特許 6152344 ニッキングエンドヌクレアーゼを用いるアッセイ方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6152344

(24)【登録日】2017年6月2日

(45)【発行日】2017年6月21日

(54)【発明の名称】ニッキングエンドヌクレアーゼを用いるアッセイ方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170612BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170612BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20170612BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20170612BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

   G01N33/483 E

   G01N37/00 101

【請求項の数】28

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2013-530398(P2013-530398)

(86)(22)【出願日】2011年9月26日

(65)【公表番号】特表2013-539973(P2013-539973A)

(43)【公表日】2013年10月31日

(86)【国際出願番号】US2011053274

(87)【国際公開番号】WO2012047589

(87)【国際公開日】20120412

【審査請求日】2014年9月24日

(31)【優先権主張番号】12/891,343

(32)【優先日】2010年9月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515353718

【氏名又は名称】ナブシス ２．０ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】オリバー， ジョン エス．

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／００２８８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０２８１４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００１−５１４４８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１４４２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０５６３８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 NANO LETTERS，２００９年，vol.9,no.9，p.3089-3095

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的被検体を調製し、かつ、該標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニタリングするための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、
ｃ．該ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、
ｄ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型および該一本鎖フラップを、該二本鎖ＤＮＡ鋳型および該一本鎖フラップの電気的検出を増強するタンパク質でコーティングし、それにより、該標的被検体を調製するステップと、
ｅ．該標的被検体が該流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる該電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示し、ここで、（ｉ）一対の検出電極が、該一対の検出電極の間に検出ボリュームを画定するために該流体チャネルに沿って間隔をあけた関係で該流体チャネルに対して垂直に位置され、そして、（ｉｉ）該一対の検出電極の間の該検出ボリュームにおける電気的性質がモニターされる、ステップと
を含む方法。

【請求項2】

前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選択される１種またはそれより多くのエンドヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記塩基伸長反応が、前記第１のＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記タンパク質が、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質からなる群から選択される１種またはそれより多くのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記流体チャネルが、マイクロチャネルまたはナノチャネルを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

少なくとも１つの一本鎖フラップ領域が二本鎖ＤＮＡ鋳型から伸長している該二本鎖ＤＮＡ鋳型を含み、該二本鎖ＤＮＡ鋳型および該一本鎖フラップ領域の少なくとも一部分が該二本鎖ＤＮＡ鋳型および該一本鎖フラップ領域の電気的検出を増強するタンパク質でコーティングされている標的被検体。

【請求項8】

前記タンパク質が、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質からなる群から選択される１種またはそれより多くのタンパク質を含む、請求項７に記載の標的被検体。

【請求項9】

標的被検体を調製し、かつ、該標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニタリングするための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成するステップと、
ｃ．各ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成するステップと、
ｄ．少なくとも１つのフラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って少なくとも１つの二本鎖フラップを形成し、それにより、該標的被検体を調製するステップと、
ｅ．該標的被検体を、該鋳型および該フラップの電気的検出を増強するタンパク質でコーティングするステップと、
ｆ．該標的被検体が該流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる該電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示し、ここで、（ｉ）一対の検出電極が、該一対の検出電極の間に検出ボリュームを画定するために該流体チャネルに沿って間隔をあけた関係で該流体チャネルに対して垂直に位置され、そして、（ｉｉ）該一対の検出電極の間の該検出ボリュームにおける電気的性質がモニターされる、ステップと
を含む方法。

【請求項10】

前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選択される１種またはそれより多くのエンドヌクレアーゼを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の塩基伸長反応が、前記第１のＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記第２の塩基伸長反応が、少なくとも１つのフラップ領域を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記標的被検体の二本鎖領域とフラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

前記タンパク質が、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質からなる群から選択される１種またはそれより多くのタンパク質を含む、請求項９に記載の標的被検体。

【請求項15】

標的被検体を調製し、かつ、該標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニタリングするための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、
ｃ．該ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、
ｄ．該一本鎖フラップを、一本鎖ＤＮＡに選択的に結合して該一本鎖フラップの電気的検出を増強するタンパク質でコーティングし、それにより、該標的被検体を調製するステップと、
ｅ．該標的被検体が該流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる該電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示し、ここで、（ｉ）一対の検出電極が、該一対の検出電極の間に検出ボリュームを画定するために該流体チャネルに沿って間隔をあけた関係で該流体チャネルに対して垂直に位置され、そして、（ｉｉ）該一対の検出電極の間の該検出ボリュームにおける電気的性質がモニターされる、ステップと
を含む方法。

【請求項16】

前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選択される１種またはそれより多くのエンドヌクレアーゼを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記塩基伸長反応が、前記第１のＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

標的被検体を調製し、かつ、該標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニタリングするための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成するステップと、
ｃ．各ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成するステップと、
ｄ．少なくとも１つの一本鎖フラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って、少なくとも１つの二本鎖フラップを形成するステップと、
ｅ．該二本鎖フラップに一本鎖の伸長物を付加するステップと、
ｆ．１種またはそれより多くのプローブを該一本鎖の伸長物とハイブリダイズさせ、それにより、該標的被検体を調製するステップと、
ｇ．該標的被検体が該流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる該電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示し、ここで、（ｉ）一対の検出電極が、該一対の検出電極の間に検出ボリュームを画定するために該流体チャネルに沿って間隔をあけた関係で該流体チャネルに対して垂直に位置され、そして、（ｉｉ）該一対の検出電極の間の該検出ボリュームにおける電気的性質がモニターされる、ステップと
を含む方法。

【請求項20】

前記二本鎖フラップに付加される前記一本鎖の伸長物が一本鎖ポリＴ伸長物である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記プローブがポリＡオリゴマーを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記二本鎖フラップに付加される前記一本鎖の伸長物が一本鎖ポリＡ伸長物である、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記プローブがポリＴオリゴマーを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記プローブがタグ付けされている、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記プローブが金粒子を用いてタグ付けされている、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記一本鎖の伸長物が、ターミナルトランスフェラーゼを使用して前記二本鎖フラップに付加される、請求項１９に記載の方法。

【請求項27】

前記一本鎖の伸長物が少なくとも１００塩基の長さである、請求項１９に記載の方法。

【請求項28】

前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１０年９月２７日に出願された米国特許出願第１２／８９１，３４３号の利益および優先権を主張し、この米国仮特許出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。

【0002】

発明の分野
本発明は、概して、バイオポリマーを分析するためのアッセイ方法およびデバイスに関する。本明細書では、そのようなバイオポリマーをマッピングすることが意図されている。

【背景技術】

【0003】

背景
ヒトＤＮＡなどの種々の生体分子の組成物および配列を正確かつ特異的に同定することは非常に重要である。しかし、マッピングおよび配列決定の技術は、開発し、実行するために時間と費用がかかる。例えば、ヒトゲノムプロジェクトとして単一個体のＤＮＡについて配列決定するためには、３０億ドルを超える財源が必要であった。

【0004】

各人のＤＮＡは、互いに、およそ１０００塩基に１塩基が異なると推定される。ヒト集団におけるそのような遺伝子変異の知見により、科学団体が、種々の医学的素因、状態、または疾患に関連づけられる遺伝的傾向を同定することが可能になり得、また、所与の個体のために、その個体のＤＮＡに基づいて処置がカスタマイズされる、正確に個別化された医療が実現され得る。そのような知見を発展させ、個々の患者の遺伝子構造に基づいた医学的診断および処置を適合させるためには、ＤＮＡマッピングおよび配列決定の時間と費用を縮小することが必要である。

【0005】

新しいＤＮＡ配列決定技術により多くの短い読み取り（ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄ）（配列決定されたＤＮＡの長さ）が生じ、次いでそれを用いて試料全体の配列を組み立てる。これらの「短い読み取り」技術により、２５塩基から４００塩基までの長さの読み取りが配列決定されている。サイズまたは複雑さがそれほど大きくないゲノムについては、これらの短い読み取りでは、配列内に繰り返しが出現するので、試料の配列を正確に組み立てることができない。組み立てを先導するためにＤＮＡマッピングを用いることができる。例えば、短い読み取りデータの組み立てを補助するために制限マップを用いることができる。短い読み取り技術によりデータを組み立てることを可能にするためには、より迅速かつより密度の高いマップが有用であると思われる。

【0006】

ハイブリダイゼーション補助ナノポアシーケンシング（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＨＡＮＳ）は、ナノポアに基づく、ＤＮＡおよび他の生体分子のゲノムの長さについて配列決定するための方法である。この方法は、配列決定しようとしている、または特徴付けようとしている生体分子の特定の部分にプローブがハイブリダイズする位置を検出することに依拠する。

【0007】

この方法では、２つの溶液のレザバーを、寸法が分かっている流体狭窄部（ｆｌｕｉｄｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）としての機能を果たすナノメートルサイズの穴、またはナノポアによって分離する。２つのレザバーの間に一定のＤＣ電圧を加えることにより、測定されるベースラインのイオン電流がもたらされる。被検体をレザバーに導入すると、被検体が流体チャネル（ｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈａｎｎｅｌ）を通過し、電解質溶液と被検体では導電率が違うことにより、観察される電流が変化し得る。電流の変化の大きさは、被検体が流体チャネル内にある間に、その被検体で置き換えられる電解質の体積に左右される。電流の変化の持続時間は、被検体がナノポア狭窄部を通過するのにかかる時間に関連する。生体分子におけるプローブの位置の決定には電流信号が使用されている。プローブの位置を測定することにより、コンピュータアルゴリズムを用いて生体分子の配列を正確に再建することが可能になる。ヒトゲノムを新規に組み立てるために、迅速かつ正確に核酸をマッピングし、配列決定することができる効率的な方法およびデバイスが必要とされている。長い読み取り長を有すること、できるだけ少ない核酸鋳型を使用することが望ましい。

【0008】

マッピングおよび配列決定は、流体ナノチャネルおよび流体マイクロチャネルに基づくデバイスを用いて実現することもできる。これらの系では、被検体を、ナノチャネルまたはマイクロチャネルを通して移行させ、その通過をチャネルの長さに沿って位置させた電極によって検出する。２０１０年５月２８日に出願され、その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国特許出願第１２／７８９，８１７号に記載の一実施形態では、第１の電極対が、その間の参照電圧を与えるようにチャネルに沿って縦方向に位置させている。第２の電極対は検出ボリュームを定義するためにチャネル全体にわたって位置させている。被検体が検出ボリュームを通過するときに、電気的性質の検出可能な変化、例えば、参照電圧の変化が引き起こされる。被検体とハイブリダイズしたプローブが検出ボリューム内に入ると、それにより電気的性質のさらなる変化が引き起こされる。したがって、被検体がいつ検出ボリュームに存在しているか、ならびに、ハイブリダイズしたプローブが検出ボリューム内に入ると、その絶対的な位置または相対的な位置を検出することが可能である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

前述のことにもかかわらず、そのようなバイオポリマーについてマッピングし、配列決定するための改善されたアッセイ方法を含めた、バイオポリマーを分析するための改善された方法およびデバイスが依然として必要である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

要旨
本発明の実施形態は、ナノポア、マイクロチャネルまたはナノチャネル分析デバイスを用いてマッピングするために適した標的被検体試料を調製するためのアッセイ方法に関する。

【0011】

一実施形態では、該方法は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、ｂ）二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼ（ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）と接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、ｃ）ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、鋳型上に、ニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、ｄ）二本鎖ＤＮＡ鋳型を、鋳型および一本鎖フラップの電気的検出を増強する結合性部分でコーティングし、それにより、標的被検体を調製するステップとを含む。

【0012】

別の実施形態では、該方法は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、ｂ）鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成するステップと、ｃ）各ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成するステップと、ｄ）少なくとも１つのフラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って少なくとも１つの二本鎖フラップを形成し、それにより、標的被検体を調製するステップとを含む。この実施形態では、生じた被検体の全部または一部を、結合性部分でコーティングすることができる。したがって、この実施形態では、二本鎖フラップ、ならびに二本鎖ＤＮＡ鋳型を、結合性部分でコーティングする追加のステップを用いることができる。

【0013】

さらに別の実施形態では、該方法は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、ｂ）二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、ｃ）ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、ｄ）一本鎖フラップを、一本鎖ＤＮＡに選択的に結合して一本鎖フラップの電気的検出を増強する結合性部分でコーティングし、それにより、標的被検体を調製するステップとを含む。

【0014】

別の実施形態では、該方法は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、ｂ）鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成するステップと、ｃ）各ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成するステップと、ｄ）少なくとも１つの一本鎖フラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って、少なくとも１つの二本鎖フラップを形成するステップと、ｅ）二本鎖フラップに一本鎖の伸長物を付加するステップと、ｆ）１種またはそれより多くのプローブを上記一本鎖の伸長物とハイブリダイズさせ、それにより、標的被検体を調製するステップとを含む。一本鎖の伸長物は少なくとも１００塩基の長さであってよく、ポリＴポリマーまたはポリＡポリマーを含んでよい。この伸長物は、ターミナルトランスフェラーゼを使用して二本鎖フラップに付加することができる。プローブは金粒子でタグ付けされていてよく、また、ポリＡオリゴマー（ポリＴ伸長物の場合）、またはポリＴオリゴマー（ポリＡ伸長物の場合）を含んでよい。

【0015】

上記の各実施形態では、分析される生体分子は二本鎖ＤＮＡであってよい。ニッキングエンドヌクレアーゼは、単独で、または種々に組み合わせて使用されるＮｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩであってよいが、任意のニッキングエンドヌクレアーゼを単独で、または組み合わせて用いることができる。塩基伸長反応は、ＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることによって実現することができる。結合性部分は、タンパク質であってよい。適切なタンパク質の例としては、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質が挙げられる。

【0016】

本発明の別の実施形態は、１つまたはそれより多くの二本鎖ＤＮＡフラップを有する二本鎖ＤＮＡ断片を含む標的被検体、および結合性部分でコーティングされた１つまたはそれより多くの一本鎖ＤＮＡフラップまたは二本鎖ＤＮＡフラップを有する二本鎖ＤＮＡ断片を含む標的被検体に関する。一本鎖の伸長物を有する１つまたはそれより多くの二本鎖フラップを有するＤＮＡ断片も意図されている。上記伸長物は、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることができ、プローブは、金粒子などのタグを含んでよい。

【0017】

本発明の方法によって調製された標的被検体は、ナノポア系、ならびにナノチャネルまたはマイクロチャネルを使用する流体チャネル系において位置情報が検出されるように構成される。したがって、本発明の実施形態は、上記の方法を用いて作製された標的被検体がナノポアまたは流体チャネルを通って移動するときに、ナノポアまたは流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニターすることに関する。モニターされた変化により、標的被検体の二本鎖領域ならびにフラップ領域が示される。さらに、本発明の実施形態は、検出された電気的性質の変化を用いて、標的被検体における二本鎖領域とフラップ領域を区別することに関する。この区別を用いて、ニックの場所を決定し、それにより、ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングすることができる。

【0018】

したがって、一実施形態では、本発明は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供し、ｂ）二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成し、ｃ）ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、鋳型上に、ニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成し、ｄ）二本鎖ＤＮＡ鋳型を、鋳型および一本鎖フラップの電気的検出を増強する結合性部分でコーティングし、それにより、標的被検体を調製し、ｅ）標的被検体がナノポアを通ってまたは流体マイクロチャネルもしくは流体ナノチャネルを横切って移動するときの、標的被検体の二本鎖領域および一本鎖フラップ領域を示す電気的性質の変化をモニターする方法に関する。さらに、ニックの場所を決定し、二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするために、少なくとも一部は、検出された電気的性質の変化に基づいて、二本鎖鋳型と一本鎖フラップ領域を区別する追加のステップも用いることができる。

【0019】

別の実施形態では、本発明は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供し、ｂ）鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成し、ｃ）各ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成し、ｄ）少なくとも１つのフラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って少なくとも１つの二本鎖フラップを形成し、それにより、標的被検体を調製し、ｅ）標的被検体がナノポアを通ってまたは流体マイクロチャネルもしくは流体ナノチャネルを横切って移動するときの、標的被検体の二本鎖領域および二本鎖フラップ領域を示す電気的性質の変化をモニターする方法に関する。さらに、ニックの場所を決定し、二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするために、少なくとも一部は、検出された電気的性質の変化に基づいて、二本鎖鋳型と二本鎖フラップ領域を区別する追加のステップも用いることができる。

【0020】

さらに別の実施形態では、該方法は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、ｂ）二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、ｃ）ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、ｄ）一本鎖フラップの電気的検出を増強するために、一本鎖フラップを、一本鎖ＤＮＡに選択的に結合する結合性部分でコーティングし、それにより、標的被検体を調製するステップと、ｅ）標的被検体がナノポアを通ってまたは流体マイクロチャネルもしくは流体ナノチャネルを横切って移動するときの、標的被検体の二本鎖領域および一本鎖フラップ領域を示す電気的性質の変化をモニターするステップとを含む。さらに、ニックの場所を決定し、二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするために、少なくとも一部は、検出された電気的性質の変化に基づいて、二本鎖鋳型と一本鎖フラップ領域を区別する追加のステップも用いることができる。

【0021】

別の実施形態では、該方法は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、ｂ）鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成するステップと、ｃ）各ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成するステップと、ｄ）少なくとも１つの一本鎖フラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って、少なくとも１つの二本鎖フラップを形成するステップと、ｅ）二本鎖フラップに一本鎖の伸長物を付加するステップと、ｆ）１種またはそれより多くのプローブを一本鎖の伸長物とハイブリダイズさせ、それにより、標的被検体を調製するステップとを含む。標的被検体がナノポアを通って、または流体マイクロチャネルもしくは流体ナノチャネルを横切って移動するときに、標的被検体の二本鎖領域および伸長したフラップ領域を示す、電気的性質の変化をモニターすることができる。さらに、ニックの場所を決定し、二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするために、少なくとも一部は、検出された電気的性質の変化に基づいて、二本鎖鋳型と伸長したフラップ領域を区別する追加のステップも用いることができる。

【0022】

別の実施形態では、該方法は、ａ）それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、ｂ）二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、ｃ）ニックにおいて開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、第１のＤＮＡ鎖において、第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、鋳型上に、ニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、ｄ）標的被検体がナノポアを通ってまたは流体マイクロチャネルもしくは流体ナノチャネルを横切って移動するときの、標的被検体の二本鎖領域および一本鎖フラップ領域を示す電気的性質の変化をモニターするステップとを含む。さらに、ニックの場所を決定し、二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするために、少なくとも一部は、検出された電気的性質の変化に基づいて、二本鎖鋳型と一本鎖フラップ領域を区別する追加のステップも用いることができる。

【0023】

前述した通り、上記の各実施形態では、分析される生体分子は二本鎖ＤＮＡであってよい。ニッキングエンドヌクレアーゼは、単独で、または種々に組み合わせて使用されるＮｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩであってよいが、任意のニッキングエンドヌクレアーゼを単独で、または組み合わせて用いることができる。塩基伸長反応は、ＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることによって実現することができる。使用する場合、結合性部分は、タンパク質であってよい。適切なタンパク質の例としては、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質が挙げられる。

【0024】

二本鎖フラップ領域上に一本鎖の伸長物が形成される場合では、一本鎖の伸長物は少なくとも１００塩基の長さであってよく、また、ポリＴポリマーまたはポリＡポリマーを含んでよい。この伸長物は、ターミナルトランスフェラーゼを使用して二本鎖フラップに付加することができる。プローブは、例えば金粒子を用いてタグ付けされていてよく、また、ポリＡオリゴマー（ポリＴ伸長物の場合）、またはポリＴオリゴマー（ポリＡ伸長物の場合）を含んでよい。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
標的被検体を調製するための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、
ｃ．該ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、
ｄ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型を、該二本鎖ＤＮＡ鋳型および該一本鎖フラップの電気的検出を増強する結合性部分でコーティングし、それにより、該標的被検体を調製するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選択される１種またはそれより多くのエンドヌクレアーゼを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記塩基伸長反応が、前記第１のＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記結合性部分がタンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記タンパク質が、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質からなる群から選択される１種またはそれより多くのタンパク質を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記標的被検体が、ナノポア系において位置情報が検出されるように構成される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記標的被検体がナノポアを通って移動するときの該ナノポア全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記標的被検体が、流体チャネル系において位置情報が検出されるように構成される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記流体チャネルが、マイクロチャネルまたはナノチャネルを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
少なくとも１つの一本鎖フラップ領域が二本鎖ＤＮＡ鋳型から伸長している該二本鎖ＤＮＡ鋳型を含み、該二本鎖ＤＮＡ鋳型および該一本鎖フラップ領域の少なくとも一部分が該二本鎖ＤＮＡ鋳型および該一本鎖フラップ領域の電気的検出を増強する結合性部分でコーティングされている標的被検体。
（項目１４）
前記結合性部分がタンパク質を含む、項目１３に記載の標的被検体。
（項目１５）
前記タンパク質が、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質からなる群から選択される１種またはそれより多くのタンパク質を含む、項目１４に記載の標的被検体。
（項目１６）
標的被検体を調製するための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成するステップと、
ｃ．各ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成するステップと、
ｄ．少なくとも１つのフラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って少なくとも１つの二本鎖フラップを形成し、それにより、該標的被検体を調製するステップと
を含む方法。
（項目１７）
前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選択される１種またはそれより多くのエンドヌクレアーゼを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の塩基伸長反応が、前記第１のＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記第２の塩基伸長反応が、少なくとも１つのフラップ領域を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記標的被検体が、ナノポア系において位置情報が検出されるように構成される、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記標的被検体がナノポアを通って移動するときの該ナノポア全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記標的被検体の二本鎖領域とフラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記標的被検体が、流体チャネル系において位置情報が検出されるように構成される、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
前記流体チャネルが、マイクロチャネルまたはナノチャネルを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記標的被検体の二本鎖領域とフラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記標的被検体を、前記鋳型および前記フラップの電気的検出を増強する結合性部分でコーティングするステップ
をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目２８）
前記結合性部分がタンパク質を含む、項目２７に記載の標的被検体。
（項目２９）
前記タンパク質が、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質からなる群から選択される１種またはそれより多くのタンパク質を含む、項目２８に記載の標的被検体。
（項目３０）
前記標的被検体が、ナノポア系において位置情報が検出されるように構成される、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記標的被検体がナノポアを通って移動するときの該ナノポア全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記標的被検体の二本鎖領域とフラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記標的被検体が、流体チャネル系において位置情報が検出されるように構成される、項目２７に記載の方法。
（項目３４）
前記流体チャネルが、マイクロチャネルまたはナノチャネルを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記標的被検体の二本鎖領域とフラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
１つまたはそれより多くの二本鎖フラップ領域が二本鎖ＤＮＡ鋳型から伸長している該二本鎖ＤＮＡ鋳型を含む標的被検体。
（項目３８）
前記二本鎖鋳型の少なくとも一部分および前記二本鎖フラップ領域の１つまたはそれより多くが該鋳型および該フラップの電気的検出を増強する結合性部分でコーティングされている、項目３７に記載の標的被検体。
（項目３９）
前記結合性部分がタンパク質を含む、項目３８に記載の標的被検体。
（項目４０）
前記タンパク質が、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質からなる群から選択される１種またはそれより多くのタンパク質を含む、項目３９に記載の標的被検体。
（項目４１）
標的被検体を調製するための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、
ｃ．該ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、
ｄ．該標的被検体がナノポアを通って移動するときの該ナノポア全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および該一本鎖フラップ領域を示すステップ、と
を含む方法。
（項目４２）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
標的被検体を調製するための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、
ｃ．該ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、
ｄ．該標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および該一本鎖フラップ領域を示すステップ、と
を含む方法。
（項目４４）
前記流体チャネルが、マイクロチャネルまたはナノチャネルを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
標的被検体を調製するための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的なニッキング場所に１つのニックを形成するステップと、
ｃ．該ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップを形成するステップと、
ｄ．該一本鎖フラップを、一本鎖ＤＮＡに選択的に結合して該一本鎖フラップの電気的検出を増強する結合性部分でコーティングし、それにより、該標的被検体を調製するステップと
を含む方法。
（項目４７）
前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩからなる群から選択される１種またはそれより多くのエンドヌクレアーゼを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記塩基伸長反応が、前記第１のＤＮＡ鎖を、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させるステップを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記結合性部分がタンパク質を含む、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記標的被検体が、ナノポア系において位置情報が検出されるように構成される、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
前記標的被検体がナノポアを通って移動するときの該ナノポア全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記標的被検体が、流体チャネル系において位置情報が検出されるように構成される、項目４６に記載の方法。
（項目５４）
前記流体チャネルが、マイクロチャネルまたはナノチャネルを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
少なくとも１つの一本鎖フラップ領域が二本鎖ＤＮＡ鋳型から伸長している該二本鎖ＤＮＡ鋳型を含み、該一本鎖フラップ領域がその電気的検出を増強する結合性部分でコーティングされている標的被検体。
（項目５８）
標的被検体を調製するための方法であって、
ａ．それぞれ５’末端と３’末端を有する第１のＤＮＡ鎖と第２のＤＮＡ鎖を有する二本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するステップと、
ｂ．該鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させて、該第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成するステップと、
ｃ．各ニックにおいて開始し、該第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行する第１の塩基伸長反応を、該第１のＤＮＡ鎖において、該第２のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って行い、それにより、該二本鎖ＤＮＡ鋳型上に、該配列特異的なニッキング場所に隣接した一本鎖フラップ領域を形成するステップと、
ｄ．少なくとも１つの一本鎖フラップ領域において第２の塩基伸長反応を行って、少なくとも１つの二本鎖フラップを形成するステップと、
ｅ．該二本鎖フラップに一本鎖の伸長物を付加するステップと、
ｆ．１種またはそれより多くのプローブを該一本鎖の伸長物とハイブリダイズさせ、それにより、該標的被検体を調製するステップと
を含む方法。
（項目５９）
前記二本鎖フラップに付加される前記一本鎖の伸長物が一本鎖ポリＴ伸長物である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記プローブがポリＡオリゴマーを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記二本鎖フラップに付加される前記一本鎖の伸長物が一本鎖ポリＡ伸長物である、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記プローブがポリＴオリゴマーを含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記プローブがタグ付けされている、項目５８に記載の方法。
（項目６４）
前記プローブが金粒子を用いてタグ付けされている、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記一本鎖の伸長物が、ターミナルトランスフェラーゼを使用して前記二本鎖フラップに付加される、項目５８に記載の方法。
（項目６６）
前記一本鎖の伸長物が少なくとも１００塩基の長さである、項目５８に記載の方法。
（項目６７）
１つまたはそれより多くの二本鎖フラップ領域が二本鎖ＤＮＡ鋳型から伸長している該二本鎖ＤＮＡ鋳型を含み、少なくとも１つの二本鎖フラップ領域に一本鎖の伸長物が付加された標的被検体。
（項目６８）
前記一本鎖の伸長物とハイブリダイズした少なくとも１つのプローブをさらに含む、項目６７に記載の標的被検体。
（項目６９）
前記一本鎖の伸長物が一本鎖ポリＴ伸長物を含む、項目６７に記載の標的被検体。
（項目７０）
前記一本鎖の伸長物が一本鎖ポリＡ伸長物を含む、項目６７に記載の標的被検体。
（項目７１）
前記プローブがポリＡオリゴマーまたはポリＴオリゴマーを含む、項目６８に記載の標的被検体。
（項目７２）
前記プローブがタグ付けされている、項目６８に記載の標的被検体。
（項目７３）
前記プローブが金粒子を用いてタグ付けされている、項目７２に記載の標的被検体。
（項目７４）
前記標的被検体が、ナノポア系において位置情報が検出されるように構成される、項目５８に記載の方法。
（項目７５）
前記標的被検体がナノポアを通って移動するときの該ナノポア全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記標的被検体が、流体チャネル系において位置情報が検出されるように構成される、項目５８に記載の方法。
（項目７８）
前記流体チャネルが、マイクロチャネルまたはナノチャネルを含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの該流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化をモニターするステップであって、該電気的性質の該変化が、該標的被検体の二本鎖領域および前記一本鎖フラップ領域を示すステップ、
をさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記標的被検体の二本鎖領域と一本鎖フラップ領域を、少なくとも一部は、検出された前記電気的性質の前記変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、前記二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングするステップ
をさらに含む、項目７９に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、ＤＮＡ分子の概略図である。

【図2a】図２ａは、ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩの認識およびニッキング部位が示されているＤＮＡ分子の概略図である。

【図2b】図２ｂは、ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩと反応させた後のＤＮＡ分子の概略図である。

【図3】図３は、ニッキング部位で始まる塩基伸長反応の後の、ニックが入ったＤＮＡ分子の概略図である。

【図4a】図４ａは、図３のＤＮＡ分子を、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに結合する結合性部分と接触させた後の該分子の概略図である。

【図4b】図４ｂは、図３のＤＮＡ分子を、一本鎖ＤＮＡに優先的に結合する結合性部分と接触させた後の該分子の概略図である。

【図5a】図５ａは、ニッキングエンドヌクレアーゼの認識およびニッキング部位が示されているＤＮＡ分子の概略図である。

【図5b】図５ｂは、ニッキングエンドヌクレアーゼと反応させた後のＤＮＡ分子の概略図である。

【図5c】図５ｃは、フラップを形成するための第１の塩基伸長反応の後の、ニックが入ったＤＮＡ分子の概略図である。

【図5d】図５ｄは、オリゴヌクレオチドプローブをフラップとハイブリダイズさせた後のＤＮＡ分子の概略図である。

【図5e】図５ｅは、二本鎖フラップを形成するための第２の塩基伸長反応の後のＤＮＡ分子の概略図である。

【図5f】図５ｆは、二本鎖フラップを有するＤＮＡ分子の概略図である。

【図6】図６は、図５ｆのＤＮＡ分子を結合性部分と接触させた後の該分子の概略図である。

【図7a】図７ａは、ニッキングエンドヌクレアーゼと反応させた後の、複数の接近した間隔にある（ｃｌｏｓｅｌｙ−ｓｐａｃｅｄ）認識およびニッキング部位を有するＤＮＡ分子の概略図である。

【図7b】図７ｂは、複数のフラップを形成するための第１の塩基伸長反応の後の、図７ａのＤＮＡ分子の概略図である。

【図7c】図７ｃは、単一のフラップの分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を示す、図７ｂのＤＮＡ分子の一部の概略図である。

【図7d】図７ｄは、フラップにプローブをハイブリダイズさせ、塩基伸長反応を用いてフラップを二本鎖ＤＮＡに変換した後の、図７ｃのＤＮＡ分子の部分の概略図である。

【図7e】図７ｅは、一本鎖の伸長物をフラップに付加した後の、図７ｄのＤＮＡ分子の部分の概略図である。

【図7f】図７ｆは、上記伸長物に相補的なオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせた後の、図７ｅのＤＮＡ分子の部分の概略図である。

【図7g】図７ｇは、上記伸長物に、タグ付けされた相補的なオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせた後の、図７ｅのＤＮＡ分子の部分の概略図である。

【図8a】図８ａは、ナノポア装置内のフラップを有するＤＮＡ分子の概略図である。

【図8b】図８ｂは、フラップを有するＤＮＡ分子が図８ａのナノポア装置を通って移動するときの電流測定波形の概略図である。

【図9】図９は、本発明の被検体をマッピングするために有用な流体チャネル装置の概略図であり、流体チャネルは、ナノチャネルまたはマイクロチャネルであってよい。

【図10a】図１０ａは、フラップを有するＤＮＡ分子が図９の装置内の検出ボリューム内に入るときの電位測定の概略図である。

【図10b】図１０ｂは、ＤＮＡ分子上のフラップが図９の装置内の検出ボリュームに入るときの電位測定の概略図である。

【図10c】図１０ｃは、ＤＮＡ分子上のフラップが図９の装置内の検出ボリュームから出るときの電位測定の概略図である。

【図10d】図１０ｄは、フラップを有するＤＮＡ分子が図９の装置内の検出ボリュームから出るときの電位測定の概略図である。

【図11】図１１は、複数の検出ボリュームを有するナノチャネル装置またはマイクロチャネル装置の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、以下の用語 は、文脈によりそうでないことが示される場合を除き、与えられた意味を有するものとする。

【0027】

「被検体」または「標的」とは、二本鎖ＤＮＡ生体分子を意味する。

【0028】

「ＤＮＡ鋳型」とは、追加の分子構造を合成するための型としての機能を果たすＤＮＡ分子を意味する。

【0029】

「結合性部分」とは、被検体にコーティングをもたらすことができるタンパク質などの実体を意味する。

【0030】

「エンドヌクレアーゼ」とは、ホスホジエステル結合をポリヌクレオチド鎖の末端で切断するエキソヌクレアーゼとは対照的に、ホスホジエステル結合をポリヌクレオチド鎖内で切断する酵素である。

【0031】

「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、ＤＮＡを特定の部位で切断する。

【0032】

「ニッキングエンドヌクレアーゼ」または「ニッカーゼ」は、制限エンドヌクレアーゼの１つの形態である。制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ内の特異的なヌクレオチド配列を認識し、一般に、両方の鎖を切断する。しかし、いくつかの配列特異的なエンドヌクレアーゼは、鎖の一方のみを切断する。これらのエンドヌクレアーゼはニッキングエンドヌクレアーゼとして公知である。

【0033】

生体分子および生体分子／タンパク質複合体の、ナノポア配列決定系、ナノチャネル配列決定系またはマイクロチャネル配列決定系を通る移動は、生体分子がその系を通過していることを示す電気信号、ならびに生体分子上に形成された一本鎖フラップまたは二本鎖フラップがその系を通過していることを示す電気信号を検出することを含み得る。生体分子および／またはフラップは、タンパク質などの結合性部分でコーティングすることができる。移動の時間により、生体分子の長さが示され得る。検出ステップにより、コーティングされた領域は、コーティングされていない領域の信号の約１０倍の信号を有し得るので、コーティングされた領域、コーティングされていない領域、または複合的にコーティングされた領域を識別することができる。信号対雑音比の増加により、生体分子上に形成されたフラップの検出の信頼度が増加し得る。標的生体分子上のフラップの位置情報を用いて、ニッキング部位を同定し、それにより、生体分子のマッピングを容易にすることができる。

【0034】

図１を参照すると、ＤＮＡ分子１０、例えば、二本鎖ＤＮＡ鋳型が概略的に描かれている。分子１０は、互いに逆平行関係で位置させている２本のＤＮＡ鎖、例えば、第１の鎖１２と第２の鎖１４を含む。この２本のＤＮＡ鎖は、上鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）１２、および下鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）１４とも称することができる。２本の向かい合う鎖１２、１４のそれぞれは、ヌクレオチド１６の繰り返し群から逐次的に形成され得、各ヌクレオチド１６は、リン酸基、２−デオキシリボース糖および４種の窒素を含有する塩基のうちの１つからなる。窒素を含有する塩基としては、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）が挙げられる。各ＤＮＡ鎖は５’末端と３’末端を有する。特に、ＤＮＡ鎖１２、１４は、上部（５’または「５プライム（ｆｉｖｅ ｐｒｉｍｅ）」末端と称される）から下部（３’または「３プライム（ｔｈｒｅｅ ｐｒｉｍｅ）」末端と称される）への特定の方向で読み取られる。同様に、ＲＮＡ分子はポリヌクレオチド鎖であり、これは、ＤＮＡのポリヌクレオチド鎖とは、デオキシリボースの代わりにリボース糖を有し、また、チミン塩基（Ｔ）の代わりにウラシル塩基（Ｕ）を有することで異なる。

【0035】

上記分子内の塩基は互いに同等の親和性を共有しない。チミン（Ｔ）塩基はアデニン（Ａ）塩基との結合を好み、一方シトシン（Ｃ）塩基はグアニン（Ｇ）塩基との結合を好む。結合は、向かい合う塩基対の間に存在する水素結合に媒介される。例えば、塩基Ａは、２つの水素結合を用いて塩基Ｔに結合し、一方、塩基Ｃは、３つの水素結合を用いて塩基Ｇに結合する。

【0036】

本発明の実施形態において有用なニッキングエンドヌクレアーゼとしては、単独で、または種々に組み合わせて使用されるＮｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩが挙げられる。上記の通り、ニッカーゼは、認識部位において二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断することを特徴とする配列特異的なエンドヌクレアーゼである。

【0037】

ニッカーゼＮｂ．ＢｂｖＣＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ由来のＢｂｖＣＩ制限遺伝子の変更された形態［Ｒａ＋：Ｒｂ（Ｅ１７７Ｇ）］を発現しているＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｂ．ＢｂｖＣＩは、以下の認識部位にニックを入れる（

【0038】

【化1】

はニッキング部位を示し、「Ｎ」はＣ、Ａ、ＧまたはＴのうちの任意の１つを示す）：

【0039】

【化2】

ニッカーゼＮｂ．ＢｓｍＩはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＵＢ３６由来のクローニングされたＢｓｍＩ遺伝子を担持するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｂ．ＢｓｍＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0040】

【化3】

ニッカーゼＮｂ．ＢｓｒＤＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｄ７０由来のＢｓｒＤＩ制限遺伝子の大サブユニットのみを発現しているＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｂ．ＢｓｒＤＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0041】

【化4】

ニッカーゼＮｂ．ＢｔｓＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ由来のＢｔｓＩ制限遺伝子の大サブユニットのみを発現しているＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｂ．ＢｔｓＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0042】

【化5】

ニッカーゼＮｔ．ＡｌｗＩは、上鎖の認識配列の３’末端を越えた４つの塩基のところでの一本鎖切断を触媒するＡｌｗＩの、工学的に作製された誘導体である。Ｎｔ．ＡｌｗＩは、ＡｌｗＩのＤＮＡ認識ドメインおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの切断／二量体形成ドメインをコードするキメラ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｔ．ＡｌｗＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0043】

【化6】

ニッカーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ由来のＢｂｖＣＩ制限遺伝子の変更された形態［Ｒａ（Ｋ１６９Ｅ）：Ｒｂ＋］を発現しているＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｔ．ＢｂｖＣＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0044】

【化7】

ニッカーゼＮｔ．ＢｓｍＡＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ａ６６４由来のＢｓｍＡＩ制限遺伝子の変更された形態を発現しているＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｔ．ＢｓｍＡＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0045】

【化8】

ニッカーゼＮｔ．ＢｓｐＱＩは、ＢｓｐＱＩ制限酵素由来の工学的に作製されたＢｓｐＱＩ変異体を発現しているＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｔ．ＢｓｐＱＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0046】

【化9】

ニッカーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩは、認識配列の３’側を越えた４つの塩基のところでの一本鎖切断を触媒する。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ３３Ｍ由来のクローニングされたＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ遺伝子を担持するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0047】

【化10】

ニッカーゼＮｔ．ＣｖｉＰＩＩは、二本鎖ＤＮＡ基質のＤＮＡの一方の鎖を切断する。ｐＵＣ１９（プラスミドクローニングベクター）での最終産物は、２５〜２００塩基対のバンドのアレイである。ＣＣＴの切断はＣＣＧおよびＣＣＡの切断よりも効率的ではなく、ＣＣＴ部位の一部は切断されないままである。Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩは、Ｍｘｅ ＧｙｒＡインテイン、キチン結合ドメインおよびクロレラウイルスＮＹｓ−１由来のＮｔ．ＣｖｉＰＩＩニッキングエンドヌクレアーゼ遺伝子の切断形態の融合物を発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩは、以下の認識部位にニックを入れる：

【0048】

【化11】

上記の制限エンドヌクレアーゼはそれぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｏｆ Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡから入手可能である。

【0049】

本発明は、上記のニッキングエンドヌクレアーゼに限定されるものではなく、二本鎖ＤＮＡ分子内にニックをもたらすことができる任意のエンドヌクレアーゼを本発明の方法に従って使用できることが予測されることが理解されるべきである。

【0050】

本発明の一実施形態が、図２ａ〜４ａまたは図４ｂに示されている。図２ａには、図１のＤＮＡ分子１０が示されている。ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩの認識配列が枠に囲まれた領域１８によって示され、そのニッキングエンドヌクレアーゼの特異的なニッキング部位２０が識別される。二本鎖ＤＮＡ鋳型をニッキングエンドヌクレアーゼと接触させる。図２ｂでは、ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩによりＤＮＡ分子の上鎖が切断され、上のＤＮＡ鎖１２上の配列特異的なニッキング場所にニック２０’が残されている。

【0051】

図３に示されているように、ニック部位（点で示されている）から始まる、例えば、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを利用するプライマー伸長反応などの塩基伸長反応２２を行う。塩基伸長反応は、上のＤＮＡ鎖において、下のＤＮＡ鎖の対応する領域に沿って（かつそれに準じて）行う。核酸鋳型と相補的な核酸を形成するそのような反応では、一本鎖ＤＮＡ鋳型と相補的なプライマーが一般に使用される。プライマーから開始し、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、プライマーの３’末端に鋳型と相補的なモノヌクレオチドを付加することができる。種々の塩基伸長反応は当業者には良く知られている。塩基伸長反応が上鎖の３’末端に向かって進行するにつれ、一本鎖ＤＮＡのフラップ２４が元のＤＮＡ分子の上鎖から形成される。フラップ２４は一本鎖であり、配列特異的なニッキング場所に隣接している。フラップ２４が所望の長さに到達するまで塩基伸長反応を進行させ、それにより、二本鎖ＤＮＡ分子とフラップとを含む標的被検体が形成される。フラップが存在することが、例えばＨＡＮＳ、または他のナノポアに基づく検出技法、ナノチャネルに基づく検出技法、またはマイクロチャネルに基づく検出技法による検出に役立つ。一実施形態では、フラップ２４は少なくとも１００塩基の長さであることが好ましいが、本発明は、そのように限定されることを意図するものではない。

【0052】

最後に、図４ａおよび４ｂに示されているように、結合性部分を使用して、ＤＮＡ分子またはその部分をコーティングすることができる。図４ａでは、結合性部分３０を使用してＤＮＡ分子の鎖１２、１４の両方ならびに一本鎖フラップ２４がコーティングされている。あるいは、図４ｂに示されているように、一本鎖ＤＮＡに対する優先性を有する結合性部分３０’を使用して、上記の方法によってＤＮＡ分子上に形成された一本鎖フラップのみをコーティングする。

【0053】

結合性部分３０は、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質または他の組成物を含んでよい、または、それから本質的になってよい。一実施形態では、結合性部分はタンパク質ＲｅｃＡである。結合性部分により、二本鎖ＤＮＡ鋳型およびフラップの、例えば、ＨＡＮＳ、または他のナノポアに基づく検出技法、ナノチャネルに基づく検出技法、またはマイクロチャネルに基づく検出技法による電気的検出を増強することができる。

【0054】

Ｅ．ｃｏｌｉ由来のタンパク質ＲｅｃＡは、一般には、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに協同的な様式で結合して、タンパク質のコアおよび外側の鞘（ｓｈｅａｔｈ）にＤＮＡを含有するフィラメントを形成する（ＭｃＥｎｔｅｅ， Ｋ．； Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ， Ｇ．Ｍ．； Ｌｅｈｍａｎ， Ｉ．Ｒ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＲｅｃＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ Ｓｉｎｇｌｅ− ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８１年、２５６巻、８８３５頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡの直径は約２ｎｍであるが、ＲｅｃＡでコーティングされたＤＮＡの直径は約１０ｎｍである。ＤＮＡの増大が持続する長さは約９５０ｎｍであり、対照的に、一本鎖ＤＮＡでは０．７５ｎｍであり、二本鎖ＤＮＡでは５０ｎｍである。Ｔ４遺伝子３２タンパク質は一本鎖ＤＮＡに協同的に結合することが公知である（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．Ｍ．； Ｆｒｅｙ， Ｌ． Ｔ４ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｇｅｎｅ３２：Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ． Ｎａｔｕｒｅ、１９７０年、２２７巻、１３１３〜１３１８頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質は、塩濃度およびマグネシウム濃度に応じて、いくつかの形態で一本鎖ＤＮＡに結合する（Ｌｏｈｍａｎ， Ｔ．Ｍ．； Ｆｅｒｒａｒｉ， Ｍ． Ｅ． Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ： Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｅｓ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９４年、６３巻、５２７〜５７０頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質は、生体分子上に異なるコーティングを形成し得る。ｆ１遺伝子Ｖタンパク質は一本鎖ＤＮＡをコーティングすることが公知であり（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ， Ｔ．Ｃ． Ｇｅｎｅ Ｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｄＡ）． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６年、３５巻、１６６５２頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ヒト複製タンパク質Ａ（Ｋｉｍ， Ｃ； Ｓｎｙｄｅｒ， Ｒ．Ｏ．； Ｗｏｌｄ， Ｍ．Ｓ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９２年、１２巻、３０５０頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質（Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｄ．； Ｇｒａｙ， Ｄ．Ｍ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｆ３ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３年、３２巻、１２５３８頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、およびアデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｔｕｃｋｅｒ， Ｐ．Ａ．； Ｔｓｅｒｎｏｇｌｏｕ， Ｄ．； Ｔｕｃｋｅｒ， Ａ．Ｄ．； Ｃｏｅｎｊａｅｒｔｓ， Ｆ．Ｅ．Ｊ．； Ｌｅｅｎｄｅｒｓ， Ｈ．； Ｖｌｉｅｔ， Ｐ．Ｃ． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｈｏｏｋ−ｏｎ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ． ＥＭＢＯ Ｊ． １９９４年、１３巻、２９９４頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も同様である。次いで、二本鎖ＤＮＡに結合したＲｅｃＡで実証されている通り、タンパク質でコーティングされたＤＮＡを、ナノポアを通して移動させることができる（Ｓｍｅｅｔｓ， Ｒ．Ｍ．Ｍ．； Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ， Ｓ．Ｗ．； Ｈａｌｌ， Ａ．Ｒ．； Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎ．Ｈ．； Ｄｅｋｋｅｒ， Ｃ． Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲｅｃＡ−Ｃｏａｔｅｄ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ． Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ２００９年、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。タンパク質コーティングは、一本鎖ＤＮＡ領域および二本鎖ＤＮＡ領域に対して同じように機能する。

【0055】

本発明の別の実施形態では、図３に例示されている塩基伸長反応によって形成されたフラップは、一本鎖フラップから二本鎖フラップに変換することができる。この実施形態では、標的被検体を結合性部分と接触させる前に、一本鎖フラップを、少なくとも１つが、フラップの一部とハイブリダイズし、プライマーとしての機能を果たすことが予想されるオリゴマープローブの無作為の選択にさらす。そのようなハイブリダイゼーションの後、塩基伸長反応を行ってフラップを二本鎖にする。

【0056】

より詳細には、図５ａに第１のＤＮＡ鎖１２と第２のＤＮＡ鎖１４を有する二本鎖ＤＮＡ分子１０が示されている。ＤＮＡ分子１０は、事前に選択したニッキングエンドヌクレアーゼのための、ニッキング部位２０を同定する認識配列を有する。図５ｂに示されているように、ニッキングエンドヌクレアーゼにさらすと、ＤＮＡ分子１０上、すなわち、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所にニック２０’が形成される。公知の認識配列を有する所定のニッキングエンドヌクレアーゼを使用することにより、ニックの部位を同定することができれば、特異的な認識配列の場所を決定することができ、それにより、分子をマッピングすることが可能になる。

【0057】

ニック２０’が形成された後、ニック部位（点で示されている）から始まる第１の塩基伸長反応２２を行う。図５ｃには、塩基伸長反応が上鎖の３’末端に向かって進行するにつれ、一本鎖ＤＮＡのフラップ２４が元のＤＮＡ分子の上鎖から形成される。フラップ２４が所望の長さに到達するまで塩基伸長反応を進行させる。一実施形態では、フラップ２４は少なくとも１００塩基の長さであることが好ましいが、図３に関して考察されている通り、本発明は、そのように限定されることを意図するものではない。

【0058】

図５ｄでは、フラップ２４をオリゴヌクレオチドプローブの無作為の選択にさらす。プローブの本質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は既知である必要はなく、少なくとも１つのそのようなプローブ３２がフラップ２４の一部とハイブリダイズして、図５ｅに示されている第２の塩基伸長３４を行うことができる部位を形成するプライマーとしての機能を果たすことが予想される。第２の塩基伸長は、フラップを、ポリメラーゼ、１つまたはそれより多くのヌクレオチド、リガーゼ、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることによって実施することができる。その結果生じた、二本鎖フラップ２４’を伴う二本鎖ＤＮＡ塩基１０を含む標的被検体５０が図５ｆに示されている。

【0059】

図６では、結合性部分３０を使用してＤＮＡ分子の鎖１２、１４の両方ならびに二本鎖フラップ２４’がコーティングされている。前の実施形態の場合と同様に、結合性部分３０は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質または他の組成物、例えば、タンパク質ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質であってよい。結合性部分により、標的被検体の電気的検出が増強される。

【0060】

いくつかの場合には、認識部位とニッキング部位は互いに比較的接近した間隔にあってよい。これらの例では、上記の方法を用いることにより、小さな、容易に検出されにくいフラップがもたらされ得る。フラップはニック間の一本鎖で形成されるので、ニックが接近した間隔にある場合、フラップの長さは限定される。さらに、これらの例では、フラップをもたらす塩基伸長をあまり長く進行させると、一本鎖は被検体から完全に削除され、その結果、フラップ、したがってフラップによりもたらされるデータが失われる。この問題に対する解決が、図７ａ〜７ｇに示されている。

【0061】

図７ａには、第１の鎖１２と第２の鎖１４を有するＤＮＡ分子１０が示されている。鎖１２は、接近した間隔にあるニック２０’を生成するニッキングエンドヌクレアーゼと反応している。１つのフラップを形成する一本鎖ＤＮＡの短いセグメント１２’がニック間に位置している。

【0062】

図７ｂでは、各ニックにおいて塩基伸長反応が行われてフラップ２４が形成されている。ニック間の間隔が近いので、塩基伸長反応はセグメント１２’が分子から完全に削除される前に終了することが好ましい。結果として、検出されにくい短いフラップが形成される。さらに、塩基伸長は、セグメント１２’の単一の短いフラップだけ隔絶している（ｉｓｏｌａｔｅｄ）のではなく、分子全体に適用されるので、塩基伸長が早期に終結することにより、全てのフラップが小さく、容易に検出されにくいものになる。枠に囲まれた領域１９は、図７ｃ〜７ｇに示されている１つのフラップを含有する分子の部分を示すために使用される。

【0063】

図７ｃには、塩基伸長が終結した後の単一の短いフラップ２４（枠１９から切り離したもの）が示されている。

【0064】

図７ｄには、二本鎖フラップ２４’が示されている。この二本鎖フラップは、図５ｅに示されている方法を用いて形成された。具体的に、一本鎖フラップはオリゴヌクレオチドプローブの無作為の選択にさらされ、そのようなプローブの１つがフラップとハイブリダイズし、プライマーとして働き、それにより第２の塩基伸長を行うことが可能になる。その結果、短い二本鎖フラップ２４’が形成される。

【0065】

図７ｅには、フラップが伸長した後の図７ｄの分子が示されている。具体的には、二本鎖プローブを形成する塩基伸長反応の後に、分子をターミナルトランスフェラーゼと反応させて、二本鎖フラップを伸長させる。さらされた３’末端を有する鎖において伸長４０が起こる。フラップ２４’から任意の配列を伸長させることができるが、ポリＡ伸長物およびポリＴ伸長物を有する一塩基のポリマーとして伸長物を形成することが好ましい。図７ｅの実施形態ではポリＴ伸長物が示されているが、本発明はそのように限定されることを意図するものではない。伸長物の特異的な配列にかかわらず、伸長物は検出するために望ましい任意の長さであってよく、数百塩基の長さであることが好ましい。

【0066】

フラップ上に形成された伸長物の結果として、下記の方法を用いたフラップの検出は、そのような伸長物を欠く短いフラップと比較して増強される。フラップおよび分子検出のさらなる増強も想定される。例えば、図４ａおよび４ｂにおいて概説されている方法を用いて分子を結合性部分と反応させることができる。あるいは、タグ付けされたプローブを、伸長物とハイブリダイズさせることができる。したがって、図７ｆに示されているように、伸長物の配列に特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることができる。図７ｆでは、ポリＴ伸長物４０が相補的なポリＡオリゴヌクレオチドプローブ４２とハイブリダイズしている。図７ｇに示されているように、これらのプローブ４２により、リンカー４６によってプローブ４２とつながったタグ４４がもたらされ得る。多種多様なタグの任意のものを用いることもができるが、好ましい一実施形態では、タグ４４は金ビーズを含む。タグにより、元のニッキング部位のそれぞれにおいて形成されたフラップの検出が増強されることが意図されている。用いる増強方法にかかわらず、原理は同じである。すなわち、フラップを検出することにより、元のニッキング部位の相対的な位置を決定することが可能になる。ニックを形成するために使用される特定のニッキングエンドヌクレアーゼは公知であるので、ニッキング部位の本質および相対的な場所を決定することが可能である。

【0067】

本明細書に記載の標的被検体は、ナノポアおよび／または流体チャネル、すなわち、マイクロチャネル系またはナノチャネル系において位置情報が検出されるように構成することができる。標的被検体のマッピングは、ナノポア、ナノチャネルまたはマイクロチャネルを使用する電気的検出法を用いて、その教示が以前に参照により本明細書に組み込まれた２０１０年５月２８日に出願された米国特許出願第１２／７８９，８１７号に記載の方法を用いて行うことができる。そのような方法は、一本鎖フラップもしくは二本鎖フラップを有するコーティングされていない被検体、または一本鎖フラップもしくは二本鎖フラップを有し、塩基分子と一本鎖フラップもしくは二本鎖フラップのどちらか、または両方が結合性部分でコーティングされている被検体に適用することができることが意図される。

【0068】

一実施形態では、図８ａに示されているように、ＤＮＡ鎖がナノポアを通って移動する間にナノポア全体にわたる電流を測定する。本発明の実施形態において用いる場合、ナノポアの直径は、約１ｎｍ〜約１μｍの範囲から選択することができる。ナノポアの直径は約２．３ｎｍから約１００ｎｍの間であることがより好ましい。ナノポアの直径は約２．３ｎｍから約５０ｎｍの間であることがなおより好ましい。標的被検体がナノポアを通って移動するときにナノポア全体にわたる電気的性質の変化をモニターすることができ、その電気的性質の変化により、標的被検体の二本鎖領域、および一本鎖フラップ領域または二本鎖フラップ領域が示される。

【0069】

具体的には、ナノポア１００に対して、電極１２０、１２２によって生じる測定可能な電流が、標的被検体５０、すなわち、フラップ２４を有するＤＮＡ分子の動きと平行１１０に流れる。電流の変動は、標的被検体５０がナノポア１００を通過するときの該標的被検体５０の相対的な直径の結果である。標的被検体５０がナノポア１００を通過するこの相対的な体積の増加により、ナノポアを通って流れる電流の流れの一過性の中断または減少が引き起こされ、その結果、測定可能な電流の変動が生じる。フラップ２４を含む標的被検体５０の部分はフラップを含まない標的被検体の部分よりも直径が大きい。その結果、フラップ２４がナノポア１００を通過すると、電極１２０と１２２の間の電流の流れのさらなる中断または減少が起こる。これらの電流の流れの変化が、図８ｂにおいて波形２００で示されている。

【0070】

波形２００を解析することにより、標的被検体の二本鎖領域とフラップ領域を、少なくとも一部は、検出された電気的性質の変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングすることが可能になる。図８ｂにおいて、波形２００は、標的被検体がナノポアを通過するときの検出された電気的性質の変化を示し、以下の通り解釈することができる。電流測定値２１０は、フラップが形成されたＤＮＡ分子１０、すなわち、標的被検体が、ナノポア１００をシス側からトランス側に通過する前に測定された電流を表す。標的被検体がナノポアのシス側からナノポア１００に入ると、電流は部分的に妨害され、記録された電流に第１のトラフ２２０が形成される。標的被検体のフラップ２４がナノポア１００に入ると、電流のさらなる減少が起こり、それにより、電流測定値に、より深い第２のトラフ２３０が引き起こされる。フラップ２４がナノポア１００を完全に通過した際、標的被検体の遠位部分がナノポア内に残っている可能性がある。これにより、測定された電流２４０がおよそ第１のトラフ２２０のレベルまで上昇する。最後に、標的被検体全体が完全にナノポア１００のトランス側へ通過すると、測定された電流２５０は最初のレベル２１０に近いレベルに戻る。電流変動の測定値は時間の関数として記録される。結果として、定期的な電流の変動により、相対的位置または絶対的位置の関数として、標的被検体１０上のどこにフラップ２４が形成されるかが示される。フラップは、フラップ形成に使用される特異的なニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位に形成されるので、使用される特定のニッキングエンドヌクレアーゼの認識部位に関連する特異的な配列の相対的位置または絶対的位置を決定することができる。これにより、標的被検体上のこれらの特異的な配列をマッピングすることが可能になる。複数のニッキングエンドヌクレアーゼを使用して複数のマップを作成することができる。

【0071】

タンパク質ＲｅｃＡなどの結合性部分を使用することにより、結合性部分でのコーティングに付加されたかさにより電流偏向が大きくなるので、標的被検体および標的被検体上のフラップ領域の検出がさらに増強され得る。

【0072】

別の実施形態では、図９〜１１に示されている通り、ＤＮＡ鎖がナノチャネルまたはマイクロチャネルを通って移動する間の電位または電流などの電気的性質を測定する。図９には流体チャネル装置の一実施形態が概略的に示されている。図９では、装置３００は、流体マイクロチャネルまたは流体ナノチャネル３０２を含む。流体チャネルは、約１μｍ〜約２５μｍの範囲から選択される幅を有するマイクロチャネルまたは約１０ｎｍ〜約１μｍの範囲から選択される幅を有するナノチャネルであってよい。マイクロチャネルの場合では、深さは、約２００ｎｍ〜約５μｍの範囲から選択することができ、ナノチャネルの場合では、深さは、約１０ｎｍ〜約１μｍの範囲から選択することができる。いずれの場合も、チャネルの長さは、約１μｍ〜約１０ｃｍの範囲から選択することができる。

【0073】

第１の起電電極の対３０４、３０４’は電源３０６に接続されており、チャネル内で間隔をあけた関係で位置している。起電電極に電位を加えると、これらの電極により、チャネルを横切って電流がもたらされ、これを用いて、チャネル内の標的被検体５０に駆動力３０８をもたらすこと、またはそれを増強することができる。他の駆動力、例えば、圧力または化学的勾配も意図されている。第２の電極対３１２、３１２’、すなわち、検出電極は、検出ボリューム３１４を画定するために間隔をあけた関係でチャネルに対して実質的に垂直に位置させることが好ましい。第２の検出電極の対３１２、３１２’は、電圧計などの検出器３１６に接続されており、これにより検出ボリューム３１４における電気的性質をモニターする。検出器３１６が電圧計である実施形態では、検出電極の対３１２、３１２’間の電位を検出ボリューム３１４全体にわたって測定する。

【0074】

このデバイスの動作については図１０ａ〜１０ｄに概略的に描かれており、標的被検体が流体チャネルを通って移動するときの流体チャネル全体にわたる電気的性質の変化がモニターされ、その電気的性質の変化により、標的被検体の二本鎖領域、およびフラップ領域が示される。図１０ａ〜１０ｄでは、明瞭にするために、第１の起電電極の対３０４、３０４’および電流源３０６は省略されている。図１０ａでは、流体チャネル３０２は、それを通って進む標的被検体５０を含有する。電気的性質、この場合は電位を、検出電極３１２、３１２’および検出器３１６により、検出ボリューム３１４全体にわたって測定し、記録する。標的被検体５０は、上記の方法を用いてその上にフラップ２４が形成されたＤＮＡ断片である。検出を増強するために、ＤＮＡ断片および／またはフラップをタンパク質ＲｅｃＡなどの結合性部分でコーティングすることができる。

【0075】

標的被検体５０が検出ボリューム３１４に入る前に、検出ボリューム全体にわたる実質的に一定の電圧３２２を測定する。この電圧は図１０ａの波形３２０に示されている。標的被検体５０が検出ボリューム３１４に入ると、それにより、検出ボリュームにおいて測定される電気的性質の中断または減少が引き起こされる。この中断または減少により、波形３２０に示される第１のトラフ３２４が引き起こされる。

【0076】

図１０ｂには、フラップ３１１を含む標的被検体５０の部分が検出ボリューム３１４に入ったときのデバイスおよび波形３２０が示されている。フラップ３１１が検出ボリューム３１４に入ることにより、検出ボリュームにおいて測定される電気的性質のさらなる中断または減少が引き起こされる。このさらなる中断または減少により、波形３２０に示される第２のトラフ３２６が引き起こされる。

【0077】

図１０ｃでは、フラップ３１１を含有する標的被検体５０の部分は検出ボリューム３１４を出ているが、標的被検体５０の遠位の部分はまだ検出ボリューム内に存在する可能性がある。その結果、波形３２０は、上記被検体の最初の部分が最初に検出ボリュームに入った際に検出されたレベルに近いレベル３２８まで戻る。

【0078】

最後に、図１０ｄに示されているように、標的被検体５０は検出ボリューム３１４から完全に出る。その結果、波形３２０は、上記被検体が最初に検出ボリュームに入る前に検出されたレベルに近いレベル３３０まで戻る。波形３２０を分析することにより、標的被検体の二本鎖ＤＮＡとフラップ領域を、少なくとも一部は、検出された電気的性質の変化に基づいて区別し、それにより、ニックの場所を決定し、二本鎖ＤＮＡ鋳型の少なくとも一部分をマッピングすることが可能になる。

【0079】

流体チャネル装置の別の実施形態が図１１に示されている。図１１では、装置４００は、流体マイクロチャネルまたは流体ナノチャネル４０２を含む。前述した通り、流体チャネルは、約１μｍ〜約２５μｍの範囲から選択される幅を有するマイクロチャネルまたは約１０ｎｍ〜約１μｍの範囲から選択される幅を有するナノチャネルであってよい。マイクロチャネルの場合では、深さは、約２００ｎｍ〜約５μｍの範囲から選択することができ、ナノチャネルの場合では、深さは、約１０ｎｍ〜約１μｍの範囲から選択することができる。いずれの場合も、チャネルの長さは約１μｍ〜約１０ｃｍの範囲から選択することができる。

【0080】

第１の起電電極の対４０４、４０４’は電源４０６に接続されており、チャネル内に間隔をあけた関係で位置させている。起電電極に電位を加えると、これらの電極により、チャネルを横切って電流がもたらされ、これを用いて、チャネル内の被検体４１０に駆動力４０８をもたらすこと、またはそれを増強することができる。他の駆動力、例えば、圧力または化学的勾配も意図されている。多数の検出電極４１２、４１４、４１６、４１８は、隣接する検出電極間の複数の検出ボリュームを画定するために、間隔をあけた関係でチャネルに対して垂直に位置させることが好ましい。したがって、図１１において見られるように、検出電極４１２および４１４により検出ボリューム４２０が画定され、検出電極４１４および４１６により検出ボリューム４２２が画定され、検出電極４１６および４１８により検出ボリューム４２４が画定される。検出電極は、それぞれ電圧計などの検出器４２６、４２８、４３０に接続されており、これにより、各検出ボリュームにおける電気的性質をモニターする。検出器が電圧計である実施形態では、各検出ボリューム全体にわたって電位の降下を測定する。この装置の動作は、追加の検出ボリュームが存在することにより追加の波形が生成されることを除いて図１０の系の動作と同様である。追加の波形を組み合わせて、デバイスにより生成されるデータの質をさらに改善することができる。

【0081】

検出電極および検出ボリュームの数は、図１１に示されている数に限定されることが意図されるものではないことが理解されるべきである。そうではなく、流体チャネルの長さに沿った任意の数の検出ボリュームを含めることができる。さらに、検出電極および検出ボリュームは一様の間隔で配置する必要はなく、一様のサイズである必要はなく、または、互いに直接隣接する必要はない。種々の検出ボリュームサイズ、間隔および立体配置が意図されている。

【0082】

ナノポア装置および流体チャネル装置のどちらによっても、被検体を検出すること、ならびにその被検体上に形成されたフラップを検出することが可能になる。さらに、フラップの相対的な位置情報または絶対的な位置情報を得ることができる。ゆえに、特異的な認識配列が既知である公知のニッキングエンドヌクレアーゼを使用すると、フラップの場所を決定することにより既知の認識配列の場所を決定することが可能になる。これにより、今度は、生体分子をマッピングすることが可能になる。異なるニッキングエンドヌクレアーゼを繰り返し使用することにより、さらなる複雑性、すなわち、多数の認識配列を組み合わせてマッピングすることが可能になる。

【0083】

等価物
示された例のいくつかには、単一のニックが形成され、その後、単一のフラップが形成されたＤＮＡ鋳型が示されている。本発明の実施形態は、そのように限定されることを意図するものではなく、ニッキングエンドヌクレアーゼにより、第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的な場所に複数のニックを形成することができることが意図される。

【0084】

本明細書において列挙されている全てのパラメータは例示的なものであり、実際のパラメータは、本発明の実施形態の方法および材料が用いられる特定の適用に左右されることを意味することは、当業者には容易に理解されよう。したがって、前述の実施形態は単に例として示されていること、および添付の特許請求の範囲およびそれに対する等価物の範囲内で、具体的に記載されているものとは別のやり方で本発明を実施することができることが理解されるべきである。したがって、多数の変形および改変が当業者に明らかになるであろう。そのような変形および改変は全て、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内であることが意図されている。

【図1】

【図2a-2b】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図5f】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図7e】

【図7f】

【図7g】

【図8a】

【図8b】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【図10d】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]