特許 6152429 神経保護用の多機能抗酸化物質及びその単機能類似体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6152429

(24)【登録日】2017年6月2日

(45)【発行日】2017年6月21日

(54)【発明の名称】神経保護用の多機能抗酸化物質及びその単機能類似体

(51)【国際特許分類】

   C07D 403/04 20060101AFI20170612BHJP

   C07D 239/47 20060101ALI20170612BHJP

   C07D 239/60 20060101ALI20170612BHJP

   A61K 31/506 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 39/06 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 25/28 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 25/16 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 25/00 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 21/02 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 27/12 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 27/06 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 27/02 20060101ALN20170612BHJP

   A61P 3/10 20060101ALN20170612BHJP

【ＦＩ】

   C07D403/04CSP

   C07D239/47

   C07D239/60

   !A61K31/506

   !A61P39/06

   !A61P25/28

   !A61P25/16

   !A61P25/00

   !A61P21/02

   !A61P27/12

   !A61P27/06

   !A61P27/02

   !A61P3/10

【請求項の数】12

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2015-557987(P2015-557987)

(86)(22)【出願日】2013年3月18日

(65)【公表番号】特表2016-507586(P2016-507586A)

(43)【公表日】2016年3月10日

(86)【国際出願番号】US2013032761

(87)【国際公開番号】WO2014126596

(87)【国際公開日】20140821

【審査請求日】2015年10月21日

(31)【優先権主張番号】13/769,247

(32)【優先日】2013年2月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515222528

【氏名又は名称】ケイドー， ピーター エフ．

(74)【代理人】

【識別番号】100158920

【弁理士】

【氏名又は名称】上野 英樹

(72)【発明者】

【氏名】ケイドー， ピーター エフ．

【審査官】 小川 由美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／００７８６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００３／０５１８４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０９７３７２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０３４４７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５２６６１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭４９−０２２３８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１０５２６９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開昭６３−１３０５９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−３０６０７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０４−２１１６４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１２３２２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００３／０１０１５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００２／０２２５８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５３０６０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Medicinal Chemistry，２０１５年 ６月１１日，58，8796-8805

【文献】 Journal of Medicinal Chemistry，２０１０年，53，1117-1127

【文献】 European Journal of Pharmacology，２００２年，444，53-60

【文献】 Synthesis and Reactivity in Inorganic and Metal-Organic Chemistry，１９９３年，23(9)，1571-1584

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ，Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化合物であって、該化合物は次の化学式を有する化合物

【化1】

及びそれらの薬学的に許容される塩であって、
ここで、Ｒ₁は、ＣＨ₂又はＣ₂Ｈ₄であり、Ｒ₂は−ＯＲ₄であり、Ｒ₄は、Ｈ、カルボニルアルキル又はカルボニルアリールであり、Ｒ_3a及びＲ_3bは、独立してＨ及び−Ｏ−アルキルからなる群から選択される、化合物。

【請求項2】

前記化合物が、

【化2】

並びにそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記化合物が、次の化学式を有する化合物

【化3】

及びその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

前記化合物が、次の化学式を有する化合物

【化4】

及びその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。

【請求項5】

前記化合物が、次の化学式を有する化合物

【化5】

及びその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

前記化合物が、次の化学式を有する化合物

【化6】

及びその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。

【請求項7】

化合物であって、該化合物は次の化学式を有する化合物

【化7】

及びそれらの薬学的に許容される塩であって、
ここで、Ｒ₁は、ＣＨ₂又はＣ₂Ｈ₄であり、Ｒ₂はＨであり、Ｒ_3a及びＲ_3bは、独立してＨ及び−Ｏ−アルキルからなる群から選択され、Ｒ_3a及びＲ_3bの両方がＨの場合にＲ₁はＣＨ₂でない、化合物。

【請求項8】

前記化合物が、

【化8】

からなる群から選択される、請求項７に記載の化合物。

【請求項9】

前記化合物が、次の化学式を有する化合物

【化9】

及びその薬学的に許容される塩である、請求項７に記載の化合物。

【請求項10】

前記化合物が、次の化学式を有する化合物

【化10】

及びその薬学的に許容される塩である、請求項７に記載の化合物。

【請求項11】

前記化合物が、次の化学式を有する化合物

【化11】

及びその薬学的に許容される塩である、請求項７に記載の化合物。

【請求項12】

化合物であって、該化合物は次の化学式を有する化合物

【化12】

及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗酸化物質に関し、特にＦｅ、Ｃｕ又はＺｎなどの金属をキレートすること及び遊離基を捕捉することの両方が可能である神経保護用の多機能抗酸化物質に関する。本発明はまた、その神経保護用の多機能抗酸化化合物の、抗酸化作用のある単機能類似体に関する。これらの化合物は、経口投与されることができ、そして血液脳関門を通過することができ、それにより化合物は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）などの様々な神経疾患の治療、外傷性脳損傷、白内障、緑内障、加齢黄斑変性症及び他の網膜変性などの眼疾患、並びに糖尿病性合併症の進行の緩和に有益である。

【背景技術】

【0002】

酸化的損傷は、神経変性疾患の顕著な特徴である。酸化的ストレスは、タンパク質、脂質二重層及びＤＮＡを酸化することによって細胞成分に損害を与える活性酸素種（ＲＯＳ）に起因する。これは、変性タンパク質構造、低下した酵素活性、原形質及びオルガネラ膜を崩壊させる過酸化脂質の発生、並びに鎖切断、ＤＮＡ−タンパク質架橋、及び塩基修飾による変異を引き起こす変性ＤＮＡをもたらす。ＲＯＳは、スーパーオキシドアニオン（Ｏ₂^-）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、一重項酸素（¹Ｏ₂）、及び過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を含む。スーパーオキシドアニオンは、酸素分子（Ｏ₂）が更なる電子を獲得することで、ミトコンドリアで継続的に生じる。生じたＲＯＳの中で最も反応性が高くて損傷を与えるヒドロキシルラジカルは、殆どが過酸化水素と鉄及び銅などの酸化還元活性のある遷移金属との間でのフェントン反応によって生じる。これらの金属はこの過程の間に酸化されるが、それらはビタミンＣ又は他の細胞還元体での「酸化還元サイクル」の過程によって、「活性」（還元）状態に戻る。いくつかの反応によって生体内で生成される過酸化水素は、反応性が高くて損傷を与えるヒドロキシルラジカル又は水のいずれかに変わり得る。過酸化水素は、活性酸素分解酵素によるスーパーオキシドラジカルの還元によって生成され、カタラーゼ又はグルタチオンペルオキシダーゼのいずれかによって水に還元される。

【0003】

酸化的ストレスは加齢に伴って増加し、組織を酸化的ストレスに長期間曝すことは、最終的に細胞死を引き起こす細胞損傷をもたらす。ＲＯＳ活性は、脳の海馬、黒質及び尾状核被殻並びに髄液において観察されている。脳の神経組織は、より高い代謝率、過酸化感受性脂肪酸の高い組成、フェントン反応に触媒作用を及ぼすことが可能な遷移金属の高い細胞内濃度、低濃度の抗酸化物質、及び組織再生の低い能力により、ＲＯＳに特に影響を受けやすい。神経組織もまた、モノアミン酸化酵素などの脳特異的な酸化酵素を有し、それは過酸化水素を生成し得る。反応性小膠細胞、マクロファージ及び炎症性Ｔ細胞によって誘発された神経炎症応答もまた、ＲＯＳを生成し得る。

【0004】

脳では、酸化還元活性な金属である鉄（Ｆｅ）、銅（Ｃｕ）、及び亜鉛（Ｚｎ）が加齢に伴って蓄積し、この蓄積が変性した脳代謝及び増加したアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）の発現につながる。アミロイドベータ（Ａβ）はアルツハイマー病（ＡＤ）の斑の主要な炎症性要素であり、そのＦｅ、Ｃｕ、及びＺｎへの結合は、プロテアーゼ耐性の金属が濃縮された沈殿物へのＡβの凝集を促進する。Ａβは、銅及び鉄の存在下において効率的に活性酸素種を生成する。異常な生体金属の恒常性及び金属タンパク質反応は、ＡＤの発症の間に起こり、酸化と関係のある神経変性をもたらす。

【0005】

Ｆｅの年齢に依存した蓄積はまた、ＡＤ及びパーキンソン病（ＰＤ）での脳におけるＦｅ代謝を変え、それは脳のイオン輸送におけるラクトトランスフェリン受容体、メラノトランスフェリン、セルロプラスミン及び二価陽イオン輸送体の発現の変化に関係している。増大したＦｅ濃度はまた、パーキンソン病患者などの他の神経変性疾患での死後脳の病理的患部で観察され、これらの患部は神経病理学的変化の増大した重症度に対応する。Ｃｕ濃度の変化もまた、Ｆｅと干渉することによって脳に影響を及ぼす。Ｃｕ結合酵素のセルロプラスミンは、そのフェロオキシダーゼ活性によりＦｅ（ＩＩ）をＦｅ（ＩＩＩ）に変換することによってＦｅの酸化還元状態を調節するので、Ｃｕ及びＦｅ代謝の間の繋がりに相当する。神経膠及びニューロンへの著しいＦｅ蓄積と共に変性Ｆｅ止血が起こる無セルロプラスミン血症で見られるように、Ｃｕがタンパク質合成の割合においてタンパク質に適切に組み込まれないときは、セルロプラスミンは急速に分解される。ＡＤ患者では、低下したセルロプラスミンのニューロン導入は、ニューロンでの酸化還元活性な鉄の蓄積を引き起こすことがある。

【0006】

神経変性に関連する酸化的経路を標的にすることは、治療になり得る。天然物（クルクミン、メラトニン、レスベラトロル、イチョウ葉エキス、緑茶、ビタミンＣ、Ｌ−カルニチン、ビタミンＥ及びカンナビノイド）からリポ酸誘導体、補酵素Ｑ（ＭｉｔｏＱ）類似体、及び「チオール送達」グルタチオン模倣体に及ぶ遊離基を捕捉する抗酸化物質で、ＲＯＳを低減することが報告されている。しかし、これらの化合物のほとんどで、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力は示されていない。

【0007】

ＲＯＳはまた、生体金属を減らす化合物の使用によって低減されることができる。デフェロキサミン（デスフェリオキサミン）は、Ｆｅ、Ｃｕ、及びＺｎに結合して、ＡＤの進行を緩和することができる。しかし、デフェロキサミンは、経口では有効でなく、そしてあまりＢＢＢを通過しない。より親油性のキレート剤であるＤｄＰ１０９は、遺伝子導入マウスに投与された時に、凝集した不溶性のＡβの濃度を低減させ、その可溶型を増大させることが報告されている。経口で有効な金属キレート剤であるクリオキノール（ＰＢＴ１）は、フェントン反応を調節し、脳でのＣｕの摂取を減らし、酸化還元金属によって誘発されたＡβ凝集を分解し、そして線維伸長を遅らせ、動物及びいくつかの臨床試験の両方で有効性を示している。経口のＰＢＴ２もまた、Ａβ―金属複合体に関連する酸化還元活性を妨げることによって、Ａβ凝集及び毒性を低減する。ＰＢＴ２は、第ＩＩａ相臨床試験で実証されたように、脳でのＡβ濃度を著しく低下させ、急速に認知障害を回復させた。そこでは、ＡＤ患者は２つの神経心理検査において改善した。これらの結果は、金属−タンパク質相互作用の低減は、治療的介入についての有望な戦略であるという前提を支持する。

【0008】

鉄は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は出血性脳卒中の際にヘモグロビンから放出され得る。遊離第一鉄の増加は、酸化的損傷をもたらし得る。子供は、特定の抗酸化分子の不十分な発現によりその未熟な脳は酸化的ストレスへの反応が弱いので、ＴＢＩ誘発出血及び細胞死に特に脆弱であり、更にその発達中の脳は遊離鉄を解毒する能力が低い。ＴＢＩはまた、ＲＯＳが生成される急性炎症反応を引き起こす。抗炎症剤、抗酸化物質、及び鉄キレート剤のデフェロキサミンは、大人及び小児のＴＢＩで観察される増大した炎症、酸化的ストレス及び遊離鉄存在レベルを治療するために提案されている。

【0009】

喫煙などの加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の危険因子は、ＡＭＤが酸化的ストレスに関連することを暗示する。ＡＭＤにおける酸化的ストレスの役割は、加齢性眼疾患研究（ＡＲＥＤＳ）の試験結果によって支持される。その試験は、抗酸化物質及び亜鉛が、ＲＯＳを減らすことによってＡＭＤ進行の危険及び酸化的ストレスによって誘発される内皮機能不全の危険を低下させることを発見した。ＡＭＤの患者は、ドルーゼンに見られる脂質過酸化生成物のより高いレチナール濃度を有する。網膜は、網膜機能に必要とされるその高濃度の酸素により酸化的ストレスに弱い。更に、外核層（ＯＮＬ）での杆錐状体の膜は、脂質過酸化反応の影響を受けやすい高い割合の多価不飽和脂肪酸を含有する。黄斑部は、入射光が黄斑に集中するので、特にＲＯＳの影響を受けやすい。入射光は、光酸化がＲＯＳを生成するので、絶えず続く酸化的ストレス源である。ＲＯＳはまた、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の食作用及びリポフスチンの光増感作用によって生成される。ＲＰＥ細胞をＲＯＳに曝すことは、アポトーシス及び早期の老化をもたらす。

【0010】

Ａβの沈着もまた、ＡＭＤに見られる。ＲＰＥに隣接して生じるＡＭＤについての生体指標であるドルーゼンはＡβを含有し、その存在は局所的炎症事象に関連する。ＡＤの斑の主要な炎症性要素であるように、網膜のＡβは、網膜変性及びＡＭＤをもたらすＲＰＥ機能障害に関連している。ＲＰＥでは、Ａβの蓄積はまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）との間の均衡に影響する。

【0011】

いくつかの動物モデルは、酸化的ストレス、鉄の調節異常、及びフェントン化学反応に関連するＡＭＤのような網膜の変化を示す。これらは、たばこの煙に曝されたＣ５７ＢＬ／６マウス、ＳＯＤ１が不足するマウス、セルロプラスミン（Ｃｐ）及びその同族体のヘファエスチンが不足するノックアウトマウス（ＤＫＯ）、及びＲＣＳラットを含む。眼に鉄を直接導入することもまた、網膜変性をもたらす。

【0012】

ＡＭＤに関連する網膜の変化に関して酸化的経路を標的にすることは、治療の可能性を示す。ＡＲＥＤＳの酸化防止剤組成物は、進行した段階へＡＭＤが進行するリスクを２５％低減する。抗酸化物質はまた、培養されたＲＰＥ細胞での酸化的ストレスを低減する。牛のメラノソーム又はメラトニンを非色素の牛のＲＰＥに加えることもまた、ＲＰＥ細胞の光増感酸化及び鉄で仲介された酸化を低減させる。抗酸化物質のＮ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシルアミン（ＮｔＢＨＡ）は、鉄過剰のヒトのＲＰＥに加えられた時に、ＲＳＯを低減し、ＧＳＨ濃度を維持する。同様に、サリチルアルデヒドイソニコチン酸ヒドラゾン（ＳＩＨ）で治療することは、フェントン反応で生成されたヒドロキシルラジカルからＲＰＥ細胞を保護する。抗酸化物質のケルセチンもまた、過酸化水素によって誘発される酸化的ストレスからＲＰＥを保護する。Ｎ−アセチルシステイン、ジメチルチオ尿素、イチョウ葉エキス、フェニル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、ＷＲ−７７９１３、テンポル（Tempol）Ｈ、及びエダラボンなどの遊離基捕捉剤は、光誘発の網膜変性を防ぐ。ＤＫＯマウスでの網膜変性は、鉄キレート剤のデフェリプロンで低減される。多機能抗酸化物質のＪＨＸ−４の投与もまた、神経網膜での酸化的ストレスの生体指標の低下、網膜のＥＲＧパターンの保存、及び光受容体層の保存によって、光誘発の網膜損傷からラットを保護する。

【0013】

ＡＭＤに加え、鉄に関連した酸化損傷は、網膜色素変性症などの網膜変性に関与する。亜鉛デフェロキサミンは、網膜色素変性症のｒｄ１０マウスにおいて、網膜変性を軽減することが知られている。

【0014】

鉄調節タンパク質のトランスフェリン、セルロプラスミン、及びフェリチンについての増大したｍＲＮＡ及びタンパク濃度は、緑内障において見られる。リソソーム膜の透過化及び細胞質ゾルへのカテプシＤの放出を誘発することによって、ＲＯＳは小柱網（ＴＭ）の細胞死をもたらす。この細胞死は、キレート化によって低減される。リソソームは、オルガネラ、長寿命タンパク質、並びに細胞外及び膜結合性物質を分解する。不安定鉄の著しい濃度が、鉄を含有する細胞内に取り込まれた及び自己貪食された物質の分解により、リソソーム内に蓄積し得る。これは、フェントン反応によって生じたリソソームのヒドロキシルラジカルをもたらし得る。鉄キレート剤による神経防護作用は、酸化還元活性イオンを隔離することによって、フェントン反応でのヒドロキシルラジカル形成を防ぐ。鉄キレート剤はまた、低酸素誘導因子−１ａ（ＨＩＦ−１ａ）を上方調節又は安定化する。ＨＩＦ−１ａの安定化は、ＨＩＦ−１ａを分解の標的にする鉄依存性の酸素センサ酵素である、ＨＩＦプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）によって制御される。ＨＩＦ−１ａは、緑内障の網膜に存在し、ＲＧＣの死と関連している。ＨＩＦ系は、ｂＨＩＦ−１ａの安定を促進し、ＨＩＦ−１に関連した生存遺伝子の転写を増大するので、神経防護作用についての新しい標的である。鉄キレート剤は、ＨＩＦ−１のシグナル経路を標的にするＰＨＤを阻害することによって神経防護作用を提供するようであり、最終的にＨＩＦ−１依存性の神経保護遺伝子を活性化する。

【0015】

酸化的ストレス及びＲＯＳに関連する白内障は、加齢、電離放射線及び紫外線、硝子体手術から生じた増大した酸素圧、並びにたばこの煙に関係があるものを含む。これらの白内障の多くでは、Ｃｕ及びＦｅもまた加齢及びたばこの煙に曝されることによって水晶体に蓄積するので、フェントン反応がＲＯＳの一因となっている。ＡＤ患者では、Ａβの沈着はまた、核上及び深部皮質の水晶体線維細胞の細胞質において電子密度の高い沈着物として蓄積することによって白内障を生じる。Ａβの沈着は、同様にＡβ遺伝子導入マウスにおいて生じ、そこではＡβの沈着はキレート化によって低減されることができる。

【0016】

白内障では、抗酸化物質は、実験動物で白内障の形成を低減するために広く使用されている。キレート化は、臨床的に及びマウスにおいて実験的に観察されるＡβの沈着を低減させる。キレート化はまた、β‐サラセミア患者及びたばこの煙に曝されたラットにおいて白内障を低減させる。

【0017】

電離放射線に細胞を曝すことは、その放射線の標的高分子との直接的な相互作用によって、又は水の放射線分解によるＲＯＳの生成によって間接的に、原子構造を変えることができる。更に、酸化的損傷は、酸化還元調節された細胞間構造によって、標的にされた細胞から、隣接した標的にされていないバイスタンダー細胞まで広がることがある。放射線はまた、フェリチン内に蓄えられた鉄の光還元によって、鉄の放出を引き起こすことができる。

【0018】

Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、及びＺｎのキレート化は、致死的に放射線を浴びたマウス及びラットの生存などの放射線傷害の回復に必要な組織修復プロセスを促進する。鉄キレート剤はまた、光による老化を防ぐことを助けることがある。頭全体に１５Ｇｙのガンマ線を与えたロングエバンスラットへの多機能抗酸化物質のＪＨＸ−４の投与は、照射への明らかな唾液腺の反応に起因する体重減少における減少量を部分的に軽減することに加え、白内障の形成を顕著に遅れさせた。

【0019】

酸化的ストレスはまた、糖尿病及び糖尿病性合併症の主な原因要素の１つであり、ヘム鉄の増大は、インスリン抵抗性及び２型糖尿病のリスクの増大と大いに関連している。実験的に、抗酸化物質及びキレート剤は、実験的糖尿病での神経機能不全及び血管機能不全の治療において、有益であることが観察されている。糖尿病のラットへの多機能抗酸化物質のＪＨＸ−４の投与も、白内障の進行を遅れさせる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

したがって、上記問題を解決する神経保護用の多機能抗酸化物質が切望されている。

【課題を解決するための手段】

【0021】

神経保護用の抗酸化化合物は、次の化学式を有するか、又はそれらの薬学的に許容される塩であり、

【化1】

ここで、Ｒ₁は、ＣＨ₂又はＣ₂Ｈ₄であり、Ｒ₂は、Ｈ又は−ＯＲ₄であり、Ｒ₄は、Ｈ、カルボニルアルキル又はカルボニルアリールであり、Ｒ_3a及びＲ_3bは、独立してＨ及び−Ｏ−アルキルからなる群から選択される。Ｒ₂がヒドロキシル基（ＯＨ）である場合、化合物は多機能活性を示す。すなわち、化合物は、独立して金属（Ｆｅ、Ｃｕ又はＺｎなど）をキレートし、かつ種々の発生源から生成された遊離基を捕捉するそれらの能力によって、神経保護活性を示す。多機能抗酸化物質の単機能類似体は、Ｒ₂が水素である場合、ＲＯＳ形成の一因となり得るＦｅ、Ｃｕ又はＺｎなどの金属をキレートすることのみによって、神経保護の抗酸化活性を示す。

【0022】

第一のグループの構造的な類似体である構造的に類似な神経保護用の抗酸化化合物の更なる類は、次の化学式を有するか、又はそれらの薬学的に許容される塩であり、

【化2】

ここで、Ｒ₁は、ＣＨ₂又はＣ₂Ｈ₄であり、Ｒ₂は、Ｈ又は−ＯＲ₄であり、Ｒ₄は、Ｈ、カルボニルアルキル又はカルボニルアリールであり、Ｒ_3a及びＲ_3bは、独立してＨ及び−Ｏ−アルキルからなる群から選択される。これらの化合物は、遊離基を捕捉するのに効果的であり、更に活性酸素種（ＲＯＳ）によって少なくとも部分的に組織損傷を媒介する神経疾患の治療のために使用されることができる。

【発明の効果】

【0023】

多機能化合物は、独立して金属（Ｆｅ、Ｃｕ又はＺｎなど）をキレートし、かつ種々の発生源から生成された遊離基を捕捉するそれらの能力を有し、多機能化合物及びそれらの単機能類似体は、神経を保護し、そしてアルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）などの様々な神経疾患の治療、外傷性脳損傷、眼疾患（白内障、緑内障、加齢黄斑変性症及び他の網膜変性など）、並びに糖尿病性合併症の進行の緩和に有益である。これらの化合物はまた、選択された疾患におけるＦｅ、Ｃｕ、又はＺｎ金属の蓄積を減らすのに有益であり得る。

【0024】

本発明のこれら及び他の特徴は、以下の詳述及び図面を更に見ることによって、容易に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】本発明による代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図1B】本発明による代表的な神経保護用の多機能抗酸化物質である。

【図1C】本発明による別の代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図1D】本発明による別の代表的な神経保護用の多機能抗酸化物質である。

【図1E】本発明による別の代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図1F】本発明による別の代表的な神経保護用の多機能抗酸化物質である。

【図1G】本発明による別の代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図1H】本発明による別の代表的な神経保護用の多機能抗酸化物質である。

【図2A】本発明による代表的な非機能の親化合物である。

【図2B】本発明による別の代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図2C】本発明による別の代表的な非機能の親化合物である。

【図2D】本発明による別の代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図2E】本発明による別の代表的な非機能の親化合物である。

【図2F】本発明による別の代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図2G】本発明による別の代表的な非機能の親化合物である。

【図2H】本発明による別の代表的な神経保護用の単機能抗酸化物質である。

【図3】本発明による神経保護用の多機能抗酸化物質及び単機能抗酸化物質であるＨＫ−１〜ＨＫ−８の合成を示す反応スキームである。

【図4】図３で参照された番号２２の２−アミノピリミジン中間化合物の合成を示す反応スキームである。

【図5】本発明による神経保護用の単機能抗酸化物質及びそれらの親化合物であるＨＫ−９〜ＨＫ−１６の合成を示す反応スキームである。

【図6】図２Ｂ及び図２Ｆで参照されたＨＫ−１０及びＨＫ−１４化合物の合成用中間物の合成を示す反応スキームである。

【図7】ＨＫ類似体（本発明による神経保護用の多機能抗酸化物質及びそれらの類似体）及びその類似体でキレートされることができる様々な金属イオンの複合体の化学量論である表１を示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

神経保護用の抗酸化化合物は、次の一般化学式を有するか、又はそれらの薬学的に許容される塩であり、

【化3】

ここで、Ｒ₁は、ＣＨ₂又はＣ₂Ｈ₄であり、Ｒ₂は、Ｈ又は−ＯＲ₄であり、Ｒ₄は、Ｈ、カルボニルアルキル又はカルボニルアリールであり、Ｒ_3a及びＲ_3bは、独立してＨ及び−Ｏ−アルキルからなる群から選択される。Ｒ₂がヒドロキシル基（ＯＨ）である場合、化合物は多機能活性を示す。すなわち、化合物は、独立して金属（Ｆｅ、Ｃｕ又はＺｎなど）をキレートし、かつ種々の発生源から生成された遊離基を捕捉するそれらの能力によって、神経保護活性を示す。多機能抗酸化物質の単機能類似体は、Ｒ₂が水素である場合、ＲＯＳ形成の一因となり得るＦｅ、Ｃｕ又はＺｎなどの金属をキレートすることのみによって、神経保護の抗酸化活性を示す。

【0027】

第一のグループの構造的な類似体である構造的に類似な神経保護用の抗酸化化合物の更なる類は、次の化学式を有するか、又はそれらの薬学的に許容される塩であり、

【化4】

ここで、Ｒ₁は、ＣＨ₂又はＣ₂Ｈ₄であり、Ｒ₂は、Ｈ又は−ＯＲ₄であり、Ｒ₄は、Ｈ、カルボニルアルキル又はカルボニルアリールであり、Ｒ_3a及びＲ_3bは、独立してＨ及び−Ｏ−アルキルからなる群から選択される。−ＯＲ₄を備えたこれらの化合物は、遊離基を捕捉するのに効果的であり、更に活性酸素種（ＲＯＳ）によって少なくとも部分的に組織損傷を媒介する神経疾患の治療のために使用されることができる。

【0028】

本明細書で用いられる用語「アルキル」は、直鎖において約１〜１０の炭素、好ましくは１〜８の炭素、更に好ましくは１〜４の炭素（低級アルキル）を含有する直鎖、分枝鎖、及び環状鎖（下記のシクロアルキル参照）の炭化水素を含む。アルキルは、ヒドロカルビルとして言及されることができる。安定したアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４ジメチルフェニル、オクチル、２,２,４トリメチルペンチル、ノニル、デシル、それらの様々な分枝鎖の異性体などを含む。それぞれのアルキル基は、例えばハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなど）、ハロアルキル（ＣＣｌ₃若しくはＣＦ₃）、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アリール、アリールオキシ、アラルキル、シクロアルキル、アルキルアミノ、アルカノイルアミノ、オキソ、アシル、アリールカルボニルアミノ、アミノ（−ＮＨ２）、置換アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ））、エポキシ、尿素（−ＮＨＣＯＮＨ₂）、チオール（−ＳＨ）、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル（−−−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲ）、アルキルカルボニルオキシ（−−−ＯＣ（＝Ｏ）−Ｒ）、カルバモイル（ＮＨ２Ｃ（＝Ｏ）−若しくはＮＨＲＣ（＝Ｏ）−）、及び／又はアルキル尿素(−ＮＨＣＯＮＨＲ)などの１〜４の置換基で任意に置換されてもよい。ここで前記置換基のＲは、アルキルラジカルを示す。アルキル基は、１つ以上の炭素炭素二重結合を任意で含んでもよい（すなわち、アルキル基は不飽和のことがある）。アルキルは、炭化水素鎖内に少なくとも１つの（例えば１〜約４の）硫黄、酸素、窒素のヘテロ原子を含んでもよい。例えば、アルキルは−ＯＲ、−ＳＲ、又は−ＮＨＲであることができ、ここでＲは炭化水素鎖である。

【0029】

本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、１〜３の環を含有する飽和又は不飽和の環状炭化水素基、つまり単環式アルキル、二環式アルキル及び三環式アルキルを含む。シクロアルキル基は、環を形成する合計３〜２０の炭素、好ましくは環を形成する合計３〜１０の炭素を含有することができ、そして以下で「アリール」について記載されるように、任意で１又は２の芳香環に縮合されることができる。不飽和シクロアルキル基は、１つ以上の二重結合又は三重結合を含むことができる。シクロアルキル基は、限定ではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル及びシクロドデシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロヘキサジエニル、並びにシクロヘプタジエニルを含む。それぞれのシクロアルキル基は、任意でハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アリール、アリールオキシ、アラルキル、シクロアルキル、アルキルアミド、アルカノイルアミノ、オキソ、アシル、アリールカルボニルアミノ、アミノ、置換アミノ、ニトロ、シアノ、チオール及び／又はアルキルチオなどの置換基で置換されてもよい。

【0030】

本明細書で用いられる用語「アリール」は、環部に６〜１０の炭素を含有する単環式及び二環式の芳香族基を指す。アリール基の例は、限定ではないが、フェニル若しくは１−ナフチル及び２−ナフチルなどのナフチル、又はインデニルを含む。アリール基は、シクロアルキル環又は複素環に縮合される１〜３の更なる環を任意で含んでもよい。アリール基は、利用可能な炭素原子を介して、水素、ハロ、アルキル、ポリハロアルキル、アルコキシ、アルケニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキニル、アリール、ヘテロシクロ、アラルキル、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、アラルコキシ、アリールチオ、アリールアゾ、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、スルホニルアニオン、アミノ、又は置換アミノから選択される１つ、２つ、又は３つの基で任意で置換されてもよい。

【0031】

用語「ハロゲン」、「ハロ」、及び「ハロゲン化物」は、塩素、臭素、フッ素又はヨウ素を指す。

【0032】

本明細書で用いられる用語「多機能」は、化合物がＦｅ、Ｃｕ又はＺｎなどの金属をキレートすること及び遊離基を捕捉することの両方をすることができ、それによって金属との反応によって生成し得る活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を防ぐこと又は抑制することを助け、そして更に遊離基を捕捉し、それによって直接的にＲＯＳをより害が少ない形態に変えることを意味する。

【0033】

代表的な神経保護用の多機能抗酸化物質及びそれらの単機能類似体は、図１Ａ〜１Ｈに示される化合物Ｋ−１〜ＨＫ−８である。化合物Ｋ−１〜ＨＫ−８は、図２の反応スキームに示されるように、市販の無水コハク酸１７又はグルタル酸無水物１８と結合し、その後に水素化することによって、アミノピリミジン１９、２０、２１、２２から合成されることができる。アミノピリミジン１９、２０（図３）は、以前にKador, Pら，Multifunctional Antioxidants and Methods of Use Thereof, U.P. Office, Editor 2012, Board of Regents of the University of Nebraska: USA, p. 33に記載されたようにして得られた。

【0034】

化合物２１（図３）は市販されている。化合物２２は、図４の反応スキームに示されるように、市販の２−クロロ−４，６−ジメトキシピリミジンをその２−塩素原子をベンジルアミンと求核置換し、その後に水素化することによって得ることができる。

【0035】

以下の実施例は、神経保護用の多機能及び単機能抗酸化物質の調製を説明する。

【実施例1】

【0036】

Ｎ−ベンジル−４，６−ジメトキシピリミジン−２−アミン（化合物２８）
ジオキサン（１．０Ｌ）中の２−クロロ−４，６−ジメトキシピリミジン（２７）（５０．０ｇ、０．２９ｍｏｌ）、ＢｎＮＨ₂（９３．３ｍＬ、０．８５ｍｏｌ）及びＫ₂ＣＯ₃（２．５ｇ、０．４５ｍｏｌ）の混合物を、４日間還流させた。反応物を濾過し、濾液を真空下で濃縮して黄色油を得た。それを２０：１〜１０：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーの後に、６１．７ｇ（８７％）の白色固体２８を得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 7.36-7.27 (m, 5H), 5.42 (s, 1H), 5.25 (s, 1H), 4.61 (d, J=5.86Hz, 2H), 3.83 (s, 6H)。

【実施例2】

【0037】

２−アミノ−４，６−ジメトキシピリミジン（化合物２２）
５．４gの２０％Ｐｄ（ＯＨ₂）触媒の存在下で、４００ｍＬのＭｅＯＨ中の化合物２８（２７．０ｇ、０．１１ｍｏｌ）を、室温で２日間水素化した。濾過及び溶媒蒸発後に、白色固体を得た。それを５０：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーの後に、１６．８ｇ、＊９８％）の２２を得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 5.47 (s, 1H, 4.90 (s, 2H), 3.84 (s. 6H)。

【実施例3】

【0038】

ＨＫ−１、ＨＫ−３、ＨＫ−５、及びＨＫ−７の合成
下記は、１−（２−ピリミジル）ピロリジン−２，５−ジオン（ＨＫ−１）、１−（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジル）ピロリジン−２，５−ジオン（ＨＫ−３）、１−（２−ピリミジル）ピペリジン−２，６−ジオン（ＨＫ−５）、１−（４，６−ジメトキシ−２−ピリミジル）ピペリジン−２，６−ジオン（ＨＫ−７）、１−（５−ベンジルオキシ−２−ピリミジル）ピロリジン−２，５−ジオン（化合物２３）、１−（５−ベンジルオキシ−２−ピリミジル）ピペリジン−２，６−ジオン （化合物２４）、１−（４，６−ジメトキシ−５−ベンジルオキシ−２−ピリミジル）ピロリジン−２，５−ジオン（化合物２５）、及び１−（４，６−ジメトキシ−５−ベンジルオキシ−２−ピリミジル）ピペリジン−２，６−ジオン（化合物２６）の一般的合成を記載する。

【0039】

図３を参照すると、３００ｍＬのトルエンに溶解された４２．０ｇ（０．４２ｍｏｌ）の無水コハク酸（１７）に、２００ｍＬのアセトンに溶解された２０ｇ（０．２１ｍｏｌ）の２−アミノピリミジン（２１）を加え、混合物を３日間８５℃に加熱した。室温に冷却後、生成物は沈殿し、生成物を濾過してトルエンで洗浄した。濾液を真空下で乾燥させ、次に乾燥生成物を３００ｍＬの無水Ａｃ₂Ｏに溶解し、再び３日間８５℃に加熱した。真空下で残ったＡｃ₂Ｏを除去した後、ＣＨＣｌ₃を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって生成物を精製し、ＥｔＯＡｃから再結晶化して、白色固体としてＨＫ−１を得た。融点１４８．５〜１４９．５℃、収率３２％。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.92 (d, J=4.88Hz, 2H), 7.42 (t, J=4.88Hz, 1H), 2.96 (s, 4H); Anal. Calcd for C₈H₇N₃O₂: C, 54.24; H, 3.98; N, 23.72。Found: C, 54.29; H, 4.19: N, 23.90。

【0040】

化合物２１の代わりに化合物２２を用いて、白色固体としてＨＫ−３を得た。融点１６６．９〜１６８．７℃、収率６０％。¹H NMR (CDCl₃) δ 6.09 (s, 1H), 3.94 (s, 6H), 2.92 (s, 4H): Anal. Calcd for C₁₀H₁₁N₃O₄: C, 50.63; H, 4.67; N, 17.71。Found: C, 50.78; H, 4.80; N, 17.80。

【0041】

ＨＫ−１についてのスキームにおいて化合物１７の代わりに化合物１８を用いて、白色固体としてＨＫ−５を得た。融点２２０．８〜２２１．３℃、収率５１％。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.88 (d, J=4.88Hz, 2H), 7.40 (t, J=4.88Hz, 1H), 2.83 (t, J=4.59Hz, 4H), 2.18-2.15 (m, 2H); Anal. Calcd for C₉H₉N₃O₂; C, 56.54; H, 4.74; N, 21.98。Found: C, 56.77; H, 4.85; N, 21.70。

【0042】

ＨＫ−１についてのスキームにおいて化合物１７の代わりに化合物１８を用い、かつ化合物２１の代わりに化合物２２を用いて、白色固体としてＨＫ−７を得た。融点２２９．２〜２３２．４℃、収率６３％。¹H NMR (CDCl₃) δ 6.06 (s, 1H), 3.92 (s, 6H), 2.79 (t, J=6.59Hz, 4H), 2.15-2.12 (m, 2H): Anal. Calcd for C₁₁H₁₃N₃O₄: C, 52.59; H, 5.22; N, 16.73。Found: C, 52.60; H, 5.40; N, 16.63。

【0043】

図３に示される化合物１７の化合物１９との反応によって、化合物２３を、溶離液として１００：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色固体として収率８６％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ8.57 (s, 2H), 7.44-7.43 (m, 5H), 5.21 (s, 2H), 2.93 (s, 4H)。

【0044】

図３に示される化合物１８の化合物１９との反応によって、化合物２４を、溶離液として１００：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色固体として収率７０％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.54 (s, 2H), 7.44-7.39 (m, 5H), 5.19 (s, 2H), 2.81 (t, J=6.59Hz, 4H), 2.17-2.13 (m, 2H)。

【0045】

図３に示される化合物１７の化合物２０との反応によって、化合物２５を、溶離液として１００：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色固体として収率７３％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 7.44-7.31 (m, 5H), 5.07 (s, 2H), 3.96 (s, 6H), 2.28 (s, 4H)。

【0046】

図３に示される化合物１８の化合物２０との反応によって、化合物２６を、溶離液として１００：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、白色固体として収率６３％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 7.47-7.35 (m, 5H), 5.03 (s, 2H), 3.96 (s, 6H), 2.80 (t, J=6.59Hz, 4H), 2.15-2.13 (m, 2H)。

【実施例4】

【0047】

ＨＫ−２、ＨＫ−４、ＨＫ−６、及びＨＫ−８の合成
下記は、１−（５−ヒドロキシ−２−ピリミジル）ピロリジン−２，５−ジオン（ＨＫ−２）、１−（４，６−ジメトキシ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジル）ピロリジン−２，５−ジオン（ＨＫ−４）、１−（５−ヒドロキシ−２−ピリミジル）ピペリジン−２，６−ジオン（ＨＫ−６）、及び１−（４，６−ジメトキシ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジル）ピペリジン−２，６−ジオン（ＨＫ−８）の一般的合成を記載する。

【0048】

図３の反応スキームを参照すると、７５０ｍＬのアセトンに溶解された化合物２３（１４．７ｇ、５１．９ｍｍｏｌ）を、３．７ｇの１０％Ｐｄ／Ｃ触媒により、室温で１２時間に亘って水素化した。濾過及び溶媒蒸発の後、ＨＫ−２を白色の綿毛状の固体として得た。ｉ−ＰｒＯＨでの再晶化の後に、１０ｇのＨＫ−２を得た。融点２７８．０〜２８０．０℃、収率７６％。¹H NMR (DMSO-d₆) δ 11.02 (s, 1H), 8.46 (s, 2H), 2.85 (s, 4H): Anal. Calcd for C₈H₇N₃O₃; C, 49.74; H, 3.65; N, 21.75。Found. C, 50.00; H, 3.69; M. 21.54。

【0049】

ＨＫ−１の合成において化合物２３の代わりに化合物２５を用いて、Ｅｔ₂Ｏからの再晶化の後に白色固体としてＨＫ−４を得た。融点１９３．７〜１９５．０℃、収率９１％。¹H NMR (CDCl₃) δ 5.15 (s, 1H), 4.03 (s,6H), 2.91 (s, 4H); Anal. Calcd for C₁₀H₁₁N₃O₅: C, 47.43; H, 4.38; N, 16.59。Found: C, 47.53; H, 4.48; N, 16.58。

【0050】

ＨＫ−１の合成において化合物２３の代わりに化合物２４を用いて、アセトンからの再晶化の後に白色固体としてＨＫ−６を得た。融点２４３．５〜２４４．３℃、収率８９％。¹H NMR (DMSO-d₆) δ 10.85 (s, 1H), 8.39 (s, 2H), 2.75 (t, J=6.35Hz, 4H), 1.99-1.96 (m, 2H); Anal. Calcd for C₉H₉N₃O₃; C, 52.17; H, 4.38; N, 20.28 Found C, 52.14; H, 4.52; N, 20.04。

【0051】

ＨＫ−１の合成において化合物２３の代わりに化合物２６を用いて、Ｅｔ₂Ｏからの再晶化の後に白色固体としてＨＫ−８を得た。融点２２２．０〜２２４．０℃、収率８６％。¹H NMR (CDCl₃) δ 6.06(s, 1H), 3.92 (s, 6H), 2.80 (t, J=6.59Hz, 4H), 2.15-2.13 (m, 2H); Anal. Calcd for C₁₁H₁₃N₃O₅; C, 49.44; H, 4.90; N 15.72。Found: C, 49.52; H, 4.99; N, 15.65。

【実施例5】

【0052】

ＨＫ−９、ＨＫ−１１、ＨＫ−１３、及びＨＫ−１５の合成
下記は、２−（ピロリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−９）、４，６−ジメトキシ−２−（ピロリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−１１）、２−（ピペリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−１３）、４，６−ジメトキシ−２−（ピペリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−１５）、５−ベンジルオキシ−２−（ピロリジン−１−イル）ピリミジン（化合物３５）、５−ベンジルオキシ−２−（ピペリジン−１−イル）ピリミジン（化合物３６）、５−ベンジルオキシ−４，６−ジメトキシ−２−（ピロリジン−１−イル）ピリミジン（化合物３７）、及び５−ベンジルオキシ−４，６−ジメトキシ−２−（ピペリジン−１−イル）ピリミジン（化合物３８）の一般的合成を記載する。

【0053】

図５の反応スキームを参照すると、４００ｍＬの無水ＴＨＦに溶解された９．５３ｍＬ（１１６ｍｍｏｌ)のピロリジン（２９）に、２．７８ｇの水素化ナトリウム（１１６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を０．５時間還流させた。室温に冷却後、１２ｇ（１０５ｍｍｏｌ)の２−クロロピリミジン（３３）を滴下し、混合物を２日間還流させ、そして氷浴中で冷却した。次に冷却された反応混合物に水(２００ｍＬ)を添加し、真空下でＴＨＦを除去した。水性残渣をＣＨＣｌ₃で抽出し、混合したＣＨＣｌ₃抽出物を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして濾過した。真空下での溶媒の除去後に、溶離液として２０：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製した。その次に生成物をジエチルエーテル（Ｅｔ₂Ｏ）から再結晶化して、黄色固体として１２．０ｇ（７６％）のＨＫ−９を得た。融点３９．０〜３９．６℃。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.31 (d, J=4.88Hz, 2H), 6.45 (t, J=4.88Hz, 1H), 3.57 (t, J=4.4Hz, 4H), 2.01-1.98 (m, 4H). Anal. Calcd for C₈H₁₁N₃: C, 64.40; H, 7.43; N, 28.16。Found: C, 64.42; H, 7.53; N, 27.97。

【0054】

ＨＫ−９の合成において化合物３３の代わりに化合物３４を用いて、Ｅｔ₂Ｏからの再晶化の後に白色固体としてＨＫ−１１を得た。融点６３．３〜６３．７℃、収率７１％。¹H NMR (CDCl₃) δ 5.34 (s, 1H), 3.87 (s, 6H), 3.56 (t, J=6.59Hz, 4H), 1.93-1.96 (m, 4H); Anal. Calcd for C₁₀H₁₅N₃O₂: C, 57.40; H, 7.23; N, 20.08。Found: C, 57.20; H, 7.03; N, 19.91。

【0055】

ＨＫ−９の合成において化合物２９の代わりに化合物３０を用いて、０．２５ｍｍＨｇ下における９０℃での真空蒸留後に、無色油としてＨＫ−１３を収率９０％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.22 (d, J=4.64Hz, 2H), 6.35 (t, J=4.64Hz, 1H), 3.71 (t, J=5.37Hz, 4H), 1.64-1.58 (m, 2H), 1.56-1.51 (m, 4H); Anal. Calcd for C₉H₁₃N₃: C, 66.23; H, 8.03; N, 25.74。Found: C, 66.49; H, 7.95; N, 25.81。

【0056】

ＨＫ−９の合成において化合物２９の代わりに化合物３０を用い、かつ化合物３３の代わりに化合物３４を用いて、白色固体としてＨＫ−１５を得た。融点５９．８〜６０．４℃、収率７４％。¹H NMR (CDCl₃) δ 5.25 (s, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.68 (t, J=5.49Hz, 4H), 1.60-1.55 (m, 2H), 1.52-1.48 (m, 4H); Anal. Calcd for C₁₁H₁₇N₃O₂: C, 59.17; H, 7.67; N, 18.82。Found: C, 58.94; H, 7.49; N, 18.56。

【0057】

図５に示される化合物２９の化合物３１との反応によって、化合物３５を収率８６％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.06 (s, 2H), 7.34-7.25 (m, 5H), 4.93 (s, 2H), 3.45 (t, J=6.59Hz, 4H), 1.58-1.52 (m, 6H)。

【0058】

図５に示される化合物３０の化合物３１との反応によって、化合物３６を収率７５％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.04 (s, 2H), 7.33-7.25 (m, 5H), 4.94 (s, 2H), 3.63 (t, J=4.88Hz, 4H), 1.93-1.90 (m, 4H)。

【0059】

図５に示される化合物２９の化合物３２との反応によって、化合物３７を収率８０％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 7.47-7.32 (m, 5H), 4.84 (s, 2H), 3.90 (s, 6H), 3.51 (t, J=6.59Hz, 4H), 1.95-1.92 (m, 4H)

【0060】

図５に示される化合物３０の化合物３２との反応によって、化合物３８を収率７５％で得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 7.46-7.27 (m, 5H), 4.85 (s, 2H), 3.89 (s, 6H), 3.69 (t, J=5.49Hz, 4H), 1.66-1.57 (m, 6H)。

【実施例6】

【0061】

ＨＫ−１０、ＨＫ−１２、ＨＫ−１４、及びＨＫ−１６の合成
下記は、５−ヒドロキシ−２−（ピロリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−１０）、５−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシ−２−（ピロリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−１２）、５−ヒドロキシ−２−（ピペリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−14）、及び５−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシ−２−（ピペリジン−１−イル）ピリミジン（ＨＫ−１６）の調製の一般的手順を記載する。

【0062】

図５の反応スキームを参照すると、３５０ｍＬのアセトンに溶解された化合物３８（１７．６ｇ、５３．４ｍｍｏｌ）を、室温で１２時間に亘って４．４ｇの１０％Ｐｄ／Ｃ触媒で水素化することによって、濾過及び溶媒蒸発の後に、淡い赤色固体としてＨＫ−１６を得た。Ｅｔ₂Ｏから再結晶化して、１２．７ｇ（８０％）のＨＫ−１６を得た。融点１２０．１〜１２０．５℃。¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7.63 (brs, 1H), 3.81 (s, 6H), 3.59 (t, J=5.25Hz, 4H), 1.60-1.56 (m, 2H), 1.52-1.47 (m, 4H); Anal. Calcd for C₁₁H₁₇N₃O₃: C, 55.22; H, 7.16; N, 17.56。Found: C, 55.15; H, 7.21; N, 17.48。

【0063】

図５に示されるように、化合物３８の代わりに化合物３７を用いて、Ｅｔ₂Ｏからの再晶化の後に黄色固体としてＨＫ−１２を得た。融点１０８．７〜１０９．２℃、収率７８％。¹H NMR (DMSO-d₆) δ 7.49 (brs, 1H), 3.82 (s, 6H), 3.41 (t, J=6.47Hz, 4H), 1.89-1.86 (m, 4H); Anal. Calcd for C₁₀H₁₅N₃O₃: C, 53.32; H, 6.71; N, 18.66。Found: C, 53.51; H, 6.80; N, 18.80。

【0064】

図５に示されるように、化合物３８の代わりに化合物３５を用いて、Ｅｔ₂Ｏからの再晶化の後に淡い黄色固体としてＨＫ−１０を得た。融点１５１．５〜１５１．８℃、収率８４％。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.05 (s, 2H), 3.55-3.75 (m, 4H), 1.96-1.92 (m, 4H). Anal. Calcd for C₈H₁₁N₃O: C, 58.17; H, 6.71; N, 25.44。Found: C, 57.92; H, 6.67; N, 25.18。

【0065】

図５に示されるように、化合物３８の代わりに化合物３６を用いて、Ｅｔ₂Ｏからの再晶化の後に淡い赤色固体としてＨＫ−１４を得た。融点９４．３〜９４．７℃、収率７９％。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.06 (s, 2H), 3.47 (t, J=6.59Hz, 4H), 1.70-1.40 (m, 6H). Anal. Calcd for C₉H₁₃N₃O: C, 60.32; H, 7.31; N, 23.45。Found: C, 60.15; H, 7.25; N, 23.26。

【実施例7】

【0066】

５−アミノ−２−クロロピリミジン（化合物４０）の合成
図６の反応スキームを参照すると、７００ｍＬのＥｔＯＨに溶解された１４０ｇ（０．８８ｍｏｌ）の２−クロロ−５−ニトロピリジン（３９）に、１４００ｍＬの酢酸、７００ｍＬの水及び１９７ｇの鉄粉（７０ｍメッシュ、＜２１２μｍ）の混合物を添加した。混合物を７０℃で一晩加熱し、室温に冷却し、そして濾過した。ＥｔＯＨを真空下で濾液から除去し、１２ＮのＮａＯＨでｐＨを８に調整した。ＥｔＯＡｃでの連続液液抽出で生成物を一晩抽出した。生じた濾過ケーキをＥｔＯＡｃで洗浄し、混合したＥｔＯＡｃ層を水、次に塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして濾過した。真空下での溶媒の除去及びＥｔＯＨでの再結晶化後に、９７．２ｇ（８５％）の淡い茶色固体の生成物３９を得た。¹H NMR (DMSO-d₆) δ 8.94 (s, 2H), 5.77 (brs, 2H)。

【実施例8】

【0067】

２−クロロピリミジン−５−オール（化合物４１）の合成
図６の反応スキームを参照すると、２Ｎの硫酸中の化合物４０（４０ｇ、０．３１ｍｏｌ）を２時間還流させた。室温に冷却後、反応混合物をＥｔＯＡｃにより一晩連続の液液抽出で抽出した。混合したＥｔＯＡｃ層を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして濾過した。真空下での溶媒の除去及びＥｔＯＨでの再結晶化後に、１０ｇ（２５％）の黄色固体４１を得た。¹H NMR (DMSO-d₆) δ 10.93 (brs, 1H), 6.45 (t, J=4.88Hz, 1H), 3.57 (t, J=4.4Hz, 4H), 2.01-1.98 (m, 4H)。

【実施例9】

【0068】

２−クロロ−５−ベンジルオキシ−ピリミジン（化合物３１）の合成
図６の反応スキームを参照すると、５００ｍＬのＭｅＯＨ中で１０ｇのアルコール４０（７６．６ｍｍｏｌ）に炭酸カリウム（１１．６ｇ、８４．３ｍｍｏｌ)を添加し、次に臭化ベンジル（１０．１ｍＬ、８４．３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１４時間攪拌した後に、水（３００ｍＬ）の添加によって反応を停止させた。ＭｅＯＨを蒸発させ、残った水層をＣＨＣｌ₃で抽出した。混合したＣＨＣｌ₃層を塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして濾過した。溶媒の除去に続いて、溶離液として１００：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、白色固体として１５ｇ（８９％）の２−アミノ−５−ベンジルオキシ−ピリミジン（３１）を得た。¹H NMR (CDCl₃) δ 8.27 (s, 2H), 7.37-7.30 (m, 5H), 5.09 (s, 2H)。

【実施例10】

【0069】

金属低減−キレート化作用
ＨＫ−１からＨＫ−８の化合物は、酸化還元活性な金属であるＣｕ¹⁺、Ｃｕ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｆｅ³⁺及びＺｎ²⁺と容易に複合体を形成するが、Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺とは容易に複合体を形成しない（図７）。連続変化法（Job plot）を用いて定められた化学量論は、多機能なＪＨＸ−化合物について観察されたものと類似した。それぞれの化合物及び関心のある金属イオンのいくつかの溶液を、ＨＫ−１からＨＫ−８及びイオンの一定の総濃度で、しかし１つの成分の異なるモル分率で調製した。平衡後、金属イオンのモル分率に応じて、各化合物について最大吸収の変化を記録した。２つの線形の依存性が得られ、一方は金属イオンの低モル分率において、他方は高モル分率においてであった。傾向線が交差するモル分率（又はその欠如）を、化学量論比を見い出すために計算した。この過程を上記イオンのすべてにおいて、すべての化合物について３度繰り返した。図７において一連のＨＫ−１からＨＫ−８について集約されたその結果は、化合物が金属と１：２又は２：１のいずれかの比で結合し、マグネシウム及びカルシウムのどちらとも相互作用しないことを示す。

【実施例11】

【0070】

細胞培養試験
多機能抗酸化物質及びそれらの単機能類似体は、過酸化物、ヒドロキシル基、及びスーパーオキシドラジカルによって生成されたＲＯＳを低減するそれらの能力について、細胞生存試験、スーパーオキシド試験、及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性アッセイによって、次のとおり検査された。

【0071】

体外での細胞生存率試験は、これまでに説明されているように、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞（ＡＴＣＣ）を使用して実施され、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する１：１のアール平衡塩類溶液を備えたイーグル最小必須培地及びハムＦ−１２（ＥＭＥＭ−Ｆ１２）培地で、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で培養した。細胞生存試験は、０．１６％のＤＭＳＯに溶解された１ｍＭの各化合物又はクリオキノール（ＰＢＴ１）で、Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS, Promega社, Madison, WI）を使用して、９６ウェルプレートで２４時間の期間に亘って実施された。クリオキノールは、東京化成工業株式会社（９８％、東京、日本）から購入し、再結晶化によって更に精製した。これは、フェナジンメチルスルファート（ＰＭＳ）の存在下で、１つの溶液（One Solution）がＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム)を含有する増殖又は細胞毒性分析において、生存細胞の数を明らかにするための比色法である。ＭＴＳ化合物は、４９０ｎｍの吸光度の値によって測定されるように、着色されたホルマザン生成物に細胞によって生体還元され、生存する培養細胞の数に正比例する。ＤＭＳＯで処理された細胞と比較して、Ｔｒｏｌｏｘに曝された場合、リードである５員環ＨＫ−２及びＨＫ−４、並びに６員環ＨＫ−６については、２４時間での細胞生存率は２０％低下したが、ＨＫ−８では３０％の低下が観察された。クリオキノールへ曝すと、細胞生存率において最大（５０％）の低下をもたらした。Ｈ₂Ｏ₂及びフェントン反応によって生成されたヒドロキシルラジカルに対するこれらの化合物の保護作用が検査された。酸化剤なしでは、クリオキノールでやはり細胞生存率において同様の低下が観察された。しかし、この影響は、酸化剤の存在下ではそれほど顕著でなかった。Ｈ₂Ｏ₂単独に曝された場合、酸化的損傷はすべての処理された細胞で低下し、未処理の細胞（ＤＭＳＯ及びＨ₂Ｏ₂のみ）に比べて細胞生存率での上昇が観察された。フェントン反応では、クリオキノールで処理された細胞での生存率は、使用濃度でのクリオキノールの特有の毒性に加えて、何の薬物効果も示さずに、ＤＭＳＯの対照よりも低かった。

【0072】

多機能及び単機能抗酸化化合物である一連のＨＫの、特に生細胞においてスーパーオキシドラジカルを低減する能力を、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞及びＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞の両方で評価した。ミトコンドリアによるスーパーオキシドの生成を、生細胞に浸透し、選択的にミトコンドリアを標的にするＭｉｔｏＳＯＸの赤試薬（Invitrogen Life Sciences社, Grand Island, NY）を使用して、蛍光顕微鏡検査法で可視可した。それは、スーパーオキシドによってすぐに酸化されるが、他の活性酸素種（ＲＯＳ）及び反応性窒素種（ＲＮＳ）によっては酸化されない。酸化された生成物は、核酸と結合すると強い蛍光を発する。これらの試験では、細胞を９６ウェルプレートに播種し、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で、８０％のコンフルエンスに達するまで（約２４時間）、標準的な培地（ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞については１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する１：１のアール平衡塩類溶液を備えたイーグル最小必須培地及びハムＦ−１２（ＥＭＥＭ−Ｆ１２）培地、又はヒトＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞については４％のＦＢＳを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）））で増殖させた。次に、細胞培地をそれぞれのウェルから除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。そして、化合物（ＤＭＳＯ（１０μＬ)に溶解された一連のＨＫ及び一連のＪＨＸ並びに酸化防止剤の普及品（ハイドロキノン（ＨＱ）、Ｔｒｏｌｏｘ（Ｔ）、ビタミンＥ（ＶＥ）、ビタミンＣ（ＶＣ））を、血清アルブミン（ＦＢＳ）を含まない新たな培地（１４０μＬ）と一緒にそれぞれのウェルに加えた。追加の対照としてスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、５００μｇ／ｍＬ、１０μＬ）を使用し、すべてのグループ（対照、薬物処理、及びＳＯＤ処理グループ）における細胞を同量のＤＭＳＯに加えた。添加後に、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で１時間、細胞を培養した。そして、キサンチン酸化酵素（ＸＯ）を添加して（２５ｍＵ／ｍＬ）、おおよそ１００μＭのスーパーオキシドを生成し、培養を更に１時間継続した。そして、培地を再び除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。最後に細胞を１００μＬのＭｉｔｏＳＯＸの赤試薬（５μＭ）で染色し、２時間更に培養し、蛍光のマイクロプレートリーダーを用いて、Ｅｘ／Ｅｍ＝５１０／５８０ｎｍでそれぞれのウェルの蛍光を測定した。

【0073】

これらの実験条件でのスーパーオキシドの生成は、両方の抗酸化物質で低下した。保護用の多機能抗酸化物質を、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞及びＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞の両方で、用量に依存した方法で試験した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞では、ＨＫ−２、ＨＫ−４及びクリオキノールは、同様のスーパーオキシドラジカルの低減を示した。一方で、化合物ＨＫ−９及びＨＫ−１１（必要なヒドロキシル基を有しない類似体）は、スーパーオキシドアニオンラジカルの低減において効果がなかった。単機能抗酸化物質であるＨＫ−１０、ＨＫ−１２、ＨＫ−１４及びＨＫ−１６もまた保護を示したが、単機能のキレート剤であるＨＫ−１、ＨＫ−３、ＨＫ−５及びＨＫ−７は保護を示さなかった。ＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞では、クリオキノール並びに多機能抗酸化物質ＨＫ−２、ＨＫ−４及びＪＨＸ−４は、抗酸化物質Ｔｒｏｌｏｘと同じように、同様の用量に依存したスーパーオキシドアニオンラジカルの低減を示す。

【0074】

多機能抗酸化化合物である一連のＨＫの、特にヒドロキシルラジカル誘発の細胞死を防ぐ能力を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性アッセイ（Invitrogen Life Sciences社, Grand Island, NY）を用いて、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞及びＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞の両方で評価した。細胞を９６ウェルプレートに播種し、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で、８０％のコンフルエンスに達するまで（約２４時間）、標準的な培地（ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞については１０％のＦＢＳを含有する１：１のＥＭＥＭ−Ｆ１２培地、又はヒトＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞については４％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）で増殖させた。そして培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。化合物（ＤＭＳＯ（１０μＬ)に溶解された一連のＨＫ及び一連のＪＨＸ又は酸化防止剤の普及品（ハイドロキノン（ＨＱ）、Ｔｒｏｌｏｘ（Ｔ）、ビタミンＥ（ＶＥ）、ビタミンＣ（ＶＣ））を、ＦＰＳを含まない適切な培地と共に改めて細胞に加えた。５％のＣＯ₂雰囲気下における３７℃での１時間の培養に続いて、フェントン試薬（ＦＰＳを含まない適切な培地で溶解されて、１００μＭの最終濃度となるＦｅ²⁺及び過酸化水素）をそれぞれのウェルに添加し、培養を継続した。フェントン試薬を加えての２時間の培養後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。カルセインＡＭ（ＡＭ、ＮＢについて８μＭ）及びエチジウムホモダイマー（ＥｔｈＤ−１、ＮＢについて１６μＭ)を含有する１００μＬのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬で、３７℃で１時間に亘って細胞を染色した。蛍光のマイクロプレートリーダーを用いて、Ｅｘ／Ｅｍ＝４９４／５１７ｎｍ（生細胞についてのＦｓａｍ）及びＥｘ／Ｅｍ＝５２８／６１７ｎｍ（死細胞についてのＦｓａｍ）でそれぞれのウェルの蛍光を測定した。対照試料の蛍光も次のとおり測定した。生細胞についてのＦｍａｘ（ＡＭのみで標識化された生細胞試料におけるＥｘ／Ｅｍ＝４９４／５１７ｎｍでの蛍光）、生細胞についてのＦｍｉｎ（ＥｔｈＤ−１のみで標識化された生細胞試料におけるＥｘ／Ｅｍ＝４９４／５１７ｎｍでの蛍光）、死細胞についてのＦｍａｘ（ＥｔｈＤ−１のみで標識化された死細胞試料におけるＥｘ／Ｅｍ＝５２８／６１７ｎｍでの蛍光）、死細胞についてのＦｍｉｎ（Ａｍのみで標識化された死細胞試料におけるＥｘ／Ｅｍ＝５２８／６１７ｎｍでの蛍光）、ブランクの４９４／５１７（染料及び細胞のないＥｘ／Ｅｍ＝４９４／５１７ｎｍでの蛍光）、ブランクの５２８／６１７（染料及び細胞のないＥｘ／Ｅｍ＝５２８／６１７ｎｍでの蛍光）。死細胞の対照については、７０％のエタノールで、３７℃で３０分間細胞を培養した。生細胞の割合を蛍光の測定値から次の式を用いて計算した。

【数1】

死細胞の割合を蛍光の測定値から次の式を用いて計算した。

【数2】

【0075】

ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性アッセイで得られた結果は、生細胞での同様の用量に依存した増加と対応しており、そして死細胞における減少が、多機能抗酸化化合物及び酸化防止剤の普及品の両方で観察された。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞及びＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞の両方において１ｍＭのフェントン試薬によって生成されたヒドロキシルラジカルに２時間曝すことは、生細胞の減少及び死細胞の増加をもたらした。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞では、多機能抗酸化物質ＨＫ−２及びＨＫ−４、並びに多機能キレート剤ＨＫ−１０、ＨＫ−１２、ＨＫ−１４及びＨＫ−１６は、クリオキノールと同様に、ヒドロキシルラジカルに２時間曝すことに対して、同様に用量に依存した保護を有する。一方で、化合物ＨＫ−９及びＨＫ−１１（必要なヒドロキシル基を有しない類似体）は、細胞を保護する効果を有しない。ＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞では、抗酸化物質は、多機能抗酸化物質のＨＫ−２、ＨＫ−４及びＪＨＸ−４並びにクリオキノールと同様に、ヒドロキシルラジカルに２時間曝すことに対して、同様に用量に依存した保護を示す。単機能抗酸化物質であるＨＫ−１０、ＨＫ−１２、ＨＫ−１４及びＨＫ−１６もまた、用量に依存した保護を示した。

【実施例12】

【0076】

ミトコンドリアの生存性／毒性
レーザ色素のローダミン１２３は、生細胞でのミトコンドリアの位置を特定するための特異的プローブであることが示されている。そのミトコンドリアについての選択性により、この染料は、薬物によって誘発されたミトコンドリアでの変化を探るために使用されることができる。したがって、多機能抗酸化物質が、遷移金属をキレートするその能力によってミトコンドリアの機能を悪い方向に変えるかどうかを明らかにするために、試験を実施した。

【0077】

ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を、８ウェルの顕微鏡プレート（BD Falcon社、８００マイクロスライド）に播種し、１０％のＦＢＳを含有するＥＭＥＭ−Ｆ１２培地で、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で細胞を培養した。各ウェルにおいて細胞がおおよそ８０％のコンフルエンスになったら、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、ＦＢＳを含まずに、ＤＭＳＯに溶解されたＪＨＸ−１、−４、−５、−８、ＨＫ−２、−４、−９、−１１、又はクリオキノールを含有し、４％のＤＭＳＯにおいて１ｍＭの最終的な薬物濃度となるようにされた２００μＬのＨＢＳＳ培地で、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で１時間、細胞を前培養（プレインキュベート）した。次に、１ｍＭの最終的な濃度になるようにＭｎＣｌ₂を適切な細胞グループに添加して、そのグループを更に２時間培養した。マンガンに３時間曝した後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。そして細胞を、ウェルごとに１００μＬの蛍光色素のローダミン１２３（Ｒｈ１２３）（２０μＭ）及びヘキスト３３３４２（８μＭ）で、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で３０分間に亘って染色した。次に、細胞をメディアで５分間で３度洗浄し、最後に殺菌されたＨＰＬＣグレードの水で洗浄した。最終的にプレートシェルフを除去し、１０％のＦＢＳを含有する１０マイクロリットルの細胞培地を各ウェルに添加し、そしてウェルを長方形のカバーガラスでカバーした。カバーガラスとスライドガラスとの間の隙間はマニキュア液で塞がれ、そして細胞を共焦点蛍光顕微鏡法によって検査した。同様の手順をＲＰＥ細胞試験について用いた。しかし、ＡＲＰＥ−１９ＲＰＥ細胞は、４％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培養した。

【0078】

検査された神経芽腫及び網膜色素上皮細胞の両方が、ミトコンドリアの赤のローダミン１２３の染色、及び青の染色のヘキスト３３３４２での細胞核におけるＤＮＡの存在を示した。多機能抗酸化物質又はその単機能類似体を細胞に添加した時に、ローダミンの染色での変化は観察されなかった。しかし、これらの細胞に１ｍＭのＭｎＣｌ₂を加えると、ミトコンドリアの機能障害を示す、ローダミンの染色の消失をもたらした。このローダミン１２３の染色の消失は、多機能抗酸化物質の類似体又はクリオキノールを含有する細胞にＭｎＣｌ₂を加えた時には観察されなかった。これらの試験は、多機能抗酸化物質の類似体はミトコンドリアに有毒でないことを示す。代わりに、それは、クリオキノールと同様に、明らかにＭｎと複合体を形成することによってミトコンドリアの機能を保護する。

【実施例13】

【0079】

多機能抗酸化物質は、Ａβ_1-42／Ｚｎ複合体を変化させることができる
Ａβ斑は、ＡＤである患者の脳、水晶体及び網膜に存在する。アミロイド斑へのペプチドアミロイドベータ（Ａβ）の凝集は、アルツハイマー病における重要事象である。アミロイドカスケード仮説によれば、Ａβの凝集は、活性酸素種の生成によってニューロンに有毒であり、したがってその疾患の原因に直接関与する。亜鉛イオンは、Ａβに結合して凝集の特性に影響し得るので、重要な役割を果たす。アルツハイマー病の治療法であるクリオキノール及びＰＢＴ２は、複合体から亜鉛を放出させることによって、アミロイドベータの分解を促進する。

【0080】

アミロイドベータ／亜鉛の複合体から亜鉛を放出させる多機能抗酸化物質の能力を、American Peptide Company, Inc.（Vista, CA）からのＡβ_1-42を使用して調査した。Ａβ_1-42／Ｚｎ複合体は、次のとおり調製された。ＺｎＳＯ４溶液（２００μＭ)及びＡβ_1-42（２００μＭ）を一緒に混合し、３７℃で培養した。４８時間の培養後、混合物を１４０００ｘｇで３分遠心分離し、凝集したＡβ_1-42のペレットを得た。次に、凝集したＡβ_1-42を水又は２００μＭの薬物に再懸濁した。その複合体をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で希釈して、各成分を１０μＭの最終濃度にした。そして、この複合体を、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞及びＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞を用いる下記の試験に使用した。その試験は、２〜４回繰り返された。

【0081】

ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を、８ウェルの顕微鏡プレート（BD Falcon社、８００マイクロスライド）に播種し、１０％のＦＢＳを含有するＥＭＥＭ−Ｆ１２培地で、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で細胞を培養した。各ウェルにおいて細胞がおおよそ８０％のコンフルエンスになったら、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次に、１０μＭの薬物（ＤＭＳＯに溶解されたＪＨＸ−１、−４、−５、−８、ＨＫ−２、−４、−９、−１１、又はクリオキノール）を含有し、ＦＢＳを含まない２００μＬのＨＢＳＳ培地で、５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で１時間に亘って細胞を前培養（プレインキュベート）した。各薬物に１時間曝した後、その培地を１０μＭのＡβ_1-42／Ｚｎ／薬物（１／１／１）を含有する２００μＬのＨＢＳＳ培地と交換し、対照グループについては、Ａβ_1-42／Ｚｎ、Ｚｎ／薬物、Ａβ_1-42／薬物、又はＡβ_1-42を含有するＨＢＳＳ培地と交換した。そして、細胞を５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で１時間に亘って更に培養した。培地を再び除去し、ＰＢＳで洗浄し、ウェルごとにＥＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）において１００μＬの蛍光染料ジンキン（zinquin）（１０μＭ）で細胞を染色した。５％のＣＯ₂雰囲気下において３７℃で３０分の培養後、ジンキン培地を除去し、４％のパラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳと交換した。そして、亜鉛の細胞局在を評価するために、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、ＤＡＰＩフィルタセットを用いて共焦点蛍光顕微鏡法によって、固定細胞におけるジンキンの蛍光を測定した。その試験は、２〜４回繰り返された。

【実施例14】

【0082】

生物学的利用能試験
０．０５％の各薬物（平均用量９０ｍｇ／ｋｇ／日）を含有する食事を１４日間与えたＣ５７ＢＬ／６マウスで生物学的利用能試験を実施した。犠牲時に全身の灌流に続いて、水晶体、神経網膜及び脳を取り出して、ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。これらの化合物は、ＪＨＸ−４及び−８に比べて著しく高い薬物の脳内濃度を達成した。しかし、一連のＪＨＸと対照的に、これらのＨＫ化合物は、水晶体において適正な濃度に到達しなかった（平均±ＳＥＭ）。グラフは、すべての多機能抗酸化物質が少なくとも１つの標的組織に対して良好な経口での生物学的利用能を有することを示す。ＪＨＸ−８を除いて、すべての化合物はリピンスキーの法則にも適合したので、このことは予想された。リピンスキーの法則は、経口での生物学的利用能は次のパラメータに関連することを述べる。（１）水素結合供与体（ＮＨ又はＯＨ）≦５、（２）水素結合受容体（Ｎ又はＯ）≦１０、（３）分子量≦５００、及び（４）オクタノール−水分配係数ｌｏｇＰ＝ｌｏｇ（Ｃ_{オクタノール}／Ｃ_水）≦５。ＪＨＸ−８は、１２の水素結合受容体を有するにもかかわらず、やはり良好な生物学的利用能を示す。

【実施例15】

【0083】

分子記述子での予測される脳／水晶体の取り込み
分析される眼組織及び神経組織へのこれらの多機能抗酸化物質の摂取及び分布の分析は、多くの複雑な薬物動態学的な段階を必要とする。水晶体については、これは血液房水関門（ＢＡＢ）を通過し、水に入り、最終的に拡散によって水晶体に入る。一方で、神経網膜及び脳については、これはそれぞれ血液網膜関門（ＢＲＢ）又は血液脳関門（ＢＢＢ）を通ることを必要とする。これらの化合物は親油性で、特定の取り込み又は排出受容体と相互作用することは予測されないが、水晶体の取り込みと薬物の親油性との間での予想される関係も、予想される同様のＢＢＢ及びＢＲＢ透過性の親油性との関係も、観察されない。代わりに、分子記述子での有望な回帰分析は、水晶体、脳及び網膜における親油性の多機能抗酸化物質の取り込みにおける顕著な相違が、選ばれた分子記述子の分析によって予測され得ることを示す。これらの化合物の物理的特性を検査した。

【0084】

Molecular Operating Environment（ＭＯＥ ２００７．０９、Chemical computing group, CO., Ltd.,)を用いて各化合物についての３次元（３Ｄ）構造を生成し、次にハミルトニアン（ＭＭＦＦ９４Ｘ）エネルギー最小化プログラムを使用して３次元構造を最小化した。次に、この最低エネルギー構造で多くの分子記述子を計算した。これらは、ｎ−オクタノールと水との間における化合物の分配係数の対数であるｌｏｇ（Ｃ_{オクタノール}／Ｃ_水）であり、そして親水性又は親油性を説明するｌｏｇＰを含む。高いオクタノール／水の分配係数を備えた疎水性薬物は、細胞の脂質二重層などの疎水性の区画に選択的に分散する。一方で、親水性薬物（低いオクタノール／水の分配係数）は、選択的に血清などの親水性の区画において見つかる。また、結合した水素を含めて、すべての極性原子（Ｎ、Ｏ、Ｓ）の表面の合計として定められる位相幾何学的極性表面積（ＴＰＳＡ）も計算した。このパラメータは、吸収を予測するために使用された。１４０Ųより大きな極性表面積を有する分子は、通常は細胞膜を通過する能力が劣ると考えられる。ＢＢＢを貫通する分子については、ＴＰＳＡは６０Ųより小さいべきである。また、分子における電荷系の電気極性の大きさである双極子モーメント（ＤＭ：μ、ＡＭ１＿μ、ＭＮＤＯ＿μ、ＰＭ３＿μ）も計算した。分子の双極子モーメントは、その極性を明らかにし、このパラメータは、薬物−受容体相互作用及び定量的構造活性相関研究においてよく使用される。また、分子の分極率を推測する分子屈折率（ＭＲ）も計算した。それは、定量的構造活性相関研究において使用される最も古くかつ最も良好な記述子の１つである。ＭＲは、しばしばリガンド結合と強い相関関係を示し、ｌｏｇＰと相補的である。ＭＲは、非親油性の相互作用の尺度を与える。ＭＲは、分子容だけでなく、薬物−受容体相互作用において作用するロンドン分散力にも関係する。

【0085】

また、平均分子分極率の概算量である原子分極率（ａｐｏｌ）も計算した。原子分極率は化合物の構造に基づき、したがって使用されるプローブの数及びタイプとは無関係である。また、水に接触可能な分子の表面積である水接触可能表面積（ＡＳＡ）も計算した。極性表面積及び疎水性表面積（ＰＳＡ、ＨＳＡ）については、極性領域の寄与の合計によってＰＳＡを計算し、一方で疎水性領域の寄与の合計によってＨＳＡを計算した。また、全電荷を加重した部分的に負又は正に帯電した分子の表面積である、電荷を加重した負電荷／正電荷表面積（ＣＡＳＡ−／＋）を計算した。また、引力の疎水性相互作用を発生させる分子エンベロープとして定められる疎水性体積（Ｄ）を計算した。８つの異なるエネルギーレベルでの疎水性記述子を、疎水性相互作用の通常のエネルギー範囲（−０．２〜−１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に適用する。また、水分子に接近し易く、水分子と引力相互作用する分子エンベロープを表す親水性体積（Ｗ）を計算した。Ｗは、相互作用エネルギーのレベルに伴って変化する。−０．２〜−１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌの分子場から計算されたＷ１〜Ｗ３は、分極率及び分散力の主要因である。−２．０〜−６．０ｋｃａｌ／ｍｏｌの分子場からのＷ４〜Ｗ８は、極性領域及び強力なＨ結合ドナーアクセプター領域の主要因である。また、分子の極性基の体積である極性体積（Ｗｐ）も計算した。また、分子の分岐の大きさの尺度であり、立体的かさ高さの尺度を与えるカッパ形状指数（Ｋｉｅｒ１−３）も計算した。

【0086】

また、体積の球の表面領域から外れた分子表面の比として定められ、分子の撓み性に関係する分子球形（Ｇ）も計算した。完全な球形分子については、Ｇは１．０である。また、分子の親水性及び親油性部分の間の比を定める臨界充填パラメータ（ＣＰ）も計算した。親水性−親油性の均衡とは異なり、ＣＰは単に分子形状を意味する。それは、体積（親油性部分）／［(表面（親水性部分)×（親油性部分の長さ）］として定められる。また、化合物の構造の複雑性を、その全体寸法に対するその分子骨格（ＭＦ）の寸法に基づいて表すトポロジー記述子（ｆ_MF）を計算した。ｆ_MFは、分子全体寸法に対する分子骨格寸法の割合として定められる。非特異性は、タンパク質と非特異的に多数の相互作用を形成する分子の能力として定められ、ｆ_MFの値が大きいときにｆ_MFと関連がある。水晶体、神経網膜、及び脳のいずれでも、それぞれの上記物理化学的記述子及びトポロジー記述子と、６つの多機能抗酸化物質及び類似体の濃度との間で観察された個々の相関が示された。回帰分析は有意な関係を示すが、多くの場合においてこれらの相関は、グラフのいずれかの端に集まった点の不均等な分布に起因する偽りのものかもしれない（例えば、水晶体におけるｌｏｇＰ、ＣＡＳＡ−ＣＡＳＡ＋）。したがって、点の広い分布を示すグラフだけが、肯定的に検討された（例えば、水晶体におけるＴＰＳＡ、ＤＭ、ＰＳＡ、ｆ_MF）。水晶体及び脳における同様の分子記述子は逆相関を与えるが、神経網膜では観察された相関は何もなかった。

【実施例16】

【0087】

ヒトＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞に曝されたＺｎの細胞局在のジンキン分析
この試験のために、ＡＲＰＥ−１９網膜色素上皮細胞が４％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭで培養されたことを除き、神経芽腫細胞株について記載されたものと同じ手順を利用した。

【0088】

青の蛍光を有するジンキン染色は細胞質における不安定なＺｎ²⁺の存在を示し、この染色は、細胞にＡβ_1-42／Ｚｎ複合体を添加した後に消える。これは、不安定な亜鉛がこの時点でもはや利用できなくなること又は複合体から放出されることを示す。これは、細胞が多機能抗酸化物質又はクリオキノールと一緒に培養されたときには起こらない。このことは、これらの化合物が凝集したＡβ_1-42／Ｚｎ複合体の存在下において、不安定な亜鉛の濃度を維持することを示唆する。同様の効果は、神経芽腫細胞株及びＲＰＥ細胞株の両方で観察された。同様の作用は、ＰＢＴ２についても同様であった。

【0089】

まとめると、ＨＫ−２、ＨＫ−４、ＨＫ−６、及びＨＫ−８は、不活性酸素種を活性酸素種（ＲＯＳ）に変える可能性のある遷移金属をキレートすると共に、遊離基を捕捉してＲＯＳをより害の少ない化合物に変える、多機能な神経保護用の抗酸化物質である。ＨＫ−１、ＨＫ−３、ＨＫ−５、及びＨＫ−７は、不活性酸素種を活性酸素種（ＲＯＳ）に変える可能性のある遷移金属をキレートする単機能な神経保護用の抗酸化物質である。ＨＫ−１０、ＨＫ−１２、ＨＫ−１４、及びＨＫ−１６は、遊離基を捕捉してＲＯＳをより害の少ない化合物に変える単機能な神経保護用の抗酸化物質である。これらの化合物はすべて、エステル型プロドラッグとして経口で投与されても良く（親油性をもたらしかつエステル基の追加によって活性化合物の水素結合性基を覆うエステル型プロドラッグへの変更は、当分野で周知技術である。）、それはすべて血液脳関門を通過することができることが示されている。

【0090】

ＨＫ−２、ＨＫ−４、ＨＫ−６、及びＨＫ−８は、Ｆｅ、Ｃｕ、又はＺｎなどの金属を独立してキレートし、種々の発生源から生成された遊離基を捕捉するそれらの能力によって、神経を保護し、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳなどの様々な神経疾患の治療、外傷性脳損傷、白内障、緑内障、加齢黄斑変性症及び他の網膜変性などの眼疾患、並びに糖尿病性合併症の進行の緩和に有益である。これらの化合物はまた、選択された疾患におけるＦｅ、Ｃｕ、又はＺｎの蓄積を減らすのに有益であり得る。

【0091】

単機能抗酸化物質ＨＫ−１、ＨＫ−３、ＨＫ−５、ＨＫ−７及びそれらの類似体は、Ｆｅ、Ｃｕ、又はＺｎ金属をキレートするそれらの能力によって、ハンチントン病及びアルツハイマー病、並びに銅中毒及び鉄中毒の治療に有益である。

【0092】

単機能の遊離基捕捉剤ＨＫ−１０、ＨＫ−１２、ＨＫ−１４、ＨＫ−１６及びそれらの類似体は、遊離基を捕捉するそれらの能力によって、上記の加齢に伴う病気だけでなく、電離放射線に対する放射線防護剤としても有益である。

【0093】

本発明は、上記の実施形態に限定されず、添付する特許請求の範囲内であるいずれか及びすべての実施形態を包含することが理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】