特許 6140841 ＶＥＧＦＲ１抗体についての治療的使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6140841

(24)【登録日】2017年5月12日

(45)【発行日】2017年5月31日

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦＲ１抗体についての治療的使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20170522BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20170522BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20170522BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20170522BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170522BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   C07K16/28

   C07K16/40

   C12P21/08

   A61K39/395 M

   A61P13/12

   A61P43/00 111

   A61K39/395 D

【請求項の数】9

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2015-556270(P2015-556270)

(86)(22)【出願日】2014年3月11日

(65)【公表番号】特表2016-511758(P2016-511758A)

(43)【公表日】2016年4月21日

(86)【国際出願番号】US2014022925

(87)【国際公開番号】WO2014150314

(87)【国際公開日】20140925

【審査請求日】2015年7月31日

(31)【優先権主張番号】61/788,870

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147131

【弁理士】

【氏名又は名称】今里 崇之

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ブレイヤー，マシュー ダグラス

(72)【発明者】

【氏名】リウ，リン

(72)【発明者】

【氏名】キ，ツォンフア

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２０２４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nephrol. Dial. Transplant.，２００３年，Vol.18，pp.1427-1430

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＥＧＦＲ１抗体を含む糖尿病性ネフロパシーの治療のための医薬組成物であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドであり、かつ、前記ＶＥＧＦＲ１抗体はＶＥＧＦＲ１に特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａレベルを増加させることにより腎臓におけるＶＥＧＦＲ２リン酸化を増加させる、前記組成物。

【請求項2】

前記糖尿病性ネフロパシーがステージ３またはステージ４である、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項3】

ＶＥＧＦＲ１抗体を含む糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされるタンパク尿を減少させるための医薬組成物であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドであり、かつ、前記ＶＥＧＦＲ１抗体はＶＥＧＦＲ１に特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａレベルを増加させることにより腎臓におけるＶＥＧＦＲ２リン酸化を増加させる、前記組成物。

【請求項4】

ＶＥＧＦＲ１抗体を含む糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされるアルブミン尿を減少させるための医薬組成物であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドであり、かつ、前記ＶＥＧＦＲ１抗体はＶＥＧＦＲ１に特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ａレベルを増加させることにより腎臓におけるＶＥＧＦＲ２リン酸化を増加させる、前記組成物。

【請求項5】

前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、配列番号１１のポリペプチドであるＬＣＶＲおよび配列番号５のポリペプチドであるＨＣＶＲを含む抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む抗体であり、前記ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、前記ＨＣが配列番号６のポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む抗体であり、前記ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、前記ＨＣが配列番号７のポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各々の重鎖が配列番号６のポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各々の重鎖が配列番号７のポリペプチドである、請求項１〜５および７のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は医薬の分野に関する。より特には、本発明は、ＶＥＧＦＲ１抗体を用いて、患者における慢性腎疾患（ＣＫＤ）および／またはより特には、糖尿病性ネフロパシー（糖尿病性腎疾患としても知られている）を治療するのに有用であり得る方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血管内皮成長因子受容体−１（Ｆｌｔ−１としても知られているＶＥＧＦＲ−１、配列番号１）は、ＶＥＧＦファミリータンパク質についての３つのチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３）の１つである。ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、および胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）を含む構造的に関連した糖タンパク質のグループからなる。ＶＥＧＦタンパク質は３つのＶＥＧＦ受容体の細胞外免疫グロブリン様ドメインに選択的に結合することによって多くの生物学的および病理学的役割を果たす。ＶＥＧＦ−ＡはＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対して高親和性を有するのに対して、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰｌＧＦはＶＥＧＦＲ１に選択的に結合する。それぞれリガンドおよび受容体としてＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ２は血管新生生物学的経路のシグナル伝達において主要な役割を果たす。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ１の可溶性形態（ｓＦｌｔ−１としても知られている）は、デコイ受容体の役割を果たすいくつかのグループによって、ＶＥＧＦ−Ａを隔離し、それが、その多くの血管新生促進パートナーであるＶＥＧＦＲ２へ結合することを防ぐことが示唆されている。

【0003】

ＶＥＧＦシグナル伝達は、脈管形成、血管新生、血管恒常性、炎症に不可欠であるので、癌、糖尿病性合併症、心血管疾患、および慢性炎症を含む、いくつかのヒト疾患に関連している。ＶＥＧＦ系はまた、腎機能を維持するのに重要な役割を果たす。ＶＥＧＦ−Ａは腎臓に対する保護効果を有することがいくつかの研究において示されているが、腎臓はまた、ＶＥＧＦ−Ａの効果に対して非常に感受性が強いことが示されている。腎損傷は、ＶＥＧＦ−ＡレベルがヒトにおけるＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体により抑制される場合（非特許文献１）、また、ＶＥＧＦ−Ａレベルが腎臓糸球体内でＶＥＧＦ−Ａを過剰発現するマウスにおいて向上する場合（非特許文献２および非特許文献３）に発生することが示されている。

【0004】

ＶＥＧＦ−Ａの生物学的研究から、ＶＥＧＦ−Ａによる処置は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、または敗血症を有する患者に有害である可能性があることが示唆されており、これらは全てＣＫＤの原因または合併症のいずれかの状態である。増加したＶＥＧＦ−Ａレベルはまた、糖尿病性ネフロパシーに関連している（非特許文献４および非特許文献５）。ＶＥＧＦ−Ａ抗体によるＶＥＧＦ−Ａの減少は、両方、糖尿病性ネフロパシーについてのマーカーである、糸球体肥大およびアルブミン尿を改善する２型糖尿病のマウスモデルにおいて示された（非特許文献６および非特許文献７）。

【0005】

ｓＦｌｔ−１はＶＥＧＦＲ１遺伝子のスプライシングバリアントから生じるＶＥＧＦＲ１の分泌形態である。ｓＦｌｔ−１は保存されたリガンド結合活性を有し、ＶＥＧＦＲ−２を介するシグナル伝達に利用可能であるＶＥＧＦ−Ａの量に関係がある。糖尿病性ネフロパシーにおける活性ｓＦｌｔ−１の量が研究されているが、その結果は一貫性がない。

【0006】

ＣＫＤは腎機能の進行性喪失によって特徴付けられる。糖尿病性ネフロパシー（糖尿病性腎疾患としても知られている）はＣＫＤの１つの種類であり、糖尿病の慢性合併症である。増加したアルブミン尿および腎機能の漸進的喪失はヒト糖尿病性ネフロパシーにおける原発性発現である。減少した腎機能の結果、増加した血中クレアチニンおよび血中尿素窒素（ＢＵＮ）が生じる。糖尿病、高血圧、および糸球体腎炎は、ＣＫＤの最も一般的な原因である。ＣＫＤ患者は、時間と共にアルブミン尿、タンパク尿、血清クレアチニン、および腎臓組織病理学的損傷の増加を経験する。ＣＫＤの悪化により、多くの患者は末期腎不全（ＥＲＳＤ）へと進行し、透析または腎臓移植のいずれかを必要とする。ＥＲＳＤ患者の約４５％はその患者らのＣＫＤの原因として２型糖尿病を有すると推定されている。糸球体濾過率（ＧＦＲ）が患者についてのＣＫＤの重症度を分類するために使用され、より低いＧＦＲはより重症のＣＫＤに対応する。ＧＦＲが低下している患者におけるその率の回復はＥＳＲＤの発生を遅延または予防すると予想される。アンジオテンシン変換酵素阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストはＣＫＤからＥＲＳＤへの進行を遅延させるための治療の現在の標準として使用されるが、これらは、透析までの最終的な進行を停止させるのに不十分であることが示されている。

【0007】

特許文献１は、多発性癌異種移植モデルにおけるＶＥＧＦＲ１抗体の活性を開示している。特定の非腫瘍性病変、血管新生疾患、例えばインスリン依存性糖尿病および自己免疫性腎炎に対する活性も開示されていた。しかしながら、これまで、ＶＥＧＦＲ１を標的化する抗体は、糖尿病性ネフロパシーまたは他の形態の進行性ＣＫＤのための治療的使用について教示も示唆もされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２００６／０５５８０９号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｅｒｅｍｉｎａら （２００８） ＮＥＪＭ ３５８：１１２９

【非特許文献2】Ｖｅｒｏｎら （２０１０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ ７７：９８９

【非特許文献3】Ｈａｋｒｏｕｓｈら （２００９） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７５：１８８３

【非特許文献4】Ｃｈａら （２０００） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ Ｓｕｐｐ ７７：Ｓ１０４

【非特許文献5】Ｈｏｖｉｎｄら （２０００） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ Ｓｕｐｐ ７５：Ｓ５６

【非特許文献6】ｄｅ Ｖｒｉｅｓｅら （２００１） Ｊ ＡＭ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｏｌ １２：９９３

【非特許文献7】Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇら （２００２） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１：３０９０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

ＣＫＤを治療するための代替の方法を提供する必要性が存在する。特に、糖尿病性ネフロパシーを治療するための方法を提供する必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

したがって、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患が糖尿病によって引き起こされる、方法を提供する。より特には、本発明の方法は慢性腎疾患のステージ３またはステージ４における患者のために提供する。

【0012】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患が糖尿病性ネフロパシーである、方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患は巣状分節状糸球体硬化症である、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患がネフローゼ症候群である、方法を提供する。

【0013】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるタンパク尿を減少させる方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるタンパク尿を減少させる方法であって、タンパク尿が慢性腎疾患によって引き起こされる、方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるタンパク尿を減少させる方法であって、タンパク尿は糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、方法を提供する。

【0014】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるアルブミン尿を減少させる方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるアルブミン尿を減少させる方法であって、アルブミン尿が慢性腎疾患によって引き起こされる、方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるアルブミン尿を減少させる方法であって、アルブミン尿が糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、方法を提供する。

【0015】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における血清クレアチニンの増加によって反映される糸球体濾過率（ＧＦＲ）の損失を減少させる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、患者における腎臓組織病理学的損傷を予防する方法であって、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0016】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における血中尿素窒素（ＢＵＮ）の増加の割合を遅延させる方法を提供する。

【0017】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるＥＳＲＤへの進行の速度を遅延させる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるＥＳＲＤの進行を遅延させる方法であって、ＥＳＲＤへの進行が少なくとも１２ヶ月遅延する、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるＥＳＲＤへの進行を遅延させる方法であって、ＥＳＲＤへの進行は少なくとも２４ヶ月遅延する、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における血清クレアチニンが倍になる時間を遅延させる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるＧＦＲが３０％低下する時間を延ばす方法を提供する。

【0018】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、遊離（未結合）ｓＦＬｔ−１を減少させる方法であって、その患者は慢性腎疾患を有する、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、他のタンパク質にシグナル伝達および／または結合するｓＦＬｔ−１の能力を減少させる方法であって、その患者は慢性腎疾患を有する、方法を提供する。

【0019】

一実施形態において、本発明は、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、慢性腎疾患は糖尿病によって引き起こされる、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。より特には、本発明は、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、慢性腎疾患はステージ３またはステージ４である、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0020】

一実施形態において、本発明は、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、慢性腎疾患は糖尿病性ネフロパシーである、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、慢性腎疾患は巣状分節性糸球体硬化症である、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、慢性腎疾患はネフローゼ症候群である、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0021】

一実施形態において、本発明は、タンパク尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、タンパク尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、タンパク尿は慢性腎疾患によって引き起こされる、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、タンパク尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、タンパク尿は糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0022】

一実施形態において、本発明は、アルブミン尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、アルブミン尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、アルブミン尿は糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、アルブミン尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、アルブミン尿は糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0023】

一実施形態において、本発明は、血清クレアチニンの増加によって反映される糸球体濾過率（ＧＦＲ）の損失を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、腎臓組織病理学的損傷を予防するのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0024】

一実施形態において、本発明は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の増加の速度を遅延させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0025】

一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＤへの進行の速度を遅延させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＤへの進行を遅延させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、ＥＳＲＤへの進行は少なくとも１２ヶ月遅延される、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＤへの進行を遅延させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、ＥＳＲＤへの進行は少なくとも２４ヶ月遅延される、ＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、血清クレアチニンが倍になる時間を遅延させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＧＦＲが３０％低下する時間を延ばすのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0026】

一実施形態において、本発明は、遊離（未結合）ｓＦＬｔ−１を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、他のタンパク質にシグナル伝達および／または結合するｓＦＬｔ−１の能力を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0027】

一実施形態において、本発明は、慢性腎疾患を治療するための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。一実施形態において、本発明は、慢性腎疾患を治療するための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、慢性腎疾患は糖尿病によって引き起こされる、使用を提供する。より特には、本発明は、慢性腎疾患を治療するための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、慢性腎疾患はステージ３またはステージ４である、使用を提供する。

【0028】

一実施形態において、本発明は、慢性腎疾患を治療するための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、慢性腎疾患は糖尿病性ネフロパシーである、使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患を治療するための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、慢性腎疾患は巣状分節性糸球体硬化症である、使用を提供する。別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患を治療するための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、慢性腎疾患はネフローゼ症候群である、使用を提供する。

【0029】

一実施形態において、本発明は、タンパク尿を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、タンパク尿を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、タンパク尿は慢性腎疾患によって引き起こされる、使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、タンパク尿を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、タンパク尿は糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、使用を提供する。

【0030】

一実施形態において、本発明は、アルブミン尿を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、アルブミン尿を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、アルブミン尿は慢性腎疾患によって引き起こされる、使用を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、アルブミン尿を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、アルブミン尿は糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、使用を提供する。

【0031】

一実施形態において、本発明は、血清クレアチニンの増加によって反映される糸球体濾過率（ＧＦＲ）の損失を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。一実施形態において、本発明は、腎臓組織病理学的損傷を予防するための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。

【0032】

一実施形態において、本発明は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の増加の速度を遅延させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。

【0033】

一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＤへの進行の速度を遅延させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＤへの進行を遅延させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、ＥＳＲＤへの進行は少なくとも１２ヶ月遅延する、使用を提供する。一実施形態において、本発明は、ＥＳＲＤへの進行を遅延させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用であって、ＥＳＲＤへの進行は少なくとも２４ヶ月遅延する、使用を提供する。一実施形態において、本発明は、血清クレアチニンが２倍になる時間を遅延させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。一実施形態において、本発明は、ＧＦＲが３０％低下する時間を延ばすための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。

【0034】

一実施形態において、本発明は、遊離（未結合）ｓＦＬｔ−１を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。一実施形態において、本発明は、他のタンパク質にシグナル伝達および／または結合するｓＦＬｔ−１の能力を減少させるための医薬を製造するためのＶＥＧＦＲ１抗体の使用を提供する。

【0035】

本発明はまた、標準的な治療と同時または連続した組み合わせで、本明細書に記載されているＶＥＧＦＲ１抗体を投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法を提供する。本発明はまた、標準的な治療と同時または連続した組み合わせで、投与することを含む、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0036】

本発明はまた、標準的な治療と同時または連続した組み合わせで、本明細書に記載されているＶＥＧＦＲ１抗体を投与することを含む、患者における糖尿病性ネフロパシーを治療する方法を提供する。本発明はまた、標準的な治療と同時または連続した組み合わせで投与することを含む、糖尿病性ネフロパシーの治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。標準的な治療は、限定されないが、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＲＢ）アンタゴニストを含む。

【0037】

本明細書に記載され、使用されているＶＥＧＦＲ１抗体は、標準的な治療と同時または連続した組み合わせで投与されてもよい。標準的な治療は、限定されないが、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＲＢ）アンタゴニストを含む。

【0038】

一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が、２５℃にて表面プラズモン共鳴により決定して８０ｐＭ未満のＶＥＧＦＲ１に対するＫ_Ｄを有する、ＶＥＧＦＲ１抗体を含む。Ｋｄ値は、実施例２に記載されているように２５℃での結合平衡によって確立される。一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が、インビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ−Ａ結合を中和する、ＶＥＧＦＲ１抗体を含む。一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が、インビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＰｌＧＦ結合を中和する、ＶＥＧＦＲ１抗体を含む。中和価は実施例４に記載されているように確立される（表４ｂを参照のこと）。一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が、２５℃にて表面プラズモン共鳴によって決定して８０ｐＭ未満のＶＥＧＦＲ１に対するＫ_Ｄを有し、インビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ−Ａ結合を中和する、および／または抗体がインビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ５０でＶＥＧＦＲ１に対するＰｌＧＦ結合を中和する、ＶＥＧＦＲ１抗体を含む。

【0039】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、治療方法であって、その患者はＶＥＧＦＲ２リン酸化を増加している、治療方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、治療方法であって、その患者はＰｌＧＦレベルを増加している、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、治療方法であって、その患者はＶＥＧＦ−Ａレベルを増加している、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、治療方法であって、その患者はｓＦＬｔ−１レベルを増加している、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、治療方法であって、その患者はＶＥＧＦ−Ｂレベルを増加している、方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＰｌＧＦレベル、ＶＥＧＦ−Ａレベル
ｓＦＬｔ−１レベル、およびＶＥＧＦ−ＢレベルがＥＬＩＳＡによって測定される、治療方法を提供する。

【0040】

一実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ２リン酸化が増加する場合に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＰＬＧＦレベルが増加する場合に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａレベルが増加する場合に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ｓＦＬｔ−１レベルが増加する場合に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｂレベルが増加する場合に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、ＰｌＧＦレベル、ＶＥＧＦ−Ａレベル、ｓＦＬｔ−１レベル、およびＶＥＧＦ−ＢレベルがＥＬＩＳＡによって測定される、使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0041】

本発明は、ヒトにおける疾患進行の付随する低下と共にタンパク尿の低下を引き起こすと考えられるＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。さらに、本発明は、ヒトにおける慢性腎疾患の治療に有効であると考えられるＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。さらに、本発明は、ヒトにおける糖尿病性ネフロパシーの治療に有効であると考えられるＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。本発明は、ヒトにおける疾患進行の付随する低下と共にアルブミン尿の低下を引き起こすと考えられるＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。本発明は、ヒトにおける疾患進行の付随する低下と共に血清クレアチニンの低下を引き起こすと考えられるＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0042】

一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体である、好ましいＶＥＧＦＲ１抗体であって、ＬＣＶＲが、相補性領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲが、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１がＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、ＬＣＤＲ２がＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、ＬＣＤＲ３がＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、ＨＣＤＲ１がＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、ＨＣＤＲ２がＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、ＨＣＤＲ３がＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、ＶＥＧＦＲ１抗体を含む。

【0043】

一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、ＬＣＶＲが配列番号１１のポリペプチドであり、ＨＣＶＲが配列番号５のポリペプチドである、好ましいＶＥＧＦＲ１抗体を含む。

【0044】

一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、ＨＣが配列番号６のポリペプチドである、好ましいＶＥＧＦＲ１抗体を含む。別の実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、ＨＣが配列番号７のポリペプチドである、ＶＥＧＦＲ１抗体を含む。

【0045】

一実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖は配列番号６のポリペプチドである、好ましいＶＥＧＦＲ１抗体を含む。別の実施形態において、本発明の方法および使用は、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号７のポリペプチドである、好ましいＶＥＧＦＲ１抗体を含む。

【0046】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号６のポリペプチドである、方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号７のポリペプチドである、方法を提供する。

【0047】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患が糖尿病性ネフロパシーであり、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号６のポリペプチドである、方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患は糖尿病性ネフロパシーであり、ＶＥＧＦＲ１抗体は２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖は配列番号７のポリペプチドである、方法を提供する。

【0048】

一実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患は巣状分節性糸球体硬化症であり、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号６のポリペプチドである、方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、慢性腎疾患は巣状分節性糸球体硬化症であり、ＶＥＧＦＲ１抗体は２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖は配列番号７のポリペプチドである、方法を提供する。

【0049】

一実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号６のポリペプチドである、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号７のポリペプチドである、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0050】

一実施形態において、本発明は、慢性腎疾患が糖尿病性ネフロパシーであり、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖は配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖は配列番号６のポリペプチドである、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患が糖尿病性ネフロパシーであり、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号７のポリペプチドである、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0051】

一実施形態において、本発明は、慢性腎疾患が巣状分節性糸球体硬化症であり、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号６のポリペプチドである、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患が巣状分節性糸球体硬化症であり、ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各重鎖が配列番号７のポリペプチドである、慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体を提供する。

【0052】

本発明はさらに、有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法を提供する。

【0053】

好ましくは、ＶＥＧＦＲ１アンタゴニストはＶＥＧＦＲ１抗体である。

【発明を実施するための形態】

【0054】

「抗体」の一般構造は当該分野において周知である。ＩｇＧ型の抗体に関して、鎖内および鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される４本のアミノ酸鎖（２本の「重」鎖および２本の「軽」鎖）が存在する。抗体に関して、重鎖の一方は軽鎖の一方と共に鎖間ジスルフィド結合を形成し、他方の重鎖は他方の軽鎖と共に鎖間ジスルフィド結合を形成し、重鎖の一方は他方の重鎖と共に２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する。

【0055】

特定の生物系において発現される場合、ヒトＦｃ配列を有する抗体はＦｃ領域においてグリコシル化される。抗体は同様に他の位置でグリコシル化されてもよい。当業者は、本発明の抗体がこのようなグリコシル化を含有できることを理解するであろう。典型的に、グリコシル化は高度に保存されたＮ−グリコシル化部位にて抗体のＦｃ領域において生じる。Ｎ−グリカンは典型的にアスパラギンに結合する。

【0056】

抗体Ｉは２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、軽鎖の各々は配列番号１２のポリペプチドからなり、重鎖の各々は配列番号６のポリペプチドからなる。抗体ＩＩは２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、軽鎖の各々は配列番号１２のポリペプチドからなり、重鎖の各々は配列番号７のポリペプチドからなる。抗体Ｉの重鎖の各々をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号１３であり、抗体Ｉの軽鎖の各々をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号１５である。抗体ＩＩの重鎖の各々をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号１４であり、抗体ＩＩの軽鎖の各々をコードする特定のＤＮＡ分子は配列番号１５である。

【0057】

抗体Ｉおよび抗体ＩＩはヒトＶＥＧＦＲ１に対する抗体であり；抗体ＩはＩｇＧ１ Ｆｃを有し、抗体ＩＩはＩｇＧ４ Ｆｃを有する。抗体ＩＩＩはマウスＶＥＧＦＲ１に対するラットＩｇＧ１抗体であり、抗体ＩＶはラット可変領域およびマウスＩｇＧ１ ＦｃとのマウスＶＥＧＦＲ１に対するキメラ抗体である。

【0058】

本発明の方法および使用のための抗体は、当該分野において周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、もしくはこのような技術の組み合わせまたは当該分野において容易に知られる他の技術を使用して産生され得る。抗体を産生し、精製するための方法は当該分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｃｈａｐｔｅｒｓ ５−８ ａｎｄ １５， ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２に見出され得る。

【0059】

「有効量」は、研究者、医師または他の臨床医によって求められている、組織、系、動物、哺乳動物またはヒトに対して所望の治療効果の生物学的または医学的反応を導く、本発明の方法および使用のための抗体または本発明の方法および使用のための抗体を含む医薬組成物の量を意味する。有効量の抗体は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、個体において所望の反応を導く抗体の能力などの要因に応じて変化してもよい。有効量はまた、抗体のあらゆる毒性または有害作用に対して治療的に有益な効果が上回るものである。有効量は、単回（例えばボーラス）、複数回または連続投与につき、約０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇの量を含んでもよい。いくつかの場合、上述の範囲の下限値より低い投薬レベルが十分以上であってもよく、一方、他の場合、さらにより多くの量が利用されてもよい。

【0060】

「治療」、「治療する」、「治療している」などの用語は、障害の進行を遅延または反転することを含むことを意味する。これらの用語はまた、障害または病態が実際に排除されなくても、および障害または病態の進行がそれ自体で遅延または反転しなくても、障害または病態の１つ以上の症状を軽減、改善、弱毒化、排除または低下させることを含む。患者とは、ＶＥＧＦＲ１活性の阻害から利益を受ける、疾患、障害または病態を有する、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。

【0061】

ＣＫＤのステージ３または４は、１５から５９ｍｌ／分／１．７３ｍ^２の推定されたＧＦＲ（ｅＧＦＲ）を有する患者であると定義されている。他はＣＫＤ患者についてステージの定義を使用しないが、これらのｅＧＦＲによって患者を以下のように定義する：正常＞８０、軽度５０〜８０、中度３０〜５０、および重度＜３０。

【0062】

本発明の方法および使用のための抗体またはその抗体を含む医薬組成物は非経口経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内または経皮）によって投与されてもよい。本発明の方法および使用のための抗体は、単回または複数回投与において、単独でまたは薬学的に許容可能な担体および／もしくは希釈剤と組み合わせて患者に投与されてもよい。本発明の方法および使用のための医薬組成物は当該分野において周知の方法によって調製され得（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９^ｔｈ ｅｄ． （１９９５）， Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、本明細書に開示される抗体、および１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む。

【実施例】

【0063】

実施例１：抗体発現および精製
重鎖および軽鎖の可変領域のポリペプチド、抗体Ｉ−ＩＶの完全重鎖および軽鎖アミノ酸配列、ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列は、「アミノ酸およびヌクレオチド配列」という標題の段落で以下に記載されている。さらに、軽鎖および重鎖ＣＤＲポリペプチドは表１に示される。

【0064】

限定されないが、抗体ＩおよびＩＩを含む、本発明の方法および使用のためのＶＥＧＦＲ１抗体は、本質的に以下のように作製され、精製され得る。ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡまたはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比またはＨＣおよびＬＣの両方をコードする単一のベクター系を使用して抗体を分泌するための発現系で一過性または安定にトランスフェクトされ得る。抗体が分泌される浄化培地は多くの一般的に使用される技術のいずれかを使用して精製され得る。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの相溶性緩衝液で平衡化されている、Ｆａｂ断片についてＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に簡便に適用され得る。カラムは非特異的結合成分を除去するために洗浄され得る。結合抗体は、例えば、ｐＨ勾配（２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７から１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ３．０、またはリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．４から１００ｍＭグリシン緩衝液 ｐＨ３．０など）によって溶出され得る。抗体画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され得、次いでプールされ得る。さらなる精製は、意図する使用に応じて任意である。抗体は一般的な技術を使用して濃縮および／または濾過滅菌され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効果的に除去され得る。産生物は−７０℃にて即座に凍結されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。

【0065】

【表1】

【0066】

実施例２：ＶＥＧＦＲ１抗体の結合キネティクス、親和性、および特異性
本発明の方法および使用のための抗体について、ヒトＶＥＧＦＲ１、ならびにヒトＶＥＧＦＲ２およびヒトＶＥＧＦＲ３に対する結合キネティクス、親和性、および選択性を、当該分野において公知の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを使用することによって求めることができる。結合キネティクス、親和性、および特異性は、マウスＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体が、インビトロで、ヒトＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体と同様に機能することを実証するための分析に使用され得る。

【0067】

種々の種類のＶＥＧＦ受容体に対する抗体の結合親和性、特異性、キネティクスおよび化学量論は、ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＢＲ−１００６−６９）を流したＢｉａｃｏｒｅ機器でＳＰＲアッセイを使用して求めることができ、分析温度は２５℃または３７℃に設定できる。固定したヤギ抗（ヒトまたはマウス）カッパ（κ鎖特異的）またはプロテインＡを含有するＣＭ４チップ（３７℃にてＴ１００についてＳシリーズ）は、２つまたは４つ全てのフローセル（Ｆｃ）上で標準的なＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成でき、捕捉法を利用するために使用できる。抗体試料またはＶＥＧＦ−Ｆｃ受容体は、ランニング緩衝液中で希釈することによって１から１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で調製できる。ＶＥＧＦＲ１−Ｈｉｓ、抗体ＩＩまたは抗体ＩＶは異なる濃度（２倍希釈増分で２００ｎＭ〜０．０７８ｎＭの濃度範囲）で調製できる。各分析サイクルは、（１）別のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４）における固定化プロテインＡまたは抗（ヒトまたはマウス）カッパ（κ鎖特異的）上で抗体試料を捕捉すること、（２）５０μＬ／分にて全てのＦｃに対して２５０μＬ（３００秒）のＨｉｓタグ化受容体、抗体ＩＩ−Ｆａｂまたは抗体ＩＶを注入すること、（３）解離相をモニタするために２０分間、緩衝液の流れに戻すこと、（４）グリシン、ｐＨ１．５の２５μＬ（３０秒）の注入によりチップ表面を再生すること、（５）ＨＢＳ−ＥＰの２５μＬ（３０秒）の注入によりチップ表面を平衡化することからなることができる。データは、標準的な二重参照を使用して処理でき、会合速度（ｋ_ｏｎ、Ｍ^−１ｓ^−１単位）、溶解速度（ｋ_ｏｆｆ、ｓ^−１単位）、およびＲ_ｍａｘ（ＲＵ単位）を求めるために、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００についてバージョン４．１およびＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００について２．０．３を使用して１：１結合モデルにフィットできる。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は関係Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎから計算できる。

【0068】

本質的にこの実施例２に記載されるように実施した実験において、抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、同様に高い結合親和性（Ｋ_Ｄ）でそれらの対応する種のＶＥＧＦＲ１に結合する（表２を参照のこと）。抗体ＩＩおよびＩＶの両方は、２００ｎＭまでの受容体で、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３に対する結合ではなく、ＶＥＧＦＲ１に対して良好な選択性を示す。抗体ＩＩはヒトおよびカニクイザルＶＥＧＦＲ１受容体に対して密接なピコモルの親和性を有する。ヒトＶＥＧＦＲ１に対する抗体ＩＩのＫ_Ｄは３７℃にて７４０＋／−３４ｐＭ（ｎ＝３）であり、カニクイザルＶＥＧＦＲ１に対しては３７℃にて５５４＋／−２９ｐＭ（ｎ＝３）である。

【0069】

【表2】

【0070】

実施例３：キメラヒトＶＥＧＦＲ１／ＥｐｏＲまたはマウスＶＥＧＦＲ１／マウスＥｐｏＲ受容体を発現する培養細胞中の抗体ＩＩおよび抗体ＩＶによるＶＥＧＦＲ１の内在化
ＶＥＧＦＲ１を中和し、続いて分解するＶＥＧＦＲ１抗体の能力は、キメラマウスＶＥＧＦＲ１／マウスＥｐｏＲまたはヒトＶＥＧＦＲ１／マウスＥｐｏＲ受容体を発現する細胞においてＶＥＧＦＲ１の内在化を測定することによって求めることができる。ＶＥＧＦＲ１内在化は、マウスＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体が、インビトロで、ヒトＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体と同様に機能することを実証するための分析に使用され得る。ＢａＦ３細胞は、キメラＶＥＧＦＲ１／Ｅｐｏ受容体を発現する場合、ＩＬ−３の非存在下で生存する。抗体介在性内在化によって細胞表面キメラＶＥＧＦＲ１／ＥｐｏＲを減少させることにより、細胞死がもたらされる。

【0071】

ヒトおよびマウスＶＥＧＦＲ１細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインはＥｐｏ受容体の細胞内ドメインと融合し得る。キメラ受容体は、ｐＭＳＣＶ ｐｕｒｏレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３４４０１）内でクローニングされ得る。ＢａＦ３−マウスＶＥＧＦＲ１−マウスＥｐｏＲ細胞およびＢａＦ３−ヒトＶＥＧＦＲ１−マウスＥｐｏＲ細胞はレトロウイルス感染によって生成できる。レトロウイルスは、マウスＶＥＧＦＲ１／マウスＥｐｏＲまたはヒトＶＥＧＦＲ１／マウスＥｐｏＲのそれぞれでＰｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏレトロウイルスパッケージング細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトすることによって産生できる。レトロウイルス粒子はＢａＦ３細胞を形質導入するために使用され得る。ＢａＦ３−ＶＥＧＦＲ１−ＥｐｏＲ細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＨ３０２５５．０１）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１００８２）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＨ３０２３９．０１）、１００Ｕ／５００ｍＬペニシリンＧ、および１００μｇ／５００ｍＬストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＳＶ３００７９．０１）、２μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃５４０４１１）；５ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ ＃４０３−ＭＬ−ＣＦ）中で培養できる。

【0072】

内在化アッセイを実施するために、形質導入したＢａＦ３細胞は、ＩＬ−３を洗い落とすためにＩＬ−３を有さない２０ｍＬの培養培地で３回洗浄できる。ＩＬ−３を有さない培養培地中の１００μｌの細胞を白／透明の９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ＃３５３３７７）の各ウェルに加えて、１〜２×１０^４細胞／ウェルを達成することができる。ＶＥＧＦＲ１およびアイソタイプ対照抗体は、ＩＬ−３を有さない培養培地で連続希釈して、２倍の試験される最終濃度を達成でき、次いで１００μｌの２倍抗体溶液を各ウェルに加えることができる。次いでこのプレートを９５％相対湿度および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２下で３７℃にてインキュベートできる。６日間の培養後、生存細胞の数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７１）によって求めることができる。プレートおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ基質は３０分間、室温で平衡化できる。１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを各ウェルに加えることができる。プレートを２分間、オービタルシェーカーで振盪して、内容物を混合でき、発光信号を安定化するために室温にて１０分間、インキュベートを継続できる。発光は、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ＴＭ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ）によって記録できる。ＶＥＧＦＲ１および対照ＩｇＧ抗体で処理した群において細胞変動性の百分率を、抗体処理していないＢａＦ３細胞と比較することによって算出できる。各用量の三連の処理の平均を、平均として、および標準誤差計算のために使用できる。Ｔ試験を同じ用量でＶＥＧＦＲ１と対照抗体との間のデータを比較するために使用できる。０．０５未満のＰ値が統計的に有意であるとみなすことができる。

【0073】

本質的にこの実施例３に記載されるように実施した実験において、異なる用量の抗体ＩＩのインキュベーションにより、抗体は、ヒトＩｇＧ４対照抗体と比較した生存率の有意な減少によって示されるように、ＢａＦ３−マウスＶＥＧＦＲ１−マウスＥｐｏＲ細胞増殖を阻害する（表３）。同様に、抗体ＩＶの異なる用量でのインキュベーションの６日後、ＢａＦ３−マウスＶＥＧＦＲ１−マウスＥｐｏＲ細胞はマウスＩｇＧ１対照抗体と比較して多くの細胞死を示した（表３）。これらの結果は抗体ＩＩおよびＩＶの両方による細胞表面ＶＥＧＦＲ１受容体の内在化を実証する。さらに、この結果は、ＢａＦ３細胞におけるキメラＶＥＧＦＲ１に対する抗体ＩＩおよびＩＶの結合が受容体活性化および細胞増殖を刺激しないことを示す。

【0074】

【表3】

【0075】

データは、３連の処理の平均および標準誤差を示し、２回の実験の代表である。

【0076】

実施例４：固相ＥＬＩＳＡおよび細胞ベースのＶＥＧＦＲ１リン酸化アッセイによって測定された抗体ＩＩによるヒトＶＥＧＦＲ１に対するヒトＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦ結合の中和
ＶＥＧＦＲ１に結合し、ＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦの結合を中和するＶＥＧＦＲ１抗体の能力は、固相ＥＬＩＳＡおよび細胞ベースのＶＥＧＦＲ１リン酸化アッセイによって測定できる。ＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦ中和は、マウスＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体が、インビトロで、ヒトＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体と同様に機能することを実証するための分析に使用され得る。

【0077】

固相ＥＬＩＳＡに関して、９６ウェルプレートは、５０μｌ／ウェルにてＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ３２１−ｆｌ ０５０／ｃｆ）でコーティングでき、次いで４℃にて一晩インキュベートできる。次いで溶液はウェルから除去でき、次いでウェルは室温にて１００μｌの１％カゼインで１時間遮断できる。抗体（対照Ｒｏｎ抗体（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ６９１）を含む）は、５０μｇ／ｍＬで開始し、０．０２３μｇ／ｍＬまで１：３希釈で希釈している、ＰＢＳｔ（Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）に対してマイクロタイタープレート中で滴定できる。（表４ａを参照のこと）。ＥＬＩＳＡプレートはＰＢＳｔで３回洗浄でき、次いで５０μｌ／ウェルの前滴定した抗体を加えることができる。３７℃での１時間のインキュベーション後、５０μｌのビオチン化リガンド（２ｎＭのｈＰＬＧＦ１（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ＃ＡＦ−１００ ０６）または２ｎＭのｈＶＥＧＦＡ−１６５（Ｒ＆Ｄ＃２９３−ＶＥ）は各ウェルに加えることができ、インキュベーションを３７℃にて３０分間継続できる。プレートはＰＢＳｔで３回洗浄でき、次いで１５分の室温にてインキュベーションしながら、５０μｌ／ウェルのＮＡ−ＡＰ（１：１０００希釈）を加えることができる。３回より多く洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＰＭＰ（水中で１：３５希釈）を加えることができる。次いでプレートを３０分間進行させ、ＯＤ_５６０にて読み取ることができる。

【0078】

細胞ベースのＶＥＧＦＲ１リン酸化アッセイに関して、ヒトＶＥＧＦＲ１を発現するＰＡＥ−Ｒ１細胞は、１００，０００細胞／ウェルにて２４ウェル組織培養プレート中に播種でき、５％ＣＯ_２、３７℃にて一晩培養できる。次いで培養培地を５００μｌの飢餓培地（０．１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）に変えることができ、一晩培養できる。次いで抗体は培地中に加えることができ、細胞を３０分間培養した。ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５（Ｒ＆Ｄカタログ番号２９３−ＶＥ）またはヒトＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄカタログ番号２６４−ＰＧ）を次いで加えることができ、細胞をさらに１０分間インキュベートできる。リン酸化ヒトＶＥＧＦＲ１は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｄｕｏ Ｓｅｔ ＩＣ ＥＬＩＳＡ開発キット、＃ＤＹＣ４１７０−２）を使用して求めることができる。

【0079】

データは平均＋／−標準誤差として表すことができる。ＪＭＰ８は、ＡＮＯＶＡ解析、その後のダネット比較のために使用できる。ＩＣ_５０はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバーション４を使用して計算できる。０．０５未満のＰ値は統計的に有意であるとみなすことができる。

【0080】

本質的にこの実施例４の上記に記載されるように実施される実験において、抗体ＩＩはＶＥＧＦＲ１に対するヒトＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦ結合を中和し、また、ヒトＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦで刺激されたＶＥＧＦＲ１リン酸化を抑制する。抗体ＩＩは、それぞれ０．４３ｎＭおよび０．１４ｎＭのＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＰｌＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａ結合を中和する（表４ａ）。

【0081】

低い抗体濃度でのデータ点はＩＣ_５０を正確に計算することを必要とする。したがって、この実験は、５μｇ／ｍＬで開始して、０．００２３μｇ／ｍＬまで１：３希釈で希釈する抗体濃度で繰り返される。実験手順は以下に記載されている通りであり得る。

【0082】

固相ＥＬＩＳＡに関して、９６ウェルプレートは、５０μｌ／ウェルにてＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのｈＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ３２１−ｆｌ ０５０／ｃｆ）でコーティングでき、次いで４℃にて一晩インキュベートできる。次いで溶液はウェルから除去でき、次いでウェルは室温にて１００μｌの１％カゼインで１時間遮断できる。抗体（対照Ｒｏｎ抗体（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ６９１）を含む）は、５μｇ／ｍＬで開始して、０．００２３μｇ／ｍＬまで１：３希釈で希釈する、ＰＢＳｔ（Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）に対してマイクロタイタープレート中で滴定できる（表４ｂを参照のこと）。ＥＬＩＳＡプレートはＰＢＳｔで３回洗浄でき、次いで５０μｌ／ウェルの前滴定した抗体を加えることができる。３７℃での１時間のインキュベーション後、５０μｌのビオチン化リガンド（４ｎＭのｈＰＬＧＦ１（Ｒ＆Ｄ カタログ番号２６４−ＰＧ−０１０）または２ｎＭのｈＶＥＧＦＡ−１６５（Ｒ＆Ｄ ＃２９３−ＶＥ）は各ウェルに加えることができ、３７℃にて３０分間インキュベーションを継続した。プレートはＰＢＳｔで３回洗浄でき、次いで室温にて１５分間インキュベートしながら、５０μｌ／ウェルのＮＡ−ＡＰ（１：１０００希釈）を加えることができる。３回より多い洗浄の後、１００μｌ／ウェルのＰＭＰ（水中で１：３５希釈）を加えることができる。次いでプレートを３０分間進行させ、ＯＤ_５６０にて読み取ることができる。

【0083】

データは平均＋／−標準誤差として表すことができる。ＪＭＰ８は、ＡＮＯＶＡ解析、その後のダネット比較のために使用できる。ＩＣ_５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６を使用して計算できる。０．０５未満のＰ値は統計的に有意であるとみなすことができる。

【0084】

本質的に上記のように実施した反復実験において、抗体ＩＩはＶＥＧＦＲ１に対するヒトＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦ結合を中和し、また、ヒトＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦで刺激したＶＥＧＦＲ１リン酸化を抑制する。抗体ＩＩは、それぞれ０．３１ｎＭおよび１．０２ｎＭのＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＰｌＧＦおよびＶＥＧＦ−Ａ結合を中和する（表４ｂ）。

【0085】

抗体ＩＩは、表５に見られるように、インビトロでＶＥＧＦおよびＰｌＧＦで刺激したＶＥＧＦＲ１リン酸化の両方を遮断する。

【0086】

【表4】

【0087】

【表5】

【0088】

【表6】

【0089】

実施例５：抗体ＩＩおよびＩＶはＶＥＧＦ−Ａ介在性ＥＲＫリン酸化に対するｓＦｌｔ１の抑制効果を弱める
ｓＦｌｔ１によるＶＥＧＦ−Ａ介在性ＥＲＫリン酸化の抑制を弱めるＶＥＧＦＲ１抗体の能力は、培養したｈＵＶＥＣおよびｂＥｎｄ３細胞において測定できる。ＶＥＧＦ−Ａ介在性ＥＲＫリン酸化の抑制は、マウスＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体が、インビトロで、ヒトＶＥＧＦＲ１に対する開示された抗体と同様に機能することを実証するための分析に使用できる。

【0090】

ｂＥｎｄ３細胞における測定に関して、ｂＥｎｄ３細胞はＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−２２９９）から購入できる。ｂＥｎｄ３細胞は、Ａｎｔｉ／Ａｎｔｉ（Ｔｈｅｒｍｏ＃ＳＶ３００７９．０１）および１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１００８２−１４７）を含有するＤＭＥＭ／高グルコース培地（ＨｙＣｌｏｎｅ＃ＳＨ３０２４３．１）中で３×１０^５細胞／ｍＬまで再懸濁できる。０．５ｍＬの再懸濁したｂＥｎｄ．３細胞（約１．５×１０^５細胞を含有する）は、２４ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５２４）の各ウェルに加えることができ、３７℃、５％ＣＯ_２にて２４時間インキュベートできる。次いで培地を吸引でき、次いで細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２にて１５時間、Ａｎｔｉ／Ａｎｔｉおよび０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ７９７９）を含有する５００μＬ／ウェルのＤＭＥＭ／高グルコース培地中で飢餓させることができる。ＶＥＧＦ−Ａ、ｓＦｌｔ１、および／またはＶＥＧＦＲ１抗体を加える前に、培養は０．１％ＢＳＡを有する新鮮な飢餓培地に変えることができる。

【0091】

ＶＥＧＦ−Ａ処理に関して、５０μＬの１０倍濃度のマウスＶＥＧＦ１６４（８ｎｇ／ｍＬ最終）（Ｒ＆Ｄ ＃４９３−ＭＶ／ＣＦ）を各ウェルに加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間インキュベートできる。ＶＥＧＦ−ＡプラスｓＦｌｔ１処理に関して、３０μＬの２０倍濃度のマウスＶＥＧＦ１６４（８ｎｇ／ｍＬ最終）は、３７℃にて３０分間、３０μＬのマウスｓＦｌｔ１（４０ｎｇ／ｍＬ最終、Ｒ＆Ｄ ＃４７１−Ｆ１）と前もって混合でき、次いで５０μＬの混合物を各ウェルに加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間インキュベートできる。ＶＥＧＦ−ＡプラスｓＦｌｔ１および抗体ＩＶに関して、２０μＬの３０倍濃度の抗体ＩＶ（５００ｎｇ／ｍＬ最終）は、３７℃にて３０分間、マウスｓＦｌｔ１（４０ｎｇ／ｍＬ最終、Ｒ＆Ｄ ４７１−Ｆ１）と前もって混合できる。次に、４０μＬの３０倍濃度のマウスＶＥＧＦ１６４（８ｎｇ／ｍＬ最終）を抗体ＩＶおよびｓＦｌｔ１の混合物に加えることができる。５０μＬの最終混合物を各ウェルに加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間インキュベートできる。無血清培地対照群に関して、０．１％ＢＳＡを有する５０μＬの飢餓培地を各ウェルに加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間インキュベートできる。

【0092】

ｈＵＶＥ細胞における測定に関して、ｈＵＶＥ細胞は、補足物（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−４１７６）を含むＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−３１５６）中で３×１０^５細胞／ｍＬまで再懸濁できる。０．５ｍＬの再懸濁したｈＵＶＥ細胞を２４ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３５２４）（１．５×１０^５細胞／ウェル）の各ウェルに加えることができ、３７℃、５％ＣＯ_２にて２４時間、インキュベートできる。次いで培地は、３７℃、５％ＣＯ_２にて１５時間、飢餓のために０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ７９７９）を含有する５００μＬ／ウェルのＥＧＭ−２培地に変えることができる。処理化合物を加える前に、培地は０．１％ＢＳＡを有する新鮮な飢餓培地に変えることができる。ＶＥＧＦ−Ａ処理のために、５０μＬの１０倍濃度のヒトＶＥＧＦ１６５（１．５ｎｇ／ｍＬ最終）（Ｒ＆Ｄ ２９３−ＶＥ）を加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間インキュベートできる。ＶＥＧＦ−ＡプラスｓＦｌｔ１に関して、３０μＬの２０倍濃度のヒトＶＥＧＦ１６５（１．５ｎｇ／ｍＬ最終）は、３７℃にて３０分間、ヒトｓＦｌｔ１（４０ｎｇ／ｍＬ最終、Ｒ＆Ｄ ３２１−ＦＬ／ＣＦ）と混合できる。次いで５０μｌの混合物をウェルに加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間、インキュベートできる。ＶＥＧＦ−ＡプラスｓＦｌｔ１および抗体ＩＩに関して、２０μＬの３０倍濃度の抗体ＩＩ（７３μｇ／ｍＬ最終）は、３７℃にて３０分間、ヒトｓＦｌｔ１（４０ｎｇ／ｍＬ最終）と前もって混合でき、次いで４０μＬの３０倍濃度のヒトＶＥＧＦ１６５（１．５ｎｇ／ｍＬ最終）をＶＥＧＦ−ＡとｓＦｌｔ１の混合物に加えることができる。５０μＬの最終混合物をウェルに加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間、インキュベートできる。無血清培地対照群に関して、０．１％ＢＳＡを有する５０μＬの飢餓培地を各ウェルに加えることができ、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２にて１０分間、インキュベートできる。

【0093】

細胞溶解調製物に関して、１０ｍＬのトリス溶解緩衝液（ＭＳＤ）を、２００μＬのプロテアーゼ阻害剤溶液（５０倍ストック）、１００μＬのホスファターゼ阻害剤Ｉ（１００倍ストック）、１００μＬのホスファターゼ阻害剤Ｉ（１００倍ストック）、１００μＬのホスファターゼ阻害剤ＩＩ（１００倍ストック）、ＤＭＳＯ中の４０μＬのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（２５０倍ストック）、および１００μＬのＳＤＳ（１０％ストック）と混合できる。ＰＭＳＦおよびＳＤＳは使用前に即座に加えることができる。処理培地を除去した後、５０μＬの細胞溶解緩衝液を各ウェルに加えることができる。細胞は、氷上の溶解緩衝液と１０分間インキュベートでき、次いで４℃にて３０分間振盪できる。溶解物のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット、カタログ番号２３２２７を使用して求めることができる。

【0094】

ＥＲＫ１／２リン酸化アッセイに関して、リン酸化ＥＲＫ１／２は、ＭＳＤ（ホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４；Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７）アッセイ全細胞溶解キット；ＭＳＤ＃Ｋ１５１ＤＷＤ−１）によって開発されたサンドイッチ免疫アッセイのプロトコルに従って求めることができる。アッセイは、リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４；Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７）について捕捉抗体でプレコーティングしたプレートを使用できる。試料を加えた後、検出抗体、電気化学発光化合物（ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識）でコンジュゲートした抗−全ＥＲＫ１／２を含有する溶液を加えることができる。ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒを、試料中のリン酸化ＥＲＫ１／２レベルと相関している放射光の強度を測定するために使用できる。捕捉および検出抗体の両方はヒトおよびマウス全細胞溶解物と交差反応する。

【0095】

データは平均＋／−標準誤差として表すことができる。ＪＭＰ８は、ＡＮＯＶＡ解析、その後のダネット比較のために使用できる。

【0096】

本質的にこの実施例５に記載されるように実施される実験において、抗体ＩＩおよび抗体ＩＶはそれぞれ、培養したｈＵＶＥＣおよびｂＥｎｄ３細胞におけるｓＦｌｔ１活性を弱める（表６）。マウスＶＥＧＦ−Ａ１６４との混合前の抗体ＩＶとのｓＦｌｔ１のプレインキュベーションは、ｂＥｎｄ３細胞においてＶＥＧＦ−Ａで刺激したＥＲＫ１／２リン酸化に対するｓＦｌｔｌの抑制効果を顕著に阻止する。最終濃度の抗体ＩＶはこの研究において５００ｎｇ／ｍＬである。抗体ＩＶと同様に、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５との混合前の抗体ＩＩとのｓＦｌｔのプレインキュベーションは、ｈＵＶＥ細胞においてＶＥＧＦ−Ａ１６５で刺激したＥＲＫ１／２リン酸化を顕著に減少させる。最終濃度の抗体ＩＩはこの研究において７３μｇ／ｍＬである。これらの結果により、抗体ＩＩおよびＩＶの両方がＶＥＧＦ−ＡのＦｌｔ１捕捉を遮断することが実証され、ＶＥＧＦＲ２に対するＶＥＧＦ−Ａの増加した接触性が生じ得る。

【0097】

【表7】

実施例６：抗体ＩＩＩおよびＩＶは、残存腎臓マウスモデルにおいてアルブミン尿を減少させ、腎臓組織病理学的損傷を改善する
アルブミン尿および腎臓組織病理学的損傷（両方、ＣＫＤの指標である）を改善するＶＥＧＦＲ１抗体の可能性は、インビボで、残存腎臓マウスモデルにおいて測定できる（Ｌｅｅｌａｈａｖａｎｉｃｈｋｕｌら、（２０１０） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．７８（１１）：１１３６−１１５３）。

【0098】

残存腎臓モデルは約８週齢でマウス腎臓塊の４分の３を外科的に除去することによって生成できる。このモデルは、アルブミン尿、高血圧症、ならびにメサンギウム増殖、糸球体硬化症、および間質性線維症を含む腎臓障害を発生しているヒト慢性腎疾患（ＣＫＤ）と似ている。残存腎臓手術は８〜９週齢の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃオスマウスにおいて行われ得る。１つの腎臓の２つの極が焼灼を使用して切除され、続いて第２の腎臓の腎摘出術を行うことができる場合、全腎臓塊の４分の３を減少させるための改変された１段階手順を使用できる。外科用ステープルを外科手術の１週間後に取り除くことができる。マウスは、マイクロアイソレーターケージングにおいて高密度ラックで個々に収容でき、１２時間の明／暗サイクルで７５°Ｆおよび湿度５０％に維持した部屋で栄養を高めるためにおがくずを敷き落ちつかせる。マウスはボトルの水およびＰｕｒｉｎａ５００８食餌を自由に得ることができる。ハウスウォーターは、逆浸透で濾過し、塩素処理した水道水（ｐＨ６．５〜７）であってもよい。残存腎臓マウスは、外科手術の２週間後、ベースライン尿ＡＣＲおよび体重によってランダム化できる。

【0099】

採尿および尿アルブミンおよびクレアチニン測定に関して、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ＃３３５９ポリプロピレンマイクロタイタープレート上に単一の動物を配置することによってスポット尿を採取することができる。プレキシガラス収容チャンバをマウスおよびプレートに固定できる。尿は、マイクロタイタープレートを使用して氷上の１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内に移すことができ、５分間、１０，０００ｒｐｍにて遠心分離できる。尿アルブミンは国内で有効とされたアッセイを使用して測定でき、尿クレアチニンは酵素法を使用して測定できる。

【0100】

腎臓病理学に関して、腎臓は、研究の終わりに採取でき、ホルマリンで固定でき、標準的な方法に従ってパラフィン切片化のために処理できる。腎臓の切片は病理学者により腎臓障害について評価できる。メサンギウム基質、糸球体線維症、および間質性線維症は、以下のスケール：なし（０）、最小（１）、わずか（２）、中度（３）、著しい（４）および重度（５）を使用して半定量的にスコア付けできる。糸球体メサンギウム基質増殖および基底膜厚化はＨ＆ＥおよびＰＡＳ染色切片を使用してスコア付けできる。腎臓のマッソンの三重染色切片は線維症（間質および糸球体）の程度を求めるために評価できる。

【0101】

最大血圧の測定に関して、血圧は、マウスを、実際の測定の３〜５日前に１日５分間、テールカフを取り付けたマウスホルダに配置することによって抑制に慣らすことができる、テールカフ法（Ｃｏｄａ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定できる。施設の室温は、血圧採取プロセスの間、さらなる加温を提供するために７５°Ｆまで増加させることができる。マウスを選択し、ランダム化できる。マウスはホルダ／保定器に配置でき、Ｃｏｄａ加温パッド装置（３１〜３３℃）の上部に固定できる。尾はテールカフにより配置でき、各マウスは、約３０分間、抑制できる。テールカフは膨らませることができ、動脈血流を一瞬だけ遮断するのに十分に尾をきつく圧縮し、次いで動脈拍動の戻りを観察するために収縮することによって徐々に緩める。動脈拍動が戻ると、カフは完全に収縮できる。一匹のマウスからの反復測定の平均が、そのマウスについて最大血圧のレベルとして使用できる。

【0102】

データは平均＋／−ＳＥとして示すことができる。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍまたはＪＭＰは、ＡＮＯＶＡまたは独立ｔ検定解析のために使用できる。解析に関して、尿ＡＣＲデータは対数値に変換できる。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰｒｉｓｍまたはＪＭＰは、ＡＮＯＶＡ解析、その後のダネット多重比較検定のために使用できる。０．０５未満のＰ値は統計的に有意とみなすことができる。

【0103】

本質的にこの実施例６に記載されるように実施される実験において、３つの研究が実施される。研究１について、６つの群を含む：（１）ＰＢＳ、１週間に３回（ｔｉｗ）、ｎ＝１２；（２）１０ｍｇ／ｋｇにてマウスＩｇＧ１、ｔｉｗ、ｎ＝１２；（３）１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＶ、ｔｉｗ、ｎ＝１２；（４）３ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＶ、ｔｉｗ、ｎ＝１２；（５）３ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＶ、ｑｗ、ｎ＝１２；および（６）１ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＶ、ｔｉｗ、ｎ＝１２。０．２ｍＬの試験または対照化合物を、１６週間、上記に示した用量および間隔で皮下注射（ｓｃ）する。スポット尿および体重をベースライン（処理前）にまとめ、３、６、１０、１２および１６週に再度投与する。最大血圧は１６週での投与で収集する。研究の８週の終わりに採取した試料は、ＥＤＴＡ抗凝固全血および腎臓を含む。ＢＵＮ、クレアチニンおよび他のパラメータを測定するためにＥＤＴＡ血漿を使用する。冠状に切片化した残存腎臓の半分を、組織病理学的検査のために１０％ｎＢＦ（中性緩衝ホルマリン）中で固定し、残存腎臓のもう半分をさらなる解析のために−８０℃で急速冷凍する。

【0104】

研究２について、５つの群をこの研究に含む：（１）偽対照（ｎ＝４、処理なし）；（２）ＰＢＳ対照（ｎ＝１０）；（３）１０ｍｇ／ｋｇにてラットＩｇＧ１（ｎ＝１０）；（４）１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ（ｎ＝１０）；および（５）３ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ（ｎ＝１０）。全ての群は、０．２ｍＬ／マウスの体積にて８週の間、一週間に３回（ｔｉｗ）、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）する。スポット尿を採取し、体重をランダムで測定し（ベースライン）、４、６および８週に再度投与する。最大血圧を４および８週の投与で採取する。テールカフを使用して血圧を求める。エンドポイント試料採取は研究１に記載されているものと同じである。

【0105】

研究３について、９つの群を含む：（１）偽操作群、処理なし、ｎ＝４；（２）ＰＢＳ対照、ｔｉｗ、ｎ＝６；（３）３０ｍｇ／ｋｇにてラットＩｇＧ１、ｂｉｗ、ｎ＝１０；（４）３０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｂｉｗ、ｎ＝１０；（５）１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｔｉｗ、ｎ＝１０；（６）１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｑｗ、ｎ＝１０；（７）３ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｔｉｗ、ｎ＝１０；（８）３ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｑｗ、ｎ＝１０；および（９）１ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｑｗ、ｎ＝１０。化合物は０．２ｍＬ／マウスの体積で６週間、皮下注射（ｓｃ）する。スポット尿および体重をベースライン（処理前）にまとめ、２、４および６週に投与する。テールカフ法を使用して最大血圧を投与の６週に収集する。エンドポイント試料採取は研究１に記載されているもと同じである。

【0106】

研究１、２および３は、抗体ＩＩＩ（３および１０ｍｇ／ｋｇ）および抗体ＩＶ（１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）が、残存腎臓マウスにおいて、尿アルブミン／クレアチニン（ＡＣＲ）によって測定して、対応する時点で対照と比較してアルブミン尿を有意に減少させることを実証する（表７〜９）。１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ（ｔｉｗ）の抗体ＩＩＩおよび抗体ＩＶを投与した群はまた、残存腎臓マウスにおいて、腎糸球体線維症、間質性線維症、およびマッソンスコアによって測定して、腎臓病理学的スコアを改善する（表１０〜１１）。

【0107】

【表8】

【0108】

【表9】

【0109】

【表10】

【0110】

【表11】

【0111】

【表12】

【0112】

実施例７：抗体ＩＩＩは、糖尿病ｄｂ／ｄｂおよび一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウスにおいてアルブミン尿を減少させ、腎臓組織学的病変を改善する
両方ともＣＫＤの指標である、アルブミン尿および腎臓組織学的病変を改善するＶＥＧＦＲ１抗体の可能性は、インビボで、糖尿病ｄｂ／ｄｂおよび一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウスにおいて測定できる。ｄｂ／ｄｂマウスは、アルブミン尿およびヒト糖尿病性ネフロパシーに似ている腎臓組織学的病変を発生する２型糖尿病マウスモデルを表す（Ｓｈａｒｍａら （２００３） Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８４： Ｆ１１３８）。一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウスは、一側性腎摘出していないｄｂ／ｄｂマウスより多くのアルブミン尿およびいくつかの腎臓構造病変を発生する（Ｎｉｎｉｃｈｕｋら （２００７） Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １２：３５１）。

【0113】

採尿および尿アルブミンおよびクレアチニン測定に関して、スポット尿は、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ ＃３３５９ポリプロピレンマイクロタイタープレートに単一動物を配置することによって採取できる。プレキシガラス収容チャンバはマウスおよびプレートに固定できる。尿はマイクロピペットを使用して氷上の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移すことができ、１０，０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離できる。尿アルブミンは、国内で有効とされたアッセイを使用して測定でき、尿クレアチニンは酵素法を使用して測定できる。

【0114】

腎臓病理学に関して、腎臓は、研究の終わりに採取でき、ホルマリンで固定でき、標準的な方法に従ってパラフィン切片化のために処理できる。腎臓の切片は病理学者により腎臓障害について評価できる。メサンギウム基質、糸球体線維症、および間質性線維症は、以下のスケール：なし（０）、最小（１）、わずか（２）、中度（３）、著しい（４）および重度（５）を使用して半定量的にスコア付けできる。糸球体メサンギウム基質増殖および基底膜厚化はＨ＆ＥおよびＰＡＳ染色切片を使用してスコア付けできる。腎臓のマッソンの三重染色切片は線維症（間質および糸球体）の程度を求めるために評価できる。

【0115】

データは平均＋／−ＳＥとして示すことができる。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍまたはＪＭＰは、ＡＮＯＶＡ解析、その後のダネット多重比較試験のために使用され得る。０．０５未満のＰ値は統計的に有意とみなすことができる。

【0116】

本質的にこの実施例７に記載されるように実施される実験において、２つの研究を実施する。研究４において、オスｄｂ／ｄｂのオスのマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ^ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ^ｄｂ／ＯｌａＨｓｄ）は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入し、７週齢にランダム化して、６週の間、１週に３回（ｔｉｗ）、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇにて対照ラットＩｇＧ１、１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩ、および３ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩをそれぞれ与える。８匹のＰＢＳ群を除いて各群におけるマウスの数は１０匹である。アルブミン／クレアチニン（ＡＣＲ）は処理の４および６週に採取したスポット尿において決定される。血液パラメータおよび腎臓組織構造は６週の研究の終わりに試験する。

【0117】

研究５において、ＩＡＣＵＣおよびそれらの機関のガイドラインに従って、一側性腎摘出術を４週齢のｄｂ／ｄｂマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ ｄｂ／＋Ｌｅｐｒ ｄｂ／ＯｌａＨｓｄ）において行う。マウスを約８〜９週齢にランダム化する。７つの群をこの研究において含む：（１）ＰＢＳ対照、ｎ＝６；（２）３０ｍｇ／ｋｇにてラットＩｇＧ１、ｂｉｗ、ｎ＝１０；（３）３０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｂｉｗ、ｎ＝１０；（４）１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｔｉｗ、ｎ＝１０；（５）１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｑｗ、ｎ＝１０；（６）３ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｑｗ、ｎ＝１０；および（７）１ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＩＩ、ｑｗ、ｎ＝１０。６週間、動物に０．２ｍＬ／注射を皮下（ｓｃ）投与する。血糖、体重、スポット尿ＡＣＲは、表１３および１５に示したように定期的に試験する。血中クレアチニン、ＢＵＮ、および腎臓組織構造は６週の研究の終わりに試験する。

【0118】

研究４および５において、抗体ＩＩＩは、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇ、ｔｉｗ、および３ｍｇ／ｋｇ、ｔｉｗの両方の用量について、および一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウスにおいて全ての試験した用量（３０ｍｇ／ｋｇ、ｔｉｗ；１０ｍｇ／ｋｇ、ｔｉｗ；１０ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ；３ｍｇ／ｋｇ、ｔｉｗ；３ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ、および１ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ）について、対照抗体と比較して尿アルブミン／クレアチニン（ＡＣＲ）を有意に減少させる（表１２〜１３）。抗体ＩＩＩはまた、メサンギウム基質スコアによって測定して、一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウスにおいて腎臓組織病理学的構造スコアを改善し、血中尿素窒素（ＢＵＮ）を減少させる（表１４および１５）。

【0119】

【表13】

【0120】

【表14】

【0121】

【表15】

【0122】

【表16】

【0123】

実施例８：抗体ＩＶは、糖尿病ｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳ糖尿病マウスにおいてアルブミン尿を減少させ、血清クレアチニン増加を防ぎ、死亡率を減少させる
両方ともＣＫＤの指標である、アルブミン尿および腎機能を改善するＶＥＧＦＲ１抗体の可能性は、糖尿病ｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳ欠損マウスにおいてインビボで測定できる。ｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳノックアウトマウスは、より進行した段階のヒト糖尿病性ネフロパシーに似ている糖尿病性腎損傷モデルを表す。マウスは、高血糖、アルブミン尿、細動脈ヒアリン変性、ＧＭＢ厚化、メサンギウム増殖、メサンギウム融解、巣状分節状および早期結節性糸球体硬化症、ならびに糸球体濾過率（ＧＦＲ）の減少を発生する（Ｚｈａｏら （２００６） Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １７：２６６４）。処置なしでは、マウスは１６〜２０週齢後に高い死亡率を示す。

【0124】

採尿および尿アルブミンおよびクレアチニン測定に関して、スポット尿は、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ＃３３５９ポリプロピレンマイクロタイタープレートに単一動物を配置することによって採取できる。プレキシガラス収容チャンバはマウスおよびプレートに固定できる。尿はマイクロピペットを使用して氷上の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移すことができ、１０，０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離できる。尿アルブミンは、国内で有効とされたアッセイを使用して測定でき、尿クレアチニンは酵素法を使用して測定できる。

【0125】

本質的にこの実施例８に記載されるように実施される実験において、抗体ＩＶの有効性を試験する２つの研究を糖尿病ｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳノックアウトマウスにおいて行う（研究６および研究７）。

【0126】

研究６について、８〜２２週齢のｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳノックアウトマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−Ｌｅｐｒ＜ｄｂ＞−Ｎｏｓ３＜ｔｍ１Ｕｎｃ／Ｒｈｒｓ＞）を２つの群にランダム化する：１０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ１を受けた６匹のオスおよび５匹のメスのマウスからなる対照群ならびに１０ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＶを受けた６匹のオスおよび４匹のメスのマウスからなる処置群。抗体は、１２週の間、０．２ｍＬ／注射の体積にて、１週に３回（ｔｉｗ）、皮下（ｓｃ）投与する。血清クレアチニンを研究の終わりに測定する。

【0127】

研究７について、ｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳノックアウトマウスを、３つの群にランダム化し、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇにて対照マウスＩｇＧ１、および１０ｍｇ／ｋｇにて抗体ＩＶのそれぞれを与える。ＰＢＳ群は５匹のオスおよび６匹のメスを含む１１匹のマウスからなる。対照ＩｇＧ１群は、６匹のオスおよび５匹のメスのマウスを含む１１匹のマウスからなる。抗体ＩＶの群は、処置の開始時に７匹のオスおよび５匹のメスのマウスからなる。抗体ＩＶおよび対照試薬は、１２週の間、１週に３回（ｔｉｗ）、ｓｃ投与する。スポット尿ＡＣＲレベルは、ベースラインおよび２、４、６、６、１０および１２週の処置で測定する。血清クレアチニンは、ベースライン、ならびに６週および１２週の処置で試験する。

【0128】

抗体ＩＶは、ｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳノックアウトマウスにおいて、対応する時点で対照と比較して尿アルブミン／クレアチニン（ＡＣＲ）によって測定して、アルブミン尿を有意に減少させる（表１６）。抗体ＩＶはまた、糖尿病ｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳノックアウトマウスにおける血清クレアチニン増加の阻止によって測定して、腎機能を改善する（表１６）。この研究のエンドポイントまで生存したマウスの中で、対照群（ＰＢＳ＋ＩｇＧ１、ｎ＝１３）における６９％は、抗体ＩＶ群において１０％に対して、５０％より多く血清クレアチニンを増加した（ｎ＝１０；カイ二乗検定においてＰ＝０．０１６）。さらに、対照群におけるマウスの３０％は血清クレアチニンが二倍になったのに対して、抗体ＩＶ群におけるマウスはならなかった。抗体ＩＶ処置はｄｂ／ｄｂ−ｅＮＯＳノックアウトマウスにおいて死亡率を減少させる（表１７）。

【0129】

【表17】

【0130】

【表18】

【0131】

実施例９：サルおよびマウスにおける血液ＰｌＧＦレベルに対する抗体ＩＩおよびＩＩＩの効果
インビボで血液ＰｌＧＦレベルに影響を及ぼすＶＥＧＦＲ１抗体の能力はサルおよびマウスにおいて測定できる。サル血漿におけるＰｌＧＦの測定のために、ＰｌＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＤＰＧ００）が使用できる。マウス血液におけるＰｌＧＦの測定のために、ＰｌＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ ＰｌＧＦ−２免疫アッセイ；カタログ番号ＭＰ２００）が使用できる。血清および血漿試料はアッセイ前に標準物質希釈剤（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＲＤ５−１７）中で２〜２０倍に希釈できる。標準曲線は、マウスＰｌＧＦについて２３．４〜１５００ｐｇ／ｍｌ、およびサルＰｌＧＦについて１５．６〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲であり得る。データは平均＋／−として示すことができ；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４をデータ解析のために使用できる。

【0132】

カニクイザルの研究において、抗体ＩＩに対する血液ＰｌＧＦのインビボ反応は、２．５〜４．５歳のサルの４つの群（各群は４匹のオスおよび４匹のメスのサルからなる）から回収した血漿を使用して測定できる。サルに、１３週の間、１週間に１回（ｑｗ）、０、３、２０または６５ｍｇ／ｋｇの用量で抗体ＩＩを与えることができる。血液試料は研究の終わりに採取できる。

【0133】

マウスの研究において、抗体ＩＩＩに対する血液ＰｌＧＦのインビボ反応は、残存マウスまたは一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウスから回収した血液を使用して測定できる。残存腎臓マウス研究において、抗体ＩＩＩは、８週の間、１週間に３回（ｔｉｗ）、１０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで投与できる。一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂ研究において、抗体ＩＩＩは、６週の間、３０ｍｇ／ｋｇ ｂｉｗ、１０ｍｇ／ｋｇ ｔｉｗ、１０ｍｇ／ｋｇ ｑｗ、３ｍｇ／ｋｇ ｑｗ、および１ｍｇ／ｋｇ ｑｗにて投与できる。血漿試料は研究の終わりに採取できる。

【0134】

本質的にこの実施例９に記載されるように実施される実験において、抗体ＩＩは、１３週の間、１週に１回、３、２０および６５ｍｇ／ｋｇの用量にて、カニクイザルにおける血漿ＰｌＧＦレベルを有意に向上させる（表１８）。抗体ＩＩＩは、残存腎臓および一側性腎摘出したマウスの両方において血液ＰｌＧＦを用量依存的に増加させる（表１９）。

【0135】

【表19】

【0136】

【表20】

【0137】

実施例１０：マウスおよびサル腎臓における腎臓ＶＥＧＦＲ２リン酸化
腎臓ＶＥＧＦＲ２リン酸化に影響を及ぼすＶＥＧＦＲ１抗体の能力はサルおよびマウスの腎臓において測定できる。

【0138】

サル腎臓は、２．５〜４．５歳の４つの群のサル（各群は４匹のオスおよび４匹のメスのサルからなる）を、１３週の間、１週に１回（ｑｗ）、０、３、２０および６５ｍｇ／ｋｇのそれぞれの用量にて抗体ＩＩにより処置できる、カニクイザルの研究から採取できる。用量０の群のサルにビヒクル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）注射を与えることができる。腎臓試料は研究の終わりに採取し、凍結できる。

【0139】

サル腎臓ホモジネートは、約１５０μｇのサル腎臓組織を、氷上の２ｍｌのＱＩＡＧＥＮチューブに入れることができるＱＩＡＧＥＮ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを使用して調製でき、次いで５００μＬの試料緩衝液（ＭＳＤホスホ−ＶＥＧＦＲ２カタログ番号Ｋ１５１ＤＪＤ−１）を加える。チューブは、６０秒間、６．５の速度で、ステンレス鋼ビーズ（５ｍｍ、ＱＩＡＧＥＮ＃６９９８９）を有するＱＩＡＧＥＮ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒで振盪できる。チューブは、５分間、氷上でインキュベートでき、続いて４℃にて３０分間、チューブを回転できる。次いでチューブは、１０分間、４℃および８，０００ｒｐｍにて遠心分離できる。上清は新鮮なエッペンドルフチューブに取り除くことができる。１：１００希釈したホモジネート中のタンパク質濃度はＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットカタログ番号２３２２７）を使用して決定できる。試料は−８０℃で保存できる。

【0140】

リン酸化ＶＥＧＦＲ２レベルは、ホスホ−ＶＥＧＦＲ−２（Ｔｙｒ１０５４）アッセイ全細胞溶解キット（ＭＳＤ＃Ｋ１５１ＤＪＤ−１）を使用して決定できる。４００ｇの全タンパク質を含有するサル腎臓ホモジネートを各ウェルに充填できる。

【0141】

マウス腎臓は、実施例６に記載される残存腎臓研究、実施例７に記載される一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウス研究、または正常な１２９マウスから採取できる。１２９マウスの研究において、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍからのオスの１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスは、約１０週齢で２つの群にランダム化でき、抗体ＩＩＩまたは対照ラットＩｇＧ１抗体のいずれかを与える。抗体ＩＩＩおよび対照ＩｇＧ１抗体の両方は、１６週の間、１週に３回（ｔｉｗ）、ｓｃ、１０ｍｇ／ｋｇにて投与できる。腎臓は１６週の研究の終わりに採取できる。

【0142】

マウス腎臓ホモジネートは、約５０μｇのマウス腎臓を３００μＬの試料緩衝液（ＭＳＤマウスホスホ−ＫＤＲ（Ｔｙｒ１１７５）を加えることによって調製できる。チューブは氷上に置くことができ、４０秒間、６．５の速度にてＦａｓｔＰｒｅｐで振盪できる。氷上でのインキュベーションの５分後、組織はＦａｓｔＰｒｅｐを使用して破壊できる。チューブは、４℃にて３０分間、回転でき、続いて１０分間、４℃および８，０００ｒｐｍにて遠心分離できる。上清は新鮮なエッペンドルフチューブに取り除くことができる。１：１００希釈したホモジネート中のタンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＡＣタンパク質アッセイキットカタログ番号２３２２７）を使用して決定できる。試料は−８０℃にて保存できる。

【0143】

リン酸化マウスＶＥＧＦＲ２は、マウスホスホ−ＫＤＲ（Ｔｙｒ１１７５）アッセイ全細胞溶解キット（ＭＳＤカスタム番号Ｎ４５ＣＡ−１）を使用して決定できる。４００μｇの全タンパク質を含有するマウス腎臓ホモジネートを各ウェルに充填できる。ＯＤはＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒを使用して読み取ることができる。

【0144】

本質的にこの実施例１０に記載されるように実施される実験において、抗体ＩＩは、１３週の間、２０ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ用量を与えているカニクイザルにおいて腎臓ＶＥＧＦＲ２リン酸化を増加させる（表２０）。同様に、抗体ＩＩＩは、６週の抗体ＩＩＩ処置を与えている残存腎臓マウスにおいて（表２１）、６週の抗体ＩＩＩ処置を与えている一側性腎摘出したｄｂ／ｄｂマウスにおいて（表２２）、および１６週の抗体ＩＩＩ処置を与えている１２９マウスにおいて（表２３）、腎臓ＶＥＧＦＲ２リン酸化を増加させる。

【0145】

【表21】

【0146】

【表22】

【0147】

【表23】

【0148】

【表24】

【0149】

アミノ酸およびヌクレオチド配列

配列番号１ （ｈＶＥＧＦＲ１）
ＭＶＳＹＷＤＴＧＶＬＬＣＡＬＬＳＣＬＬＬＴＧＳＳＳＧＳＫＬＫＤＰＥＬＳＬＫＧＴＱＨＩＭＱＡＧＱＴＬＨＬＱＣＲＧＥＡＡＨＫＷＳＬＰＥＭＶＳＫＥＳＥＲＬＳＩＴＫＳＡＣＧＲＮＧＫＱＦＣＳＴＬＴＬＮＴＡＱＡＮＨＴＧＦＹＳＣＫＹＬＡＶＰＴＳＫＫＫＥＴＥＳＡＩＹＩＦＩＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＱＩＳＴＰＲＰＶＫＬＬＲＧＨＴＬＶＬＮＣＴＡＴＴＰＬＮＴＲＶＱＭＴＷＳＹＰＤＥＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲＩＤＱＳＮＳＨＡＮＩＦＹＳＶＬＴＩＤＫＭＱＮＫＤＫＧＬＹＴＣＲＶＲＳＧＰＳＦＫＳＶＮＴＳＶＨＩＹＤＫＡＦＩＴＶＫＨＲＫＱＱＶＬＥＴＶＡＧＫＲＳＹＲＬＳＭＫＶＫＡＦＰＳＰＥＶＶＷＬＫＤＧＬＰＡＴＥＫＳＡＲＹＬＴＲＧＹＳＬＩＩＫＤＶＴＥＥＤＡＧＮＹＴＩＬＬＳＩＫＱＳＮＶＦＫＮＬＴＡＴＬＩＶＮＶＫＰＱＩＹＥＫＡＶＳＳＦＰＤＰＡＬＹＰＬＧＳＲＱＩＬＴＣＴＡＹＧＩＰＱＰＴＩＫＷＦＷＨＰＣＮＨＮＨＳＥＡＲＣＤＦＣＳＮＮＥＥＳＦＩＬＤＡＤＳＮＭＧＮＲＩＥＳＩＴＱＲＭＡＩＩＥＧＫＮＫＭＡＳＴＬＶＶＡＤＳＲＩＳＧＩＹＩＣＩＡＳＮＫＶＧＴＶＧＲＮＩＳＦＹＩＴＤＶＰＮＧＦＨＶＮＬＥＫＭＰＴＥＧＥＤＬＫＬＳＣＴＶＮＫＦＬＹＲＤＶＴＷＩＬＬＲＴＶＮＮＲＴＭＨＹＳＩＳＫＱＫＭＡＩＴＫＥＨＳＩＴＬＮＬＴＩＭＮＶＳＬＱＤＳＧＴＹＡＣＲＡＲＮＶＹＴＧＥＥＩＬＱＫＫＥＩＴＩＲＤＱＥＡＰＹＬＬＲＮＬＳＤＨＴＶＡＩＳＳＳＴＴＬＤＣＨＡＮＧＶＰＥＰＱＩＴＷＦＫＮＮＨＫＩＱＱＥＰＧＩＩＬＧＰＧＳＳＴＬＦＩＥＲＶＴＥＥＤＥＧＶＹＨＣＫＡＴＮＱＫＧＳＶＥＳＳＡＹＬＴＶＱＧＴＳＤＫＳＮＬＥＬＩＴＬＴＣＴＣＶＡＡＴ ＬＦＷＬＬＬＴＬＦＩＲＫＭＫＲＳＳＳＥＩＫＴＤＹＬＳＩＩＭＤＰＤＥＶＰＬＤＥＱＣＥＲＬＰＹＤＡＳＫＷＥＦＡＲＥＲＬＫＬＧＫＳＬＧＲＧＡＦＧＫＶＶＱＡＳＡＦＧＩＫＫＳＰＴＣＲＴＶＡＶＫＭＬＫＥＧＡＴＡＳＥＹＫＡＬＭＴＥＬＫＩＬＴＨＩＧＨＨＬＮＶＶＮＬＬＧＡＣＴＫＱＧＧＰＬＭＶＩＶＥＹＣＫＹＧＮＬＳＮＹＬＫＳＫＲＤＬＦＦＬＮＫＤＡＡＬＨＭＥＰＫＫＥＫＭＥＰＧＬＥＱＧＫＫＰＲＬＤＳＶＴＳＳＥＳＦＡＳＳＧＦＱＥＤＫＳＬＳＤＶＥＥＥＥＤＳＤＧＦＹＫＥＰＩＴＭＥＤＬＩＳＹＳＦＱＶＡＲＧＭＥＦＬＳＳＲＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＬＳＥＮＮＶＶＫＩＣＤＦＧＬＡＲＤＩＹＫＮＰＤＹＶＲＫＧＤＴＲＬＰＬＫＷＭＡＰＥＳＩＦＤＫＩＹＳＴＫＳＤＶＷＳＹＧＶＬＬＷＥＩＦＳＬＧＧＳＰＹＰＧＶＱＭＤＥＤＦＣＳＲＬＲＥＧＭＲＭＲＡＰＥＹＳＴＰＥＩＹＱＩＭＬＤＣＷＨＲＤＰＫＥＲＰＲＦＡＥＬＶＥＫＬＧＤＬＬＱＡＮＶＱＱＤＧＫＤＹＩＰＩＮＡＩＬＴＧＮＳＧＦＴＹＳＴＰＡＦＳＥＤＦＦＫＥＳＩＳＡＰＫＦＮＳＧＳＳＤＤＶＲＹＶＮＡＦＫＦＭＳＬＥＲＩＫＴＦＥＥＬＬＰＮＡＴＳＭＦＤＤＹＱＧＤＳＳＴＬＬＡＳＰＭＬＫＲＦＴＷＴＤＳＫＰＫＡＳＬＫＩＤＬＲＶＴＳＫＳＫＥＳＧＬＳＤＶＳＲＰＳＦＣＨＳＳＣＧＨＶＳＥＧＫＲＲＦＴＹＤＨＡＥＬＥＲＫＩＡＣＣＳＰＰＰＤＹＮＳＶＶＬＹＳＴＰＰＩ

配列番号２ （ＨＣＤＲ１−抗体１および２）
ＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ

配列番号３ （ＨＣＤＲ２−抗体１および２）
ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ

配列番号４ （ＨＣＤＲ３−抗体１および２）
ＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ

配列番号５ （ＨＣＶＲ−抗体１および２）
ＱＡＱＶＶＥＳＧＧＧＶＶＱＳＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号６ （ＨＣ−抗体１）
ＱＡＱＶＶＥＳＧＧＧＶＶＱＳＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号７ （ＨＣ−抗体２）
ＱＡＱＶＶＥＳＧＧＧＶＶＱＳＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ

配列番号８ （ＬＣＤＲ１−抗体１および２）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ

配列番号９ （ＬＣＤＲ２−抗体１および２）
ＧＡＳＳＲＡＴ

配列番号１０ （ＬＣＤＲ３−抗体１および２）
ＱＱＹＧＳＳＰＬＴ

配列番号１１ （ＬＣＶＲ−抗体１および２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号１２ （ＬＣ−抗体１および２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号１３ （ＨＣ ＤＮＡ−抗体１）
ＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＣＴＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

配列番号１４ （ＨＣ ＤＮＡ−抗体２）
ＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＣＴＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ

配列番号１５ （ＬＣ ＤＮＡ−抗体１および２）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＧＣＴＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ

配列番号１６ （ＨＣ−抗体３）
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＲＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＳＬＳＷＶＲＲＰＳＧＫＧＰＥＷＬＧＲＬＷＦＤＧＤＴＴＹＮＳＡＦＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＫＤＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＧＴＹＹＣＴＲＤＤＲＤＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＡＥＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＧＴＡＬＫＳＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＡＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＧＬＹＴＬＴＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＮＣＧＧＤＣＫＰＣＩＣＴＧＳＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＱＤＤＰＥＶＨＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＲＰＰＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＬＨＱＤＷＬＮＧＲＴＦＲＣＫＶＴＳＡＡＦＰＳＰＩＥＫＴＩＳＫＰＥＧＲＴＱＶＰＨＶＹＴＭＳＰＴＫＥＥＭＴＱＮＥＶＳＩＴＣＭＶＫＧＦＹＰＰＤＩＹＶＥＷＱＭＮＧＱＰＱＥＮＹＫＮＴＰＰＴＭＤＴＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＮＶＫＫＥＫＷＱＱＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ

配列番号１７ （ＬＣ−抗体３）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＶＳＭＳＶＳＬＧＧＱＶＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＮＮＮＧＮＴＹＬＳＷＹＩＱＫＰＳＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＶＳＧＩＳＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＮＫＩＥＰＤＤＬＧＶＹＹＣＧＱＮＴＱＹＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＴＥＱＬＡＴＧＧＡＳＶＶＣＬＭＮＮＦＹＰＲＤＩＳＶＫＷＫＩＤＧＴＥＲＲＤＧＶＬＤＳＶＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＳＬＴＫＡＤＹＥＳＨＮＬＹＴＣＥＶＶＨＫＴＳＳＳＰＶＶＫＳＦＮＲＮＥＣ

配列番号１８ （ＨＣ−抗体４）
ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＲＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＳＬＳＷＶＲＲＰＳＧＫＧＰＥＷＬＧＲＬＷＦＤＧＤＴＴＹＮＳＡＦＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＳＫＤＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＧＴＹＹＣＴＲＤＤＲＤＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧ

配列番号１９ （ＬＣ−抗体４）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＶＳＭＳＶＳＬＧＧＱＶＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＮＮＮＧＮＴＹＬＳＷＹＩＱＫＰＳＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＶＳＧＩＳＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＮＫＩＥＰＤＤＬＧＶＹＹＣＧＱＮＴＱＹＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ

本発明の実施態様の例として以下を挙げる。
［１］
有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、方法。
［２］
前記慢性腎疾患が糖尿病によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
［３］
前記患者が慢性腎疾患のステージ３またはステージ４である、請求項１または２に記載の方法。
［４］
前記慢性腎疾患が糖尿病性ネフロパシーまたは巣状分節性糸球体硬化症である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［５］
有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるタンパク尿を減少させる方法であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、方法。
［６］
前記タンパク尿が糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、請求項５に記載の方法。
［７］
有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるアルブミン尿を減少させる方法であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、方法。
［８］
前記アルブミン尿が糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、請求項７に記載の方法。
［９］
有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における血清クレアチニンの増加によって反映される糸球体濾過率の損失を減少させる方法であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、方法。
［１０］
有効量のＶＥＧＦＲ１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者における腎臓組織病理学的損傷を予防する方法であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、方法。
［１１］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、表面プラズモン共鳴によって測定して、８０ｐＭ未満のＶＥＧＦＲ１に対するＫ_Ｄを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、インビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ−Ａ結合を中和する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、インビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＰｌＧＦ結合を中和する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、配列番号１１のポリペプチドであるＬＣＶＲおよび配列番号５のポリペプチドであるＨＣＶＲを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、前記ＨＣが配列番号６のポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、前記ＨＣが配列番号７のポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各々の重鎖が配列番号６のポリペプチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各々の重鎖が配列番号７のポリペプチドである、請求項１〜１４または１６のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
慢性腎疾患の治療に使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、ＶＥＧＦＲ１抗体。
［２０］
前記慢性腎疾患が糖尿病によって引き起こされる、請求項１９に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［２１］
前記慢性腎疾患がステージ３またはステージ４である、請求項１９または２０に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［２２］
前記慢性腎疾患が糖尿病性ネフロパシーまたは巣状分節性糸球体硬化症である、請求項１９または２１のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［２３］
タンパク尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、ＶＥＧＦＲ１抗体。
［２４］
前記タンパク尿が糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、請求項２３に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［２５］
アルブミン尿を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、ＶＥＧＦＲ１抗体。
［２６］
前記アルブミン尿が糖尿病性ネフロパシーによって引き起こされる、請求項２５に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［２７］
血清クレアチニンの増加によって反映される糸球体濾過率の損失を減少させるのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、ＶＥＧＦＲ１抗体。
［２８］
腎臓組織病理学的損傷を予防するのに使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体であって、前記ＶＥＧＦＲ１抗体は軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体であり、前記ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲは、ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１はＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号８）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ２はＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号９）のポリペプチドであり、前記ＬＣＤＲ３はＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１０）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ１はＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＲＧ（配列番号３）のポリペプチドであり、前記ＨＣＤＲ３はＤＨＹＧＳＧＶＨＨＹＦＹＹＧＬＤＶ（配列番号４）のポリペプチドである、ＶＥＧＦＲ１抗体。
［２９］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、表面プラズモン共鳴によって測定して、８０ｐＭ未満のＶＥＧＦＲ１に対するＫ_Ｄを有する、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［３０］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、インビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ−Ａ結合を中和する、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［３１］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、インビトロで、２．０ｎＭ未満のＩＣ_５０でＶＥＧＦＲ１に対するＰｌＧＦ結合を中和する、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［３２］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が、配列番号１１のポリペプチドであるＬＣＶＲおよび配列番号５のポリペプチドであるＨＣＶＲを含む抗体である、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［３３］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む抗体であり、前記ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、前記ＨＣが配列番号６のポリペプチドである、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［３４］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む抗体であり、前記ＬＣが配列番号１２のポリペプチドであり、前記ＨＣが配列番号７のポリペプチドである、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［３５］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各々の重鎖が配列番号６のポリペプチドである、請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。
［３６］
前記ＶＥＧＦＲ１抗体が２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各々の軽鎖が配列番号１２のポリペプチドであり、各々の重鎖が配列番号７のポリペプチドである、請求項１９〜３２または３４のいずれか一項に記載の使用するためのＶＥＧＦＲ１抗体。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]