特許 6144695 タキサン療法を用いて乳癌を処置する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6144695

(24)【登録日】2017年5月19日

(45)【発行日】2017年6月7日

(54)【発明の名称】タキサン療法を用いて乳癌を処置する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170529BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20170529BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170529BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20170529BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   A61K31/337ZNA

   A61P35/00

   A61P15/00

【請求項の数】21

【全頁数】74

(21)【出願番号】特願2014-544926(P2014-544926)

(86)(22)【出願日】2012年11月30日

(65)【公表番号】特表2015-505830(P2015-505830A)

(43)【公表日】2015年2月26日

(86)【国際出願番号】US2012067317

(87)【国際公開番号】WO2013082440

(87)【国際公開日】20130606

【審査請求日】2015年9月30日

(31)【優先権主張番号】61/635,048

(32)【優先日】2012年4月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/565,133

(32)【優先日】2011年11月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】501378929

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ノースカロライナ アット チャペル ヒル

(73)【特許権者】

【識別番号】592105745

【氏名又は名称】ワシントン ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(73)【特許権者】

【識別番号】504260058

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデイション

(73)【特許権者】

【識別番号】500489613

【氏名又は名称】ブリティッシュ コロンビア キャンサー エージェンシー ブランチ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(72)【発明者】

【氏名】チャールズ エム．ペロウ

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ エス．バーナード

(72)【発明者】

【氏名】トルステン オー．ニールセン

(72)【発明者】

【氏名】マシュー ジェイ．エリス

(72)【発明者】

【氏名】ジョエル エス．パーカー

(72)【発明者】

【氏名】ミゲル マルティン

(72)【発明者】

【氏名】エバ カラスコ

(72)【発明者】

【氏名】ロザリア カバレロ

【審査官】 今村 明子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２４１６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２８６９６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Journal of Clinical Oncology，２００９年，vol.27, no.8，p.1160-1167

【文献】 Clin. Cancer Res.，２０１０年，vol.16, no.21，p.5222-5232

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／３３−３３／４４

Ａ６１Ｐ １５／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳癌の処置を必要とする対象における、毎週投与される、タキサンを含んで成る乳癌処置の有効性の見込みをスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
（ａ）前記対象からのサンプルを準備し；
（ｂ）前記サンプルにおける、表１のうちの少なくとも１１種類の遺伝子の組合せの発現を測定し、ここで当該少なくとも１１種類の遺伝子は、以下の：
ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣＡ１／ＮＵＦ２、ＣＥＰ５５、ＫＮＴＣ２／ＮＤＣ８０、ＭＫＩ６７、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、及びＵＢＥ２Ｃを含み；そして
（ｃ）前記サンプルにおける前記少なくとも１１種類の各遺伝子の発現に基づく増殖シグネチャーを決定する、を含み、
前記サンプルが、参照サンプルセットと比較した場合に低い増殖シグネチャーを有していると分類される場合は、毎週投与されるタキサンを含んで成る乳癌処置が、対象で有効である傾向がより強い、方法。

【請求項2】

ＡＮＬＮ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ６、ＣＥＮＰＦ、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＯＲＣ６Ｌ、及びＵＢＥ２Ｔから選択される少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＡＮＬＮ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ６、ＣＥＮＰＦ、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＯＲＣ６Ｌ、及びＵＢＥ２Ｔから選択される遺伝子のそれぞれの発現を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＡＮＬＮ、ＣＣＮＥ１、ＤＣ６、ＣＥＮＰＦ、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＭＥＬＫ、ＯＲＣ６Ｌ、及びＵＢＥ２Ｔから選択される少なくとも１種類の遺伝子の発現をさらに測定することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ＡＮＬＮ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ６、ＣＥＮＰＦ、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＭＥＬＫ、ＯＲＣ６Ｌ及びＵＢＥ２Ｔから選択される遺伝子のそれぞれの発現を測定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項6】

ＡＮＬＮ、ＣＥＮＰＦ、ＫＩＦ２Ｃ、及びＭＹＢＬ２から選択される少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ＡＮＬＮ、ＣＥＮＰＦ、ＫＩＦ２Ｃ、及びＭＹＢＬ２から選択される遺伝子のそれぞれの発現を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記タキサンが、パクリタキセルである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項9】

前記タキサンを含んで成る乳癌処置が、アントラサイクリン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルから成る群のうちの１若しくは複数のメンバーをさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン及びエピルビシンから成る群から選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

タキサンが、アントラサイクリン、シクロホスファミド、又は５−フルオロウラシルの投与前、又は投与後に投与される、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記タキサンを含んで成る乳癌処置が、アントラサイクリン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルから成る群のメンバーのそれぞれをさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン及びエピルビシンから成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

タキサンが、アントラサイクリン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルの投与前、投与後、又は同時に投与される、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

次の：腫瘍の大きさ、腫瘍のグレード、結節状態、固有サブタイプ、エストロゲン受容体発現、プロゲステロン受容体発現、及びＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２発現、のうちの少なくとも１種類を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

次の：腫瘍の大きさ、腫瘍のグレード、結節状態、固有サブタイプ、エストロゲン受容体発現、プロゲステロン受容体発現、及びＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２発現、のそれぞれを測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記サンプルが、細胞又は組織の抽出サンプルである、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記組織を生検から得る、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記サンプルが、体液の抽出サンプルである、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記体液が、血液、リンパ液、尿、唾液、及びニップル吸引液から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記少なくとも１種類の遺伝子の発現を、ナノレポーターコードシステムを使用して測定する、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
この出願は、２０１１年１１月３０日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／５６５，１３３、及び２０１２年４月１８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／６３５，０４８の優先権及び利益を主張する。これらの出願のそれぞれの内容の全体を参照により本明細書中に援用する。

【0002】

本発明の分野
本開示は、概して、癌生物学の分野に関し、詳細には、特定の癌細胞表現型の検出及び同定、ならびに適切な療法との相関の分野に関する。

【背景技術】

【0003】

ヒト乳癌は、分子が異なる５つの固有サブタイプ、Ｈｅｒ２高発現（Her2-enriched）、基底様（Basal-like）、管腔Ａ（Luminal A）、管腔Ｂ（Luminal B）及び正常様（normal-like）に分類できる（Perou et al. Nature, 406(6797):747-52 (2000); Sorlie et al. PNAS, 98(19):10869-74 (2001)）。予後及び分子生物学における相違点は確立されたが、これまで、固有サブタイプの間の化学感受性の差異を実証するには少ない徴候しか存在しない。

【0004】

タキサン療法は、多くの腫瘍タイプに対して有効であることが証明された。しかしながら、悪心・嘔吐、食欲不振、味覚変化、薄毛及び脆弱毛、２〜３日続く腕又は脚の関節の疼痛、爪の変色、及び手又は爪先の刺痛を含めた副作用が、タキサン療法に関連している。そうしたより重篤な副作用には、打ち身及び出血、注射部位の疼痛／発赤／膨張、２日間を超える正常な腸管習慣の変化、発熱、悪寒、咳、咽頭痛、嚥下困難、目まい、息切れ、激しい疲労感、皮膚発疹、顔面紅潮、卵巣の損傷による女性不妊症、ならびに胸痛が含まれる。タキサンベースの療法のこれらの副作用に基づいて、タキサンベースの療法に対して最適に応答する癌の種類、及び非タキサンベースの療法で治療する方が良い癌の種類を決定する必要性が当該技術分野に存在する。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、以下のステップ：対象からのサンプルを準備し；サンプルにおける、表１のうちの少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定し；サンプルにおける前記少なくとも１種類の遺伝子の発現に基づく増殖シグネチャーを決定し；そして、乳癌処置を対象に投与するが、サンプルが低い増殖シグネチャーを有していると分類される場合、対象にタキサン又はタキサン誘導体を含んで成る乳癌処置が投与され、そして、サンプルが低い増殖シグネチャーを有していないと分類される場合、対象にタキサン又はタキサン誘導体を含まない乳癌処置が投与され、これにより、対象において乳癌を処置すること、を含む乳癌処置を必要とする対象において乳癌を処置する方法を提供する。

【0006】

本発明はまた、以下のステップ：対象からのサンプルを準備し；サンプルにおける、表１のうちの少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定し；そして、サンプルにおける前記少なくとも１種類の遺伝子の発現に基づく増殖シグネチャーを決定すること、を含み；サンプルが低い増殖シグネチャーを有していると分類される場合、タキサン又はタキサン誘導体を含んで成る乳癌処置が対象に有効である傾向がより強い、乳癌処置を必要とする対象における、タキサン又はタキサン誘導体を含んで成る乳癌処置の有効性の見込みをスクリーニングする方法も提供する。

【0007】

本発明はまた、以下のステップ：対象からのサンプルを準備し；前記サンプルにおける、表１の少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定し；前記サンプルにおける前記少なくとも１種類の遺伝子の平均遺伝子発現を測定して、増殖シグネチャーを得；サンプルの増殖シグネチャーを参照サンプルセットと比較し；そして、乳癌処置を対象に投与するが、サンプルの増殖シグネチャーが参照サンプルセットの最も低い部分範囲内にある場合、サンプルの増殖シグネチャーは低い増殖シグネチャーであり、そして、サンプルが低い増殖シグネチャーを有していると分類される場合、対象には、毎週投与されるタキサン又はタキサン誘導体を含んで成る乳癌処置が与えられ、そして、サンプルが低い増殖シグネチャーを有していないと分類される場合、対象には、毎週投与されるタキサン又はタキサン誘導体を含まない乳癌処置が与えられ、これにより、対象において乳癌を処置すること、を含む乳癌処置を必要とする対象において乳癌を処置する方法を提供する。

【0008】

本発明はまた、以下のステップ：対象からのサンプルを準備し；前記サンプルにおける、表１の少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定し；前記サンプルにおける前記少なくとも１種類の遺伝子の平均遺伝子発現を測定して、増殖シグネチャーを得；サンプルの増殖シグネチャーを参照サンプルセットと比較すること、を含み；サンプルの増殖シグネチャーが参照サンプルセットの最も低い部分範囲内にある場合、サンプルの増殖シグネチャーは低い増殖シグネチャーであり、そして、サンプルが低い増殖シグネチャーを有していると分類される場合、毎週投与されるタキサン又はタキサン誘導体を含んで成る乳癌処置が対象に有効である傾向がより強い、乳癌処置を必要とする対象における、毎週投与されるタキサン又はタキサン誘導体を含んで成る乳癌処置の有効性の見込みをスクリーニングする方法も提供する。

【0009】

本発明の方法は、表１で列挙した遺伝子のうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含む。好ましくは、少なくとも１種類の遺伝子とは、増殖の遺伝子である。より好ましくは、少なくとも１種類の遺伝子とは、表１で列挙した少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも１６種類、少なくとも１７種類、少なくとも１８種類、少なくとも１９種類、少なくとも２０種類又は少なくとも２１種類の遺伝子である。

【0010】

一部の実施形態では、本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ１、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＮＴＣ２、ＭＥＬＫ、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＯＲＣ６Ｌ、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ及び／又はＵＢＥ２Ｔから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子のうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ１、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＮＴＣ２、ＭＥＬＫ、ＭＫＩ６７、ＯＲＣ６Ｌ、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ及び／又はＵＢＥ２Ｔから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子のうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣＡ１／ＮＵＦ２、ＣＥＰ５５、ＫＮＴＣ２／ＮＤＣ８０、ＭＫＩ６７、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ及び／又はＵＢＥ２Ｃから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子のうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＫＩＦ２Ｃ、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２及び／又はＵＢＥ２Ｃから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子のうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。表１のうちの少なくとも１種類の遺伝子の発現は、ナノレポーターコードシステム（nCounter（登録商標）Analysis system）を使用することで測定できる。

【0011】

タキサン又はタキサン誘導体は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））又はドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））であり得る。好ましくは、タキサン又はタキサン誘導体はパクリタキセルである。タキサン又はタキサン誘導体は、毎日（２４時間ごとに一度）、毎週（５〜７日ごとに一度）、２週間ごと（１０〜１４ごと）又は毎月（３０日ごとに一度）投与され得る。好ましくは、タキサン又はタキサン誘導体は、毎週投与される。

【0012】

タキサン又はタキサン誘導体を含んで成る乳癌処置は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、及び５−フルオロウラシルから成る群のうちの１若しくは複数のメンバー、又はそのメンバーのそれぞれをさらに含み得る。アントラサイクリンは、ドキソルビシン又はエピルビシンである。タキサン又はタキサン誘導体は、アントラサイクリン、シクロホスファミド及び／又は５−フルオロウラシルの投与の前、後、又はそれと同時に投与され得る。好ましくは、タキサン又はタキサン誘導体は、アントラサイクリン、シクロホスファミド及び／又は５−フルオロウラシルの投与の前又は後に投与される。

【0013】

本発明の方法は、次の：腫瘍の大きさ、腫瘍のグレード、結節状態、固有サブタイプ、エストロゲン受容体発現、プロゲステロン受容体発現、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２発現、及び／又はＲＯＲスコア、のうちの少なくとも１種類、次のものそれらの組み合わせ、又はそのそれぞれを測定することを含み得る。

【0014】

サンプルは、細胞又は組織の抽出サンプルとすることができる。組織は、生検から得ることができる。サンプルは、体液の抽出サンプルとすることもできる。体液は、血液、リンパ液、尿、唾液又はニップル吸引液とすることができる。

【0015】

開示はその詳細な説明と併せて説明されたが、先の説明は、例示を目的とするものであって、開示の範囲を制限するものではなく、開示の範囲は、添付した請求項の範囲によって規定される。他の態様、利点、及び変更も、以下の請求項の範囲内にある。

【0016】

本明細書中で言及した特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を規定する。本明細書中に引用した米国特許及び公開又は未公開米国特許出願のすべてが、参照により援用される。本明細書中に引用した公開外国特許及び特許出願のすべてが、参照により援用される。本明細書中に引用した受入番号によって示したＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ寄託物が、参照により援用される。本明細書中に引用した他の刊行参考文献、文書、原稿及び科学文献のすべてが、参照により本明細書中に援用される。

【0017】

この開示は、その好ましい実施形態を参照して詳細に示され、そして、説明されたが、形態及び詳細の様々な変更が添付の請求項によって包含された開示の範囲内から逸脱することなく好ましい実施形態の中でなされ得ることは、当業者によって理解される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】ＦＥＣ及びＦＥＣ−Ｐ処置治験群における全生存率を示す線グラフである。

【図1B】腫瘍サブタイプに基づく全生存率を示す線グラフである。

【図2A】増殖スコアに基づく全生存率を示す線グラフである。

【図2B】Ｋｉ−６７に基づく全生存率を示す線グラフである。

【図3A】腫瘍が低い増殖スコアを有する患者のＦＥＣ及びＦＥＣ−Ｐ処置治験群における全生存率を示す線グラフである。

【図3B】他の増殖スコア群のＦＥＣ及びＦＥＣ−Ｐ処置治験群における全生存率を示す線グラフである。

【図4】ＦＥＣ及びＦＥＣ−Ｐ処置治験群の両方に関する増殖スコアの線形関数としての１０年間の全生存率を示す線グラフである。

【図5】ＧＥＩＣＡＭ／９９０６トライアルサンプルセットの略図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の詳細な説明
本開示は、タキサン又はタキサン誘導体を含む乳癌処置が、乳癌に罹患している患者に投与するのに最適であるか否かを決定する方法を提供する。乳癌患者が、タキサン又はタキサン誘導体を含む処置を受けるべきであるか否かの決定は、固有遺伝子発現セットを用いた乳癌の増殖シグネチャーの決定を含む。本開示はまた、乳癌患者が、タキサン又はタキサン誘導体を含む処置を受けるべきであるか否かを決定し、そしてこの決定に基づいて患者に最適な乳癌処置を施すことによって乳癌を治療する方法を提供する。

【0020】

Perou et al. (2000) Nature 406:747-752で説明されている固有遺伝子は、同一個体からの生物学的サンプル複製物間での発現の変動が小さく、かつ異なる個体からのサンプル全体での発現の変動が大きいものが統計学的に選択される。したがって、固有遺伝子は、乳癌の分類のためのクラシファイア遺伝子として使用される。臨床情報は、乳癌固有サブタイプを導き出すためには使用されなかったが、この分類は、予後に重要であることを証明している。固有遺伝子スクリーニングを使用して、乳癌を様々なサブタイプに分類することができる。乳癌の主要な固有サブタイプは、管腔Ａ（ＬｕｍＡ）、管腔Ｂ（ＬｕｍＢ）、ＨＥＲ２高発現（Ｈｅｒ−２−Ｅ）、基底様及び正常様と呼ばれる。

【0021】

ＰＡＭ５０遺伝子発現アッセイ（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、Parker et al. J Clin Oncol., 27(8):1160-7 (2009)及び国際公開ＷＯ２００９／１５８１４３）は、標準的なホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織から固有サブタイプを同定することができる。この方法は、教師付きアルゴリズム（supervised algorithm）を使用して乳癌固有サブタイプに従って対象サンプルを分類する。このアルゴリズムは、本明細書ではＰＡＭ５０分類モデルと呼ばれ、乳癌固有サブタイプの分類に優れているとして本明細書で同定された、固有遺伝子の指定サブセットの遺伝子発現プロフィールに基づいている。この遺伝子のサブセット及びそれらの検出専用のプライマーが表１に示されている。

【0022】

【表1-1】

【0023】

【表1-2】

【0024】

【表1-3】

【0025】

【表1-4】

【0026】

表２は、表１のＰＡＭ５０遺伝子の選択配列を示す。

【0027】

表２

【表2-1】

【0028】

【表2-2】

【0029】

【表2-3】

【0030】

【表2-4】

【0031】

【表2-5】

【0032】

【表2-6】

【0033】

【表2-7】

【0034】

【表2-8】

【0035】

【表2-9】

【0036】

【表2-10】

【0037】

【表2-11】

【0038】

【表2-12】

【0039】

【表2-13】

【0040】

【表2-14】

【0041】

【表2-15】

【0042】

【表2-16】

【0043】

【表2-17】

【0044】

【表2-18】

【0045】

【表2-19】

【0046】

【表2-20】

【0047】

【表2-21】

【0048】

【表2-22】

【0049】

【表2-23】

【0050】

【表2-24】

【0051】

【表2-25】

【0052】

【表2-26】

【0053】

【表2-27】

【0054】

【表2-28】

【0055】

【表2-29】

【0056】

【表2-30】

【0057】

【表2-31】

【0058】

【表2-32】

【0059】

【表2-33】

【0060】

【表2-34】

【0061】

【表2-35】

【0062】

【表2-36】

【0063】

【表2-37】

【0064】

【表2-38】

【0065】

【表2-39】

【0066】

発現についてアッセイされるかもしれない遺伝子のサブセットには、表２で列挙した遺伝子のうちの少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも１６種類、少なくとも１７種類、少なくとも１８種類、少なくとも１９種類、少なくとも２０種類、少なくとも２１種類、少なくとも２２種類、少なくとも２３種類、少なくとも２４種類、少なくとも２５種類、少なくとも２６種類、少なくとも２７種類、少なくとも２８種類、少なくとも２９種類、少なくとも３０種類、少なくとも３１種類、少なくとも３２種類、少なくとも３３種類、少なくとも３４種類、少なくとも３５種類、少なくとも３６種類、少なくとも３７種類、少なくとも３８種類、少なくとも３９種類、少なくとも４０種類、少なくとも４１種類、少なくとも４２種類、少なくとも４３種類、少なくとも４４種類、少なくとも４５種類、少なくとも４６種類、少なくとも４７種類、少なくとも４８種類、少なくとも４９種類又は５０種類すべてが含まれる。

【0067】

遺伝子セットは、増殖に関する既知のマーカーである多くの遺伝子を含む。本発明の方法は、増殖シグネチャーを提供する遺伝子のサブセットの測定を提供する。本発明の方法は、少なくとも１種類の増殖遺伝子の発現を測定することを含み得る。好ましくは、少なくとも１種類の増殖の遺伝子とは、表１又は表２で列挙したうちの少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも１６種類、少なくとも１７種類、少なくとも１８種類、少なくとも１９種類、少なくとも２０種類、又は少なくとも２１種類の遺伝子である。

【0068】

本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ１、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＮＴＣ２、ＭＥＬＫ、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＯＲＣ６Ｌ、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ及び／又はＵＢＥ２Ｔから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子から成る２１種類の遺伝子サブセットのうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。
本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ１、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＮＴＣ２、ＭＥＬＫ、ＭＫＩ６７、ＯＲＣ６Ｌ、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ及び／又はＵＢＥ２Ｔから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子から成る１９種類の遺伝子サブセットのうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。
本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＣＣＮＥ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ６、ＣＤＣＡ１、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＥＸＯ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＮＴＣ２、ＭＥＬＫ、ＭＫＩ６７、ＯＲＣ６Ｌ、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ及び／又はＵＢＥ２Ｔから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子から成る１９種類の遺伝子サブセットのうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。
本発明の方法は、から選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子から成る１８種類の遺伝子サブセットのうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。
本発明の方法は、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣＡ１／ＮＵＦ２、ＣＥＰ５５、ＫＮＴＣ２／ＮＤＣ８０、ＭＫＩ６７、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ及び／又はＵＢＥ２Ｃから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子から成る１１種類の遺伝子サブセットのうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。
本発明の方法は、ＡＮＬＮ、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＰ５５、ＫＩＦ２Ｃ、ＭＫＩ６７、ＭＹＢＬ２、ＲＲＭ２及び／又はＵＢＥ２Ｃから選択されるＰＡＭ５０固有遺伝子から成る１０種類の遺伝子サブセットのうちの少なくとも１種類、それらの組み合わせ、又はそのそれぞれの発現を測定することを含み得る。

【0069】

生物学的サンプルの増殖シグネチャーを決定する方法は、Nielsen et al. Clin. Cancer Res., 16(21):5222-5232 (2009)と補足のオンラインコンテンツ及び（オンラインで刊行された）Bastien et al. BMC Medical Genomics, 5:44 (2012)と補足のオンラインコンテンツ（これらの文書は、それらの全体を参照により本明細書中に援用する）。

【0070】

本発明は、対象からの乳癌サンプルの増殖シグネチャー（増殖スコア又はｐ−スコアとも呼ばれ、これらの用語は本明細書中で互換的に利用される）を決定する方法を提供する。表１で列挙した遺伝子のうちの１種類以上の発現は、当該技術分野で既知の方法、及び本明細書中に記載した方法を使用して測定され、そして、対照ハウスキーピング遺伝子（すなわち、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭｌ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰＯ、及びＴＦＲＣ）に対して正規化され得る。好ましくは、表１の１若しくは複数の遺伝子は、本明細書中に記載したように、増殖に関して知られている遺伝子のサブセット（例えば、細胞周期を調節する遺伝子、Bastien et al., BMC Medical Genomics 5:44-, 2012を参照のこと）である。任意に、遺伝子発現はまた、サンプルと対照サンプルの間のそれぞれの遺伝子の比を測定することによって対照サンプルに対して正規化され得る。当該技術分野で知られている任意の対照サンプルが利用され得るが、１つの代表的な対照サンプルは、既知濃度のそれぞれの遺伝子の試験管内転写ＲＮＡ配列を含んでいる。それぞれの増殖遺伝子の対数比の平均値又は正規化値が、サンプルの平均増殖遺伝子発現を決定するために計算され得る。増殖シグネチャーは、例えば、１〜１０（例えば、図４）の範囲に対して計算した平均遺伝子発現をスケーリングすることによって決定できるが、そのスケーリングは、参照サンプルセットによって決定される。増殖シグネチャーの最低値は、参照サンプルセットで最も低い増殖シグネチャーに相当し、そして、増殖シグネチャーの最高値は、最も高い増殖シグネチャーに相当するので、サンプルの増殖シグネチャーは、参照サンプルセットの最高値と最低値の間の線形補間によって決定できる。

【0071】

参照サンプルセットは、それぞれのサンプルの増殖シグネチャーが前掲に記載したように測定された乳癌サンプルの集団である。参照サンプルセットは、そのセットが、統計的有意性を有する臨床的変数、例えば、処置計画に対する応答、エストロゲン受容体の状態、及び腫瘍の大きさを評価できる位に十分なサイズがなければならない。一部の実施形態では、参照サンプルセットは、乳癌と診断された対象からの原発性乳癌組織又は整復乳房形成や非癌性乳房組織からの「正常な」乳房組織サンプルを含む。これらのサンプルは、本明細書中に記載したＰＡＭ５０分類モデルを使用することで、特定の乳癌固有サブタイプ、例えば、管腔Ａ、管腔Ｂ、基底様、及びＨｅｒ２に分類できる。例えば、参照サンプルセットは、少なくとも１００個のサンプル、少なくとも２００個のサンプル、少なくとも３００個のサンプル、少なくとも４００個のサンプル、少なくとも５００個のサンプル、少なくとも６００個のサンプル、少なくとも７００個のサンプル、少なくとも８００個のサンプル、少なくとも９００個のサンプル、又は少なくとも１０００個のサンプルを含む。好ましくは、参照サンプルセットは、少なくとも５００個のサンプルを含む。

【0072】

参照サンプルセット中のそれぞれの参照サンプルの増殖シグネチャーは、最低から最高まで、例えば、１から１０まで配列され得る。そして、増殖シグネチャーによって配列された時点で、参照サンプルセットは部分範囲に分割されるが、それぞれの部分範囲は参照セットの非重複部分である。サンプルの増殖シグネチャーは、参照サンプルセットと比較され得る。これらの部分範囲は、低い増殖シグネチャーのカットオフ閾値制限を決定するのに使用される。例えば、部分範囲は、配列された参照サンプルセットの増殖シグネチャーの５０％、３３％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％であり得る。部分範囲の数に関係なく、サンプルの増殖シグネチャーは、それが参照サンプルセットの最も低い部分範囲内に存在している場合には、低い増殖シグネチャーであると考えられる。例えば、参照サンプルセットが３つの部分範囲に分割される場合、サンプルの増殖シグネチャーが配列された参照サンプルセットの増殖スコアの最も低い３３％の範囲内に存在しているのであれば、低い増殖シグネチャーの分類に割り当てられる。

【0073】

定義

【0074】

本開示において、「乳癌」は、例えば、生検又は組織学によって悪性病変として分類される状態を含む。乳癌診断の臨床的描写は医学の分野で周知である。当業者であれば、乳癌が、例えば、癌腫及び肉腫を含む乳房組織のあらゆる悪性腫瘍を指すことを理解されよう。乳癌の特定の具体例は、非浸潤性腺管癌（ductal carcinoma in situ）（ＤＣＩＳ）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、又は粘液性癌腫を含む。乳癌はまた、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）、又は浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）も指す。本開示の殆ど実施形態では、目的の対象は、乳癌の疑いのあるヒト患者、又は実際に乳癌と診断されたヒト患者である。

【0075】

本開示において、「タキサン又はタキサン誘導体」は、ジテルペン、すなわち、イチイ（Taxus）属の植物（yews）によって製造される、癌化学療法に使用される薬物のクラスである。これらの薬物は、乳癌を含む多様な癌を処置するために使用される。しかしながら、このクラスの薬物は、極めて毒性が強く、著しく有害な副作用をもたらす。タキサン又はタキサン誘導体は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））又はドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））を含む。

【0076】

本開示において、「タキサン又はタキサン誘導体を含む乳癌処置」は、タキサン又はタキサン誘導体を含む乳癌の処置である。これらの処置は、他の抗癌剤も含み得る。これらの他の作用物質は、アントラサイクリン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0077】

本開示において、「タキサン又はタキサン誘導体を含まない乳癌処置」は、タキサン又はタキサン誘導体を一切含まない乳癌の処置である。これらの処置は、他の抗癌剤を含む。

【0078】

好ましくは、タキサン及びタキサン誘導体は、静脈内に投与されるが、当該技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。タキサン又はタキサン誘導体は、約７５ｍｇ／ｍ²〜約３００ｍｇ／ｍ²、好ましくは約７５ｍｇ／ｍ²〜約１７５ｍｇ／ｍ²、及び最も好ましくは約１００ｍｇ／ｍ²の投薬量で投与され得る。投薬量が、約１〜約２４時間又は１週間（５〜７日）にわたって投与されるのが好ましい。投薬量が、１〜約４週間以上、好ましくは約２〜約３週間繰り返され得る。好ましくは、投与計画は、６０分の静脈内注射によって投与されるパクリタキセルの１週間コース８回である。

【0079】

好ましくは、アントラサイクリンは、静脈内に投与するが、当該技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。アントラサイクリンは、１週間あたり１０ｍｇ／ｍ²〜３００ｍｇ／ｍ²の投薬量で投与され得る。アントラサイクリンは、１週間あたり２０〜２００ｍｇ／ｍ²、３０〜１００ｍｇ／ｍ²、又は３５〜７５ｍｇ／ｍ²で投与され得る。好ましくは、アントラサイクリンは、１週間あたり約６０ｍｇ／ｍ²で投与される。アントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン及びミトキサントロンを含む。

【0080】

好ましくは、５−フルオロウラシルは、静脈内投与されるが、当分野で公知の任意の方法によって投与することもできる。５−フルオロウラシルは、１週間に２５ｍｇ／ｍ²〜１０００ｍｇ／ｍ²の用量で投与することができる。５−フルオロウラシルは、１週間に５０ｍｇ／ｍ²〜９００ｍｇ／ｍ²、１００ｍｇ／ｍ²〜８００ｍｇ／ｍ²、３００ｍｇ／ｍ²〜７００ｍｇ／ｍ²、又は４５０ｍｇ／ｍ²〜６５０ｍｇ／ｍ²で投与することができる。好ましくは、５−フルオロウラシルは、１週間に約５００ｍｇ／ｍ²で投与される。

【0081】

好ましくは、シクロホスファミドは、経口投与されるが、当分野で公知の任意の方法によって投与することもできる。シクロホスファミドは、１日に１０ｍｇ／ｍ²〜３００ｍｇ／ｍ²の用量で投与することができる。シクロホスファミドは、１日に２０ｍｇ／ｍ²〜２００ｍｇ／ｍ²、３０ｍｇ／ｍ²〜１００ｍｇ／ｍ²、又は４０ｍｇ／ｍ²〜８０ｍｇ／ｍ²で投与することができる。好ましくは、シクロホスファミドは、１日に約７５ｍｇ／ｍ²で投与される。

【0082】

タキサン又はタキサン誘導体、アントラサイクリン、５−フルオロウラシル及び／又はシクロホスファミドを投与するための方法、スケジュール、及び投薬量は、Martin et al., J Natl Cancer Inst. 100(11):805-14, 2008に記載され、そしてそれは、全体を参照により本明細書中に援用する。

【0083】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書で使用される。一例として、「ある要素」は、１つ以上の要素を意味する。

【0084】

本明細書を通して、語「含む（comprising）」又は語尾変化、例えば、「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」は、述べられた要素、整数、又はステップ、或いは一群の要素、複数の整数、又は複数のステップを含むが、他の要素、整数、又はステップ、或いは他の一群の要素、複数の整数、又は複数のステップを除外することを意味するのではないことを理解されたい。

【0085】

臨床的変数

【0086】

本明細書に説明されているように、多数の臨床乳癌因子及び予後乳癌因子は、当分野で公知であり、治療結果及び疾患の再発の可能性を予測するために使用される。このような因子は、例えば、リンパ節転移、腫瘍サイズ、組織学的グレード、エストロゲン及びプロゲステロンホルモン受容体の状態、ＨＥＲ−２レベル、及び腫瘍倍数性を含む。一実施形態では、再発のリスク（ＲＯＲ）スコアは、乳癌と診断された対象又は乳癌の疑いがある対象に対して付与される。このスコアは、リンパ節の状態（Ｎ）及び腫瘍サイズ（Ｔ）の臨床因子と組み合わせてＰＡＭ５０分類モデルを使用する。臨床的変数の評価は、乳癌の病期分類用の対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）標準システムに基づいている。このシステムでは、原発腫瘍サイズは、０〜４の等級（Ｔ０：原発腫瘍の証拠がない；Ｔ１：＜２ｃｍ；Ｔ２：＞２ｃｍ−＜５ｃｍ；Ｔ３：＞５ｃｍ；Ｔ４：胸壁又は皮膚に直接転移したあらゆるサイズの腫瘍）に分類される。リンパ節の状態は、Ｎ０〜Ｎ３（Ｎ０：局所リンパ節が転移していない；Ｎ１：移動可能な同側腋窩リンパ節（複数可）への転移；Ｎ２：互いに又は他の構造に固定された同側リンパ節（複数可）への転移；Ｎ３：胸骨下の同側リンパ節への転移）として分類される。乳癌患者の識別方法及び疾患の病期分類方法は、周知であり、指診、生検、患者の病歴及び／又は家族歴の精査、及びイメージング技術、例えば、マンモグラフィー、磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）、及びポジトロン放射型断層撮影法（ＰＥＴ）を含み得る。

【0087】

サンプルの起源

【0088】

本開示の一実施形態では、乳癌サブタイプは、１つ以上の対象サンプルにおける表１に列記されている固有遺伝子の発現パターン又は発現プロフィールの評価によって評価される。考察において、用語、対象又は対象サンプルは、健常及び／又は疾患状態を問わない個体を指す。対象は、対象、試験参加者、コントロール対象、スクリーニング対象、又はサンプルが採取されて本開示の文脈で評価される他のクラスの個体とすることができる。したがって、対象は、乳癌と診断され得る、乳癌の１つ以上の症状又は素因、例えば、家族歴（遺伝的）因子若しくは病歴（医学的）因子を示し得る、乳癌の処置又は療法を受け得る、又は同様のものであり得る。或いは、対象は、いずれかの上記の因子又は基準に対して健常であり得る。本明細書で使用される用語「健常」は、あらゆる絶対評価又は状態に一致するように定義できないため、用語「健常」は乳癌の状態に対して相対的であることを理解されたい。したがって、あらゆる指定の疾患又は疾患基準に対して健常として定義される個体は、実際に他の１つ以上の疾患と診断されても良いし、又は乳癌以外の１つ以上の癌を含め、他の１つ以上の疾患基準を示しても良い。しかしながら、健常コントロールは、好ましくは、他の癌に罹患していない。

【0089】

特定の実施形態では、乳癌固有サブタイプを予測する方法は、癌細胞又は組織を含む生物学的サンプル、例えば、乳房組織サンプル又は原発性乳房腫瘍組織サンプルを採取することを含む。「生物学的サンプル」とは、固有遺伝子の発現を検出できる細胞、組織、又は体液の任意の抽出見本のことである。このような生物学的サンプルの例は、限定されるものではないが、生検又は塗沫標本である。本開示に有用な体液は、血液、リンパ液、尿、唾液、乳頭吸引液、婦人科液体、又は他の分泌液、又はそれらの派生物を含み得る。血液は、全血、血漿、血清、又は血液の任意の派生物を含み得る。一部の実施形態では、生物学的サンプルは、乳房細胞、特に生検による乳房組織、例えば、乳房腫瘍組織サンプルを含む。生物学的サンプルは、例えば、ある部位の擦り取り若しくは拭き取り、針を使用した細胞若しくは体液の吸引、又は組織サンプルの除去（すなわち、生検）を含む様々な技術によって対象から得ることができる。様々な生物学的サンプルを採取する方法は、当分野で周知である。一部の実施形態では、乳房組織サンプルは、例えば、微細針吸引生検、針生検、又は切除生検によって得られる。標本の保存及び検査を容易にするために、細胞又は組織を固定液及び染色液に浸漬する。生物学的サンプル、特に乳房組織サンプルは、顕微鏡下で観察するためにスライドガラスに移すことができる。一実施形態では、生物学的サンプルは、ホルマリン固定されたパラフィン包埋乳房組織サンプル、特に原発性乳房腫瘍サンプルである。様々な実施形態では、組織サンプルは、病理医によってガイドされた組織コアサンプルから得られる。

【0090】

発現プロファイリング

【0091】

様々な実施形態では、本開示は、対象の乳癌を分類する方法、予後を判定する方法、又は監視する方法を提供する。この実施形態では、固有遺伝子の発現の分析から得られるデータを、１つ以上のパターン認識アルゴリズムを用いて評価する。このような分析方法を使用して、予測モデルを形成することができ、この予測モデルを用いて試験データを分類することができる。例えば、特に有効な１つの便利な分類方法は、多変量統計解析モデリングを利用し、先ず既知のサブタイプのサンプル（例えば、特定の乳癌固有サブタイプ：ＬｕｍＡ、ＬｕｍＢ、基底様、ＨＥＲ２高発現、又は正常様を有する既知の対象に由来する）からデータ（「モデリングデータ」）を用いてモデル（「予測数学モデル」）を作成し、次いでサブタイプに従って未知のサンプル（例えば、「試験サンプル」）を分類する。パターン認識方法は、例えば、言語学、フィンガープリンティング、化学、及び心理学に及ぶ多くの異なる種類の問題を特徴付けるために広く使用されている。本明細書で説明される方法の文脈では、パターン認識は、パラメトリック及びノンパラメトリックの両方の多変量統計学を使用してデータを解析し、これによりサンプルを分類し、そして一連の観察された測定値に基づいて一部の従属変数の値を予測する。２つの主な手法がある。１組の方法は、「教師なし」と呼ばれ、これらは、データの複雑さを合理的な方法で単純に緩和すると共に、人間の眼で解釈できる表示プロットを作成する。しかしながら、このタイプの手法は、予測アルゴリズムの訓練に使用される初期のサンプル集団とは独立した対象に由来するサンプルを分類するために使用することができる臨床アッセイの開発には適していないであろう。

【0092】

もう１つの手法は、「教師付き」と呼ばれ、クラス又は結果が既知であるサンプルの訓練セットを使用して数学モデルを作成し、次いで独立バリデーションデータセットを用いて評価する。ここで、固有遺伝子発現データの「訓練セット」を用いて、各サンプルの「サブタイプ」を正確に予測する統計モデルを構築する。次いで、この訓練セットを独立データ（試験セット又はバリデーションセットと呼ぶ）で試験してコンピュータベースのモデルの頑強性を決定する。これらのモデルは、時には「エキスパートシステム」と呼ばれることもあるが、一連の異なる数学的手順に基づいても良い。教師付き方法は、次元が下げられたデータセット（例えば、最初の２、３の主成分）を使用することができるが、典型的には、次元が下げられていない全次元のデータを使用する。どの場合でも、この方法は、固有遺伝子発現プロフィールに関して各サブタイプを特徴付けて区別する多変量境界の定量的記述を可能にする。また、任意の予測、例えば、適合度に当てはめられる確率のレベルに対する信頼限界を得ることも可能である。予測モデルの頑強性はまた、選択されるサンプルを分析から除外することによって、クロス確認を用いてチェックすることもできる。

【0093】

本明細書で説明されるＰＡＭ５０分類モデルは、表１に列記されている固有遺伝子を用いた、複数の対象サンプルの遺伝子発現プロフィールに基づいている。複数のサンプルは、各サブタイプクラスに属する対象に由来する十分な数のサンプルを含む。この文脈における「十分なサンプル」又は「代表的な数」とは、各サブタイプをその群の他のサブタイプから確実に区別できる分類モデルを構築するのに十分である、各サブタイプに由来するサンプルの数のことである。教師付き予測アルゴリズムは、このアルゴリズムを「訓練する」ための客観的に選択されるプロトタイプサンプルのプロフィールに基づいて開発されている。サンプルは、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる国際公開ＷＯ２００７／０６１８７６に開示されている方法に従って拡大固有遺伝子セットを用いて選択され、サブタイプに分類される。或いは、サンプルは、乳癌のサブタイプを分類するための任意の既知のアッセイに従ってサブタイプに分類することができる。サブタイプに従って訓練サンプルを階層化した後、セントロイドをベースとする予測アルゴリズムを用いて、表１に記載されている固有遺伝子の発現プロフィールに基づいてセントロイドを作成する。

【0094】

一実施形態では、予測アルゴリズムは、参照によりその全容が本明細書に組み入れられるNarashiman and Chu (2002) PNAS 99:6567-6572に記載されているものに関連した最短セントロイド法である。本開示では、この方法は、各サブタイプについての標準セントロイドを計算する。このセントロイドは、各サブタイプ（又は「クラス」）における各遺伝子の平均遺伝子発現をその遺伝子のクラス内の標準偏差で除算した値である。最短セントロイド分類は、新たなサンプルの遺伝子発現プロフィールを取り出して、このプロフィールをこれらのクラスの各セントロイドと比較する。サブタイプ予測は、５つのセントロイドに対して各テストケースのスペアマンの順位相関を計算し、次いで最短セントロイドに基づいてサンプルをサブタイプに割り当てることによって行われる。

【0095】

固有遺伝子発現の検出

【0096】

表１に列記されている固有遺伝子の発現を検出するための、当分野で利用可能なすべての方法が本明細書に含まれる。「発現の検出」とは、固有遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の量又は存在を決定することである。本開示の固有遺伝子の発現を検出する方法、すなわち遺伝子発現プロファイリングは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析をベースとする方法、ポリヌクレオチドの配列決定をベースとする方法、免疫組織化学法、及びプロテオミクスをベースとする方法を含む。これらの方法は、一般に、表１に列記されている固有遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）を検出する。好ましい実施形態では、ＰＣＲをベースとする方法、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Weis et al., TIG 8:263- 64, 1992）、及びアレイをベースとする方法、例えば、マイクロアレイ（Schena et al., Science 270:467- 70, 1995）が使用される。「マイクロアレイ」とは、ハイブリダイズ可能なアレイ要素、例えば、ポリヌクレオチドプローブなどが基板上に規則的に配置されたもののことである。用語「プローブ」は、特に意図する標的生体分子、例えば、固有遺伝子によってコードされるか、又は固有遺伝子に対応するヌクレオチド転写物又はタンパク質に選択的に結合できるあらゆる分子を指す。プローブは、当業者が合成することもできるし、又は適切な生物学的標本から得ることもできる。プローブは、標識するように特別に設計することができる。プローブとして利用できる分子の例には、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が含まれる。

【0097】

多くの発現検出法は、単離ＲＮＡを使用する。開始材料は、典型的には、生物学的サンプル、例えば、腫瘍又は腫瘍細胞株及び対応する正常組織又は細胞株から単離された全ＲＮＡである。ＲＮＡ源が、原発性腫瘍である場合は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、凍結又は保管されたパラフィン包埋されて固定（例えば、ホルマリン固定）された組織サンプル（例えば、病理医によってガイドされた組織コアサンプル）から抽出することができる。

【0098】

ＲＮＡ抽出の一般的な方法は、当分野で周知であり、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999を含む分子生物学の標準的な教科書に記載されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出の方法は、例えば、Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67, (1987); and De Andres et al. Biotechniques 18:42-44, (1995)に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、商業製造業者、例えば、Qiagen（Valencia, CA）社の精製キット、緩衝液セット、及びプロテアーゼを用いて、商業製造業者の説明書に従って行うことができる。例えば、培養細胞由来の全ＲＮＡを、Qiagen社のＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットには、MASTERPURE（商標）ＤＮＡ及びＲＮＡ完全精製キット（Epicentre, Madison, Wis.）及びパラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ambion, Austin, TX）が含まれる。組織サンプル由来の全ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Tel-Test, Friendswood, TX）を用いて単離することができる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離することができる。加えて、多数の組織サンプルを、当業者に周知の技術、例えば、Chomczynskiの単一ステップＲＮＡ単離プロセス（米国特許第４，８４３，１５５号）などを用いて容易に処理することができる。単離ＲＮＡは、限定されるものではないが、ＰＣＲ分析及びプローブアレイを含むハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに用いることができる。ＲＮＡレベルを検出する１つの方法では、検出され多遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）に単離ＲＮＡを接触させる。核酸分子プローブは、例えば、完全長ｃＤＮＡ、又は本開示の固有遺伝子又は任意のＤＮＡ若しくはＲＮＡ誘導体にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分である完全長ｃＤＮＡの一部、例えば、少なくとも７、１５、３０、６０、１００、２５０、若しくは５００のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとすることができる。ｍＲＮＡのプローブとのハイブリダイゼーションは、目的の固有遺伝子が発現されていることを示す。一実施形態では、ｍＲＮＡを固体表面に固定し、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲルに流してこのｍＲＮＡをゲルから膜、例えば、ニトロセルロースに移してプローブに接触させる。代替の実施形態では、プローブを固体表面に固定し、ｍＲＮＡを、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ遺伝子チップアレイのプローブに接触させる。熟練技術者であれば、既知のｍＲＮＡ検出法を本開示の固有遺伝子の発現レベルの検出に用いるために容易に適応させることができる。

【0099】

サンプルにおける固有遺伝子発現産物のレベルを決定する代替の方法では、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Barany, PNAS USA 88: 189-93, (1991)）、自己持続配列複製法（self sustained sequence replication）（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 1874-78, (1990)）、転写増幅システム（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 86: 1173-77, (1989)）、Ｑベータレプリカーゼ法（Lizardi et al., Bio/Technology 6:1197, (1988)）、ローリングサークル複製法（米国特許第５，８５４，０３３号）又は任意の他の核酸増幅法による核酸増幅プロセスが行われ、続いて当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出が行われる。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少ない数量で存在する場合には、核酸分子の検出に特に有用である。

【0100】

本開示の特定の態様では、固有遺伝子発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって評価される。多種多様なＰＣＲ又はＱＰＣＲプロトコルが当分野で公知であり、このようなプロトコルは、以下に例示され、表１に列記されている固有遺伝子の検出及び／又は定量に直接使用することもできるし、又はここで説明される組成物を用いて使用するように適応させることもできる。一般に、ＰＣＲでは、標的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー又は一対のオリゴヌクレオチドプライマーとの反応によって増幅される。プライマー（複数可）は、標的核酸の相補領域にハイブリダイズし、そしてＤＮＡポリメラーゼが、プライマー（複数可）を伸長させて標的配列を増幅させる。ポリメラーゼをベースとする核酸増幅産物を提供するのに十分な条件下で、１つのサイズの核酸断片が、反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）の大部分を占める。増幅サイクルを繰り返して、１つの標的ポリヌクレオチド配列の濃度を上昇させる。この反応は、ＰＣＲに一般的に使用される任意のサーモサイクラーで行うことができる。しかしながら、好ましくは、リアルタイム蛍光測定性能を有するサイクラー、例えば、ＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Cepheid,Sunnyvale CA）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（登録商標）（Applied Biosystems,Foster City,Calif.）、ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）（Corbett Research,Sydney,Australia）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Roche Diagnostics Corp,Indianapolis,Ind.）、ＩＣＹＣＬＥＲ（登録商標）（Biorad Laboratories,Hercules,Calif.）、及びＭＸ４０００（登録商標）（Stratagene,La Jolla,Calif.）である。

【0101】

本開示の別の実施形態では、マイクロアレイが発現プロファイリングに使用される。マイクロアレイは、様々な実験間での再現性から、特にこの目的に適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時測定する１つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に取り付けられた捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識ＲＮＡ又はＤＮＡが、アレイ上の相補プローブにハイブリダイズし、次いでレーザー走査によって検出される。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が決定され、相対遺伝子発現レベルを表す定量値に変換される。例えば、米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号、及び同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、及び同第６，３４４，３１６号を参照されたい。サンプルにおける多数のＲＮＡの遺伝子発現プロフィールの決定には、高密度オリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。

【0102】

好ましい実施形態では、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムを用いて固有遺伝子発現を検出する。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムの原理は、アッセイされる各核酸標的に割り当てられた一意のコードである（それぞれ参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９９５９及びGeiss et al. Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325）。このコードは、アッセイされる各標的の一意のバーコードを作成する整列した一連の着色蛍光スポットから構成される。一対のプローブが、各ＤＮＡ又はＲＮＡ標的用に設計され、ビオチン化捕捉プローブ及びレポータープローブが、蛍光バーコードを備えている。このシステムは、本明細書では、ナノレポーターコードシステムとも呼ばれる。

【0103】

特定のレポーター及び捕捉プローブを、各標的について合成する。簡単に述べると、配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、コード特異的レポーター分子に付着する。捕捉プローブは、各標的に対する第２の配列特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドをビオチンを含むユニバーサルオリゴヌクレオチド（universal oligonucleotide）に結合することによって形成される。レポータープローブ及び捕捉プローブはすべて、１つのハイブリダイゼーション混合物、すなわち「プローブライブラリー」に集められる。

【0104】

各標的の相対的存在量を、１回の多重ハイブリダイゼーション反応で測定する。サンプルをプローブライブラリーと組み合わせて、溶液中でハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後、３部分ハイブリダイズ複合体を、捕捉プローブ及びレポータープローブに存在するユニバーサル配列に相補的なオリゴヌクレオチドに連結された磁気ビーズを用いて２段階処置で精製する。この二重精製プロセスにより、標的特異的プローブが過剰に存在する状態でハイブリダイゼーション反応が完了するが、これらのプローブは最終的に除去され、従ってサンプルの結合及びイメージングは妨げられない。ハイブリダイゼーション後のステップはすべて、カスタム液体処理ロボット（Prep Station,NanoString Technologies）でロボット制御で行われる。

【0105】

精製反応物を、Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎによってサンプルカートリッジの個々のフローセル内に入れ、捕捉プローブを介してストレプトアビジン被覆表面に結合させ、電気泳動させてレポータープローブを伸ばし、そして固定する。処理後、サンプルカートリッジを、完全に自動化されたイメージング／データ収集装置（Digital Analyzer,NanoString Technlogies）に移す。標的の発現レベルを、各サンプルをイメージングしてその標的のコードが検出された回数をカウントすることによって測定する。各サンプルに対して、典型的には、６００視野（ＦＯＶ）がイメージングされ（１３７６×１０２４ピクセル）、約１０ｍｍ²の結合表面を表す。典型的なイメージング密度では、多重化、入力サンプルの量、及び標的全体の存在度によって、１視野当たり１００〜１２００のレポーターがカウントされる。データは、各サンプルについて各標的当たりのカウント数を列記する単純な表計算形式で出力される。

【0106】

このシステムは、ナノレポーターと共に使用することができる。ナノレポーターに関するさらなる開示は、それぞれ参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられる、国際公開ＷＯ０７／０７６１２９及びＷＯ０７／０７６１３２で確認することができる。さらに、用語、核酸プローブ及びナノレポーターは、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる国際公開ＷＯ２０１０／０１９８２６に開示されている合理的に設計されたもの（例えば、合成配列）を含み得る。

【0107】

データ処理

【0108】

多くの場合、例えば、欠測データのアドレス指定、変換、スケーリング、正規化、重み付けなどによって遺伝子発現データを前処理することが有用である。多変量投影法、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）及び部分最小二乗法（ＰＬＳ）は、いわゆるスケーリング高感度法（scaling sensitive method）と呼ばれる。試験データの種類についての従来の知識及び経験を使用することにより、多変量モデリングの前のデータの質を、スケーリング及び／又は重み付けによって向上させることができる。十分なスケーリング及び／又は重み付けにより、データ内に隠れている重要で興味深い変動を明らかにすることができ、従って後続の多変量モデリングをより効率的にすることができる。スケーリング及び重み付けを使用して、試験したシステムの知識及び経験に基づいてデータを正しい測定基準（correct metric）にし、これによりデータに元々存在するパターンを明らかにする。

【0109】

可能であれば、欠測データ、例えば、列の値における空白を回避するべきである。しかしながら、必要に応じて、このような欠測データを、例えば、列の平均値（「平均値充当」）；乱数値（「乱数値充当」）；又は主成分分析に基づいた値（「主成分値充当」）で置き換える又は「充当する」ことができる。

【0110】

記述子座標軸の「変換」が有用であり得る。このような変換の例には、正規化及び平均センタリングが含まれる。「正規化」を使用してサンプル間のばらつきを排除することができる。マイクロアレイデータの場合、正規化プロセスは、２つの標識色素の蛍光強度を釣り合わせることによってシステムエラーを排除することを目的とする。色素の偏りは、色素標識効率の差異、熱感度及び光感受性、ならびに２つのチャネルを走査するためのスキャナ設定を含む様々な源から生じ得る。正規化因子を計算するために一般的に使用されている一部の方法は、（ｉ）アレイ上のすべての遺伝子を使用する全正規化；（ｉｉ）常に発現されるハウスキーピング／不変遺伝子を使用するハウスキーピング遺伝子の正規化；及び（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション中に添加される既知量の外来制御遺伝子を使用する内部コントロール正規化を含む（Quackenbush Nat. Genet. 32 (Suppl.), 496-501 (2002)）。一実施形態では、本明細書に開示される固有遺伝子を正規化してハウスキーピング遺伝子を制御することができる。例えば、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００８／００３２２９３号に記載されているハウスキーピング遺伝子を正規化に使用することができる。例示的なハウスキーピング遺伝子には、ＭＲＰＬ１９、ＰＳＭＣ４、ＳＦ３Ａ１、ＰＵＭｌ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤ、ＧＵＳＢ、ＲＰＬＰＯ、及びＴＦＲＣが含まれる。当業者であれば、本明細書に開示される方法が、特定のハウスキーピング遺伝子に対する正規化に縛られるものではなく、当分野で公知の任意の適切なハウスキーピング遺伝子（複数可）を使用できることを理解されよう。

【0111】

多数の正規化手法が可能であり、このよう正規化手法は、分析における任意のいくつかの点で適用できる場合が多い。一実施形態では、マイクロアレイデータは、ＬＯＷＥＳＳ法を用いて正規化され、このＬＯＷＥＳＳ法は、全局所的重み付け散布図平滑正規化関数（global locally weighted scatterplot smoothing normalization function）である。別の実施形態では、ｑＰＣＲデータは、複数のハウスキーピング遺伝子のセットの幾何平均に対して正規化される。

【0112】

解釈を簡単にするために、「平均センタリング」を使用することもできる。通常、各記述子に対して、すべてのサンプルの記述子の平均値が減算される。この方法では、記述子の平均値が、原点に一致し、すべての記述子が、０に「中心」が合わされている。「単位分散スケーリング（unit variance scaling）」では、データを、同等の分散にスケーリングすることができる。通常、各記述子の値は、１／ＳｔＤｅｖによってスケーリングされ、ＳｔＤｅｖは、すべてのサンプルに対する記述子の標準偏差である。「パレートスケーリング」は、ある意味で、平均センタリングと単位分散スケーリングとの間の中間である。パレートスケーリングでは、各記述子の値は、ｌ／ｓｑｒｔ（ＳｔＤｅｖ）によってスケーリングされ、ＳｔＤｅｖは、すべてのサンプルに対する記述子の標準偏差である。この方法では、各記述子は、その最初の標準偏差に数値的に等しい分散を有する。パレートスケーリングは、例えば、生データ又は平均センタリングデータに対して行うことができる。

【0113】

データが正のスキューを有する場合及び／又はデータが広範囲、例えば、数桁に跨る場合に解釈を容易にするために「対数スケーリング」を使用することができる。通常、各記述子に対して、値は、その値の対数に置き換えられる。「同等範囲スケーリング」では、各記述子は、すべてのサンプルの記述子の範囲によって除算される。この方法では、すべての記述子は、同じ範囲、すなわち１を有する。しかしながら、この方法は、外れ点の存在に影響される。「自動スケーリング」では、各データベクトルは、平均センタリングされ、単位分散スケーリングされる。この技術は、各記述子が等しく重み付けされ、大きい値と小さい値が等しい重要性で扱われるため、非常に有用である。これは、非常に低いが検出可能なレベルで発現される遺伝子にとって重要となることがある。

【0114】

一実施形態では、１つ以上の試験サンプルに関するデータが収集され、これらのデータが、本明細書で説明されるＰＡＭ５０分類モデルを用いて分類される。複数の分析からのデータを比較する（例えば、１つ以上の試験サンプルの発現プロフィールを、独立した試験で収集されて分析されたサンプルから構築されたセントロイドと比較する）場合、これらのデータセット全体に亘ってデータを正規化する必要がある。一部の実施形態では、これらのデータセットを一緒にするために距離重み付け区別（ＤＷＤ）が使用される（参照によりその全容が本明細書に組み入れられるBenito et al. (2004) Bioinformatics 20(1): 105-114）。ＤＷＤは、別々のデータセットに存在する系統的偏りを特定して、全体的に調整してこれらの偏りを補正することができる多変量解析ツールであり；本質的には、各別々のデータセットは、データポイントの多次元クラウド（multi-dimensional cloud）であり、ＤＷＤは、２つのポイントクラウドをとり、一方が他方により最適に重なるようにシフトさせる。

【0115】

本明細書で説明される方法は、この方法を実施することができ、かつ／又は結果を記録することができる任意の装置を用いて実施することができ、かつ／又は結果を記録することができる。使用できる装置の例には、限定されるものではないが、あらゆるタイプのコンピュータを含む電子計算装置が含まれ得る。本明細書で説明される方法が、コンピュータで実施され、かつ／又は記録される場合は、この方法のステップを実施するためのコンピュータを構成するために使用できるコンピュータプログラムを、このコンピュータプログラムを保存できる任意のコンピュータ可読媒体に保存することができる。使用できるコンピュータ可読媒体の例には、限定されるものではないが、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ならびに他のメモリ及びコンピュータ記憶装置が含まれる。この方法のステップを実施でき、かつ／又は結果を記録するためのコンピュータを構成するために使用できるコンピュータプログラムは、電子ネットワーク、例えば、インターネット、イントラネット、又は他のネットワークを介して提供することもできる。

【0116】

再発リスクの計算

【0117】

固有サブタイプの文脈内での乳癌の転帰、及び任意選択の他の臨床的変数を予測する方法が本明細書で提供される。転帰とは、全生存率又は疾患特異的生存率、イベントフリー生存率、又は特定の処置若しくは療法に応じた転帰のことである。特に、この方法は、長期に亘る無疾患生存確率を予測するために使用することができる。「乳癌患者の生存確率の予測」とは、原因となる乳癌の結果として患者が死亡するリスクを評価することである。「長期に亘る無疾患生存率」とは、最初の診断又は処置から少なくとも５年、少なくとも１０年又はより長い年数の期間内に原因となる乳癌で患者が死亡しないし、患者が乳癌を再発もしないことを意味する。

【0118】

一実施形態では、転帰は、サブタイプに従った対象の分類に基づいて予測される。この分類は、表１に列記されている固有遺伝子のリストを用いた発現プロファイリングに基づいている。サブタイプ割り当てを行うのに加えて、ＰＡＭ５０バイオインフォマティクスモデルは、試験サンプルの４つすべてのサブタイプに対する類似性の測定値を提供し、この測定値は、疾患状態及び処置選択肢にかかわらず、あらゆる患者集団にも使用できる再発リスク（ＲＯＲ）スコアに変換される。固有サブタイプ及びＲＯＲはまた、例えば、ネオアジュバントのタキサン及びタキサン又はタキサン誘導体化学療法（参照によりその全容が本明細書に組み入れられるRouzier et al., J Clin Oncol 23:8331-9 (2005)）で処置された女性における病理学的完全奏効の予測の値も提供する。したがって、本開示の様々な実施形態では、再発リスク（ＲＯＲ）モデルを使用して転帰を予測する。これらのリスクモデルを使用することにより、対象を、低リスク、中リスク、及び高リスク再発群に階層化することができる。ＲＯＲの計算は、処置の決定を導き、かつ／又は療法に対する応答を監視するために予後情報を提供することができる。

【0119】

本明細書で説明される一部の実施形態では、ＰＡＭ５０によって決定された固有サブタイプ及び／又は他の臨床パラメータの予後成績を、コックス比例ハザードモデル解析を利用して評価され、この解析は、ハザード比及びその信頼区間の推定を提供する生存データの回帰法である。このコックスモデルは、患者の生存と特定の変数との間の関係を利用する周知の統計技術である。この統計方法は、個体の予後変数（例えば、本明細書で説明される追加の臨床因子を有する、又は有しない固有遺伝子発現プロフィール）が与えられた個体のハザード（すなわち、リスク）の推定を可能にする。「ハザード比」とは、特定の予後変数を示す患者のいずれかの時点での死のリスクのことである。一般的には、Spruance et al., Antimicrob. Agents & Chemo. 48:2787-92 (2004)を参照されたい。

【0120】

本明細書で説明されるＰＡＭ５０分類モデルは、サブタイプ距離（又は相関）のみを用いて、又は上記説明された臨床的変数と共にサブタイプ距離を用いて再発のリスクについて訓練することができる。一実施形態では、試験サンプルのリスクスコアを、以下の式を用いて固有サブタイプ距離のみで計算することができる。

【0121】

ＲＯＲ＝０．０５^*基底＋０．１ｌ^*Ｈｅｒ２＋−０．２５^*ＬｕｍＡ＋０．０７^*ＬｕｍＢ＋−０．１ｌ^*正常
式中、変数「基底」、「Ｈｅｒ２」、「ＬｕｍＡ」、「ＬｕｍＢ」、及び「正常」は、試験サンプルからの発現プロフィールが、Gene Expression Omnibus（ＧＥＯ）に預けられた遺伝子発現データを用いて作成されたセントロイドに対して比較されたときのそれぞれのクラシファイアのセントロイドに対する距離である。

【0122】

リスクスコアは、同様に、以下の式を用いて、乳癌サブタイプと臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）とリンパ節状態（Ｎ）の組み合わせを用いて計算することができる。
ＲＯＲ（完全）＝０．０５^*基底＋０．１^*Ｈｅｒ２＋−０．１９^*ＬｕｍＡ＋０．０５^*ＬｕｍＢ＋−０．０９^*正常＋０．１６^*Ｔ＋０．０８^*Ｎ
同様に、試験発現プロフィールが、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに預けられた遺伝子発現データを用いて作成されたセントロイドに対して比較されたときのものである。

【0123】

なお別の実施形態では、試験サンプルのリスクスコアは、以下の式を用いて固有サブタイプ距離のみで計算される。

【0124】

ＲＯＲ−Ｓ＝０．０５^*基底＋０．１２^*Ｈｅｒ２＋−０．３４^*ＬｕｍＡ＋０．０．２３^*ＬｕｍＢ
式中、変数「基底」、「Ｈｅｒ２」、「ＬｕｍＡ」、及び「ＬｕｍＢ」は、上記説明の通りであり、試験発現プロフィールが、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに預けられた遺伝子発現データを用いて作成されたセントロイドに対して比較される。なお別の実施形態では、リスクスコアは、以下の式（変数は上記説明のとおりである）を用いて、乳癌サブタイプと臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）との組み合わせを用いて計算することもできる：
ＲＯＲ−Ｃ＝０．０５^*基底＋０．１１^*Ｈｅｒ２＋−０．２３^*ＬｕｍＡ＋０．０９^*ＬｕｍＢ＋０．１７^*Ｔ。

【0125】

なお別の実施形態では、試験サンプルのリスクスコアは、以下の式を用いて増殖シグネチャー（「Ｐｒｏｌｉｆ」）と組み合わせて固有サブタイプ距離を使用して計算される。

【0126】

ＲＯＲ−Ｐ＝−０．００１^*基底＋０．７^*Ｈｅｒ２＋−０．９５^*ＬｕｍＡ＋０．４９^*ＬｕｍＢ＋０．３４^*Ｐｒｏｌｉｆ
式中、変数「基底」、「Ｈｅｒ２」、「ＬｕｍＡ」、「ＬｕｍＢ」、及び「Ｐｒｏｌｉｆ」は、上記説明の通りであり、試験発現プロフィールが、アクセッション番号ＧＳＥ２８４５としてＧＥＯに預けられた遺伝子発現データを用いて作成されたセントロイドに対して比較される。なお別の実施形態では、リスクスコアは、以下の式（変数は上記説明のとおりである）を用いて、乳癌サブタイプ、増殖シグネチャー及び臨床的変数である腫瘍サイズ（Ｔ）との組み合わせを用いて計算することもできる：
ＲＯＲ−ＰＴ＝−０．００１^*基底＋０．７３^*Ｈｅｒ２＋−０．９^*ＬｕｍＡ＋０．０５^*ＬｕｍＢ＋０．１３^*Ｔ＋０．３３^*Ｐｒｏｌｉｆ。

【0127】

サブタイプの検出

【0128】

エストロゲン（ＥＲ）、プロゲステロン（ＰｇＲ）、ＨＥＲ２、及びＫｉ６７の免疫組織化学を、色原体として３，３’−ジアミノベンジジンを用いる標準的なストレプトアビジン−ビオチン複合体法で連続切片に対して同時に行った。ＥＲ、ＰｇＲ、及びＨＥＲ２の解釈のための染色を、既に説明したように行うことができるが（Cheang et al., Clin Cancer Res. 2008;14(5):1368-1376）、当分野で公知の任意の方法を使用することもできる。

【0129】

例えば、Ｋｉ６７抗体（クローンＳＰ６；ThermoScientific,Fremont,CA）を１：２００の希釈となるように添加して３２分間インキュベートし、次いでＶｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ自動免疫染色装置（Ventana,Tucson AZ）の標準的なＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ １（商品名ＣＣ１の緩衝液）プロトコルに従って９８℃で３０分間インキュベートした。ＥＲ抗体（クローンＳＰ１；ThermoFisher Scientific,Fremont CA）を、１：２５０の希釈で使用し、１０分間インキュベートし、８分間のマイクロウエーブ後、抗原を１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）で回収することができる。すぐに使用できるＰＲ抗体（クローン１Ｅ２；Ventana）を、上記のようにＣＣ１プロトコルに従って使用することができる。ＨＥＲ２染色を、スチーマで３０分間、９５℃で加熱して０．０５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ １０．０）で抗原を回収した後に、１：１００に希釈したＳＰ３抗体（ThermoFisher Scientific）で行うことができる。ＨＥＲ２蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイでは、製造業者の取扱説明書に従うが、既に説明したように前処置及びハイブリダイゼーションに変更を加えて、ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ ＨＥＲ−２ ＤＮＡプローブキット（Abbott Molecular,Abbott Park,IL）を使用することにより、スライドを、プローブを用いてＬＳＩ（領域特異的プローブ（locus-specific identifier））ＨＥＲ２／ｎｅｕ及び動原体１７にハイブリダイズさせることができる（Brown LA, Irving J, Parker R, et al. Amplification of EMSY, a novel oncogene on 11q13, in high grade ovarian surface epithelial carcinomas. Gynecol Oncol. 2006;100(2):264-270）。次いで、スライドを４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで対比染色することができ、染色された物質を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ落射蛍光顕微鏡で可視化し、そしてＭｅｔａｆｅｒ画像収集システム（Metasystems,Altlussheim,Germany）でシグナルを分析した。次いで、免疫組織化学アッセイによるバイオマーカーの発現に２人の病理学者がスコアを付けることができ、これらの病理学者は、臨床病理学的特性及び転帰について盲検化され、他の乳癌のコホートに対して開発されたバイオマーカー発現レベルについての、既に確立されて公表された基準を使用した。

【0130】

既に説明したように、腫瘍核の１％を超えて免疫染色が観察された場合、腫瘍は、ＥＲ又はＰＲに対して陽性であると見なされた。免疫染色が、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ基準に従って３＋のスコアが付けられた場合は、腫瘍は、ＨＥＲ２に対して陽性であると見なされ、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの増幅比２．０以上が、免疫組織化学的に曖昧な腫瘍（２＋のスコア）を分離するために使用されるカットポイントである（Yaziji, et al., JAMA, 291(16):1972?1977 (2004)）。Ｋｉ６７には、２人の病理学者によって、陽性免疫染色がバックグラウンドレベルよりも高い腫瘍細胞核の割合について視覚的にスコアが付けられた。

【0131】

他の方法を用いても、サブタイプを検出することができる。これらの技術には、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、又はＦＡＣＳ分析が含まれる。

【0132】

キット

【0133】

本開示は、乳癌固有サブタイプの分類、及び／又はアントラサイクリンにより応答する乳癌を識別する予後情報の提供に有用なキットについて述べる。このようなキットは、表１に列記されている固有遺伝子に特異的な捕捉プローブ及び／又はプライマーのセットを含む。キットは、コンピュータ可読媒体をさらに含み得る。

【0134】

本開示の一実施形態では、捕捉プローブは、アレイ上に固定される。「アレイ」とは、ペプチド又は核酸プローブが取り付けられた固体支持体又は基板のことである。アレイは、典型的には、異なる既知の位置にある基板表面に結合された複数の異なる捕捉プローブを備えている。本開示のアレイは、固有遺伝子発現産物に特異的に結合できる複数の捕捉プローブを有する基板を含む。基板上の捕捉プローブの数は、アレイの意図する目的によって異なる。アレイは、低密度アレイであっても高密度アレイであっても良く、４以上、８以上、１２以上、１６以上、又は３２以上のアドレスを備えることができるが、最小限でも、表１に列記されている５０の固有遺伝子に対する捕捉プローブを備える。

【0135】

機械合成法を用いるこのようなアレイの合成技術は、例えば、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。アレイは、実質的にあらゆる形状の表面、又は複数の表面にさえも形成することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、ファイバー、例えば、光ファイバー、ガラス、又は任意の他の適切な基板上のプローブ（例えば、核酸結合プローブ）とすることができ、参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、及び同第５，８００，９９２号を参照されたい。アレイは、デバイス上で診断又は他の操作ができるようにパッケージングすることができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８５６，１７４号及び同第５，９２２，５９１号を参照されたい。

【0136】

別の実施形態では、キットは、表１に列記されている固有遺伝子のそれぞれの検出及び／又は定量に十分なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、凍結乾燥形態又は水で戻す形態で提供しても良いし、或いはヌクレオチド配列のセットとして提供しても良い。一実施形態では、プライマーは、マイクロプレート形式で提供され、各プライマーのセットが、マイクロプレートの１つのウェル（又は、複製の場合には複数のウェル）を占有する。マイクロプレートは、以下に説明される１つ以上のハウスキーピング遺伝子の検出に十分なプライマーをさらに含み得る。キットは、表１に列記されている遺伝子の発現産物の増幅に十分な試薬及び取扱説明書をさらに含み得る。

【0137】

例えば、比較、精査、回収、及び／又は変更のために容易なアクセスを促進するために、分子シグネチャ／発現プロフィールが、典型的には、データベースに記録される。最も典型的には、データベースは、計算機によってアクセス可能なリレーショナルデータベースであるが、他の形式、例えば、写真、アナログ又はデジタル画像読み出し情報などのような手動でアクセス可能な発現プロフィールのインデックスファイルも使用することができる。最初に記録される発現パターンの性質がアナログ又はデジタルであるかにかかわらず、発現パターン、発現プロフィール（集合的発現パターン）、及び分子シグネチャ（相関した発現パターン）が、デジタルで記録され、データベースを介してアクセスされる。典型的には、データベースは、中心施設でコンパイルされて維持され、構内及び／又は遠隔からアクセス可能である。

【実施例】

【0138】

実施例１．増殖シグネチャーは、乳癌の毎週のアジュバントパクリタキセルに対する応答を予測する
患者、サンプル及び臨床データ

【0139】

ＧＥＩＣＡＭ／９９０６トライアルは、リンパ節陽性乳癌における、６サイクルのフルオロウラシル、エピルビシン、及びＣシクロホスファミド単独（ＦＥＣ、対照治験群）対４サイクルのＦＥＣとそれに続く、８回の１００ｍｇ／ｍ²のパクリタキセルの１週間サイクル（ＦＥＣ−Ｐ、実験的治験群）を比較する、アジュバントの前向き多施設無作為化第３相試験（ｎ＝１，２４６対象）であった。ＧＥＩＣＡＭ／９９０６臨床試験の主要な評価項目は、無病生存率であった。副次的評価項目は：（ａ）全生存；（ｂ）分子／ゲノムマーカーの予後及び予測値、及び（ｃ）安全性であった。試験を、すべての参加研究機関及びSpanish Health Authorityの倫理委員会によって承認されたヘルシンキ宣言に従って実施し、そして、それはwww.clinicaltrials.gov（識別子コード：NCT00129922）に登録された。すべての患者に、処置の無作為化及び分子分析に関して書面によるインフォームドコンセントを提供した。試験設計と患者の特性の詳細は、以前に報告した（Martin et al., J Natl Cancer Inst 100: 805 ? 814, 2008; Martin et al., Breast Cancer Res Treat 123:149?157, 2010）。ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍ブロックは、８２５人の患者で入手可能であった。それぞれのＦＦＰＥ組織ブロックからのＨ＆Ｅ切片は、ＧＥＩＣＡＭの中央検査室の病理学者によって審査された。少なくとも２つの腫瘍コアを、１ｍｍのコアパンチを使用して、代表的な侵襲性乳癌を含む領域から抽出した。ＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ抽出及びＲＴ−ｑＰＣＲ ＰＡＭ５０アッセイの詳細なプロトコールは、以前に記載した（Parker et al., J Clin Oncol 27:1160?1167, 2009）。

【0140】

ＰＡＭ５０サブタイプの分類

【0141】

サンプルは、以前に記載したＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用してプロフィールを示し、そして、サブタイプ予測のための臨床アルゴリズムを使用して分析した遺伝子発現であった（Parker et al., J Clin Oncol 27:1160?1167, 2009; Arup Laboratories: PAM50 Breast Cancer Intrinsic Classifier Information. http://www.aruplab.com/ Lab-Tests/ General-Oncology/ PAM50/ index.jsp）。サンプルを、以下の固有サブタイプカテゴリ：管腔Ａ、管腔Ｂ、ＨＥＲ２高発現、基底様及び正常様、に割り当てた。正常様に分類されたサンプルは、腫瘍標本内の正常乳房組織又は間質の混入によりもたらされる分類の誤りの可能性のために、更なる分析から排除した（Elloumi et al., BMC Med Genomics 4:54, 2011）。サブタイプ分類法に加えて、ＰＡＭ５０増殖スコアを、以前に記載した１１個の遺伝子シグネチャー（ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＣＤＣ２０、ＣＤＣＡ１、ＣＥＰ５５、ＫＮＴＣ２、ＭＫＩ６７、ＰＴＴＧ１、ＲＲＭ２、ＴＹＭＳ、ＵＢＥ２Ｃ）を使用して計算した（Nielsen et al., Clin Cancer Res 16(21):5222-32, 2010）。増殖の有意を、四分位への分類法を使用し、且つ、連続的変数としての増殖スコアを使用して評価した。

【0142】

免疫組織化学的（ＩＨＣ）Ｋｉ−６７定量化

【0143】

Ｋｉ−６７状態を、中央検査室において、Ｃｌｏｎｅ ＭＩＢ１抗体（DakoCytomation, Glostrup, Denmark）を使用した免疫組織化学法によってパラフィン切片上で評価した。
Ｋｉ６７スコアは核染色で総数の腫瘍細胞のパーセンテージに規定された。

【0144】

統計解析

【0145】

この分析には、既定義集団における、あらかじめ指定された試験目的及びあらかじめ指定された検査室アッセイを伴った前向き−後向きデザイン（無作為化前向き臨床研究の後向き分析）がある。試験のあらかじめ指定された主要な目的は、ＰＡＭ５０サブタイプ及び／又はＰＡＭ５０増殖スコアがＯＳ及び／又はパクリタキセル利益の予測に関連しているか否か決定することであった。カプラン−マイヤー法を、全生存（ＯＳ）を推定するのに使用し、そして、ログランク検定を、群間のＯＳを比較するのに使用した。一変量及び多変量コックス比例ハザードモデルを、生存とそれぞれの変数との関連性、及び処置とＰＡＭ５０サブタイプと増殖との相互作用を調べるために使用した。結果を、腫瘍マーカー予後試験（ＲＥＭＡＲＫ）基準に関する報告提言に従って提示する（McShane et al., J Clin Oncol 23:9067?9072, 2005）。

【0146】

患者の人口統計

【0147】

腫瘍ブロックは、８２５人の患者について入手可能であり、ＰＡＭ５０ゲノムプロファイリングは、サイン済みのインフォームドコンセントが得られた患者の８２０個のサンプル（９９．４％）で成功し（図５）、そしてそれは、ＧＥＩＣＡＭ／９９０６トライアルの本来の１，２４６サンプルセットの６６％に相当する（Martin et al., J Natl Cancer Inst 100: 805-814, 2008）。この従属試験に加えられた患者の人口統計及び予後像、並びに１０年ＯＳは、全体的な調査集団のものと同様であった。この試験に加えられた患者の臨床−病態学的特徴の分布を、表３に示す。

【0148】

表３．患者の臨床−病態学的特徴

【表3】

【0149】

全生存転帰

【0150】

中央値８．７年の追跡調査で、ＦＥＣ−Ｐ治験群のＯＳは、ＦＥＣ治験群と比較して有意に優れており（ＯＳのハザード比［ＨＲ］０．６９３、９５％信頼区間［ＣＩ］０．６９３〜０．９２７、ｐ＝０．０１３）、それぞれ７０．９０％と７８．４４％のＦＥＣ及びＦＥＣ−Ｐ治験群における１０年ＯＳ比を有する（図１Ａ）。一変量解析法により、以下の変数：閉経状態、結節状態、組織病理学的グレード、腫瘍の大きさ、エストロゲン受容体（ＥＲ）状態、プロゲステロン受容体（ＰＲ）状態、Ｋｉ６７、ＰＡＭ５０サブタイプ、及び増殖スコア、ＯＳに有意に関連していることを明らかにした。予想されるように、ＰＡＭ５０管腔Ａ腫瘍が、最も良い転帰（１０年で８４．０４％のＯＳ）を示し、管腔Ｂ（７０．７５％）、基底様（７０．４２％）、そして、ＨＥＲ２高発現（６５．１９％）がそれに続いた（図１Ｂ）。管腔Ａ腫瘍と比較して、管腔Ｂ、ＨＥＲ２高発現及び基底様腫瘍は、それぞれ１．９９（１．３５〜２．９７）、２．６０（１．５２〜４．４０）、及び２．６２（１．７４〜３．９５）のＯＳに関するＨＲを示した。興味深いことに、増殖スコアとＫｉ−６７がＯＳと有意に関連しているのがわかったが（図２）、四分位分布による曲線の分離で、ＩＨＣによってＫｉ−６７と比較した増殖スコアをもっと使用することがわかった。

【0151】

評価した変数の中で、腫瘍の大きさ、結節状態、及び増殖シグネチャーは、有意（ｐ＝０．０６７）な傾向を示している処置治験群を用いた多変量解析におおいてＯＳの独立予測因子であることがわかった（表４）。注目すべきことに、ＩＨＣによるＫｉ−６７及び組織学的グレードが、増殖シグネチャーによって提供される情報に取って代わった。

【0152】

表４．予測変数

【表4】

【0153】

ＰＡＭ５０サブタイプと増殖スコアにおけるパクリタキセルの効果

【0154】

ＦＥＣ対ＦＥＣ−Ｐで処置を比較するＯＳのカプラン−マイヤープロットを、ＰＡＭ５０アッセイで規定された各群カテゴリで評価した。個々のＰＡＭ５０サブタイプに、パクリタキセルの有効性の予兆は見られなかった。その一方、パクリタキセルからの利益は、腫瘍が低い増殖スコア（最も低い四分位の中のＨＲ＝０．２３、ＣＩ ０．０９〜０．５７、ｐ＜０．００１）を有する患者で観察され、７１．２４％から９４．４２％への１０年ＯＳの改善を示した（図３Ａ）。増殖スコアの下位四分位群（ｎ＝１８１）の中のＰＡＭ５０サブタイプ分布は、以下のとおりであった：管腔Ａ ７６．２４％、管腔Ｂ ６．６３％、ＨＥＲ２高発現 １７．１３％及び基底様 ０％。個別に評価したとき又は一群の中に組み合わせたとき、パクリタキセルの利益は他の増殖スコア群内で観察されず（図３Ｂ）、そこで、ＯＳに関する一変量ＨＲは０．８５であった（ＣＩ ０．６２〜１．１６）。増殖スコアを三分位を使用して評価したときに、同様のデータを得た。

【0155】

増殖スコアとパクリタキセル処置の利益の相関

【0156】

パクリタキセルの利益の程度と増殖スコアとの相関の統計的妥当性を試験するために、増殖スコアとパクリタキセル処置との統計的相互作用の形式テストを実施した。パクリタキセル処置と増殖スコアを含むＣｏｘモデルの多変量解析では、相互作用に関する試験により、統計的に有意であることがわかった（連続的変量としてｐ＝０．００６；四分位式を使用した群カテゴリとしてｐ＝０．０１９）。加えて、すべての臨床−病理的変数について調整された、増殖スコアとパクリタキセル処置との相互作用に関する多変量モデルは、増殖スコアとパクリタキセル処置との相互作用の持続する有意性を示した（表５）。

【0157】

表５．多変量コックス比例ハザードモデルにおける増殖シグネチャーとパクリタキセル処置との相互作用

【表5】

【0158】

連続関数としての増殖スコアに対する相関における、パクリタキセル処置による利益の程度について調査するために、ＯＳの見込みを、両治験群に関する増殖スコアの一次関数として当てはめた。予想されるとおり、パクリタキセルの利益の程度は、増殖スコアが減少するに従って、連続的に増加するように見えた（図４及び表６）。

【0159】

表６．低リスク群内のＦＥＣ−Ｔ対ＦＥＣのハザード比

【表6】

【0160】

パクリタキセルの利益と臨床−病理的変数

【0161】

週１回のパクリタキセルに対する応答の他の予測因子を同定するために、パクリタキセル処置の、臨床−病理的変数（年齢、閉経状態、組織学的グレード、腫瘍の大きさ、ＥＲ［ＩＨＣ］状態、ＰＲ［ＩＨＣ］状態、Ｋｉ−６７［ＩＨＣ］及びＨＥＲ２状態［ＩＨＣ／ＣＩＳＨ］）との相互作用もまた評価した。これらの変数と処置との間には、有意な相互作用は見られなかった。

【0162】

考察

【0163】

個人化された医療の時代において、乳癌患者について臨床的に有用な予後及び予兆の情報を提供することを可能にし得る新たなツールが必要である。２つのゲノムアッセイ（ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸ及びＭａｍｍａｐｒｉｎｔ）では、早期の乳癌における予測情報を提供し（Van de Vijver et al., N Engl J Med 347:1999-2009, 2002; Buyse et al., J Natl Cancer Inst 98: 1183 - 92, 2006; Paik et al., N Engl J Med 351:2817-26, 2004）、そして、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸでは、ＥＲ陽性疾患における、アジュバント化学療法（シクロホスファミド−メトトレキサート−フルオロウラシル（ＣＭＦ）又はシクロホスファミドドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））−フルオロウラシル（ＣＡＦ））からの利益に関する予兆情報を提供する（Paik et al., J Clin Oncol 24:3726-34, 2006; Albain et al., Lancet Oncol 11: 55-65, 2010）。しかしながら、これらと他のアッセイの現代のタキサン投薬計画に処置利益を予測する、及び／又は特異的薬剤に利益を予測する能力は不明瞭である。

【0164】

アントラサイクリンベースの化学療法に週１回のアジュバントであるパクリタキセルを追加する利益はわずかであるという報告が以前にあった（De Laurentiis et al., J Clin Oncol 26:44-53, 2008; Nowak et al., Lancet Oncol 5: 372-80, 2004; Tang, Cancer Investigation 27:489-495, 2009; Bria et al., Cancer 106: 2337-2344, 2006）。これにより、患者がこの薬物及びスケジュールの利益を最も多く得るという確認は、正当であると思われる。従来の臨床−病理的指標（すなわち、年齢、腫瘍の大きさ、陽性結節の数、ＥＲ状態、ＰＲ状態、及びＨＥＲ２状態）並びにＰＡＭ５０固有サブタイプが、アジュバントであるパクリタキセルの有効性の予兆であると分からなかった。

【0165】

増殖の計測は、特に初期のＥＲ陽性乳癌において予後に使用される試験の重要な構成要素である。増殖はまた、有糸分裂像をカウントするか（すなわち、変法ノッティンガム−ブルーム−リチャードソンスコア）又は例えば、Ｋｉ−６７などの細胞周期調整バイオマーカーを使用した分裂指数を明らかにすることによって（Simpson et al., J Clin Oncol. 18(10):2059-69, 2000; Meyer et al., Mod Pathol. 2005 Aug;18(8):1067-78. Erratum in: Mod Pathol 18(12):1649, 2005; Dowsett et al., J Natl Cancer Inst 99(2):167-70, 2007）、組織学的グレードづけに組み入れられる。この試験では、増殖スコアシグネチャー（１１種類の増殖関連遺伝子の平均発現値である）が、アジュバント設定の週１回のパクリタキセルの利益に関して予測的であることがわかった。このシグネチャーのあらかじめ指定されたカットオフをここでのＧＥＩＣＡＭ／９９０６トライアルで試験しなかったが、下位四分位群内のＯＳに関するＨＲは、注目に値した（ＨＲ＝０．２３２、ｐ＝０．００２）。加えて、他のすべての臨床−病理的変数が考慮されたときでさえ、パクリタキセル処置と増殖スコアとの相互作用の試験は、統計的に有意であった。興味深いことに、ＩＨＣによる増殖関連バイオマーカーであるＫｉ−６７は、中央病理検査室において評価されたにもかかわらず、パクリタキセルの利益を予測することはなかったが、１１種類の遺伝子増殖スコア（11-gene proliferation score）は有意であった。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]