特許 6141186 非常に効率的なエネルギー移動及び調整可能なストークシフトを特徴とする複数の色素がドープされたシリカナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6141186

(24)【登録日】2017年5月12日

(45)【発行日】2017年6月7日

(54)【発明の名称】非常に効率的なエネルギー移動及び調整可能なストークシフトを特徴とする複数の色素がドープされたシリカナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 49/00 20060101AFI20170529BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20170529BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20170529BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20170529BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170529BHJP

   B82Y 20/00 20110101ALI20170529BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20170529BHJP

   B82Y 30/00 20110101ALI20170529BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20170529BHJP

   C09B 67/08 20060101ALN20170529BHJP

   C09B 67/02 20060101ALN20170529BHJP

【ＦＩ】

   A61K49/00 A

   A61K9/14

   A61K47/04

   A61K47/34

   A61P43/00

   B82Y20/00

   B82Y5/00

   B82Y30/00

   G01N21/64 F

   !C09B67/08 B

   !C09B67/02 A

【請求項の数】10

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2013-533319(P2013-533319)

(86)(22)【出願日】2011年10月13日

(65)【公表番号】特表2014-503471(P2014-503471A)

(43)【公表日】2014年2月13日

(86)【国際出願番号】IB2011054546

(87)【国際公開番号】WO2012049657

(87)【国際公開日】20120419

【審査請求日】2014年9月19日

(31)【優先権主張番号】RM2010A000547

(32)【優先日】2010年10月14日

(33)【優先権主張国】IT

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504381401

【氏名又は名称】アルマ・マーター・ステュディオラム−ウニベルシタッディ・ボローニャ

(74)【代理人】

【識別番号】100108855

【弁理士】

【氏名又は名称】蔵田 昌俊

(74)【代理人】

【識別番号】100103034

【弁理士】

【氏名又は名称】野河 信久

(74)【代理人】

【識別番号】100153051

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100179062

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 正

(74)【代理人】

【識別番号】100189913

【弁理士】

【氏名又は名称】鵜飼 健

(72)【発明者】

【氏名】ボナッチ、サラ

(72)【発明者】

【氏名】モンタルティ、マルコ

(72)【発明者】

【氏名】プロディ、ルカ

(72)【発明者】

【氏名】ザッケローニ、ネルシ

(72)【発明者】

【氏名】ジュリス、リッカルド

(72)【発明者】

【氏名】ジェノベーゼ、ダミアノ

(72)【発明者】

【氏名】ラムパッツォ、エンリコ

【審査官】 小森 潔

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２１４８３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｂ，２０１０年 ７月１３日，[online]，doi:10.1021/jp1023444，Retrieved from the internet: ，ＵＲＬ，http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp1023444

【文献】 ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２０１０年 ９月，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．９，ｐ５３８９−５３９７

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｂ，２００７年，Ｖｏｌ．１１１，Ｎｏ．２５，ｐ７０８５−７０９１

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，２０１０年 １月，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１，ｐ６７−７２

【文献】 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１０年 ３月，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．９，ｐ１２６９−１２７２

【文献】 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９５年，Ｖｏｌ．２０７，Ｎｏ．２，ｐ５０８−５１４

【文献】 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６年，Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．３７，ｐ１３８７２−１３８７７

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／２２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ．親水性のシェル及び疎水性の中心部分を有するミセルと、
ｂ．前記ミセルの中心部分の領域に位置し、シリケートネットワークを含むコアと、
ｃ．少なくとも1種類の界面活性剤の複数の分子であって、以下の構造
Ｍ¹−Ｈｙｄｒｏ¹−Ｌｉｐｏ−Ｈｙｄｒｏ²−Ｍ²
（式中、
Ｌｉｐｏは、疎水性の鎖を表し、
Ｈｙｄｒｏ¹及びＨｙｄｒｏ²は、互いに独立して、それぞれの親水性の鎖を表し、Ｍ¹は、認識官能基であり、
Ｍ²は、−Ｈ、−ＯＨ、認識官能基及びヘテロ基からなる群より選択される）を有する官能化界面活性剤の少なくとも１種類の分子を含む複数の分子と、
ｄ．前記コアｂ）中の第１のドナー色素及び少なくとも第２のアクセプター色素であって、前記第１及び前記少なくとも第２の色素は、エネルギー移動過程におけるドナー−アクセプター対のそれぞれの関係を有し、考慮するスペクトル領域についてモル吸光係数ε≧１０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、蛍光量子収率Φ≧０．０１、前記ドナー及び前記アクセプター色素との間でのフェルスター理論による十分な重なり積分を有し、前記色素は親油性であってよいし、又はトリアルコキシシラン部分の導入に有用な官能基を持っていてもよく；
前記第一の色素は７−（ジエチルアミノ）−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミド（Ｄ）および１１−オキソ−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２,３,５,６,７,１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピラノ［２,３−ｆ］ピリド［３,２,１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボキサミド（Ｄ２）からなる群から選択され；
前記少なくとも前記第２の色素は（２,６−ジエチル−４,４−ジフルオロ−１,３,５,７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバモイル）フェニル）−３ａ,４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）（Ｂ）、４,４−ジフルオロ−１,３,５,７−テトラメチル−８−（３−オキソ−３−（（３−（トリエトキシ−シリル）プロピル）アミノ）プロピル）−３ａ,４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン（Ｂ１）、４,４−ジフルオロ−１,３,５,７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバモイル）フェニル）−３ａ,４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン（Ｂ２）、ローダミンＢトリエトキシシラン誘導体（Ｒ）、シアニン２−（（１Ｅ,３Ｅ,５Ｅ）−５−（１−（６−（２,５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−６−オキソヘキシル）−３,３−ジメチルインドリン−２−イリ−デン）−ペンタ−１,３−ジエニル）−１−エチル−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムヨージドのトリエトキシシラン誘導体（Ｃ５）、シアニン２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２,５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェノキシ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１,１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロ−へキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１,１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヨージドのトリエトキシシラン誘導体（Ｃ７）、及びシアニンナトリウム２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２,５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェニルチオ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１,１−ジメチル−６−スルホナト−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１,１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６−スルホネートのトリエトキシシラン誘導体（Ｃ２）からなる群から選択される、色素と
を含むシリカナノ粒子。

【請求項2】

前記官能基がアミン、−ＣＯＯＨ、−Ｎ₃、アルキン、アルケン、アクリロイル、−ＳＨ、マレイミド、アルデヒド、−ＯＨ、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、ヨードアセチル、ＴＣＴ（２,４,６−トリクロロ−１,３,５−トリアジン）および活性化カルボン酸基からなる群より選択される請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項3】

前記活性化カルボン酸基がＮＨＳ及びＮＨＳ−スルホエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＴＦＰエステル（２,３,５,６−テトラフルオロフェノール）、ＰＦＰエステル（ペンタフルオロフェノール）、ＨＯＢｔエステル（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、およびＮ−アシルイミダゾールからなる群より選択される請求項２に記載のナノ粒子。

【請求項4】

ＤＢ、ＤＲ、ＤＣ５、ＤＢＲ、ＤＢＣ５、ＤＲＣ５、ＤＢＲＣ５、ＤＢＲＣ５Ｃ７及びＤ２Ｂ２Ｃ５Ｃ２からなる群より選択される色素の組合せを含む請求項１から３のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項5】

前記ナノ粒子がＢＲ、ＢＣ５、ＲＣ５、ＢＲＣ５からなる群より選択される色素の組合せを含む請求項１から３のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項6】

治療、診断及びセラノステックにおいて使用するための請求項１から５のいずれか一項のナノ粒子。

【請求項7】

治療、診断及びセラノステックにおけるプローブとして使用するための請求項６に記載のナノ粒子。

【請求項8】

分析化学における請求項１から５いずれか一項のナノ粒子の使用（ヒトの治療、診断及びセラノステックにおける使用を除く）。

【請求項9】

分析化学におけるプローブとしての請求項８に記載の使用。

【請求項10】

請求項１から５のいずれか一項の、適切な量のナノ粒子を含む診断又はセラノステックのための組成物。

【発明の詳細な説明】

【発明の概要】

【0001】

本発明は、ナノテクノロジーの分野、特には少なくとも２種類の色素を含むシリカナノ粒子に関する。より詳細には、本発明は、色素が効率的なエネルギー移動過程を提供するシリカナノ粒子に関する。また、本発明は、医学、特には治療及び診断の分野における、より詳細にはセラノステック（theranostics）における、及び分析化学の分野における、前記ナノ粒子の使用も提供する。

【0002】

発明の背景
発光色素は、影響力の大きな分野における数多くの用途、例えば、環境及び食品分析、セキュリティ、並びに医療診断のために広く使用されているマーカーである。蛍光測定は、通常、非常に感度が高く、低コストであり、容易に行うことができ、多目的に使用でき、サブミクロンの視覚化及びサブミリ秒の時間分解能を提供する（L. Prodi, New J. of Chem. 2005, 29, 20-31）。

【0003】

特に、早期診断は治療の成功及び患者のクオリティ・オブ・ライフに密接に関連するので、医療診断は、水溶性、光安定性、非常に低い毒性及び高輝度などの特定の（光）化学的及び光物理学的性質が付与された蛍光ラベル及びセンサを必要とする（L. Prodi, New J. of Chem. 2005, 29, 20-31; Wolfbeis, O. S. Analytical Chemistry 2006, 78, 3859）。

【0004】

フォトルミネセンス分光法の汎用性は、好都合な信号を最適化するために調整することができる幅広い数のパラメータにも起因する。非常に複雑な分析学的問題でさえも、励起及び発光波長、信号収集のタイムウィンドウ、並びに励起ビーム又は放射光の偏光を制御することによって、実際に解決できる。

【0005】

役立つ蛍光ベースラベルは、様々な特徴を示さなければならない（O. S. Wolfbeis, Anal. Chem. 2006, 78, 3859-3873）。全ての生体ラベルのように、生体分子へ共有結合するための反応基を持つこと、水溶性であること、及び毒性を示さないことが要請される。蛍光性に関する限りにおいては、まずは蛍光単位が考えられる最高の蛍光信号を与えるという事実に依存する。フォトルミネセンスは、光子の吸収による励起状態の生成とそれにつづく輻射失活とを含むので２段階過程であり、信号強度は、モル吸収係数（ε）及びルミネセンス量子収率（Φ）による両方の過程の効率に直接関連する。ルミネセンス強度は、実際、非常に希釈した溶液中では、積ε×Φに正比例し、色素の輝度として定義される（L. Prodi, ibid）。また、光安定性も、特に撮像用途においては、特に重要である。更に、生物学的試料が含まれる場合特に、自己蛍光及び光散乱、関連する干渉は、信号対ノイズ比を高めるために、避けなければならない。これは、典型的には、３つの別々の手法を使用して行うことができる。第１は、７００〜９００ｎｍ領域に吸収及びルミネセンス帯を示す赤色及び近赤外（ＮＩＲ）色素の開発及び使用に基づく。これらの色素は、散乱を抑え（波長の４乗に反比例するため）、このスペクトル領域では生体分子の自然蛍光がないことの結果として、極小のバックグラウンドを示す。第２の手法は、室温で長寿命を示す燐光色素の使用に基づく。この場合、バックグランド光は時間分解分光の使用により排除される。なぜなら、自然蛍光色素分子からの散乱光及び蛍光は、燐光よりも遥かに早く減衰し、そのため、測定装置によって取り除くことができるからである。最後に、大きなストークスシフトも有用である。なぜなら、これは、レイリー−チンダル及びラマンバンドからの干渉を減らすのに役立つからである。

【0006】

ルミネセンス分光法の幅広い用途のおかげで、蛍光ラベルの設計を最適にするための多くの研究努力が行われており、ナノ技術界における利点の利益も得てきた（Bruchez, M.; Moronne, M.; Gin, P.; Weiss, S.; Alivisatos, A. P. Science 1998, 281, 2013; Riehemann, K.; Schneider, S. W.; Luger, T. A.; Godin, B.; Ferrari, M.; Fuchs, H. Angew. Chem. Int. Edit. 2009, 48, 872; Shi, D. L. Adv. Funct. Mater. 2009, 19, 3356; Gunasekera, U. A.; Pankhurst, Q. A.; Douek, M. Targeted Oncology 2009, 4, 169; Strassert, C. A.; Otter, M.; Albuquerque, R. Q.; Hone, A.; Vida, Y.; Maier, B.; De Cola, L. Angew Chem Int Edit 2009, 48, 7928, Doshi, N.; Mitragotri, S. Adv. Funct. Mater. 2009, 19, 3843; Medintz, I. L; Uyeda, H. T.; Goldman, E. R.; Mattoussi, H. Nature Materials 2005, 4, 435）。これらの研究分野によって与えられる様々な全ての可能性の中で、シリカ系のルミネセンスナノ粒子（色素がドープされたシリカナノ粒子−ＤＤＳＮ−とも呼ばれる）は、重要な分析的課題、特に医療診断及び撮像に関連するもの（D. Shi, Adv. Funct. Mat. 2009, 19, 3356-3373）に対する、及びナノセラノステックデバイスの開発（Shi, D. L. Adv. Fund. Mater. 2009, 19, 3356; Gunasekera, U. A.; Pankhurst, Q. A.; Douek, M. Targeted Oncology 2009, 4, 169; Yong, K. T.; Roy, I.; Swihart, M. T.; Prasad, P. N. Journal of Materials Chemistry 2009, 19, 4655; Kim, D. K.; Dobson, J. Journal of Materials Chemistry 2009, 19, 6294; Liu, Y. Y.; Miyoshi, H.; Nakamura, M. International Journal of Cancer 2007, 120, 2527; Liu, Y.; Lou, C; Yang, H.; Shi, M.; Miyoshi, H. Curr. Cancer Drug Targets 2011 , 11, 156）に対する興味深い解決策を提供することができる。シリカは、実際、内在性の毒性を示さないが、小さな寸法のナノ粒子に関連する考えられる危険性を完全に排除するための、より深い研究が進行中である（Gunasekera, U. A.; Pankhurst, Q. A.; Douek, M. Targeted Oncology 2009, 4, 169; Wang, L.; Wang, K. M.; Santra, S.; Zhao, X. J.; Hilliard, L. R.; Smith, J. E.; Wu, J. R.; Tan, W. H. Analytical Chemistry 2006, 78, 646; Yong, K. T.; Roy, I.; Swihart, M. T.; Prasad, P. N. Journal of Materials Chemistry 2009, 19, 4655; Burns, A. A.; Vider, J.; Ow, H.; Herz, E.; Penate-Medina, O.; Baumgart, M.; Larson, S. M.; Wiesner, U.; Bradbury, M. Nano Letters 2009, 9, 442）。更に、それらのかなり単純であり且つ手ごろな合成は、バイオコンジュゲーションの準備が整った水溶性構造を容易にもたらすことができる。加えて、各ＤＤＳＮは、多くの蛍光色素分子を含むことができ、１０⁶Ｍ^-1ｃｍ^-1を容易に超えるモル吸収係数に達することができる。また、シリカマトリックスは、ナノ粒子内部に隔離された色素を外部薬品から保護することもでき、それにより、それらの（光）安定性及び、多くの場合、それらのルミネセンス量子収率を高めるので、ＤＤＳＮは一般に見事なほど高い明るさを示す。

【0007】

しかしながら、明るさに加え、ＤＤＳＮは上で論じた他の特徴も示し得る。

【0008】

例えば、それらは、大きなストークスシフトを示すように、且つ、より要件の多い条件で、バーコーディング及び多重分析に適した性質を示すように、容易に設計することができる。励起波長及び発光波長の間の大きな分離を得るために今までのところ提案されている最も単純な戦略は、Wiesner及びその同僚によって使用されるそれであり（E. Herz, A. Burns, D. Bonner, U. Wiesner, Macromol. Rapid Commun. 2009, 30, 1907-1910）、彼らは内在的に大きなストークスシフトによって特徴付けられる市販の蛍光色素分子を含有するＤＤＳＮ（電荷移動特性を有する最低励起状態を典型的に有する）及びアルコキシシランにより誘導体化されたものを合成した。この手法は、直接的であるが、この特性を有する比較的少量の色素によって制限され得る。

【0009】

他の最も興味深く有益な手法は、シリカナノ粒子内部に拘束された２種以上の化学種、金属錯体又は有機色素の間の効率的なエネルギー移動過程を利用することである。Zhao及びその同僚（C. Wu, J. Hong, X. Guo, C. Huang, J. Lai, J. Zheng, J. Chen, X. Mu, Y. Zhao, Chem. Commun. 2008, 750-752）がＲｕ（ＩＩ）及びＴｂ（ＩＩＩ）錯体がドープされたシリカベースの系を開発した一方で、Konovalov及びその同僚（S. V. Fedorenko, O. D. Bochkova, A. R. Mustafina, V. A. Burilov, M . K. Kad irov, C . V. Hol in , I . R. N izameev, V. V. Skripacheva , A. Yu . Menshikova, I. S. Antipin, A. I. Konovalov, J. Phys. Chem. C 2010, 114, 6350-6355）は、類似した系であるが、さらによりレッドシフトした、Ｒｕ（ＩＩ）及びＹｂ（ＩＩＩ）を含有した種をベースにしたものを提案した。

【0010】

この戦略は、異なる色の放射を示すが同じ波長で効率的に励起することができるナノ粒子のセットを得ることを可能にすることもでき（L. Wang, W. H. Tan, Nano Lett. 2006, 6, 84-88; L. Wang, C. Y. Yang, W. H. Tan, Nano Lett. 2005, 5, 37-43; X. L. Chen, M. C. Estevez, Z. Zhu, Y. F. Huang, Y. Chen, L. Wang, W. H. Tan, Anal. Chem. 2009, 81, 7009-7014）、それ以外では量子ドット（ＱＤ）を使用するだけで達成可能な特徴である。それらの中で色素の数及び性質並びにエネルギー移動過程の効率に依存して、２つの異なる用途が考え出され得ることに留意することが重要である。

【0011】

第１の用途は、バーコーディングＮＰの開発に基づく。この場合において、様々なナノ粒子のファミリーは、ｎ種類の色素のセットを使用して調製され、各々のそれは、ドープ材料として、区別可能なルミネセンス帯を与える。ナノ粒子の各種類は、シリカマトリックス内部の様々な色素の異なる濃度によって特徴づけられる。部分的だが完全ではないエネルギー移動を有するために色素が適切に選択されるならば、全てのナノ粒子は１つの波長励起下で多帯域放射を呈することができ、それらは、異なるｎ種類の色素のｎ個のバンド（色）における異なる強度によって構成されるサインによって顕著であり得る。４つの放射帯のそれぞれで５つの異なる強度を持つ４種類の色素がドープされたＮＰを使用して、１０２４（４⁴）個の異なるナノ粒子を予想することができる。この手法は、例えば蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリーにおいて単一のナノ粒子を扱うことができる場合には常に役立ち、ナノ粒子の各種類が、異なる生体分子又は生体構造（細胞）を認識するために誘導体化されるならば、ＮＰの蛍光サインは調査中の分析物の性質を明確に示し、広範な多重化を可能にする。単一のアッセイにおいて多くの分析物の量を同時に測定する能力が医療診断及び撮像においてますます重要になっていることを思い出させることは重要である（Wolfbeis, O. S. Analytical Chemistry 2006, 78, 3859; Yao, G.; Wang, L.; Wu, Y. R.; Smith, J.; Xu, J. S.; Zhao, W. J.; Lee, E. J.; Tan, W. H. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2006, 385, 518; Sukhanova, A.; Nabiev, I. Critical Reviews in Oncology Hematology 2008, 68, 39）。シリカナノ粒子についてもこの手法の多くの例が報告されている。

【0012】

第２の手法は、（ほとんど）完全なエネルギー移動が、ナノ粒子内部に存在する異なる色素間で起こる場合にのみ可能である。４種類の異なる色素、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ（波長が増加する順番）のセットが使用される場合、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ａ及びＢ、（ｉｉｉ）Ａ、Ｂ及びＣ、並びに（ｉｖ）Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含有する４種類のナノ粒子のセットを得ることができる。全てのナノ粒子は、Ａ（単一波長励起）の吸収で励起することができるが、この場合において、最長波長色素のみが、短波長励起であっても有意な蛍光を呈することができる（Wang, L.; Tan, W. H. Nano Letters 2006, 6, 84）。この場合において、同時に調査することができる可能分析物の数は有意に低いが、異なるナノ粒子を分離する必要もなく異なる信号を区別することが可能であり、例えば多くのＤＮＡ分析、細胞蛍光測定（cytofluorimetry）及び組織化学において興味深い特徴である。この文脈において、ＤＤＳＮは、２種類の蛍光色素、エネルギードナー、例えばフィコエリトリン、及びエネルギーアクセプター（典型的にはシアニン５又は７）の組合せである市販のタンデム色素の役立つ代替物であり得る（Roederer, M.; Kantor, A. B.; Parks, D. R.; Herzenberg, L. A. Cytometry 1996, 24, 191）。

【0013】

タンデム色素は、高輝度及び大きなストークシフトを提供する一方で、多くの欠点、例えば不安定性及び可変性を示す（Hulspas, R.; Dombkowski, D.; Preffer, F.; Douglas, D.; Kildew-Shah, B.; Gilbert, J. Cytom. Part A 2009, 75A, 966）。

【0014】

それらの間の非常に効率的なエネルギー移動過程がドナーのほぼ定量的な消光及びアクセプターの増感を確実にすることができる（少なくとも）２種類の異なる色素がドープされたシリカナノ粒子に基づく再現性が高く安定なラベルを提供する必要もある。

【0015】

効率的な粒子内エネルギー移動の適正な設計は、他の非常に役立つ機能、例えば光捕集、信号処理及びエネルギー変換を行うのに適したＤＤＳＮを生成することができることも留意すべきである（Bonacchi, S.; Genovese, D.; Juris, R.; Montalti, M.; Prodi, L.; Rampazzo, E.; Zaccheroni, N. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 4056）。我々が知る限り、この種類の手法はシリカナノ粒子の分野において未だ探究されていない。

【0016】

ナノ粒子は、生体分析学的分野において、特には生体分子の検出、ラべリング及び撮像のため、並びに治療法として、特に薬物担体としても使用される（例えば、Q. Huo, J. Liu, L. Q. Wang, Y. Jiang, T. N. Lambert, E. Fang, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6447-6453を参照のこと）。

【0017】

Tan及び同僚ら（L. Wang, W. Tan, Nano Lett. 2006, 6, 84-88及びWO2007044711において）は、微生物及び生物学的材料の検出のための二重及び三重色素ナノ粒子を開示している。これらの文献によると、蛍光エネルギー移動過程（ＦＲＥＴ）ＮＰの１つの他の有望な利点は、ＮＰ中の色素分子の量を最適化することによって、最長波長色素のみが短波長励起で有意な蛍光を呈するように放射スペクトルを調整することができることである。この特徴は、多くの有機色素の小さなストークスシフトという課題を乗り越え、ＮＰを、有意なレイリー／ラマン散乱又は内在性の蛍光（fluorescece）によって試料中で検出できるようにする。しかしながら、この問題の解決法を見い出す又は任意の改善を提供する方法は示されていない。更に、エネルギー移動効率はより低く、主なチャネルとは異なるチャネルの「ノイズ」が高い。この理由により、前記著者は、各チャネル（色）について異なる強度があるバーコーディングにおける用途も示唆している（例えば４、これは、５種類のチャネルで５⁴（１０２４）種類の異なるナノ粒子を与え、各チャネルを所定のバイオマーカーに関連させることができる）。この種類の用途は、本発明の目的に不適切である。

【0018】

L. Wang, W. Zhao, W. Tan, Nano Res. 2008, 1, 99-115は、治療及び診断におけるバイオコンジュゲートされたシリカナノ粒子の使用を概説している。この概説において、前記著者は、多重細菌検出のための２種及び３種類の色素をドープしたシリカナノ粒子を提案している。３種色素ナノ粒子が説明されており、これらの３種類の色素は、効率的な蛍光エネルギー移動を可能にするように選択され、それらの有効なスペクトルの重なりのおかげで、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）及び６−カルボキシル−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）である。

【0019】

エネルギー移動過程（又は蛍光エネルギー移動過程−ＦＲＥＴ）を使用する多くの診断技術は、大きなストークスシフトに関連する高輝度を必要とする。

【0020】

これは、エネルギー移動過程の可能な限り最高の効率、単一波長励起及び大きなストークスシフトの可能性を意味する。

【0021】

しかしながら、ドナー色素の寄生自己消光の問題がまだある。

【0022】

更に、考えられる最高の輝度を求める際、自己消光過程は最小化されるべきである。なぜなら、それらが平均蛍光量子収率を低くし、ラベリングの程度を増加させることによって分子輝度を増加させる直接的手法の有効性を制限するからである（Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy; 3rd Ed. ed.; Springer: New York, 2006; Montalti, M.; Prodi, L.; Zaccheroni, N.; Zattoni, A.; Reschiglian, P.; Falini, G. Langmuir 2004, 20, 2989）。

【0023】

この文脈において、ＤＤＳＮ内部でも自己消光過程が発生し得るが、ナノ粒子のコアに含められる大量の色素のおかげにより、観察される量子収率の減少は、しばしば、吸収の増加によって相殺されるのより大きいことが強調されるべきである。ＤＤＳＮ内部の効率的なエネルギー移動はこの方向において役立ち得る。

【0024】

特には、クマリン色素、又はキサンテン色素、例えばフルオレセインは、エネルギー移動過程における優れたドナーであるが、ナノ粒子中に特定の濃度で投入されると寄生自己消光に悩まされる（例えば、M. Montalti, L Prodi, N. Zaccheroni, A. Zattoni, P. Reschiglian, G. Falini, Langmuir, 2008, 20, 2989-2991を参照のこと）。

【0025】

本発明者らが知る限り、自己消光と同時に多重分析学的及び診断の技術において効率的なエネルギー移動過程及び大きなストークスシフトを確保するという問題の解決策は、文献では未だに報告されていない。

【0026】

発明の概要
驚くべきことに、WO2010013136及びWO2010013137に開示されている特定のシリカナノ粒子を、特定のスペクトル特性が付与されている色素の選択との組合せで使用することによって、自己消光の問題が予想外にも回避される、又は少なくとも実質的に低減され、大きなストークスシフトが単一励起波長を使用しても得られることが見いだされた。同時に、最も長波長の色素のみが、より短い励起波長であっても有意な蛍光を呈する。

【0027】

本発明の利点の１つは、他の利点の中でも、一、ニ、三及び四発色団のナノ粒子を提供し、ナノ構造体内部の異なる色素間でのエネルギー移動過程に対する前例のない効率が観察されることである。これらの過程は、一方の側面では、非常に高い全体的な増感を、及び他方の側面では、異なるドナーの非常に低い残留放射をもたらし、単一波長励起によって少なくとも４種類の異なる色を交差干渉がほとんどなく得ることを可能にする。

【0028】

それゆえに、本発明の1つの目的は、
ａ．実質的に親水性のシェル及び実質的に疎水性の中心部分を有するミセルと、
ｂ．ミセルの中心部分の領域に位置し、シリケートネットワークを含むコアと、
ｃ．少なくとも1種類の界面活性剤の複数の分子であって、以下の構造
Ｍ¹−Ｈｙｄｒｏ¹−Ｌｉｐｏ−Ｈｙｄｒｏ²−Ｍ²
（式中、
Ｌｉｐｏは、実質的に疎水性の鎖を表し、
Ｈｙｄｒｏ¹及びＨｙｄｒｏ²は、互いに独立して、それぞれの実質的に親水性の鎖を表し、
Ｍ¹は、認識官能基であり、
Ｍ²は、−Ｈ、−ＯＨ、認識官能基及びヘテロ基からなる群より選択される）
を有する官能化界面活性剤の少なくとも１種類の分子を含む複数の分子と、
ｄ．第１及び少なくとも第２の色素であって、前記第１及び前記少なくとも第２の色素は、エネルギー移動過程におけるドナー−アクセプター対のそれぞれの関係を持つ色素であり、考慮するスペクトル領域についてのモル吸光係数ε≧１０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、蛍光量子収率Φ≧０．０１、前記ドナーと前記アクセプター色素との間でのフェルスター（Foerster）理論による十分な重なり積分を有し、前記色素は親油性（lipophylic）（水に不溶性）であってよいし、又は官能基（例えばアミン、−ＣＯＯＨ、−Ｎ₃、アルキン、アルケン、アクリロイル、−ＳＨ、マレイミド、アルデヒド、−ＯＨ、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、ヨードアセチル、ＴＣＴ（２,４,６−トリクロロ−１,３,５−トリアジン）若しくは活性化カルボン酸基、例えばＮＨＳ及びＮＨＳ−スルホエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＴＦＰエステル（２,３,５,６−テトラフルオロフェノール）、ＰＦＰエステル（ペンタフルオロフェノール）、ＨＯＢｔエステル（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、トリアルコキシシラン部分の導入に有用なＮ−アシルイミダゾールを持っていてもよい色素と
を含むシリカナノ粒子である。

【0029】

本発明の別の目的は、治療、診断及びセラノステックにおける上記ナノ粒子の使用である。本発明のナノ粒子の特に好ましい使用は、この技術分野において通例意図される通りの定義に従った、及び上述されているWO2010013136及びWO2010013137に提供されている定義にも従ったプローブである。

【0030】

本発明の別の目的は、分析化学における、特にはこの技術分野において通例意図される通りのプローブとしての、上記ナノ粒子の使用である。

【0031】

本発明の別の目的は、適切な量の上記ナノ粒子を含む診断又はセラノステックの組成物である。

【0032】

本発明のナノ粒子は、全色素系のドナー／アクセプターの各対のエネルギー移動効率が８５％以上であるという利点を持つ。

【0033】

本発明は、以下のさらなる利点を提供する。

【0034】

−ナノ粒子が２種より多い色素を含有する場合、異なるドナーの非常に高い全体的増感及び非常に低い残留放射、
−最大７００〜８００ｎｍまでの非常に大きなストークスシフト、
−最も高いエネルギーを有するドナー（最も青いドナー）さえ励起させる非常に高い輝度、
−最後のアクセプターを除く全ての色素のほとんど無視できる残留強度。

【0035】

本発明は、核酸分析、組織化学、細胞蛍光測定、病原性（patogenic）細菌検出に有利に適用される。

【0036】

これら及び他の目的を、更に図及び例を用いて詳細に開示する。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１は、ナノ粒子当たりのＤの分子の増加数の関数として、Ｄ_x（丸）、Ｄ_x−Ｂ_0.1対（三角）、Ｄ_xＢ１_0.1対（四角）、及びＤ_xＢ１_0.2対（ひし形）を含有するナノ粒子の輝度レベルを示している（表５を参照のこと、λ_ex＝４００ｎｍ）。ここで、ｘ＝（色素のモル／ＴＥＯＳのモル）^*１００。

【図2】図２は、コアシェルシリカ−ＰＥＧナノ粒子の典型的なＴＥＭ画像、及びシリカコア粒度分布、ｄ＝（１１±３）ｎｍ、（スケールバー１００ｎｍ及び２００ｎｍ）を示している。

【図3】図３は、水中におけるコアシェルシリカ−ＰＥＧナノ粒子（ｄ＝２３ｎｍ、ＰｄＩ＝０．０９）の典型的な動的光散乱粒径分布を示している。

【図4】図４は、４０５ｎｍ（細胞蛍光測定において典型的に用いられるレーザー源の放射波長）での非常に高い吸収係数及び４つの区別可能な放射帯での高輝度を示し、ほとんど交差干渉を示さない４種類のＮＰのセットを表している。

【図5】図５は、全ての可視範囲における放射が１種類の色素がドープされたナノ粒子のその１種と比較してほとんど無視できるテトラタンデム（tetratandem）系で得られた結果を示している。

【図6】図６は、ガラス繊維の４つのセットの共焦点発光スペクトルを示しており、ここでは、本発明の代表的なナノ粒子が吸収されていた。繊維は同じ波長（４０５ｎｍ）で励起され、明確に区別可能である。

【0038】

図において、ａ．ｕ．は任意の単位を意味する。

【0039】

発明の詳細な説明
本発明のシリカナノ粒子はWO2010/013136及びWO2010/013137に開示されており、そこに記載されている方法によって調製することができる。上記文献に開示されている全ての態様、条件及び教示は、本発明においても適用可能である。

【0040】

本発明の一般的理解を目的として、シリカナノ粒子の調製のスキームを提供する。

【化1】

【0041】

フルオロフォア（色素）を界面活性剤と混合することでミセルを形成し、これを引き続いてアルコキシシランと反応させることでシリカナノ粒子を形成し、最終的にナノ粒子を単離する。色素がナノ粒子シリカコア内に拘束されていることに留意されたい。

【0042】

本発明の第１の好ましい態様において、コアシェルシリカ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）ナノ粒子は、E. Rampazzo, S. Bonacchi, R. Juris, M. Montalti, D. Genovese, N. Zaccheroni, L. Prodi, D. C. Rambaldi, A. Zattoni, P. Reschiglian J. Phys. Chem. B, 2010, 114（45), 14605-14613）において以前に報告された手順を採用して調製される。シリカナノ粒子コア中に色素を拘束するには、前のRampazzoらの方法の変更が必要である。典型的な調製において、適切な量の界面活性剤、例えばPluronic F127、及び所望量のアルコキシシラン誘導体化又は水不溶性の色素が、適切な溶媒、例えばハロゲン化炭化水素又は同様の溶媒特性を有する有機溶媒、例えばジクロロメタン中に可溶化される。均質溶液が得られた後、溶媒は、例えば不活性ガス流による、及び／又は真空下にて生成物の安定性に影響しない温度、例えば室温での蒸発によって排除される。不活性イオン性塩（例えばＮａＣｌ）を、溶液のイオン強度を増加させるために固体残渣に添加し、混合物を室温にて希釈酸性水溶液により可溶化する。この溶液は、弱酸（例えば酢酸）又はより強い酸（例えばＨＣｌ）を含有することができる。次に、得られた水性均質溶液に、シリカ前駆体、例えばＴＥＯＳを、次いで、十分な量の時間、例えば３時間後にシラン化させる化合物、例えばＴＭＳＣｌを添加する。

【0043】

反応完了後、２０〜７２時間（例えば４８時間）以内に、ナノ粒子を反応混合物から単離する。単離方法はよく知られており、好ましい態様では、水に対する透析が使用される。

【0044】

さらに、特に酸性の環境において安定でない色素の場合、代替の合成スキームが使用され得る。典型的な調製において、界面活性剤、例えばPluronic F127、及び所望量のアルコキシシラン誘導体化又は水不溶性の色素（単数又は複数）は、ジクロロメタン中に可溶化する。溶媒の排除後、不活性な塩、例えばＮａＣｌを固体残渣に添加し、続いて混合物を室温にて水で可溶化させる。次に、得られた水性均質溶液に、テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）を、続いて、適切な量の時間、例えば１５分後に、トリメチルシリルクロリド（ＴＭＳＣｌ）を添加する。反応は、完了まで（at completion）、充分な時間、例えば２４〜７２時間、好ましくは４８時間実施し、最終生成物を単離させる。透析は単離方法の一例である。

【0045】

上述の文献によると、以下の用語は、本明細書において提供される定義の通りと意図される。

【0046】

本発明によると、ミセルを含むシリカナノ粒子が提供され、これは、順じて、実質的に親水性のシェル（即ち、外部の方に向いた部分）及び実質的に疎水性の内側部分を有し、順じて、ミセルの内側部分の区域に位置するコアを含有し、シリケートネットワーク並びに第１及び少なくとも第２の色素を含む。

【0047】

「ミセル」という用語は、ミセル凝集体（１種類の界面活性剤のみの分子を含む）又はミセル共凝集体（多くの種類の界面活性剤の分子を含む）のいずれかを意味する。幾つかの態様によると、ミセルはミセル凝集体である。特には、粒子は形状が本質的に球状である。

【0048】

「実質的に親水性」という用語は、実質的に疎水性の鎖の水溶性より高い水溶性を有するナノ粒子、分子又は分子の一部、例えば鎖の領域を意図する。有利には、実質的に親水性の部分は、エタノール中より水中においてより高い可溶性を有する。「実質的に疎水性の」という用語は、実質的に親水性の鎖の水溶性より低い水溶性を有するナノ粒子、分子又は分子の一部、例えば鎖の領域を意図する。有利には、実質的に疎水性の部分は、実質的に親油性である。ナノ粒子、分子の一部（或いは鎖又は化合物）の実質的に親油性の領域は、水中よりエタノール中においてより高い可溶性を有する領域、分子の一部（或いは鎖又は化合物）を意味する。

【0049】

「認識官能基」という用語は、特定の基質又は分析物を結合できる官能基を意図する。有利には、基質及び／又は分析物は生体分子である。

【0050】

「ヘテロ基」という用語は、ヒドロ¹及びヒドロ²の構成成分と異なるものであり、少なくとも１つのヘテロ原子及び／又は少なくとも１つの不飽和結合を持つ置換基を意図する。ヘテロ基は中間基として機能することができ、それは反応を介して、認識官能基で置換されているか、又は認識官能基を結合する。

【0051】

有利には、ヘテロ基は、−ＯＣＯ（ＣＨ₂）₂ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｎ₃、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＯ₃Ｎａ、−（ＣＨ₂）₃−ＳＯ₃Ｎａ、−ＳＯ₃ＣＨ₃、−ＯＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ₂ＣＯＯＨからなる群より選択される。

【0052】

「十分な重複」という用語は、フェルスター理論に従って定義される重なり積分Ｊを意図し、これは１×１０¹²Ｍ^-1ｃｍ^-1ｎｍ⁴を超える、好都合には１×１０¹⁴Ｍ^-1ｃｍ^-1ｎｍ⁴を超える。

【0053】

これらの文献は、放射性及び／若しくは電気活性及び／若しくはコントラスト剤である、及び／又は陽電子を放射できる有機若しくは有機金属化合物として意図される一般的に活性な化合物も開示している。放射化合物は、エネルギーを、好ましくは検出可能な電磁放射線（発光化合物）として又は熱として放射できる化合物として定義される。放射化合物は、発光種間における適切なエネルギー移動の過程を介しても、それ自体によって及び／又は少なくとも第２の放射する化合物との組合せで放射できることがあり、放射は、蛍光、燐光、電気化学ルミネセンス過程を介して、又は化学ルミネセンス反応を介して行うことができる。放射する化合物は蛍光性又は発光性であり得、後者は特には燐光性又は電気化学発光性のいずれかである。

【0054】

本発明は、具体的には、上記WO2010/013136及びWO2010/013137によって具体化されたものからの色素の選択に言及する。これらは、以下の特性を有する色素である。

【0055】

第１及び少なくとも第２の色素は、上記のシリカナノ粒子のコア中に含有され、ここで、前記第１及び前記少なくとも第２の色素は、エネルギー移動過程におけるドナー−アクセプター対のそれぞれの関係を有する色素であり、考慮するスペクトル領域について、モル吸収率ε≧１０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、好ましくは≧３０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、より好ましくは≧１００，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、考えられるスペクトル領域について、蛍光量子収率Φ≧０．０１、好ましくは≧０．０４、より好ましくは≧０．３０、官能基（例えばアミン、−ＣＯＯＨ、−Ｎ₃、アルキン、アルケン、アクリロイル、−ＳＨ、マレイミド、アルデヒド、−ＯＨ、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、ヨードアセチル、ＴＣＴ（２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン）又は活性化カルボン酸基、例えばＮＨＳ及びＮＨＳ−スルホエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＴＦＰエステル（２，３，５，６−テトラフルオロフェノール）、ＰＦＰエステル（ペンタフルオロフェノール）、ＨＯＢｔエステル（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、トリアルコキシシラン部分の導入に適したＮ−アシルイミダゾール、及び前記ドナー及び前記アクセプター色素との間にフェルスター理論による十分な重なり積分を有する。

【0056】

本発明によると、選択される色素は、前記シリカナノ粒子のコアのシリケートネットワークに共有結合的に結合されるために誘導体化されるために誘導体化される、又はそれは、ミセルの中心部分に、及び、それにより、前記シリカナノ粒子のコアに拘束されるために親油性（水中で不溶性）である。

【0057】

本発明の好ましい態様において、色素は、Ｃ₁〜Ｃ₄トリアルコキシシランに、より好ましくはＣ₂又はＣ₁トリアルコキシシランに結合される。

【0058】

ドナー色素は、アクセプター色素に対してより短い波長で放射する色素である。

【0059】

第１の好ましい態様において、ドナー色素は、クマリン色素、又はキサンテン誘導体色素、例えばフルオレセイン若しくはその誘導体である。

【0060】

より好ましい態様において、トリアルコキシシランにすでに結合しているドナークマリン色素は、（７−（ジエチルアミノ）−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）クマリン−３−カルボキサミド）とも名づけられる７−（ジエチルアミノ）−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミド（ＤＥＡＣトリエトキシシラン；この明細書の以降においてはＤとも呼んでいる）及び１１−オキソ−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２，３，５，６，７，１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボキサミド（クマリン３４３トリエトキシシラン；この明細書の以降においては、Ｄ２とも呼んでいる）からなる群から選択される。

【0061】

ドナー色素と組み合わせられるための好ましいアクセプター色素は、Ｂｏｄｉｐｙのトリエトキシシラン誘導体２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバモイル）フェニル）−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＤＥ Ｐｈトリエトキシシラン；この明細書の以降においてはＢとも呼んでいる）、ボディパイのトリエトキシシラン誘導体４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシ−シリル）プロピル）カルバ−モイル）フェニル）−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン］（Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｐｈトリエトキシシラン；この明細書の以降においはＢ２とも呼んでいる）、この明細書の以降においてはＢ１とも呼んでいるＢｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｅｔトリエトキシシラン（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−８−（３−オキソ−３−（（３−（トリエトキシシリル）−プロピル）アミノ）プロピル）−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）、ローダミンＢトリエトキシシラン誘導体（この明細書の以降においはＲとも呼んでいる）、シアニン２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−（６−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチルインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１−エチル−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムヨージドのトリエトキシシラン誘導体（Ｃｈｒｏｍｉｓ ６４５ Ｃ ＮＨＳ、この明細書の以降においてはＣ５とも呼んでいる）、及び以下の明細書においてＣ７として同定される２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェノキシ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヨージドのトリエトキシシラン誘導体（Ｃｈｒｏｍｉｓ ８００ Ｃ ＮＨＳ）、及びこの明細書の以降においてはＣ２とも呼んでいるナトリウム２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェニルチオ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１，１−ジメチル−６−スルホナト−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６−スルホネートのトリエトキシシラン誘導体（Ｃｈｒｏｍｉｓ ８３０Ａ ＮＨＳ）からなる群より選択される。

【化2】

【0062】

本発明による好ましい組合せは、
ＤＢ、ＤＲ、ＤＣ５、ＤＢＲ、ＤＢＣ５、ＤＲＣ５、ＤＢＲＣ５、ＤＢＲＣ５Ｃ７；Ｄ２Ｂ２、Ｄ２Ｒ、Ｄ２Ｃ５、Ｄ２Ｃ５Ｃ２、Ｄ２Ｂ２Ｃ５、Ｄ２Ｂ２Ｃ２、Ｄ２Ｂ２Ｃ５Ｃ２；Ｄ２Ｂ２ＲＣ５
である。

【0063】

いくつかの用途、例えばＤＮＡ分析、細胞蛍光測定及び組織化学において、励起光源の数は実験ハードウェアの設定によって限定される。多くの用途にとって、４０５ｎｍでのレーザー系統がますます重要になってきている励起光源である。そのため、この波長で吸収する化合物の利用可能性は特に有用である。

【0064】

本発明の好ましい態様において、２種類の色素を含有する色素ドープシリカナノ粒子（ＤＤＮ）のファミリーが提供される。この態様はナノ−タンデム色素（Ｎ−ＴＤ）とも称され、異なる２種類の色素がドープされたシリカナノ粒子に基づいており、その間で、非常に効率的なエネルギー移動過程が、ドナーのほとんど定量的な消光及びアクセプターの増感を確実にする。結果として、これらのナノ系において、最長波長色素のみが短波長励起で有意な蛍光を呈する。エネルギー移動過程を特徴とする多発色団のシリカナノ粒子の多くの例が今まで報告されてきたが、この特徴は満足のいくレベルではまだ達成されていない（Wang, L.; Tan, W. H. Nano Letters 2006, 6, 84; Wang, L.; Zhao, W. J.; O’Donoghue, M. B.; Tan, W. H. Bioconjugate Chemistry 2007, 18, 297）。

【0065】

ナノ−タンデム色素に関連する本発明の態様の文脈において、この種類の例は、ドナー（Ｄ）としてのＤＥＡＣ、及びアクセプターとしてのＢｏｄｉｐｙ色素、１つの場合におけるＴＭＤＥ−Ｐｈ−ＣＯＯＨ（Ｂ）、及びＴＭ−Ｐｈ−ＣＯＯＨ（Ｂ２）第２色素である。色素は、以下の要件を満たすように選択された。（ｉ）高い（＞４０，０００Ｍ−１ｃｍ−１）モル吸収係数ε、（ｉｉ）非常に高い（＞０．５０）蛍光量子収率Φ、（ｉｉｉ）トリアルコキシシラン基の容易な導入のための官能基、及び（ｉｖ）ドナー及びアクセプターとの間のフェルスター理論（Foerster, T. Discuss. Faraday Soc. 1959, 27, ７）による十分な重なり積分。

【0066】

本発明の別の好ましい態様において、４種類の異なる色素：ＤＥＡＣトリエトキシシラン（Ｄ）、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＤＥ−Ｐｈ−ＣＯＯＨ（Ｂ）のトリエトキシシラン誘導体、ローダミンＢ誘導体（Ｒ）、シアニンＣｈｒｏｍｉｓ ６４５ Ｃ誘導体（Ｃ５）を、全ての場合においてＢ、Ｒ及びＣ５のためのＴＥＯＳのモルに対して０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％、例えば０．１％の、及びＤのためのＴＥＯＳのモルに対して０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％、例えば０．２％のドープ程度を使用する全てのそれらの可能な組合せで含有する色素ドープシリカナノ粒子（ＤＤＳＮ）のファミリーが提供される。５種類の異なる色素Ｄ（０．２％）、Ｂ、Ｒ、Ｃ５、Ｃ７（０．１％）を含有する色素ドープシリカナノ粒子の試料も、近赤外放射系の例として調製した。Ｄのみが、又はＤ及びＢ対がドープされたナノ粒子の場合、ナノ粒子は、Ｄについて０．０５％、０．１％及び０．４％のドープ程度も使用して調製した。本発明の一般性を示すために、４種類の異なる色素Ｄ２（０．２％）、Ｂ２、Ｃ５、Ｃ２（０．１％）を含有する色素ドープシリカナノ粒子の試料も調製した。

【0067】

色素は以下の要件を満たすように選択された。（ｉ）フルオロフォアの最大吸収の付近の考慮するスペクトル領域について少なくとも高いモル吸収係数ε（≧１０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、好ましくは≧３０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、より好ましくは≧１００，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1）、（ｉｉ）高い蛍光量子収率Φ（≧０．０１、好ましくは≧０．０４、より好ましくは≧０．３０）、（ｉｉｉ）トリアルコキシシラン基（又は、代替として、水に対する全体的な不溶性）の容易な導入ための官能基、及び（ｉｖ）カスケード法における、ドナーとしての色素Ｄ及びアクセプターとしてのＢの間、ドナーとしてのＢ及びアクセプターとしてのＲの間、及びドナーとしてのＲ及びアクセプターとしてのＣの間における、フェルスター理論による十分な重なり積分。

【0068】

この最後の要件の有効性を評価するため、我々は、同じ系に属する色素の各対に対してフェルスター半径Ｒ⁰を算出しておいた。値を表１に報告する。これからわかるように、色素のほとんどいずれの組合せも、かなり十分なドナー−アクセプター対を提供している。さらに、各色素は、それ自体の放射に対して優れたアクセプターであり、そのためホモ−ＥＴ過程もナノ粒子の全体的な光物理学に積極的に寄与している。

【表1】

【表2】

【0069】

１種類の色素のみがドープされたナノ粒子（参考）
本発明をより十分に理解するために、１種類の色素のみがドープされたナノ粒子の最も重要なパラメータを表３に示す。

【0070】

主に、各ナノ構造体中でのいくつかの色素の封入によるより高い吸収係数のおかげで、遥かに高い輝度がナノ粒子において常に観察されていることに気づかれたい。これは、他方では、蛍光量子収率はそれほど劇的には影響されない。同じ場合では、最もおそらく周囲環境のより高い強剛性のおかげで、このパラメータの増加が観察されている（Ｂ１、Ｃ１、及びＲ）が、他の場合では、ナノ粒子コア中の色素の封入時に観察された蛍光量子収率の減少は、寄生自己消光過程に起因し得る（Montalti, M.; Prodi, L.; Zaccheroni, N.; Zattoni, A.; Reschiglian, P.; Falini, G. Langmuir 2004, 20, 2989）。さらなる研究の努力は、こうした効果を最小化することに充てるべきであるが、全ての場合において、こうした減少が、吸収の増加によって相殺されるのより多いことを再び強調することが重要である。

【表3】

【0071】

Ｂ、Ｒ、Ｃ５及びＣ７の場合、ナノ粒子中の異なる色素の光物理的データは、無水エタノール中の単一色素によって示されるデータと非常に類似しており、関連するπ−π^*遷移の性質により予測されるように、吸収及び発光スペクトルの両方における非常に小さいレッドシフト（＜１０ｎｍ）及び励起状態の寿命の一部延長が伴う。この効果は、最もおそらくは、堅牢なシリカマトリックスによって提供される保護によるものであり、Ｃ５の場合、より明らかである効果であり、その非輻射失活は主にトランス−シス光異性化によるものである。Ｂ及びＣ５の場合、ナノ粒子のドープ程度の変化は、励起状態の寿命及び蛍光量子収率の顕著な変化を誘発せず、自己消光機序がこれらの色素に対してほとんど非効率的であることを示すことに留意するのも興味深い。逆に、これらの過程は、Ｒの場合除外するべきでない。Ｒの関しては、ドープ程度を増加させる際に蛍光量子収率の無視できない低減が観察され得る。Ｄの場合、シリカマトリックス中へのその封入はずっと顕著なレッドシフトを誘発し、その最低励起状態が電荷輸送性状を有するために予想される通りである。励起状態の性質により、この色素は最も大きなストークシフトも示す。表４に報告されているデータから、クマリン色素の場合、自己消光過程は、ナノ粒子当たり色素の５分子超が存在する時、即ち、色素の間の平均距離が６．５ｎｍより短い時にかなり効率的であることは明らかである。一般に、ナノ粒子の輝度（単数又は複数）は、単一色素の輝度と比較して高く、ドープ程度を増加させると、自己消光過程があまり効率的でない場合（Ｒの場合のように）にはさらに増加させることができ、又はそれらが無視できる場合（Ｂ及びＣ５の場合のように）にはさらにいっそう増加させることができる。

【表4】

【0072】

多発色団のナノ粒子。

【0073】

本発明の一態様において、ナノ粒子は２種類の色素からなる対を含む。

【0074】

本発明の別の態様において、ナノ粒子は３種類の色素を含む。

【0075】

本発明のまた別の態様において、ナノ粒子は４種類の色素を含む。

【0076】

本発明のさらなる態様において、ナノ粒子は５種類の色素を含む。

【0077】

ナノ粒子の各セットにおけるドナー及びアクセプターとの間のエネルギー移動（ＥＴ）過程η_ETの効率は、等式１に従って、ドナーの蛍光の消光に基づいて評価し、式中、Ｉ_D及びＩ°_Dは、それぞれ、アクセプターの存在及び非存在におけるナノ粒子中のドナーの蛍光強度である。

【0078】

η_ET＝（１−Ｉ_D／Ｉ°_D）（等式１）
等式１に従って得られたデータは、アクセプターの蛍光の増感を検査して概算されたデータと、実験エラー内で常に完全一致しており、ドナーからアクセプターへの他の非活性化過程が無視できたことを示唆した。ＥＴ過程の高い効率により、研究された全てのナノ粒子ついて、励起スペクトルは吸収スペクトルと非常に類似していた。Ｄ、Ｂ及びＢ１を含有するナノ粒子の例示的な場合、我々は特に、ナノ粒子当たりのドナー分子の数の光物理学的性質に対する効果を調査した。この手法は一見して、あまり適切でないように想定され得るが、それは、唯一の興味深い特徴として、エネルギー移動過程のための可能な限り高い効率を得ると考えられてこなかったからである。この目標は、実際、ナノ粒子内部のアクセプターの濃度を増加させるより有効な方法で達することができ、なぜならこの後者単位の濃度が変化する場合のみ、その励起状態におけるドナー、及びアクセプターの間の平均距離が変化するからである。結果として、他の過程の非存在下で、アクセプターの濃度のみがヘテロ−エネルギー移動の効率に対する効果を有するはずである。しかしながら、大きなストークスシフト及び単一波長励起の可能性を有するためには、励起はドナーに対して行われるべきであり、分析学的観点から、アクセプター分子の数の増加は、輝度における有意な増加をもたらさないが、一方ドナー分子の数の増加はもたらす。

【0079】

表５からわかるように、等式２（式中、τ°は、アクセプターの非存在下におけるドナーの励起状態寿命である）に従って算出されるエネルギー移動過程のための速度定数は、ドナーの濃度を変化させる際に有意に変化することはない。

【0080】

k_ET＝１／［τ°（１／η_ET−１）］（等式２）
しかしながら、エネルギー移動過程の導入は、Ｄについて観察された寄生自己消光過程への非常に競合的な経路を提供し、エネルギー移動の効率が高いドープ程度についても相対的に高い（＞８５％）ままであるという結果を伴うことに留意すべきである。この結果は、分析学的観点から重要な利点をもたらし、即ち、ＢｏｄｉｐｙのＢ又はＢ１の放射を見るがクマリンＤを励起しない系の輝度は（これらのナノ粒子が想定された実験条件）、０．０５％から０．４％のＤのドープ程度を増加させる際に５倍の増加を受け、それで、Ｄのみが存在する時には観察することができない効果である信号の平行増加を達成することができる（図１も参照のこと）。この結果は、我々の知るところではこれまで文献においてまだ報告されておらず、新規ナノ粒子の設計のために重要であり、というのは、フルオレセインとして、自己消光現象を被ることが知られている色素を使用する可能な方法を示唆しているからである。

【0081】

Ｄ_xＢ_y＠ＮＰ、又はＤ_xＢ１_y＠ＮＰ（Ｘ及びＹは、色素Ｄ、Ｂ及びＢ１のモル対ＴＥＯＳのモルをそれぞれ表す）の例示的な態様においてここに示される、本発明によって提供されるタンデム色素ナノ粒子は、４０５ｎｍ（サイトフルオロメトリーに通常用いられるレーザー供給源の放射波長）、２つの区別可能な放射帯を有しほとんど交差干渉を有していない高輝度で両方とも効率的に励起することができる２つの蛍光性ラベルのファミリーを表す。全てのこれらの結果は、これらの種類のコアシェルナノ粒子を、蛍光ベースの分析技術のためのラベルとして非常に興味深いものとしている。

【0082】

この拘束媒体において発生する追加の興味深い現象は、ナノ粒子内部のエネルギー移動を可能にするホモ−エネルギー移動過程である。これらの過程の発生は、増加的にドープされるＮＰについて観察される異方性のより低い値によって確認される。シリカマトリックスに包埋される場合、色素の回転自由は強く低減され、そのため、蛍光脱分極のための可能な機序だけがホモ−エネルギー移動であり、これは、色素が近いほど、即ち高いドープ比で発生する可能性がある。この効果は、ストークスシフトがより小さく、重なり積分が結果としてより高いために予想される通り、Ｂ、Ｂ１、Ｒ及びＣ５ではより高い。しかしながら、Ｄについても、この効果はモル数が高い場合には特に無視できず、励起状態寿命の短縮にもかかわらない測定異方性値の低減は（逆効果を通常誘発する）、この過程の発生の明らかな表れである（表７）。表６からわかるように、３種類又は４種類の色素がナノ粒子のコアに挿入される場合、異なるドナーの消光及びアクセプターの増感の効率はまたさらに明白である。特に、異なるドナーの残留強度は、５％の値をまれに超える。それは、ナノ粒子の該ファミリーにおいて観察される効率が、他の多発色団のシリカナノ粒子についてこれまでに報告されている効率より予想外にも高いことを強調するために特に重要である。本発明者らは如何なる理論にも束縛されるのを望まないが、この予想外の増加に対する可能な説明は、ナノ粒子の異なる構造に依拠する。一般に、前の例は、van Blaaderenによって修正された通りのStober方法論に従って調製された、５０ｎｍを通常超える直径を有するナノ粒子に基づいていた。我々は、この合成戦略が、色素の濃度がコアにおいては高いが外部シェルにおいてはずっと低いコア／シェル構造を自然発生的にもたらすことをすでに実証した（E. Rampazzo, S. Bonacchi, M. Montalti, L. Prodi, N. Zaccheroni, J. Am. Chem. Soc., 2009, 129, 14251-14256）。低密度は（より大きな発色団間距離を暗示する）、これらの外部層に埋められた色素のエネルギー移動の効率をおそらく制限する。我々の合成方法論は、逆に、より均質であるＮＰを代わりにもたらし、なぜならばＮＰがより小さいこと及びＮＰの形成が拘束ナノリアクターにおいて発生することの両方からであり、これは、我々が観察した前例のない効率の理由である。

【0083】

表６からわかるように、３種又は４種類の色素がナノ粒子のコアに挿入される場合、異なるドナーの消光及びアクセプターの増感の効率はまたさらに明白である。

【表5】

【表6】

【表7】

【0084】

二、三又は四発色団のナノ粒子における様々なＥＴ過程に関する前例のない効率は、一方の側では非常に高い全体的な増感を、他方の側では異なるドナーの非常に低い残留放射もたらす。

【0085】

この材料は、最終的には、非常に大きなストークスシフト（最大４４０ｎｍ、最終アクセプターとしてＮＩＲ色素を使用して達することができる値）、「最も青い」ドナーさえ励起する非常に高い輝度、及び最後のアクセプター以外全ての色素のほとんど無視できる残留強度を持つ。単一励起時に、ドープ色素の適正な選択だけで最終アクセプターの放射色を得ることが可能であるため、全てのこの特徴は、一緒になって、これらの系を、分離もなしに、多重化のための非常に有望なものとする加えて、これらのナノ粒子は、大きなストークスシフトに関連する高輝度を必要とする全ての診断技法のための役立つ溶液として現れる。

【0086】

本発明によって提供される１つのさらに重要な利点は、本明細書に記載されている系においてレイリー−チンダル及びラマンバンドから来る干渉の効率的な低減を可能にする値である８０ｎｍを超えるこれらのナノ粒子のストークスシフトによって表されることが、本明細書において強調される。

【0087】

用途の観点から、観察されたＥＴの高い効率により、これらのナノ粒子は非常に有効及び再生可能な錯体タンデム色素とみなすことができる。図４から観察できるように、Ｄ＠ＮＰ、（Ｄ＋Ｂ）＠ＮＰ、（Ｄ＋Ｂ＋Ｒ）＠ＮＰ及び（Ｄ＋Ｂ＋Ｒ＋Ｃ５）＠ＮＰは、４０５ｎｍ（サイトフルオロメトリーにおいて通常用いられるレーザー供給源の放射波長）での非常に高い吸収係数、４つの区別可能な放射帯を有する高輝度を持ち、ほとんど交差干渉がない４種類のＮＰのセットを表す。

【0088】

それ以上であるとは言わないまでも、同様の結果が（Ｄ２Ｂ２Ｃ５Ｃ２）＠ＮＰで得ることができ、全ての可視範囲におけるこれの放射は、単一色素がドープされたナノ粒子のその放射と比較してほとんど無視できる（図５）。より低いエネルギーアクセプターの放射波長及び吸収波長（疑似ストークスシフト）の間の差異は、この系において４３５ｎｍ（表６）であり、文献においてこれまでに報告されている最も大きいものの１つであることは留意に値する。

【0089】

交差干渉がほとんど存在しないことを証明するため、我々は、ガラス繊維の４つのサンプルにＤ＠ＮＰ、（ＤＢ）＠ＮＰ、（ＤＢＲ）＠ＮＰ及び（ＤＢＲＣ５）＠ＮＰをそれぞれ吸着させた。

【0090】

図６からわかるように、繊維の４セットは、全て同じ波長（４０５ｎｍ）で励起され、明確に区別可能な共焦放射スペクトルを有しており、このことは、この戦略が効率及び多用性において、如何なる場合においても２種類のみの蛍光色素の結合に限定される市販のタンデム色素を上回ることができる高発光ラベルの調製をもたらすことができるという事実を示している。

【0091】

以下の例で、本発明をさらに例示する。

【0092】

化学薬品：全ての試薬及び溶媒を、さらに精製することなく、購入した状態で使用した。非イオン性界面活性剤Pluronic（登録商標）Ｆ１２７、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、９９．９９％）、オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ、＞９９％）、クロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ、≧９８％）、塩酸（発煙性、≧３７％）、３−エチル−２，４−ジメチルピロール（９７％）、４−（クロロカルボニル）ベンゾエート（≧９５％）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（ＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、≧９９％）及び酢酸（≧９９．７％）をAldrichから購入した。トリエチルアミン（≧９９．５％）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ≧９９．０％）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ・ＨＣｌ、≧９８．０％）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、≧９８．０％）、ＬｉＯＨ・Ｈ₂Ｏ（≧９９％）、試薬グレードのジクロロメタン、シクロヘキサン、酢酸エチル及びＮａＣｌをFlukaから購入した。７−（ジエチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸（ＤＥＡＣ、≧９８．０％）をSigmaから購入した。Chromis 645 C NHS（（２−（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）−５−（１−（６−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチルインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエニル）−１−エチル−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド））、Chromis 800 C NHS（２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェノキシ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヨージド）、及びChromis 830A NHS（ナトリウム２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェニルチオ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１，１−ジメチル−６−スルホナト−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１，１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６−スルホネート）をCyanagen s. r. l.（ボローニャ−イタリア）から購入した。

【0093】

Milli-Q Millipore系を水の精製のために使用した（抵抗率≧１８ＭΩ）。

【0094】

限界濾過及び透析実験：ナノ粒子限界濾過を、窒素圧下にてMillipore（４７ｍｍのフィルター）から購入した７５ｍＬのステンレス鋼−ガラス耐溶媒性の撹拌セル中で実施した。限界濾過実験構成には、Amicon再生セルロース膜（１０ｋＤａカットオフ）及び濃度切替弁が備えられている助剤リザーバー（８００ｍＬ）を含めた。

【0095】

透析を水に対して室温にて穏やかな撹拌下で、再生セルロース透析チュービング（Sigma、ｍｏｌ ｗｔ．カットオフ＞１２０００Ｄａ、平均直径３３ｍｍ）を用いて行った。粒子溶液の濾過を、必要な場合にはMillipore Duraporeフィルター（０．２２、０．４５μｍ）を使用して行った。

【0096】

例１
Chromis 645 C NHSのトリエトキシシラン誘導体、Ｃ５

【化3】

【0097】

ガラスバイアル中でＣｈｒｏｍｉｓ ６４５ Ｃ ＮＨＳ ０．５７ｍｇ（０．０００８ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ジクロロメタン２４５μＬで可溶化させた。この溶液にジクロロメタン（０．００１６ｍｍｏｌ、２当量）中のＡＰＴＥＳの１：１０（ｖ／ｖ）溶液３．８μＬを添加した。混合物を終夜撹拌し、さらに精製することなく使用した。

【0098】

例２
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｐｈ−ＣＯＯＭｅ（４，４−ジフルオロ−８−（４−（メトキシカルボニル）フェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）

【化4】

【0099】

窒素雰囲気下にて、凝縮器及び滴下漏斗が備えられている３つ口フラスコ中で、２，４−ジメチルピロール４６０μＬ（４．３３ｍｍｏｌ、２当量）及び硫酸マグネシウム５７９ｍｇ（４．７６ｍｍｏｌ、２．２当量）を、ジクロロメタン６ｍＬ中に溶解させた。この溶液に、ジクロロメタン４ｍＬ中に可溶化したメチル４−（クロロカルボニル）ベンゾエート４９８ｍｇ（２．３８ｍｍｏｌ、１．１当量）を、滴下により３０分かけて添加した。反応混合物を３時間加熱還流し、この間それは濃紫色を帯び、次いで室温で冷却した。次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１．６９ｍＬ（９．５３ｍｍｏｌ、４．４当量）、及び１５分後に三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート１．７６ｍＬ（１４．３ｍｍｏｌ、６．６当量）を添加した。反応混合物を３時間再び加熱還流し、この間蛍光が現れた。

【0100】

最終的に、溶液を水で希釈し、２回ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。生じた混合物を、フラッシュクロマトグラフィーの手段によって、シリカゲル上でシクロヘキサン／エーテルの勾配（９５：５〜９：１〜８：２、ｖ／ｖ）を溶出液として使用して精製し、橙色の固体２１５ｍｇ（収率２６％）を生成した。

【0101】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ: 8.19 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.41 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.00 (s, 2 H), 3.98 (s, 3 H), 2.57 (s, 6 H), 1.37 (s, 6 H).

【0102】

例３
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｐｈ−ＣＯＯＨ（８−（４−カルボキシフェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）

【化5】

【0103】

２つ口フラスコ中で、ＴＭ−Ｐｈ−ＣＯＯＭｅ ８０ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ２．５ｍＬ中に溶解させた。この溶液に、水１ｍＬ中に溶解させた水酸化リチウム一水和物４４．４ｍｇ（１．０５ｍｍｏｌ、５当量）を、滴下により急速に添加した。反応混合物を撹拌下にて３時間室温で保持した。次いで、それを塩酸０．１Ｍ溶液で希釈し、３回ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。生じた混合物を、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカゲル上でジエチルエーテル／酢酸エチル／アセトン混合物（４．５：４．５：１、ｖ／ｖ）を使用して精製し、橙色の固体１７ｍｇ（収率２２％）を生成した。

【0104】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ: 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.62 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 6.17 (s, 2 H), 2.54 (s, 6 H), 1.44 (s, 6 H).

【0105】

例４
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｐｈトリエトキシシラン（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバモイル）フェニル）−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）、Ｂ２

【化6】

【0106】

窒素雰囲気下にて、３−アミノプロピルトリエトキシシラン１９μＬ（ＡＰＴＥＳ、０．０７９ｍｍｏｌ、２当量）、ＴＭ−Ｐｈ−ＣＯＯＨ １４．５ｍｇ（０．０３９ｍｍｏｌ、１当量）、トリエチルアミン１１μＬ（ＴＥＡ、０．０７９ｍｍｏｌ、２当量）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド１４．４μＬ（ＥＤＣ、０．０７９ｍｍｏｌ、２当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物１１ｍｇ（ＨＯＢｔ、０．０７９ｍｍｏｌ、２当量）を、ジクロロメタン中に溶解させ、終夜室温で撹拌した。

【0107】

反応混合物を次いで減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカ上でシクロヘキサン／酢酸エチル混合物（８：２、ｖ／ｖ）を溶出液として使用して精製し、生成物を橙色−黄金色の固体として１３．１ｍｇ（収率５８％）を得た。

【0108】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ: 7.94 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 6.70 (bs, 1H), 5.99 (s, 2 H), 3.85 (q, J = 7.0 Hz, 6 H), 3.57-3.48 (m, 2 H), 2.56 (s, 6 H), 1.89-1.74 (m, 2 H), 1.37 (s, 6 H), 1.24 (t, J = 7.0 Hz, 9 H), 0.76 (t, J = 7.9 Hz, 2 H).

【0109】

例５
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｅｔ−ＣＯＯＭｅ（４，４−ジフルオロ−８−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）−１，３，５，７−テトラメチル−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）

【化7】

【0110】

窒素雰囲気下にて、凝縮器及び滴下漏斗を備えた３つ口フラスコ中で、２，４−ジメチルピロール１０００μＬ（９．４２ｍｍｏｌ、２当量）をジクロロメタン１２ｍＬ中に溶解させた。この溶液に、ジクロロメタン６ｍＬ中に可溶化したメチル４−クロロ−４−オキソブチレート１．２０ｍＬ（９．４２ｍｍｏｌ、２当量）を滴下により３０分かけて添加した。反応混合物を終夜加熱還流し、この間それは濃紫色を帯び、次いで室温で冷却した。次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン３．６８ｍＬ（２０．７ｍｍｏｌ、４．４当量）、及び１５分後に三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート３．８４ｍＬ（３１．１ｍｍｏｌ、６．６当量）を添加した。反応混合物を再び３時間加熱還流し、この間蛍光が現れた。

【0111】

最終的に、溶液を水で希釈し、２回ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。生じた混合物を、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカゲル上でシクロヘキサン／エーテルの勾配（９：１〜８：２、ｖ／ｖ）を溶出液として使用して精製し、橙色の固体４７１ｍｇ（収率３０％）を生成した。

【0112】

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz, 25℃) δ: 6.05 (s, 2 H), 3.72 (s, 3 H), 3.31-3.27 (m, 2 H), 2.61-2.57 (m, 2H), 2.50 (s, 6 H), 2.42 (s, 6 H).

【0113】

例６
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｅｔ−ＣＯＯＨ（８−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）

【化8】

【0114】

２つ口フラスコ中で、ＴＭ−Ｅｔ−ＣＯＯＭｅ １００ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ １０ｍＬ中に溶解させた。この溶液に、水４ｍＬ中に溶解させた水酸化リチウム３６．６ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ、５当量）を、滴下により急速に添加した。反応混合物を撹拌下で３時間室温にて保持した。次いで、それを塩酸０．１Ｍ溶液で希釈し、３回ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。生じた混合物を、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカゲル上でシクロヘキサン／酢酸エチル混合物（３：７、ｖ／ｖ）を使用して精製し、橙色の固体７３ｍｇ（収率７６％）を生成した。

【0115】

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz, 25℃) δ: 6.06 (s, 2 H), 3.33-3.29 (m, 2 H), 2.67-2.63 (m, 2 H), 2.51 (s, 6 H), 2.43 (s, 6 H).

【0116】

例７
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭ−Ｅｔトリエトキシシラン（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−８−（３−オキソ−３−（（３−（トリエトキシ−シリル）プロピル）アミノ）プロピル）−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）、Ｂ１

【化9】

【0117】

窒素雰囲気下にて、３−アミノプロピルトリエトキシシラン１０２μＬ（ＡＰＴＥＳ、０．４３ｍｍｏｌ、２当量）、ＴＭ−Ｅｔ−ＣＯＯＨ（０．２１ｍｍｏｌ、１当量）６８．６ｍｇ、トリエチルアミン（ＴＥＡ、０．４３ｍｍｏｌ、２当量）５９．９μＬ、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド１１７μＬ（ＥＤＣ、０．４３ｍｍｏｌ、２当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物８９．５ｍｇ（ＨＯＢｔ、０．４３ｍｍｏｌ、２当量）をジクロロメタン中に溶解させ、４時間室温で撹拌した。

【0118】

反応混合物を次いで減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカ上でシクロヘキサン／酢酸エチルの勾配（９：１〜１：１、ｖ／ｖ）を溶出液としてを使用して精製し、生成物を橙色−黄金色の固体として７５．７ｍｇ（収率６８％）得た。

【0119】

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz, 25℃) δ: 6.03 (s, 2 H), 5.82 (bs, 1 H), 3.79 (q, J = 7.1 Hz, 6 H), 3.33-3.29 (m, 2 H), 3.27-3.22 (m, 2 H), 2.49 (s, 6 H), 2.42 (s, 6 H), 2.41-2.38 (m, 2 H), 1.65-1.57 (m, 2 H), 1.20 (t, J = 7.1 Hz, 9 H), 0.60 (t, J = 8.0, 2 H).

【0120】

例８
クマリン３４３−トリエトキシシラン（１１−オキソ−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２，３，５，６，７，１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピラノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボキサミド）、Ｄ２

【化10】

【0121】

窒素雰囲気下にて、３−アミノプロピルトリエトキシシラン３２．５μＬ（ＡＰＴＥＳ、０．１３６ｍｍｏｌ、２当量）、クマリン３４３ ２０ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ、１当量）、トリエチルアミン１９．１μＬ（ＴＥＡ、０．１３６ｍｍｏｌ、２当量）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド２４．８μＬ（ＥＤＣ、０．１３６ｍｍｏｌ、２当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物１８．９ｍｇ（ＨＯＢｔ、０．１３６ｍｍｏｌ、２当量）をジクロロメタン中に溶解させ、終夜室温で撹拌した。反応混合物を次いで減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカ上でシクロヘキサン／酢酸エチルの勾配（６：４〜１：１、ｖ／ｖ）を溶出液として使用して精製し、生成物を薄橙色の固体として２２．８ｍｇ（収率６９％）得た。

【0122】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ 8.9 (bs, 1 H), 8.63 (s, 1 H), 7.02 (s, 1 H), 3.84 (q, J = 7.0 Hz, 6 H), 3.50-3.40 (m, 2 H), 3.38-3.23 (m, 4 H), 2.91-2.76 (m, 4 H), 2.05-2.00 (m, 4 H), 1.79-1.67 (m, 2 H), 1.24 (t, J = 7.0 Hz, 9 H), 0.72 (t, J = 8.4 Hz, 2 H).

【0123】

例９
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＤＥ−Ｐｈ−ＣＯＯＭｅ（２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−８−（４−（メトキシカルボニル）−フェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）

【化11】

【0124】

窒素雰囲気下にて、凝縮器及び滴下漏斗が備えられている３つ口フラスコ中で、３−エチル−２，４−ジメチルピロール６０２μＬ（４．３３ｍｍｏｌ、２当量）及び硫酸マグネシウム５７９ｍｇ（４．７６ｍｍｏｌ、２．２当量）を、ジクロロメタン６ｍＬ中に溶解させた。この溶液に、ジクロロメタン４ｍＬ中に可溶化したメチル４−（クロロカルボニル）ベンゾエート４９８ｍｇ（２．３８ｍｍｏｌ、１．１当量）を、滴下により３０分かけて添加した。反応混合物を３時間加熱還流し、この間それは濃紫色を帯び、次いで室温で冷却した。次いでＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１．６９ｍＬ（９．５３ｍｍｏｌ、４．４当量）、及び１５分後に三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート１．７６ｍＬ（１４．３ｍｍｏｌ、６．６当量）を添加した。反応混合物を再び３時間加熱還流し、この間蛍光が現れた。

【0125】

最終的に、溶液を水で希釈し、２回ジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。生じた混合物を、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカゲル上でシクロヘキサン／エーテルの勾配（９８：２〜９５：５〜９：１、ｖ／ｖ）を溶出液として使用して精製し、暗色橙色の固体４１１ｍｇ（収率４４％）を生成した。

【0126】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ 8.18 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 2.54 (s, 6H), 2.30 (q, J = 7.5 Hz, 4H), 1.26 (s, 6H), 0.96 (t, J = 7.5 Hz, 6H).
例１０
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＤＥ−Ｐｈ−ＣＯＯＨ（８−（４−カルボキシフェニル）−２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）

【化12】

【0127】

２つ口フラスコ中で、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＤＥ−Ｐｈ−ＣＯＯＭｅ １００ｍｇ（０．２３、１当量）をＴＨＦ２．５ｍＬ中に溶解させた。この溶液に、滴下により水酸化リチウム一水和物４８．３ｍｇ（１．１４、５当量）を含有する１ｍＬの水溶液を急速に添加した。反応混合物を撹拌下で５時間室温にて保持した。次いで、それを水で希釈し、３回酢酸エチルで抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。生じた混合物を、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカゲル上でジエチルエーテル／酢酸エチル／アセトン混合物（４．５：４．５：１、ｖ／ｖ）を使用して精製し、橙色の固体４１ｍｇ（収率４２％）を生成した。

【0128】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ 8.26 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.55 (s, 6H), 2.31 (q, J = 7.5 Hz, 4H), 1.28 (s, 6H), 0.99 (t, J = 7.5 Hz, 6H).

【0129】

例１１
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＤＥ−Ｐｈトリエトキシシラン（２，６−ジエチル−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバモイル）フェニル）−３ａ，４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）、Ｂ

【化13】

【0130】

窒素雰囲気下にて、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ、０．０７ｍｍｏｌ、２当量）１７μＬ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＤＥ−Ｐｈ−ＣＯＯＨ（０．０３５ｍｍｏｌ、１当量）１５ｍｇ、トリエチルアミン１０μＬ（ＴＥＡ、０．０７ｍｍｏｌ、２当量）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド１３ｍｇ（ＥＤＣ、０．０７ｍｍｏｌ、２当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物１０ｍｇ（ＨＯＢｔ、０．０７ｍｍｏｌ、２当量）を、ジクロロメタン中に溶解させ、終夜室温で撹拌した。

【0131】

反応混合物を次いで減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカ上でシクロヘキサン／ジエチルエーテル混合物（１：１、ｖ／ｖ）を溶出液として使用して精製し、生成物を橙色−黄金色の固体として１５．１ｍｇ（収率６８％）得た。

【0132】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ 7.94 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6,70 (bs, 1H), 3.86 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 3.53 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 2.54 (s, 6H), 2.31 (q, J = 7.6 Hz, 4H), 1.89-1.75 (m, 2H), 1.28-1.21 (m, 15H), 0.99 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 0.77 (t, J = 7.9 Hz, 2H).

【0133】

例１２
ローダミンＢトリエトキシシラン誘導体、Ｒの合成
ローダミンＢ誘導体Ｒを、報告した手順を使用して合成した。［J. Phys. Chem. B, 2010, 114(45), 14606-14613.］

【化14】

【0134】

例１３
ＤＥＡＣトリエトキシシラン。７−（ジエチルアミノ）−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミド（７−（ジエチルアミノ）−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）−プロピル）クマリン−３−カルボキサミド）、Ｄの合成
窒素雰囲気下にて、３−アミノプロピルトリエトキシシラン３４μＬ（ＡＰＴＥＳ、０．１４ｍｍｏｌ、２当量）、７−（ジエチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸１９ｍｇ（ＤＥＡＣ、０．０７ｍｍｏｌ、１当量）、トリエチルアミン２０μＬ（ＴＥＡ、０．１４ｍｍｏｌ、２当量）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド２６ｍｇ（ＥＤＣ、０．１４ｍｍｏｌ、２当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物２０ｍｇ（ＨＯＢｔ、０．１４ｍｍｏｌ、２当量）を、ジクロロメタン中に溶解させ、終夜室温で撹拌した。

【化15】

【0135】

反応混合物を次いで減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーの手段によってシリカ上でシクロヘキサン／酢酸エチル混合物（１：１、ｖ／ｖ）を溶出液として使用して精製し、生成物を黄色の固体として１５．７ｍｇ（収率４８％）得た。

【0136】

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz, 25℃) δ 8.81-8.85 (m, 1H), 8.71 (s, 1H), 7.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.65 (dd, J = 2.5 Hz, J = 8.8 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.83 (q, J = 6.9 Hz, 6H), 3.40-3.51 (m, 6H), 1.66-1.82 (m, 2H), 1.20-1.28 (m, 15H), 0.67-0.76 (m, 2H).
ESI-MS (M + H⁺) = 465.

【0137】

例１４
Ｃｈｒｏｍｉｓ ８００ Ｃ ＮＨＳのトリエトキシシラン誘導体、Ｃ７

【化16】

【0138】

ガラスバイアル中で、Ｃｈｒｏｍｉｓ ８００ Ｃ ＮＨＳ ０．８２ｍｇ（０．０００８ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ジクロロメタン２４５μＬで可溶化した。この溶液に、ジクロロメタン（０．００１６ｍｍｏｌ、２当量）中のＡＰＴＥＳの１：１０（ｖ／ｖ）溶液３．８μＬを添加した。混合物を終夜撹拌し、次いでさらに精製することなく使用した。

【0139】

例１５
Ｃｈｒｏｍｉｓ ８３０ Ａ ＮＨＳのトリエトキシシラン誘導体、Ｃ２

【化17】

【0140】

ガラスバイアル中で、Ｃｈｒｏｍｉｓ ８００ Ｃ ＮＨＳ ０．８８ｍｇ（０．０００８ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ジクロロメタン２４５μＬで可溶化した。この溶液に、ジクロロメタン（０．００１６ｍｍｏｌ、２当量）中のＡＰＴＥＳの１：１０（ｖ／ｖ）溶液３．８μＬを添加した。混合物を終夜撹拌し、次いでさらに精製することなく使用した。

【0141】

例１６
ナノ粒子合成
コアシェルシリカ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）ナノ粒子を、前に報告した手順を用いて合成した。［J. Phys. Chem. B, 2010, 114(45), 14605-14613］典型的な調製において、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７ １００ｍｇ及び所望量のシラン化又は水不溶性色素(複数可）をジクロロメタン１．０〜２．０ｍＬで、２０ｍＬのガラスシンチレーションバイアル中で慎重に可溶化した。溶媒を均質溶液から、穏やかな窒素流によって及び引き続いて真空下にて室温で蒸発させた。ＮａＣｌ（６８．６ｍｇ）を固体残渣に添加し、混合物を２５℃にて電磁攪拌下で、酢酸１Ｍを１５６５μＬ用いて可溶化した。ＴＥＯＳ（１７９μＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を次いで生じた水性均質溶液に、続いてＴＭＳＣｌ（１０μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を１８０分後に添加した。

【0142】

混合物を撹拌下で４８時間２５℃にて保持した後、透析処理した。透析精製段階を、水と対比して、５ｍＬの総容量に水で最終的に希釈したナノ粒子溶液（１５００μＬ）の正確な量で実施した。

【0143】

例１７
特に酸性環境において安定でない色素で使用することができる代替の合成スキーム
典型的な調製において、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７ １００ｍｇ及び所望量のシラン化又は水不溶性色素(複数可）をジクロロメタン１．０〜２．０ｍＬで、２０ｍＬのガラスシンチレーションバイアル中で慎重に可溶化した。溶媒を均質溶液から、穏やかな窒素流の手段によって及び引き続いて真空下にて室温で蒸発させた。ＮａＣｌ（６８．６ｍｇ）を固体残渣に添加し、混合物を２５℃にて電磁攪拌下で、水１５６５μＬを用いて可溶化した。ＴＭＯＳ（１１９μＬ、０．８ｍｍｏｌ）を次いで生じた水性均質溶液に、続いてＴＭＳＣｌ（１０μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）を１５分後に添加した。

【0144】

混合物を撹拌下にて４８時間２５℃で保持した後、透析処理した。透析精製段階を、水と対比して、５ｍＬの総容量に水で最終的に希釈したナノ粒子溶液（１５００μＬ）の正確な量で実施した。

【0145】

ＤＬＳ：ナノ粒子水力学的直径分布の決定を、６３３ｎｍのレーザーダイオードが備えられているＭａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ ＺＳ機器を採用する動的光散乱測定を介して実施した。試料を、１ｃｍの光路長の使い捨てポリスチレンキュベット中に、水を溶媒として使用して収容した。ＤＬＳ水力学的直径分布の幅をＰｄＩ（多分散指数）によって示す。キュムラント解析の手段によって算出した単一モード分布（ガウス）の場合はＰｄＩ＝（σ／Ｚ_avg）²であり、ここで、それぞれ、σは分布の幅であり、Ｚ_avgは粒子集団の平均直径である。

【0146】

ＴＥＭ実験：８０ｋＶで動作するＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ １００透過型電子顕微鏡を使用した。ＴＥＭ調査のため、Ｆｏｒｍｖａｒ支持膜によって覆われた３．０５ｍｍの銅グリッド（４００メッシュ）を、水で希釈した（１：５０）ナノ粒子溶液の１滴の沈殿後に真空下で乾燥させた。

【0147】

ＮＰのＴＥＭ画像は、シリカコアだけが画像に現れる充分なコントラストを持つことを示している。サイズ分布を、数百のナノ粒子のブロックを有する画像を分析して得た、図２（左）。得られたヒストグラムをガウス分布に従って一致させて、シリカナノ粒子コアについて（１１±３）ｎｍの平均直径を得た。

【0148】

光物理の測定：全てのＮＰ溶液が非常に弱い光散乱を示し、光物理の観点から分子種の任意の溶液として処理することができる。ＤＬＳ測定は数カ月後でさえもＮＰの凝集を示さない。

【0149】

ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトルを、２５℃にてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ４５分光光度計の手段によって記録した。１ｃｍの光路長を有する石英キュベットを使用した。蛍光スペクトルを、光電子増倍管Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｒ９２８Ｐが備えられているＥｄｉｎｂｕｒｇｈ ＦＬＳ９２０で記録した。ＰＣＳ９００ ＰＣカードに接続されている同機器を、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）実験のために使用した。ルミネセンス量子収率（不確実性、±１５％）を、エタノール中のローダミン６Ｇの溶液を基準（Φ＝０．９４）として使用して決定し、蛍光強度を、標準的方法に従って内部フィルター効果に対して補正した。［Montalti, M.; Credi, C.; Prodi, L.; Gandolfi, M.T. Handbook of Photochemistry, CRC Press Boca Raton (FL), 2006.］。

【0150】

全ての蛍光異方性測定を、Ｇｌａｎ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ偏光子が備えられているＥｄｉｎｂｕｒｇｈ ＦＬＳ９２０上で行った。異方性測定値を、Ｌ−フォーマット構成を使用して回収し、全てのデータを、Ｇ因子を使用して偏光バイアスに対して補正した。

【0151】

４つの異なるスペクトルを、励起及び放射の偏光子：Ｉ_VV、Ｉ_VH、Ｉ_HH、Ｉ_HV（ここで、Ｖは垂直を表し、Ｈは水平を表し、第１の添え字は励起を指し、第２の添え字は放射を表す）の異なる配向組み合わせた各試料について獲得した。スペクトルを、Ｇ因子及び異方性を算定するのに使用した。

【0152】

Ｇ＝Ｉ_HV／Ｉ_NH、ｒ＝（Ｉ_VV−ＧＩ_VH）／Ｉ_VV＋２ＧＩ_VH
［Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition, Lakowicz, J. R., Springer 2006］。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ａ．実質的に親水性のシェル及び実質的に疎水性の中心部分を有するミセルと、
ｂ．前記ミセルの中心部分の領域に位置し、シリケートネットワークを含むコアと、
ｃ．少なくとも1種類の界面活性剤の複数の分子であって、以下の構造
Ｍ¹−Ｈｙｄｒｏ¹−Ｌｉｐｏ−Ｈｙｄｒｏ²−Ｍ²
（式中、
Ｌｉｐｏは、実質的に疎水性の鎖を表し、
Ｈｙｄｒｏ¹及びＨｙｄｒｏ²は、互いに独立して、それぞれの実質的に親水性の鎖を表し、
Ｍ¹は、認識官能基であり、
Ｍ²は、−Ｈ、−ＯＨ、認識官能基及びヘテロ基からなる群より選択される）を有する官能化界面活性剤の少なくとも１種類の分子を含む複数の分子と、
ｄ．前記コアｂ）中の第１及び少なくとも第２の色素であって、前記第１及び前記少なくとも第２の色素は、エネルギー移動過程におけるドナー−アクセプター対のそれぞれの関係を有し、考慮するスペクトル領域についてモル吸光係数ε≧１０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1、蛍光量子収率Φ≧０．０１、前記ドナー及び前記アクセプター色素との間でのフェルスター理論による十分な重なり積分を有し、前記色素は親油性であってよいし、又はトリアルコキシシラン部分の導入に有用な官能基を持っていてもよい色素と
を含むシリカナノ粒子。
［２］
前記官能基がアミン、−ＣＯＯＨ、−Ｎ₃、アルキン、アルケン、アクリロイル、−ＳＨ、マレイミド、アルデヒド、−ＯＨ、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、ヨードアセチル、ＴＣＴ（２,４,６−トリクロロ−１,３,５−トリアジン）又は活性化カルボン酸基、例えばＮＨＳ及びＮＨＳ−スルホエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＴＦＰエステル（２,３,５,６−テトラフルオロフェノール）、ＰＦＰエステル（ペンタフルオロフェノール）、ＨＯＢｔエステル（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、Ｎ−アシルイミダゾールからなる群より選択される［１］に記載のナノ粒子。
［３］
前記ドナー色素がクマリン色素又はキサンテン誘導体色素である［１］又は［２］に記載のナノ粒子。
［４］
前記キサンテン誘導体色素がフルオレセイン又はその誘導体である［３］に記載のナノ粒子。
［５］
前記クマリン色素が７−（ジエチルアミノ）−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミド（Ｄ）又は１１−オキソ−Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−２,３,５,６,７,１１−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピラノ［２,３−ｆ］ピリド［３,２,１−ｉｊ］キノリン−１０−カルボキサミド（Ｄ２）である［３］に記載のナノ粒子。
［６］
前記アクセプター色素が（２,６−ジエチル−４,４−ジフルオロ−１,３,５,７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバモイル）フェニル）−３ａ,４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン）（Ｂ）、４,４−ジフルオロ−１,３,５,７−テトラメチル−８−（３−オキソ−３−（（３−（トリエトキシ−シリル）プロピル）アミノ）プロピル）−３ａ,４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン（Ｂ１）、４,４−ジフルオロ−１,３,５,７−テトラメチル−８−（４−（（３−（トリエトキシシリル）プロピル）カルバモイル）フェニル）−３ａ,４ａ−ジアザ−４−ボラ−ｓ−インダセン（Ｂ２）、ローダミンＢトリエトキシシラン誘導体（Ｒ）、シアニン２−（（１Ｅ,３Ｅ,５Ｅ）−５−（１−（６−（２,５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−６−オキソヘキシル）−３,３−ジメチルインドリン−２−イリ−デン）−ペンタ−１,３−ジエニル）−１−エチル−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウムヨージドのトリエトキシシラン誘導体（Ｃ５）、シアニン２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２,５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェノキシ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１,１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロ−へキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１,１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウムヨージドのトリエトキシシラン誘導体（Ｃ７）、及びシアニンナトリウム２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（４−（５−（２,５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）−５−オキソペンタンアミド）フェニルチオ）−３−（（Ｚ）−２−（３−エチル−１,１−ジメチル−６−スルホナト−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−２（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エニル）ビニル）−３−エチル−１,１−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドリウム−６−スルホネートのトリエトキシシラン誘導体（Ｃ２）からなる群から選択される［１］から［５］のいずれか一に記載のナノ粒子。
［７］
ＤＢ、ＤＲ、ＤＣ５、ＤＢＲ、ＤＢＣ５、ＤＲＣ５、ＤＢＲＣ５、ＤＢＲＣ５Ｃ７及びＤ２Ｂ２Ｃ５Ｃ２からなる群より選択される色素の組合せを含む［５］及び［６］に記載のナノ粒子。
［８］
前記ナノ粒子がＢＲ、ＢＣ５、ＲＣ５、ＢＲＣ５からなる群より選択される色素の組合せを含む［１］に記載のナノ粒子。
［９］
治療、診断及びセラノステックにおける、特にはプローブとしての、［１］から［８］のいずれか一のナノ粒子の使用。
［１０］
分析化学における、特にはプローブとしての、［１］から［８］のいずれか一のナノ粒子の使用。
［１１］
［１］から［８］のいずれか一の、適切な量のナノ粒子を含む診断又はセラノステックの組成物。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】