特許 6144483 変異グリコシドハイドロラーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6144483

(24)【登録日】2017年5月19日

(45)【発行日】2017年6月7日

(54)【発明の名称】変異グリコシドハイドロラーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170529BHJP

   C12N 9/42 20060101ALI20170529BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170529BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170529BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170529BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170529BHJP

   C11D 3/386 20060101ALI20170529BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/42

   C12N1/15

   C12N1/21

   C12N1/19

   C12N5/10

   C11D3/386

【請求項の数】17

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2012-266732(P2012-266732)

(22)【出願日】2012年12月5日

(65)【公開番号】特開2014-110777(P2014-110777A)

(43)【公開日】2014年6月19日

【審査請求日】2015年9月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】劉 生浩

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−０８５０７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−３０９７８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−３１０２７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０８−５０１６９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２９９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０３９９６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１１１８３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０７０１０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Kim J. Y.，Database Accession No.Q83ZQ6，UniProt[online]，２０１１年 ９月２１日，[2015年10月13日検索], インターネット，ＵＲＬ，http://www.uniprot.org/uniprot/Q83ZQ6.txt?version=31

【文献】 Lucas S. et al，Database Accession No.D3EBL0，UniProt[online] ，２０１１年１２月１４日，[2015年10月13日検索], インターネット，ＵＲＬ，http://www.uniprot.org/uniprot/D3EBL0.txt?version=9

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表１（i）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、表１（ii）記載のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなる、変異グリコシドハイドロラーゼであって、前記変異グリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼと比較して耐熱性が向上したものであり、且つ、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、変異グリコシドハイドロラーゼ。

【表1】

【請求項2】

配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１２４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の２６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギンである、請求項１記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【請求項3】

配列番号２で示されるアミノ酸配列の表２（i）記載の位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、表２（ii）記載のアミノ酸残基である、請求項１又は２記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【表2】

【請求項4】

前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、（Ａ）３５６位、（Ｂ）３１０位、（Ｃ）２１０位、（Ｄ）８７位、（Ｅ）４６位、（Ｆ）１１位、（Ｉ）２５位、（Ｌ）３８位、（Ｎ）４５位、（Ｖ）１０９位、（ＡＤ）２７５位、（ＡＥ）２８４位、（ＡＦ）２８８位、及び（ＡＫ）３７７位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【請求項5】

配列番号２で示されるアミノ酸配列の以下の位置又はこれらに相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つに、下記アミノ酸残基を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ：
（Ａ）３５６位又はこれに相当する位置：トレオニン；
（Ｂ）３１０位又はこれに相当する位置：グルタミン酸；
（Ｃ）２１０位又はこれに相当する位置：システイン；
（Ｄ）８７位又はこれに相当する位置：グルタミン酸又はイソロイシン；
（Ｅ）４６位又はこれに相当する位置：システイン、アルギニン又はチロシン；
（Ｆ）１１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン；
（Ｉ）２５位又はこれに相当する位置：トレオニン；
（Ｌ）３８位又はこれに相当する位置：チロシン；
（Ｎ）４５位又はこれに相当する位置：グルタミン酸；
（Ｖ）１０９位又はこれに相当する位置：チロシン；
（ＡＤ）２７５位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン；
（ＡＥ）２８４位又はこれに相当する位置：アラニン；
（ＡＦ）２８８位又はこれに相当する位置：アラニン；
（ＡＫ）３７７位又はこれに相当する位置：トレオニン。

【請求項6】

セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子。

【請求項8】

請求項７記載の遺伝子を含有する組換えベクター。

【請求項9】

請求項８記載の組換えベクターを含む形質転換体。

【請求項10】

請求項９記載の形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法。

【請求項11】

請求項１〜６のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する洗浄剤組成物。

【請求項12】

配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表３（i）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、表３（ii）記載のアミノ酸残基に置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの耐熱性を向上させる方法であって、前記変異導入後のグリコシドハイドロラーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、方法。

【表3】

【請求項13】

前記グリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、１２４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、２５３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、且つ２６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギンである、請求項１２記載の方法。

【請求項14】

前記グリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表４（i）記載の位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、表４（ii）記載のアミノ酸残基である、請求項１２又は１３記載の方法。

【表4】

【請求項15】

前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、（Ａ）３５６位、（Ｂ）３１０位、（Ｃ）２１０位、（Ｄ）８７位、（Ｅ）４６位、（Ｆ）１１位、（Ｉ）２５位、（Ｌ）３８位、（Ｎ）４５位、（Ｖ）１０９位、（ＡＤ）２７５位、（ＡＥ）２８４位、（ＡＦ）２８８位、及び（ＡＫ）３７７位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の方法。

【請求項16】

配列番号２で示されるアミノ酸配列の以下の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されている、請求項１２〜１５のいずれか１項記載の方法：
（Ａ）３５６位又はこれに相当する位置：トレオニン；
（Ｂ）３１０位又はこれに相当する位置：グルタミン酸；
（Ｃ）２１０位又はこれに相当する位置：システイン；
（Ｄ）８７位又はこれに相当する位置：グルタミン酸又はイソロイシン；
（Ｅ）４６位又はこれに相当する位置：システイン、アルギニン又はチロシン；
（Ｆ）１１位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン；
（Ｉ）２５位又はこれに相当する位置：トレオニン；
（Ｌ）３８位又はこれに相当する位置：チロシン；
（Ｎ）４５位又はこれに相当する位置：グルタミン酸；
（Ｖ）１０９位又はこれに相当する位置：チロシン；
（ＡＤ）２７５位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン；
（ＡＥ）２８４位又はこれに相当する位置：アラニン；
（ＡＦ）２８８位又はこれに相当する位置：アラニン；
（ＡＫ）３７７位又はこれに相当する位置：トレオニン。

【請求項17】

前記グリコシドハイドロラーゼが、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、請求項１２〜１６のいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、変異グリコシドハイドロラーゼに関する。

【背景技術】

【0002】

プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、クチナーゼ、リケナーゼ等の複数の酵素を洗浄補助剤として洗剤に配合することは以前から検討又は実施されている。グリコシドハイドロラーゼの一つであるセルラーゼは、木綿単繊維の非晶質領域に作用し、単繊維内の皮脂汚れ等を効果的に除去するため、衣料用洗剤に配合するのに適している。

【0003】

衣料用洗剤等の洗剤用酵素として優れた効果を発揮する酵素として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のアルカリセルラーゼが開発され、特許出願されている（特許文献１及び２）。上記ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のアルカリセルラーゼは、グリコシドハイドロラーゼのファミリー８（ＧＨファミリー８）に属する酵素である。当該ファミリーのグルコシドハイドロラーゼは、β−１，４グルカン、キシラン、キトサン、リケナン等のβ−１，４結合を切断することを特徴とする一群の酵素群である。上記ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来の酵素も、カルボキシメチルセルロースや結晶性セルロース等のセルロース分解活性以外にリケナン分解活性も有する、グリコシドハイドロラーゼである。当該ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来の酵素（以下、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ）については、同じＧＨファミリー８に属するセルラーゼであるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のセルラーゼ（非特許文献１）やＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３３０株由来のセルラーゼ（非特許文献２）とのアミノ酸配列の比較や、酵素タンパク質結晶のＸ線解析により、触媒部位のアミノ酸及び保存アミノ酸の解析が行われている（非特許文献３）。

【0004】

洗剤はその形態により、粉末洗剤と液体洗剤に分類することが出来る。液体洗剤は、粉末洗剤に比べて溶解性に優れ、また、汚れ部分に原液を直接塗布出来るメリットもある。さらに最近では、使用量が従来の液体洗剤の半分程度でよい液体洗剤（いわゆる、濃縮液体洗剤）も市販されている。

【0005】

液体洗剤が常に一定の洗浄活性を発揮するためには、液体洗剤に配合された酵素が活性を維持し、且つ液体洗剤中において均一状態で安定に存在する必要がある。しかし、液体洗剤への酵素の安定的な配合に関しては、技術的な困難さがあることが広く知られている。元来、液体中で常温保存すること自体がタンパク質の変性を招きやすい上に、液体洗剤は界面活性剤、脂肪酸、溶剤等を含有し、ｐＨも弱アルカリ性であり、酵素にとって極めて厳しい条件になっている。また、タンパク質である酵素は、同じく洗剤中に配合されたプロテアーゼにより消化される可能性があり、このことが液体洗剤中での安定保存を更に困難なものにしている。さらに、洗剤用酵素は、高温下での保存に耐え、または湯を使用した洗濯においても洗浄力を発揮できるように、耐熱性を有することが求められている。

【0006】

従って、酵素活性及び液体洗剤中での安定性が高く、または耐熱性に優れており、高い洗浄力を発揮することができる洗剤用酵素が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２００１−３０９７８１号公報

【特許文献2】特開２００２−８５０７８号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｂｕｅｎｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，４２４８，１９９０

【非特許文献2】Ｏｚａｋｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３７，４１−４８，１９９１

【非特許文献3】Ｈａｋａｍａｄａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１５７０，１７４−１８０，２００２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、耐熱性が高い変異グリコシドハイドロラーゼを提供することに関する。本発明はまた、当該変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤組成物を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のグリコシドハイドロラーゼ（以下、本明細書においてＮ２５７グリコシドハイドロラーゼと称する）のアミノ酸配列上の特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することによって、当該酵素の耐熱性が向上することを見出した。

【0011】

すなわち本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表１（i）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、表１（ii）記載のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなる、変異グリコシドハイドロラーゼを提供する。

【0012】

【表1】

【0013】

また本発明は、上記変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子を提供する。
また本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターを提供する。
また本発明は、上記組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
また本発明は、上記形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法を提供する。
また本発明は、上記変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤組成物を提供する。
さらに本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表１（i）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、表１（ii）記載のアミノ酸残基に置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの耐熱性を向上させる方法を提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは耐熱性が高いため、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを配合した洗剤は、保存中の温度変化に強く、また高温下でも高い洗浄力を発揮することができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌを意味する。

【0016】

本明細書において、「（アミノ酸配列間の）同一性」とは、２つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）したときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。

【0017】

本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸残基又は塩基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個であり得る。また本明細書において、アミノ酸残基又は塩基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１〜数個のアミノ酸又は塩基の付加が含まれる。

【0018】

本明細書において、「グリコシドハイドロラーゼ活性」とは、β−１，４グルカン、キシラン、キトサン、リケナン等のβ−１，４結合を切断し得る活性をいい、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性、及びキシラナーゼ活性を含む。本明細書において、「グリコシドハイドロラーゼ」とは、グリコシドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質又はポリペプチドをいい、例えば、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性のいずれか１つ以上の活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。

【0019】

本明細書において、所与の変異タンパク質又はポリペプチドの「親」タンパク質又はポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異タンパク質又はポリペプチドとなるタンパク質又はポリペプチドをいう。

【0020】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼから、下記表２−１又は表２−２に示される位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、当該表に変異後のアミノ酸残基として示されるアミノ酸残基に置換することによって得ることができる。あるいは、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼから、下記表２−１又は表２−２に示される位置に相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、当該表に変異後のアミノ酸残基として示されるアミノ酸残基に置換することによって得ることができる。

【0021】

【表2-1】

【0022】

【表2-2】

【0023】

上記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼ、及び上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼは、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼの親グリコシドハイドロラーゼである。以下の本明細書において、これらを、「本発明の親グリコシドハイドロラーゼ」と呼ぶことがある。

【0024】

本発明の親グリコシドハイドロラーゼのうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼとしては、例えば、Ｎ２５７株〔バチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７３）〕由来のグリコシドハイドロラーゼが挙げられる（特許文献１及び２）。

【0025】

また本発明の親グリコシドハイドロラーゼのうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは異なるが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つグリコシドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質又はポリペプチド、ならびに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つグリコシドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質又はポリペプチドが挙げられる。

【0026】

配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＮ２５７株〔バチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７３）〕由来のグリコシドハイドロラーゼにおいて、触媒活性に関与するアミノ酸は、６３位のグルタミン酸及び１２４位のアスパラギン酸であることが知られている（非特許文献３）。また、バチルス エスピーＫ１７のチトサナーゼの立体構造と比較して、２５３位のグルタミン酸および２６３位のアスパラギンも触媒活性に関与することが分かる。よって、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる本発明の親グリコシドハイドロラーゼにおいて、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であり、１２４位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、２５３位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であり、且つ２６３位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギンである。

【0027】

より好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる本発明の親グリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の下記表３（i）記載の位置に相当する位置のアミノ酸残基は、表３（ii）に記載のアミノ酸残基である。

【0028】

【表3】

【0029】

本発明の親グリコシドハイドロラーゼとなり得る、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼの例としては、非特許文献３に記載のＧＨファミリー８に属する他の酵素：例えば、バチルス サーキュランス由来のセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＰ２２９４６、アミノ酸配列同一性９７％）；パエニバチルス エスピーＹ４１２ＭＣ１０由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ＿００３２４０６３０、アミノ酸配列同一性９６％）；パエニバチルス エスピーＨＧＦ５由来のｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ８（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＺＰ＿０８２８３３９７、アミノ酸配列同一性９６％）；パエニバチルス ボルテックスＶ４５３由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＺＰ＿０７８９７９６４、アミノ酸配列同一性９３％）；及び、パエニバチルス ラクティス１５４由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＺＰ＿０９００２３２４、アミノ酸配列同一性８３％）が挙げられる。上記に挙げたグリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するとともに、それらのアミノ酸配列上における、配列番号２の表３（i）記載の位置に相当する位置に、表３（ii）に記載のアミノ酸残基を有している。

【0030】

本明細書において、「相当する位置のアミノ酸残基」の特定は、公知のアルゴリズムを用いて、目的アミノ酸配列を参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）と比較し、各グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより行なうことができる。グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各グリコシドハイドロラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。アラインメントは、例えば、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイトから利用することができる。

【0031】

当業者であれば、上記で得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することできる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。

【0032】

上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置に整列した目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置のアミノ酸残基」と称される。

【0033】

すなわち、上記方法を用いることにより、例えば、上述したグリコシドハイドロラーゼであるセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＰ２２９４６）において、配列番号２における（Ａ）３５６位、（Ｂ）３１０位、（Ｃ）２１０位、（Ｄ）８７位、（Ｅ）４６位、（Ｆ）１１位、（Ｇ）１６位、（Ｈ）２３位、（Ｉ）２５位、（Ｊ）２９位、（Ｋ）３１位、（Ｌ）３８位、（Ｍ）４２位、（Ｎ）４５位、（Ｏ）５０位、（Ｐ）５１位、（Ｑ）６１位、（Ｒ）７９位、（Ｓ）８５位、（Ｔ）９０位、（Ｕ）１０７位、（Ｖ）１０９位、（Ｗ）１４１位、（Ｘ）１４６位、（Ｙ）１８１位、（Ｚ）２０２位、（ＡＡ）２４３位、（ＡＢ）２５９位、（ＡＣ）２６１位、（ＡＤ）２７５位、（ＡＥ）２８４位、（ＡＦ）２８８位、（ＡＧ）３１１位、（ＡＨ）３３４位、（ＡＩ）３４８位、（ＡＪ）３５２位及び（ＡＫ）３７７位の各位置に相当する位置は、それぞれ、３８６位のグリシン残基、３４０位のアスパラギン残基、２４０位のアスパラギン残基、１７１位のグリシン残基、７６位のアラニン残基、４１位のチロシン残基、４６位のイソロイシン残基、５３位のグルタミン残基、５５位のアラニン残基、５９位のアラニン残基、６１位のリジン残基、６８位のリジン残基、７２位のロイシン残基、７５位のアラニン残基、８０位のチロシン残基、８１位のチロシン残基、９１位のバリン残基、１０９位のアスパラギン酸残基、１１５位のチロシン残基、１１７位のアスパラギン酸残基、１２０位のチロシン残基、１３７位のトリプトファン残基、１３９位のグルタミン残基、１７６位のイソロイシン残基、２１１位のイソロイシン残基、２３２位のアラニン残基、２７３位のアスパラギン残基、２８９位のリジン残基、２９１位のチロシン残基、３０５位のチロシン残基、３１４位のロイシン残基、３１８位のアスパラギン残基、３４１位のロイシン残基、３６４位のトレオニン残基、３７８位のチロシン残基、３８２位のアラニン残基及び４０７位のチロシン残基というように特定することができる。

【0034】

Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ（配列番号２）のアミノ酸配列の（Ａ）３５６位、（Ｂ）３１０位、（Ｃ）２１０位、（Ｄ）８７位、（Ｅ）４６位、（Ｆ）１１位、（Ｇ）１６位、（Ｈ）２３位、（Ｉ）２５位、（Ｊ）２９位、（Ｋ）３１位、（Ｌ）３８位、（Ｍ）４２位、（Ｎ）４５位、（Ｏ）５０位、（Ｐ）５１位、（Ｑ）６１位、（Ｒ）７９位、（Ｓ）８５位、（Ｔ）９０位、（Ｕ）１０７位、（Ｖ）１０９位、（Ｗ）１４１位、（Ｘ）１４６位、（Ｙ）１８１位、（Ｚ）２０２位、（ＡＡ）２４３位、（ＡＢ）２５９位、（ＡＣ）２６１位、（ＡＤ）２７５位、（ＡＥ）２８４位、（ＡＦ）２８８位、（ＡＧ）３１１位、（ＡＨ）３３４位、（ＡＩ）３４８位、（ＡＪ）３５２位及び（ＡＫ）３７７位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記で例示したセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＰ２２９４６）を含め、先述したアミノ酸配列において配列番号２と８０％以上の同一性を有するパエニバチルス エスピーＹ４１２ＭＣ１０由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＰ＿００３２４０６３０）、パエニバチルス エスピーＨＧＦ５由来のｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０８２８３３９７）、パエニバチルス ボルテックスＶ４５３由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０７８９７９６４）、及びパエニバチルス ラクティス１５４由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０９００２３２４）について示す（表４）。

【0035】

【表4】

【0036】

斯くして特定される「相当する位置」は、アミノ酸配列において高い同一性を有し且つグリコシドハイドロラーゼであるタンパク質同士の間では、その三次元構造中で同等の位置に存在すると考えられる。したがって、相当する位置に存在するアミノ酸残基の変異は、グリコシドハイドロラーゼの特異的機能に対して、互いに類似した効果を及ぼすと推定される。

【0037】

さらに、本発明の親グリコシドハイドロラーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列のグリコシドハイドロラーゼが有する次の酵素学的性質のいずれか１つ以上を有するものが、より好ましい：
１）等電点電気泳動法により測定された等電点が９．３である；
２）カルボキシメチルセルロースを液化型で良好に分解する；
３）基質特異性：カルボキシメチルセルース、リケナン、結晶性セルロース又はセロトリオース以上のセロオリゴ糖及を分解し、還元糖を生成する；
４）最適反応ｐＨ：少なくともｐＨ５〜１０で作用し、最適ｐＨは８．５である；
５）最適反応温度：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で反応を行った場合、最適反応温度は５５℃である；
６）安定ｐＨ範囲：３０℃、６０分間で処理した場合、ｐＨ５〜１１の範囲で安定である；
７）耐熱性：トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１５分間の処理において、５５℃まで安定である；
８）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、４３ｋＤａである。

【0038】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼにおいて、上記表２−１及び表２−２に記載のアミノ酸残基の置換は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。さらに、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、上記表２−１及び表２−２に記載された位置のアミノ酸残基の置換に加えて、そのグリコシドハイドロラーゼ活性及び耐熱性向上効果を妨げない限り、他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。当該任意の位置における変異もまた、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。

【0039】

グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸残基を置換する手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、本発明の親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列をコードするグリコシドハイドロラーゼ遺伝子（以下、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子とも称する）内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、更にその変異遺伝子から変異グリコシドハイドロラーゼを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基が所望のアミノ酸残基に置換された変異グリコシドハイドロラーゼを得ることができる。

【0040】

親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子への目的の変異の導入は、例えば基本的には、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版 新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。

【0041】

親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するポリヌクレオチドを含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば、通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。

【0042】

変異導入はまた、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つの変異プライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）７７（１），ｐ．６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。このＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた変異導入手順については、後述の実施例にも詳述している。

【0043】

親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したバチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７（ＦＥＲＭ Ｐ-１７４７３）、バチルス サーキュランス、パエニバチルス エスピーＹ４１２ＭＣ１０、パエニバチルス エスピーＨＧＦ５、パエニバチルス ボルテックスＶ４５３、パエニバチルス ラクティス１５４、又はそれらの変異株から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。

【0044】

上記バチルス属菌株からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，８：ｐ．１５１−１５６に記載の方法などを用いて行うことができる。親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから切り出した親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。

【0045】

プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７０５９−７０７１，１９８９）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて作製することもできる。変異プライマーを含むプライマーセットを使用し、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を得ることができる。本発明はこのようにして得られる変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子にも関する。なお本発明において「変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子」とは、変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子のアミノ酸配列をコードする任意の核酸断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び人工核酸等を含む）を意味する。本発明に係る「遺伝子」は、オープンリーディングフレームに加えて非翻訳領域（ＵＴＲ）などの他のヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0046】

得られた変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより、組換えベクターを作製することができる。本発明で用いるベクターは特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターがより好ましく、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターであることが更に好ましい。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を組換え生産する上で特に好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ａｎｄ Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ，（１９８５）６０，ｐ．２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８８）１６，ｐ．８７３２）等のシャトルベクター、ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７８）１３４，ｐ．３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１８（１９８７）ｐ．８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），ｐ．１６３−１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。

【0047】

変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を組換え生産する目的では、ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須な各種エレメントの他、選択マーカー遺伝子やポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等の有用な配列を必要に応じて含み得る。

【0048】

変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む組換えベクターを用いて、形質転換体を作製することができる。本発明では、本発明に係る変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む組換えベクター（具体的には組換え発現ベクター）を宿主細胞に導入することにより形質転換体（形質転換細胞）を作製し、それを組換えタンパク質の発現が誘導される条件下で培養することにより、変異グリコシドハイドロラーゼを産生させることができる。

【0049】

組換えベクターを導入する宿主細胞としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞を使用することができる。本発明においては、特に、枯草菌やその変異株等のバチルス属細菌を使用することが好ましい。

【0050】

形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｂｏｔｔ．Ｋ．Ｆ．ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９６７）９３，１９２５）、エレクトロポレーション法（Ｂｒｉｇｉｄｉ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）５５，１３５）、プロトプラスト形質転換法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９７９）１６８，ｐ．１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５６，ｐ．１１３０−１１３４）などが挙げられる。

【0051】

組換えタンパク質生産のための上記形質転換体の培養は、当業者には一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、薬剤選択マーカーの種類に対応してアンピシリンやテトラサイクリン等を添加してもよい。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した細菌等を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ−マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。

【0052】

本発明に係る変異グリコシドハイドロラーゼは、無細胞翻訳系を使用して変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、インビトロ転写翻訳系又はインビトロ翻訳系を構成したものである。発現された変異グリコシドハイドロラーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、又は無細胞翻訳系から取得することができる。また、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮したその培養上清や溶菌液上清等の溶液は、粗酵素液としてそのまま使用することもできる。発現された変異グリコシドハイドロラーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。

【0053】

なお本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，（２００１）３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。特に、枯草菌の遺伝子組換え実験については例えば、吉川博文著"７．２ 枯草菌系"「続生化学実験講座１．遺伝子研究法ＩＩ」，（１９８６）東京化学同人社（東京），ｐ．１５０−１６９等の枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。

【0054】

斯くして、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを得ることができる。従って、本発明はまた、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）、当該遺伝子を含むベクター、及び当該ベクターを含む形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法を提供する。

【0055】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、本発明の親グリコシドハイドロラーゼに対して、上記表２−１又は表２−２に示される位置又はそれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸残基が置換されている。

【0056】

好ましくは、置換されたアミノ酸残基の位置は、配列番号２で示されるアミノ酸配列における３５６位、３１０位、２１０位、８７位、４６位、１１位、２５位、３８位、４５位、１０９位、２７５位、２８４位、２８８位及び３７７位からなる群、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列における上記位置に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つを含む。あるいは、置換された位置は、上記に挙げた位置からなる群より選択される少なくとも２つを含む。またあるいは、置換された位置は、上記に挙げた位置からなる群より選択される少なくとも３つを含む。

【0057】

上記に挙げた好ましい置換位置における置換後のアミノ酸残基の好ましい例としては、以下が挙げられる：
３５６位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましく；
３１０位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸が好ましく；
２１０位又はこれに相当する位置は、システインであり；
８７位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸又はイソロイシンが好ましく；
４６位又はこれに相当する位置は、システイン、アルギニン又はチロシンが好ましく；
１１位又はこれに相当する位置は、フェニルアラニンであり；
２５位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましく；
３８位又はこれに相当する位置は、チロシンが好ましく；
４５位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸であり；
１０９位又はこれに相当する位置は、チロシンが好ましく；
２７５位又はこれに相当する位置は、フェニルアラニンであり；
２８４位又はこれに相当する位置は、アラニンが好ましく；
２８８位又はこれに相当する位置は、アラニンであり；
３７７位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましい。

【0058】

さらに、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼにおいては、上記３５６位、３１０位、２１０位、８７位、４６位、１１位、２５位、３８位、４５位、１０９位、２７５位、２８４位、２８８位及び３７７位、又はこれらに相当する位置の単置換、二重又は多重置換に加えて、さらに上記表２−１及び表２−２に示される他の位置のアミノ酸残基が置換されていてもよい。

【0059】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼにおいては、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であり、１２４位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、２５３位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であり、且つ２６３位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギンである。より好ましくは、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表３（i）記載の位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記表３（ii）に記載のアミノ酸残基である。

【0060】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、グリコシドハイドロラーゼ活性、好ましくはアルカリセルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性、好ましくはセルラーゼ活性を有する。また本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、親グリコシドハイドロラーゼと比べて、耐熱性が向上している。

【0061】

よって本発明はまた、本発明の親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸残基を上述のとおり置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの耐熱性を向上させる方法を提供する。

【0062】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、各種洗剤配合用酵素、好ましくは、洗剤配合用酵素として有用である。本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは耐熱性が向上しているため、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤は、保存中の温度変化に強く、また高温下でも高い洗浄力を発揮することができ、結果としてより強力な酵素洗浄力を発揮することができる。よって本発明はまた、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供する。

【0063】

本発明の洗浄剤組成物における本発明の変異グリコシドハイドロラーゼの含有量は、組成物の０．０００１質量％から５質量％、好ましくは０．０００１質量％から２質量％であり、均一に溶解又は分散可能な範囲で異なる活性を有する酵素を配合することもできる。

【0064】

本発明の洗浄剤組成物は、本発明のグリコシドハイドロラーゼに加えて、界面活性剤及び水等を含有する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0065】

非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ₁Ｏ−（ＡＯ）ｍ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６〜３５）〔特開２０１０−２７５４６８号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１〜５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１０−２６５４４５号公報、特開２０１１−６３７８４号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０〜３０、ｎ＝０〜５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−１８９５５１号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）ｌＯ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｒ₂（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０〜１、ｍ＝１４〜５０、ｎ＝１〜５、Ｒ₂＝水素（ｌ＝０）又はＣ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２２９３８５号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５〜３０、ｎ＝１〜５）〔特開２０１０−２２９３８７号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ−Ｈ及び／又はＲ₂−ＣＯＯ−（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素基、Ｒ₂＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０〜５、ｎ＝２〜１０、ｐ＝０〜５、ｑ＝２〜１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２５４８８１号公報〕；
Ｒ₁−ＣＯＯ−（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ−Ｒ₂（Ｒ₁＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３〜５、ｎ＝８〜２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２６５３３３号公報〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＰＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ８−Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ₁Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＰＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ₁＝Ｃ１０−Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５〜１５、ｎ＝１〜３）〔特開平８−１５７８６７号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）−（ＥＯ）ｍ−ＯＲ₂（Ｒ₁＝Ｃ１１−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０〜２０）〔特開２００８−７７０６号公報、特開２００９−７４５１号公報、特開２００９−１５５５９４号公報、特開２００９−１５５６０６号公報〕；
Ｒ₁（ＣＯ）−（ＡＯ）ｍ−ＯＲ₂（Ｒ₁＝Ｃ９−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ₂＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ｍ＝５〜３０）〔特開２００９−１４４００２号公報、特開２００９−１７３８５８号公報、特開２０１０−１８９６１２号公報〕；
ならびに、脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等が挙げられる。

【0066】

陰イオン界面活性剤としては、例えば、カルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。

【0067】

陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。両性イオン活性剤としては、アルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。

【0068】

好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、液体洗剤組成物である。当該液体洗剤組成物は、濃縮液体洗剤組成物であってもよい。本明細書において、「濃縮液体洗剤」とは、界面活性剤を４０質量％以上、水を６０質量％未満含有する液体洗剤を意味し得る。好ましくは、界面活性剤を４０〜９０質量％、水を５質量％以上６０質量％未満含有する液体洗剤であり得、より好ましくは、界面活性剤を４５〜９０質量％、水を５質量％以上５５質量％未満含有する液体洗剤であり得、さらに好ましくは、界面活性剤を５０〜７５質量％、水を５〜５０質量％未満含有する液体洗剤であり得る。上記のような「濃縮液体洗剤」の例としては、使用量が従来の半分程度又はそれ以下でよい液体洗剤、例えば、衣料用液体洗剤であれば、水槽式洗濯機で水３０Ｌに対する標準使用量が７〜１３ｇ又はそれ以下と表示されているものを挙げることができる。

【0069】

本発明の液体洗剤組成物は、さらに、液体洗剤に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、キレート剤、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤及び分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類等を含み得る。

【0070】

水溶性ポリマーとしては、例えば、（ｉ）炭素数２〜５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（ｉ）又は（ii）はいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０−２７５４６８号公報）、ならびにアルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９−１５５６０６号公報）等が挙げられる。

【0071】

水混和性有機溶剤としては、例えばアルカノール類、のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、１〜４０質量％、好ましくは１〜３５質量％である。

【0072】

アルカリ剤としては、例えばＣ２−Ｃ４のアルカノールを１〜３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又はポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、０〜２０質量％、好ましくは０〜１０質量％である。

【0073】

キレート剤としては、例えばニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、これらのアルカリ金属または低級アミン塩等が挙げられる。本発明の液体洗剤組成物における当該キレート剤の含有量は、０．１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．１〜４質量％である。

【0074】

有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、またはそれらの塩などの多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類が挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が特に好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、０〜５質量％、好ましくは０〜３質量％である。

【0075】

再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸−酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができるが、配合に適さない場合は除外してもよい。

【0076】

色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１〜１０質量％が好ましい。

【0077】

漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。

【0078】

蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。

【0079】

本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ以外の他の酵素としては、例えば、プロテアーゼ、他のセルラーゼ、他のリケナーゼ、他のβ−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、他のキシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等を始めとする加水分解酵素、ならびにそれらのうち２種以上の混合物が挙げられる。

【0080】

その他成分として、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ビヒドロキシ化合物、蟻酸等の酵素安定化剤、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などの可溶化剤、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ−リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤等が挙げられる。

【0081】

本発明の洗浄剤組成物は、限定するものではないが、好ましくは衣料用、又は布製品（シーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）用のものである。本発明に係る洗浄剤組成物は、本発明の耐熱性の高い変異グリコシドハイドロラーゼを含有することにより、従来品と比べて高温での安定性が高くなり、高い酵素洗浄力を発揮することができる。

【0082】

本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、方法、あるいは用途を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

【0083】

＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表１（i）記載の位置又はそれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、上記表１（ii）記載のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなる、変異グリコシドハイドロラーゼ。

【0084】

＜２＞上記配列同一性が９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である＜１＞記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【0085】

＜３＞配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１２４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の２６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギンである、＜１＞又は＜２＞記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【0086】

＜４＞配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表３（i）記載の位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、上記表３（ii）記載のアミノ酸残基である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【0087】

＜５＞上記少なくとも１つのアミノ酸残基が、（Ａ）３５６位、（Ｂ）３１０位、（Ｃ）２１０位、（Ｄ）８７位、（Ｅ）４６位、（Ｆ）１１位、（Ｉ）２５位、（Ｌ）３８位、（Ｎ）４５位、（Ｖ）１０９位、（ＡＤ）２７５位、（ＡＥ）２８４位、（ＡＦ）２８８位、及び（ＡＫ）３７７位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される、＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【0088】

＜６＞配列番号２で示されるアミノ酸配列の以下の位置又はこれらに相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つに、下記アミノ酸残基を有する、＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ：
（Ａ）３５６位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましく；
（Ｂ）３１０位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸が好ましく；
（Ｃ）２１０位又はこれに相当する位置は、システインであり；
（Ｄ）８７位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸又はイソロイシンが好ましく；
（Ｅ）４６位又はこれに相当する位置は、システイン、アルギニン又はチロシンが好ましく；
（Ｆ）１１位又はこれに相当する位置は、フェニルアラニンであり；
（Ｉ）２５位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましく；
（Ｌ）３８位又はこれに相当する位置は、チロシンが好ましく；
（Ｎ）４５位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸であり；
（Ｖ）１０９位又はこれに相当する位置は、チロシンが好ましく；
（ＡＤ）２７５位又はこれに相当する位置は、フェニルアラニンであり；
（ＡＥ）２８４位又はこれに相当する位置は、アラニンが好ましく；
（ＡＦ）２８８位又はこれに相当する位置は、アラニンであり；
（ＡＫ）３７７位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましい。

【0089】

＜７＞セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。

【0090】

＜８＞＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子。

【0091】

＜９＞＜８＞記載の遺伝子を含有する組換えベクター。

【0092】

＜１０＞＜９＞記載の組換えベクターを含む形質転換体。

【0093】

＜１１＞＜１０＞記載の形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法。

【0094】

＜１２＞＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する洗浄剤組成物。

【0095】

＜１３＞液体洗剤組成物である、＜１２＞記載の洗浄剤組成物。

【0096】

＜１４＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表１（i）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、上記表１（ii）記載のアミノ酸残基に置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの耐熱性を向上させる方法。

【0097】

＜１５＞上記配列同一性が９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である＜１４＞記載の方法。

【0098】

＜１６＞上記グリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１２４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２５３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列の２６３位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアスパラギンである、＜１４＞又は＜１５＞記載の方法。

【0099】

＜１７＞上記グリコシドハイドロラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表３（i）記載の位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、上記表３（ii）記載のアミノ酸残基である、＜１４＞〜＜１６＞のいずれか１に記載の方法。

【0100】

＜１８＞上記少なくとも１つのアミノ酸残基が、（Ａ）３５６位、（Ｂ）３１０位、（Ｃ）２１０位、（Ｄ）８７位、（Ｅ）４６位、（Ｆ）１１位、（Ｉ）２５位、（Ｌ）３８位、（Ｎ）４５位、（Ｖ）１０９位、（ＡＤ）２７５位、（ＡＥ）２８４位、（ＡＦ）２８８位、及び（ＡＫ）３７７位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される、＜１４＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法。

【0101】

＜１９＞配列番号２で示されるアミノ酸配列の以下の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基に置換されている、＜１４＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の方法：
（Ａ）３５６位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましく；
（Ｂ）３１０位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸が好ましく；
（Ｃ）２１０位又はこれに相当する位置は、システインであり；
（Ｄ）８７位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸又はイソロイシンが好ましく；
（Ｅ）４６位又はこれに相当する位置は、システイン、アルギニン又はチロシンが好ましく；
（Ｆ）１１位又はこれに相当する位置は、フェニルアラニンであり；
（Ｉ）２５位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましく；
（Ｌ）３８位又はこれに相当する位置は、チロシンが好ましく；
（Ｎ）４５位又はこれに相当する位置は、グルタミン酸であり；
（Ｖ）１０９位又はこれに相当する位置は、チロシンが好ましく；
（ＡＤ）２７５位又はこれに相当する位置は、フェニルアラニンであり；
（ＡＥ）２８４位又はこれに相当する位置は、アラニンが好ましく；
（ＡＦ）２８８位又はこれに相当する位置は、アラニンであり；
（ＡＫ）３７７位又はこれに相当する位置は、トレオニンが好ましい。

【0102】

＜２０＞上記グリコシドハイドロラーゼが、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の方法。

【実施例】

【0103】

以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0104】

参考例１ Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼの調製
グリコシドハイドロラーゼの調製方法について、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭＰ−１７４７３）由来のＮ２５７グリコシドハイドロラーゼを例として以下に示す。
Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１）〔以下、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子とも称する；塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０５９２６７に基づき入手可能；Ｈａｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１５７０，２００２，ｐ．１７４−１８０〕におけるＮ２５７グリコシドハイドロラーゼのＮ末端アミノ酸からターミネーター配列までをコードする核酸断片を増幅した。さらに、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）〔以下、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子とも称する；塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１８４２０に基づき入手可能；Ｈａｋａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（１１），２０００，ｐ．２２８１−２２８９；特開２０００−２１００８１号公報〕のプロモーター及びシグナル配列の核酸断片を増幅した。
ＳＯＥ−ＰＣＲにて２つの核酸断片を連結し、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社；Ｉｓｈｉｗａ，Ｈ．＆Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８５，６０，ｐ．２３５−２４３）に導入することで、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを作製した。

【0105】

詳細には、初めにバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株からゲノムＤＮＡを常法により抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、表５に示すプライマーＳ２３７ＵＢ１ ＦＷ（配列番号４）とＳ２３７−ＰＳ ＲＶ（配列番号５）からなるプライマーセットを用いて、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）のプロモーター及びシグナル配列を含むＤＮＡ断片１を増幅した。
次に、バチルス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＫＳＭ−Ｎ２５７株からゲノムＤＮＡを常法により抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、表５に示すＮ２５７ｍａｔ−Ｑｓｔｅｒ ＦＷ（配列番号６）とＮ２５７−Ｃｒｙｔｅｒ ＲＶ（配列番号７）からなるプライマーセットを用いて、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子の成熟タンパク質コード領域及びターミネーター配列（配列番号１の３３８番塩基以降）を含むＤＮＡ断片２を増幅した。
上記ＤＮＡ断片１、２の増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行った。ＰＣＲの反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ混合し、水を加えて反応液総量を５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整したが、目安は１ｋｂ当たり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させる条件で行った。
上記で得られたＤＮＡ断片１及び２を鋳型として、Ｓ２３７セルラーゼのプロモーター及びシグナル配列とＮ２５７成熟タンパク質コード領域及びターミネーター配列とを含むＤＮＡ断片を、表５に示すＳ２３７ＵＢ１ Ｆｗ（配列番号４）とＮ２５７−Ｃｒｙｔｅｒ Ｒｖ（配列番号７）からなるプライマーセットを用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲによって増幅した。

【0106】

【表5】

【0107】

シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社；Ｉｓｈｉｗａ，Ｈ．＆Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８５，６０，ｐ．２３５−２４３）をＳｍａＩにて制限酵素処理し、これに増幅断片を挿入し、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７を構築した。プラスミド中に挿入されたＮ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子断片については、３１００ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定することにより、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）のプロモーター及びシグナル配列とＮ２５７成熟タンパク質コード領域及びターミネーター配列とが連結したヌクレオチド配列を有することを確認した。次いでプロトプラスト形質転換法により、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８株（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９））を組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７を導入して形質転換した。

【0108】

プロトプラスト形質転換法では、まず、枯草菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を、５０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）中で３７℃にて約２時間振盪培養し、６００ｎｍにおける吸光度が０．４となった時点で、室温で遠心分離（７０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を集めた。集めた菌体を５ｍＬのＳＭＭＰ［０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で１時間保温して菌体をプロトプラスト化した。保温終了後、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に、１０μＬのプラスミド溶液（Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを含む）と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）を加え、緩やかに攪拌して室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を、３７℃で９０分間振盪（１２０ｒｐｍ）した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地［０．８％（ｗ／ｖ）寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、ロイシン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）］上に塗布し、３０℃で７２時間培養して、生育したコロニーを形質転換体として分離した。

【0109】

得られた形質転換体を１０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で３０℃にて一夜振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。培養によって得られたＮ２５７グリコシドハイドロラーゼを含む培養液を遠心分離し、培養上清を得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、培養上清に含まれる蛋白質がＮ２５７グリコシドハイドロラーゼであることを確認した。

【0110】

参考例２ グリコシドハイドロラーゼ活性の測定
（１）グリコシドハイドロラーゼ蛋白量測定
培養上清中のグリコシドハイドロラーゼ蛋白量の測定は、プロテインアッセイラピッドキット（和光純薬工業）を用いて以下の通り行なった。すなわち、９６穴プレートの各ウェルに、同キットの発色液２５０μＬを加え、さらに適宜希釈した酵素液（グリコシドハイドロラーゼを含む培養上清）１０μＬを混和し、室温で３０分間撹拌したのち、マイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて６００ｎｍにおける吸光度を測定した。同キット付属の牛胸腺アルブミン（ＢＳＡ）標準液を用いて同時に作製した検量線から、グリコシドハイドロラーゼタンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ相当）を算出した。

【0111】

（２）グリコシドハイドロラーゼのセルラーゼ活性測定（ＤＮＳ法）
セルラーゼ活性測定は９６穴プレートを用いて測定を行った。１．０％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、日本製紙）及び５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を調製し、基質溶液とした。この基質溶液９０μＬに対し、適当な濃度に希釈した酵素液（培養上清）１０μＬを加え、４０℃で２０分反応した後、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液１００μＬを加えて１００℃で５分間熱処理し、速やかに氷水中で冷却した。冷却した溶液１００μＬを９６穴アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）へと移し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて５３５ｎｍの吸光度を測定した。４０℃、１００℃での熱処理はＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ ＰＴＣ−２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。また、サンプルの希釈、基質反応液への添加、ＤＮＳ溶液の添加にはマルチディスペンサーＥＤＲ３８４Ｓ（バイオテック）を用いた。吸光度に基づいて酵素反応により生成した還元糖の量を測定し、上記条件下で１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコース相当の還元糖を遊離する活性を１ｕｎｉｔ（Ｕ）として、グリコシドハイドロラーゼのセルラーゼ活性（Ｕ）を求めた。

【0112】

参考例３ グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性の測定
５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）で適当な濃度に希釈した酵素液（グリコシドハイドロラーゼを含む培養上清）を６０℃で１０分間保温した。保温操作には、ＰＣＲプレートとＰＣＲサイクラーＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅ ＰＴＣ−２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。保温前後のサンプルのセルラーゼ活性を参考例２と同様の方法にて測定し、保温前に対する保温後の残存活性（％）〔（保温後のセルラーゼ活性）／（保温前のセルラーゼ活性）×１００〕を求めた。

【0113】

実施例１ グリコシドハイドロラーゼ変異体の作製
本発明のグリコシドハイドロラーゼ変異体の作製方法を、野生型（親）Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ成熟酵素領域のアミノ酸配列（配列番号２）における１１番目のチロシン（Ｙ１１）をフェニルアラニンに変異させた変異体「Ｙ１１Ｆ」の作製方法を例として、以下に示す。

【0114】

大腸菌から抽出し、十分に希釈したプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７（上記参考例１参照）を鋳型とし、表６−１に示したプライマーＹ１１Ｆ−ＦＷ（配列番号８）とＹ１１−ＲＶ（配列番号９）からなるプライマーセット、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、インバースＰＣＲを行った。詳細には、鋳型としてｐＨＹ−Ｎ２５７ １００ｐｇ、各プライマー（フォワード、リバース）２μＭ、Ｋｉｔに付属のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２５μＬを、滅菌水を用いて５０μＬに調製した。反応は、変性を９８℃ １０秒、アニーリングを５５℃ ５秒、伸長を７２℃ ４５秒で３０サイクルにて行った。本ＰＣＲシステムでは、プラスミドを鋳型に５'側が１５塩基オーバーラップしたプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行うことによって、オーバーラップ部分が５'側に突出したプラスミドの配列を全て含むＰＣＲ産物を得ることができる。この増幅産物は形質転換可能な環状構造をとることが出来るため、この増幅産物を用いることで形質転換を直接行うことができる。本実施例では、フォワードプライマーのオーバーラップ配列直後の３'側の３塩基を目的のアミノ酸の塩基配列に変えることで、同じ位置のアミノ酸残基を置換する場合には、リバースプライマーを共用できるようにした。以上の方法により、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子の１１位のチロシン残基に対応する位置をフェニルアラニンに置換した変異を含むｐＨＹ−Ｎ２５７＿Ｙ１１Ｆを得た。制限酵素ＤｐｎＩ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて鋳型プラスミドを消化した後に、ＮｕｃｌｅｏＦａｓｔ ９６ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ（ＭＡＣＨＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて増幅産物を精製した。次いで、参考例１と同様に、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７＿Ｙ１１Ｆを枯草菌に導入し、得られた形質転換体を培養した。得られた培養物から遠心分離にて菌体を除いて培養上清を取得した。この培養上清は、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）の１１位のチロシンがフェニルアラニンに置換された変異Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ（以下、Ｎ２５７＿Ｙ１１Ｆとも称する）を含む。

【0115】

同様に、Ｙ１１Ｆ−ＦＷ及びＹ１１Ｆ−ＲＶに代えて、下記表６−１〜６−３の「Ｆｏｒｗａｒｄプライマー」欄及び「Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー」欄に記載のプライマーをそれぞれ用いて同様の操作を行うことで、下記表６−１〜６−３の「Ｎ２５７変異」欄記載の変異を有するＮ２５７グリコシドハイドロラーゼ変異体を含む培養上清を得た。

【0116】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0117】

実施例２ 変異グリコシドハイドロラーゼの耐熱性評価
参考例３記載の方法にて、実施例１で得た変異グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を測定した。同様の方法で測定した親グリコシドハイドロラーゼ（Ｎ２５７）の残存活性を１００％としたときの、各変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素の耐熱性を評価した。
結果を表７に示す。全ての変異体は、親グリコシドハイドロラーゼと比較して耐熱性が向上していた。

【0118】

【表7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]