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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6143270
(24)【登録日】2017年5月19日
(45)【発行日】2017年6月7日
(54)【発明の名称】マイオスタチン阻害ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20170529BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20170529BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20170529BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20170529BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47ZNA
C07K7/08
A61K37/02
A61P21/04
【請求項の数】15
【全頁数】48
(21)【出願番号】特願2014-559788(P2014-559788)
(86)(22)【出願日】2014年1月31日
(86)【国際出願番号】JP2014052345
(87)【国際公開番号】WO2014119753
(87)【国際公開日】20140807
【審査請求日】2016年1月29日
(31)【優先権主張番号】特願2013-17540(P2013-17540)
(32)【優先日】2013年1月31日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】592068200
【氏名又は名称】学校法人東京薬科大学
(73)【特許権者】
【識別番号】597039984
【氏名又は名称】学校法人 川崎学園
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100185959
【弁理士】
【氏名又は名称】今藤 敏和
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】林 良雄
(72)【発明者】
【氏名】伊東 史子
(72)【発明者】
【氏名】薬師寺 文華
(72)【発明者】
【氏名】高山 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】青木 進
(72)【発明者】
【氏名】野口 百合
(72)【発明者】
【氏名】砂田 芳秀
(72)【発明者】
【氏名】大澤 裕
(72)【発明者】
【氏名】西松 伸一郎
【審査官】
森井 文緒
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００８−５０６６３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００５−５０７６３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００１／００７４７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
砂田芳秀，Myostatin prodomainにおけるmyostatin阻害領域の解析，骨格筋増殖抑制因子myostatinの活性阻害による筋ジストロフィー治療薬の開発 平成19年度総括・分担研究報，２００８年，p.6-9
【文献】
砂田芳秀，Myostatin prodomainにおけるmyostatin阻害領域の解析，筋ジストロフィーおよびその関連する疾患の病態生理の解明と治療薬物の開発に関する研究 清水班平成17〜19，２００８年，p.126
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ｃ）のペプチドまたはその薬学的に許容される塩：
（ｃ）配列番号２、５〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、１以上６以下のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、もしくは１又は２のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、マイオスタチンの活性を選択的に阻害するペプチドであって、
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、以下の少なくとも１つの置換：
（１）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンがフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンにより置換；
（２）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１のグルタミン酸がα−アミノイソブタン酸により置換；
（３）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０のリシンがα−アミノイソブタン酸により置換；
（４）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７のチロシンがフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンにより置換；
（６）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２１のトリプトファンが、炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環の少なくも１つを有するカルボン酸又はアミノ酸により置換：
（７）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが、夫々、ロイシン又はノルロイシンにより置換；
（８）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンがイソロイシン又はノルロイシンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる。
配列番号２：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号５：NTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号６：WRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号７：AWRQNTRYSRIEAIKIEILSKLRL
配列番号８：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLR
配列番号９：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKL
配列番号４０：WRTRYSRIEAIKIQILSKLRL
（ｃ）配列番号２、５〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、１以上６以下のアミノ酸が置換又は欠失されたアミノ酸配列、もしくは１又は２のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、マイオスタチンの活性を選択的に阻害するペプチドであって、
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、以下の少なくとも１つの置換：
（１）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンがフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンにより置換；
（２）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１のグルタミン酸がα−アミノイソブタン酸により置換；
（３）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０のリシンがα−アミノイソブタン酸により置換；
（４）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７のチロシンがフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンにより置換；
（６）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２１のトリプトファンが、炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環の少なくも１つを有するカルボン酸又はアミノ酸により置換：
（７）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが、夫々、ロイシン又はノルロイシンにより置換；
（８）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンがイソロイシン又はノルロイシンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる。
配列番号２：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号５：NTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号６：WRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号７：AWRQNTRYSRIEAIKIEILSKLRL
配列番号８：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLR
配列番号９：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKL
配列番号４０：WRTRYSRIEAIKIQILSKLRL
【請求項2】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンが、フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンにより置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１のグルタミン酸がα−アミノイソブタン酸により置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０のリジンがα−アミノイソブタン酸により置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７のチロシンがフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンにより置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２のいずれか１以上のアミノ酸がアラニンにより置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２１のトリプトファンが、炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環の少なくとも１つを有するカルボン酸又はアミノ酸により置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
前記カルボン酸が、１−アダマンタン酢酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−（２−フルオロフェニル）−プロピオン酸、３−（３−フルオロフェニル）−プロピオン酸又は３−（４−フルオロフェニル）−プロピオン酸から選択される、請求項７に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項9】
前記アミノ酸が、アセチル−Ｌ−トリプトファンである、請求項７に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項10】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが、夫々、ロイシン又はノルロイシンにより置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項11】
前記（ｃ）のペプチドが、配列番号２、５〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンがイソロイシン又はノルロイシンにより置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項12】
配列番号１０〜４８で表されるアミノ酸配列からなる、マイオスタチンの活性を選択的に阻害するペプチド又はその薬学的に許容される塩。
【請求項13】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩を含む、マイオスタチン関連障害を治療するための医薬組成物。
【請求項14】
マイオスタチン関連障害が筋萎縮障害である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
筋萎縮障害が、デュシェンヌ筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジェリン・ランドゥジー筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー又は小児神経軸索筋ジストロフィーから選択される少なくとも一つである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨格筋増殖抑制因子マイオスタチン（ＧＤＦ８）の作用を選択的に阻害する新規なペプチド、及び当該ペプチドを含む医薬組成物に関る。【背景技術】
【0002】
筋ジストロフィーは、骨格筋の変性・壊死を主病変とし、筋力低下が進行する遺伝性疾患である。筋力の発現には、細胞内の筋原繊維で生じた張力を複数の蛋白質を介して細胞外の基底膜まで伝達する仕組みが必要である。これに携わる蛋白質群をコードする遺伝子の不具合は、当該蛋白質の機能を損なうため、筋ジストロフィーが起こる。例えば、最も重篤なデュシェンヌ型では、ジストロフィン遺伝子が変異し、当該蛋白質の欠失や機能不全が主因となる。そこで、筋ジストロフィーでの骨格筋の変性壊死に対抗する一手段として、骨格筋量を負に制御する因子である「マイオスタチン」の機能を阻害することで、筋肉量を増加させる治療法の開発が特に有用と考えられている。【0003】
マイオスタチンは、ＴＧＦ−βと同様に前駆体タンパク質として分泌後、プロドメイン部分がｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＡＰ）として残存し、マイオスタチン本体と相互作用することで、マイオスタチンを不活性化する。そして、ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦ-ｂｅｔａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＬＴＢＰ)との結合を介して細胞外マトリックスに潜在し、体内でのマイオスタチンリザーバーとして働く。即ち、必要な時に、ＬＡＰが酵素的に除去され活性体となるのである。このことから、ＬＡＰ部分にはマイオスタチンと結合し、その活性を抑制できるペプチド構造が存在することが予測された。２００４年にＪｉａｎｇらはこの認識配列が前駆体配列４２−１１５位に存在することを報告している（非特許文献１）。さらに最近、Ｗａｌｔｏｎらは、この認識配列として、ＴＧＦ−β１の前駆体配列４２−５７位（マウスマイオスタチンの５０−６５位に相当）に存在するαへリックスの重要性を指摘している（非特許文献２）。
【0004】
また、マイオスタチンの機能が阻害されることで、骨格筋量の増大に繋がることを示す研究がこれまで複数報告されている。例えば、ヒト及び複数の動物においてマイオスタチン遺伝子異常によるマイオスタチン関連筋肥大症が報告されている（非特許文献３）。更に、当該遺伝子を不全にしたマウスでは、筋肉量が２−３倍増大することも報告されている（非特許文献４）。これらの結果は、マイオスタチンを骨格筋量の増強を目的とする医薬品開発における有効な分子標的として位置づけるのみならず、マイオスタチン活性の阻害による筋量増大・筋力強化は、Ｐｒｏｏｆ ｏｆ cｏｎｃｅｐｔ (ＰＯＣ)が確立された創薬課題と言える。従って、高活性で標的分子選択性に優れかつ安全性の高い化合物を創製できれば、筋ジストロフィーを克服する治療薬開発に極めて有用である。しかしながら、現時点での具体的創薬例は、主に高分子蛋白質を用いる例である。即ち、マイオスタチンに対する特異的中和抗体（ＭＹＯ−０２９）を用いた臨床試験（Ｐｈａｓｅ ＩＩ）では、ベッカー型及び肢帯型筋ジストロフィー患者の筋肥大効果が確認されている（非特許文献５）。また、マイオスタチン可溶性受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）を利用した研究では、担癌マウスの筋量増加、がん細胞による筋肉破壊の軽減により、癌悪液質の改善が報告されている（非特許文献６）。一方、ＴＧＦ−ｂｅｔａファミリーの細胞内情報伝達を担うＳｍａｄ２のリン酸化を阻害するキナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２が知られている。本阻害剤はマイオスタチンの細胞内情報伝達も抑制することが知られているが（非特許文献７）、ＴＧＦ−ｂｅｔａファミリー間の選択性は低い。したがって、高い選択性を有するマイオスタチンシグナルの阻害剤としては、マイオスタチン自体の機能を阻害する分子が有用と言える。
【0005】
このように、標的分子選択性に優れかつ安全性が高く、ヒトおよび動物のマイオスタチンに対して高い阻害活性を有する医薬品として有用な化合物は未だ見出されていない。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】ＢＢＲＣ、３１５、５２５（２００４）
【非特許文献2】ＪＢＣ、２８５、１７０２９（２０１０）
【非特許文献3】Schuelke, M., et al., N Engl J Med, 350, 2682(2004)
【非特許文献4】McPherron, A. C., et al., Nature, 387, 83 (1997)
【非特許文献5】Wagner, K. R., et al., Ann Neurol, 63, 561 (2008)
【非特許文献6】Zhou, X., et al., Cell, 142, 531 (2010)
【非特許文献7】Watt, K.I., et al., Muscle Nerve, 41, 624 2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、マイオスタチンに対して選択的で高い阻害活性を有し、筋肉の過形成、筋肉重量増加を可能とする治療薬を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、マウス由来マイオスタチンプロドメイン配列中の部分ペプチドを合成し、ヒト／マウスマイオスタチンの活性を阻害するペプチドの探索を精力的に行ったところ、特定の残基を有するペプチドに阻害活性があり、濃度依存的にヒトマイオスタチン受容体を介したシグナルを強く阻害すること、および該ペプチドを世界で初めて明らかにした。【0009】
即ち、本発明は、［１］以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩：
（ａ）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETA
配列番号２：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号３：NTRYSRIEAIKIQILSKLRLETA
配列番号４：SRIEAIKIQILSKLRLETA
配列番号５：NTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号６：WRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL
配列番号７：AWRQNTRYSRIEAIKIEILSKLRL
配列番号８：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLR
配列番号９：AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKL
配列番号４０：WRTRYSRIEAIKIQILSKLRL
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列を含み、かつ長さが３０のアミノ酸以下のペプチド；
（ｃ）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、１以上６以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、マイオスタチンの活性を選択的に阻害するペプチド；又は
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドの誘導体。
［２］前記誘導体が、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドに対する任意のタイプの分子の共有結合によって化学的に修飾されたペプチド、又は前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含むＦｃ融合タンパク質である、［１］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［３］前記誘導体が、下記式（Ｉ）：
（化１）
Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （Ｉ）
（式中、Ｒ1は、水素原子、アシル基、スルホニル基又は炭化水素基を表し：
Ｒ2は、水素原子、アルコキシ基、ポリエチレングリコール類似基、炭化水素基、アミン基を表し：
Ｘは請求項１の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのペプチド残基又は、当該ペプチド残基の両末端又は片末端の１つのアミノ酸残基が削除されたペプチド残基を表す。）で表される、［１］又は［２］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［４］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、以下の少なくとも１つの置換：
（１）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンがフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンにより置換；
（２）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１のグルタミン酸がα−アミノイソブタン酸により置換；
（３）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０のリシンがα−アミノイソブタン酸により置換；
（４）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７のチロシンがフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンにより置換；
（５）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２のいずれか１以上のアミノ酸が別のアミノ酸により置換：
（６）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２１のトリプトファンが、炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環の少なくも１つを有するカルボン酸又はアミノ酸により置換：
（７）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが、夫々、ロイシン又はノルロイシンにより置換；
（８）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンがイソロイシン又はノルロイシンにより置換；
されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［５］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンが、フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンにより置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［６］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１のグルタミン酸がα−アミノイソブタン酸により置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［７］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０のリジンがα−アミノイソブタン酸により置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［８］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７のチロシンがフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンにより置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［９］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２のいずれか１以上のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１０］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２のいずれか１以上のアミノ酸がアラニンにより置換されたアミノ酸配列からなる、［９］に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１１］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２１のトリプトファンが、炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環の少なくとも１つを有するカルボン酸又はアミノ酸により置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１２］前記カルボン酸が、１−アダマンタン酢酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−（２−フルオロフェニル）−プロピオン酸、３−（３−フルオロフェニル）−プロピオン酸又は３−（４−フルオロフェニル）−プロピオン酸から選択される、［１１］に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１３］前記アミノ酸が、アセチル−Ｌ−トリプトファンである、［１１］に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１４］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが、夫々、ロイシン又はノルロイシンにより置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１５］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンがイソロイシン又はノルロイシンにより置換されたアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１６］前記（ｃ）のペプチドが、配列番号１０〜４８で表されるアミノ酸配列からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩。
［１７］配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、以下の少なくとも１つの置換：
（１）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンがフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンにより置換；
（２）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１のグルタミン酸がα−アミノイソブタン酸により置換；
（３）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０のリジンがα−アミノイソブタン酸により置換；
（４）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７のチロシンがフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンにより置換；
（５）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２のいずれか１以上のアミノ酸が別のアミノ酸により置換：
（６）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２１のトリプトファンが、炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環の少なくとも１つを有するカルボン酸又はアミノ酸により置換：
（７）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが、夫々、ロイシン又はノルロイシンにより置換；
（８）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンがイソロイシン又はノルロイシンにより置換；
がされたアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体、又はこれらの薬学的に許容される塩。
［１８］［１］〜［１７］のいずれか１項に記載のペプチド又はその薬学的に許容される塩を含む、マイオスタチン関連障害を治療するための医薬組成物。
［１９］マイオスタチン関連障害が筋萎縮障害である、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］筋萎縮障害が、デュシェンヌ筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジェリン・ランドゥジー筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー又は小児神経軸索筋ジストロフィーから選択される少なくとも一つである、［１９］に記載の医薬組成物。
を、提供するものである。
【発明の効果】
【0010】
本発明のペプチドは、マイオスタチンに対して選択的で高い阻害活性を有する。また、本発明のペプチドは、生体におけるマイオスタチン阻害の原理を、そのまま小さなペプチド分子で実現しているため、副作用が少なく、選択性の高い医薬品化合物を創製することが可能である。【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】プロドメイン−Ｆｃ融合蛋白質発現プラスミドの構築
【図2】Ｉｎ ｖｉｔｒｏマイオスタチン転写活性測定系によるプロドメインの活性阻害中心の解析
【図3A】プロドメイン−Ｆｃ融合蛋白質共発現によるマイオスタチン活性阻害中心の同定結果
【図3B】プロドメイン−Ｆｃ融合蛋白質共発現によるマイオスタチン活性阻害中心の同定結果
【図4】合成ペプチド添加によるマイオスタチン活性阻害の検討結果
【図5】種々の合成ペプチドのマイオスタチン活性阻害の比較
【図6】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１、２、３及び５のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図7】ペプチド１のマイオスタチン阻害活性の濃度依存性
【図8】ペプチド２のマイオスタチン阻害活性の濃度依存性
【図9】ペプチド３のマイオスタチン阻害活性の濃度依存性
【図10】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１、４、６及び７のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図11】ウエスタンブロットによるペプチド１〜３、８のマイオスタチンシグナル阻害活性の評価結果
【図12】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１のＴＧＦ−β３阻害活性の評価結果
【図13】ペプチド１の野生型マウス大腿部筋に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｖｏ評価）
【図14】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１０のＴＧＦ−β３阻害活性の評価結果
【図15】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１３および１４のマイオスタチン阻害活性評価
【図16】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１５〜２２のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図17】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド２３〜２９のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図18】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３０およびペプチド３１のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図19】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３２〜３６のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図20】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３７およびペプチド３８のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図21】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３９〜４４のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図22】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド４５のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図23】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド４６のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図24】Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド４７〜５３のマイオスタチン阻害活性の評価結果
【図25】ペプチド１のＣ２Ｃ１２筋芽細胞に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価）
【図26】ペプチド１の野生型マウス大腿部筋に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｖｏ評価）（ＨＥ染色）
【図27】ペプチド１の野生型マウス大腿部筋に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｖｏ評価）（細胞数の統計学的解析）
【図28】ペプチド１の野生型マウス大腿部筋に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｖｏ評価）（免疫染色）
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の１つの態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩：（ａ）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列を含み、かつ長さが３０のアミノ酸以下のペプチド；
（ｃ）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、１以上６以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、マイオスタチンの活性を選択的に阻害するペプチド；又は
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドの誘導体
である。本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、骨格筋増殖抑制因子マイオスタチン（ＧＤＦ８）の作用を選択的に阻害することができる。
【0013】
本明細書において、「マイオスタチン活性を阻害する」とは、例えばＣＡＧＡ１２-ｌｕｃレポーター導入細胞に基づくマイオスタチン活性アッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、または以下に記載するようなｉｎ ｖｉｖｏ動物試験によって立証されるように、ペプチドまたはこれを含む医薬組成物が、マイオスタチン活性またはシグナル伝達を減少させるかまたは遮断する能力を指す。【0014】
上記（ａ）のペプチドが有するアミノ酸配列を以下の表に示す。【0015】
ペプチド本明細書において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸の分子を指す。本発明のペプチドは、好ましくは、長さ約１０〜３０アミノ酸の間、より好ましくは、長さ１５〜２５アミノ酸の間であり、そしてマイオスタチン・タンパク質に結合することが可能である。
【0016】
本発明のペプチドは、天然マウスマイオスタチンのプロドメインに存在する活性配列を含む。本発明の配列番号１〜６、８〜９で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、マウス由来マイオスタチンのプロドメインの部分ペプチドである。例えば、配列番号１を例にとると、表１中の説明のmMPS(20-46)は、マウス由来マイオスタチンプロドメイン配列中のＮ末端から２０番目から４６番目のアミノ酸配列を有することを示す。
また、配列番号７のmMPS(20-43)Q36Eは、マウス由来マイオスタチンプロドメイン配列中のＮ末端から２０番から４３番目のアミノ酸配列においてＮ末端から３６番目のＱ（グルタミン）がＥ（グルタミン酸）で置換されたアミノ酸配列を有することを示す。また、配列番号４０のmMPS(21-43)ΔQ23N24は、マウス由来マイオスタチンプロドメイン配列中のＮ末端から２１番から４３番目のアミノ酸配列においてＮ末端から２３番目のＱと２４番目のＮが欠失しているアミノ酸配列を有することを示す。
【0017】
上記（ａ）のペプチドとしては、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号２〜８のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、配列番号２、配列番号６〜７のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが更に好ましい。【0018】
本発明のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列を含み、かつ長さが３０のアミノ酸以下のペプチド（以下「（ｂ）のペプチド」ともいう）を含む。アミノ酸の長さは、好ましくは、１０〜３０であり、より好ましくは、１５〜２５である。【0019】
本発明のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、１以上６以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、マイオスタチンの活性を選択的に阻害するペプチド（以下「（ｃ）のペプチド」ともいう）を含む。ここで、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、１以上６以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ一もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１以上６以下（好ましくは１以上５以下、より好ましくは１以上３以下、更に好ましくは１又は２）のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加があることを意味し、置換、欠失もしくは付加が同時に生じてもよい。配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、１以上６以下のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列としては、例えば、（１）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列中の１以上６以下（好ましくは１以上５以下、より好ましくは１以上３以下、更に好ましくは１又は２）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列に１以上６以下（好ましくは１以上５以下、より好ましくは１以上３以下、更に好ましくは１又は２）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（３）配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列中の１以上６以下（好ましくは１以上５以下、より好ましくは１以上３以下、更に好ましくは１又は２）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）上記（１）〜（３）の変異が組み合わされたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が１以上６以下（好ましくは１以上５以下、より好ましくは１以上３以下、更に好ましくは１又は２））が挙げられる。
【0020】
置換または付加されるアミノ酸としては、通常のアミノ酸（例えば、蛋白質を構成するアミノ酸として知られる２０種類のＬ-アミノ酸、即ちＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＬ−システインが挙げられるが、これに限定されるものではなく、例えば、ｔｅｒｔ-ロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、２−アミノブタン酸、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、ホモセリン等の他のアミノ酸、および天然由来のアミノ酸）とともに、異常アミノ酸（例えば、天然等から得られる場合もあるが、化学合成により創出することができるアミノ酸やペプチド合成に用いられる保護基や蛍光基、側鎖にアミンや窒素があればアシル化、スルホン化、リン酸化などされたアミノ酸、側鎖にカルボキシル基があればエステル化、アミド化、還元されたアミノ酸、側鎖に水酸基があればエーテル化、リン酸化、硫酸化されたあるいはハロゲンやニトロ基に置換されたアミノ酸、他の官能基を有するアミノ酸で、例示すれば、アミノアルキルカルボン酸、アミノイソブタン酸に代表される様なαアルキルアミノ酸、ピリジン等のヘテロ環を側鎖に有するアミノ酸、モノおよび多置換βアミノ酸、アミノ基とカルボキシル基を置換基に有する複素環化合物、アミノシクロヘキサンやアミノフリル酢酸の様なアミンとカルボン酸を置換基に有する環状化合物、アミノフェニル酢酸等のアミノ酸、インドール環が修飾されたトリプトファン誘導体、イミダゾール環が修飾されたヒスチジン誘導体、β−ハロアラニン、ハロアルキルアラニン、環状アミンの炭素部分にカルボキシル基やカルボン酸を有するアミノ酸、トラネキサム酸、レボドバ、メチルドパ、メルファラン、バクロフェン）、または両方を含有することも可能である。【0021】
上記（ｃ）のペプチドにおいて、付加は、ペプチドのいずれかの末端または両末端に位置することも可能であるし、あるいはペプチドのアミノ酸配列の内部領域内に位置することも可能である。【0022】
また、上記（ｂ）のペプチドにおいて、欠失は、ペプチドの一方の末端または両方の末端での、あるいはペプチドのアミノ酸配列内の１以上の残基の除去により達成することも可能である。【0023】
また、上記（ｃ）のペプチドには、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの置換変異体も含まれる。これらの変異体は、活性の向上または生体酵素に対する安定性を向上させうるものであれば何でも良いが、置換変異体には、１以上のアミノ酸残基が除去され、そして１以上の別のアミノ酸と交換されているペプチドが含まれ、交換するアミノ酸は、天然存在または非天然存在であることも可能である。置換変異体は、２つの分子が、特定の割合で同一アミノ酸を有する点で、元来のペプチドに「類似」であるペプチドを生成する。置換の数は、ペプチドのアミノ酸の２０パーセントまでであることも可能である。さらに、変異体としては各アミノ酸残基の保存的な構造変化による配列を含む。例えばロイシンからイソロイシンやセリンからスレオニン、グルタミンからグルタミン酸、アスパラギンからアスパラギン酸、リジンからアルギニンなどである。
【0024】
関連ペプチドの同一性および類似性は、既知の方法によって容易に計算可能である。こうした方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．監修， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．監修， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏら， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。【0025】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンが置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、３２位のアラニンを置換するアミノ酸としては、好ましくは、フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンから選択される。【0026】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１位のグルタミン酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、３１位のグルタミン酸を置換するアミノ酸としては、好ましくはα−アミノイソブタン酸である。【0027】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０位のリジンが置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、４０位のリジンを置換するアミノ酸としては、好ましくはα−アミノイソブタン酸である。【0028】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７位のチロシンが置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、２７位のチロシンを置換するアミノ酸としては、好ましくはフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンから選択される。【0029】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２位のいずれか１以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。また、好ましい側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２のいずれか１以上のアミノ酸がアラニンにより置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。【0030】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２１位のトリプトファンが置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、２１位のトリプトファンは、好ましくは炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環を有するカルボン酸又はアミノ酸により置換される。脂肪鎖は飽和鎖、不飽和鎖、鎖状、環状のものであって良く、さらに分岐鎖構造を取っていても良い。また、脂肪鎖は、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などの置換基を有していてもよい。
芳香族環及び／又は複素環を有するカルボン酸においては、炭素数Ｃ１〜Ｃ４の脂肪鎖カルボン酸を有する芳香族環および複素環で、芳香族環はＣ１２以下の炭素数であり、複素環は、酸素、窒素、イオウ原子を環内に含むもので、ヘテロ原子の数が４個以下で炭素数８以下のものを指す。これらの環には置換基数０〜３の置換基があっても良く、置換基としては、それぞれＣ６以下の脂肪鎖、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲンなどである。置換基は、原子６以下からなる。
炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環を有するカルボン酸としては、好ましくは、１−アダマンタン酢酸、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３−（２−フルオロフェニル）−プロピオン酸、３−（３−フルオロフェニル）−プロピオン酸又は３−（４−フルオロフェニル）−プロピオン酸が挙げられる。また、炭素数がＣ１〜Ｃ１０の脂肪鎖、又は、芳香族環及び／又は複素環を有するアミノ酸としては、好ましくは、アセチル−Ｌ−トリプトファンである。
【0031】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、イソロイシンを置換するアミノ酸としては、好ましくは、ロイシン又はノルロイシンである。２以上のイソロイシンを置換する場合は、いずれもロイシンにより置換してもよく、いずれもノルロイシンにより置換してもよく、あるいは、ロイシンとノルロイシンにより置換してもよい。【0032】
本発明の一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９、４０のいずれかで表されるアミノ酸配列において、マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンが置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ここで、ロイシンを置換するアミノ酸としては、好ましくは、イソロイシン又はノルロイシンである。【0033】
本発明のもう一つの側面において、上記（ｃ）のペプチドは、配列番号１〜９のいずれか、又は４０で表されるアミノ酸配列において、以下の少なくとも１つの置換：（１）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３２位のアラニンがフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ヒスチジン又はチロシンにより置換；
（２）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３１のグルタミン酸がα−アミノイソブタン酸により置換；
（３）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４０のリジンがα−アミノイソブタン酸により置換；
（４）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２７のチロシンがフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン又はアルギニンにより置換；
（５）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が２２、２３、２４、２８、３１、３４、３６、３９、４０、４２のいずれか１以上のアミノ酸が別のアミノ酸により置換：
（６）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ端からの番号が２１のトリプトファンが、嵩高い脂肪鎖構造又は芳香族環で置換されたカルボン酸又はアミノ酸により置換：
（７）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が３０，３３、３５、３７のいずれか１以上のイソロイシンが、夫々、ロイシン又はノルロイシンにより置換；
（８）マウス由来マイオスタチンプロドメインのＮ末端からの番号が４３のロイシンがイソロイシン又はノルロイシンにより置換；
されたアミノ酸配列からなるペプチドである。
【0034】
本発明の更に一つの側面において、前記（ｃ）のペプチドは、配列番号１０〜４８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。【0035】
本発明のペプチドには、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドの誘導体も含まれる（以下「（ｄ）のペプチド」ともいう。）。本明細書において、用語「誘導体」は、マイオスタチンへの結合能を保持する、アミノ酸残基への挿入、アミノ酸残基の欠失、または置換以外の、またはこれらに加えた修飾を指す。具体的には、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドに対する任意のタイプの分子の共有結合によって化学的に修飾されたペプチド、又は上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含むＦｃ融合タンパク質である。【0036】
好ましくは、誘導体を生じるために本発明のペプチドに行う修飾は、共有性であり、そして例えば、ポリマー、脂質、他の有機部分、および無機部分との化学的結合が含まれる。一方、本発明のペプチドは二次構造としてα−へリックスを有するペプチドであり、マイオスタチンの阻害活性の強化には、本発明のペプチドのα−へリックス性をさらに強化した誘導体や生体内酵素により分解され難い構造へ変換した誘導体も本発明に包含される。前者には、アミノ酸配置として、i, i+4 位等に塩橋を形成した誘導体、ジスルフィド結合、炭素−炭素結合などにより、外側を架橋した誘導体を含んでも良い。例えば、塩橋を形成した誘導体としては、配列番号７があげられる。更に、生体内酵素により分解され易い構造を改善した誘導体も含まれる。
【0037】
その典型的な誘導体は、活性の向上または生体酵素に対する安定性を向上させうるものであれば何でも良いが、特に以下のような化合物が含まれる：１．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端は、（１）Ｃ１〜Ｃ２０の脂肪酸で修飾可能であり、脂肪酸としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルアルケニル基、アルアルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、さらにｐ−フルオロベンゾイルなどの安息香酸誘導体、アリールおよびヘテロアリールカルボン酸などを含み、（２）カルボン酸を含む核酸やビタミンの誘導体で修飾されているもので、例えばオロチン酸や５-フルオロオロチン酸などを含み、（３）ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールなどでＰＥＧ化、糖化されているものなどを含み、（４）ペプチド合成に一般的に使用される保護基（例えば、Ｂｏｃ基、Ｚ基など）やカルバメート誘導体で修飾されているものなどを含み、（５）アミノ酸から容易に誘導されるカルボン酸（例えば、ピログルタミン酸、モロタン酸など）で修飾されているものなどを含み、さらに（７）ベンゼンスルホン酸などのスルホン酸誘導体、リン酸誘導体、さらに、Ｃ１〜Ｃ２０の炭化水素基で修飾可能であり。さらにそれらがＮ端のアミノ基を含んで環状構造を形成していても良い。
典型的なＮ末端誘導基には、アセチル、プロピオニル、カプロイル、パルミトイル、ベンゾイル、置換ベンゾイル、オキサゾールカルボキシル、イミダゾールカルボキシル、オロチニル、５−フルオロオロチニル、乳酸、ピルビン酸、グルコン酸、ターシャリーブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ピログルタミル、エチル、ジメチル、アセトアミドメチル、ベンゼンスルホニル、アミノ基自体が変換されたピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノ、イミダゾリノ、チソゾリジノ、ピロジニノ基が含まれる。
【0038】
２．Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端はアミド化（例えば、エチルアミド等のアルキルアミド）あるいはエステル化されている。アミドおよびエステルのアミン部およびアルコール部は、活性の向上または生体酵素に対する安定性を向上させうるものであれば何でも良いが、一般にＣ０からＣ１０の炭素数を含むもので良く、その中に、酸素、窒素、硫黄、ハロゲンなどが含まれるアミンおよびアルコールで良い。アルコールには、多価アルコール、糖、エーテル構造を含むアルコールなども含まれる。また、アミンには生体アミン、アミノ酸から容易に誘導されるアミンにより修飾されることも可能である。典型的なＣ末端誘導体基には、エチルアミド、イソプロピルアミド、ベンジルアミド、シアノエチルアミド、エチルエステル、イソプロピルエステル、ベンジルエステル、グルコース等が含まれる。また、体内動態の改善に寄与する末端に水酸基やアミノ基を有するポリエチレングリコール類似体がエステル結合やアミド結合で結合していても良く、当該ポリエチレングリコールの炭素数は４〜２０で、ポリエチレングリコール基の反対側の末端は、アルキル基など水酸基の保護に使われる一般的な保護基で修飾されていても良い。ポリエチレングリコール類似体には、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどが含まれる。【0039】
本発明の一つの側面において、（ｄ）のペプチド（（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドの誘導体）は、下記式（Ｉ）：Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （Ｉ）で表されるペプチドである。
式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素原子、アシル基、スルホニル基、炭化水素基を表す。
Ｒ１がアシル基の場合は、種々のカルボン酸から誘導されるアシル基が含まれる。すなわち、脂肪鎖を有するカルボン酸、芳香族環および複素環を有するカルボン酸から誘導されるアシル基である。また、アシル基には、アミノ酸誘導体、フリーのアシル基を有するビタミンおよびビタミン誘導体、フリーのアシル基を有する核酸塩基誘導体よりなる群の中から選ばれたアシル基も含まれる。
脂肪鎖を有するカルボン酸においては、その炭素数がＣ１〜Ｃ１０であって、脂肪鎖は飽和鎖、不飽和鎖、鎖状、環状のものであって良く、さらに分岐鎖構造を取っていても良い。また、脂肪鎖は、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などの置換基を有していてもよい。また、脂肪鎖は、複数の酸素原子を有するＣ４〜Ｃ１５のポリエーテル鎖であっても良い。
芳香族環および複素環を有するカルボン酸においては、炭素数Ｃ１〜Ｃ４の脂肪鎖カルボン酸を有する芳香族環および複素環で、芳香族環はＣ１２以下の炭素数であり、複素環は、酸素、窒素、イオウ原子を環内に含むもので、ヘテロ原子の数が４個以下で炭素数８以下のものを指す。これらの環には置換基数０〜３の置換基があっても良く、置換基としては、それぞれＣ６以下の脂肪鎖、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲンなどである。置換基は、原子６以下からなる。
ヘテロ環がインドール誘導体である場合の芳香族環および複素環を有するカルボン酸から誘導されるアシル基としては、種々のインドール環が挙げられるが、以下の式（１）で表されるアシル基が挙げられる。
式中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基又はＯ−アルキル基であり、好ましくは、水素原子、低級アルキル基又は低級Ｏ−アルキル基であり；Ｒ４は、水素原子、アルキル基、脂肪鎖スルホキシル基又は芳香族スルホキシル基であり、好ましくは、水素原子又は低級アルキル基であり；Ｒ５は、水素原子、アルキル基又はＯ−アルキル基であり、好ましくは、水素原子、低級アルキル基又は低級Ｏ−アルキル基である。式（１）において、各々のＲ５は同じであっても異なっていてもよい。また、ｑは０〜３の整数である。
Ｒ１のアシル基として用いられるビタミンおよびビタミン誘導体はとくに限定されない。例えば、ニコチン酸、ｐ−パントテン酸、ビオチン、プテロイルグルタミン酸、オロチン酸、フルオロオロチン酸、リポ酸、５−ピリドキシン酸、ビオチンｐ−，Ｌ−スルホキシド、ビオチンスルホン、ビオシチン、プテロイン酸、１０−ホルミルプテロイン酸、７，８−ジヒドロ葉酸、（−）Ｌ−Ｈ，葉酸、ホモプロテイン酸、６−カルボキシプテリン、ジヒドロリポ酸、ハイドロオロチン酸などが挙げられる。
さらに、式（Ｉ）における核酸の塩基またはその誘導体とは、一般にヌクレオチドを構成する塩基成分およびその誘導体を指すが、好ましくはピリミジン誘導体等、例えば５−カルボキシメチルウラシル、５−カルボキシチオウラシル等を例示することができる。
Ｒ１がスルホニル基である場合は、上記アシル基で説明したのと同等であり、スルホニル基には、アシル基のカルボニル構造をスルホン構造に変換した構造を有するものが含まれる。
Ｒ１が炭化水素基である場合は、その炭素数がＣ１〜Ｃ１０であって、炭化水素鎖は飽和鎖、不飽和鎖、鎖状、環状のものであって良く、さらに分岐鎖構造を取ってもよい。芳香族環および複素環を有する炭化水素基においては、炭素数Ｃ０〜Ｃ３の炭化水素鎖を有する芳香族環および複素環で、芳香族環はＣ１２以下の炭素数であり、複素環は、酸素、窒素、イオウ原子を環内に含むもので、ヘテロ原子の数が４個以下で炭素数８以下のものを指す。これらの環には置換基数０〜３の置換基があっても良く、置換基としては、それぞれＣ６以下の脂肪鎖、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲンなどである。置換基は、原子６以下からなる。
Ｒ１として、例えば、アセチル、プロピオニル、カプロイル、パルミトイル、ベンゾイル、置換ベンゾイル、オキサゾールカルボキシル、イミダゾールカルボキシル、オロチニル、５−フルオロオロチニル、ラクチル、ピルビル、グルコリル又はピログルタミル、ターシャリーブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、エチル、ジメチル、アセトアミドメチル、ベンゼンスルホニル、アミノ基自体が変換されたピペリジノ、モルホリノ、ピペラジノ、イミダゾリノ、チソゾリジノ又はピロジニノが挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
Ｒ２は、水素原子、アルコキシ基、ポリエチレングリコール類似基、炭化水素基、アミン基を表す。Ｒ２がアルコキシ基を有するエステル構造では、その炭素数がＣ１〜Ｃ１８であって、炭化水素部分は飽和鎖、不飽和鎖、鎖状、環状のものであって良く、さらに分岐鎖構造を取っていても良い。芳香族環および複素環を有する炭化水素部分においては、炭素数Ｃ０〜Ｃ４の炭化水素鎖を有する芳香族環および複素環で、芳香族環はＣ１２以下の炭素数であり、複素環は、酸素、窒素、イオウ原子を環内に含むもので、ヘテロ原子の数が４個以下で炭素数８以下のものを指す。これらの環には置換基数０〜３の置換基があっても良く、置換基としては、それぞれＣ６以下の炭化水素鎖、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲンなどである。置換基は、原子６以下からなる。
Ｒ２がポリエチレングリコール類似基を有するエステルまたはアミドの構造では、体内動態の改善に寄与する、末端に水酸基やアミノ基を有するポリエチレングリコールがエステル結合やアミド結合で結合していても良く、当該ポリエチレングリコールの炭素数は４〜２０で、ポリエチレングリコール基の反対側の末端は、アルキル基など水酸基の保護に使われる一般的な保護基で修飾されていても良い。
Ｒ２が炭化水素基を有するケトン構造においても、アルコキシ基と同様に定義される。
Ｒ２がアミン基においては、その窒素上の置換基が、水素、炭化水素基又はアミン基であって、どちらも窒素原子上の一方または両方にあっても良い。
炭化水素基は、炭素数がＣ１〜Ｃ１８であって、炭化水素部分は飽和鎖、不飽和鎖、鎖状、環状のものであって良く、さらに分岐鎖構造を取っていても良い。芳香族環および複素環を有する炭化水素部分においては、炭素数Ｃ０〜Ｃ４の炭化水素鎖を有する芳香族環および複素環で、芳香族環はＣ１２以下の炭素数であり、複素環は、酸素、窒素、イオウ原子を環内に含むもので、ヘテロ原子の数が４個以下で炭素数８以下のものを指す。これらの環には置換基数０〜３の置換基があっても良く、置換基としては、それぞれＣ６以下の炭化水素鎖、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲンなどである。置換基は、原子６以下からなる。
アミン基は、アミノ基（ヒドラジンとなる）や置換アミノ基であって、置換基としては水素、炭化水素基であって、どちらも窒素原子上の一方または両方にあっても良い。炭化水素基は、炭素数がＣ１〜Ｃ１８であって、炭化水素部分は飽和鎖、不飽和鎖、鎖状、環状のものであって良く、さらに分岐鎖構造を取っていても良い。芳香族環および複素環を有する炭化水素部分においては、炭素数Ｃ０〜Ｃ４の炭化水素鎖を有する芳香族環および複素環で、芳香族環はＣ１２以下の炭素数であり、複素環は、酸素、窒素、イオウ原子を環内に含むもので、ヘテロ原子の数が４個以下で炭素数８以下のものを指す。これらの環には置換基数０〜３の置換基があっても良く、置換基としては、それぞれＣ６以下の炭化水素鎖、Ｃ５以下のアルコキシ鎖、アミノ基、置換アミノ基、カルボキシル基、エステル基、カルバモイル基、置換カルバモイル基、アミド基、置換アミド基、グアジノ基、ニトロ基、スルホン酸基、スルホンアミド、ハロゲンなどである。置換基は、原子６以下からなる。
Ｒ２として、例えば、水素原子、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ベンジルアミノ基、シアノエチルアミノ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ベンジルオキシ基又は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グルコシル基が挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
Ｘは前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のペプチドのペプチド残基又は、当該ペプチド残基の両末端又は片末端の１つのアミノ酸残基が削除されたペプチド残基を表す。）で表されるペプチドである。【0042】
上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドを含むＦｃ融合タンパク質は、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドのＮ末端または／およびＣ末端にＦｃを付加したものである。ここで、Ｆｃは、抗体の非抗原結合断片で、具体的にはヒトの免疫グロブリン等に由来するヒト完全Ｆｃが例示される。他のタンパク質又はペプチドとしては、抗体、抗体の部分であるポリペプチドのフラグメントが挙げられる。これら抗体又はポリペプチドのフラグメントは、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンド又はその他のタンパク質に対する結合、その他によって化学的に修飾してもよい。【0043】
本発明のペプチドは、化学合成、タンパク質の消化、または組換え技術を含む、当該技術分野に知られる方法のいずれかによって調製することが可能である。マイオスタチンに結合可能なペプチドを生成するには、ファージディスプレイおよびＲＮＡ−ペプチド・スクリーニング、および他のアフィニティースクリーニング技術が特に有用である。【0044】
本発明のペプチドを化学合成により調製するには、各アミノ酸をペプチド化学において通常用いられる方法、例えば、「ザ ペプチド(The Peptides)」第１巻〔Schroder and Luhke著, Academic Press, New York, U.S.A.(1966年)〕、「ペプチド合成の基礎と実験」〔泉屋信夫ら著丸善（株）(1985年)〕等に記載されている方法によって製造することが可能であり、液相法及び固相法のいずれによっても製造できる。さらに、カラム法、バッチ法のいずれの方法も用いることができる。【0045】
ペプチド結合を形成するための縮合方法として、アジド法、酸ハライド法、酸無水物法、カルボジイミド法、カルボジイミド−アディティブ法、活性エステル法、カルボニルイミダゾール法、酸化還元法、酵素法、ウッドワード試薬Ｋ、ＨＡＴＵ試薬、Ｂｏｐ試薬を用いる方法等を例示することができる。なお、固相法での縮合反応は上記した方法のうち、酸無水物法、カルボジイミド法、及び活性エステル法が主な方法として挙げられる。【0046】
さらに、固相法でペプチド鎖を延長するときは、Ｃ末端アミノ酸を用いる有機溶媒に対して不溶な樹脂等の支持体に結合する。ここでは、アミノ酸を樹脂に結合させる目的で官能基を導入した樹脂や、樹脂と官能基の間にスペーサーを挿入したもの、更に条件によって種々の箇所で切断できるハンドル（ｈａｎｄｌｅ）と称する鎖を導入した樹脂を目的に応じて用いることもできる。このような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂などのハロメチル樹脂、オキシメチル樹脂、４−(オキシメチル)−フェニルアセトアミドメチル樹脂、４−(オキシメチル)−フェノキシメチル樹脂、Ｃ末端アミド化用樹脂などを挙げることができる。なお、これらの縮合反応を行なう前に、通常公知の手段によって当該縮合反応に関与しないカルボキシル基やアミノ基や水酸基やアミジノ基等の保護手段を施すことができる。また逆に当該縮合反応に直接関与するカルボキシル基やアミノ基を活性化することもできる。【0047】
各ユニットの縮合反応に関与しない官能基の保護手段に用いる保護基としては有機化学において通常用いられている保護基、例えば、「プロテクティブ グループス イン オーガニック シンセシス(Protective Groups in Organic Synthesis)〔Greene著、John Wiley & Sons, Inc.(1981年）〕等に記載されている保護基によって保護することが可能である。【0048】
カルボキシル基の保護基としては、例えば、各種のメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル、ｔ−ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等の通常公知の保護基を挙げることができる。アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基等を挙げることができる。【0049】
カルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、当該カルボキシル基に対応する酸無水物；アジド；ペンタフルオロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等との活性エステル等を挙げられる。【0050】
アミノ基の活性化されたものとしては、当該アミノ基に対応する燐酸アミド等を挙げることができる。ペプチド合成の際の縮合反応は、通常溶媒中で行なわれる。当該溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、水、メタノール等、または、これらの混合物を挙げることができる。また、当該縮合反応の反応温度は、通常の場合と同様に、−３０℃〜５０℃の範囲で行なうことができる。【0051】
さらに、本発明のペプチドの製造工程における保護基の脱離反応の種類は、ペプチド結合に影響を与えずに保護基を離脱させることができる限りにおいて、用いる保護基の種類に応じて選択することができる。例えば、塩化水素、臭化水素、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこれらの混合物等による酸処理、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ヒドラジン、ジエチルアミン、ピペリジン等によるアルカリ処理、液体アンモニア中におけるナトリウム処理やパラジウム炭素による還元及び、トリメチルシリルトリフラート、トリメチルシリルブロマイド等のシリル化処理等が挙げられる。なお、上記の酸またはシリル化剤処理による脱保護基反応においては、アニソール、フェノール、クレゾール、チオアニソール、エタンジチオールの如きカチオン補足剤を添加するのが、脱保護基反応が効率的に実行されるという点において好ましい。【0052】
なお、固相法で合成した本発明のペプチドの固相からの切断方法も通常公知の方法に従う。例えば、上記の酸またはシリル化剤による処理等を当該切断方法として挙げることができる。このようにして製造された本発明のペプチドに対しては、上記の一連の反応の終了後に通常公知の分離、精製手段を駆使することができる。例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、カラムクロマトグラフィー等によって、より純粋なかたちで本発明のペプチドを収得することができる。【0053】
また、ファージディスプレイ技術は、例えば、各々、本明細書に援用される、Ｓｃｏｔｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４（１９９０）；米国特許第５，２２３，４０９号、１９９３年６月２９日発行；米国特許第５，７３３，７３１号、１９９８年３月３１日発行；米国特許第５，４９８，５３０号、１９９６年３月１２日発行；米国特許第５，４３２，０１８号、１９９５年７月１１日発行；米国特許第５，３３８，６６５号、１９９４年８月１６日発行；米国特許第５，９２２，５４５号、１９９９年７月１３日発行；ＷＯ ９６／４０９８７、１９９６年１２月１９日公開；およびＷＯ ９８／１５８３３、１９９８年４月１６日公開に記載される。ファージライブラリーを用いて、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって、ランダムペプチド配列をディスプレイする。【0054】
本発明のペプチドを調製する他の方法には、当該技術分野に知られるさらなるアフィニティー選択技術が含まれる。ペプチドライブラリーをｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端で融合させて、そして大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）で発現させることも可能である。大腸菌に基づく別の方法は、ペプチドグリカン会合リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって、細胞の外膜上でのディスプレイを可能にする。本明細書において、これ以降、これらの方法および関連法を、まとめて「大腸菌ディスプレイ」と称する。別の方法において、リボソーム放出前にランダムＲＮＡの翻訳を停止して、会合するＲＮＡがまだ付着したポリペプチドのライブラリーを生じる。【0055】
本発明のペプチドの薬学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、金属塩、有機塩基付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。有機塩基付加塩としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、アニリン等の一級アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン等の二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン等の三級アミン等とで形成される塩、アンモニウム塩等が挙げられる。【0056】
本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩は単離又は精製されていることが好ましい。「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の純度（ペプチドまたはその薬学的に許容される塩の全重量に対する、本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の重量の割合）は、通常５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば１００％）である。【0057】
ペプチドの活性本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、マイオスタチンに結合し、そしてターゲットとされた細胞内のマイオスタチンシグナル伝達を遮断するかまたは阻害する。
本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、好ましくはヒトマイオスタチンに結合し、そしてターゲットとされた細胞内のマイオスタチンシグナル伝達を遮断するかまたは阻害する。
【0058】
本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩のマイオスタチンに結合し、そしてマイオスタチン活性を阻害するかまたは遮断する能力を決定するには、いかなる種類のアッセイまたは動物試験を用いることが可能である。本発明のペプチドを性質決定するのに用いられるいくつかのアッセイを、以下の実施例に記載する。１つのアッセイは、レポーターアッセイであり、該アッセイは、マイオスタチンシグナルに応答するレポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子を細胞内に導入し、０．１％血清含有培地での培養後、マイオスタチン添加時のレポーター活性（発光量）を測定するものである
以下に記載する第二のアッセイは、ウエスタンブロットによるマイオスタチンシグナル活性評価であり、該評価法は、０．１％血清含有培地での培養後にマイオスタチンを添加し、細胞ライセートをポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）により分子量の大きさで分離したゲルをＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜へ電気的に転写し、リン酸化Smad-2を認識する一次抗体、更に一次抗体認識抗体（二次抗体）を添加してSmad-2のリン酸化（マイオスタチンシグナル活性化）量をバンドとして検出・測定するものである。
【0059】
医薬組成物本発明のもう一つの態様は、上記（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含む、マイオスタチン関連障害を治療するための医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、有効投与量を対象に投与することによって、対象におけるマイオスタチンの量または活性を減少させることができる。１つの側面において、本発明は、対象においてマイオスタチン関連障害を治療する方法および医薬組成物であって、該対象に１以上のペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物の有効投与量を投与することを含むものを提供する。
本発明の医薬組成物を投与する対象には、魚類を含む動物が挙げられるが、好ましくはヒト、及びマウス、牛、ブタ、馬（競走馬を含む）、家禽などの産業上有用な哺乳・鳥類などの動物が含まれる。
【0060】
これらのマイオスタチン関連障害には、限定されるわけではないが、筋萎縮の多様な型とともに、糖尿病および関連障害などの代謝障害、並びに骨粗しょう症などの骨変性疾患が含まれる。筋萎縮障害には、デュシェンヌ筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジェリン・ランドゥジー筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー、および小児神経軸索筋ジストロフィーなどのジストロフィーが含まれる。【0061】
また、本発明の医薬組成物は、通常歩行に障害をもつ老人を対象とした局所投与による前脛骨筋の強化にも有効である。前脛骨筋を強化するのみでも足関節の背屈が容易になり、転倒防止に繋がる。また、本発明の医薬組成物は、廃用性筋萎縮も対象となり得る。たとえば、宇宙飛行士による筋力低下は、姿勢保持や歩行を担う筋肉で特に著しい。宇宙滞在時の継続的な局所投与を実施できれば、帰還後のリハビリ期間短縮等に貢献できる。
また、本発明の医薬組成物は、封入体筋炎（ＩＢＭ）も対象となり得る。
更に、本発明の医薬組成物の全身投与の対象として、寝たきり患者の廃用性筋萎縮や老年症候群のサルコペニアが挙げられる。
【0062】
さらなる筋萎縮障害は、筋萎縮性側索硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、癌、ＡＩＤＳ、腎不全、および関節リウマチなどの慢性疾患から生じる。例えば、マイオスタチンを全身投与することによって、無胸腺ヌードマウスにおいて、悪液質または筋萎縮および体重減少が誘導された（Ｚｉｍｍｅｒｓら）。したがって、本発明の医薬組成物は、筋肉の萎縮を伴う悪液質の改善に利用できる。【0063】
さらに、マイオスタチンレベルを減少させることによって、筋量を増加させると、骨強度が改善され、そして骨粗しょう症および他の変性骨疾患を減少させることも可能である。例えば、マイオスタチン欠損マウスが、マウス上腕骨のミネラル含量および密度の増加、並びに筋が付着する領域の、骨梁部および皮質骨両方のミネラル含量の増加とともに筋量の増加を示すことが見出された（Ｈａｍｒｉｃｋら、 Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ７１（１）：６３−８（２００２））。【0064】
本発明はまた、動物に上記（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含むマイオスタチン結合剤の有効投薬量を投与することによって、食用動物における筋量を増加させる方法および試薬も提供する。成熟Ｃ末端マイオスタチン・ポリペプチドは、試験した全ての種で高度に保存されているため、マイオスタチン結合剤は、ウシ、ニワトリ、七面鳥、およびブタを含む、農業的に重要な種のいずれにおいても、筋量を増加させ、そして脂肪を減少させるのに有効であると期待される。
【0065】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載するような、療法的または予防的に有効な量のペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、医薬的に許容しうる剤と組み合わせて含む。好ましい態様において、医薬組成物は、医薬的に許容しうる剤と混合された、マイオスタチンを部分的または完全に阻害するアンタゴニスト結合剤を含む。典型的には、マイオスタチン結合剤は、対象に投与するため、十分に精製されているであろう。【0066】
本発明の医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸着または浸透を修飾するか、維持するか、または保存する配合物質を含有することも可能である。適切な配合物質には、限定されるわけではないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）；充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；増量剤（ｆｉｌｌｅｒ）；単糖；二糖および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン類など）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤；フレーバー剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増進剤（スクロースまたはソルビトール）；等張化増進剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトールソルビトール）；搬送ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬剤佐剤が含まれる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）。【0067】
最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、搬送形式、および望ましい投薬量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記を参照されたい。こうした組成物は、結合剤の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼしうる。【0068】
医薬組成物中の主なビヒクルまたはキャリアーは、水性または非水性いずれであることも可能である。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアーは、注射用水、生理学的食塩水溶液または人工的脳脊髄液であって、場合によって非経口投与用の組成物に一般的な他の物質が補充されているものであることも可能である。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水が、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な薬剤組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはさらにソルビトールまたはひいては適切な代用物を含むことも可能である。本発明の１つの態様において、結合剤組成物は、凍結乾燥ケークまたは水性溶液の形で、場合による配合剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と、望ましい度合いの純度を有する選択した組成物を混合することによって、保存用の結合剤組成物を調製することも可能である。さらに、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、結合剤産物を凍結乾燥物として配合することも可能である。【0069】
医薬組成物を非経口搬送用に選択することも可能である。あるいは、吸入または経腸搬送のため、例えば経口、耳、眼、直腸、または膣搬送のため、組成物を選択することも可能である。こうした薬学的に許容しうる組成物は、当該技術分野の技術範囲内である。【0070】
また、本発明の医薬組成物は、徐放系で投与することができる。徐放組成物の好適な例は、造形品の形態の半透ポリマー材料、例えばフィルムまたはマイクロカプセルを含む。徐放性材料は、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸エステルのコポリマー（Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983))、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（R. Langer et al., Id.）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）を含む。徐放医薬組成物は、リポソームに封入した化合物を含んでいてもよい。リポソーム含有医薬組成物は、自体公知の方法：E 3,218,121； Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985)； Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980)； ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２，３２４によって製造される。通常は、リポソームは、約３０モルパーセントのコレステロール以上の脂質含有量であり、選択された割合は最適な治療のために調節される、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型のものである。また、本医薬組成物は、局所投与としてイオントフォレシスにより経皮的に導入することも可能である。さらに、口腔、鼻腔、咽頭、気管および肺に対しては吸入による導入が可能である。一方、全身および局所投与よる部位選択的な送達においては、バブルリポソームと超音波の組合せによる導入も可能である。【0071】
本発明の医薬組成物においてペプチド又はその薬学的許容される塩は、投与部位に許容されうる濃度で存在する。例えば、緩衝液を用いて、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に、組成物を維持する。【実施例】
【0072】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【0073】
［実施例１］（１）マイオスタチンのプロドメインの活性阻害中心の同定
マイオスタチン前駆体のＮ末端に相当するプロドメインの、Ｃ末端成熟マイオスタチンへの阻害作用について、その活性阻害中心を同定するために、図１で示すようにプロドメイン各領域と免疫グロブリンＦｃ融合蛋白質発現プラスミドを構築した。
次に、図２に示すように、マイオスタチンの細胞内エフェクターであるＳｍａｄ２／３認識配列［（ＣＡＧＡ）１２］の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだレポータープラスミドとプロドメイン−Ｆｃ融合蛋白質発現プラスミドをヒト腎芽細胞に共発現させた。培地へのリコンビナントマイオスタチン刺激によって転写阻害活性をアッセイした。
【0074】
プロドメイン−Ｆｃ融合蛋白質共発現によるマイオスタチン活性阻害中心の探索をした結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。プロドメイン各領域（１〜８）のうち、１１０アミノ酸残基からなるＰｒｏｄ−２は、２６２アミノ酸残基からなるプロドメイン全長（Ｐｒｏｄ−１）より高い阻害活性を示した。このＰｒｏｄ−２から約７０％の阻害活性を示すＰｒｏｄ−７（２９アミノ酸残基）を絞り込んだ。【0075】
（２）合成ペプチド添加によるマイオスタチン活性阻害の検討次に、Ｐｒｏｄ−７に相当するペプチド（Ｐｒｏｄ−７ペプチド）と、コントロールとして、Ｐｒｏｄ−７のアミノ酸逆配列のペプチド（Ｒｅｖ．Ｐｒｏｄ−７ペプチド）を化学合成してマイオスタチン活性を比較した。図４で示すように、合成ペプチドの培地への添加は、最終１μＭの濃度でマイオスタチン活性を８０％阻害した。
【0076】
（３）種々の合成ペプチドのマイオスタチン活性阻害の比較Ｐｒｏｄ−７ペプチドと、種々の合成ペプチド（合成方法は後述する各実施例に記載した）について、マイオスタチン阻害活性を測定した結果を図５に示す。各々最終１μＭの合成ペプチドを培地に添加した。ここで、ペプチド０は配列番号１で表されるペプチドであり、Ｐｒｏｄ−７ペプチドに対して、Ｎ末端の１残基、及びＣ末端の１残基を削った配列を有する。図５で示すように、ペプチド１はＰｒｏｄ−７ペプチドと、ほぼ同等のマイオスタチン阻害活性を示した。
【0077】
以下の配列番号を有するペプチドを実施例及び参考例において合成した。mMPS：マウス由来マイオスタチンプロドメインの部分ペプチド
（ ）内は、プロドメインのＮ末端からの番号
hMPS：ヒト由来マイオスタチンプロドメインの部分ペプチド
mMPS(26-41)mut：α−へリックスを破壊した部分ペプチド
Human/mouse TGFβ3 precursor (30-53)：mMPS(20-43)に相当するヒト／マウス由来TGFβ3部分ペプチド
【0078】
［実施例２］ペプチド１の合成
AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド１）
配列番号２を有するペプチド１を以下に示すＦｍｏｃ固相ペプチド合成法により合成した。
Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０４７ｍｍｏｌ）を固相合成用反応容器に量りとり、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中室温で２時間静置し樹脂を膨潤させた後、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３ｍＬ）中室温で２０分間反応させることで樹脂上の保護基Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチオキシカルボニル）基を除去した。ＤＭＦ（３ｍＬ）で１０回樹脂を洗浄し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２２ｍｇ（０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）０．０２３ｍＬ（０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）存在下Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ４８ｍｇ（０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）を室温で２時間ＤＭＦ中反応させ樹脂上にアミノ酸を導入した。次のアミノ酸を縮合させるため、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３ｍＬ）中２０分間反応させることで樹脂上のＦｍｏｃ基を除去した。以下、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの場合と同様にして順次Ｃ末端側からＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（９１ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（４８ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（６６ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（９１ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（４８ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（４８ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（８６ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（４８ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（６６ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（４８ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（４４ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（６０ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ（４８ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（９１ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（９１ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（６４ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（８４ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（８６ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（９１ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（７４ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（４４ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）を導入しペプチド鎖を伸長させた。２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３ｍＬ）中２０分間反応させることでＮ末端のＦｍｏｃ基を除去し、ＤＭＦ（３ｍＬ、１０回）、メタノール（３ｍＬ、５回）、クロロホルム（３ｍＬ、５回）の順に洗浄し樹脂を乾燥させた。側鎖保護基の除去及び脱樹脂のため、ｍ−クレゾール（０．１２５ｍＬ）、チオアニソール（０．１２５ｍＬ）、１，２−エタンジチオール（０．０５０ｍＬ）存在下トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５．０ｍＬ中２時間反応させた。ガラスフィルター付きロートを用いてろ過することで樹脂を除去した後、ロータリーエバポレーターによりＴＦＡを減圧留去し、ジエチルエーテル１００ｍＬを加えて粗精製ペプチドを析出させた。粗精製ペプチドを１Ｍ酢酸に溶解し、高速液体クロマトグラフィーを用いて精製することにより、白色固体を得た（１５．３ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ、８．１％）。
HRMS(ES+) calcd for (M3++3H) 986.2442, found 986.2116.
【0079】
［実施例３］ペプチド２の合成
NTRYSRIEAIKIQILSKLRLETA-NH2（ペプチド２）
配列番号３を有するペプチド２をＲｉｎｋアミド樹脂（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）５０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１６．１ｍｇ、０．００４５ｍｍｏｌ、１９％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）543.9262，found 543.9313．
【0080】
［実施例４］ペプチド３の合成
SRIEAIKIQILSKLRLETA-NH2（ペプチド３）
配列番号４を有するペプチド３をＲｉｎｋアミド樹脂（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）５０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１２．６ｍｇ、０．００４４ｍｍｏｌ、１９％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）437.2657，found 437.2602．
【0081】
［実施例５］ペプチド４の合成
NTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド４）
配列番号５を有するペプチド４はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（８．８ｍｇ、０．００２９ｍｍｏｌ、５．４％）。
HRMS（ES+）calcd for（M3++3H）805.4960，found 805.4984．
【0082】
［実施例６］ペプチド１１の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド１１）
配列番号６を有するペプチド１１はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１４．１ｍｇ、０．００４０ｍｍｏｌ、７．２％）。
HRMS（ES+）calcd for（M５++５H）577.7485，found 577.7549．
【0083】
［実施例７］ペプチド１２の合成
AWRQNTRYSRIEAIKIEILSKLRL-NH2（ペプチド１２）
配列番号７を有するペプチド１２はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１０．８ｍｇ、０．００２６４ｍｍｏｌ、９．６％）。
HRMS（ES+）calcd for（M3++3H）986.2494，found 986.2457．
【0084】
［実施例８］ペプチド１３の合成
AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLR-NH2（ペプチド１３）
配列番号８を有するペプチド１３はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（６．７ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ、３．３％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）711.422，found 711.4211．
【0085】
［実施例９］ペプチド１４の合成
AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKL-NH2（ペプチド１４）
配列番号９を有するペプチド１４はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（９．５ｍｇ、０．００２６ｍｍｏｌ、４．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M3++3H）896.1930，found 896.1958．
【0086】
［実施例１０］ペプチド１５の合成
WAQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド１５）
配列番号１０を有するペプチド１５はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（４．７ｍｇ、０．００１６ｍｍｏｌ、５．５％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）700.6677，found 700.6661．
【0087】
［実施例１１］ペプチド１６の合成
WRANTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド１６）
配列番号１１を有するペプチド１６はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（４．７ｍｇ、０．００１３ｍｍｏｌ、５．３％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）566.3442，found 566.3473．
【0088】
［実施例１２］ペプチド１７の合成
WRQATRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド１７）
配列番号１２を有するペプチド１７はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（４．８ｍｇ、０．００１４ｍｍｏｌ、６．２％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）711.1823，found 711.1854．
【0089】
［実施例１３］ペプチド１８の合成
WRQNARYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド１８）
配列番号１３を有するペプチド１８はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２．２ｍｇ、０．０００６２ｍｍｏｌ、２．５％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）714.4311，found 714.4288．
【0090】
［実施例１４］ペプチド１９の合成
WRQNTAYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド１９）
配列番号１４を有するペプチド１９はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）８０ｍｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（４．６ｍｇ、０．００１４ｍｍｏｌ、３．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）702.9259，found 702.9250．
【0091】
［実施例１５］ペプチド２０の合成
WRQNTRASRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド２０）
配列番号１５を有するペプチド２０はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）８０ｍｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１６．６ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ、１０．８％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）698.9272，found 698.9250．
【0092】
［実施例１６］ペプチド２１の合成
WRQNTRYARIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド２１）
配列番号１６を有するペプチド２１はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）８０ｍｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（３５．１ｍｇ、０．００９９ｍｍｏｌ、２１．４％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）574.5496，found 574.5444．
【0093】
［実施例１７］ペプチド２２の合成
WRQNTRYSRIAAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド２２）
配列番号１７を有するペプチド２２はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）８０ｍｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２７．７ｍｇ、０．００７９ｍｍｏｌ、１７．０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）566.1475，found 566.1432．
【0094】
［実施例１８］ペプチド２３の合成
WRQNTRYSRIEAIAIQILSKLRL-NH2（ペプチド２３）
配列番号１８を有するペプチド２３はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１４．０ｍｇ、０．００４１ｍｍｏｌ、１６．９％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）707.6693，found 707.6689．
【0095】
［実施例１９］ペプチド２４の合成
WRQNTRYSRIEAIKIAILSKLRL-NH2（ペプチド２４）
配列番号１９を有するペプチド２４はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１９．２ｍｇ、０．００５５ｍｍｏｌ、２２．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）566.3442，found 566.3425．
【0096】
［実施例２０］ペプチド２５の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILAKLRL-NH2（ペプチド２５）
配列番号２０を有するペプチド２５はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（７．９ｍｇ、０．００２２ｍｍｏｌ、１１．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）574.5496，found 574.5496．
【0097】
［実施例２１］ペプチド２６の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILSALRL-NH2（ペプチド２６）
配列番号２１を有するペプチド２６はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)１００ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（３．２ｍｇ、０．０００９４ｍｍｏｌ、３．８％）。
HRMS（ES+）calcd for（M3++3H）943.2331，found 943.2232．
【0098】
［実施例２２］ペプチド２７の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILSKARL-NH2（ペプチド２７）
配列番号２２を有するペプチド２７はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）８１．５ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１８．１ｍｇ、０．００５１ｍｍｏｌ、１１．４％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）711.4220，found 711.4183．
【0099】
［実施例２３］ペプチド２８の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILSKLAL-NH2（ペプチド２８）
配列番号２３を有するペプチド２８はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）８１．５ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２８．８ｍｇ、０．００８５ｍｍｏｌ、１９．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）700.6677，found 700.6633．
【0100】
［実施例２４］ペプチド２９の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRA-NH2（ペプチド２９）
配列番号２４を有するペプチド２９はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）８１．５ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（３１．２ｍｇ、０．００８８ｍｍｏｌ、１９．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）569.3391，found 569.3355．
【0101】
［実施例２５］ペプチド３０の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRA-NH2（ペプチド３０）
配列番号２５を有するペプチド３０はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)５５ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（６．０ｍｇ、０．００１７ｍｍｏｌ、１２．３％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）717.9350，found 717.9410．
【0102】
［実施例２６］ペプチド３１の合成
WRQNTRWSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド３１）
配列番号２６を有するペプチド３１はTentaGel S RAM樹脂 (０．２５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社)５５ｍｇ（０．０１４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（５．６ｍｇ、０．００１６ｍｍｏｌ、１１．３％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）727.6877，found 727.6931．
【0103】
［実施例２７］ペプチド３２の合成
WRQNTRYSRIEFIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド３２）
配列番号２７を有するペプチド３２はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１８．２ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、24.6％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）592.9548，found 592.9555．
【0104】
［実施例２８］ペプチド３３の合成
WRQNTRYSRIEYIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド３３）
配列番号２８を有するペプチド３３はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１６．０ｍｇ、０．００４４ｍｍｏｌ、２１．５％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）596.1537，found 596.1620．
【0105】
［実施例２９］ペプチド３４の合成
WRQNTRYSRIEWIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド３４）
配列番号２９を有するペプチド３４はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２２．５ｍｇ、０．００６１ｍｍｏｌ、３０．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）600.7570，found 600.7562．
【0106】
［実施例３０］ペプチド３５の合成
WRQNTRYSRIEHIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド３５）
配列番号３０を有するペプチド３５はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１３．８ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ、１８．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）590.9529，found 590.9570．
【0107】
［実施例３１］ペプチド３６の合成
WRQNTRYSRIEXIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝ホモフェニルアラニン（ペプチド３６）
配列番号３１を有するペプチド３６はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１９．３ｍｇ、０．００５３ｍｍｏｌ、２６．０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）595.7579，found 595.7608．
【0108】
［実施例３２］ペプチド３７の合成
WRQNTRYSRIXAIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝α−アミノイソブタン酸（ペプチド３７）
配列番号３２を有するペプチド３７はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（９．７ｍｇ、０．００２８ｍｍｏｌ、１４．０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）568.9506，found 568.9470．
【0109】
［実施例３３］ペプチド３８の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQILSXLRL-NH2、Ｘ＝α−アミノイソブタン酸（ペプチド３８）
配列番号３３を有するペプチド３８はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２７．５ｍｇ、０．００８１ｍｍｏｌ、３９．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++4H）711.1732，found 711.1719．
【0110】
［実施例３４］ペプチド３９の合成
XRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝１−アダマンタン酢酸（ペプチド３９）
配列番号３４を有するペプチド３９はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（４．２ｍｇ、０．００１２ｍｍｏｌ、５．８％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）575.7567，found 575.7684．
【0111】
［実施例３５］ペプチド４０の合成
XRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（ペプチド４０）
配列番号３５を有するペプチド４０はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（３．１ｍｇ、０．０００８８ｍｍｏｌ、４．３％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）572.3464，found 572.3454．
【0112】
［実施例３６］ペプチド４１の合成
XRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝３−（２−フルオロフェニル）−プロピオン酸（ペプチド４１）
配列番号３６を有するペプチド４１はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（６．５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ、９．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）570.5423，found 570.5367．
【0113】
［実施例３７］ペプチド４２の合成
XRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝３−（３−フルオロフェニル）−プロピオン酸（ペプチド４２）
配列番号３７を有するペプチド４２はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（４．４ｍｇ、０．００１２ｍｍｏｌ、６．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）570.5423，found 570.5423．
【0114】
［実施例３８］ペプチド４３の合成
XRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝３−（４−フルオロフェニル）−プロピオン酸（ペプチド４３）
配列番号３８を有するペプチド４３はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（６．５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ、９．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）570.5423，found 570.5455．
【0115】
［実施例３９］ペプチド４４の合成
XRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝アセチル−Ｌ−トリプトファン（ペプチド４４）
配列番号３９を有するペプチド４４はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１２．０ｍｇ、０．００３３ｍｍｏｌ、１６．４％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）586.1506，found 586.1483．
【0116】
［実施例４０］ペプチド４５の合成
WRTRYSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド４５）
配列番号４０を有するペプチド４５はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１５．６ｍｇ、０．００４７ｍｍｏｌ、２３．１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）529.3282，found 529.3278．
【0117】
［実施例４１］ペプチド４６の合成
WRTRYSRIEAIKIQILSKLRL-OH（ペプチド４６）
配列番号４１を有するペプチド４６はWang樹脂（０．７３ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３０ｍｇ（０．０２１９ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１０．４ｍｇ、０．００２９ｍｍｏｌ、１３．２％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.9453，found 577.9456．
【0118】
［実施例４２］ペプチド４７の合成
WRQNTRYSRIEAIKIQIISKIRI-NH2（ペプチド４７）
配列番号４２を有するペプチド４７はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１０．４ｍｇ、０．００２０ｍｍｏｌ、１０．０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.7485，found 577.7452．
【0119】
［実施例４３］WRQNTRYSRIEAIKIQIXSKXRX-NH2、Ｘ＝ノルロイシン（ペプチド４８）
配列番号４３を有するペプチド４８はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１５．５ｍｇ、０．００４３ｍｍｏｌ、２１．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.7485，found 577.7516．
【0120】
［実施例４４］WRQNTRYSRLEALKIQILSKLRL-NH2（ペプチド４９）
配列番号４４を有するペプチド４９はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１５．０ｍｇ、０．００４２ｍｍｏｌ、２１．０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.7485，found 577.7452．
【0121】
［実施例４５］WRQNTRYSRIEAIKLQLLSKLRL-NH2（ペプチド５０）
配列番号４５を有するペプチド５０はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１９．３ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ、２７．０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.7485，found 577.7500．
【0122】
［実施例４６］WRQNTRYSRXEAXKIQILSKLRL-NH2、Ｘ＝ノルロイシン（ペプチド５１）
配列番号４６を有するペプチド５１はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１７．６ｍｇ、０．００４９ｍｍｏｌ、２４．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.7485，found 577.7500．
【0123】
［実施例４７］WRQNTRYSRIEAXKXQILSKLRL-NH2、Ｘ＝ノルロイシン（ペプチド５２）
配列番号４７を有するペプチド５２はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２０．９ｍｇ、０．００５９ｍｍｏｌ、２９．３％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.7485，found 577.7520．
【0124】
［実施例４８］WRQNTRYSRIEAIKXQXLSKLRL-NH2、Ｘ＝ノルロイシン（ペプチド５３）
配列番号４８を有するペプチド５３はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）３５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１３．０ｍｇ、０．００３６ｍｍｏｌ、１８．２％）。
HRMS（ES+）calcd for（M5++5H）577.7485，found 577.7421．
【0125】
［実施例４９］ペプチド０の合成
AWRQNTRYSRIEAIKIQILSKLRLETA-NH2（ペプチド０）
配列番号１を有するペプチド０をＲｉｎｋアミド樹脂（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）５０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を用いて実施例１と同様の手法により合成及び精製した（１９．１ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ、２０．０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M4++5H）652.1814，found 652.1826．
【0126】
［実施例５０］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド１のマイオスタチン阻害活性評価は以下の手法により実施した。その結果を図６に示す。さらに、ペプチド１の濃度依存的なマイオスタチン阻害能を評価した結果を図７に示す。ペプチド１は３０μＭの濃度において顕著なマイオスタチン阻害活性を有し、４．１μＭのＩＣ５０値を示した。
（１）細胞培養
ヒト肝がん由来ＨｅｐＧ２細胞は、非必須アミノ酸（ＷＡＫＯ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＷＡＫＯ）が添加された１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ（Ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイ
２４ウェル白色透明プレート（ＢＤファルコン）にＨｅｐＧ２細胞を１ウェルたり７．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ（５００μＬ ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）播種し、２４時間培養した。翌日１ウェルあたり０．０５μｇ（ＣＡＧＡ）１２−ｌｕｃレポータープラスミド、及びインターナルコントロールとして０．０１μｇ β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（ｐＣＨ１１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）の最終濃度が２３μｇ／ｍＬになるよう混合し、細胞培養液に添加した。この細胞を３７℃、２４時間培養したのち、細胞培養液をＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳに交換して１６時間培養した。ペプチド１はストック溶液として３ｍＭになるようＤＭＳＯを用いて懸濁させ、−３０℃で保存した。細胞に添加する１時間前にＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳ培地で最終濃度３０μＭ（あるいは１０μＭ、３μＭ、１μＭ）、マイオスタチン１０ｎｇ／ｍＬになるよう懸濁して３７℃で１時間インキュベーションを行った後、細胞に添加して８時間刺激を行った。ポジティブコントロールとして用いたＳｍａｄ−２リン酸化阻害剤ＳＢ−４３１５４２（Ｗａｋｏ）はストック溶液として５ｍＭになるようＤＭＳＯを用いて懸濁させ、−３０℃で保存した。細胞に添加する１時間前にＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳ培地で最終濃度５μＭ、マイオスタチン１０ｎｇ／ｍＬになるよう懸濁して３７℃で１時間インキュベーションを行った後、細胞に添加して８時間刺激を行った。刺激後アスピレーターで培養液を取り除き、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄したのち、１ウェルあたり１００μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＣＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）を加えて細胞を溶解した。溶解液を１３０００ ｒｐｍで１０分間遠心し、上清３０μＬとルシフェラーゼ・アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２５μＬを白色９６ｗｅｌｌプレート内で混合し、発光をＣｅｎｔｒｏ ＸＳ３ ＬＢ ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で検出してレポーターアッセイを行った。さらに上清５０μＬとβ−ｇａｌ基質（２００ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ２−ＭＥ、１．３３ｍｇ／ｍＬ ＯＮＰＧ）５０μＬを白色透明９６ウェルプレート（ＢＤファルコン）で混合させ、３７℃で１時間インキュベーションしたのち、４２０ｎｍの吸光度をＳｕｎｒｉｓｅ ＲＥＭＯＴＥ（Ｗａｋｏ）にて検出し、インターナルコントロールとした。
【0127】
［実施例５１］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド２のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド２のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図６に示す。またさらに、ペプチド２の濃度依存的なマイオスタチン阻害能を評価した結果を図８に示す。ペプチド２は３０μＭの濃度において比較的高いマイオスタチン阻害活性を有し、１０μＭの濃度においても若干の阻害活性を示した。
【0128】
［実施例５２］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド３のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図６に示す。さらに、ペプチド３の濃度依存的なマイオスタチン阻害能を評価した結果を図９に示す。ペプチド３は３０μＭの濃度において５０％程度のマイオスタチン阻害活性を示した。
【0129】
［実施例５３］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド４のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド４のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１０に示す。ペプチド４は３０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0130】
［実施例５４］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１３および１４のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド１３および１４のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１５に示す。ペプチド１３および１４は３０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0131】
［実施例５５］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１５〜２２のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド１５〜２２のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１６に示す。ペプチド１５〜２２は３０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0132】
［実施例５６］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド２３〜２９のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド２３〜２９のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１７に示す。ペプチド２３〜２９は３０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0133】
［実施例５７］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３０およびペプチド３１のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド３０およびペプチド３１のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１８に示す。両ペプチドは１０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0134】
［実施例５８］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３２〜３６のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド３２〜３６のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１９に示す。ペプチド３２〜３６は１０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0135】
［実施例５９］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３７およびペプチド３８のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド３７およびペプチド３８のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図２０に示す。両ペプチドは１０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0136】
［実施例６０］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド３９〜４４のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド３９〜４４のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図２１に示す。両ペプチドは１０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0137】
［実施例６１］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド４５のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド４５のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図２２に示す。ペプチド４５は１０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0138】
［実施例６２］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド４６のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド４６のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図２３に示す。ペプチド４６は３０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0139】
［実施例６３］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド４７〜５３のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド４７〜５３のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図２４に示す。ペプチド４７〜５３は１０μＭの濃度において阻害活性を示した。
【0140】
［実施例６４］ウエスタンブロットによるペプチド１のマイオスタチンシグナル阻害活性評価
ペプチド１のマイオスタチンシグナル阻害活性評価を以下の手法により実施した。その結果を図１１に示す。ペプチド１は３０μＭの濃度において顕著にＳｍａｄ−２のリン酸化を抑制したことから、高いマイオスタチンシグナル阻害活性を有することが明らかとなった。
（１）細胞培養
実施例５０と同様の手法でＨｅｐＧ２細胞を培養した。
（２）ウエスタンブロット
１２ウェル白色透明プレート（ＢＤファルコン）にＨｅｐＧ２細胞を１ウェルたり１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ播種し２４時間培養した。翌日細胞培養液をＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳに交換して１６時間培養した。ペプチド１は細胞に添加する１時間前にＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳ培地で最終濃度３０μＭ、マイオスタチン１０ｎｇ／ｍＬになるよう混合して３７℃で１時間インキュベーションを行った後、細胞に添加して１時間刺激した。ＳＢ−４３１５４２（Ｗａｋｏ）は細胞に添加する１時間前にＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳ培地で最終濃度５μＭ、マイオスタチン１０ｎｇ／ｍＬになるよう懸濁して３７℃で１時間インキュベーションを行った後、細胞に添加して１時間刺激をした。刺激後アスピレーターで培養液を取り除き、１ｘＰＢＳで洗浄したのち、１ウェルあたり２００μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、４０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加えて細胞を溶解した。溶解液を１３０００ ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清と等量の２ｘ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２００ｍｇ／ｍＬブロモフェノールブルー、１０％ ２−ＭＥ）とを混合させ、９８℃、５分加熱したのち、４０μＬを用いて８％アクリルアミドゲルにアプライしてＳＤＳ−ｐａｇｅを行った。分子量の大きさで分離させたゲルをＰＶＤＦ膜（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に転写し、ウエスタンブロット解析を行った。抗体は、自家製ウサギリン酸化Ｓｍａｄ２抗体（ｘ２０００）、マウス抗Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｈｉｇｍａ）（ｘ４０００）、ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（ｘ１００００）、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（ｘ１００００）を用い、ＨＲＰの発色はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｃｅ）を利用して、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００（ＧＥヘルスケア）にて検出した。
【0141】
［実施例６５］ウエスタンブロットによるペプチド２のマイオスタチンシグナル阻害活性評価
ペプチド２のマイオスタチンシグナル阻害活性は実施例６４と同様の手法により評価した。その結果を図１１に示す。ペプチド２は３０μＭの濃度において明らかにＳｍａｄ−２のリン酸化を抑制した。
【0142】
［実施例６６］ウエスタンブロットによるペプチド３のマイオスタチンシグナル阻害活性評価
ペプチド３のマイオスタチンシグナル阻害活性は実施例６４と同様の手法により評価した。その結果を図１１に示す。ペプチド３は３０μＭの濃度においてＳｍａｄ−２のリン酸化抑制活性を示した。
【0143】
［実施例６７］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１のＴＧＦ−β３阻害活性評価
ペプチド１のＴＧＦ−β３阻害活性評価は以下の手法により実施した。その結果を図１２に示す。
ペプチド１は３０μＭの濃度においてＴＧＦ−β３を全く阻害しなかった。故に、ペプチド１のマイオスタチン阻害は選択的なものであると考えられる。
（１）細胞培養
実施例５０と同様の手法でＨｅｐＧ２細胞を培養した。
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイ
２４ウェル白色透明プレート（ＢＤファルコン）にＨｅｐＧ２細胞を１ウェルたり７．５ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ（５００μＬ ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）播種し、２４時間培養した。翌日１ウェルあたり０．０５μｇ（ＣＡＧＡ）１２−ｌｕｃレポータープラスミド、及びインターナルコントロールとして０．０１μｇ β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（ｐＣＨ１１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）の最終濃度が２３μｇ／ｍＬになるよう混合し、細胞培養液に添加した。この細胞を３７℃、２４時間培養したのち、細胞培養液をＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳに交換して１６時間培養した。ペプチド１はストック溶液として３ｍＭになるようＤＭＳＯを用いて懸濁させ、−３０℃で保存した。細胞に添加する１時間前にＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳ培地で最終濃度３０μＭ、ＴＧＦ−β３ ５ｎｇ／ｍＬになるよう懸濁して３７℃で１時間インキュベーションを行った後、細胞に添加して８時間刺激を行った。ポジティブコントロールとして用いたＳｍａｄ−２リン酸化阻害剤ＳＢ−４３１５４２（Ｗａｋｏ）はストック溶液として５ｍＭになるようＤＭＳＯを用いて懸濁させ、−３０℃で保存した。細胞に添加する１時間前にＤＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳ培地で最終濃度５μＭ、ＴＧＦ−β３ ５ｎｇ／ｍＬになるよう懸濁して３７℃で１時間インキュベーションを行った後、細胞に添加して８時間刺激を行った。刺激後アスピレーターで培養液を取り除き、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄したのち、１ウェルあたり１００μＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ７．８）、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＣＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）を加えて細胞を溶解した。溶解液を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清３０μＬとルシフェラーゼ・アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）２５μＬを白色９６ｗｅｌｌプレート内で混合し、発光をＣｅｎｔｒｏ ＸＳ３ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で検出してレポーターアッセイを行った。さらに上清５０μＬとβ−ｇａｌ基質（２００ｍＭリン酸Ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ２−ＭＥ、１．３３ｍｇ／ｍＬ ＯＮＰＧ）５０μＬを白色透明９６ウェルプレート（ＢＤファルコン）で混合させ、３７℃で１時間インキュベーションしたのち、４２０ｎｍの吸光度をＳｕｎｒｉｓｅ ＲＥＭＯＴＥ（Ｗａｋｏ）にて検出し、インターナルコントロールとした。
【0144】
［実施例６８］ペプチド１のＣ２Ｃ１２筋芽細胞に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｔｒｏ評価）
ペプチド１の筋芽細胞におけるマイオスタチン阻害効果を検証するため以下の手法により評価を行った。
６０ｍｍディッシュ（ＢＤファルコン）にＣ２Ｃ１２細胞を２．０ｘ１０５ ｃｅｌｌｓで播種し培養した。５％ウシ血清、５％ウマ血清にペプチド１が最終濃度３０μＭ、マイオスタチン１０ｎｇ／ｍＬになるよう混合して３７℃で２４時培養した後、細胞を回収し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調整してｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡと筋特異的遺伝子（ＭｙｏｇｅｎｉｎｅおよびＭｙｌｐＦ）のプライマーをＰＣＲにかけ遺伝子を増幅した（９５℃、５ｍｉｎ；９５℃、３０ｓｅｃ；６２℃、４５ｓｅｃ；７２℃、１ｍｉｎ；７２℃、５ｍｉｎを３０ｃｙｃｌｅｓ）。
アガロース電気泳動を行い、目的のバンドを観察した結果を、図２５に示す。ペプチド１は陽性対照と同様にしてマイオスタチンを有意に阻害した。
【0145】
［実施例６９］ペプチド１の野生型マウス大腿部筋に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｖｏ評価）
ペプチド１のｉｎ ｖｉｖｏにおける筋量増大効果を検証するため以下の手法により評価を行った。
ペプチド１を生理食塩水に０．６ｍＭになるよう懸濁した。麻酔下にある４週齢Ｃ５７／ＢＬ６雄マウスの右鼠蹊部に、５０μＬずつ筋肉内投与した。２週間後、再度ペプチド１を投与し、さらに４週間後、マウスをＳａｃｒｉｆｉｃｅして筋肉の剖検をおこなった。摘出した筋組織は、ホルマリンで一晩固定した。その後ＰＢＳで３回３０分洗浄したのち７０％ＥｔＯＨ／ＰＢＳで一晩浸透後、パラフィンブロックを作製した。３μｍ薄切切片を作製し、Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ， Ｅｏｓｉｎ染色、または免疫染色を行った。Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ， Ｅｏｓｉｎ染色において、３枚の切片画像から核の数をカウントすることで、一視野の平均細胞数を統計学的に解析した。胚性ミオシン重鎖の免疫染色は、１２１℃２０分オートクレーブにて抗原の賦活化し、ＰＢＳ洗浄５分を３回、ブロッキング（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ） ）室温３０分、１次抗体（ＭＦ２０、２００倍希釈、Ｏ／Ｎ），ＰＢＳ洗浄５分を３回、２次抗体（ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ， ２００倍希釈）、ＰＢＳ洗浄５分を３回、ＤＡＢ発色の手順で行った。対比染色にはＨｅｍａｔｏｘｉｌｉｎを用いた。
この結果を図１３（外観）、２６（ＨＥ染色）、２７（細胞数の統計学的解析）、２８（免疫染色）に示す。ペプチド１はそのマイオスタチン阻害活性に基づいて統計学的に有意にマウス大腿部筋の筋量を増大させ、明らかな胚性ミオシン重鎖免疫染色シグナルの増加がみられた。
【0146】
［参考例１］ペプチド５の合成
AWRQNTRYSRIEAIKIQILSK-NH2（ペプチド５）
配列番号４９を有するペプチド５はＲｉｎｋアミド樹脂（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）５０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１３．１ｍｇ、０．００３７ｍｍｏｌ、１６％）。
HRMS（ES+）calcd for（M2++2H）1287.2435，found 1287.2073．
【0147】
［参考例２］ペプチド６の合成
SRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド６）
配列番号５０を有するペプチド６はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２６．１ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、２０％）。
HRMS（ES+）calcd for（M3++3H）627.4110，found 627.4123．
【0148】
［参考例３］ペプチド７の合成
TWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRL-NH2（ペプチド７）
配列番号５１を有するペプチド７はＲｉｎｋアミド樹脂（０．５５ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）１００ｍｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（２１．４ｍｇ、０．００６０ｍｍｏｌ、１１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M3++3H）961.2457，found 961.2437．
【0149】
［参考例４］ペプチド８の合成
RYSRIEAIKIQILSKL-NH2（ペプチド８）
配列番号５２を有するペプチド８はＲｉｎｋアミド樹脂（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）５０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１２．９ｍｇ、０．００４９ｍｍｏｌ、２１％）。
HRMS（ES+）calcd for（M2++2H）966.0903，found 966.0923．
【0150】
［参考例５］ペプチド９の合成
RYSRIEAIKAQAASKA-NH2（ペプチド９）
配列番号５３を有するペプチド９はＲｉｎｋアミド樹脂（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、渡辺化学工業株式会社）５０ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を用いて実施例２と同様の手法により合成及び精製した（９．３ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ、１６％）。
HRMS（ES+）calcd for（M3++3H）588.0002，found 588.0001．
【0151】
［参考例６］ペプチド１０の合成
LDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRL-NH2（ペプチド１０）
配列番号５４を有するペプチド１０は実施例２と同様の手法により合成及び精製した（１３．３ｍｇ、０．００３７ｍｍｏｌ、６．７％）。
HRMS（ES+）calcd for（M2++2H）1409.3749，found 1409.3763．
【0152】
［参考例７］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド５のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド５のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図６に示す。ペプチド５は３０μＭの濃度において阻害活性を示さなかった。
【0153】
［参考例８］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド６のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド６のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１０に示す。ペプチド６は３０μＭの濃度において阻害活性を示さなかった。
【0154】
［参考例９］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド７のマイオスタチン阻害活性評価
ペプチド７のマイオスタチン阻害活性は実施例５０と同様の手法により評価した。その結果を図１０に示す。ペプチド７は３０μＭの濃度において阻害活性を示さなかった。
【0155】
［参考例１０］ウエスタンブロットによるペプチド８のマイオスタチンシグナル阻害活性評価
ペプチド８のマイオスタチンシグナル阻害活性は実施例６４と同様の手法により評価した。その結果を図１１に示す。ペプチド８は３０μＭの濃度においてＳｍａｄ−２のリン酸化を全く抑制しなかった。
【0156】
［参考例１１］ペプチド９の野生型マウス大腿部筋に及ぼす影響（ｉｎ ｖｉｖｏ評価）
ペプチド９のｉｎ ｖｉｖｏにおける筋量増大効果を検証するため実施例６９と同様の手法により評価を行った。その結果を図１３に示す。ネガティブコントロールとして用いたペプチド９は野生型マウス大腿部筋量に影響を及ぼさない。
【0157】
［参考例１２］Ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイによるペプチド１０のＴＧＦ−β３阻害活性評価
ペプチド１０のＴＧＦ−β３阻害活性は実施例６７と同様の手法により評価した。その結果を図１４に示す。ペプチド１０は３０μＭの濃度において阻害活性を示さなかった。
【0158】
上記の通り、実施例のペプチド１、２、３及び４は参考例のペプチド５〜１０に対して、マイオスタチンによるレポーター活性を強く抑制し、ペプチド１〜３については用量依存的にレポーター活性を抑制することが示された（図６〜１０）。また、３０μＭにおけるペプチド１１および１２の阻害率は、ペプチド１が同条件で ９２．４％であったのに対し、それぞれ８９．２％および９４．７％と、顕著な阻害活性を示した。なお、ペプチド７は、ヒト由来マイオスタチンプロドメインの部分ペプチドhMPS(20-43)の配列を有し、この配列のプロドメイン中の存在位置は、ペプチド１の配列のマウス由来マイオスタチンのプロドメイン中における存在位置と同じであるにもかかわらず、マイオスタチン阻害活性を示さなかった。
また、図１２で示すとおり、ペプチド１はＴＧＦ−β３によるレポーター活性を阻害しない。このことから、本発明のペプチドはマイオスタチンの活性を選択的に阻害することが示唆される。
更に、ペプチド１の野生型マウス大腿部筋でのｉｎ ｖｉｖｏ評価の結果から、ペプチド１はそのマイオスタチン阻害活性に基づいてマウス大腿部筋の筋量を増大させることが示された。
【0159】
また、配列番号４０で表されるペプチド４５は、マイオスタチンによるレポーター活性を強く抑制することが示された（図２２）。更に、配列番号４０で表されるペプチドの置換体は、配列番号６で表されるペプチド１１と同等のマイオスタチン阻害活性を示した。【0160】
このように、本発明のペプチドを含む治療薬は、マイオスタチンに対して選択的で高い阻害活性を有し、筋肉の過形成、筋肉重量増加を可能とするものである。【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]