特許 6148738 肝組織培養用デバイス、肝組織培養用システム、肝組織培の培養方法及び肝機能の評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6148738

(24)【登録日】2017年5月26日

(45)【発行日】2017年6月14日

(54)【発明の名称】肝組織培養用デバイス、肝組織培養用システム、肝組織培の培養方法及び肝機能の評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20170607BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20170607BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20170607BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

   C12M1/00 A

   C12Q1/02

【請求項の数】13

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2015-546218(P2015-546218)

(86)(22)【出願日】2013年11月8日

(86)【国際出願番号】JP2013080207

(87)【国際公開番号】WO2015068253

(87)【国際公開日】20150514

【審査請求日】2016年5月12日

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100205981

【弁理士】

【氏名又は名称】野口 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】100085464

【弁理士】

【氏名又は名称】野口 繁雄

(72)【発明者】

【氏名】藤山 陽一

(72)【発明者】

【氏名】田川 陽一

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−２４４７１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０４７６３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 明地将一, et al.，肝機能デバイスの開発，島津評論，２０１０年，Vol.67, No.1/2，p.53-59

【文献】 田川陽一，胚性幹細胞研究におけるバイオマテリアル，バイオマテリアル−生体材料，２００８年，Vol.26, No.4，p.325-329

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも培地を導入及び排出するための少なくとも２本の流路が接続されている培養室を備え、
前記培養室の中に細胞の足場材となるゲルが収容されており、
前記ゲル上で内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び星細胞を含む共培養系が管状の構造をもつように共培養されていることを特徴とする肝組織培養用デバイス。

【請求項2】

前記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項１に記載の肝細胞培養用デバイス。

【請求項3】

前記ゲルはＥＨＳ−ｇｅｌを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項１又は２に記載の肝細胞培養用デバイス。

【請求項4】

前記培養室の培養室部分と蓋部分が開閉可能であり、かつ前記２本の流路のうちの１つである出口側流路にフィルターが配置されていることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイス。

【請求項5】

前記培養室の少なくとも一部にＰＤＭＳ又はシリコーン系ゴムが用いられていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイス。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイスにポンプを接続することにより、前記培養室内に前記培地を連続送液する機能を備えたことを特徴とする肝細胞培養用システム。

【請求項7】

請求項１から５のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイスにポンプを接続することにより、前記培養室内から前記培地を連続吸引する機能を備えたことを特徴とする肝細胞培養用システム。

【請求項8】

細胞の足場材となるゲル上に少なくとも内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び星細胞を播種して共培養することにより、前記内皮細胞系の細胞、前記肝細胞系の細胞及び前記星細胞を少なくとも含み、かつ管状の構造をもつ共培養系を培養することを特徴とする肝細胞の培養方法。

【請求項9】

前記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項８に記載の肝細胞の培養方法。

【請求項10】

前記ゲルはＥＨＳ−ｇｅｌを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項８又は９に記載の肝細胞の培養方法。

【請求項11】

前記共培養系に培地を連続供給することを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載の肝細胞の培養方法。

【請求項12】

請求項１から５のいずれか一項の肝細胞培養用デバイス、又は請求項６もしくは７に記載の肝細胞培養用システムが用いられることを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の肝細胞の培養方法。

【請求項13】

請求項８から１２のいずれか一項に記載の肝細胞の培養方法によって培養された前記共培養系を用いて肝機能を評価することを特徴とする肝機能の評価方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝組織培養用デバイス、肝組織培養用システム、肝組織培の培養方法及び肝機能の評価方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

細胞培養のためには、その細胞に応じた足場材を用いることが有効である。しかし、デバイスを用いる場合には、デバイス作製のプロセスとの関連から制約が多い。
肝臓以外の臓器の細胞は１細胞につき１機能であることが多い。これに対し、肝臓中の肝細胞は１つで１００以上の特異的機能を有している。

【0003】

しかし、これまでの培養肝細胞は、ほとんどの機能を維持したり発揮したりすることはできていない。例えば、人工肝臓に関する研究など多く成されているが、ほとんどの薬物代謝は実現できていない。

【0004】

本願発明者らは、足場材の選択によってネットワーク構造を形成する内皮細胞と肝実質細胞との共培養系で高い肝機能が発現することを報告している（非特許文献１，２を参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１１−２４４７１３号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】藤山陽一、田川陽一、他５名、「管化内皮肝細胞培養用システムを用いた肝実質細胞との共培養における肝機能の解析」、第３０回日本分子生物学会年会予稿集、２００７年

【非特許文献2】Yu Toyoda, Miho Tamai, Kasumi Kashikura, Shunsuke Kobayashi, Yoichi Fujiyama, Tomoyoshi Soga and Yoh-ichi Tagawa, "Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in a Liver Tissue Model Consisting of Primary Hepatocytes Assembling around an Endothelial Cell Network", DRUG METABOLISM AND DISPOSITION, 2012, Vol. 40, 169-177

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本願発明者らは、ネットワーク形成された内皮細胞と肝実質細胞の共培養系が高い肝機能を発現することを報告済みである（非特許文献２を参照。）。しかし、この構造は構築後３日程度で崩壊が始まる。したがって、長期的な試験が困難であるという問題があった。

【0008】

本発明は、ネットワーク形成された皮細胞系の細胞と肝細胞系の細胞の共培養系の構造をより長期間維持させることを目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明にかかる肝組織培養用デバイスは、少なくとも培地を導入及び排出するための少なくとも２本の流路が接続されている培養室を備え、上記培養室の中に細胞の足場材となるゲルが収容されており、上記ゲル上で内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系が管状の構造をもつように共培養されていることを特徴とするものである。

【0010】

本発明にかかる肝細胞培養用システムは、本発明の肝細胞培養用デバイスにポンプを接続することにより、上記培養室内に上記培地を連続送液する機能又は上記培養室内から上記培地を連続吸引する機能を備えたことを特徴とするものである。

【0011】

本発明にかかる肝細胞の培養方法は、細胞の足場材となるゲル上に少なくとも内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を播種して共培養することにより、前記内皮細胞系の細胞、前記肝細胞系の細胞及び前記間葉系の細胞を少なくとも含み、かつ管状の構造をもつ共培養系を培養することを特徴とすることを特徴とする。

【0012】

本発明にかかる肝機能の評価方法は、本発明の肝細胞の培養方法によって培養された共培養系を用いて肝機能を評価することを特徴とする。

【発明の効果】

【0013】

本発明の肝組織培養用デバイス、肝細胞培養用システム、肝細胞の培養方法及び肝機能の評価方法は、ネットワーク形成された皮細胞系の細胞と肝細胞系の細胞の共培養系の構造をより長期間維持させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】肝組織培養用デバイスの一実施例を説明するための概略的な断面図である。

【図2】同実施例の平面図である。

【図3】肝細胞培養用システムの一実施例を説明するための概略図である。

【図4】肝細胞培養用システムの他の実施例を説明するための概略図である。

【図5】ＥＨＳ−ｇｅｌ上にネットワーク形成された類胴内皮細胞及び肝実質細胞の状態を示す写真である。

【図6】ネットワーク形成された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系の構造を一部断面で示した模式的な斜視図及び模式的な断面図である。

【図7】肝細胞を用いた肝機能評価試験の結果を示す図である。

【図8】図１に示された肝組織培養用デバイスを用いて、内皮細胞と肝実質細胞を共培養した結果と、これに星細胞を添加した際の結果をそれぞれ示す写真である

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることが好ましい。

【0016】

また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記ゲルはＥＨＳ（Engelbreth-Holm-Swarm）−ｇｅｌを少なくとも含んでいることが好ましい。

【0017】

また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記間葉系の細胞は少なくとも星細胞系の細胞又は線維芽細胞を含んでいることが好ましい。

【0018】

また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記培養室の培養室部分と蓋部分が開閉可能であり、かつ上記２本の流路のうちの１つである出口側流路にフィルターが配置されている例を挙げることができる。ただし、本発明の肝組織培養用デバイスの構造はこれに限定されない。

【0019】

また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記培養室の少なくとも一部にＰＤＭＳ又はシリコーン系ゴムが用いられている例を挙げることができる。ただし、本発明の肝組織培養用デバイスの構造はこれに限定されない。

【0020】

本発明の肝細胞の培養方法において、上記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることが好ましい。

【0021】

また、本発明の肝細胞の培養方法において、上記ゲルはＥＨＳ−ｇｅｌを少なくとも含んでいることが好ましい。

【0022】

また、本発明の肝細胞の培養方法において、上記間葉系の細胞は少なくとも星細胞系の細胞又は線維芽細胞を含んでいることが好ましい。

【0023】

また、本発明の肝細胞の培養方法において、上記共培養系に培地を連続供給することが好ましい。ただし、本発明の肝細胞の培養方法は、上記共培養系に培地を連続供給ではなく間欠的に供給する構成も含む。

【0024】

また、本発明の肝細胞の培養方法において、本発明の肝細胞培養用デバイス又は本発明の肝細胞培養用システムが用いられる例を挙げることができる。ただし、本発明の肝細胞の培養方法はこれに限定されない。

【0025】

例えばＥＨＳ−ｇｅｌのような特殊な足場材を用いて内皮細胞を培養すると、内皮細胞が管状のネットワーク構造を形成する。これに肝実質細胞を共培養すると、肝実質細胞が内皮細胞のネットワークヘ遊走し、生体内の肝組織に近い構造を取り、高い肝機能を発現する。しかし、この構造は３日程度しか維持できなかった。本発明者らは、この管状の構造に間葉系の細胞、例えば星細胞を加えることにより、長期的に生体内の肝組織に近い管状の構造が維持されることを見いだした。

【0026】

本発明の肝組織培養用デバイス又は肝組織培養用システムを用いれば、流路から培養室への培地の連続供給又は間欠供給により、良好な培養環境が維持される。本発明の肝組織培養用デバイス及び肝組織培養用システムはシャーレ上では不可能な生体内に非常に近い環境を実現できる。したがって、本発明の肝組織培養用デバイス及び肝組織培養用システムは高い肝機能をもつ管状の構造を長期間維持できるデバイス及びシステムと成り得る。

【0027】

本発明の肝組織培の培養方法は、ネットワーク形成された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系の管状の構造をより長期間維持させることができる。特に、本発明の肝組織培養用デバイス又は肝組織培養用システムを用いる本発明の肝組織培の培養方法は、生体内に非常に近い環境で、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系を培養できる。

【0028】

本発明の肝機能の評価方法は、本発明の肝組織培の培養方法によって培養された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系を用いて肝機能を評価できる。特に、本発明の肝組織培養用デバイス又は肝組織培養用システムを用いた本発明の肝細胞の培養方法によって培養された共培養系を用いる本発明の肝機能の評価方法は、生体内に非常に近い環境で肝機能を評価できる。

【0029】

本発明は細胞培養のための技術であり、特に人工肝臓など人工臓器又は薬物代謝試験などに用いて有用な技術である。

【0030】

図１は、肝組織培養用デバイスの一実施例を説明するための概略的な断面図である。図２は同実施例の平面図である。図１の断面は図２のＡ−Ａ位置に対応している。

【0031】

肝組織培養用デバイス１は、大きく分けて培養室部分３と蓋部分５で形成されている。培養室部分３はベースプレート７とＰＤＭＳ構造体９を備えている。蓋部分５はフィルター保持層１１とＰＤＭＳ構造体１３を備えている。

【0032】

ベースプレート７は例えば合成石英で形成されている。ＰＤＭＳ構造体９及びＰＤＭＳ構造体１３は例えばＳＩＬＰＯＴ１８４（東レダウコーニング社製）で形成されている。フィルター保持層１１は、例えば、多孔質膜からなるフィルター１１ａがシリコーンゴムシート１１ｂの間に挟み込まれている構造を備えている。フィルター１１ａは例えばポリカーボネートの市販フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製、ＣＹＣＬＯＰＯＲＥ７０６２−２５１３）である。

【0033】

これらの部材はいずれも幅２０ｍｍ（ミリメートル）、長さ２０ｍｍの平板形状を有している。ベースプレート７の厚みは例えば１ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体９の厚みは例えば３ｍｍである。フィルター１１ａを構成する多孔質膜の厚みは例えば０.２５ｍｍである。シリコーンゴムシート１１ｂの厚みは例えば０.２ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体１３の厚みは例えば３ｍｍである。

【0034】

ＰＤＭＳ構造体９の中央に貫通孔からなる培養室１５が形成されている。培養室１５の直径は例えば１０ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体９には、培養室１５の側壁に設けられた溝９ａと、溝９ａに接続された溝９ｂも形成されている。溝９ａ及び溝９ｂの深さは例えば０.１ｍｍである。溝９ｂの幅は例えば１ｍｍである。溝９ｂの長さは例えば５ｍｍ程度である。

【0035】

ＰＤＭＳ構造体９は例えば２層構造である。溝９ａ，９ｂは、ＰＤＭＳ構造体９を構成する２層のＰＤＭＳのうち一方の層のＰＤＭＳの表面に型取りによって形成された凹部によって形成されている。溝９ａ，９ｂは２層のＰＤＭＳの貼り合わせ面に配置されている。

【0036】

フィルター保持層１１の中央にフィルター１１ａが配置されている。フィルター１１ａの直径は例えば１１ｍｍである。フィルター１１ａは培養室１５の上方を覆う位置に配置されている。シリコーンゴムシート１１ｂの中央に貫通孔が形成されている。その貫通孔にフィルター１１ａが配置されている。シリコーンゴムシート１１ｂはフィルター１１ａをＰＤＭＳ構造体１３に密着させるように保持している。

【0037】

ＰＤＭＳ構造体１３の中央に円形の凹部１３ａが形成されている。凹部１３ａの直径は例えば８ｍｍである。凹部１３ａの深さは例えば０.１ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体１３には、凹部１３ａに接続された溝１３ｂも形成されている。溝１３ｂはＰＤＭＳの型取りによって形成されたものである。溝１３ｂの深さは例えば０.１ｍｍである。溝１３ｂの幅は例えば１ｍｍである。溝１３ｂの長さは例えば５ｍｍ程度である。

【0038】

ＰＤＭＳ構造体９、フィルター保持層１１のシリコーンゴムシート及びＰＤＭＳ構造体１３には、溝９ｂに接続された貫通孔１７が形成されている。ＰＤＭＳ構造体１３には、溝１３ｂに接続された貫通孔１９が形成されている。貫通孔１７及び貫通孔１９の直径は例えば１.５ｍｍである。貫通孔１７及び貫通孔１９は例えば貫通孔加工によって形成されたものである。

【0039】

溝９ａ、溝９ｂ及び貫通孔１７によって培地の入口側流路２１が形成されている。凹部１３ａ、溝１３ｂ及び貫通孔１９によって培地の出口側流路２３が形成されている。

【0040】

ベースプレート７とＰＤＭＳ構造体９が貼り合わされて培養室部分３が形成されている。また、フィルター保持層１１とＰＤＭＳ構造体１３貼り合わされて蓋部分５が形成されている。各部材を貼り合わせる際には、強固な接着性を得るために、各部材の接合面を酸素プラズマや紫外線により活性化して接合させることが好ましい。

【0041】

培養室部分３の上部に蓋部分５が重ね合わせられることにより、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１が形成されている。フィルター保持層１１の一部を構成するシリコーンゴムは自己吸着性を有するので、蓋部分５は培養室部分３に対して容易に着脱することができる。
このような肝組織培養用デバイス１の構造は、例えば特許文献１に開示されている。

【0042】

肝組織培養用デバイス１の培養室１５の中に細胞の足場材となるゲル２５が収容されている。ゲル２５は例えばＥＨＳ−ｇｅｌである。ＥＨＳ−ｇｅｌは、ＥＨＳマウス肉腫細胞から単離した基底膜調製物であり、ラミニン、IV型コラーゲン及びプロテオグリカンを豊富に含んでいる。このＥＨＳ−ｇｅｌは低温で液状化し、常温で固体状となる。したがって、肝組織培養用デバイス１を冷却した状態でＥＨＳ−ｇｅｌを培養室１５に流し込み、例えば３７℃のインキュベーター内又は室温で静置することにより培養室１５の底面にＥＨＳ−ｇｅｌを固定させることができる。なお、このような足場材によるコーティングは、肝組織培養用デバイス１の製造段階で行ってもよいし、肝組織培養用デバイス１を購入したユーザが行うようにしてもよい。

【0043】

培養室１５の中では、ゲル２５上で内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系２７が管状の構造をもつように共培養されている。内皮細胞系の細胞は、例えば、類胴内皮細胞やヒト臍帯静脈（動脈）内皮細胞、ＴＤ２、ＧＨ７などである。肝細胞系の細胞は、例えば、肝実質細胞やＨｅｐａＲＧ、Ｈｕｈ−７、Ｈｅｐ Ｇ２、ＴＬＲ２、Ｈｅｐａ１−６、肝前駆細胞などである。間葉系の細胞は、例えば、星細胞系の細胞、線維芽細胞、ＨＦＯ、ＮＩＨ−３Ｔ３、マウス胎仔線維芽細胞などである。星細胞系の細胞は、例えば、星細胞や、ＴＷＮＴ−４、ＬＸ−２、ＬＩ９０、ＲＩ−Ｔなどである。

【0044】

図３は、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１を用いた肝細胞培養用システムの一実施例を説明するための概略図である。

【0045】

肝細胞培養用システム３１は、肝組織培養用デバイス１と、肝組織培養用デバイス１に培地を連続送液する送液機構を組み合わせたものである。その送液機構は、培地収容部３３、培地供給管３５、培地排出管３７、廃液収容部３９、送液ポンプ４１及び制御部４３を備えている。

【0046】

培地供給管３５の一端は培地収容部３３に挿入されている。培地供給管３５の他端は肝組織培養用デバイス１の入口側流路２１に接続されている。培地排出管３７の一端は肝組織培養用デバイス１の出口側流路２３に接続されている。培地排出管３７の他端は廃液収容部３９に挿入されている。送液ポンプ４１は培地供給管３５に接続されている。制御部４３は送液ポンプ４１の動作を制御する。

【0047】

培地収容部３３に収容された培地は、送液ポンプ４１によって吸引され、培地供給管３５を通って肝組織培養用デバイス１に送られる。肝組織培養用デバイス１に供給された培地は、図１中の矢印で示されるように、入口側流路２１を通過して培養室１５の周面から培養室１５内に導入される。

【0048】

培養室１５への培地の導入に伴い、培養室１５内の培地の一部は、図１中の矢印で示されるように、培養室１５からフィルター保持層１１のフィルター部分及び出口側流路２３を介して外部へ排出される。肝組織培養用デバイス１の外部へ排出された培地は培地排出管３７を介して廃液収容部３９に排出される。

【0049】

肝組織培養用デバイス１は、培養室１５内の培地を出口側流路２３から排出する際にフィルター保持層１１のフィルター部分を通過させるので、剥離したゲル２５によって出口側流路２３が詰まってしまう確率を低減することができる。

【0050】

また、肝組織培養用デバイス１では、図２に示されるように、出口側流路２３の流路端部を構成する凹部１３ａは溝１３ｂの端部と比較して広い面積となっているので、局所的な強い液体の流れが発生しにくい。これにより、肝組織培養用デバイス１は、ゲル２５の剥離を抑制する効果も得られる。
このように、肝組織培養用デバイス１は細胞の長期培養に有利である。

【0051】

図３に示された肝細胞培養用システム３１は、送液ポンプ４１を培地供給管３５に備え、培養室１５内に培地を連続送液する機能を備えているが、本発明の肝細胞培養用システムはこれに限定されない。

【0052】

例えば、図４に示されるように、本発明の実施例である肝細胞培養用システム４５は、培地排出管３７に送液ポンプ４１を備え、培養室１５内から培地を連続吸引する機能を備えているようにしてもよい。なお、本発明の肝細胞培養用システムは、図３又は図４に示された構成に限定されない。

【0053】

次に、肝組織培養用デバイス１を用いて内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系２７の培養を行う工程例を説明する。
まず、培養室部分３及び蓋部分５をオートクレーブやアルコール等によって滅菌処理する。滅菌処理された培養室部分３と蓋部分５を貼り合わせる。冷却したＥＨＳ−ｇｅｌを培養室１５に流し込み、培養室１５の底面にＥＨＳ−ｇｅｌを行き渡らせる。ＥＨＳ−ｇｅｌを例えば３７℃でゲル化させてＥＨＳ−ｇｅｌからなるゲル２５を培養室１５内に固定する。

【0054】

ゲル２５の上に類洞内皮細胞を播種し、内皮細胞ネットワークを形成させる。ネットワーク構造を構築した内皮細胞の上に星細胞を播種し、この上から肝実質細胞も播種する。これにより、内皮細胞ネットワーク内に星細胞が組み込まれ、その周りに肝細胞が遊走し、実際の肝臓の構造に近い構造をもった共培養系２７が形成される。

【0055】

なお、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を播種する順番は上記の順番に限定されない。例えば、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を同時に播種してもよい。また、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞、間葉系の細胞の順に播種してもよい。

【0056】

次に、肝組織培養用デバイス１を用いた細胞培養実験について説明する。
図５は、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１を用いてＥＨＳ−ｇｅｌ上にネットワーク形成された類胴内皮細胞及び肝実質細胞の状態を示す写真である。なお、図５では間葉系の細胞は共培養されていない。図６は、ネットワーク形成された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系の構造を一部断面で示した模式的な斜視図及び模式的な断面図である。

【0057】

ＥＨＳ−ｇｅｌをコーティングした培養室１５内に類胴内皮細胞を播種して内皮細胞ネットワークを形成させ、その後、その内皮細胞上に肝実質細胞を播種して細胞培養を行った。図５の写真から明らかなように、内皮細胞４７のネットワークの中に肝実質細胞４９が遊走しており、生体内の肝組織に近い構造になっていることが判る。

【0058】

上記肝細胞を用いた肝機能評価試験の結果を図７に示す。本実施例の肝組織培養用デバイス１（図中の「デバイス」）と、比較例として一般的な細胞培養用シャーレ（図中の「シャーレ」を使用した。上記の類胴内皮細胞（図中の「ＧＨ７」）と肝実質細胞（図中の「肝細胞」）をそれぞれ単独又は両者の共培養系で培養して各培養細胞の尿素合成能を評価した。尿素合成能はアンモニアを分解して尿素を合成する肝機能である。肝組織培養用デバイスを用いた培養では、培地の供給を流速４０μＬ／ｈ（マイクロリットル／時）で２４時間連続送液して行った。シャーレを用いた培養では一定時間おきに培地交換を行った。

【0059】

図７から明らかなように、肝実質細胞単独で培養した場合に比べて共培養系の方が高い肝機能を示している。特に、本発明の肝組織培養用デバイスで培養した細胞の方がシャーレで培養したものに比べて高い肝機能を示している。これは、肝組織培養用デバイスを用いた培養では培地の連続供給を行ったために組織にシェアストレス（ずり応力）が掛かり、より生体内に近い環境での培養が行われたためと考えられる。

【0060】

また、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１は、上述のように足場材の剥離による流路の詰まりを防止することができる。したがって、肝組織培養用デバイス１は生体内に近い環境での肝細胞の培養を長期間にわたって安定して行うことが可能である。このため、肝組織培養用デバイス１は薬物代謝試験等の様々な系における研究に利用可能であると共に、人工肝臓への展開も期待できる。

【0061】

しかしながら、類胴内皮細胞と肝実質細胞の共培養系は３日程度で構造が崩れてしまう問題があった。本願発明者らは類胴内皮細胞と肝実質細胞の共培養系に星細胞を添加することにより、ネットワーク構造が長期間維持されることを見いだした。

【0062】

図８は、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１を用いて内皮細胞と肝実質細胞を共培養した結果と、これに星細胞を添加した際の結果を示す写真である。

【0063】

ゲル２５の作製、各細胞の播種、培地の供給については上記実施例での説明と同様にして行った。
細胞播種の条件は次のとおりである。
GH7： ５×１０⁵セル／φ３.５ｃｍ（10%FBS-DMEM（Invitrogen社の製品））
Hepatocyte：５×１０⁵セル／φ３.５ｃｍ（10%FBS-DMEM（Invitrogen社の製品））
HUVEC： ４×１０⁵セル／φ３.５ｃｍ（EGM-2：内皮細胞培地キット−２（Lonza社の製品））
TWNT-4： １×１０⁵セル／φ３.５ｃｍ（10%FBS-DMEM（Invitrogen社の製品））

【0064】

図８に示された結果から判るように、内皮細胞と肝実質細胞の共培養系５１に比べて、星細胞（ＴＷＮＴ−４）の添加によって、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系２７は長期的なネットワーク構造の維持が実現できている。

【0065】

本発明の肝組織培養用デバイス又は本発明の肝組織培養用システムを用いれば、肝機能の検討を行うことができる。具体的には、例えば薬物動態試験など、生理活性物質を探索できる分析系が考えられる。

【0066】

なお、ここでは間葉系の細胞として星細胞（ＴＷＮＴ−４）が添加されているが、ＴＷＮＴ−４以外の星細胞が添加された場合であっても長期的なネットワーク構造の維持を実現できる。また、星細胞以外の間葉系の細胞が添加された場合であっても長期的なネットワーク構造の維持を実現できる。

【0067】

以上、本発明の実施例を説明したが、実施例における構成、配置、数値等は一例であり、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内で種々の変更が可能である。

【0068】

例えば上記実施例では細胞の足場材となるゲルとしてＥＨＳ−ｇｅｌが用いられているが、本発明で用いられるゲルはこれに限定されない。本発明で用いられるゲルは、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系が管状の構造、好ましくはネットワーク構造を形成するゲルであればよい。本発明で用いられるゲルは、ＥＨＳ−ｇｅｌに限らず、例えばラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいるゲルであってもよいし、ＥＨＳ−ｇｅｌに他の成分が混合されたゲルであってもよい。

【符号の説明】

【0069】

１ 肝組織培養用デバイス
３ 培養室部分
５ 蓋部分
１５ 培養室
２１ 入口側流路
２３ 出口側流路
２５ ゲル
２７ 内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系
３１，４５ 肝組織培養用システム

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】