特許 6143282 核酸の伸長・固定デバイス、該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法、核酸固定部材、及び核酸の伸長・固定デバイスを用いて作製した核酸標本

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6143282

(24)【登録日】2017年5月19日

(45)【発行日】2017年6月7日

(54)【発明の名称】核酸の伸長・固定デバイス、該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法、核酸固定部材、及び核酸の伸長・固定デバイスを用いて作製した核酸標本

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20170529BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20170529BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170529BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   C12Q1/68 Z

   C12N15/00 A

【請求項の数】8

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2013-43361(P2013-43361)

(22)【出願日】2013年3月5日

(65)【公開番号】特開2014-168449(P2014-168449A)

(43)【公開日】2014年9月18日

【審査請求日】2016年3月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人名古屋大学

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】小野島 大介

(72)【発明者】

【氏名】矢崎 啓寿

(72)【発明者】

【氏名】安井 隆雄

(72)【発明者】

【氏名】加地 範匡

(72)【発明者】

【氏名】馬場 嘉信

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０４０２１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−１２１０９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−３３７２６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２３７２７７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸を固定する固定部を含む核酸固定部材、
核酸を含む溶液を注入するための注入口、前記溶液の流路、及び前記溶液を吸引する吸引口を含む流路部材、
を含み、
前記固定部が、対となる溝部を含むことを特徴とする核酸の伸長・固定デバイス。

【請求項2】

核酸を含む溶液の流路及び該流路に形成された核酸を固定する固定部を含む核酸固定部材、
核酸を含む溶液を注入するための注入口、及び前記溶液を吸引する吸引口を含む蓋部材、
を含み、
前記固定部が、対となる溝部を含むことを特徴とする核酸の伸長・固定デバイス。

【請求項3】

前記対となる溝部が、ホール型、ライン型、又はジグザグ型から選ばれる形状であることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸の伸長・固定デバイス。

【請求項4】

前記溶液を所定のスピードで吸引できる吸引具を更に含むことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸の伸長・固定デバイス。

【請求項5】

請求項１〜４の何れか一項に記載されている核酸の伸長・固定デバイスの注入口から注入した核酸を含む溶液を、吸引口から所定のスピードで吸引することで、核酸固定部材の固定部に核酸を伸長・固定することを特徴とする核酸の伸長・固定方法。

【請求項6】

流路、及び該流路に形成された核酸を固定する固定部を含み、前記固定部が対となる溝部を含むことを特徴とする核酸固定部材。

【請求項7】

前記対となる溝部が、ホール型、ライン型、又はジグザグ型から選ばれる形状であることを特徴とする請求項６に記載の核酸固定部材。

【請求項8】

請求項１に記載の核酸の伸長・固定デバイス、
前記核酸の伸長・固定デバイスの核酸固定部材の固定部に伸長・固定され且つ染色された核酸、及び、
前記核酸固定部材を密閉したカバーガラス、
を含むことを特徴とする核酸標本。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸の伸長・固定デバイス、該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法、核酸固定部材、及び核酸の伸長・固定デバイスを用いて作製した核酸標本に関するもので、特に、ＤＮＡやＲＮＡを含んだ溶液を所定の速度で流すことができる流路を設け、該流路に面する部分に核酸を固定する固定部を設けることで、伸長した核酸を効率的に固定することができる核酸の伸長・固定デバイス、該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法、前記デバイスに用いることができる核酸固定部材、及び核酸の伸長・固定デバイスを用いて作製した核酸標本に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ＳＮＰｓやＤＮＡメチル化の解析は、生活習慣病、癌、老化、あるいは薬剤の効果や副作用発現の研究分野で注目されている。ＳＮＰｓやＤＮＡメチル化の解析には、ＤＮＡの１分子イメージングやＤＮＡとタンパク質の相互作用の１分子解析が有効であり、そのため、個々のＤＮＡ分子を伸長・固定化する研究が２０世紀末から国内外で精力的に進められている。

【0003】

ＤＮＡを伸長・固定化する技術としては、（１）融解したアガロース中でＤＮＡ分子を伸長し、ゲル化の際に固定する方法（非特許文献１参照）、及び（２）交流電場をかけることによりＤＮＡ分子を濃縮されたアクリルアミド溶液中で伸長する方法（非特許文献２参照）等が知られている。しかしながら、上記（１）及び（２）に記載されている方法は、ゲル中でＤＮＡを伸長させるため、ＤＮＡの直線性が悪く、且つ取扱いが困難であり、意図しないＤＮＡの切断に伴って精度が低下する等の問題がある。また、電場をかけてＤＮＡを伸長させる方法は、電場をかけることを中止すると、伸長したＤＮＡが元の形態に戻ってしまうという問題もある。

【0004】

一方、ＤＮＡを伸長・固定化する際に、ゲルを使用しない技術も知られており、例えば、（３）溶液と気体のメニスカスの原理を用いた例として、ＤＮＡを溶解した水溶液にガラス基板を浸し、次いで、ガラス基板を引き上げる過程で水相と気相の界面移動を利用してＤＮＡを伸長・固定する方法（非特許文献３参照）が知られている。前記（３）に記載された方法は、上記（１）及び（２）に記載されたゲルを用いる方法と比較して、ＤＮＡの安定した伸長が可能で高いスループットが得られるが、ＤＮＡを固定する場所が制御できずにランダムな配置となる問題がある。また、ＤＮＡを固定するためにはＤＮＡ末端と基板表面の化学修飾が必要であり、そのため、一端固定したＤＮＡを他の媒体に移動できないという問題もある。

【0005】

また、ゲルを用いない方法として、（４）核酸分子の一端を、アミノ基を介して基板に固定し、回転による遠心力を利用してＤＮＡを基板上に固定する方法も知られている（特許文献１参照）。しかしながら、上記（４）に記載されている方法は、アミノ基による修飾が必要であり、更に遠心装置が必要であるという問題がある。

【0006】

上記（３）及び（４）に記載されている方法と異なり、（５）修飾をすることなく、ＤＮＡ分子を基板上に伸長・固定する方法も知られている。前記（５）に記載されている方法は、図１に示すように、凹型マイクロホール構造を持つ樹脂製基板とカバーガラスの間にＤＮＡ溶液を挟み、基板をスライドさせながら溶液を蒸発させることよって基板上にＤＮＡを伸長・固定する方法である（非特許文献４参照）。しかしながら、上記（５）に記載されている方法は、所定の位置にＤＮＡを効率よく伸長・固定することは可能であるが、ＤＮＡを伸長・固定するためには、基板とカバーガラスの間隔を一定にし、且つカバーガラスの移動速度等を調整する特殊な装置と技術が必要で汎用性に欠けるという問題がある。また、上記（５）に記載されている方法は、図１の１〜３の矢印が示すように、カバーガラスの移動に伴いＤＮＡ溶液の気液界面の溶液が気化することでＤＮＡを伸長・固定していることから、ＤＮＡ溶液が乾燥する時間が必要で迅速にＤＮＡを固定することができないという問題がある。更に、カバーガラスを移動した後には基板上に一定量のＤＮＡ溶液が残り、前記残ったＤＮＡ溶液の気化にともない、実際には図１の４．に示されている補足部位に固定されたＤＮＡ以外に、基板上にＤＮＡが残存するという問題がある。

【0007】

更に、ＤＮＡ断片から標本を作製し顕微鏡で病理観察を行う際の精度を高めるためには、複数本の同じ断片長のＤＮＡを取得する必要がある。また、病理学的に有利な統計データを取得する観点からは、目的とするＤＮＡ断片を少なくとも１００本以上、望ましくは２００本以上解析することが望ましいが、上記（３）〜（５）に記載されている方法では、溶液に含まれている様々な断片長のＤＮＡを単に固定しているに過ぎず、溶液中に含まれている様々な断片長のＤＮＡを選択的に固定することはできなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００６−６７９２１号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＤＣ． ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｍａｐｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３， ２６２， １１０−４

【非特許文献2】Ｗａｓｈｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｌａｒｇｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｎｅｗ ＤＮＡ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １９９９， ２６５， １４０−３

【非特許文献3】Ｂｅｎｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｙｎａｍｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｍｂｉｎｇ： Ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９７， ２７７， １５１８−１５２３

【非特許文献4】Ｃｒａｉｇｈｅａｄ ＨＧ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｒｒａｙｓ ｏｎ ｇｒａｐｈｅｎｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ”， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， ２０１１ Ｏｃｔ １２， １１（１０）， ４２３２−４２３８

【非特許文献5】Ｂｅｎｓｉｍｏｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ．，“Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｍｏｖｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５， ２０９６−２０９８ （１９９４）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、核酸を含む溶液を流すことができる流路を設け、該流路に面する部分に核酸を固定する固定部を設けるとともに、核酸を含む溶液を前記流路に注入する注入口及び前記溶液を吸引する吸引口を設け、前記吸引口から前記溶液を所定のスピードで吸引することで、修飾処理及び乾燥工程を必要とせず、効率的且つ高い再現性で核酸を伸長・固定できることを新たに見出した。また、核酸を伸長・固定する固定部に設ける対となる溝部と溝部の間隔を調整することで、溶液中に含まれている様々な断片長のＤＮＡを選択的に固定できることを新たに見出した。更に、伸長・固定した核酸を蛍光染色等を行うことで核酸分子単体を標本化することができ、細胞や血液に含まれる異常なＤＮＡを直接観察できることを見出し、本発明を完成した。

【0011】

すなわち、本発明の目的は、核酸の伸長・固定デバイス、該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法、核酸固定部材、及び核酸の伸長・固定デバイスを用いて作製した核酸標本を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は、以下に示す、核酸の伸長・固定デバイス、該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法、核酸固定部材、及び核酸の伸長・固定デバイスを用いて作製した核酸標本に関する。

【0013】

（１）核酸を固定する固定部を含む核酸固定部材、
核酸を含む溶液を注入するための注入口、前記溶液の流路、及び前記溶液を吸引する吸引口を含む流路部材、
を含むことを特徴とする核酸の伸長・固定デバイス。
（２）核酸を含む溶液の流路及び該流路に形成された核酸を固定する固定部を含む核酸固定部材、
核酸を含む溶液を注入するための注入口、及び前記溶液を吸引する吸引口を含む蓋部材、
を含むことを特徴とする核酸の伸長・固定デバイス。
（３）前記固定部が、対となる溝部を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の核酸の伸長・固定デバイス。
（４）前記対となる溝部が、ホール型、ライン型、又はジグザグ型から選ばれる形状であることを特徴とする上記（３）に記載の核酸の伸長・固定デバイス。
（５）前記溶液を所定のスピードで吸引できる吸引具を更に含むことを特徴とする上記（１）〜（４）の何れか一に記載の核酸の伸長・固定デバイス。
（６）上記（１）〜（５）に記載されている核酸の伸長・固定デバイスの注入口から注入した核酸を含む溶液を、吸引口から所定のスピードで吸引することで、核酸固定部材の固定部に核酸を伸長・固定することを特徴とする核酸の伸長・固定方法。
（７）核酸を固定する固定部を含み、前記固定部が対となる溝部を含むことを特徴とする核酸固定部材。
（８）前記対となる溝部が、ホール型、ライン型、又はジグザグ型から選ばれる形状であることを特徴とする上記（７）に記載の核酸固定部材。
（９）前記核酸固定部材が流路を有し、前記核酸を固定する固定部が前記流路に形成されていることを特徴とする上記（７）又は（８）に記載の核酸固定部材。
（１０）上記（６）に記載されている方法により核酸固定部材の固定部に伸長・固定され且つ染色された核酸を含み、核酸固定部材をカバーガラスで密閉したことを特徴とする核酸標本。

【発明の効果】

【0014】

本発明の核酸の伸長・固定デバイスは、例えば、シリンジポンプ等の簡単な装置を用いて、固定部上を通過する核酸を含む溶液のスピードを一定にすることができるので、従来のカバーガラスを移動する方法と比較して、操作が簡単である上、再現性を高くすることができる。また、本発明のデバイスは、カバーガラスを移動する方法と違い核酸を含む溶液を乾燥する工程が不要であることから、処理時間を短縮し効率的に核酸を固定することができる。

【0015】

本発明は、吸引口から核酸を含む溶液を吸引することから、固定された核酸以外の核酸を溶液とともに回収することができ、また、核酸固定部材上に溶液が残らないことから固定部以外に核酸（残留物）が非特異吸着することが無いので、貴重な生体試料を効率的に使用することができる。更に、核酸の固定に修飾処理を用いないことから、固定した核酸を他の基板へ転写することが可能で、観察用の専用基板を要する顕微鏡検査に用いることができるので非常に高い応用性がある。特に、後述するように、本発明では、固定部を特定の形状にすることで、所期の核酸を複数本纏めて固定することができるので、固定した複数本の核酸を纏めて基板に転写・観察することで、検査・統計学的データの取得に有効である。

【0016】

本発明の核酸固定部材の固定部は対となる溝部を含み、該溝部と溝部の間隔より長い核酸断片は固定されないことから、固定したい核酸断片を伸長した時の長さに基づき溝部と溝部の間隔を調整することで、様々な断片を含む核酸溶液の中から、目的とする核酸断片を効率的に固定することができる。

【0017】

本発明の固定部には、核酸分子単体が伸長した状態で固定しているので、そのまま核酸標本として用いることができ、蛍光染色等を施し、直接観察して病理学的検査をすることができる。また、対となる溝部を複数及び／又はライン、ジグザグ形状に設けることで、同じ長さの核酸断片を複数本纏めて一度の操作で伸長・固定することができ、病理学的検査の精度が上がるとともに、統計学的データを効率的に取得することができる。

【0018】

そして、本発明の固定部及び流路は、ＣＡＤ等により設計されたマイクロパターンを使用し、フォトリソグラフィー技術により作製した鋳型に樹脂を流し込んで作るキャスティング製法で安価に大量作製することが可能であるので、固定したい核酸のサイズや用途に合わせた多様なマイクロパターンの核酸固定部材を作製することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、従来のＤＮＡ伸長・固定方法を示す概念図である。

【図2】図２は、本発明の核酸の伸長・固定デバイスの使用方法の１例を示した概略図である。

【図3】図３は、本発明の核酸固定部材１０の固定部３０の断面を拡大した模式図である。

【図4】図４（ａ）は、本発明の核酸の伸長・固定デバイスの概略構成を表す図である。図４（ｂ）は本発明の核酸の伸長・固定デバイスの実施形態の一例を表す断面図で、図４（ｃ）は本発明の核酸の伸長・固定デバイスの他の実施形態の一例を表す断面図である。

【図5】図５は、本発明の核酸を固定する固定部３０を含む核酸固定部材１０の作成手順の一例を示したフローチャートである。

【図6】図６は、固定部３０を作製するためのフォトマスクのＣＡＤデータ例を示しており、（ａ）はホール型、（ｂ）はライン型、（ｃ）はジグザグ型の例を示す。

【図7】図７は、図面代用写真で、（ａ−１）及び（ａ−２）は実施例１、（ｂ）は実施例２、（ｃ）は実施例３で作製した核酸固定部材１０の固定部３０を拡大した光学顕微鏡写真である。

【図8】図８は、図面代用写真で、実施例４で作製した核酸の伸長・固定デバイスの写真である。

【図9】図９は、実施例４で作製したＤＮＡ標本の固定部に伸長・固定されたＤＮＡ断片の分布図である。

【図10】図１０は、図面代用写真で、実施例５で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。

【図11】図１１は、図面代用写真で、実施例６で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。

【図12】図１２は、図面代用写真で、実施例７で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。

【図13】図１３は、図面代用写真で、実施例８で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。

【図14】図１４は、図面代用写真で、実施例９で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下に、本発明の核酸の伸長・固定デバイス、該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法、核酸固定部材、及び核酸の伸長・固定デバイスを用いて作製した核酸標本について詳しく説明する。

【0021】

図２は、本発明の核酸の伸長・固定デバイス１（以下、単に「デバイス」と記載することもある。）の使用方法の１例を示す概略図である。核酸を含む溶液（以下、単に「溶液」と記載することもある。）５０は注入口２０から流路４０に注入され、吸引具６０により溶液５０を所定のスピードとなるように吸引口２３からすると、溶液５０が核酸を固定する固定部（以下、単に「固定部」と記載することもある。）３０上を通過する際に、溶液５０に含まれる核酸を固定部３０に伸長・固定することができる。点線は固定部３０を拡大した図である。

【0022】

図３は、固定部３０の断面を拡大した模式図である。本発明において「固定部」とは、対となる溝部３５を少なくとも１以上有し、核酸３６を固定する領域のことを意味する。また、固定部３０において、「深さ」とは溝部３５の深さ３７、「幅」とは溝部３５の幅３８、「間隔」とは溝部３５と溝部３５の間隔で核酸３６が伸長・固定する部分の長さ３９、を意味する。

【0023】

図４（ａ）は、デバイス１の概略構成を示す図である。デバイス１は、核酸固定部材１０と該核酸固定部材１０に被せられるようにして用いられる流路部材２０又は蓋部材２１を含んでいる。流路部材２０又は蓋部材２１の上部には、溶液５０を注入するための注入口２２及び前記溶液５０を吸引するための吸引口２３が形成されており、注入口２２及び吸引口２３は流路４０と連通している。

【0024】

図４（ｂ）はデバイス１の実施形態の一例を表す断面図で、核酸固定部材１０上に固定部３０を有している。流路部材２０には溶液を流すための流路４０が形成されており、更に、図示しない注入口２２及び吸引口２３が前記流路４０に貫通するように形成されている。したがって、核酸固定部材１０及び流路部材２０を液密的に組合せることで、固定部３０上に溶液５０を流すことができる。

【0025】

図４（ｃ）は本発明のデバイス１の他の実施形態を表す断面図で、核酸固定部材１０には溶液５０を流すための流路４０が形成され、該流路４０上に固定部３０が形成されている。一方、蓋部材２１には、図示しない注入口２２及び吸引口２３が蓋部材２１を貫通するように形成されている。したがって、核酸固定部材１０及び蓋部材２１を液密的に組合せることで、固定部３０上に溶液５０を流すことができる。

【0026】

前記核酸固定部材１０の材料は、固定部３０を形成できるもの、又は流路４０を形成し該流路４０上に固定部３０を形成ができるものであれば特に制限はなく、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ））、ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン、ガラス等が挙げられる。前記材料の中で、固定部３０、並びに流路４０及び該流路４０上に形成する固定部３０は、後述するフォトリソグラフィー技術を用いて先ず鋳型を作製し、該鋳型に材料を押し付けて作製すると安価で大量に高性能な核酸固定部材１０を作製できることから、プラスチック、シリコン系材料が好ましい。また、核酸を伸長・固定後に顕微鏡観察することから光透過性（透明度）が高く、更に、吸引後は溶液５０が流路４０内に残留しない方が核酸の残留物がなく好ましいことから、疎水性のＰＤＭＳが特に好ましい。

【0027】

流路部材２０及び蓋部材２１の材料も、前記核酸固定部材１０と同様の材料を用いることができ、上記と同様の理由で、ＰＤＭＳが特に好ましい。流路部材２０に形成する流路は、核酸固定部材１０と同様に、後述するフォトリソグラフィー技術を用いて作製することができる。また、流路部材２０及び蓋部材２１に形成する注入口２２及び吸引口２３は、流路４０と連通していればサイズ・形状等は特に制限はなく、パンチ、超音波ドリル、サンドブラスター等を用いて作製すればよい。

【0028】

図５は、図４（ｂ）に示す固定部３０を含む核酸固定部材１０の作成手順の一例を示したフローチャートである。
（１）先ず基板３１を準備する。
（２）基板３１にフォトレジスト３２をスピンコートし、ホットプレート上でプリベイクする。
（３）固定部３０の形状に対応する図示しないフォトマスクを用いて露光し、ホットプレート上でポストエクスポージャーベイクを行う。
（４）現像液を用いて現像した後、超純水を用いてリンスし、スピンドライヤー等で水分を飛ばし乾燥させ、鋳型３３を作製する。
（５）鋳型３３を、上記の核酸固定部材１０用の材料３４に転写し、次いで、鋳型３３を分離することで、フォトマスクの形状に対応した溝部を含む固定部３０が形成された核酸固定部材１０を作製する。

【0029】

上記手順に用いられる基板３１としては、シリコン、シリコンカーバイド、サファイア、リン化ガリウム、ヒ化ガリウム、リン化ガリウム、窒化ガリウム等、フォトリソグラフィーの分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無い。

【0030】

フォトレジスト３２は、固定部３０を作製するためのフォトマスクの形状に応じて、ポジ型又はネガ型を適宜選択すればよい。ポジ型フォトレジストとしてはＰＭＥＲ、ＡＺ等、ネガ型のフォトレジストとしては、ＳＵ−８、ＫＭＰＲ等、フォトリソグラフィーの分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無い。また、現像液としては、選択したフォトレジストをエッチングできるものであれば特に制限は無い。

【0031】

図４（ｂ）に示す流路部材２０は、図５（３）の手順のフォトマスクとして、流路４０に対応する形状のフォトマスクを用いる以外は、図５と同様の手順で作製することができる。

【0032】

図４（ｃ）に示す、流路４０上に固定部３０を形成した核酸固定部材１０を作製する場合は、図５（１）、（２）の手順の後に、
（ａ）流路４０を作製するためのフォトマスクを用いて露光、ホットプレート上でポストエクスポージャーベイクを行う。
（ｂ）現像液を用いて現像した後、超純水を用いてリンスし、スピンドライヤー等で水分を飛ばし乾燥させ、流路４０に相当する凸部を有する基板３１を作製する。
（ｃ）フォトレジスト３２を、再びスピンコートして、次いで、前記流路４０に相当する凸部の部分に、固定部３０の形状に対応する図示しないフォトマスクを配置し、その後は、図５（３）〜（５）の手順にしたがって作製することができる。

【0033】

固定部３０は、図３に示すように、溶液５０が流れる面に設けられた対となる溝部３５から構成されている。溝部３５の形状及び配置は、核酸が伸長・固定できれば特に制限は無い。一方、本発明のデバイス１を用いて核酸を固定部３０に伸長・固定する場合、溝部３５と溝部３５の間隔３９を調整すると、伸長・固定する核酸の長さを変えることができる。したがって、例えば、ホール型の溝部３５をランダムに設けると、溶液５０の流れ方向にある任意の対となるホール型の溝部３５と溝部３５の間隔３９に応じて、伸長・固定する核酸の長さが変わる。また、対となる溝部３５を、溶液５０の流れ方向に対して一定の間隔３９となるように設けたホール型、溶液５０の流れ方向に対して直交する方向に設けたライン型、ジグザグ型にすることで、溝部３５と溝部３５の間隔３９に長さが一定の核酸を一回の操作で複数本固定することもできる。前記対となる溝部３５は１対に限定されず、複数設けてもよく、その場合、複数の対となる溝部３５と溝部３５の間隔３９を等間隔にしてもよいし、対毎に間隔３９を変化させてもよい。また、溝部３５を階段型に設け、長さの異なる核酸を伸長・固定するようにしてもよい。

【0034】

図６は固定部３０を作製するためのフォトマスク用のＣＡＤデータの例で、図６（ａ）はホール型、（ｂ）はライン型、（ｃ）はジグザグ型の例を示す。

【0035】

固定部３０の溝部３５の形状、深さ３７、幅３８及び本数、並びに流路４０の幅、深さ及び長さは、本発明が実施できる大きさであれば特に制限はなく、フォトマスクの形状及び大きさ、並びにレジストを積層する厚さにより調整することができる。また、溝部３５と溝部３５の間隔３９は、伸長・固定したい核酸のサイズに応じて、フォトマスクの幅を適宜調整すればよい。

【0036】

本発明のデバイス１は、上記の手順により作製した核酸固定部材１０と流路部材２０又は蓋部材２１を張り合わせることで作製することができる。核酸固定部材１０と流路部材２０又は蓋部材２１をＰＤＭＳ等の樹脂を用いて作製した場合は、樹脂自体が持つ密着機能により単に張り合わせるのみでよい。また、ガラス等、部材同士の密着性が弱い材料で核酸固定部材１０と流路部材２０又は蓋部材２１を作製した場合は、シリコンオイル等を部材の縁部に塗布して張り合わせればよい。溶液５０は、注入口２１上に直接液滴を滴下してもよいし、溶液５０を貯めた図示しない容器にチューブを接続し、該チューブの他端を注入口２１に接続してもよく、注入口２１に溶液５０が導入できるものであれば特に制限は無い。また、吸引具６０は、シリンジポンプ等、一定速度で溶液５０を吸引できるものであれば特に制限は無い。

【0037】

溶液５０を流した後は、核酸固定部材１０と流路部材２０又は蓋部材２１を分離し、固定部３０に伸長・固定された核酸を、ＹＯＹＯ−１、ＰＩ、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ等の公知の蛍光色素で染色することで核酸標本を作製し、カバーガラスで覆い、顕微鏡で観察することができる。なお、溶液５０を流す際には、核酸を予め染色してもよい。

【0038】

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

【実施例】

【0039】

[フォトマスク形成用の作製]
フォトマスクの材料としては、クロムマスクブランクス（クリーンサアフェイス社製、厚さ２．３ｍｍ）を用いた。図６に示した（ａ）ホール型、（ｂ）ライン型、（ｃ）ジグザグ型のＣＡＤデータから、マスクレス露光機（株式会社ナノシステムソリューションズ）を用い、１００ｍＪ／ｃｍ^２で露光してフォトマスク（クロムマスク）を作製した。

【0040】

[本発明の核酸固定部材の作製]
（ホール型の核酸固定部材の作製）
＜実施例１＞
本発明の核酸固定部材は以下の手順により作製した。先ず、シリコン基板（フェローテックシリコン社製、直径７６ｍｍ、厚さ６００μｍ）上に、ＳＵ−８ ３００５（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ社製）をスピンコータにより、厚さが６μｍになるように塗布し、ホットプレート（ＡＳ ＯＮＥ社製）上で、９５℃で２分間プリベイクした。次いで、上記〔フォトマスクの作製〕で作製したホール型のフォトマスクを基板に被せ、紫外線照射装置（ＭＩＫＡＳＡ社製）を用い、１００ｍＪ／ｃｍ^２で露光後、６５℃で１分間、９５℃で１分間ポストエクスポージャーベイクを行い、ＳＵ−８ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ）を用いて現像した。現像後は、超純水を用いてリンスし、スピンドライヤーで水分をとばして乾燥させ、鋳型を作製した。作製した鋳型に、ポリジメチルシロキサン（東レ社製、ＳＩＬＰＯＴ１８４）を流し込み、ＰＤＭＳを硬化後、硬化したＰＤＭＳを鋳型から取り外すことで、核酸固定部材を作製した。図７（ａ−１）は実施例１で作製した核酸固定部材の固定部を拡大した光学顕微鏡写真で、図７（ａ−２）は（ａ−１）を更に拡大した光学顕微鏡写真である。ホール型の溝部の深さは６μｍ、直径は５．３μｍ、溶液の流れ方向のホールとホールの間隔は、９．５μｍであった。

【0041】

（ライン型の核酸固定部材の作製）
＜実施例２＞
実施例１のフォトマスクに代え、上記[フォトマスクの作製]で作製したライン型のフォトマスクを用いた以外は、実施例１と同様の手順で核酸固定部材を作製した。図７（ｂ）は実施例２で作製した核酸固定部材の固定部を拡大した光学顕微鏡写真で、ライン型の溝部の深さは６μｍ、ライン型の溝部の幅は１５μｍ、溝部と溝部の間隔は１５μｍであった。

【0042】

（ジグザグ型の核酸固定部材の作製）
＜実施例３＞
実施例１のフォトマスクに代え、上記[フォトマスクの作製]で作製したジグザグ型のフォトマスクを用いた以外は、実施例１と同様の手順で核酸固定部材を作製した。図７（ｃ）は実施例３で作製した核酸固定部材の固定部を拡大した光学顕微鏡写真で、ジグザグ型の溝部の深さは６μｍ、溝部の幅（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）は３０μｍ、溝部と溝部の間隔（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）は１５μｍ、ジグザグの一つの頂点とその隣の頂点の頂点間距離は７．３μｍであった。

【0043】

[流路部材の作製]
実施例１のＳＵ−８ ３０５０の厚さを５０μｍとなるように塗布し、更に、実施例１のフォトマスクに代え、流路形状（幅６５０μｍ、長さ０．８ｃｍ）を施したフォトマスクを用いた以外は、実施例１と同様の手順で流路部材を作製した。得られた流路部材の流路は幅６５０μｍ、深さ５０μｍ、長さ０．８ｃｍであった。次いで、溶液を注入する注入口及び吸引する吸引口を、パンチ（Ｈａｒｒｉｓ社製）により作製した。注入口の直径は１．５ｍｍ、吸引口の直径は１ｍｍであった。

【0044】

〔サンプルの調整〕
４８．５ｋｂｐのλＤＮＡ（ニッポンジーン社製）をＴＥバッファー（ニッポンジーン社製、ｐＨ８．０）に濃度が５０ｎｇ／μｌとなるように溶解し、次いで１ｍＭのＹＯＹＯ−１で染色した。なお、４８．５ｋｂｐのλＤＮＡを伸長した時の長さの理論値は約１６．５μｍであるが、染色して伸長した場合の実測値は２１．５±０．５μｍである（非特許文献５参照）。

【0045】

（伸長・固定されたサンプルλＤＮＡ断片の断片長分布）
＜実施例４＞
先ず、本発明のデバイスを用いて伸長・固定されるＤＮＡ断片長の分布について調べた。上記のとおり、染色したＤＮＡサンプル中に含まれるλＤＮＡの実測値は約２１．５±０．５μｍであることから、その長さより十分長い溝部と溝部の間隔（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）が３０μｍとなるようなフォトマスクを作製し、上記実施例１の手順にしたがって、ジグザグ型の固定部を有する核酸固定部材を作製した。なお、ジグザグ型の溝部の深さは６μｍ、溝部の幅（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）は３０μｍ、ジグザグの一つの頂点とその隣の頂点の頂点間距離は７．３μｍであった。

【0046】

次に、作製した核酸固定部材、及び[流路部材の作製]で作製した流路部材を張り合わせて本発明の核酸の伸長・固定デバイスを作製した。図８は作製した核酸の伸長・固定デバイスである。次いで、ＴＥバッファー１０μｌを注入口に滴下し、吸引口とシリコンチューブで接続したシリンジ（ＨＡＭＩＬＴＯＮ社製（５００μＬ））を、シリンジポンプ（ＡＳ ＯＮＥ社製）を用いて吸引することで流路内を洗浄した。その後、上記〔サンプルの調整〕で作製したサンプル１０μｌを注入口に滴下し、シリンジポンプの流速が１．０μｌ／ｍｉｎとなるように吸引口から吸引した。溶液を吸引してシリンジに回収した後は、核酸固定部材と流路部材を分離し、カバーガラスを被せてＤＮＡ標本を作製した。

【0047】

図９は、実施例４で作製したＤＮＡ標本の固定部に伸長・固定されたＤＮＡ断片の分布図である。図９から明らかなように、伸長・固定されたＤＮＡ断片は、２０μｍ及び２１μｍをピークに、７μｍ〜３３μｍに分布していた。ピーク値は、ほぼ理論値に近い値が得られたが、ピーク値より短い断片は、λＤＮＡ溶液の作製中及び／又は本発明のデバイスを用いて伸長・固定している間に切断されたためと考えられる。一方、理論値より長いＤＮＡ断片は、断片同士が絡まって見かけ上一本のＤＮＡのように伸長・固定されたものと考えられる。なお、本発明のλＤＮＡサンプルは、上記非特許文献５に記載されている方法と同様の手順で作製したが、図１と同様の原理でＤＮＡ断片を固定した場合、非特許文献５のＦｉｇ．２に示されるようにＤＮＡ断片は約２１μｍにピークがあるものの、３〜１２μｍの間にもやや大きなピークが見られ、伸長・固定中にＤＮＡ断片が切断されたことがわかる。しかしながら、実施例４の方法で伸長・固定したＤＮＡ断片は、切断された断片が少ないことから、本発明のＤＮＡの伸長・固定方法は、サンプル中のＤＮＡ断片が切断されにくいという効果を奏することが明らかとなった。

【0048】

（固定部の形状を変えたデバイスの作製及び該デバイスを用いた核酸の伸長・固定方法）
＜実施例５＞
溶液の流れ方向のホールとホールの間隔を１５μｍとした以外は、上記実施例１と同様の手順で核酸固定部材を作製し、次いで、実施例４と同様の手順でＤＮＡ標本を作製した。

【0049】

図１０は実施例５で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。写真から明らかなように、溶液中のＤＮＡは、ホールとホールの間に伸長して固定されていた。しかしながら、図９に示されているように、サンプル中のＤＮＡ断片は、ホールとホールの間隔である１５μｍより長い断片が多く含まれているものの、ホールとホールの間隔より長いＤＮＡ断片は確認されなかった。

【0050】

＜実施例６＞
上記実施例３で作製した核酸固定部材を用いた以外は、実施例４と同様の手順でＤＮＡ標本を作製した。

【0051】

図１１は実施例６で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。写真から明らかなように、溶液中のＤＮＡは、ジグザグの溝部の頂点から伸長して固定されていた。また、実施例５と同様、ジグザグの間隔より長いＤＮＡ断片は確認されなかった。

【0052】

＜実施例７＞
上記実施例３で作製したジグザグ型の核酸固定部材に代え、ジグザグ型の溝部の深さが６μｍ、溝部の幅（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）が１５μｍ、溝部と溝部の間隔（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）が２０μｍ、ジグザグの一つの頂点とその隣の頂点の頂点間距離が４μｍの核酸固定部材を作製・使用した。更に、サンプルを、ボルテックスミキサーで１０〜２０秒撹拌することで、上記〔サンプルの調整〕で作製したサンプルより短いＤＮＡ断片を多く含むサンプルとした以外は、実施例４と同様の手順でＤＮＡ標本を作製した。

【0053】

図１２は実施例７で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。写真から明らかなように、溶液中のＤＮＡは、ジグザグの溝部の頂点から伸長して固定されていた。また、溝部と溝部の間隔より短い間隔のＤＮＡ分子の片末端が溝部に引っ掛かり固定されていたが、ジグザグの間隔より長いＤＮＡは確認されなかった。

【0054】

＜実施例８＞
上記実施例７で作製したジグザグ型の核酸固定部材に代え、ジグザグ型の溝部の深さが６μｍ、溝部の幅（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）が１５μｍ、溝部と溝部の間隔（ジグザグの頂点を結んだ短い距離）が２０μｍ、ジグザグの一つの頂点とその隣の頂点の頂点間距離が７．３μｍの核酸固定部材を作製・使用した以外は、実施例７と同様の手順でＤＮＡ標本を作製した。

【0055】

図１３は実施例８で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。写真から明らかなように、実施例７と同様に、溶液中のＤＮＡは、ジグザグの溝部の頂点から伸長して固定されていた。また、溝部と溝部の間隔より短い間隔のＤＮＡ分子の片末端が溝部に引っ掛かり固定されていたが、ジグザグの間隔より長いＤＮＡは確認されなかった。

【0056】

＜実施例９＞
上記実施例７で作製したジグザグ型の核酸固定部材に代え、ライン型の溝部の深さが５０μｍ、溝部の幅が１．３μｍ、溝部と溝部の間隔が２．６μｍの核酸固定部材を作製・使用した以外は、実施例７と同様の手順でＤＮＡ標本を作製した。

【0057】

図１４は実施例９で得られたＤＮＡ標本の蛍光顕微鏡写真である。実施例７に記載されているように、サンプルをボルテックスミキサーで撹拌することで、サンプルには短いＤＮＡ断片が多く含まれるものの、図１２及び図１３に示されるように、サンプルには、実施例７及び８で用いた溝部と溝部の間隔である２０μｍに近い長さのＤＮＡ断片も含まれている。しかしながら、図１４の写真から明らかなように、溝部と溝部との間隔である２．６μｍより長いＤＮＡは固定されなかった。一方、サイズの小さいＤＮＡ断片は、溝部と溝部の間に固定された。

【0058】

上記の実施例４〜９の結果より、溝部と溝部の間隔より長いＤＮＡ断片は伸長・固定されないことから、間隔を所期の長さとすることで、様々なＤＮＡ断片を含む溶液の中から選択的にＤＮＡを伸長・固定することができる。更に、固定部としてジグザグ型を採用すると、比較的長さの揃ったＤＮＡ断片を決まった間隔で伸長・固定することができるので、病理学的検査や統計データの収集等に特に有用である。

【産業上の利用可能性】

【0059】

本発明の、核酸の伸長・固定デバイスは、簡単な操作で且つ多様な断片長を含む核酸溶液の中から、一定の長さの核酸を複数本同時に伸長・固定することができ、更に染色することで、ＤＮＡ分子単体を標本化して病理検査することができる。したがって、医療機関、大学、企業、研究機関等での簡便且つ迅速な標本の作製及び検査に有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】