特許 6144672 再構成頭皮モデルおよび活性分子のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6144672

(24)【登録日】2017年5月19日

(45)【発行日】2017年6月7日

(54)【発明の名称】再構成頭皮モデルおよび活性分子のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/60 20060101AFI20170529BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20170529BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20170529BHJP

   G01N 33/15 20060101ALN20170529BHJP

   G01N 33/50 20060101ALN20170529BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20170529BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20170529BHJP

【ＦＩ】

   A61L27/60

   A61K35/36

   A61P17/02

   !G01N33/15 Z

   !G01N33/50 Z

   !C12N5/071

   !C12Q1/02

【請求項の数】8

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2014-513176(P2014-513176)

(86)(22)【出願日】2012年5月30日

(65)【公表番号】特表2014-518099(P2014-518099A)

(43)【公表日】2014年7月28日

(86)【国際出願番号】EP2012060164

(87)【国際公開番号】WO2012163974

(87)【国際公開日】20121206

【審査請求日】2015年5月27日

(31)【優先権主張番号】1154684

(32)【優先日】2011年5月30日

(33)【優先権主張国】FR

(31)【優先権主張番号】61/492,383

(32)【優先日】2011年6月2日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】391023932

【氏名又は名称】ロレアル

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】ハリド・バカール

【審査官】 深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−０２９３４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２５０８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０００１９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Arch Dermatol Res，２００６年，Vol.298，p.183-190

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ ２７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

毛包間頭皮ケラチノサイトが、コラーゲンおよび毛包間頭皮線維芽細胞を含む真皮同等物上で、播種および培養されることを特徴とする、頭皮同等物の調製方法であって、前記毛包間頭皮ケラチノサイトが、外上皮の鞘のケラチノサイトが事前に除去されている頭皮試料から得られることを特徴とする、調製方法。

【請求項2】

前記真皮同等物が、収縮したコラーゲン格子であり、ケラチノサイトの前記播種が前記格子の収縮の2〜5日後に実施されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

前記毛包間頭皮線維芽細胞およびケラチノサイトが、頭皮試料から得られる真皮および表皮からそれぞれ単離されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】

前記毛包間頭皮ケラチノサイトが、次のステップ:
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、頭皮真皮を表皮から分離するステップ、
- 前記頭皮表皮を回収するステップ、
- このようにして得られた前記頭皮表皮をトリプシンに接触させるステップ、
- 前記毛包間頭皮ケラチノサイトを回収するステップ、および
- このようにして得られた前記ケラチノサイトを培養するステップ
によって得られることを特徴とする、請求項3に記載の方法。

【請求項5】

前記ケラチノサイトの培養が、事前にマイトマイシンで処理したか、もしくは照射した線維芽細胞との共培養である、またはフィブロネクチンもしくはコラーゲンを補充した培養培地での培養であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。

【請求項6】

前記毛包間頭皮線維芽細胞が、次のステップ:
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、頭皮真皮を表皮から分離するステップ、
- 前記頭皮真皮を回収するステップ、
- このようにして得られた前記頭皮真皮をコラゲナーゼおよび/またはトリプシンに接触させるステップ、
- 前記毛包間頭皮線維芽細胞を回収するステップ、および
- このようにして得られた前記線維芽細胞を培養するステップ
によって得られることを特徴とする、請求項3に記載の方法。

【請求項7】

前記毛包間頭皮ケラチノサイトを播種した前記真皮同等物が、培養培地中に浸漬して5〜7日間、次いで好適な担体上で培地の上に出して5〜7日間培養されることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

真皮乳頭の線維芽細胞および/もしくは結合組織鞘の線維芽細胞、ならびに/または真皮乳頭全体および/もしくは結合組織鞘および/もしくは結合組織鞘の部分から選択される毛の線維芽細胞が、収縮したまたは収縮途中の前記真皮同等物の中に移植されるステップを含むことを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、再構成頭皮モデル、その調製方法、および化粧用、医薬用または皮膚用の局所用生成物の効果を評価するためのその使用に関する。

【0002】

本発明による再構成頭皮は、哺乳動物に、より特定するとヒト患者、たとえば第3度熱傷の患者に移植するように意図される移植片の調製のために使用することもできる。

【背景技術】

【0003】

ヒト皮膚に多少なりとも類似した再構成皮膚モデルが近年開発されてきている。挙げることができる再構成皮膚モデルの例には、次の文献に記載されているモデルが含まれる。EP0285471、EP0285474、EP0418035、WO90/02796、WO91/16010、EP0197090、EP0020753、FR2665175、FR2689904。これらのモデルは、第1に、力学的分野および生理学的分野の両方において、皮膚の役割をより理解するために必要な研究を行うことを可能にし、第2に、化粧用および/または医薬用の活性剤の活性または局所用成分の副作用の予測試験を構成する。

【0004】

本出願人は、これらのモデルは人体の皮膚に関する研究には好適であるが、特定の皮膚、頭皮に関する研究には理想的でないことに気がついた。本出願人の知るところでは、再構成頭皮モデルはこれまでに提案されていない。

【0005】

頭皮は頭髪の下、すなわち頭蓋を覆って位置する皮膚の部分である。成人では、その面積は650〜700cm²の間の範囲とすることができる。頭皮は通常構造を有するが、人体の他の部分の皮膚とは差異のある重要な特徴がいくつかある。
- 頭皮の表皮は、その細胞の再生がより速いため、より厚く、
- 頭皮の角質層はより厚いが、整然としておらず、
- 頭皮の毛包はより多く存在するため(毛包約200〜300個/cm²)、その活動がより活発であり、
- 頭皮の皮脂腺の産生力は強く、頭皮の汗腺の活動度は高く、そこにかなりの細菌および真菌のコロニー形成が可能になる。

【0006】

一般に、上記の文献に記載されている再構成皮膚モデルは、真皮乳頭または結合組織鞘(connective sheath)の線維芽細胞、および/または外上皮の鞘(外毛根鞘を表すORSとしても知られる)から得られる細胞から、これらの細胞の生成が容易であるという理由で調製される。具体的には、これらの細胞は毛が引き抜かれると取り出され、担体、通例真皮同等物上に配置され、好適な培養培地中で培養されると表皮を生成することが可能である。しかし、真皮乳頭細胞を培養して得られる組織は巨大分子(特にコラーゲン)を発現し、これはin vivoの頭皮の組織には相応しない。ORS細胞を培養して得られる組織にも頭皮の特性はない。さらに、ORS細胞は空気と接触したことがないため、落屑しないので、in vivoで頭皮に発生する正常な落屑の現象が見られないであろう。したがって、このようにして得られたモデルは、頭垢の出現をin vitroで再現するために使用することができない。最後に、これらの種々の細胞を使用して得られる表皮および真皮のサイズおよび形態は、頭皮の表皮および真皮のものと同じではないであろう。なぜなら、頭皮の場合、真皮は皮膚の場合より厚く、陥入度が大きいためである。

【0007】

本出願人は、驚くべきことに、毛包間頭皮細胞を培養すると、in vivoの頭皮の特性の大部分を有する再構成頭皮モデルを構築することが可能になることを立証した。

【0008】

この頭皮モデルの1つの特性は、最後の基底上層、すなわち表皮顆粒層中に、インボルクリンおよびケラチンK10を発現することである(特に図1を参照)。顆粒層の細胞は、角質層の下に位置している。顆粒層(すなわちstratum granulosum)は密集した卵形の核を伴う平らになったケラチノサイトの3つの層から形成されている。インボルクリンおよびケラチンK10の遅発的な発現が、「持ち上げ(lifting)」中に採った試料から得られた頭皮の切片に観察されるが、一方、再構成皮膚の切片には、これらのマーカーの発現は、基底上層全体にわたって、すなわちマルピーギ粘膜物質(これは有棘層を構成する)の層の細胞中に観察される。これは、本発明による頭皮モデルがin vivoの頭皮の特異性を有することを示している。

【0009】

この特性によって、とりわけ、標準的な再構成皮膚モデルと比較して、本発明の方法によって得られた頭皮モデルを特徴づけることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】EP0285471

【特許文献2】EP0285474

【特許文献3】EP0418035

【特許文献4】WO90/02796

【特許文献5】WO91/16010

【特許文献6】EP0197090

【特許文献7】EP0020753

【特許文献8】FR2665175

【特許文献9】FR2689904

【特許文献10】WO00/29553

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Bellら、1979年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、76巻、No.3、1274〜1278頁

【非特許文献2】Asselineauら、1987年(Models in dermato、III巻、Lowe & Maibach編、1〜7頁)

【非特許文献3】Van der RestおよびGaronne、1990年、Biochem.、72巻、473〜484頁

【非特許文献4】1991年、Faseb Journal、5巻、2814〜2823頁

【非特許文献5】RheinwaldおよびGreen(Cell、6巻、331〜344頁、1975年)

【非特許文献6】Reynolds A.J.、Lawrence C.M.、Jahoda C.A.、Human hair follicle germinative epidermal cell culture、J. Invest. Dermatol、1993年10月、101(4):634〜8頁

【非特許文献7】Bouhannaら(Dermatol. Surg.、2003年11月、29[11]、1130〜4頁)

【非特許文献8】Roguetら、J. Tox. In vitro 6:303(1992年)

【非特許文献9】Ponec M著In Vitro Toxicology、Rougier、MaibachおよびGolberg編、107頁、1994年

【非特許文献10】JID86、598(1986年)

【非特許文献11】M. PrunierasおよびR. Roguet、Toxicologie cellulaire in vitro methodes et applications、M.Adolphe、A.GuillouzoおよびF.Marano編、INSERM発行、1995年、191〜236頁

【非特許文献12】Duffy P.A.、Flint O.P.、In vitro dermal irritancy test、掲載はC.K. AtterwillおよびC.E.Steele(編)、In vitro methods in Toxicology、Cambridge Univ. Press Cambridge、1987年、279〜297頁

【非特許文献13】Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy、Roguet、Cell Biology and Toxicology、1999年、15、63〜75頁

【非特許文献14】AsselineauおよびPrunieras、1984年(British J. of Derm.、111、219〜222頁)

【非特許文献15】Regnierら(Frontier of Matrix Biology、9巻、4〜35頁、Karger、Basle、1981年)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、本出願人は、頭皮同等物の新規な調製方法を開発した。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本出願人は毛包間頭皮細胞を単離し、これらを使用して頭皮同等物を構築する着想を得た。

【0014】

「頭皮同等物」という用語は、下記では頭皮モデルとも呼び、頭皮真皮同等物上を覆う頭皮表皮同等物のアセンブリーを意味する。これはin vitroで技術的プロセスによって生成される構造である。

【0015】

したがって、本発明は、播種するステップ、および真皮同等物上で毛包間頭皮ケラチノサイトを培養するステップを含み、前記真皮同等物がコラーゲンおよび毛包間頭皮線維芽細胞を含む、頭皮同等物の調製方法に関する。

【0016】

真皮同等物は、種々の方法、たとえば文献EP0418035、WO00/29553またはEP0285471に記載されている方法によって調製することができ、注意を払って上記の線維芽細胞を使用することができる。

【0017】

挙げることができる真皮同等物には、コラーゲン/線維芽細胞混合格子、事前に上皮を除去した真皮、人工膜、たとえばMillipore銘柄のフィルター、コラーゲン系の皮下基質、合成樹脂または細胞生存能力に適合する任意の他の担体が含まれる。優先的には、本発明による真皮同等物は、コラーゲン格子またはコラーゲンスポンジの形態である。

【0018】

「コラーゲン格子」という用語は、従来技術において周知であり(Bellら、1979年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、76巻、No.3、1274〜1278頁)、数十年間使用されてきた真皮同等物の既知のモデルを意味する。

【0019】

優先的には、本発明によれば、格子は、Asselineauら、1987年(Models in dermato、III巻、Lowe & Maibach編、1〜7頁)に記載されている方法に従って調製される。

【0020】

「コラーゲンスポンジ」という用語も当業者に公知である。これはコラーゲン系のバイオポリマー(たとえばBASF Beauty Careから販売されているMimedisk(登録商標))を意味する。

【0021】

本発明によれば、コラーゲンは、いずれの供給源のいずれの型のコラーゲンでもよい。この点では、Van der RestおよびGaronne、1990年、Biochem.、72巻、473〜484頁または1991年、Faseb Journal、5巻、2814〜2823頁のレビューに述べられている種々の型のコラーゲンが参照されるであろう。たとえば、本発明によれば、コラーゲンは好ましくは線維性コラーゲンのI型、III型またはV型から選択される。

【0022】

本発明によれば、優先的には、動物由来のコラーゲンおよびとりわけウシ由来のコラーゲンが使用される。

【0023】

本発明によって優先的に使用されるコラーゲンは、I型コラーゲンである。本発明によれば、最も優先的にはウシI型コラーゲンが使用される。

【0024】

当然ながら、本発明によれば、種々の型のコラーゲンの任意の割合での混合物および/または種々の供給源のコラーゲンの混合物を使用することができる。

【0025】

真皮同等物は、優先的には収縮したコラーゲン格子であり、ケラチノサイトの播種は優先的には格子の収縮の2〜6日後に、より優先的には3〜5日後に、さらにより優先的には3日後に実施される。コラーゲンゲルの収縮は、優先的にはコラーゲン上の毛包間頭皮線維芽細胞の作用によるものである。

【0026】

毛包間頭皮線維芽細胞および/またはケラチノサイトは、優先的には、頭皮試料から得られた真皮から、および表皮からそれぞれ単離される。1つの優先的な実施形態において、外上皮の鞘のケラチノサイトは、たとえば前記試料の脱毛によって、事前にこの試料から除去されていることになる。頭皮試料の脱毛は、たとえばピンセットを使用して、試料から外上皮の鞘のケラチノサイトを完全に除去するために行うことになる。

【0027】

毛包間頭皮ケラチノサイトは、優先的には次のステップによって得られる。
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、とりわけ頭皮試料をディスパーゼまたはテルモリシンに接触させることによって頭皮真皮を表皮から分離するステップ、
- 頭皮表皮を回収するステップ、
- このようにして得られた頭皮表皮をトリプシンに接触させるステップ、
- 毛包間頭皮ケラチノサイトを回収するステップ、および
- このようにして得られたケラチノサイトを培養するステップ。

【0028】

ケラチノサイトを、RheinwaldおよびGreen(Cell、6巻、331〜344頁、1975年)の技術に従って、当業者に公知の好適な培地中で、増殖因子、特にアミノ酸、血清、コレラ毒素、インスリン、トリヨードチロニンおよびpH緩衝溶液の存在下で、線維芽細胞からなる栄養担体上で培養することによって、播種する前に増殖させる。とりわけ、かかる培養培地は、ケラチノサイトの少なくとも1種の分裂促進増殖因子(たとえば表皮増殖因子(EGF)および/またはケラチノサイト増殖因子(KGF)、とりわけKGF)、インスリン、ヒドロコルチゾンおよび任意選択で抗生物質(たとえば、ゲンタマイシンまたはアムホテリシンB)を特に含有することができる。

【0029】

前記培地は、有利には、血清もしくは下垂体抽出物、たとえばウシ由来のもの、エピネフリン、トランスフェリンおよび/または非必須アミノ酸を含むこともできる。

【0030】

この培養に使用する線維芽細胞は、より優先的には3T3線維芽細胞となろう。3T3線維芽細胞は、当業者に周知である。これは1962年から知られている線維芽細胞の細胞株である。「3T3」とは「3日ごとの細胞3×10⁵個の継代、接種」の意味である。

【0031】

毛包間頭皮ケラチノサイトの培養は、優先的には線維芽細胞(優先的には3T3線維芽細胞)との共培養であり、線維芽細胞の増殖は、優先的にはこれらを事前に照射(たとえばUVで)することによって、またはこれらを事前にマイトマイシンで処理することによって、事前に止められている。マイトマイシン(とりわけマイトマイシンC)はこれらの細胞の増殖を阻止するが、これらがケラチノサイトの増殖に有用である栄養物質を生成するのを妨げることはない。

【0032】

別の実施形態によれば、ケラチノサイトは、フィブロネクチン(たとえば「フィブロネクチンで被覆した」培養箱)もしくはコラーゲン(たとえば「I型コラーゲンで被覆した」培養箱)で処理した、もしくはこれらを補充した培養培地で、または栄養に富む培養培地、たとえばEpilife(登録商標)培地(Gibco)で培養することによって、播種前に増殖させる。

【0033】

ディスパーゼ(中性プロテアーゼとしても知られる)はプロテアーゼファミリーに属する酵素であり、フィブロネクチンならびにI型およびIV型コラーゲンを分解する能力がある。

【0034】

毛包間頭皮線維芽細胞は、優先的には次のステップによって得られる。
- 頭皮試料のタンパク質分解処理によって、特に頭皮試料をディスパーゼまたはテルモリシンに接触させることによって、頭皮真皮を表皮から分離するステップ、
- 頭皮真皮を回収するステップ、
- このようにして得られた頭皮真皮をコラゲナーゼおよび/またはトリプシンに接触させるステップ、
- 毛包間頭皮線維芽細胞を回収するステップ、および
- このようにして得られた線維芽細胞を培養するステップ。

【0035】

上記の酵素は、当業者に公知の濃度で使用されると所望の効果を発揮させることができることは、明確に理解される。優先的には、頭皮真皮を表皮から分離するために使用することになるのはディスパーゼである。トリプシン(Gibco)を使用すると、毛包間頭皮ケラチノサイトの懸濁液を頭皮表皮から得ることが可能になるであろう。コラゲナーゼ(Boehringer)および/またはトリプシンを使用すると、毛包間頭皮線維芽細胞の懸濁液を頭皮真皮から得ることが可能になるであろう。

【0036】

毛包間頭皮ケラチノサイトまたは線維芽細胞の回収は、優先的にはトリプシンまたはコラゲナーゼの作用によって得られた懸濁液の濾過、これに次ぐ当業者に公知の条件下での遠心分離、および遠心分離による沈殿物の再懸濁によって実施される。

【0037】

より特定すると、本発明による方法には、以下が含まれる。
a-培養培地中に浸漬した担体上に置いたコラーゲン格子に毛包間頭皮ケラチノサイトを播種するステップ、
b-前記コラーゲン格子の表面で毛包間頭皮ケラチノサイトを増殖させるステップ、
c-生成中に培養培地が表皮同等物の上表面を覆わないように、前記担体を上げるステップ。

【0038】

担体は、とりわけ、グリル状の担体とすることができる。

【0039】

本発明による真皮同等物は、特に、培養培地に毛包間頭皮線維芽細胞を播種し、次いでコラーゲンを添加することによって得られる。

【0040】

本発明による方法は、次の培養ステップを含むことができる。
a)たとえば、動物またはヒトの組織片を播種した栄養培地で生成した単層培養物から回収した収縮性細胞と、
b)真皮の細胞外マトリックスの成分、特にコラーゲンを補充した栄養培地と
の前記混合物が収縮したゲルを形成し、栄養培地を除去して真皮同等物および特に収縮したコラーゲン格子を形成するステップ。

【0041】

健常なヒトドナーから得られ、制御したトリプシン処理によって、またはコラゲナーゼを使用することによって単層培養物から回収された毛包間頭皮線維芽細胞が、収縮性細胞として使用されることになる。

【0042】

本発明による調製方法の実施は、真皮同等物-または真皮の基質-に毛包間頭皮ケラチノサイトを播種することにある。

【0043】

前記基質の表面でケラチノサイトの増殖を可能にする条件を維持し、この毛包間頭皮ケラチノサイトの培養の進展を、少なくとも1つの最少栄養培地、好ましくは実施例1に記載する3F培地を前記ケラチノサイトに接触させて使用することによって促進する。

【0044】

有利には、基質にケラチノサイトを播種した後、植え込まれた基質を、好ましくは5〜7日の間、ケラチノサイトを覆うこの栄養培地中に浸漬することによって保持する。

【0045】

次に、真皮同等物を空気に接触させる。これを行うために、真皮同等物を、容器の基底に対して上げられたグリル状の担体に載せ、栄養培地の高さを調整し、生成中にグリル状の担体がちょうど覆われるが、栄養培地が皮膚同等物の上表面を覆わないようにする。

【0046】

本発明の方法によれば、毛包間頭皮ケラチノサイトを播種した収縮した真皮同等物は、このように、優先的には培養培地中に浸漬して5〜7日間、次いで好適な担体上で培地の上に出して5〜7日間培養される。

【0047】

このように構成された本発明による頭皮同等物は、十分に分化し、十分に組織化されている。これは全体的に均質でもある。

【0048】

本発明による方法の1つの変形形態によれば、収縮したまたは収縮途中の前記真皮の頭皮同等物の中に(特にコラーゲン格子の中に)、真皮乳頭の線維芽細胞および/もしくは結合組織鞘の線維芽細胞、ならびに/または真皮乳頭全体および/もしくは結合組織鞘および/もしくは結合組織鞘の部分から選択される毛の線維芽細胞(hair fibroblast)を移植することによって、毛を含む頭皮同等物を得ることが可能である。これは、たとえば注射器を使用して実施することができる。これらの毛の線維芽細胞、真皮乳頭全体、結合組織鞘および/または結合組織鞘の部分は、毛包間線維芽細胞がコラーゲン上でその作用を開始してから添加されることになる。したがって、これらは毛包間頭皮線維芽細胞と同時に添加するのではない。毛の線維芽細胞は、優先的には細胞1000〜10000個の量で、すなわち毛包間頭皮線維芽細胞100個につき、毛の線維芽細胞約1〜10個の割合で添加されることになる。

【0049】

毛の線維芽細胞、たとえば乳頭線維芽細胞もしくは結合組織鞘の線維芽細胞または乳頭全体もしくは結合組織鞘もしくは結合組織鞘の部分を真皮同等物の中に移植することによって、ケラチノサイトは体毛または頭髪(毛の柄[hair stalk])の形態形成を再生することになる(Reynolds A.J.、Lawrence C.M.、Jahoda C.A.、Human hair follicle germinative epidermal cell culture、J. Invest. Dermatol、1993年10月、101[4]:634〜8頁)。

【0050】

本発明の別の主題は、本発明による方法によって得ることができる頭皮同等物である。

【0051】

この頭皮同等物は、その顆粒層中にインボルクリンおよび/またはケラチンK10を発現し、これはin vivoの頭皮における発現に匹敵する発現である。「匹敵する発現」という用語は、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現を意味し、これはin vivoの組織中と同じ場所に位置する細胞の中で、かつ/または同じ強度で生じる。

【0052】

頭皮同等物がin vivoの頭皮の特性を有することを考慮すると、処置対象の個体の項部または後頭部から得られた移植片と同じ方法で、かつ同じ成功率で移植することができる。自家移植技術は、たとえばBouhannaら(Dermatol. Surg.、2003年11月、29[11]、1130〜4頁)に記載されている。したがって、本発明による頭皮同等物は、移植後に、元の頭皮部分に適切に置換する能力を有する。

【0053】

頭皮同等物は、頭皮皮膚障害、たとえば熱傷、瘢痕形成異常または白毛症を処置するように意図され、したがって哺乳動物に、より特定するとヒト患者、たとえば第3度熱傷の患者に移植するように意図される移植片の調製にも用途があるであろう。移植片とは移植用に意図された組織の一部と定義される。

【0054】

したがって、本発明の別の主題は、処置に使用するための、または上記の頭皮皮膚障害のうち1つの処置において使用するための、上記に定義した頭皮同等物に関する。この頭皮同等物または移植片は、インボルクリンおよびケラチンK10の発現に関して、in vivoの頭皮の特性に匹敵する特性(すなわち表皮の最後の顆粒層におけるインボルクリンおよびケラチンK10の発現)を有するであろう。したがって、本発明は、これらの頭皮皮膚障害の1つを処置するための移植片を製造するための、上記で定義した頭皮同等物の使用にも関する。

【0055】

その調製に採用される方法の変形形態に関係なく、得られる頭皮同等物は、動物実験を必要とすることになる任意の試験の代替試験として、たとえば活性剤の放出、その皮膚浸透性および/もしくはその吸収性ならびに/またはそのバイオアベイラビリティに関する研究、あるいは、活性剤および/または化粧用、医薬用もしくは皮膚用の成分の、耐容性、適合性または有効性に関する研究に有用な3次元モデルである。

【0056】

したがって、本発明の別の主題は、頭皮での化合物の皮膚浸透性および/もしくは吸収性ならびに/またはバイオアベイラビリティならびに/または有効性を試験するため、ならびに/または頭皮に対する化合物の耐容性および/もしくは適合性を試験するための、上記の頭皮同等物の使用である。

【0057】

したがって、この使用によって、化合物が頭皮の種々の層の中に浸透するかどうか、または化合物に所望の効果が本当にあるかどうかを知ることが可能になる。

【0058】

この頭皮同等物は、発毛のモジュレーターである化合物、ならびに/または頭皮の質および恒常性、特に頭皮の落屑、頭垢もしくは敏感頭皮の処置に作用する分子の特定に特に有用である。

【0059】

さらに、この頭皮同等物は、頭皮の正常状態または病的状態に関連するバイオマーカーの探索を可能にする。追加の利点は、in vivoの頭皮にさらにより近づけるために、毛包、汗腺または皮脂腺の実現を研究する可能性にある。

【0060】

このモデルは、幹細胞の注入によって毛の形成を誘導するために必要である。

【0061】

本発明による再構成頭皮モデルは、幹細胞から(たとえば毛球細胞(bulb cell)から)毛の形成を誘導する能力のある分子の活性を定量化することを可能にすることができる。

【0062】

毛包を含む頭皮同等物は、特に、体毛または頭髪の発毛動態を実現することを可能にし、したがって、in vivoの状況で可能な限り完璧な多数の生きている毛を必要とする任意の研究、たとえば毛のサイクルおよびこのサイクルに影響を及ぼすことが可能な要因についての研究、発毛を促進する活性剤、脱毛を抑制する活性剤または発毛を緩慢にする活性剤の研究まで可能にするであろう。

【0063】

新規な活性剤を特定するための生成物スクリーニング方法には、前記試験生成物を本発明による頭皮同等物に接触させるステップ(a)と、次いで頭皮同等物の少なくとも1つのパラメーターについて前記生成物の効果を分析するステップ(b)と、前記パラメーターを変更する生成物を選択するステップ(c)とが含まれる。

【0064】

好ましくは、ステップ(a)を実施するために、試験生成物を局所的に適用する。たとえば試験生成物を標準的な局所用製剤に配合するか、または培養培地中に導入する。

【0065】

頭皮同等物のパラメーターは、優先的には、事前に選択されたマーカーの、頭皮同等物および/または頭皮同等物の落屑の中での発現、生成および/または活性から選択される。

【0066】

ステップ(b)は、とりわけ、頭皮の質および/または恒常性に関連するマーカーの、発現、生成および/または活性の分析によって実施することができる。マーカーの例には、表皮のマーカーおよび/または真皮のマーカー、たとえば構造タンパク質、特に表皮分化タンパク質および真皮のマトリックスの巨大分子タンパク質がある。挙げることができる構造タンパク質の例は、ヘアケラチンである。

【0067】

頭皮の質および/または恒常性に関連するこれらのマーカーは、頭皮の落屑、頭垢の状態または敏感頭皮を表すものとなりうる。

【0068】

本発明による頭皮モデルが、真皮同等物の中に上記のとおり移植されている毛の線維芽細胞、たとえば乳頭線維芽細胞もしくは結合組織鞘の線維芽細胞または乳頭全体もしくは結合組織鞘もしくは結合組織鞘の部分を含む場合、スクリーニング試験は、毛の柄の成長を誘導することが可能な生成物を特定することを意図することもできる。

【0069】

これを行うために、スクリーニング方法のステップ(b)は、毛の柄の成長に対する効果を分析することになる。

【0070】

本発明による頭皮モデルが、免疫系の細胞、たとえばランゲルハンス細胞を含む場合、スクリーニング試験は、刺激反応またはアレルギー反応を誘導することが可能な生成物を特定することを意図することもできる。

【0071】

これを行うために、スクリーニング方法のステップ(b)は、優先的には以下から選択されるパラメーターのうち少なくとも1つについて生成物の効果を分析することになる。
- 細胞毒性、
- 炎症メディエーターの放出、
- 組織構造によって、または乳酸デヒドロゲナーゼの放出(ケラチノサイト膜統合のマーカー)によって明らかにされる細胞傷害(Roguetら、J. Tox. In vitro 6:303[1992年]およびPonec M著In Vitro Toxicology、Rougier、MaibachおよびGolberg編、107頁、1994年)、
- 皮膚脂質、特にセラミドおよびリン脂質の合成および組成の変更(JID86、598[1986年])、
- 上皮細胞の分化のマーカーとしての層形成(M. PrunierasおよびR. Roguet、Toxicologie cellulaire in vitro methodes et applications、M.Adolphe、A.GuillouzoおよびF.Marano編、INSERM発行、1995年、191〜236頁)(Duffy P.A.、Flint O.P.、In vitro dermal irritancy test、掲載はC.K. AtterwillおよびC.E.Steele[編]、In vitro methods in Toxicology、Cambridge Univ. Press Cambridge、1987年、279〜297頁)(Use of skin cell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy、Roguet、Cell Biology and Toxicology、1999年、15、63〜75頁)。

【0072】

生成物の効果を分析するステップ(b)は、優先的には、試験生成物と接触させた頭皮同等物について測定した少なくとも1つのパラメーターと、同一の条件下で培養したが試験生成物を付与していない対照頭皮同等物について測定した同じパラメーターとを比較することになる。

【0073】

頭皮同等物のパラメーターを変更する生成物を選択するステップ(c)は、事前に規定した基準に応じて実施することになる。

【0074】

このパラメーターの変更とは、前記マーカーの発現、生成および/もしくは活性、ならびに/または毛の柄の成長、ならびに/または頭皮同等物の落屑の、刺激、低減または全部もしくは部分的な抑制とすることができる。

【0075】

前記生成物を選択する基準は、たとえば、この生成物が、測定されたパラメーターについて刺激効果または抑制効果を有するというようなものとなろう。

【0076】

本発明による頭皮同等物は、新規な活性剤を特定するための、化粧用、医薬用または皮膚用の化合物の自動化スクリーニング方法に使用することもできる。

【0077】

図1は、本発明をより明確に示すものであるが、その範囲を限定するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】この図において、写真は、抗インボルクリン抗体(I)および抗K10抗体(II)を使用して免疫標識した後の、再構成皮膚(皮膚同等物)の切片(A)、本発明による頭皮同等物の切片(B)および頭皮試料の切片(C)を示す。

【発明を実施するための形態】

【0079】

以下に記載する実施例は、本発明の非限定的な例示として提示するものである。

【0080】

(実施例１)
- 頭皮モデルの調製
毛包間頭皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞を、顔の除皺術中に採取した(したがって比較的熟年の女性から得られる)頭皮試料から、または比較的若い男性から得られる頭皮試料から単離する。

【0081】

これらの頭皮細胞を単離するために、脱毛を実施して外上皮の鞘のケラチノサイトを除去し、次いで、真皮を表皮から分離して、2つの標的細胞集団、すなわち毛包間線維芽細胞およびケラチノサイトを抽出する。

【0082】

実験プロトコール
他に指示がない限り、実施例において使用するすべての培地および緩衝液は、Bellら、1979年(P.N.A.S. USA、76、1274〜1278頁)、AsselineauおよびPrunieras、1984年(British J. of Derm.、111、219〜222頁)またはAsselineauら、1987年(Models in dermato.、III巻、LoweおよびMaibach編、1〜7頁)に記載されているものである。

【0083】

培地MEM+10%FCS+3F(3F培地として知られる)は次の組成を有する。

【0084】

【表1】

【0085】

- 30〜40mlのディスパーゼ(Roche)を含有する直径100mmの培養皿に「頂」部の断片を入れ、終夜(約15時間)4℃で保管するか、またはドライインキュベーター中で1時間30分、37℃で保管し、注意を払って小片に切り分ける。

【0086】

1.正常なヒトケラチノサイトの初代培養物の調製
- ディスパーゼ槽から試料を取り出し、これを、10mlのトリプシン-EDTA(0.05%〜0.02%)を含有する培養皿(直径100mm)に入れる。
- カーブしたピンセットを使用して真皮を表皮から分離し、ピンセットの背部で真皮の表面を丁寧にこすり落として、基底層のケラチノサイトを回収する。
- 皿から、表皮を、10mlのトリプシン-EDTAとともにコニカルチューブ(50ml)に入れる。
- 5mlのトリプシン-EDTAで皿をすすぐ。
- 滅菌ガーゼで濾過する。
- 20mlの純粋なウシ胎仔血清(FCS)で中和する。
- 懸濁液を50mlコニカルチューブに入れる。
- 細胞懸濁液を10分間1200rpmで遠心分離する。
- 上澄みを除去し、MEM10%FCS+7F(この培地は、3F培地と同一の化合物および4種の追加の化合物、すなわちアデニン、トランスフェリン、T3、インスリンを含む)に沈殿物を採る。
- 生存細胞を計数する。
- 培養皿に生細胞10000個/cm²を播種する。
- 24時間後、培地を変更せず、マイトマイシンC(Ametycine(登録商標))で処理した3T3(細胞12000個/cm²)を添加することによって標準的な共培養を実施する。

【0087】

2.真皮細胞を単離するプロトコール
a)0.1%グルコース、0.8%NaClおよび0.04%KClを含む溶液を調製する。
- コラゲナーゼを0.1%まで添加する(Worthington)。
- 溶液をMilliporeまたはNalgene0.22μmフィルターで濾過する。

【0088】

b)辺長が約2mmの小片の形態の真皮、20mlのコラゲナーゼ溶液および滅菌バーを50mlビーカーに入れる。
- 37℃、5%CO₂下で1時間30分攪拌する。
- 得られた懸濁液を、厚みを倍にした滅菌ガーゼで濾過する。
- 濾過した懸濁液を、細胞遠心分離の通例の条件下で遠心分離する。

【0089】

c)沈殿物を新鮮培養培地中に再懸濁し、細胞を計数し、皿に播種する。

【0090】

3.格子の調製
実施すべき実験が25を超える格子を含む場合、上記のすべての体積を2倍にしなければならない。

【0091】

MEM 1.76X
17.6mlのMEM 10X
5.1mlのNaHCO₃ 7.5%
0.88mlのL-グルタミン(1.76mM)
0.88mlのピルビン酸ナトリウム(0.88mM)
0.88mlの非必須アミノ酸0.88X(照会番号:K0293-供給業者:Biochrom KG)
0.088mlのペニシリンストレプトマイシン8.8U/8.8μg/ml(0.088%)(照会番号.:A2212-供給業者:Biochrom KG)
0.044mlの抗真菌抗生物質0.04X(0.04%)
75mlの滅菌超純水

【0092】

MEM HEPES 10% FCS
50mlのMEM 25mM HEPES
0.5mlのL-グルタミン(2mM)
0.5mlのピルビン酸ナトリウム(1mM)
0.5mlの非必須アミノ酸1X
0.1mlのペニシリンストレプトマイシン20U/20μg/ml(0.2%)
0.05mlの抗真菌抗生物質0.1X(0.1%)
5mlのFCS10%。

【0093】

NaOH 0.1N
10ml NaOH 1N
90mlの滅菌超純水

【0094】

この溶液を、GV Durapore0.22μm膜を伴うMilliporeフィルターに通過させる。

【0095】

酢酸1/1000
0.5mlの100%氷酢酸
499.5mlの滅菌超純水

【0096】

このように調製された培地の使用
- 滅菌コニカルフラスコ中に次の溶液5mlを調製する。
3.22mlのMEM 1.76X
0.63mlのFCS
0.35mlのNaOH 0.1N
0.6mlの酢酸1/1000
0.2mlのMEM HEPES 10% FCS。
- 0.5mlの毛包間頭皮線維芽細胞の細胞懸濁液をこの溶液に添加する。
- 次に、必要な体積の冷たいコラーゲン(このコラーゲンがGattefosseまたはSymateseのコラーゲンの場合2.1ml、またはColeticaのコラーゲンの場合1.5ml)をゆっくりと添加する。
- コニカルフラスコを、均質化する(フクシャピンクの溶液がサーモン色に変わる)まで激しく振盪する。
- コニカルフラスコの内容物を60mmのFalconφ

【0097】

細菌皿の中に空ける。
- 皿を乾燥器(37℃-5%CO₂)に入れ、約1時間30分〜2時間置く。
- ゲルが凝固すれば、培地を除去し、収縮の開始を確認する。
- 午後に、格子を規則的に振盪し、再度くっつき合わないようにする。
- 収縮が進展するように3日間放置する。

【0098】

4.培養-ケラチノサイトの播種
ケラチノサイトの播種を格子の収縮の3日後に実施する。

【0099】

a)接着剤の調製
- 2つの格子を接着するために付与される、次の溶液0.7mlを調製する。
0.46mlのMEM 1.76X
0.09mlのFCS
0.05mlのNaOH 0.1N
0.1mlのMEM HEPES 10% FCS。
- このチューブに0.3mlの透析コラーゲンを添加する。したがって最終体積は1mlになる。

【0100】

注解:
- 上記の体積を、2つの格子を接着するために付与する。
- いくつかの格子については、接着されるべきn+1の試料に対応する全体的な溶液をコニカルフラスコ中に調製する。
- マルチピペットを使用して、この溶液0.7mlをチューブごとに分注する。
- 次に、チューブ1つにつき0.3mlのコラーゲンを添加する。
- 格子を2つずつ処理する。

【0101】

b)格子の接着
- 接着剤溶液を充填した6mlチューブを取る。
- ボルテックスミキサーで攪拌する。
- ピペットで溶液を取り出し、溶液約0.45mlの液滴を、Corningの培養皿2つの各々の中央に載せる。
- カーブしたピンセットおよび細胞リフターを使用して、格子を取り上げる。
- 格子を元の皿の蓋の中に入れて、過剰な培地を除去する。
- 格子を取り上げ、これを接着剤の液滴に載せる。
- 接着剤が格子の周囲に配分されるように、皿を回転させて均一に広げる。
- 皿を乾燥器(37℃-5%CO₂)に入れ、20〜30分間置いて接着剤を凝固させる。

【0102】

c)ケラチノサイトの播種
- 細胞が凍結している場合、37℃の水浴中でバイアルを攪拌することによって、可能な限り速やかにこの細胞を解凍する。
- バイアルの内容物を、35mlのMEM 10% FCS+3F培地を含有する50mlのFalconの培養チューブ中に移す。
- 5分間1000rpmで遠心分離する。
- 上澄みを除去する。
- 遠心分離による沈殿物をMEM 10% FCS+3F培地に採って、細胞100000個/mlを含有する溶液を得る。
- 数回吸引-吐出することによって細胞を再懸濁する。
- 直径14mmの播種リングを、接着した格子に載せる。
- このリングの中に、0.5mlの細胞懸濁液(=細胞50000個/リング1.5cm²、すなわちcm²当たり約33000細胞)を入れる。
- リングの周囲に、5〜7mlのMEM 10% FCS+3F培地を、格子を分離しないように静かに添加する。
- 同時に、2つの「対照リング」(リングを入れてあるが格子を含有しない皿)に播種する。
- 皿を37℃-5%CO₂の乾燥器に入れ、2時間置く。
- リングを、取り付けの2時間後に、カーブしたピンセットを使用して取り外す。
- 皿を37℃-5%CO₂の乾燥器に戻す。
- 培地を水曜日および金曜日に交換する(1つの皿につき5〜7mlのMEM 10%FCS+3F培地)。

【0103】

- 培養-再構成皮膚を培地の上に出す。
7日間浸漬して培養した後、皮膚を培地の上に出して置く。

【0104】

しかし、ケラチノサイトが格子より上にあることを顕微鏡で観察して確認する。
- 培地の上に出すためのグリルをFalconの細菌皿に入れる。
- 泡の形成を避けるように注意しながら7.5mlのMEM 10% FCS+3Fを添加する。
- 滅菌メスを使用して、培地の上に出すべき皮膚の周囲の接着剤を切除する。
- カーブしたピンセットおよび細胞リフターで、皮膚をグリルの上に移す。
- 皿を37℃-5%CO₂の乾燥器に入れる。
- 培地を水曜日および金曜日に交換する(7〜7.5mlのMEM 10%FCS+3F培地)。

【0105】

培地の上に出して7日後に、再構成頭皮は使用できる状態になっている。

【0106】

(実施例２)
インボルクリンおよびケラチンK10の発現の比較
実施例1で得られた頭皮同等物におけるインボルクリンおよびケラチンK10の発現は、インボルクリンまたはK10に対するマウスモノクローナル抗体を使用して免疫標識した後に観察される。この発現は、標準的な皮膚同等物および頭皮試料においても観察される。

【0107】

標準的な皮膚同等物および頭皮試料の調製
標準的な真皮同等物を調製するために、3.22mlのMEM 1.76X培地、0.63mlのウシ胎仔血清、0.35mlの0.1N水酸化ナトリウムおよび10%ウシ胎仔血清を含有する0.20mlのMEM/HEPES培地の混合物(MEM/HEPES/FCS10)を、Falconの滅菌チューブに入れる。

【0108】

次いで、Bellら、1979年(P.N.A.S. USA、76、1274〜1278頁)、AsselineauおよびPrunieras、1984年(British J. of Derm.、111、219〜222頁)またはAsselineauら、1987年(Models in dermato.、III巻、Lowe & Maibach編、1〜7頁)に記載されている方法に従って事前に調製した、ヒト乳房の手術から得られた線維芽細胞を含有する0.50mlのMEM/HEPES/FCS10培地を、培養培地0.5mlにつき1×10⁶細胞の濃度まで添加する。

【0109】

次いで、1/1000の酢酸中濃度3mg/mlのコラーゲンの2ml体積/体積混合物を、チューブの壁づたいにゆっくりと添加して、白っぽい濁りの出現が観察されるようにする。次いで、全体を注意深く混合し、直径60mmのペトリ皿(Falconの60mm型、照会番号1016)に入れる。次いで、ペトリ皿を37℃の乾燥器に入れ、約2時間30分置く。2相(ゲル+培地)の出現が観察されたら、格子をその担体から慎重に取り外し、その担体から取り外された格子を4日間乾燥器の中に置く。

【0110】

標準的な皮膚同等物を調製するために、標準的な真皮同等物を、Corning型の直径60mmの培養皿の中で、コラーゲン「接着剤」(0.6ml)の液滴の上に広げ、次いで37℃で乾燥器の中に20〜30分間保持する。

【0111】

滅菌の鋼鉄製リングを格子に載せ、Regnierら(Frontier of Matrix Biology、9巻、4〜35頁、Karger、Basle、1981年)に従って調製した、乳房の手術から得られたヒトケラチノサイトの細胞懸濁液0.5mlを、MEM 10% FCS+3F培地中細胞100000個/mlの比率で、リングの内側に入れる。

【0112】

約6mlの培地(MEM 10% FCS+3F)をリングの周囲に加え、皿を37℃の乾燥器に入れて2時間置く。次いで、リングを取り外し、皿を乾燥器に戻す。

【0113】

次に、8日後、培養物を空気/液体界面に置くが、そのとき前記液体はそれまでと同一の培地からなるものとする。

【0114】

次いで、培養を1週間継続すると、組織学的に条件を満たす表皮同等物、すなわち4つの標準的な細胞層、つまり基底層、基底上層、顆粒層および角質層を有する表皮同等物が得られる。

【0115】

頭皮試料を、当業者に公知の方法によって持ち上げた後に回収する。

【0116】

インボルクリンおよびケラチンK10の発現の測定
凍結した後、種々の組織を、クライオスタットを使用して厚さ5μmの切片に切り分ける。

【0117】

次いで、切片をPBSで2回すすぎ、1/50に希釈した25μlの、抗インボルクリン抗体(Sigma-照会番号:I9018)および抗K10抗体(Immuquest Ltd-照会番号AE20)を、各切片に載せ、30分間室温(25℃)で置く。次いで、切片をPBSで2回すすぎ、25μlの、FITCをコンジュゲートした抗体(ウサギ抗マウスFITC、Dako F232)を各切片に載せ、30分室温(25℃)で置く。各切片をPBSで2回すすぎ、Leica銘柄の蛍光顕微鏡、Leitz DMRBモデルの下に固定して観察する。

【0118】

観察の結果、対照(再構成皮膚)においては、インボルクリン(図1、I)およびケラチンK10(図1、II)が、再構成表皮のすべての基底上層に発現している(図1、A)が、一方これらは、頭皮同等物(図1、B)および頭皮試料(図1、C)の表皮では、遅発的に、すなわち顆粒層の中のみに発現していることが示されている。

【0119】

これらの2つのマーカーは、再構成皮膚(A)には早期に発現し、再構成頭皮モデル(B)および頭皮試料(C)には、図1の矢印で示された場所に遅発的に発現している。

【0120】

したがって、これらの結果により、本発明による再構成頭皮モデルがin vivoの頭皮の構造および機能に類似していると確証することが可能になる。

【図1】