヒト血清の希釈物を０〜５００ｎＭの融合タンパク質ＡＣＰ−６、ＡＣＰ−７、ＡＣＰ−９、またはＡＣＰ−１０と３７℃で１時間混合することによって活性化した。次いで、ＥＡの溶血を、血清およびＥＡの１時間のインキュベーション後にＯＤ５４１ｎｍでの吸収の測定によってアッセイした。データを、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｉｎｃ．）を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析した。

【0155】

融合タンパク質の存在下でのＥＡの溶血率の分析により、ヒトＣＲ１ ＳＣＲ１−３ドメインがＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端に融合したＡＣＰ−６が１６．２ｎＭのＥＣ５０で補体活性を強く阻害したことが証明された（図３Ａ、黒円）。ヒトＣＲ１ ＳＣＲ１−３ Ｎ２９Ｋ／Ｄ１０９ＮバリアントをＩｇＧ１ ＦｃのＣ末端に融合したＡＣＰ−７は、１．６ｎＭのＥＣ５０まで阻害効果を１０倍有意に増強させた（図３Ａ、黒四角）。ヒトＣＲ１ ＳＣＲ１−３ Ｎ２９Ｋ／Ｄ１０９Ｎ Ｓ３７Ｙ／Ｇ７９ＤバリアントをＩｇＧ１のＣ末端に融合したＡＣＰ−９は、阻害活性を０．６ｎＭのＥＣ５０までさらに２．７倍増加させた（図３Ａ、黒三角）。対照的に、ヒトＣＲ１ ＳＣＲ８−１０をＩｇＧ１のＣ末端に融合したＡＣＰ−１０は５００ｎＭまでに補体活性のいかなる阻害も示さなかった（図３Ａ、逆三角）。

【0156】

ＤＡＦ ＳＣＲ２−４、ＭＣＰ ＳＣＲ２−４、Ｈ因子ＳＣＲ１−４、またはＣ４ＢＰＡ ＳＣＲ１−３ ＣＩＤを含むＡＣＰによる古典的補体経路の阻害を、同様に評価する。

【0157】

実施例３：ＡＣＰによる第二補体経路の阻害
活性化にマグネシウムイオンおよびカルシウムイオンの両方が必要な古典的およびレクチン補体経路と対照的に、第二補体経路の活性化にはマグネシウムイオンのみを必要とする。したがって、ＡＣＰの存在下での第二経路補体活性を定量するために、ウサギ赤血球（Ｅｒ）を血清、０〜５００ｎＭ ＡＣＰ、５ｍＭ Ｍｇ^２＋、および５ｍＭ ＥＧＴＡ（カルシウムイオンと優先的にキレート化する）とインキュベーションするように上記アッセイを修正した。

【0158】

このアッセイのために、１．２５×１０^７ウサギ赤血球／ｍｌ（Ｅｒ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号Ｂ３００）の９０％を溶解する正常ヒト血清（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号ＮＨＳ）の希釈物を、３７℃で３０分間のインキュベーション後に最初に決定した。アッセイを、５ｍＭのＭｇＣｌ_２および５ｍＭのＥＧＴＡを含むＧＶＢ^０緩衝液（０．１％ゼラチン、５ｍＭベロナール、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＮａＮ_３（ｐＨ７．３））中で行った。第二補体経路の阻害を、Ｅｒの９０％を溶解すべき正常ヒト血清の希釈物を０〜５００ｎＭのＦｃ融合タンパク質ＡＣＰ−６、ＡＣＰ−７、ＡＣＰ−９、またはＡＣＰ−１０と３７℃で１時間混合することによって開始した。次いで、Ｅｒの溶血を、血清およびＥｒの３０分間のインキュベーション後にＯＤ４１２ｎｍでの吸収の測定によってアッセイした。データを、Ｐｒｉｓｍ４を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析した。

【0159】

融合タンパク質の存在下でのＥＡの溶血率（％）の分析により、ＡＣＰ−６が３１９．９ｎＭのＥＣ５０で非常に低い阻害活性を示したことが証明された（図３Ｂ、黒円）。ＡＣＰ−７は、１２７．０ｎＭのＥＣ５０に阻害効果を改善した（２．５倍）（図３Ｂ、黒四角）。ＡＣＰ−９は、３１．９ｎＭのＥＣ５０へのさらに高い阻害効果を示した（すなわち、野生型配列（ＡＰＣ−６）の１０倍）（図３Ｂ、黒三角）。対照的に、ＡＣＰ−１０は、５００ｎＭまでに補体活性のいかなる効果も示さなかった（図３Ｂ、逆三角）。

【0160】

ＤＡＦ ＳＣＲ２−４、ＭＣＰ ＳＣＲ２−４、Ｈ因子ＳＣＲ１−４、またはＣ４ＢＰＡ ＳＣＲ１−３ ＣＩＤを含むＡＣＰによる第二補体経路の阻害を、同様に評価した。

【0161】

実施例４：補体経路およびＶＥＧＦ経路の両方を阻害した二重特異性タンパク質ＡＣＶＰの発現および精製
補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、およびＦｃドメイン（すなわち、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域）を含む一連の二重特異性融合タンパク質を産生した（図１Ｂ）。二重特異性融合タンパク質のために使用したＶＩＤは、ＶＥＧＦＲ１の第２のＩｇ様ドメインおよびＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇ様ドメインのＶＥＧＦＲ１＿Ｄ２−ＶＥＧＦＲ２＿Ｄ３融合物であった（すなわち、アフリベルセプトとしても公知のＶＥＧＦ−ｔｒａｐ−ｅｙｅに類似する）（例えば、Ｆｒａｍｐｔｏｎ（２０１２）． Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ ２９：８３９−４６およびＯｈｒら（２０１２）．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１３：５８５−９１を参照のこと）。融合タンパク質ＡＣＶＰ−１をコードする核酸を、ＡＣＰ−９のＮ末端でＳＰ２シグナルペプチドの下流のＶＩＤをコードする核酸をプラスミドｐＶ１３１に挿入することによって構築した。構築されたＡＣＶＰ−１プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクションした。分泌されたＡＣＶＰ−１を含む細胞培養培地をトランスフェクションの７２時間後に採取し、タンパク質をプロテインＡクロマトグラフィによって精製した。簡潔に述べれば、分泌されたＡＣＶＰ−１を含む培養上清を、プロテインＡアガロースビーズと一晩混合後、ポリプロピレンカラムにアプライした。ビーズを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で洗浄後、溶離緩衝液（０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．５）でＡＣＶＰ−１を溶離し、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。溶離されたタンパク質を濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析後、ＢＣＡアッセイによって最終タンパク質濃度を決定した。各単離ＡＣＶＰ−１の純度は９０％超と決定された。精製ＡＣＶＰ−１の２μｇサンプル（レーン１および３）を、還元条件下（レーン３および４）または非還元条件下（レーン１および２）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での泳動によって精製ＡＣＰ−９（レーン２および４）と比較した（図２Ｂ）。二量体ＡＣＶＰ−１の分子量は約１３９ｋＤであった。

【0162】

ＡＣＶＰ−１のＦｃドメイン、ＣＩＤ、およびＶＩＤの位置を、相互に関連させて再構成する。さらに、別のＣＩＤ（ＡＣＰ中に存在するものなど）および別のＶＩＤを使用する。上記のように、図１Ｂに示す任意のＡＣＶＰをコードする核酸構築物を調製し、哺乳動物細胞中で発現させる。同様に、本明細書中に記載のように、かかるＡＣＶＰをプロテインＡクロマトグラフィによって精製する。

【0163】

ＤＡＦ ＳＣＲ２−４、ＭＣＰ ＳＣＲ２−４、Ｈ因子ＳＣＲ１−４、またはＣ４ＢＰＡ ＳＣＲ１−３ ＣＩＤを含むＡＣＶＰを構築する。

【0164】

実施例５：ＡＣＶＰのＶＥＧＦへのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合
ＡＣＶＰがＶＥＧＦに直接結合するかどうかを決定するためにＥＬＩＳＡを行った。簡潔に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに、１００ｎｇ ＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）をコーティングした。次いで、０〜１０ｎＭの精製ＡＣＶＰを各ウェルに添加し、１時間インキュベーションした。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む４００μＬ ＰＢＳで３回の洗浄後、１００μｌの抗Ｆｃ ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ０１７０−１ＭＬ）の５０００倍希釈物を、各ウェルに添加して１時間インキュベーションした。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む４００μＬ ＰＢＳでの３回の洗浄後、ＴＭＢ基質反応停止剤（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５８１４−１００ＭＬ）を各ウェルに添加し、４５０ｎｍでのＯＤ吸収を測定した。データを、Ｐｒｉｓｍ４を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析した。図４Ａに示すように、ＡＣＶＰ−１は、０．２２ｎＭのＥＣ５０でＶＥＧＦへの強い結合を示した。

【0165】

溶液中のＡＣＶＰのＶＥＧＦへの結合親和性をより良好に評価するために、５ｐＭのＶＥＧＦ−Ａを、０〜１００ｐＭの精製ＡＣＶＰと希釈緩衝液ＲＤ５Ｋ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＶＥ００）中にて４℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、緩衝液中の遊離ＶＥＧＦ濃度を、ヒトＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＶＥ００）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。ＡＣＶＰ−１を使用した２つの独立した試験由来のデータを、Ｐｒｉｓｍ４を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析した。図４Ｂに示すように、ＡＣＶＰ−１は、３．４ｐＭの親和性で同一のＶＥＧＦへの強い結合を示した。

【0166】

ＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、およびアバスチンのＶＥＧＦ−Ａへの結合親和性を比較するためにもＥＬＩＳＡを行った。試験したＶＩＤは、ＶＩＤがそのＣ末端に融合したＦｃドメインを有するＡＣＶＰ−１のフラグメントであった。約４０ｐＭのＶＥＧＦ１６５（２９３−ＶＥ）を、１ｎＭの精製されたＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはアバスチンと３７℃で４５分間インキュベーションした。インキュベーション後、遊離ＶＥＧＦを、製造者の説明書にしたがってヒトＶＥＧＦ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＤＹ２９３Ｂ）を使用して検出した。データを、Ｐｒｉｓｍ４を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析した。図４Ｃに示すように、ＡＣＶＰ−１は、ＶＥＧＦに対する親和性（約０．０１ｎＭのＥＣ５０）を示し、この親和性はアバスチンまたはＶＩＤのＶＥＧＦへの結合（それぞれ、約０．７ｎＭのＥＣ５０）の７０倍である。

【0167】

上記のように、他のＡＣＶＰ（例えば、ＣＩＤとしてＤＡＦ ＳＣＲ２−４、ＭＣＰ ＳＣＲ２−４、Ｈ因子ＳＣＲ１−４、またはＣ４ＢＰＡ ＳＣＲ１−３を含む）を、そのＶＥＧＦに結合する能力についてアッセイし、そのＶＥＧＦに対する結合親和性を決定する。

【0168】

実施例６：ＡＣＰまたはＡＣＶＰのＣ３ｂまたはＣ４ｂへのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合
ＡＣＰまたはＡＣＶＰのＣ３ｂまたはＣ４ｂへの結合を、直接Ｅｌｉｓａ実験でアッセイする。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに、１００ｎｇ／ウェルのＣ３ｂまたはＣ４ｂ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．から入手可能）をコーティングする。次いで、図１に示した０〜１μＭの精製ＡＣＰまたはＡＣＶＰを各ウェルに添加し、１時間インキュベーションする。非結合のＣ３ｂまたはＣ４ｂの洗い流した後、１００μｌの抗Ｆｃ ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ０１７０−１ＭＬ）の５０００倍希釈物を、各ウェルに添加して１時間インキュベーションする。洗浄後、ＴＭＢ基質反応停止剤（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５８１４−１００ＭＬ）を添加し、ＯＤ４５０ｎｍでの吸収を測定する。

【0169】

実施例７：ＡＣＰまたはＡＣＶＰによる第二経路コンバターゼのＤＡＡの阻害
第二経路Ｃ３−コンバターゼの崩壊促進活性（ＤＡＡ）をＥＬＩＳＡによって決定する。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに、１μｇ／ｍｌのＣ３ｂ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手可能）を最初にコーティングし、次いで、ブロッキングする。次いで、各ウェルを、４００ｎｇ／ｍｌのＢ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手可能）、２５ｎｇ／ｍｌのＤ因子（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手可能）、および２ｍＭのＮｉＣｌ_２とインキュベーションする。洗浄後、プレート結合Ｃ３ｂＢｂ（Ｎｉ^２＋）複合体を、種々の濃度のＡＣＰまたはＡＣＶＰとインキュベーションする。第２の洗浄後、残存するプレート結合Ｃ３ｂＢｂ（Ｎｉ^２＋）複合体を、ヤギ抗Ｂ因子ポリクローナル抗体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手可能）およびその後のＨＲＰ結合体化ウサギ抗ヤギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）で検出する。洗浄後、ＴＭＢ基質のための停止試薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｓ５８１４−１００ＭＬ）を添加し、ＯＤ４５０ｎｍ吸収を測定する。

【0170】

第二経路Ｃ５−コンバターゼのＤＡＡを、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを１μｇ／ｍｌのＣ３ｂ二量体でコーティングすることを除いて上記のＥＬＩＳＡによって決定する。Ｃ３ｂ二量体を、２ｍｇのＣ３（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から入手可能）を２０μｇのトリプシン（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．から入手可能）を使用して２００μｌのＰＢＳ中にて３７℃で３分間処理することによって生成する。次いで、２００μｇのダイズトリプシンインヒビター（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．から入手可能）で反応停止させる。次いで、メタノールに溶解した１５μｇの０．３４ｍＭビスマレイミドヘキサン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ．から入手可能）を使用した４℃で３日間のチオエステル結合後にＣ３ｂ二量体を形成する。Ｃ３ｂ二量体を、ＳＥＣクロマトグラフィによって精製する。

【0171】

実施例８：ＡＣＶＰによる古典的補体経路の阻害
ＡＣＶＰの古典的補体経路を阻害する能力を、実施例２に記載のようにアッセイした。０．１５ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むＧＶＢ^＋＋緩衝液（０．１％ゼラチン、５ｍＭベロナール、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＮａＮ_３（ｐＨ７．３））中でアッセイを行った。古典的補体経路の阻害を、ＥＡの９０％を溶解することができる正常ヒト血清の希釈物を０〜５００ｎＭのＡＣＶＰ−１と３７℃で１時間混合することによって活性化した。阻害データを、Ｐｒｉｓｍ４を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析した。図５Ａに示すように、二重特異性融合タンパク質ＡＣＶＰ−１は、０．１９ｎＭのＥＣ５０で古典的経路の補体活性化に阻害効果を及ぼす可能性が非常に高かった。

【0172】

他のＡＣＶＰｓ（例えば、ＣＩＤとしてＤＡＦ ＳＣＲ２−４、ＭＣＰ ＳＣＲ２−４、Ｈ因子ＳＣＲ１−４、またはＣ４ＢＰＡ ＳＣＲ１−３を含む）を、その古典的補体経路を阻害する能力を決定するために本明細書中に記載のようにアッセイする。

【0173】

実施例９：ＡＣＶＰによる第二補体経路の阻害
ＡＣＶＰの第二補体経路を阻害する能力を、実施例３に記載のようにアッセイした。５ｍＭのＭｇＣｌ_２および５ｍＭのＥＧＴＡを含むＧＶＢ^０緩衝液（０．１％ゼラチン、５ｍＭベロナール、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＮａＮ_３（ｐＨ７．３））中でアッセイを行った。第二補体経路の阻害を、Ｅｒの９０％を溶解することができる正常ヒト血清の希釈物を０〜５００ｎＭのＡＣＶＰ−１と３７℃で１時間混合することによって開始した。次いで、Ｅｒの溶血を、血清およびＥｒの３０分間のインキュベーション後にアッセイした。阻害データを、Ｐｒｉｓｍ４を使用したＳ字カーブフィッティングによって分析した。図５Ｂに示すように、二重特異性ＡＣＶＰ−１融合タンパク質は、２１．１ｎＭのＥＣ５０で第二経路の補体活性化に阻害効果を及ぼす可能性が非常に高かった。

【0174】

他のＡＣＶＰ（例えば、ＣＩＤとしてＤＡＦ ＳＣＲ２−４、ＭＣＰ ＳＣＲ２−４、Ｈ因子ＳＣＲ１−４、またはＣ４ＢＰＡ ＳＣＲ１−３を含む）を、その第二補体経路を阻害する能力を決定するために上記のようにアッセイする。

【0175】

実施例１０：ＡＣＶＰによるＶＥＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ増殖の阻害アッセイ
ＡＣＶＰを、細胞ベースのアッセイにおいてＶＥＧＦシグナル伝達経路を阻害する能力（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）について試験する。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）は、ＡＣＶＰのＶＥＧＦへの結合によって阻害することができるＶＥＧＦ依存性細胞増殖を証明するためにしばしば使用される。このアッセイでは、ＨＵＶＥＣを、２％ＦＢＳを有する内皮細胞成長培地（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）中で維持する。９６ウェル平底マイクロタイタープレートにコラーゲンをコーティングし、次いで、５０μｌのｌｎＭのＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）および種々の濃度のＡＣＶＰと各ウェル中にて３７℃で１時間インキュベーションする。１時間のインキュベーション後、５０μｌのＨＵＶＥＣ（１×１０^５細胞／ｍｌ）を含むＭｅｄｉｕｍ−１９９（１０％ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加する。５％ＣＯ_２下にて３７℃で７２時間のインキュベーション後、細胞増殖を、１０μｌのＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｉｎｃ．）の各ウェルへの添加によってアッセイする。細胞増殖を、４５０／６５０ｎｍのＯＤ吸収で測定する。

【0176】

例えば、ＡＣＶＰ−１を細胞ベースのアッセイにおいてＶＥＧＦシグナル伝達経路（例えば、ＶＥＧＦ活性の阻害）を阻害する能力を試験し、ＣＩＤおよびＶＩＤのＶＥＧＦ阻害活性と比較した。試験したＶＩＤは、ＶＩＤがそのＣ末端に融合したＦｃドメインを有するＡＣＶＰ−１のフラグメントであった。試験したＣＩＤは、ＣＩＤがそのＮ末端に融合したＦｃドメインを有するＡＣＶＰ−１のフラグメントであった。内皮細胞増殖を測定するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．から入手可能）を、ＥｎｄｏＧＲＯ−ＶＥＧＦ完全培地キットを使用して９６ウェルプレート（４×１０^４細胞／ウェル）中に播種した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中にて０．３ｎＭ ＶＥＧＦ１６５の存在下で３５ｎＭ／ｍｌのＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはＣＩＤとインキュベーションした。コントロールのために、細胞を、ＰＢＳ、２０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ、０．３ｎＭ ＶＥＧＦ１６５を含む２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、または３５ｎＭ／ｍｌのＩｇＧを含む２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭとインキュベーションした。４８時間後、１０μｌ ＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、細胞増殖をマイクロプレートリーダーにて４５０／５７０ｎｍのＯＤ吸収で測定した。スチューデントｔ検定を使用した統計分析は、ＡＣＶＰ−１がＤＭＥＭ＋ＶＥＧＦコントロールと比較してＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖を有意に阻害し（^＊＊ｐ＜０．０１）、ＡＣＶＰ−１の阻害効果がＶＩＤまたはＣＩＤよりも高いことを示した（図６）。

【0177】

実施例１１：ＡＣＶＰはＶＥＧＦＲ２経路を介したＨＵＶＥＣにおけるＥＲＫおよびＡＫＴの活性化を阻害する
ＡＣＶＰを、ＶＥＧＦＲ経路による下流細胞内シグナル伝達の活性化を阻害する能力について試験する。このアッセイでは、ＨＵＶＥＣを３ｎｍｏｌ／ｍｌのＩｇＧ、ＶＩＤ、ＣＩＤ、またはＡＣＶＰで３０分間前処理し、次いで、３ｎｍｏｌ／ｍｌ ＶＥＧＦ_１６５でさらに１０分間刺激する。細胞を採取し、ウェスタンブロットによって分析してＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、またはＶＥＧＦＲ３）、ＡＫＴ、およびＥＲＫリン酸化を評価する。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用する。ブロッキングされた膜を、リン酸化ＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、またはＶＥＧＦＲ３）、ＧＡＰＤＨ（３０００倍希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、リン酸化Ｅｒｋ（ｐ−Ｅｒｋ）、Ｅｒｋタンパク質、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−Ａｋｔ）、およびＡｋｔタンパク質に対する一次抗体にて４℃で一晩探索する。一次抗体の洗い流し後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化した二次抗体を膜に添加し、室温で１時間インキュベーション後、さらに洗浄し、タンパク質をＨＲＰの化学発光基質で視覚化した。

【0178】

例えば、ＡＣＶＰ−１を、ＶＥＧＦＲ２経路を介したＥＲＫおよびＡＫＴの活性化を阻害する能力について試験した。このアッセイでは、ＨＵＶＥＣを３ｎｍｏｌ／ｍｌのＩｇＧ、ＶＩＤ、ＣＩＤ、またはＡＣＶＰ−１で３０分間前処理し、次いで、３ｎｍｏｌ／ｍｌ ＶＥＧＦ_１６５でさらに１０分間刺激した。試験したＶＩＤは、ＶＩＤがそのＣ末端に融合したＦｃドメインを有するＡＣＶＰ−１のフラグメントであった。試験したＣＩＤは、ＣＩＤがそのＮ末端に融合したＦｃドメインを有するＡＣＶＰ−１のフラグメントであった。細胞を採取し、ウェスタンブロットによって分析してＶＥＧＦＲ２、ＡＫＴ、およびＥＲＫリン酸化を評価した。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。ブロッキングされた膜を、リン酸化ＶＥＧＦＲ２（１０００倍希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＡＰＤＨ（３０００倍希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、リン酸化Ｅｒｋ（ｐ−Ｅｒｋ）、Ｅｒｋタンパク質、リン酸化ＡＫＴ（ｐ−Ａｋｔ）、およびＡｋｔタンパク質に対する一次抗体にて４℃で一晩探索した。一次抗体の洗い流し後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化した二次抗体を膜に添加し、室温で１時間インキュベーション後、さらに洗浄し、タンパク質をＨＲＰの化学発光基質で視覚化した。図７に示すように、ＡＣＶＰ−１およびＶＩＤは、ＶＥＧＦ_１６５誘導性のＶＥＧＦＲ２、ＥＲＫ、およびＡＫＴリン酸化を阻害し、ＣＩＤはＥＲＫリン酸化を阻害した。

【0179】

実施例１２：マウスにおけるＡＣＶＰによるレーザー誘導ＣＮＶの阻害
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、湿性加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の一般的な症状である。ＣＮＶは、眼の脈絡膜を起源とする新規の血管がブルッフ膜の破壊または欠損によって成長し、網膜下色素上皮または網膜下腔に侵入する場合に起こる。この過程は、瘢痕組織を形成し、最終的には失明を引き起こす。動物モデルとしてのレーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、湿性ＡＭＤ処置を試験するために一般的に使用される。例えば、このモデルを使用して、ＡＣＶＰがＣＮＶを阻害する能力を評価することができる。

【0180】

マウスのレーザー誘導ＣＮＶを使用して、ＡＣＶＰおよびＡＣＰがＣＮＶを阻害する能力を試験する。このアッセイでは、マウスを塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、１％トロピカミドで散瞳させ、５３２ｎｍダイオードレーザー光凝固による３つの熱傷を各網膜に送達した。網膜後極の９時、１２時、および３時の位置に熱傷を作製する。レーザー使用時にブルッフ膜の破損を示す泡の生成がＣＮＶの重要な因子である。ＡＣＶＰまたはＡＣＰがレーザー誘導ＣＮＶの形成を防止する能力を試験するために、４μｇのＡＣＶＰまたはＡＣＰを、レーザー熱傷の同日に硝子体内注射する。レーザー傷害の１４日後、マウスに５０ｍｇフルオレセイン標識デキストランを静脈内注射し、安楽死させる。次いで、マウスの眼を切開して脈絡膜伸展標本を作製し、ＣＮＶ病変サイズの変化を評価する。

【0181】

実施例１３：ＡＣＶＰによるサルにおけるレーザー誘導ＣＮＶの阻害
サルにおけるレーザー誘導ＣＮＶを使用して、ＡＣＶＰおよびＡＣＰがＣＮＶを阻害する能力を試験する。簡潔に述べれば、５３２ｎｍダイオードレーザー光凝固による６〜９個の熱傷を、各眼内の黄斑周囲に送達させる。０．１〜０．５ｍｇの投薬量のＡＣＶＰをレーザー熱傷の同日に硝子体内注射する。およそ２０日後、動物を静脈内２．５％可溶性ペントバルビトン（１ｍＬ／ｋｇ）で鎮静させる。開眼状態を維持し、アクセス可能なように眼瞼を固定する。眼底カメラを使用してカラー写真を最初に撮影する。最初の撮影後、フルオレセイン色素（２０％フルオレセインナトリウム；０．０５ｍＬ／ｋｇ）を下肢静脈を介して注射する。色素注射後のいくつかの時点で（動脈相、初期動静脈相、およびいくつかの後期動静脈相が含まれる）写真撮影する。ＣＮＶ病変に関連するフルオレセインの漏出をモニタリングする。

【0182】

例えば、レーザー誘導ＣＮＶモデルを３〜６歳の範囲のアカゲザルで準備した。全部で８匹のサルを以下の４つの投与群に分類した：１）ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）；２）ＡＣＶＰ１（０．５ｍｇ／眼）；３）ＶＩＤ（０．５ｍｇ／眼）；または４）ＣＩＤ（０．５ｍｇ／眼）。群あたり全部で２匹のサル（４つの眼）が存在した。試験したＶＩＤは、ＶＩＤがそのＣ末端に融合したＦｃドメインを有するＡＣＶＰ−１のフラグメントであった。試験したＣＩＤは、ＣＩＤがそのＮ末端に融合したＦｃドメインを有するＡＣＶＰ−１のフラグメントであった。およそ６〜９個の５３２ｎｍダイオードレーザー光凝固による熱傷を、眼内の黄斑周囲に送達させた。ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）または０．５ｍｇの投薬量のＡＣＶＰ−１、ＶＩＤ、またはＣＩＤを、レーザー熱傷の２１日後に硝子体内注射した。投与１４日後、動物を静脈内２．５％可溶性ペントバルビトン（１ｍｌ／ｋｇ）で鎮静させる。開眼状態を維持し、アクセス可能なように眼瞼を固定した。眼底カメラを使用してカラー写真を最初に撮影した。最初の撮影後、フルオレセイン色素（２０％フルオレセインナトリウム；０．０５ｍＬ／ｋｇ）を下肢静脈を介して注射した。色素注射の５分後に写真撮影して（動脈相、初期動静脈相、およびいくつかの後期動静脈相が含まれる）、ＣＮＶ病変に関連するフルオレセインの漏出をモニタリングした。写真中の斑点領域を漏出領域として測定した。斑点漏出写真の分析により、ビヒクル処置群の平均漏出領域は、注射１４日後にＰＢＳ注射前の漏出領域と比較して大きいことが示された（図８Ａ）。対照的に、ＡＣＶＰ−１（図８Ｂ）、ＶＩＤ（図８Ｃ）、またはＣＩＤ（図８Ｄ）のいずれかを注射したサルの漏出は、注射１４日後に注射前の漏出領域と比較して減少した。スチューデントｔ検定を使用した統計分析は、斑点数および漏出領域はＡＣＶＰ−１またはＶＩＤで処置された動物において投与前よりも有意に小さかったことを示した（表３）。ＣＩＤ処置動物では、漏出領域も投与前より有意に小さかった（表３）。全体的に見て、ＡＣＶＰ−１は、レーザー誘導ＣＮＶの阻害においてＶＩＤおよびＣＩＤより有効であった。

【表3】

【0183】

実施例１４：異種移植マウスにおけるＡＣＰおよびＡＣＶＰによるヒト腫瘍成長の阻害
種々のヒト癌細胞（ヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６４）およびヒト結腸直腸癌ＬｏＶｏ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２９）など）を使用して、ヌードマウスにおける異種移植モデルを確立することができる。腫瘍成長に対するＡＣＰおよびＡＣＶＰの阻害効果を評価するために、種々の濃度の各ＡＣＰおよび各ＡＣＶＰ（例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を、腫瘍細胞移植後にマウスに週２回静脈内投与する。腫瘍成長を７週目まで毎週測定する。

【0184】

実施例１５：マウスおよびサルにおけるＡＣＰおよびＡＣＶＰの薬物動態学的評価
１０〜４０ｍｇ／ｋｇの投薬量の各ＡＣＰおよびＡＣＶＰを、マウスまたはサルに皮下注射または静脈内注射によって投与する。血清サンプルを、１５日目まで注射後の異なる時点で採取する。血清サンプル中の各ＡＣＰまたはＡＣＶＰ融合タンパク質の濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、および半減期延長ドメインを含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が補体活性化およびＶＥＧＦ活性を阻害する、融合タンパク質。
（項目２）
前記ＣＩＤが、ＣＲ１、Ｈ因子、Ｃ４−ＢＰ、ＤＡＦ、およびＭＣＰからなる群から選択されるヒト補体調節タンパク質の少なくとも１つのショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記ＣＩＤが、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１または２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
前記ＶＩＤがヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部を含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目５）
前記ＶＩＤがヒトＶＥＧＦＲ−１の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメイン３を含む、項目４に記載の融合タンパク質。
（項目６）
前記ＶＩＤが、配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列、または配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目７）
前記半減期延長ドメインが免疫グロブリンＦｃ領域を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目８）
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒトＦｃである、項目７に記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記Ｆｃ領域が、配列番号７もしくは３９のアミノ酸配列、または配列番号７もしくは３９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目７に記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記融合タンパク質がドメイン間にペプチドリンカーをさらに含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記ペプチドリンカーが、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記融合タンパク質が、（１）ＶＩＤ、Ｆｃ、ＣＩＤ；（２）ＣＩＤ、Ｆｃ、ＶＩＤ；（３）ＣＩＤ、ＶＩＤ、Ｆｃ；（４）ＶＩＤ、ＣＩＤ、Ｆｃ；（５）Ｆｃ、ＶＩＤ、ＣＩＤ；および（６）Ｆｃ、ＣＩＤ、ＶＩＤからなる群から選択されるＮ末端からＣ末端への順序で該ＶＩＤ、ＣＩＤ、およびＦｃを含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１３）
Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＥＧＦ阻害ドメイン（ＶＩＤ）、免疫グロブリンＦｃ領域、および補体阻害ドメイン（ＣＩＤ）を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質が補
体活性化およびＶＥＧＦ活性を阻害する、融合タンパク質。
（項目１４）
前記ＣＩＤが、配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１〜６および１３〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記ＶＩＤがヒトＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインの一部を含む、項目１３または１４に記載の融合タンパク質。
（項目１６）
前記ＶＩＤがヒトＶＥＧＦＲ−１の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメイン３を含む、項目１５に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
前記ＶＩＤが配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列、または配列番号１１もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒトＦｃである、項目１３〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
前記Ｆｃ領域が配列番号７もしくは３９の配列、または配列番号７もしくは３９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１８に記載の融合タンパク質。
（項目２０）
前記融合タンパク質がドメイン間にペプチドリンカーをさらに含む、項目１３〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２１）
前記ペプチドリンカーがＦｃ領域と前記ＣＩＤとの間に存在する、項目２０に記載の融合タンパク質。
（項目２２）
前記ペプチドリンカーが配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目２０または２１に記載の融合タンパク質。
（項目２３）
前記融合タンパク質が、配列番号１２もしくは４０のアミノ酸配列、または配列番号１２もしくは４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１３に記載の融合タンパク質。
（項目２４）
融合タンパク質であって、項目１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養し、該宿主細胞によって産生された融合タンパク質を回収することによって産生された融合タンパク質。
（項目２５）
各融合タンパク質が項目１３〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、２つの融合タンパク質を含む二量体融合タンパク質。
（項目２６）
項目１〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
（項目２７）
前記融合タンパク質が二量体形態である、項目２６に記載の薬学的組成物。
（項目２８）
項目１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（項目２９）
項目１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター。
（項目３０）
項目２８に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目３１）
融合タンパク質の産生方法であって、項目１〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、該融合タンパク質を産生する条件下で培養する工程、および該宿主細胞によって産生された該融合タンパク質を回収する工程を含む、方法。
（項目３２）
前記融合タンパク質が細胞培養培地から回収され、そして精製される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記宿主細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞である、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３４）
回収された前記融合タンパク質が二量体である、項目３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
炎症性疾患、自己免疫疾患、眼の疾患または癌を有する被験体の処置方法であって、有効量の項目１〜２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目３６）
前記被験体が、関節リウマチ、乾癬、黄斑変性、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞、または角膜移植を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記黄斑変性が湿性加齢性黄斑変性または乾性加齢性黄斑変性である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、または網膜芽細胞腫を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記疾患処置のための第２の治療剤を投与する工程をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
項目１〜２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含むキット。
（項目４１）
被験体の炎症性疾患、自己免疫疾患、眼の疾患または癌の処置のための融合タンパク質の使用説明書を含む添付文書をさらに含む、項目３１に記載のキット。

【0185】

配列

【化14-1】

【化14-2】

【化14-3】

【化14-4】

【化14-5】

【化14-6】

【化14-7】

【化14-8】

【化14-9】

【化14-10】

【化14-11】

【化14-12】

【化14-13】

【化14-14】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]