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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6144679
(24)【登録日】2017年5月19日
(45)【発行日】2017年6月7日
(54)【発明の名称】生細胞干渉法を介した急速超並列単細胞薬物反応測定法
(51)【国際特許分類】
G01N 21/45 20060101AFI20170529BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20170529BHJP
【ＦＩ】
G01N21/45 A
G01N33/483 C
【請求項の数】19
【全頁数】38
(21)【出願番号】特願2014-524086(P2014-524086)
(86)(22)【出願日】2012年8月2日
(65)【公表番号】特表2014-527168(P2014-527168A)
(43)【公表日】2014年10月9日
(86)【国際出願番号】US2012049388
(87)【国際公開番号】WO2013019984
(87)【国際公開日】20130207
【審査請求日】2015年7月28日
(31)【優先権主張番号】61/514,353
(32)【優先日】2011年8月2日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100114889
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 義弘
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】リード ジェイソン シー．
(72)【発明者】
【氏名】テイテル マイケル エー．
【審査官】
横尾 雅一
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許出願公開第２００７／０２７９６３８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特表２０１１−５０９２４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１０−５０５１２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２０１０／０２８４０１６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特開２００９−２７６３２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２００９／０２３８８１７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００９／０８６５１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
欧州特許出願公開第０２２２４９４６（ＥＰ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２００９／０１６３５６４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００８／０６０３６９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
欧州特許出願公開第０１９７１６９０（ＥＰ，Ａ２）
【文献】
Reed J , et.al.，High throughput cell nanomechanics with mechanical imaging interferometry，Nanotechnology，２００８年 ６月１１日，Vol.19, No.23，235101 p1-16
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ２１／００−２１／６１
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
Ｇ０２Ｂ １９／００−２１／００
Ｇ０２Ｂ ２１／０６−２１／３６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
環境に対する細胞応答を観察するための方法であって、
（ａ）第１の環境内に少なくとも１つの細胞を提供する段階と、
（ｂ）生細胞干渉法を行い、細胞の質量に比例する測定値を第１の環境において決定する段階であって、該生細胞干渉法が、該細胞を通って伝播する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定すること、および該位相偏移を該細胞の面積にわたって積分して該測定値を提供することを含む、段階と、
（ｃ）生細胞干渉法を行い、細胞の質量に比例する測定値を第２の環境において決定する段階であって、該生細胞干渉法が、該細胞を通って伝播する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定すること、および該位相偏移を該細胞の面積にわたって積分して該測定値を提供することを含む、段階と、
（ｄ）（ｂ）で決定された測定値を、（ｃ）で決定された測定値と比較する段階であって、（ｂ）で決定された測定値と（ｃ）で決定された測定値との差が第１の環境に対する細胞応答を示す、段階と、
を含み、
処置の2時間以内または4時間までに環境に対する該細胞応答を検出するのに十分な感度を提供する、方法。
（ａ）第１の環境内に少なくとも１つの細胞を提供する段階と、
（ｂ）生細胞干渉法を行い、細胞の質量に比例する測定値を第１の環境において決定する段階であって、該生細胞干渉法が、該細胞を通って伝播する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定すること、および該位相偏移を該細胞の面積にわたって積分して該測定値を提供することを含む、段階と、
（ｃ）生細胞干渉法を行い、細胞の質量に比例する測定値を第２の環境において決定する段階であって、該生細胞干渉法が、該細胞を通って伝播する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定すること、および該位相偏移を該細胞の面積にわたって積分して該測定値を提供することを含む、段階と、
（ｄ）（ｂ）で決定された測定値を、（ｃ）で決定された測定値と比較する段階であって、（ｂ）で決定された測定値と（ｃ）で決定された測定値との差が第１の環境に対する細胞応答を示す、段階と、
を含み、
処置の2時間以内または4時間までに環境に対する該細胞応答を検出するのに十分な感度を提供する、方法。
【請求項2】
（ｂ）で行われる生細胞干渉法が、単離された単細胞に対して行われる、請求項１記載の方法。
【請求項3】
（ｂ）で行われる生細胞干渉法が、細胞集合または集塊に対して行われる、請求項１記載の方法。
【請求項4】
第１の環境内に存在する複数の細胞について細胞の質量に比例する測定値が決定される、請求項１または３記載の方法。
【請求項5】
第１の環境が試験組成物を含み、第２の環境は該試験組成物を含まない、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項6】
前記試験組成物が、抗生物質、抗体、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞周期阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ、または細胞を含む、請求項５記載の方法。
【請求項7】
前記試験組成物が、ＨＥＲ２に結合する抗体を含む、請求項６記載の方法。
【請求項8】
第１の環境内の細胞の質量に比例する測定値が、ある期間にわたって該細胞の質量がどのように変化するかを観察するように、複数回観察される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項9】
細胞の質量の変化が、時間的質量プロファイルを観察するように経時的に観察される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
観察された時間的質量プロファイルを時間的質量プロファイルのデータベースと比較する段階をさらに含み、該時間的質量プロファイルのデータベースは、前記試験組成物に対する細胞感受性の特性を示す時間的質量プロファイル、および前記試験組成物に対する細胞抵抗性の特性を示す時間的質量プロファイルを含むように選択される、請求項９記載の方法。
【請求項11】
（ｂ）および（ｃ）における生細胞干渉法を行う段階が、
試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定するように適合されている干渉顕微鏡の観察チャンバの中に細胞を提供することと、
照明波長における試験光線に細胞を暴露させることと、
細胞を通って伝搬する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定することと、
測定された分数位相偏移を使用して前記細胞の質量に比例する測定値を決定することと、
を含む、請求項１記載の方法。
試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定するように適合されている干渉顕微鏡の観察チャンバの中に細胞を提供することと、
照明波長における試験光線に細胞を暴露させることと、
細胞を通って伝搬する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定することと、
測定された分数位相偏移を使用して前記細胞の質量に比例する測定値を決定することと、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項12】
細胞の質量に比例する測定値が、以下の方程式
を使用して決定され、式中、ｍは、細胞の質量であり、αは、前記位相偏移と細胞質量との間の関係を表す定数であり、φは、前記測定された分数位相偏移であり、λは、照明波長であり、積分が全細胞面積Ａにわたって行われる、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【数1】
【請求項13】
α＝１．８×１０−３ｍ３ｋｇ−１である、請求項１２記載の方法。
【請求項14】
顕微鏡に動作可能に連結されている検出器と、
細胞を含有するように適合されている観察チャンバを備える、サンプルアセンブリと、
参照細胞を含有するように適合される参照チャンバを備える、参照アセンブリと、
光源からの光線を試験ビームおよび参照ビームに分割するためのビームスプリッタと、
を備える、生細胞干渉法システムを使用して行われる、請求項１１記載の方法。
細胞を含有するように適合されている観察チャンバを備える、サンプルアセンブリと、
参照細胞を含有するように適合される参照チャンバを備える、参照アセンブリと、
光源からの光線を試験ビームおよび参照ビームに分割するためのビームスプリッタと、
を備える、生細胞干渉法システムを使用して行われる、請求項１１記載の方法。
【請求項15】
観察チャンバが、該チャンバ内で細胞培地を循環させるように適合されている少なくとも１本の灌流導管を備える、請求項１４記載の方法。
【請求項16】
生細胞干渉法システムが、細胞の１つまたは複数の画像を処理して記憶するように適合されているプロセッサ要素とメモリ記憶要素とを備える、請求項１４記載の方法。
【請求項17】
細胞の質量に比例する測定値が、治療組成物に対する細胞応答を定量化するように決定される、請求項１１記載の方法。
【請求項18】
前記細胞が、癌に罹患している個人から得られ、前記治療組成物が、癌を治療するために使用される、請求項１７記載の方法。
【請求項19】
質量蓄積動力学が、同時に測定された細胞集団について、数時間にわたって細胞ごとに決定される、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
政府支援の声明本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された政府支援助成金第ＣＡ０９０５７１号、第ＣＡ１０７３００号、第ＧＭ０７４５０９号を用いて行われた。政府が本発明で特定の権利を有する。
【0002】
関連出願の相互参照本願は、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれる、「ＲＡＰＩＤ， ＭＡＳＳＩＶＥＬＹ ＰＡＲＡＬＬＥＬ ＳＩＮＧＬＥ−ＣＥＬＬ ＤＲＵＧ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴＳ ＶＩＡ ＬＩＶＥ ＣＥＬＬ ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＭＥＴＲＹ」と題された、２０１１年８月２日出願の同時係属米国仮特許出願第６１／５１４，３５３号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で主張するものである。本願は、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれる、２００９年５月６日に出願された米国特許出願第１２／４３６，７０２号に関係する。
【0003】
本発明は、１つ以上の細胞を検査するために使用することができる、干渉計システム、材料、および技法に関する。
【背景技術】
【0004】
干渉顕微鏡法は、細胞および他の透明な物体の内側の物質の空間分布を測定することへの興味深い生物物理学的アプローチを提供する。生細胞干渉法（ＬＣＩ）という、この技法の適合は、同時に何百もの細胞のナノ機械的特性を敏感に検出して追跡できることが、以前に示されている（１）。ＬＣＩはまた、細胞の表面上に高度磁気プローブによって小さな圧痕が作製される際に、単細胞の内側の細胞質の動的な流れを監視するために使用することもできる（２）。研究は、細胞物質のほとんど瞬間的な再分布が、従来の光学顕微鏡法の検出限界を超えた、細胞表面の圧痕に起因したことを示した。
【0005】
どのようにして個々の細胞がそれらのサイズを調節するかは、十分には理解されておらず、細胞質量と十分に特徴付けられた生化学的経路との間の関係も同様である。単生細胞の定量的質量測定は１９５０年代に始まった（３、４）が、ごく最近になって、細胞質量測定の速度、精度、および実用性を増加させるためのより新しいアプローチが利用可能になってきた。単独状態または大きな細胞集団内に群がった状態のいずれかにおいて、１つ以上の細胞の質量を急速かつ同時に測定する新しい方法の必要性がある（７、８）。本明細書で開示される本発明の実施形態は、この必要性ならびに他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【0006】
本発明の実施形態は、例えば、１つ以上の細胞の１つ以上の特性または性質を判定するために使用することができる、干渉法システム、方法、および材料を含む。そのような性質は、例えば、細胞質量、細胞体積、光学的細胞厚（細胞密度）等を含む。本発明の実施形態は、干渉計を用いて細胞の１つ以上の特性または性質を観察し、次いで、細胞の生理機能を特徴付けるためにこれらの観察を使用することを伴う。
【0007】
本発明の例証的実施形態は、生細胞干渉法を使用して細胞の質量を観察するための方法である。典型的には、そのような干渉方法は、試験光線と参照光線との間の分数位相偏移（fractional phase shift）を測定するように適合される干渉顕微鏡の観察チャンバの中に細胞を配置するステップと、照明波長における試験光線に細胞を暴露させるステップと、次いで、細胞を通って伝搬する試験光線と参照／対照光線との間の分数位相偏移を測定するステップとを含む。次いで、そのような測定は、細胞の質量を導出するために使用することができる。
【0008】
本発明の共通実施形態では、細胞の質量は、以下の方程式【数1】
【0009】
本発明の典型的な実施形態では、本方法は、顕微鏡に動作可能に連結される検出器と、細胞を含有するように適合される観察チャンバを備えるサンプルアセンブリと、参照細胞を含有するように適合される参照チャンバを備える参照アセンブリと、光源からの光線を試験ビームおよび参照ビームに分割するためのビームスプリッタとを備える、生細胞干渉法システムを使用して行われる。本発明のある実施形態では、観察チャンバは、チャンバ内で細胞培地を循環させるように適合される、少なくとも１本の灌流導管を備える。本発明のいくつかの実施形態では、生細胞干渉法システムは、細胞（複数可）の１つ以上の画像を処理して記憶するように適合されるプロセッサ要素とメモリ記憶要素とを備える。本発明のある実施形態では、細胞の質量特性は、治療薬に対する細胞の応答を定量化するように観察される。随意に、１つ以上の細胞は、癌に罹患している個人から得られ、治療薬は、典型的には、（例えば、治療薬に対する癌細胞の感受性を評価するように設計されている方法で）癌を治療するために使用されるものである。【0010】
本発明のさらに別の実施形態は、特定の環境または一式の環境条件、例えば、試験組成物、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ等の治療薬を含む、細胞培養に対する細胞応答を観察するための方法である。本発明のそのような方法では、細胞は、第１の環境（例えば、第１の観察チャンバ）内に配置され、次いで、第１の環境内の細胞の質量特性が、生細胞干渉法を含むプロセスを使用して観察される。本発明の方法では、第１の環境内で観察される質量特性は、生細胞干渉法を含むプロセスを使用して第２の環境で観察される細胞の質量特性と比較される。このようにして、第１の環境に対する細胞応答を観察することができる。典型的な方法では、第１の環境は、試験組成物を含み、第２の環境は、試験組成物を含まない。これらの方法では、細胞の生理機能は、細胞が第１の環境内の試験組成物に暴露されたときに試験組成物によって転換され、次いで、この変換は、本発明の方法によって観察される（そして典型的には、試験組成物に暴露されておらず、したがって、組成物によって変換されていない対照細胞と比較される）。随意に、試験組成物は、抗生物質、抗体、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞周期阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態では、試験組成物は、細胞内で機能し、例えば、ｓｉＲＮＡ等の外因性ポリヌクレオチドを含む。
【0011】
本発明のある実施形態では、質量特性が観察される細胞は、単離された単細胞として第１の環境内に存在する。代替として、質量特性を観察することができる細胞は、細胞集合または集塊の中で第１の環境内に存在する。本発明のいくつかの実施形態では、第１の環境内に存在する複数の細胞の質量特性が観察される。本発明の実施形態では、第１の環境内の１つ以上の細胞の質量特性は、ある期間にわたって１つ以上の細胞の質量特性がどのようにして変化するかを観察するよう、複数回観察することができる。随意に、例えば、細胞の質量特性の変化は、時間的質量プロファイルを観察するように経時的に観察される。本発明のある実施形態は、観察された時間的質量プロファイルを時間的質量プロファイルのデータベースと比較するステップを含み、時間的質量プロファイルのデータベースは、（例えば、細胞の成長が試験組成物の存在下で阻害される状況で）試験組成物に対する細胞感受性の特性を示す時間的質量プロファイル、および（例えば、細胞の成長が試験組成物の存在下で阻害されない状況で）試験組成物に対する細胞抵抗性の特性を示す時間的質量プロファイルを含むように選択される。
【0012】
本発明の他の例証的実施形態は、例えば、細胞の質量を定量化する、および／または環境的刺激に応答して１つ以上の細胞の質量がどのようにして変化するかを観察するためのシステムおよび方法を含むことができる。いくつかの実施形態は、試験ビームと参照ビームとの間の分数位相偏移を生成および測定することが可能な干渉顕微鏡の観察チャンバの中に１つ以上の細胞を配置するステップと、照明波長における試験ビームに細胞を暴露させるステップと、細胞を通って伝搬する試験ビームと参照細胞を通って伝搬する参照ビームとの間の分数位相偏移を測定するステップと、以下の方程式【数2】
【0013】
他の細胞特性を観察するための方法論的実施形態も考慮される。例えば、本発明のある実施形態では、本方法は、水性媒体内の生細胞の光学的厚さを観察するために使用することができる。代替として、本方法は、例えば、生細胞集団における刺激に対する静止および動的細胞応答を識別、監視、および測定するように、生細胞集団を同時に観察するために使用することができる。典型的には、これらの方法では、治療薬等の刺激への細胞の暴露に応答して、特性が観察される。ある実施形態では、本発明の方法は、内部または外部刺激に対する集団内の細胞の反応差のプロファイルを作成するように、高度並列様式で行うことができる。随意に、本方法はさらに、観察チャンバから細胞を除去することと、さらなる分析のために細胞を操作することとを含む。本発明のある実施形態では、本方法は、水性媒体内の生細胞の細胞特異的プロファイルを含む情報を取得するため、次いで、この情報をメモリ記憶要素の中に記憶するために使用される。
【0014】
本発明の種々の方法論的実施形態が考慮される。例えば、マイケルソン干渉対物レンズを有する顕微鏡と、顕微鏡に動作可能に連結されるカメラ（例えば、静止カメラ、ビデオカメラ、電荷結合素子（ＣＣＤ）等）等の検出器と、細胞を含有するように適合される観察チャンバを備えるサンプルアセンブリと、参照チャンバを備える参照アセンブリとを備える、システムを使用して、本発明のある方法論的実施形態を実施することができる。さらに、そのようなシステムは、加えて、細胞の１つ以上の画像を記憶するように適合されるメモリ記憶要素と、細胞の１つ以上の画像を処理するように適合されるプロセッサ要素とを含んでもよい。他の実施形態では、顕微鏡は、流体媒体を通して干渉縞を観察することが可能な干渉顕微鏡である。代替として、本システムは、複数の位相偏移における干渉パターンを観察し、次いで、観察された干渉パターンを細胞の光学的厚さのプロファイルと相関させることが可能である。そのような一般実施形態は、本明細書で開示されるシステムが種々の構成を採用することができるため、非限定的である。本発明の他の実施形態は、細胞の適性のリアルタイムかつ低侵襲性のマーカーと、細胞の適性を観察する方法とを含む。そのようなシステムおよび技法は、細胞質量の変化の観察に依存し得る。
【0015】
付録を含む以下の発明を実施するための形態から、本発明の他の目的、特徴、および利点が当業者に明白となるであろう。しかしながら、発明を実施するための形態および具体的実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示しながら、限定ではなく例証として挙げられることを理解されたい。本発明の範囲内の多くの変更および修正が、その精神から逸脱することなく行われてもよく、本発明は、全てのそのような修正を含む。[本発明1001]
環境に対する細胞応答を観察するための方法であって、第1の環境に対する細胞応答が観察されるように、
（ａ）第1の環境内に少なくとも1つの細胞を配置する段階と、
（ｂ）生細胞干渉法を含むプロセスを使用して、第1の環境内の細胞の質量特性を観察する段階と、
（ｃ）（ｂ）で観察される質量特性を、生細胞干渉法を含むプロセスを使用して第2の環境で観察される細胞の質量特性と比較する段階と、
を含む、方法。
[本発明1002]
質量特性が観察される前記少なくとも1つの細胞が、単離された単細胞として第1の環境内に存在する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
質量特性が観察される前記少なくとも1つの細胞が、細胞集合または集塊の中で第1の環境内に存在する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第1の環境内に存在する複数の細胞の質量特性が観察される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
第1の環境が試験組成物を含み、第2の環境は該試験組成物を含まない、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記試験組成物が、抗生物質、抗体、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞周期阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ、または細胞を含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記試験組成物が、ＨＥＲ2を結合する抗体を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
第1の環境内の細胞の前記質量特性が、ある期間にわたって該細胞の質量特性がどのように変化するかを観察するように、複数回観察される、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記細胞の質量特性の変化が、時間的質量プロファイルを観察するように経時的に観察される、本発明1008の方法。
[本発明1010]
観察された時間的質量プロファイルを時間的質量プロファイルのデータベースと比較する段階をさらに含み、該時間的質量プロファイルのデータベースは、前記試験組成物に対する細胞感受性の特性を示す時間的質量プロファイル、および前記試験組成物に対する細胞抵抗性の特性を示す時間的質量プロファイルを含むように選択される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
細胞の質量を観察するための方法であって、
（ａ）試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定するように適合されている干渉顕微鏡の観察チャンバの中に細胞を配置する段階と、
（ｂ）照明波長における試験光線に細胞を暴露させる段階と、
（ｃ）細胞を通って伝搬する試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定する段階と、
（ｄ）細胞の質量を観察するために、（ｃ）で得られた測定値を使用する段階と、
を含む、方法。
[本発明1012]
細胞の質量が、以下の方程式
[数1]
[本発明1013]
α＝1．8×10−3ｍ3ｋｇ−1である、本発明1011の方法。
[本発明1014]
細胞の質量が、ある期間にわたって細胞の質量がどのように変化するかを観察するよう、複数回観察される、本発明1011の方法。
[本発明1015]
複数の細胞の質量を定量化するために使用される、本発明1011の方法。
[本発明1016]
（ａ）顕微鏡に動作可能に連結されている検出器と、
（ｂ）細胞を含有するように適合されている観察チャンバを備える、サンプルアセンブリと、
（ｃ）参照細胞を含有するように適合される参照チャンバを備える、参照アセンブリと、
（ｄ）光源からの光線を試験ビームおよび参照ビームに分割するためのビームスプリッタと、
を備える、生細胞干渉法システムを使用して行われる、本発明1011の方法。
[本発明1017]
観察チャンバが、該チャンバ内で細胞培地を循環させるように適合されている少なくとも1本の灌流導管を備える、本発明1016の方法。
[本発明1018]
生細胞干渉法システムが、プロセッサ要素と、細胞の1つまたは複数の画像を処理して記憶するように適合されているメモリ記憶要素とを備える、本発明1016の方法。
[本発明1019]
細胞の質量特性が、治療組成物に対する細胞応答を定量化するように観察される、本発明1011の方法。
[本発明1020]
前記細胞が、癌に罹患している個人から得られ、前記治療組成物が、癌を治療するために使用される、本発明1019の方法。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】生細胞干渉計（ＬＣＩ）の実施形態の概略図を図示する。ＬＣＩ（ａ）は、参照細胞の光学的厚さを、観察チャンバの中に配置されたサンプルの光学的厚さと比較する、マイケルソン型干渉顕微鏡である。観察チャンバの中には鏡面基材が懸垂され、ＬＣＩが透明細胞に対して光学的厚さの測定を行うことを可能にする。顕微鏡対物レンズおよび観察チャンバの相対位置は、コンピュータによって制御され、３次元に変換可能であり、急速な自動画像収集を可能にする。データ収集の全体を通して、観察チャンバの中の細胞は、標準細胞培養条件（例えば、ｐＨ７．４、３７℃、５％ＣＯ２）で維持される。生細胞干渉計は、接着性および非接着性細胞の両方の質量を測定することが可能である。フレーム（ｂ）が、ポリ−Ｌ−リシン溶液で基材を被覆した後に観察チャンバ基材に付着した、いくつかの非接着性Ｈ９２９細胞を示す一方で、フレーム（ｃ）は、基材上に直接培養された接着性の雌インドキョン（９）細胞を示す。カラーマップは、青が背景に対する低い光学的厚さであり、赤が高い光学的厚さである、光学的厚さの測定を示す。
【図2】ＬＣＩを用いた細胞質量の高スループットの長期的測定を図示する。ＬＣＩからのＨ９２９多発性骨髄腫細胞の４つのサンプル画像（ａ）は、６時間の観察にわたる細胞の光学的厚さのプロファイルを示す。色は、ｎｍ単位で位相偏移を示し、濃い青が低い厚さを示し、白／赤が高い厚さを示す。これらのサンプル画像は、７分ごとに撮影された２５の連続ＣＣＤキャプチャの合成画像である。差し込み図は、単細胞にわたる位相偏移の測定を示す。細胞にわたる統合位相偏移は、細胞の乾燥質量に正比例する。（ｂ）何百もの個々の細胞（赤で輪郭が描かれている）が各フレーム内の独自の位置で識別され、（ｃ）各個別細胞の質量が判定され、経時的に高スループットの集団レベル質量プロファイリングを可能にする。（ｄ）個々の細胞の質量が、単細胞成長動力学を調べるように、経時的に縦方向に追跡される。測定は、線形最小二乗最良適合線とともに中抜き記号として示される。この場合の測定された成長速度は、６．５（標準誤差＋／−０．７２）ｐｇ／時間である。残余誤差の標準偏差として受け取られる、線形傾向についての変動は、５．０ｐｇまたは細胞質量中央値の１．１７％である。最大ピーク間残余誤差は、１０２分で１１ｐｇ、またはその時点での質量中央値の２．６１％である。
【図3】単細胞質量蓄積によってプロファイル作成されたＨ９２９多発性骨髄腫細胞の薬物反応を図示する。ＤＭＳＯ処置対照の質量蓄積をツニカマイシン処置（１０ｇ／ｍｌ）細胞と比較する、Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞の集団でのＬＣＩ長期的質量測定の結果である。データは５時間にわたって得られる。処置細胞は、対照よりもゆっくりと成長する。実験番号２および番号３は、番号１の３７℃と対比して３２℃で行われ、これが、観察されたわずかに低い成長速度の原因である。散布図（ａ〜ｂ）は、それらの最初の質量と対比した（最初の質量によって正規化された）５時間での個々の細胞の成長を描写する。誤差バーは、測定誤差の推定値である、＋／−２％の変動係数を表す。誤差バーは、全てのデータに適用されるが、明確にするために図中の点の大部分について省略されている。正規化質量対時間の箱ひげ図（ｃ〜ｄ）では、円は、サンプル中央値を示し、三角形は、中央値の９５％信頼区間を示す。同一色の箱は、２５および７５パーセンタイルの限界を示し、ひげは、平均値からの２つの標準偏差を表す。
【図4】ツニカマイシンに対するＨ９２９応答の分子プロファイルを図示する。処置および未処置集団間の成長速度の相違は、処置集団において転写因子ＣＨＯＰ（ａ）および転写因子ＸＢＰ１の代替的スプライシング（ｂ）の上方調節と同期して生じる。ＣＨＯＰおよびＸＢＰ１−ｓは、小胞体内のタンパク質の誤った折り畳みの影響を軽減することに関与する、多数の遺伝子を活性化する。これは、タンパク質糖化の阻害剤である、ＴＭ作用の既知の機構と一致する。（ｃ）細胞周期データが、細胞周期停止と一致する、Ｇ２／Ｍ相集団の急速な低減およびＧ１／Ｇ０集団の対応する増加を示す。この偏移は、５時間の治療の終了までにＧ１／Ｇ０の中の細胞の５０％を残して、３時間の治療後に顕著になる。
【図5】細胞分割の質量動力学を図示する。２８の分裂事象が、全ての実験で処置および未処置集団から（合計約６００個の細胞から）記録された。（ａ）分裂細胞の質量範囲が、個々の分割を観察し、親および娘細胞の質量を直接測定することによって判定された。パネル（ａ）は、測定された全ての細胞（処置および未処置の両方、破線）の質量分布を、実験中に分裂した細胞の質量（分裂前は赤、分裂後は青）と比較する。（ｂ）驚くべきことに、いくつかの細胞分裂は高度に非対称であり、全親細胞質量の約５５％以上が２つの娘細胞のうちの小さいほうにとどまった。（ｃ）高度非対称分裂の２つの実施例が、５時間の時間的経過にわたって示される。（アスタリスクによって示される）これらの分裂の中の娘細胞のうちの小さいほうは、それぞれ、親細胞質量の３５％および４０％を含有した。これらの分裂事象は、（ｂ）で赤く塗られた円によって示される。誤差バーは、測定誤差の推定値である、＋／−２％の変動係数を表す（方法を参照）。
【図6】接着性細胞の質量の生細胞干渉計測定を図示する。フレームは、研磨シリコン基材上に直接培養された、いくつかのマウス線維芽細胞を示す。カラーマップは、青が背景に対する低い光学的厚さであり、赤が高い光学的厚さである、光学的厚さの測定を示す。左側は、示されるように、２００分間で２秒ごとに得られた、４つの細胞の質量測定である。接着性細胞対非接着性細胞のより小さい光学的厚さが、ＬＣＩによって容易に測定される。
【図7a】処置および未処置データセットの散布図を図示する。赤い傾向線は、データへの線形最小二乗適合を表す。成長速度と細胞質量との間に相関がないという確率を示す、ｐ値が、各適合について求められる。細胞質量が未処置対照において増加するにつれて、より遅い成長に向かった傾向があるが、これは９５％信頼にとって統計的に有意ではない。処置セットＴｍ２およびＴｍ３が、成長速度と質量との間の相関を示さない一方で、負の傾斜は、Ｔｍ１について有意である（ｐ＝０．０２）。各線形適合の残余（residual）のノルム（norm）は、各質量セグメント内の成長変動の推定値を提供する。誤差バーは、測定誤差の推定値である、＋／−２％の変動係数を表す。
【図7b】処置および未処置データセットの散布図を図示する。赤い傾向線は、データへの線形最小二乗適合を表す。成長速度と細胞質量との間に相関がないという確率を示す、ｐ値が、各適合について求められる。細胞質量が未処置対照において増加するにつれて、より遅い成長に向かった傾向があるが、これは９５％信頼にとって統計的に有意ではない。処置セットＴｍ２およびＴｍ３が、成長速度と質量との間の相関を示さない一方で、負の傾斜は、Ｔｍ１について有意である（ｐ＝０．０２）。各線形適合の残余のノルムは、各質量セグメント内の成長変動の推定値を提供する。誤差バーは、測定誤差の推定値である、＋／−２％の変動係数を表す。
【図8】ＬＣＩの光路および質量測定安定性を図示する。干渉計の安定性を試験するように、高さ約３５ｎｍのシリコン上に蒸着させられた金の島部分（ａ、下のパネル）が、１４０分間で繰り返し測定された。上のパネルで示されるように、３つの代表的な島部分の平均高さは、この期間中に有意義な動向を示さず、高さの標準偏差として求められる測定再現性は、約１．２オングストロームまたは全高の０．３５％である。同様に、透明な物体の質量測定の安定性は、８０＋分にわたって部分的に溶解した１０ｕｍ直径のポリスチレン球（ｂ）を繰り返し測定することによって推定される。上のパネルでは、トレース番号１は、クラスタに溶解した３つの球を表し、トレース番号２は、クラスタに溶解した２つの球を表す。他の３つの球は、単一球に由来する。ポリスチレン球の質量測定の変動係数は、金の島部分の平均高さについて得られる係数に類似し、測定期間にわたってごくわずかな動向を伴って０．４％未満である。水が培地に取って代わったことを除いて、生細胞を測定するために使用される条件と同一の条件下で、データがＬＣＩ観察チャンバの中で収集された。
【図9】ＬＣＩを用いた高精度質量測定を図示する。４つの個々の細胞（ａからｄ）が選択され、約１２秒間隔で行われた９８回の連続測定にわたって追跡された。この期間（合計２０分）にわたって、観察された細胞は、質量のわずかな変化を示し（質量対時間の差し込み図を参照）、測定再現性の評価を可能にした。ｃおよびｄにおける細胞は、この期間にわたって１ピコグラム超の平均質量変化を示すため、ｃおよびｄにおけるヒストグラムは、成長による任意の付加的な分散を除去するように、（差し込み図において赤で示される）最小二乗適合線の線形成分を差し引いた、測定された質量を提示する。各細胞の測定のヒストグラムは、Ｍａｔｌａｂにおいて非線形最小二乗適合によってガウス分布に適合された。平均（μ）および標準偏差（σ）が、各分布について報告される。全ての標準偏差は、分布平均の１％未満であり、ＬＣＩを用いた質量測定が高度に反復可能であることを示す。
【図10】水中でＬＣＩによって測定された、部分的に溶解した６μｍ直径のポリスチレン球（Ｆｌｏｗ Ｃｈｅｃｋ， Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）の集団の質量を図示する（ａ）。調製中に、球は、低頻度で凝集し、二量体および三量体を加熱すると、単一の円錐クラスタに融合する。単量体（１１０．７ｐｇ）、二量体（２１３．７ｐｇ）、および三量体（３０８．１ｐｇ）の集団のピークをヒストグラムにおいて区別することができる。単量体集団質量のＬＣＩ測定標準偏差は、７．５ｐｇ、または平均の６．８％であり、１５％という製造業者の規定の仕様を超える。４つの異なる哺乳類細胞型および６ｕｍポリスチレン球の集団の質量分布が、比較のためにヒストグラムとしてともに描画される（ｂ）。ＬＣＩを用いて判定されたマウス赤血球（ＲＢＣ）集団の平均質量を、他の技法（例えば、Ｎｉｅ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７．７９：ｐ．７４０１−７４０７、Ｖａｙｓｓｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８８．４４（３）：ｐ．２６５−２７６、Ｗｉｒｔｈ−Ｄｚｉｅｃｉｏｌｏｗｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｐｅｒｓ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００９．２７（１）：ｐ．６９−７７、Ｍａｇｎａｎｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８８．４２（１）：ｐ．３７−４７を参照）によって、およびマイクロ干渉法を使用した別の群（例えば、Ｍｙｓｌｉｗｓｋｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８５．２９（２）：ｐ．１０７−１１０を参照）によって判定された公表値と比較することができる（ｃ）。Ｎｉｅらは、新規の質量分光分析方法を使用して、マウスＲＢＣの細胞質量を測定し、また、従来の光化学的技法によって平均赤血球ヘモグロビン質量（ＭＣＨ）も測定した（例えば、Ｎｉｅ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７．７９：ｐ．７４０１−７４０７を参照）。ＭＣＨは、典型的には、哺乳類赤血球の全細胞質量の大部分を表す。種々のマウス株のＭＣＨ値の範囲が、十分に確立されている（例えば、Ｍａｇｎａｎｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８８．４２（１）：ｐ．３７−４７、Ｍｙｓｌｉｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８５．２９（２）：ｐ．１０７−１１０、Ｗｉｒｔｈ−Ｄｚｉｅｃｉｏｌｏｗｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｐｅｒｓ ａｎｄ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００９．２７（１）：ｐ．６９−７７を参照）。推定値としてＮｉｅらによって求められたＭＣＨ対全質量の比を使用して、マウスＲＢＣ ＭＣＨの確立値を、測定された平均マウスＲＢＣ質量と比較することができる。確立値は、赤で表示される。
【図11a】ＬＣＩによって測定された、４つの異なる生細胞または新たに調製した細胞型の集団のうち、マウスＷＥＨＩ−２３１Ｂリンパ腫細胞の質量分布を図示する。
【図11b】ＬＣＩによって測定された、４つの異なる生細胞または新たに調製した細胞型の集団のうち、１５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の赤血球（ＲＢＣ）の質量分布を図示する。
【図11c】ＬＣＩによって測定された、４つの異なる生細胞または新たに調製した細胞型の集団のうち、ヒトＨ９２９多発性骨髄腫細胞の質量分布を図示する。
【図11d】ＬＣＩによって測定された、４つの異なる生細胞または新たに調製した細胞型の集団のうち、標準的な技法を使用したレトロウイルス導入および養子細胞移入によってＣ５７ＢＬ／６マウスで確立された、一次骨髄および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の混合物の質量分布を図示する。
【図12】図９ａで挙げられたデータからの代表的な細胞の質量対時間のプロット（ａ）を図示する。破線は、データへの指数成長適合を表す。生細胞実験における測定変動の尺度を推定するために、３つ全てのＴｍ処置およびＤＭＳＯ対照実行（それぞれ、Ｄ１〜Ｄ３およびＴｍ１〜Ｔｍ３と示される）からの全ての単細胞質量対時間のデータを、単純指数成長モデルに適合させ（ｍａｓｓ（ｔ）＝ｍ０＊Ｃｔ、式中、定数Ｃは単位元に近い）、残余誤差を、傾向と各時点における実際のデータとの間のパーセント差として計算した。箱ひげ図では、中心線は、サンプル中央値を示し、三角形は、中央値の９５％信頼区間を示す。同一色の箱は、２５および７５パーセンタイルの限界を示し、ひげは、平均値からの２つの標準偏差を表す。残余は、ゼロの周囲で対称に分布し、２５％から７５％の四分位の範囲（ＩＱＲ）は、０．０１２６（Ｄ２）から０．０２７（Ｄ３）まで変化する。平均ＩＱＲは、０．０２である。
【図13】撮像された種々の単細胞、細胞集合、および密集したコロニー、ならびにａＬＣＩによって定量化された質量を図示する。（ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＢＴ−４７４乳癌細胞株の共焦点像。ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株が、単細胞として、または疎性集団の中で成長する一方で、ＢＴ−４７４およびＭＣＦ−７細胞株は、密集した多細胞コロニーとして成長する。赤は、Ａｌｅｘａ ５６８ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎアクチン染色であり、青は、ＤＡＰＩ核染色である。（ｂ）各細胞株の質量分布の位相画像。単細胞、疎性集団、および密集したコロニーは、ａＬＣＩを用いてリアルタイムで再現可能に定量化される。カラースケールは、ｐｇ／ｕｍ２単位で質量密度を表す。スケールバーは５０ｕｍである。
【図14】ａＬＣＩを用いた単細胞および大型コロニーの同時撮像を図示する。（ａ）位相画像は、約５２個の細胞から成る多細胞ＭＣＦ−７コロニー（２１，６６０ｐｇ）と一緒に、単一のＭＣＦ−７細胞（５５５ｐｇ）を示す。カラースケールは、ｐｇ／ｕｍ２単位で質量密度を表す。（ｂ）全ての細胞株の成長速度対初期質量の複合散布図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（赤）、ＭＣＦ−７（青）、ＳＫ−ＢＲ−３（シアン）、およびＢＴ−４７４（黒）は、異なる株の細胞およびコロニーサイズならびに成長速度の範囲を示すように重ねられている。コロニー形成株（ＭＣＦ−７およびＢＴ−４７４）は、単細胞から大型の多細胞コロニーまでの範囲に及ぶ。
【図15】３〜５時間以内にａＬＣＩを用いて再現可能に定量化された、トラスツズマブによる乳癌細胞成長阻害を図示する。（ａ）２０ｕｇ／ｍｌトラスツズマブ処置を伴う各細胞株の集団平均正規化質量対時間のプロットである（誤差バーは標準誤差を示す）。（ｂ）トラスツズマブ処置による成長阻害が、７時間までにＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４株について高度に有意（ｐ＜０．００１）になる。１時間ごとの成長速度が、質量蓄積データへの線形適合から計算される。
【図16】６時間で収集されたａＬＣＩ質量蓄積プロファイリングデータ（列４）と一緒に示されている、７日間増殖アッセイによって判定されたトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）感受性（列３）を図示する、表を提供する。ＨＥＲ２状態は、Ｏ'Ｂｒｉｅｎらによって判定された（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１０，９，１４８９−５０２を参照）。
【発明を実施するための形態】
【0017】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、および他の科学用語または専門用語は、本発明が関連する当技術者によって一般的に理解される意味を有することを目的としている。場合によっては、一般的に理解されている意味を伴う用語は、明確にするため、および／またはすぐ参照できるように、本明細書で定義されてもよく、そのような定義を本明細書に含むことは、必ずしも、当技術分野で概して理解されるものを超える大幅な差異を表すように解釈されるべきではない。本明細書で説明または参照される技法および手順の多くは、当業者によって良く理解され、従来の方法論を使用して一般的に採用される。適宜に、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順が、概して、特に記述がない限り、製造業者によって定義されたプロトコルおよび／またはパラメータに従って実行される。いくつかの用語が以下で定義される。
【0018】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、説明される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、当然ながら変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、本発明の範囲は、添付の請求項のみによって限定されるであろうから、限定的であることを目的としていないことも理解されたい。また、本明細書および添付の請求項で使用されるように、「１つの」（「ａ」、「ａｎ」）、および「該」（「ｔｈｅ」）という単数形は、文脈が特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの試験組成物」という言及は、複数のそのような試験組成物等を含む。整数以外の値で数値的に特徴付けることができる値（例えば、溶液中の化合物の濃度）を指す、本明細書および関連請求項で記載される全ての数字は、「約」という用語によって修飾されると理解される。値の範囲が提供される場合、文脈が特に明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、その範囲の上限と下限との間、およびその規定範囲内の任意の他の規定値または介在値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、また、本発明内にも包含されるが、規定範囲内の任意の特異的に除外された限界の対象となる。規定範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれた限界のいずれか一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【0019】
本明細書で記述される全ての出版物は、引用される出版物との関連で方法および／または材料を開示および説明するように、参照することによって本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される出版物は、本願の出願日より前のそれらの開示について引用される。発明の最先の優先日または先行日により、本発明者らが出版物に先行する資格がないという了解として、ここでは解釈されるものではない。さらに、実際の公開日が、示される日付とは異なり、独立した検証を必要とする場合がある。
【0020】
本明細書で開示される本発明は、いくつかの実施形態を有する。本発明の実施形態は、細胞の１つ以上の特性、例えば、その質量および／または種々の環境条件に応答して細胞の質量がどのようにして変化するかを観察し、および／または特徴付けるための方法、材料、およびシステムを提供する。本発明の例証的実施形態は、細胞の質量についての情報を取得し、および／または細胞の質量に関係する１つ以上の細胞特性を特徴付けるために、干渉法を使用することを含む。本発明の実施形態によって観察することができる例証的な細胞特性は、例えば、刺激、例えば、薬剤または他の生物学的活性剤への暴露、ならびに種々の要因を含む、刺激に応答した、細胞骨格の再構成挙動を含むことができる。本発明のいくつかの実施形態では、観察される現象は、前癌および癌細胞で起こるもの等の、異常細胞分裂等の病態に対応する、または関連付けられる現象である。本発明のいくつかの実施形態では、移動が観察される細胞膜は、単細胞の膜である。本発明の他の実施形態では、複数の細胞の膜特性が観察される。ある実施形態では、膜は、組織中の細胞の膜である。他の実施形態では、膜は、細胞のコロニー（例えば、患者または樹立細胞株から得られる一次細胞の生体外細胞培養）内の細胞の膜である。本発明の典型的な実施形態では、細胞は、真核（例えば、哺乳類）細胞である。
【0021】
本発明の典型的な干渉法の実施形態では、干渉計は、例えば、マイケルソン構成を使用する。加えて、スペクトル的に分解された干渉法、波長走査干渉法、デジタルホログラフィ等を含む、干渉法技術と関連付けられる方法および要素を、本発明の実施形態で使用することができる。多くの干渉法の顕微鏡システムおよび方法は、本発明の実施形態とともに使用するために適合することができるが、本発明の他の実施形態は、走査型光学顕微鏡、共焦点顕微鏡等を使用することができる。本発明の実施形態とともに使用するために適合することができる、光学プロファイリング方法および材料を説明する出版物の例証的かつ非限定的なリストは、例えば、その内容が参照することにより組み込まれる、米国特許出願第２０１００２８４０１６号、第２００５０２４８７７０号、第２００５０２２５７６９号、第２００５０２００８５６号、第２００５０１９５４０５号、第２００５０１２２５２７号、第２００５００８８６６３号、第２００４０２５２３１０号、第２００５０１１７１６５号、第２００３０２３４９３６号、第２００４００６６５２０号、第２００８００１８９６６号、および第２００５０１６７５７８号で開示されている。
【0022】
本発明の実施形態は、例えば、高さ測定、形状測定の方法、ならびに細胞膜の形状および細胞の質量に関し得る他の特性の他の変調の尺度を提供するために、光学的形状測定技法を使用する。試験細胞または細胞集団の形状、サイズ等に応じて、これらの技法は、典型的には、経済的かつ実用的な方法で結果を最適化するために、構造光、光学部の集束特性、光の干渉等を使用する。モアレの技法、ＥＳＰＩ（電子スペックルパターン干渉法）、レーザ走査、写真測量法、および干渉法が、３次元形状測定を行うために開発された例証的な技法である。白色光干渉法またはコヒーレンスレーダとも一般的に呼ばれる、白色光垂直走査干渉法（ＶＳＩ）の技法が、小さい物体、典型的には、数マイクロメートルを超えない粗度を伴う物体を撮像するために使用される。ＶＳＩ方法は、２つの干渉する多色波面によって作成されるコヒーレンスピークの検出に基づく。それは、絶対深度判別、速い測定周期、および高い垂直分解能等の多くの利点を有する。ＶＳＩの１つの利点は、精度が優れているが、ＶＳＩの走査深度が欠如し得る、位相偏移干渉法（ＰＳＩ）等の他の測定技法と組み合わせることができるという容易性である。ＰＳＩは、典型的には、プロファイルのわずかな変化を伴う平滑面の測定に使用される（例えば、Ｋ．Ｃｒｅａｔｈ，"Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｐｈａｓｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，"Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｇｒａｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｔｄ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，１９９３，ｐｐ．９４−１４０を参照）。ＶＳＩは、概して、大きなピクセル間高さの範囲を伴う平滑および／または粗面を測定するために使用される（Ｋ．Ｇ．Ｌａｒｋｉｎ，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｗｈｉｔｅ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ，"Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．，Ａ／Ｖｏｌ．１３，８３２−８４３（１９９６）。ＶＳＩおよびＰＳＩの組み合わせは、例えば、ＰＳＩ精度で大きな段差を測定するために使用されてきた（Ｃ．Ａｉ、米国特許第５，４７１，３０３号）。ＶＳＩおよびＰＳＩの組み合わせの特定の場合である、ＰＳＩＯＴＦ技法は、より大きい高さの範囲内で平滑面の測定を向上させる（例えば、Ｈａｒａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ，"Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．３９，２１０７−２１１５，２０００を参照）。典型的なＶＳＩおよびＰＳＩシステムおよび方法は、例えば、その内容が参照することにより組み込まれる、米国特許第５，１３３，６０１号、第５，４７１，３０３号、および米国特許第６，４４９，０４８号、ならびに米国特許出願第２００２０１９６４５０号で開示されている。
【0023】
上述のように、本発明の実施形態は、本明細書で開示されるシステムを使用して、細胞の質量特性を観察するための方法を含む。実施形態は、例えば、膜の運動が、光学的細胞厚（細胞密度）、細胞体積等の要因のリアルタイム位相測定で観察される、膜の観察を含む。１つのそのような方法は、細胞（および／または細胞集団）の特性を観察するための方法であって、マイケルソン干渉対物レンズを有する光学顕微鏡の細胞 観察チャンバの中に細胞を配置することと、細胞を観察するためにこのマイケルソン干渉対物レンズを使用することとを含む、方法である。典型的には、そのような実施形態では、質量特性は、細胞密度および／または細胞体積物の細胞の観察可能な特性と相関することができ、このようにして、本方法は、細胞の質量特性が観察されることを可能にする。
【0024】
本発明の１つの例証的実施形態は、生細胞干渉法を使用して細胞の質量を観察するための方法である。典型的には、そのような方法は、試験光線と参照光線との間の分数位相偏移を測定するように適合される干渉顕微鏡の観察チャンバの中に細胞を配置するステップと、照明波長における試験光線に細胞を暴露させるステップと、次いで、細胞を通って伝搬する試験光線と参照光線（例えば、対照または参照細胞を通って伝搬する光線）との間の分数位相偏移を測定するステップとを含む。本発明のいくつかの実施形態では、熟練者であれば、細胞を通って伝搬する試験ビームと参照細胞を通って伝搬する参照ビームとの間の分数位相偏移を測定するために顕微鏡を使用することができ、分数位相偏移は、細胞の特性に相関する。次いで、そのような測定は、細胞の質量を導出するために使用することができる。
【0025】
本発明の共通実施形態では、細胞の質量は、以下の方程式【数3】
【0026】
本発明の典型的な実施形態では、本方法は、顕微鏡に動作可能に連結される検出器と、細胞を含有するように適合される観察チャンバを備えるサンプルアセンブリと、参照細胞を含有するように適合される参照チャンバを備える参照アセンブリと、光源からの光線を試験ビームおよび参照ビームに分割するためのビームスプリッタとを備える、生細胞 干渉法システムを使用して行われる。本発明のある実施形態では、観察チャンバは、チャンバ内で細胞培地を循環させるように適合される、少なくとも１本の灌流導管を備える。本発明のいくつかの実施形態では、生細胞干渉法システムは、細胞の１つ以上の画像を処理して記憶するように適合されるプロセッサ要素とメモリ記憶要素とを備える。本発明のある実施形態では、細胞質量特性（例えば、細胞の質量、細胞の重量、細胞の体積等）は、治療薬に対する細胞の応答を定量化するように観察される。随意に、例えば、細胞は、癌に罹患している個人から得られ、治療薬は、癌を治療するために使用される。【0027】
本発明のさらに別の実施形態は、特定の環境、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ等の治療薬を含むものに対する細胞応答を観察するための方法である。本発明のそのような方法では、細胞は、第１の環境内に配置され、次いで、第１の環境内の細胞の質量特性が、生細胞干渉法を含むプロセスを使用して観察される。典型的には、この比較は、第１および第２の環境内の患者に由来する同一系統（例えば、癌系統）の細胞を観察することを含む。このようにして、第１の環境および／または第２の環境に対する細胞応答を観察することができる。典型的には、これらの方法では、第１の環境は、試験組成物を含み、第２の環境は、試験組成物を含まない。随意に、試験組成物は、抗生物質、抗体、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞周期阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ、または細胞（例えば、抗原提示細胞等のヒト免疫細胞）を含む。これらの方法では、第１の環境で観察される質量特性は、生細胞干渉法を含むプロセスを使用して第２の環境で観察される細胞の質量特性と比較される。
【0028】
本発明のある実施形態では、質量特性が観察される細胞は、単離された単細胞として第１の環境内に存在する。代替として、質量特性を観察することができる細胞は、細胞集合または集塊（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個の細胞の凝集）の中で第１の環境内に存在する。本発明のいくつかの実施形態では、第１の環境内に存在する複数の細胞の質量特性が観察される。本発明の実施形態では、第１の環境内の１つ以上の細胞の質量特性は、ある期間にわたって１つ以上の細胞の質量特性がどのようにして変化するかを観察するよう、複数回観察することができる。随意に、例えば、細胞の質量特性の変化は、時間的質量プロファイル（例えば、細胞の質量が経時的に変化する特定の方法）を観察するように経時的に観察される。本発明のある実施形態は、観察された時間的質量プロファイルを時間的質量プロファイルのデータベースと比較するステップを含み、時間的質量プロファイルのデータベースは、試験組成物に対する細胞感受性の特性を示す時間的質量プロファイル、および試験組成物に対する細胞抵抗性の特性を示す時間的質量プロファイルを含むように選択される。
【0029】
本発明の他の例証的な実施形態は、例えば、細胞の質量を定量化する、および／または環境的刺激に応答して１つ以上の細胞の質量がどのようにして変化するかを観察するためのシステムおよび方法を含むことができる。いくつかの実施形態は、試験ビームと参照ビームとの間の分数位相偏移を生成および測定することが可能な干渉顕微鏡の観察チャンバの中に１つ以上の細胞を配置するステップと、照明波長における試験ビームに細胞を暴露させるステップと、細胞を通って伝搬する試験ビームと参照細胞を通って伝搬する参照ビームとの間の分数位相偏移を測定するステップと、以下の方程式【数4】
【0030】
質量および／または他の細胞特性を観察するための方法論的実施形態も考慮される。例えば、本発明のある実施形態では、本方法は、水性媒体内の生細胞の光学的厚さを観察するために使用することができる。代替として、本方法は、例えば、生細胞集団における刺激に対する静止および動的細胞応答を識別、監視、および測定するように、生細胞集団を同時に観察するために使用することができる。典型的には、これらの方法では、治療薬等の刺激への細胞の暴露に応答して、特性が観察される。ある実施形態では、本発明の方法は、内部または外部刺激に対する集団内の細胞の反応差のプロファイルを作成するように、高度並列様式で行うことができる。随意に、本方法はさらに、観察チャンバから細胞を除去することと、さらなる分析のために細胞を操作することとを含む。本発明のある実施形態では、本方法は、水性媒体内の生細胞の細胞特異的プロファイルを含む情報を得るため、次いで、この情報をメモリ記憶要素の中に記憶するために使用される。
【0031】
種々の方法論的実施形態が考慮される。例えば、マイケルソン干渉対物レンズを有する顕微鏡と、顕微鏡に動作可能に連結されるカメラ（例えば、静止カメラ、ビデオカメラ、電荷結合素子（ＣＣＤ）等）等の検出器と、細胞を含有するように適合される観察チャンバを備えるサンプルアセンブリと、参照チャンバを備える参照アセンブリとを備える、システムを使用して、本発明のある方法論的実施形態を実施することができる。さらに、そのようなシステムは、加えて、細胞の１つ以上の画像を記憶するように適合されるメモリ記憶要素と、細胞の１つ以上の画像を処理するように適合されるプロセッサ要素とを含んでもよい。他の実施形態では、顕微鏡は、流体媒体を通して干渉縞を観察することが可能な干渉顕微鏡である。代替として、本システムは、複数の位相偏移における干渉パターンを観察し、次いで、観察された干渉パターンを細胞の光学的厚さのプロファイルと相関させることが可能である。そのような一般実施形態は、本明細書で開示されるシステムが種々の構成を採用することができるため、非限定的である。本発明の他の実施形態は、細胞の適性のリアルタイムかつ低侵襲性のマーカーと、細胞の適性を観察する方法とを含む。本発明の別の実施形態は、顕微鏡と、顕微鏡に動作可能に連結される点検出器、線検出器、マイクロボロメータ、またはカメラ（例えば、静止カメラ、ビデオカメラ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、顕微鏡法で使用される他の画像捕捉デバイス）等の検出器と、細胞を含有するように適合される観察チャンバを備えるサンプルアセンブリと、参照チャンバを備える参照アセンブリとを備える、細胞の質量の特性を観察するためのシステムである。そのようなシステムおよび技法は、細胞質量の変化の観察に依存する。
【0032】
本発明の他の実施形態は、干渉縞から情報を抽出することが可能な干渉顕微鏡と、干渉顕微鏡に動作可能に連結される検出器と、細胞を含有するように適合される観察チャンバを備えるサンプルアセンブリと、サンプルアセンブリの光路長に実質的に合致するように適合される参照アセンブリとを備える、細胞の１つ以上の画像を取得するためのシステムを含む。本発明の１つの典型的な実施形態は、マイケルソン干渉対物レンズを有する顕微鏡と、顕微鏡に動作可能に連結されるカメラと、細胞を含有するように適合される観察チャンバを備えるサンプルアセンブリと、流体（例えば、観察チャンバの中に配置された培地、ＲＰＭＩ、ＰＢＳ、水等）を含有するように適合される参照チャンバを備える参照アセンブリとを備える、細胞の画像を取得するためのシステムである。
【0033】
本システムの実施形態は、当技術分野で公知である、および／または本明細書で説明される種々の要素および方法を使用するように適合される。例えば、サンプルおよび／または参照チャンバは、典型的には、流体を含むが、流体セルを必要としない他の実施形態、例えば、（例えば、塩を使用することによる）透過型媒体（ＴＴＭ）対物レンズも、本発明の実施形態で使用することができる。また、本発明のある実施形態では、細胞を保持するサンプルチャンバが閉鎖される一方で、他の実施形態では、細胞チャンバは、上部を開くことができる（すなわち、蓋を必要としない）。本発明の実施形態は、典型的には、サンプルおよび参照アセンブリを構成する要素のサイズおよび構造を制御することによって、干渉計システムのアーム間の光路差を合致させることを含むことができる。例えば、本発明のある実施形態では、参照アセンブリはさらに、第１の光学窓と、第１の光学窓を保持するように適合される第１の筐体要素と、第２の光学窓と、第２の光学窓を保持するように適合される第２の筐体要素と、第１の光学窓と第２の光学窓との間に配置可能であり、定義された距離まで第１および第２の光学窓を分離するように適合される、複数の球状スペーサ要素とを備える。これは、この目的を達成する１つの方法の例証的かつ非限定的な実施例にすぎず、アーム間の光路差を合致させる種々の他の方法等がある（例えば、１つだけのプレートが細胞チャンバを合致させる実施形態では、光路が変化させられるように相互に対して２つのウェッジを移行させることができ、球状スペーサ要素の代わりに異なる種類のスペーサを使用することができる等）。
【0034】
本発明の別の実施形態は、ビームスプリッタ、参照鏡、補償流体セルを備える、干渉計を提供するステップを含み、該流体セルは、標本を包囲する流体によって誘発される光路差に合わせて調整するために使用される。そのような方法は、光路を少量減少させるために圧電変換装置を使用し、試験および参照ビームの間の位相偏移を引き起こすことを含むことができる。そのような方法は、透明細胞体を通って伝搬する光に付与される、位相の変動を判定することを含むことができる。そのような方法は、以下の式【数5】
【0035】
本発明の実施形態は、これらのシステムの種々の順列を含む。例えば、ある実施形態では、観察チャンバは、チャンバ内で細胞培地を循環させるように適合される、少なくとも１本の灌流導管を備える。本発明のいくつかの実施形態はさらに、細胞の１つ以上の画像を処理して記憶するように適合されるプロセッサ要素とメモリ記憶要素とを備える。本発明のある実施形態では、細胞は、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）等の当技術分野で公知である別のマーカー／プローブで標識され、本システムは、これらの標識細胞を撮像するように適合される光学的要素を含む。本発明のいくつかの実施形態は、ＦＴ赤外線分光法、ラマン分光法等で使用されるデバイスおよびプロセス（例えば、ソフトウェアベースのプロセス）等の、細胞特性を観察するために使用される付加的な要素を含む。
【0036】
本発明の方法は、１つ以上の細胞特性に関する多種多様の情報を取得するために使用することができる。例えば、本発明のある実施形態では、本方法は、例えば、水性媒体内の生細胞の光学的厚さを観察するために使用することができる。本発明の実施形態は、視野内の全ての細胞について、１１秒ごとに１という画像捕捉速度（修正を伴って１秒の１／１０００で１まで増加させることができる）で１ｎｍ垂直分解能まで、液体（すなわち、培地）中の生細胞の光学的厚さを測定するために使用することができる。この観察は、有用な情報を提供し、例えば、視野内の細胞体の水平軸を横断してピクセルごとの基準でＣＣＤ検出器カメラに戻る、干渉計光の帰還を遅延させる、細胞内のタンパク質、核酸、および他の分子の尺度を含む。
【0037】
代替として、本方法は、水性媒体内の生細胞の細胞質量特性を観察するために使用することができる。例えば、本明細書で開示されるシステムの実施形態から得られる観察からの各細胞について、液体中の細胞質量を計算することができる。ある期間にわたってそのような計算を収集することによって、環境（すなわち、抗原提示細胞等の他の細胞との相互作用、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ等の薬剤との相互作用等）に応答して、細胞の光学的厚さ（質量）の適応および／または不適応変化を評価することができる。次いで、この情報から、例えば、（典型的には、当技術分野で公知である計算を使用して）粘弾性等の視野内の各細胞の生物物理的パラメータを導出することができる。このようにして、熟練者であれば、経時的に変化する条件下で細胞質量特性を観察することができる。本発明のさらに別の実施形態では、静止時に、または何らかの環境条件に応答して、集団内の各個別細胞について、細胞質量「シグネチャ」を導出することができる。本発明の別の実施形態では、独自の特性を伴う個々の生細胞を、それらの位置（複数可）が干渉計の視野内で識別されるため、単離し、視野から回収することができる。付加的な分析のために観察された細胞を回収すること等のさらなる操作が考慮される。回収は、例えば、さらなる研究（すなわち、小動物への養子移入、単細胞マイクロアレイ遺伝子発現プロファイリング等の種々の設定でのさらなる試験等）を可能にするように、吸入ピペットを用いたものであり得る。
【0038】
上述のように、本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、水性媒体内の生細胞の質量特性を観察するために使用される。随意に、本方法は、生細胞集団を観察するため、例えば、生細胞集団における刺激に対する静止および動的応答を観察するために使用される。本発明のある実施形態では、生細胞集団内の複数の細胞の静止および／または動的応答を同時に測定することができる。典型的には、これらの方法では、細胞の培地に導入される組成物等の刺激への細胞の暴露に応答して、特性が観察される。随意に、本方法はさらに、観察チャンバから細胞を除去することと、さらなる分析のために細胞を操作することとを含む。本発明のある実施形態では、本方法は、水性媒体内の生細胞の細胞特異的プロファイルを含む情報を取得するため、次いで、この情報をメモリ記憶要素の中に記憶するために使用される。本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、適切なサイズの「穴」（例えば、ナノウェルまたはマイクロウェル）を用いて、（例えば、当技術分野で公知のフォトレジスト堆積プロセスによって）さらに均一で、より高い密度およびより高いスループットの分析のために配列することができる。
【0039】
試験細胞の特性を識別するために有用な本発明の実施形態は、コンピュータシステムおよびデータベースに連結することができる。試験細胞の特性を識別するための方法は、概して、試験プロファイルを生成するように試験細胞の細胞特性プロファイルを判定することと、試験プロファイルを対象データベースの中の参照プロファイルと比較することとを伴う。そのような方法はさらに、プロファイルのライブラリ（例えば、治療薬に対する細胞感受性または抵抗性等の種々のプロファイルと関連付けられる特定の生理学的条件に従ってグループ化されるもの）の生成、ならびにプロファイルのライブラリの中のプロファイルとの試験プロファイルの比較を含む。そのような比較は、例えば、試験プロファイルと実質的に同一である参照プロファイルを識別するように、最良適合を提供するために当技術分野で公知のソフトウェアプロセスを使用することができる。次いで、参照プロファイルは、試験細胞の１つ以上の特性を相関させるために使用することができる。
【0040】
細胞特性プロファイルは、上記で説明されるように、データベースに蓄積することができ、データベースの中の情報は、試験細胞のプロファイルをデータベースの中の参照プロファイルと比較するために使用される。比較は、訓練された人員（例えば、臨床医、技術者等）によって行うことができるか、またはコンピュータあるいは他の機械によって行うことができる。対象診断アッセイは、任意の種類の異常細胞を識別するために有用であり、例えば、本発明の診断アッセイは、生物サンプル、例えば、生検において、ならびに生体内で個人において、癌細胞を識別するために有用である。
【0041】
種々の生理学的条件下で、および種々の生理学的状態で、種々の細胞型の分析から取得されるデータは、例えば、細胞型および細胞の生理学的状態の独立した検出のために、ニューラル・ネットワークを訓練するために、データベースに蓄積することができる。細胞特性プロファイルは、上記で説明されるように取得され、ニューラル・ネットワークは、種々の細胞型の細胞、種々の生理学的状態の細胞、および種々の刺激に応答する細胞を認識するように訓練される。ニューラル・ネットワークは、癌細胞、前癌細胞、および他の病態の細胞を識別するために有用である。
【0042】
本発明の実施形態とともに使用するために適合することができる、一般的な方法および材料は、その内容が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１００２８４０１６号で開示されている。本発明の実施形態と関連付けられる、さらなる態様、要素、およびプロセスが、以下で開示される。
【0043】
上述のように、本発明の実施形態は、生細胞干渉法の技法に関する。そのような技法は、当技術分野で公知である。生細胞干渉法（ＬＣＩ）システム、方法、および材料を説明する出版物の例証的かつ非限定的なリストは、例えば、その内容が参照することにより組み込まれる、Ｔｅｉｔｅｌｌらの米国特許出願公開第２０１０／０２８４０１６号、Ｐｏｐｅｓｃｕらの米国特許出願公開第２００９／０２９０１５６号、Ｒｅｅｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２００８，２，８４１−６、Ｒｅｅｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００８，１９，２３５１０１、Ｒｅｅｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．２０１１，１０１，１０２５−３１で開示されている。
【0044】
ＬＣＩの基礎と成る物理的原理は、以下の通りである。透明な細胞体を通って伝搬するコヒーレントまたは半コヒーレント光に付与される位相の変動は、細胞の物質密度に直線的に比例する（９〜１１）。干渉顕微鏡法は、ミクロンサイズの物体について、波長の１／１０００を超える、または可視光について０．５ｎｍよりも良い精度で、これらの位相の変化を測定することができる。次いで、細胞質量は、以下のように各細胞の測定された位相遅延に関係することができる（９）：【数6】
【0045】
広域撮像技法であるため、ＬＣＩは、何百もの細胞の同時質量測定を提供する（図２）。データ収集の全体を通して、細胞は、６時間以上にわたって周期的な長期的測定を可能にする生理学的条件（例えば、ｐＨ７．４、３７℃、５％ＣＯ２）において、標準培養皿の中で維持することができる（図２ａ）。自動画像処理アルゴリズムを用いて、急速連続で、何百もの細胞を各画像中で識別し、質量プロファイルを作成することができる（図２ｂ）。これらの条件で、単細胞質量測定は、高度に反復可能である（３％未満の変動係数、例えば、方法：測定誤差を参照）。したがって、各時点で、細胞質量の集団全体の分布を判定することができる（図２ｃ）。さらに、図２ｄのように、成長速度曲線（非水性細胞質量変化）を生じるように、個々の細胞を長期間にわたって追跡することができる。
【0046】
以下の実施例は、本発明がさらに完全に理解され得るように提供される。これらの実施例は、例証的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0047】
実施例１：本発明の実施形態で有用な例証的な方法および材料干渉計
生細胞干渉計は、以前に詳細に説明されている（１）。簡潔には、本システムは、典型的な光学分解能（２０ｘ対物レンズについては１．１６μｍ）で、横特徴だけでなく、１ナノメートルの尺度を下回る反射物体の高さ寸法の観察も可能にする、２０Ｘ ０．２８ＮＡマイケルソン干渉対物レンズを伴う、改良型Ｖｅｅｃｏ ＮＴ９３００光学プロファイラに基づく光学顕微鏡である。マイケルソン干渉計は、標本を包囲する流体によって誘発される光路差に合わせて調整するように、ビームスプリッタ、参照鏡、および補償流体セルから成る。位相偏移干渉法（ＰＳＩ）（１４）方法が、原位置で細胞体の位相画像を捕捉するために使用された。測定中に、圧電変換装置が、光路を少量減少させ、試験および参照ビームの間の位相偏移を引き起こす。本システムは、多くの異なる位相偏移において結果として生じる干渉パターンの放射照度を記録し、次いで、ＰＳＩアルゴリズムを使用して放射照度データを統合することによって、放射照度を位相波面データに変換する。現在実装されているように、自動焦点およびＰＳＩ測定周期は、１２秒かかる。ＰＳＩ測定自体は、１〜２秒かかり、カメラフレームレート（６０ｆｐｓ）によって制限される。この実験では、４００〜１，０００個の細胞を含有する、一式の２５の画像が、７分ごとに捕捉された。各一式の２５の画像は、何百もの細胞を含有し、ここでは最初の５つの画像からのデータが提示され、したがって、各実行は、約８０個の細胞を含む。選択された画像のそれぞれの中の全ての細胞が測定された。
【0048】
データ分析Ｖｅｅｃｏ ＮＴ９３００に固有のソフトウェアは、位相画像から手動で選択される細胞の光学的厚さの自動測定を可能にする。光学的厚さは、Ｒｏｓｓと一致する、変換定数α＝１．８×１０−３ｍ３ｋｇ−１を使用して、本文で説明されるように質量に変換される（９）。各細胞の境界が、ピクセル高のヒストグラムから判定される閾値を使用して、背景から物体を区切るアルゴリズムによって自動的に選択された（１５）。光学的厚さへの未加工位相画像の変換は、一連の十分に確立された「位相アンラッピング」ルーチンを使用する（１６）。時として、この位相から光学的厚さへの変換は、１つの波長（５３０ｎｍ）分小さく不正確であり、細胞を伴う連続領域に、真の値よりも１波長小さい、見掛けの光学的厚さを持たせる。この誤差は、光学的厚さの非物理的不連続性として容易に検出され、影響を受けたピクセルに光学的厚さの１つの波長を再び追加することによって補正される。このプロセスは、現在、完全には自動化されていない。
【0049】
測定誤差の定量化細胞質量測定のための干渉顕微鏡法の精度は、電磁気理論で（１７、１８）、ならびに超遠心分離（３、４、１０〜１２、１９〜２１）、タンパク質溶液、ヒドロゲル、および透明膜の屈折率測定（２２〜２４）、ｘ線密度測定（２５）、および電子顕微鏡法（２６〜３０）を含む、種々の参照技法によって確固たるものとして確証される。ＬＣＩシステムの精度および安定性を特徴付けるために、いくつかのベンチマーク実験を行い、その詳細が図８〜１１で挙げられる。干渉光路の時間的安全性（１．２オングストローム、図８ａ）の関数である、ＬＣＩ質量測定の変動係数（ＣＶ）の下限は、約０．３５％であると判定された。類似ＣＶが、細胞を刺激した、部分的に溶解したポリスチレンビーズの連続測定について（ＣＶ＜０．４％、図８ｂ）、および実際の生細胞の短期反復測定について（ＣＶ＜１％、図９）判定された。集団平均体積および標準偏差が製造業者によって提供され、通常はフローサイトメトリ（Ｆｌｏｗ Ｃｈｅｃｋ， Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）で較正標準として使用される、６μｍ直径ポリスチレン球の集団（図１０ａ）を測定した。ＬＣＩによって判定された集団質量ＣＶ（６．８％）は、製造業者によって判定される（１５％）よりもかなり小さかった。また、１５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから新たに得られた赤血球（ＲＢＣ）の集団も測定した（図１０ｂ〜ｃ）。（光化学および他の方法によって判定される）平均細胞質量の値の確立された範囲が存在するため、マウスＲＢＣは、情報を与える独立標準としての機能を果たす。平均ＲＢＣ細胞質量の我々のＬＣＩ判定値である、１９．４ｐｇは、１５〜２１ｐｇにおける公表値の範囲と優れた一致にある（９〜１２、３１）。最終的に、比較のために、種々の哺乳類細胞型の集団の質量を測定した（図１０ｂ、１１）。これらは、図９ｂのマウスＲＢＣおよびポリスチレン球データとともに描画される。多時間生細胞実験における測定変動の尺度を推定するために、全ての単細胞質量対時間のデータ（約４８０個の細胞を表す）を、単純指数成長モデルに適合させ（ｍａｓｓ（ｔ）＝ｍ０＊Ｃｔ、式中、定数Ｃは単位元に近い）、残余誤差を、傾向と各時点における実際のデータとの間のパーセント差として計算した（図１２ａ）。残余は、ゼロの周囲で対称に分布し（図１２ｂ）、２５％から７５％の四分位の範囲（ＩＱＲ）は、０．０１２６（ｃ２）から０．０２７（ｃ３）まで変化する。平均ＩＱＲは、０．０２であった。総合すると、これらの結果は、約０．５〜１．０％の測定再現性の下界、および２．０〜３．０％の外界を示す。生細胞の短期および長期測定の主な違いは、数時間の尺度にわたって生じる形状変化である。これは、（１）細胞境界の区切りにおける小さな誤差、（２）「丸みを帯びた」細胞の縁に存在する密集縞の光学的「平均化」、および（３）質量対光学的厚さの定数である、αの値の潜在的変化から、統合光学的厚さの追加変動を引き起こし得るが、以前の研究は、この誤差が比較的小さくなるであろうと示唆する（３）。（１）αは、結晶化タンパク質溶液の限界までさえも、濃度の変化による影響を受けない（９）、（２）αは、特定の場所で光と相互作用する質量を反映し（９〜１２、３１）、したがって、細胞が成長するにつれて、細胞が視野内でどれだけ多くの面積を占有するかによって影響されない、（３）αの値は、細胞で見出される広範囲の物質にわたって０．００１８に近いままである（３２）ことが確立される。
【0050】
細胞株および組織培養Ｈ９２９ヒト多発性骨髄腫細胞を、１０％の既定ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）および抗生物質を補充したＲＰＭＩ １６４０成長培地の中で、５％ＣＯ２中で３７℃にて維持した。観察チャンバは、シリコンが流体表面の最上部の付近にあるように、プラスチック棚の上に配置された２ｘ２ｃｍシリコン基材を伴って、直径４．５ｃｍおよび深さ１．５ｃｍであった。均一な厚さのサンプルチャンバを作成するように、３つの６００μｍステンレス鋼ビーズ（Ｓａｌｅｍ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｂａｌｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃａｎｔｏｎ，ＣＴ）の上に静置することによってシリコン表面から分離された、一片の光学ガラス（ＢＫ７ガラス、Ｑｕａｒｔｚ Ｐｌｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｌｉｎｅ，ＮＨ）によって、撮像セルが完成された。０．５ｍＬ／分の速度で蠕動灌流ポンプを使用して、５％ＣＯ２空気で発泡させられた培地を、インキュベーションチャンバを通して連続的に流した。サンプルチャンバ上に入射する５３０ｎｍ波長のＬＥＤ照明（Ｌｕｘｅｏｎ Ｓｔａｒ ＬＥＤ，Ｂｒａｎｔｆｏｒｄ，Ｏｎｔａｒｉｏ）は、１．２ｍｍ直径の照明スポットにわたって拡散した１５μＷの出力を有した。外部刺激に対する細胞応答が、この構成では７時間もの長さにわたって測定され、非摂動培養が最大１２時間にわたって観察されたが、実験の持続時間の上限は判定されていない。
【0051】
薬物治療、細胞周期分析、および核酸単離Ｈ９２９細胞を、１×１０６細胞／ウェルの密度で６ウェル培養皿の中に播種した。ＬＣＩの観察チャンバの中で細胞を平板培養する前に、ＤＭＳＯ中の１μＬのツニカマイシン（Ｔ７７６５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはＤＭＳＯのみのいずれかを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度、ＤＭＳＯ／培地（１：１０００希釈）で培地に添加した。実験システムが安定すること、すなわち、培養順化、温度安定化等を可能にするために、細胞が観察チャンバの中で平板培養された１時間後に、質量測定が始まった。細胞周期分析については、各時点からの細胞を収集し、ヨウ化プロピジウムを含有する低張性ＤＮＡ染色緩衝液でインキュベートし、後に、フローサイトメトリによって分析した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、各時点のＲＮＡを抽出した。
【0052】
逆転写、ＲＴ−ＰＣＲ、および定量的ＲＴ−ＰＣＲＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、オリゴ（ｄＴ）プライマーを伴う３μｇの全ＲＮＡからＣＤＮＡを合成した。２５周期にわたって５８℃の焼鈍温度でＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＸＢＰ１スプライスおよび非スプライスアイソフォームのＲＴ−ＰＣＲを行った。説明されるように、ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲキット（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）７７００シーケンス検出器を使用して、ＣＨＯＰ（ＤＤＩＴ３）ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った（３３）。正規化対照として、サンプルを３６ｂ４発現について分析した。プライマー配列が要求に応じて利用可能である。
【0053】
結果および考察質量蓄積動力学は、同時に測定された約１００個の細胞の集団全体について、長期的尺度（数時間）にわたって細胞ごとの基準で以前に報告されていない。ＬＣＩ質量プロファイリングが、薬物反応等の外部細胞刺激に対する応答を急速に判定できるという仮説を試験するために、Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞を、タンパク質糖化阻害剤である薬剤ツニカマイシン（ＴＭ）に暴露させ（３４）、５時間にわたって質量を連続的に測定することによって、ＴＭ処置細胞の成長プロファイルを未処置対照細胞と比較した。
【0054】
Ｈ９２９細胞質量の初期分布は、２００〜７００ｐｇの範囲で、ほぼ対数正規であると判定した。細胞の大部分が、２００ｐｇ超および４００ｐｇ未満の質量を有した一方で、ごくわずか（３６％）は、５００ｐｇを上回る質量を伴って、平均よりもはるかに大きい。処置および未処置集団の両方が成長を示したが、質量蓄積速度は、処置細胞においてはるかに低かった（図３）。両方の集団の成長プロファイルは、明確に不均一であり（図３ａ〜ｂ）、両方で、少数の細胞が、質量の活発な増加（＋１５％成長）を示したか、質量蓄積がほとんどまたは全くなかった（５％未満の成長）かのいずれかであった。処置集団の成長の抑制は、２時間以内に現れ、４時間までには容易に明白である（図３ｃ〜ｄ）。したがって、細胞薬物反応の全集団検出および定量化が、治療の数時間以内に達成された。５時間での処置および未処置群内の成長速度の変動（図３ｃ〜ｄ）は、同一点での処置および未処置培養間の変動の大きさに近似した。これらの実験は、別個の日に行われ、明確に異なる継代培養がマスタ原液から得られた。したがって、それらは、「技術的」ではなく「生物学的」複製であり、挙動の差異が、おそらく生物学的変動を反映する。測定誤差を３％未満の変動係数と推定するために、対照サンプルに技術的複製を使用した。それでもなお、我々は、各処置サンプルと各未処置サンプルとの間の正規化最終質量（最終／初期）の差異が、ｐ＜０．０５で統計的に有意である（図３ｃ〜ｄ）ことに留意する。これは、ＬＣＩが細胞の処置および未処置集団間の成長速度の差異を検出することが可能であるという証拠を提供する。
【0055】
単細胞レベルで、個々の細胞の成長速度は、処置および未処置細胞の両方について、実験誤差内で大部分が細胞質量とは無関係である（図７）。例外は、処置集団Ｔｍ１であり、そのより大きい細胞小集団において、より遅い成長に向かった統計的に有意な線形傾向を示した。この差異の理由は不明確である。興味深いことに、任意の特定の質量分率内の成長速度の拡散は、測定誤差によって完全には説明することができず、この変動の生物学的起源も示唆する。質量データと対比した成長への線形最小二乗適合の残余のノルムと見なされる、この変動が、３．１５．８％に及ぶ（図１２）一方で、我々は、質量測定誤差が３％未満の変動係数であると推定する（方法における誤差の考察を参照）。
【0056】
質量蓄積の動態を生化学的シグナル伝達と結び付けるために、ＰＣＲを用いて分子マーカーのプロファイルを作成し、処置集団に細胞周期分析を行った。処置および未処置集団間の成長速度の相違は、処置集団において、転写因子ＣＨＯＰおよびＸＢＰ１のスプライス形態（「ＸＢＰ１−ｓ」）の上方調節と同期して生じる（図４ａ〜ｂ）。ＣＨＯＰおよびＸＢＰ１−ｓは、タンパク質の折り畳みを補助する分子シャペロンの産生の増加、および誤って折り畳まれたタンパク質の分解の加速（いわゆる変性タンパク質応答（ＵＰＲ）、およびＥＲ関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）経路）を通して、小胞体内のタンパク質の誤った折り畳みの影響を軽減することに関与する、多数の遺伝子を活性化する（３５）。これは、既知のＴＭ作用機構と一致する（３４）。ＵＰＲおよびＥＲＡＤ分子経路の両方は、多発性骨髄腫を含む広範囲の疾患において、治療的介入のための新たな標的である。
【0057】
ＸＢＰ１は、多発性骨髄腫細胞における細胞成長および分化のコンテキスト依存性の陽性または陰性調節因子である（３４）。その双極性転写能の分子動力学は、十分に理解されていない。我々の実験との関連で、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡスプライシングの誘導は、質量蓄積の減速と関連付けられるが、細胞収縮またはアポトーシスとは関連付けられない。この細胞質量の時間分解された非破壊的測定は、免疫組織化学またはｑＰＣＲを含む、従来の技法を通して分析される、相反する増殖誘発分子信号および抗増殖分子信号の解釈に大いに役立つ。細胞周期データは、細胞周期停止と一致する、Ｇ２／Ｍ相集団の急速な低減およびＧ１／Ｇ０集団の対応する増加を示す（図４ｃ）。この偏移は、５時間の治療の終了までにＧ１／Ｇ０の中の細胞の５０％を残して、３時間のＴＭ暴露後に顕著になる。これはまた、ＵＰＲ経路の活性化が細胞周期停止につながるという観察とも一致する（３５、３６）。
【0058】
個々の分割を観察し、親および娘細胞の質量を直接測定することによって、分裂細胞の質量範囲を判定した。２８の細胞分裂が、合計約６００個の細胞から、全ての実験にわたって観察された。分裂の数は、未処置集団に有利に非対称であり、１８：１１であった。これは、その集団において観察されたより高い成長速度と一致する。細胞が分裂する質量は、緊密に調節され、処置および未処置集団の両方で類似した（図５ａ）。分裂時の質量中央値は、５１５ｐｇ（＋／−７５ｐｇ）であって、２つの結果として生じた娘細胞はそれぞれ、２５０ｐｇ（＋／−４０ｐｇ）の質量中央値を有した。この結果は、質量値を介して、集団の中のどの個別細胞が、細胞周期の初期、中期、および後期段階にある可能性が高いかを推測することを可能にする。娘細胞の質量分率が、ほとんどの場合において約５０／５０であった一方で、少数の細胞分裂は高度に非対称であり、２つの娘細胞のうちの小さいほうが、親の細胞質量の４５％未満を保持した（図５ｂ）。非対称細胞分裂を受ける２つの細胞の質量マップが、図５ｃに示される。
【0059】
単細胞質量測定のための他の確立された方法および新興方法と比べて、ＬＣＩの明確な利点がある。非接着性細胞を必要とする、中空カンチレバーＭＥＭＳ質量測定デバイス（５、６）とは異なり、ＬＣＩは、接着性または非接着性細胞と同等に適合性がある（図６）。接着性細胞と連動する能力は、質量蓄積／分布と細胞・基材相互作用との間の関係を精査するため、およびヒト悪性腫瘍の大部分を形成する上皮または間質細胞型を評価するために、絶対的に重要である。ＬＣＩはまた、質量プロファイリングを、創薬で一般的に使用される全クラスの細胞移動、運動性、および組織侵襲性アッセイと結び付けるための優れたアプローチでもある。干渉顕微鏡は、標本への完全光学的アクセスを可能にし、高分解能の光学顕微鏡写真および蛍光像が容易に得られることを意味する。これは、同時評価のために、質量プロファイリング、および細胞生物学で使用される蛍光レポータアッセイの大規模装置の複合利用を可能にする。さらに、ＬＣＩは、細胞分裂の全体を通して、および細胞分裂に続いて、個々の細胞質量の定量化追跡および定量化を実証する。これは、例えば、幹細胞における質量区分化の広域プロファイリングを初めて直接的に可能にするであろう。
【0060】
ＬＣＩは、高スループットであり、経時的に同一の細胞の長期的測定を可能にする。それはまた、超並列でもあり、同時に何百もの長期的測定を可能にし、変動する条件による実験間誤差を低減させる。しかしながら、時として、位相から光学的厚さへの変換は、２πよりも大きい位相偏移の曖昧性により、１つの波長（５３０ｎｍ）分小さく不正確である。この状況は、細胞を伴う連続領域に、真の値よりも１波長小さい、見掛けの光学的厚さを持たせる。この誤差は、光学的厚さの非物理的不連続性として容易に検出され、影響を受けたピクセルに光学的厚さの１つの波長を再び追加することによって補正される。この補正プロセスは、現在、完全には自動化されていないが、この問題に対処する、かなり多数の研究が文献に存在する（１６）。
【0061】
７時間もの長さにわたって外部刺激に対する細胞応答を測定し、最大１２時間にわたって非摂動培養を観察した。原則として、細胞が、緊密に制御された培養条件下で何日も生存能力を持ったままであるため、測定は、はるかに長い持続時間にわたって継続することができる。ＬＣＩおよび代替的なアプローチ（５、７、８）に共通である、１つの制限は、細胞が観察チャンバに導入された後、または異なる温度あるいは密度を伴う培地が導入された後に、本システムが安定するために必要とされる時間である。本実験では、保守的に１時間の整定時間を許容したが、必要であれば、この整定時間を少なくとも２倍短縮することができる。
【0062】
要約すれば、高スループットＬＣＩ質量プロファイリングは、医学関連薬物反応等の環境摂動に対する単細胞集団ベースの応答を定量化するための高感度かつ精密な機構である。
【0063】
当技術分野で公知である種々の方法および材料、例えば、以下の参考文献で開示されるものは、本発明の実施形態を作製および／または使用するように適合することができる。
【0064】
括弧内で上記の本文中で識別される参考文献【0065】
実施例２：質量プロファイリングによる単およびクラスタ乳癌細胞のリアルタイム薬物感受性の定量化上記で論議されるように、生細胞質量プロファイリングは、経時的な細胞質量のピコグラム規模の変化を通して、治療薬に対する応答を急速に定量化するための有望な新しいアプローチである。質量プロファイリングにおける有意な障壁は、単離された単細胞よりも患者由来のサンプルまたは組織培養中でより一般的に存在する、多形細胞集合および集塊を、既存の方法が扱えないことである。ここで、ＨＥＲ２指向モノクローナル抗体である、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に対する単細胞およびコロニー形成ヒト乳癌細胞株の感受性の急速かつ正確な数量詞として、自動生細胞干渉法（ａＬＣＩ）の証拠が提供される。相対感受性が、従来の増殖アッセイで可能であるよりも数十倍から数百倍速く判定された。クラスタサンプル評価および速度における、これらのａＬＣＩの前進は、患者由来の固形腫瘍サンプルの治療反応試験に使用されてもよく、これらのサンプルは、生体外で短期間のみ生存可能であり、細胞凝集体および集合の形態である可能性が高い。
【0066】
２０１１年に米国では、２３０，４８０人の女性が乳癌と診断され、３９，５２０人の女性が該疾患で死亡した（例えば、Ｒ．Ｓｉｅｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２０１１，６１，２１２−３６を参照）。この一般的な悪性腫瘍の臨床経過および転帰は、腫瘍サブタイプ、臨床グレードおよび病期、ならびにエストロゲン（ＥＲ）、プロゲステロン（ＰＲ）、および増幅ＨＥＲ２細胞表面受容体の発現を含む、臨床評価の組み合わせによって通常は誘導される治療にもかかわらず、可変のままである（例えば、Ｍ．Ｉｇｎａｔｉａｄｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９，１５，１８４８−５２、Ｍ．Ｉｇｎａｔｉａｄｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２，９，１２−４を参照）。残念ながら、ＥＲ、ＰＲ、および／または増幅ＨＥＲ２表面受容体を発現する乳癌は、これらの受容体結合経路を標的にする治療に常に応答するわけではなく、これらのバイオマーカーのみの発現の分析が、治療決定には不十分となる。例えば、増幅したＨＥＲ２発現を伴う乳癌は、頻繁に、ヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に応答しない（例えば、ＪＡ．Ｗｉｌｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｎｅｗ ｔｒｉｃｋｓ ｆｏｒ ａｎ ｏｌｄ ｄｒｕｇ．Ｉｎ：Ｂｒａａｔｅｎ Ｄ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｔｏｗａｒｄ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ２０１０．ｐ．５３−６５を参照）。さらに、最初に応答する受容体陽性腫瘍は、経時的に標的治療に対して不応性となり得、それは、ＨＥＲ２増幅乳癌（例えば、Ｒ．Ｎａｈｔａ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００６，８を参照）および多くの他の種類の癌にも起こる。
【0067】
乳癌および他の癌における現在のバイオマーカーアプローチの共通特徴および不具合は、特定の患者のための特定の薬剤に対する腫瘍細胞応答を直接評価しない、それらの典型的には静的な時間的スナップショット代理性質である。優れたアプローチは、利用可能である場合、腫瘍がどのようにして一連の候補治療に応答するかをリアルタイム監視によって急速に判定し、次いで、その特定の患者の疾患にとって最も有効である薬剤（複数可）を選ぶことであり得る。生細胞のリアルタイム質量プロファイリングは、優れたアプローチを提供し得る、新しい再現可能な生物物理学的測定法である。生細胞質量プロファイリングは、主に、光学的方法（例えば、Ｇ．Ｐｏｐｅｓｃｕ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２００８，２９５，Ｃ５３８−Ｃ４４、Ｂ．Ｒａｐｐａｚ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ．２００５，１３，９３６１−７３、Ｊ．Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．２０１１，１０１，１０２５−３１、Ｊ．Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２００８，２，８４１−６を参照）または微細加工チップセンサ（例えば、Ｍ．Ｇｏｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００７；９１、Ｋ．Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０，１０７，２０６９１−６を参照）を使用して達成され、成長阻害または細胞毒性薬に対する細胞応答の検出を含む、変化する外部環境に暴露される細胞集団における単細胞乾燥質量変化の急速な連続定量化を生じることができる（例えば、Ｊ．Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．２０１１，１０１，１０２５−３１を参照）。残念ながら、技術的制限により、生細胞質量プロファイリングは、細菌、酵母、およびリンパ球等の空間的に単離された単細胞として存在する、細胞型に制約されている。これは、乳癌等における固形腫瘍治療反応試験のための質量プロファイリングの効果的な使用にとって、多大な障害である。一般に、解離した固形腫瘍サンプルは、機械的に分けられたときでさえも、純粋に単細胞としてよりもむしろ、小型および大型多細胞集合、シート、または球の組み合わせとして存在する。また、固形腫瘍を単細胞に分離するために必要とされる撹拌は、細胞を損傷し得、悪性表現型の維持に不可欠であり、薬剤反応性を評価するために必要とされ得る、細胞・細胞および細胞・基質相互作用を妨害する（例えば、ＢＥ．Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８１，４１，４３７８−８１、ＭＳ．Ｗｉｃｈａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８２，７９，３２１３−７を参照）。
【0068】
自動生細胞干渉法（ａＬＣＩ）と称される、本明細書で開示されるような質量プロファイリングアプローチを使用して、この阻害障壁が克服されてきた。ａＬＣＩを用いて、単細胞および大型コロニーまたはクラスタの両方として培養下で成長する、乳癌の治療反応動力学のプロファイルを作成してきた。これらの組織化されたコロニーは、サイズが最大で５０個の細胞であり、さらに大きいコロニーも、実際には測定され得る。６時間の経過にわたってトラスツズマブに暴露された４つの乳癌細胞株からの細胞集団またはコロニーの成長動態を定量化してきた。本研究では、どの乳癌株が、増幅ＨＥＲ２表面受容体を発現したか、またはどのようなレベルで発現したかという予備知識なしで、ａＬＣＩを行った。非常に高い精度で単細胞／単コロニー質量蓄積を定量化することによって、トラスツズマブ感受性および耐性腫瘍を急速に区別した。顕著に、ａＬＣＩは、細胞増殖アッセイ等の従来の技法を使用して可能であるよりも約１桁（ａ ｌｏｇ−ｏｒｄｅｒ）迅速に感受性および耐性細胞およびコロニーを識別した。この速度および感受性の向上は、不応性ＨＥＲ２増幅乳癌応答と対比した感受性の評価を可能にする。それはまた、診療所への応用も可能にし、そこではしばしば、脆弱な患者由来細胞が、短期間のみ生存可能であり、サンプルが、全てではないが多くの固形腫瘍型について、単細胞および凝集塊の不均一な混合物の形態である可能性が高い。
【0069】
２０ｕｇ／ｍｌの臨床グレードトラスツズマブの同時インキュベーションとともにａＬＣＩを使用して、４つのヒト乳癌細胞株の質量応答プロファイリングをリアルタイムで行った。各細胞型について、培地のみを含有する対照ウェル、およびトラスツズマブを含有する処置ウェルを同時に測定した。株のうちの２つである、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３は、高レベル表面受容体発現を伴う増幅ＨＥＲ２を有し、５〜７日間増殖アッセイによって評価されるように、生体外でトラスツズマブに対して特異的に感受性がある一方で、他の２つの株である、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、通常レベルでＨＥＲ２受容体を発現し、トラスツズマブ耐性である（例えば、ＮＡ．Ｏ'Ｂｒｉｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１０，９，１４８９−５０２を参照）。重要なことに、これらの細胞株は、非常に異なる形態で成長する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫ−ＢＲ−３株が、単細胞として、または疎性分散クラスタの中で成長する一方で、ＭＣＦ−７およびＢＴ−４７４株は、密集した多細胞コロニーとして成長する（図１３）。単一のＭＣＦ−７細胞（質量約５ｘ１０２ｐｇ）と大型コロニー（約２２ｘ１０３ｐｇ）との間の相対的尺度は、質量の４４倍差を対象とする（図１４）。
【0070】
何百もの個々の細胞およびコロニーの質量を、７時間にわたって連続的に定量化した。処置および対照群における全集団応答を特徴付けるように、３０分間隔での各細胞株の平均質量蓄積速度を描画した（図１５ａ）。ＨＥＲ２正常表現株の処置および対照サンプルである、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、経時的に同一の質量の増加を示した。対照的に、ＨＥＲ２増幅高発現株の処置および対照サンプルである、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３の成長速度は、治療の約４時間で分散し始めた。トラスツズマブ感受性株である、ＳＫ−ＢＲ−３およびＢＴ−４７４が、成長速度の高度有意差（ｐ＜０．００１）を示した一方で、非感受性株である、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、有意差を示さなかった（図１５ｂ）。ＢＴ−４７４株は、ＳＫ−ＢＲ−３株よりもトラスツズマブに応答し、６時間後に、それぞれ、１．７０＋／−０．３９および１．２４＋／−０．１０の対照対処置質量倍率変化を伴った（平均＋／−標準誤差、図１６）。２つの感受性株のうち、ＳＫ−ＢＲ−３が、主に単離された単細胞として存在する一方で、ＢＴ−４７４は、小型コロニーの中で成長し、コロニー形成が、トラスツズマブ感受性または耐性のために予測的ではない、または必要とされないことを示す。また、トラスツズマブに対するａＬＣＩ測定応答を、従来の複数日の細胞計数成長阻害アッセイで判定されたものと比較した。４つ全ての場合において、６時間にわたってａＬＣＩによって測定されたトラスツズマブ感度は、３〜７日にわたって細胞計数によって測定されたものと一致した（図１６）。
【0071】
これらの結果は、ａＬＣＩを介した生細胞質量定量化が、調べられている細胞の物理的構成および関連にかかわらず、乳癌におけるトラスツズマブに対する生物学的応答を急速かつ敏感に検出できることを示す。ＭＥＭＳ微小共振器等の他の最近開発された生細胞質量プロファイリング方法は、微小共振器の構成に応じて、高精度で単細胞の質量を瞬時に測定することができる（例えば、Ｍ．Ｇｏｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００７；９１、Ｋ．Ｐａｒｋ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０，１０７，２０６９１−６を参照）。そのアプローチの欠点は、十分な感受性を達成するために、共振器の活性面積が、ミクロン単位以下でなければならないことであり、ほとんどの固形腫瘍型に起こるように、単細胞およびより大型の多細胞コロニーの混合物の連続測定を不可能ではないが非常に困難にする。
【0072】
一般に、ａＬＣＩを含む、定量的位相光学顕微鏡法アプローチは、ＭＥＭＳベースのアプローチと同等の質量測定精度および正確度を保有し（例えば、Ｇ．Ｐｏｐｅｓｃｕ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２００８，２９５，Ｃ５３８−Ｃ４４、Ｊ．Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．２０１１，１０１，１０２５−３１を参照）、細胞集団および集塊の研究へのそれらの適用は、基礎的な物理的制限によってよりもむしろ、高スループット位相撮像と関連付けられる実用的困難によって制限されている。未加工位相画像を質量情報に変換することは、特に、照明波長と比較して大きい複雑な内部構造および光学的厚さを伴う細胞および物体のクラスタの場合に、計算的に挑戦的であり得る（例えば、Ｄ．Ｇｈｉｇｌｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｈａｓｅ Ｕｎｗｒａｐｐｉｎｇ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，ａｎｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；１９９８を参照）。凝集細胞集塊、シート、および球の治療反応の分析および定量化の増加した速度は、固形腫瘍治療における薬剤選択および予後にとって、刺激的な新しい機会を提供する。
【0073】
材料および方法細胞株および培養
ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＭＣＦ−７乳癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。全ての株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｏｍｅｇａ；Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）、ならびに１％ペニシリン、ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｃｅｌｌｇｒｏ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）成長培地の中で維持した。
【0074】
薬剤治療臨床グレードトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を２０ｕｇ／ｍｌで使用した。
【0075】
増殖アッセイ５×１０４個の細胞を、１２ウェルプレートの中へ播種し、治療を開始する前に２日間にわたって付着および成長させた。２０ｕｇ／ｍｌのＨｅｒｃｅｐｔｉｎを用いた治療の第０、３、５、および７日に、細胞をトリプシン処理し、数を数えた。倍率変化を計算するために、倍増時間を対照および薬剤処置サンプルについて判定し（ＤＴ＝ｔ＊（ｌｏｇ（２）／ｌｏｇ（Ｎｔ／Ｎ０）））、倍率変化をＤＴｄｒｕｇ／ＤＴｃｔｒｌと見なした。ＤＴ＝倍増時間、ｔ＝時間、Ｎｔ＝時間ｔでの細胞の数または質量、Ｎ０＝時間ｔ＝０での細胞の数または質量。
【0076】
共焦点撮像細胞を、チャンバ状カバーガラス上へ播種し、一晩付着させた。細胞を、ｐＨ７．４の１ｘＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中で透過処理した。次いで、サンプルをＡｌｅｘａ ５６８−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎアクチン染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）およびＤＡＰＩとともにインキュベートした。Ｚｅｎ ２０１０ソフトウェアを使用したＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０ ＣＣＤカメラを用いて、共焦点画像を撮影した。
【0077】
干渉計生細胞干渉計が以前に説明されている（例えば、Ｊ．Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．２０１１，１０１，１０２５−３１、Ｊ．Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２００８，２，８４１−６、Ｊ．Ｒｅｅｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００８，１９を参照）。本システムは、２０Ｘ ０．２８ＮＡマイケルソン干渉対物レンズを伴う、改良型Ｂｒｕｋｅｒ ＮＴ９３００光学プロファイラ（Ｂｒｕｋｅｒ；Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）から成る。マイケルソン干渉計は、サンプルを包囲する流体によって誘発される光路差に対処するように、ビームスプリッタ、参照鏡、および補償流体セルから成る。位相偏移干渉法（ＰＳＩ）方法が、細胞サンプルの位相画像を捕捉するために使用された。多重サンプル撮像を可能にするために、ａＬＣＩは、各サンプルウェルにおけるカバーガラス光路長のわずかな差に合わせて干渉計参照鏡を調整するために、小型モータを採用する。
【0078】
データ分析Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）で書かれた、カスタム多重ステッププログラムを使用して、画像分析を行った。第１のステップは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｎａｎｏ Ｉｎｃ．，Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺ）によって採用されたＧｏｌｄｓｔｅｉｎ位相アンラッピングアルゴリズムによる処理後に残留した、位相誤差（定量的位相撮像に固有の曖昧性による整数波長誤差）を除去する、位相アンラッピングステップであった。このアルゴリズムは、整数波長ジャンプ、および背景レベルを下回る非物理的偏位を除去するために、各ピクセルから離れた複数のランダムウォークを使用する。第２のステップは、局所適応メジアンフィルタおよび流域変換の組み合わせを使用して、各画像を細胞またはコロニー物体に区分することである。最終的に、ＩＤＬ粒子追跡コードに基づく、Ｄａｎｉｅｌ ＢｌａｉｒおよびＥｒｉｃ ＤｕｆｒｅｓｎｅによるＭａｔｌａｂのために適合された粒子追跡コードを使用して、画像分割によって識別された物体を追跡した（例えば、ＪＣ．Ｃｒｏｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６，１７９，２９８−３１０を参照）。