特許 6154282 神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6154282

(24)【登録日】2017年6月9日

(45)【発行日】2017年6月28日

(54)【発明の名称】神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7034 20060101AFI20170619BHJP

   A61K 36/899 20060101ALI20170619BHJP

   A61K 36/00 20060101ALI20170619BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170619BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20170619BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20170619BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170619BHJP

   C07H 15/203 20060101ALN20170619BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7034

   A61K36/899

   A61K36/00

   A61P25/00

   A61P25/28

   A61P25/16

   A61P43/00 107

   !C07H15/203

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2013-208328(P2013-208328)

(22)【出願日】2013年10月3日

(65)【公開番号】特開2015-71565(P2015-71565A)

(43)【公開日】2015年4月16日

【審査請求日】2016年6月3日

(73)【特許権者】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(74)【代理人】

【識別番号】100122954

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷部 善太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162396

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 泰之

(72)【発明者】

【氏名】山崎 いづみ

(72)【発明者】

【氏名】山田 昌良

【審査官】 渡部 正博

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１３−０７１９１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０５７６４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１０２０６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 再公表特許第２０１１／０８３８２７（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５１４８２７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下に示す化学式Ｉ〜Ｖで表される化合物のいずれか１以上を有効成分として含む神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【請求項2】

請求項１に記載の化学式Ｉ〜Ｖで表される化合物のいずれか１以上を有効成分として含むコムギ末粉抽出物からなる神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

成熟した哺乳動物では、一般に神経細胞は分裂能を持っていない特殊な細胞からなる組織である。そのため一旦障害を受けると長期にわたって障害が続く。特に脳や脊髄といった中枢神経系では全く再生能がないといわれて来た。
外因性の傷害による脊髄損傷に代表される不随やアルツハイマー病、パーキンソン病といった神経変性疾患に対する治療方法がないことも、中枢神経における再生能が無いことが一つの原因である。一方で、末梢神経は再生能を有しており、一旦切断された後も軸索が再生し機能が回復する。しかしこの場合にも再生に要する期間は数ヶ月から１年以上と長期間を要する。このため、患者にとっての苦痛は大きい。
また神経の再生に長期間を要するために、その間に神経細胞が死滅し機能回復に至らない場合も多い。このように再生能を有する末梢神経の場合も、脳や脊髄といった中枢神経系の環境では全く伸長することはできない。そのため、中枢神経系には神経の伸長を阻止する物質が存在していることが推測されている。この中枢神経系に存在する神経再生阻害物質を抗体などで抑制すると、中枢で一部の神経再生が起こり、機能の回復も見られる。最近、この中枢神経再生阻害因子としてNogoが発見された（非特許文献１：Nature 403, 434, 2000、非特許文献２：Nature 403, 439, 2000）。しかし、Nogoを阻害することによって、再生する神経線維は一部であり、他の再生阻害物質が存在するのではないかと考えられているが、インビボで神経の再生阻害に働いている因子の一つとしてセフォマリンも推定されている（非特許文献３：Cell 75, 217, 1993、非特許文献４：Cell 75, 1389, 1993）が、これまで明らかにされていない。

【0003】

近年、アルツハイマー病などの認知症治療薬である塩酸ドネルペジル（商品名：アリセプト）が、海馬内のインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）を介して海馬神経を再生させることが発見された（非特許文献５：ＣＬＩＮＩＣＩＡＮ、２００９、Ｎｏ．５８３，１０７７−１０８５）。このような知見が積み重なることによって再生困難とされてきた中枢神経の新生や再生する薬剤や物質の探索が進められている。特許文献１（特表２０１２−５０８２５４号公報）にはα−７アゴニストを投与することで中枢神経再生を促進する方法が提案されている。また特許文献２（特表２０１１−５１１６２１号公報）ＣＲＥＢ経路を活性化させて神経系を活性化させるために、その遺伝子の上流域にあるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ伝達経路及びタンパク質キナーゼを活性化させる技術が提案されている。また特許文献3（特表２００６−５１４６３０号公報）には、神経細胞内のｃＡＭＰレベルを上昇させることによって中枢神経系の発生促進する方法が提案されている。

【0004】

本発明者はコムギ由来の末粉抽出物に神経再生促進作用を見出し特許出願している（特許文献４：特開２０１３−７１９１０号公報）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表２０１２−５０８２５４号公報

【特許文献2】特表２０１１−５１１６２１号公報

【特許文献3】特表２００６−５１４６３０号公報

【特許文献4】特開２０１３−７１９１０号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】雑誌 Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４３４，２０００（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ刊）

【非特許文献2】雑誌 Ｎａｔｕｒｅ ４０３，４３９，２０００（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ刊）

【非特許文献3】雑誌 Ｃｅｌｌ ７５，２１７，１９９３（Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ刊）

【非特許文献4】雑誌 Ｃｅｌｌ ７５，１３８９，１９９３（Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ刊）

【非特許文献5】雑誌 ＣＬＩＮＩＣＩＡＮ ５８３，１０７７−１０８５、２００９（エーザイ刊）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、神経新生剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、コムギ末粉の神経新生作用に着目して研究を行った結果、あらたに神経新生作用を見出し、活性の本体を単離同定することができた。

【0009】

すなわち、本発明は次の構成である。
（１）以下に示す化学式Ｉ〜Ｖで表される化合物のいずれか１以上を有効成分として含む神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤。

【0010】

【化1】

【0011】

【化2】

【0012】

【化3】

【0013】

【化4】

【0014】

【化5】

（２）化学式Ｉ〜Ｖで表される化合物のいずれか１以上を有効成分として含むコムギ末粉抽出物からなる神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤。

【発明の効果】

【0015】

本発明により、新たな神経新生剤が提供される。さらにまた本発明の神経新生剤は中枢神経系の障害にともなう各種疾患や知的障害の予防、治療剤とすることができる。またiPS細胞などの多能性細胞株から確立した神経幹細胞や神経前駆細胞から神経系を形成させる目的で使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】コムギ末粉抽出物中に神経新生活性が存在することを示すグラフである。

【図2】コムギ末粉抽出物からエタノール濃度を変えて分画したときの神経新生作用の分布を示すグラフである。

【図3】コムギ末粉抽出物から５％エタノール溶液で分画した神経新生活性を有する画分のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。

【図4】コムギ末粉抽出物から単離した化学式Ｉ〜Ｖの化合物の神経新生を確認したグラフである。対照に対して神経幹細胞が増殖していることを示す。

【図5】ＯＤＳカラムにより分離された神経新生活性を有する化合物の構造式を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、化学式Ｉ〜Ｖの化合物を含む神経新生剤に係る発明である。
化学式Ｉ〜化学式Ｖの化合物はいずれも、コムギ末粉から単離され、メトキシヒドロキノンまたはジメトキシヒドロキノンにグルコースまたは、オリゴ糖が結合した配糖体構造を有している。化学式Ｉの化合物は、メラニン生成抑制剤として公知である（特開平５−３１０５４７号公報参照）。しかし化学式Ｉの化合物がコムギ末粉に含有されていることは知られていない。化学式ＩＩ〜Ｖの物質もいずれも配糖体として公知であるが、コムギ末粉に含まれていることは知られていない。
化学式１〜Ｖの化合物は、一般的な化学合成法によって合成することもできる。またコムギ末粉から抽出することもできる。
なお本発明でいう神経新生とは神経幹細胞または神経前駆細胞に作用して細胞を増殖性、神経を新生させる作用をいう。

【0018】

本発明の神経新生剤を製造するには、上記の方法で製造した化学式Ｉ〜Ｖの化合物を常法に従って公知の医薬用無毒性担体と組み合わせて製剤化すればよい。あるいはコムギ末粉から神経新生活性を指標として抽出した活性画分を、公知の医薬用無毒性担体と組み合わせて製剤化すればよい。本発明に関する神経新生剤は、種々の剤型での投与が可能であり、例えば、経口投与剤としては錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、非経口投与剤としては注射剤のほか、坐剤、噴霧剤、経皮吸収剤等が挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
医薬用担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。本発明に関わる末梢神経障害改善剤において、卵黄由来ホスファチジルセリンの投与量は、患者の年齢、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態などにより、適宜選択・決定されるが、例えば一日あたり０．０１mg/kg〜１０００mg/kg体重程度とされ、一日数回に分けて投与してもよい。

【0019】

また、化学式Ｉ〜Ｖで表される化合物のいずれか１以上を含むコムギ末粉抽出物は機能性食品として摂取することもできる。本発明に関わるコムギ末粉抽出物を含有することを特徴とする機能性食品は、特定保健用食品、栄養機能性食品、又は健康食品として位置づけることができる。機能性食品としては、例えば適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル剤、ペースト状等に形成したものを用いることができる。この機能性食品は、そのまま食用に供してもよく、また種々の食品（例えばハム、ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、パン、バター、粉乳、チョコレートなど）に添加して使用したり、水、酒類、果汁、牛乳、清涼飲料水等の飲物に添加して使用してもよい。
神経新生剤の摂取量は、対象の年齢、体重、症状、摂取スケジュール、製剤形態などにより、適宜選択・決定されるが、例えば一日あたり０．０１mg/kg〜１０００mg/kg体重程度とされる。

【0020】

以下に実施例、試験例を示し、本発明をさらに説明する。

【実施例】

【0021】

＜コムギ末粉からの神経新生活性画分の抽出と構造決定＞
１．コムギ末粉水抽出物の調製
コムギ末粉１ｇに対して水５ｍＬを添加し、１分３０秒超音波処理を行った。次いで、遠心機で１，０００ｒｐｍ×１０分遠心後、上清を回収し、凍結乾燥機で水分を飛ばしたものを水抽出物とした。

【0022】

２．コムギ末粉水抽出物からの分画
コムギ末粉水抽出物からＧ３０００Ｓ（東ソー株式会社）オープンカラムを用いて、５、１０、１５、２０および１００％エタノールにて分画した（５、１０、１５、２０および１００％エタノール画分）。得られた分画は、凍結乾燥して試験に用いた。

【0023】

３．神経新生活性試験
下記方法で神経幹／前駆細胞（ＮＳＣ／ＮＰＣｓ）を得た。
（１）妊娠１４〜１８日目のラットを購入し、頸椎脱臼後、胎仔を取り出す。
（２）クリーンベンチ内で脳を採取し、大脳皮質および海馬部分を選別して軟膜を取り除く。
（３）ＰＢＳ（−）上で細断した後、遠沈管に移し、２．５％トリプシン１ｍＬ、５％グルコースＰＢＳ（−）１ｍＬ、１％ ＤＮａｓｅＩ溶液１００μＬを加えて全量を１０ｍＬとし、３７℃のインキュベーター内で１０分間、時々撹拌しながらインキュベートする。
（４）Ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ５ｍＬを加えて低速遠心機で８００ｒｐｍ、３分間遠心して上清を捨てた後、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１０％ＦＢＳ、１％ＰＳ）を１０ｍＬ加え、細胞塊がなくなるまでピペッティングする。
（５）細胞懸濁液をＣｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒに通して細胞塊を取り除く、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ ＦＢＳ培地で培養する。
（６）培養２日後にＡｒａｃ １０μＭを添加し、増殖性の細胞を変性死させる。
（７）さらに２日後，Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔおよび２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２に換える。
（８）コンフルエントになった後トリプシン処理により細胞を剥がし、試験に用いる。

【0024】

４．ＮＳＣ／ＮＰＣｓであることの確認
ＮＳＣ／ＮＰＣｓとして使用するため、神経幹／前駆細胞マーカーであるｎｅｓｔｉｎが発現していることを確認した。
神経新生活性試験を実施する前に、上記で得た細胞について、１次抗体にＲａｔ ｎｅｓｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２次抗体にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ａｎｔｉ−ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、蛍光抗体法によって、ＮＳＣ／ＮＰＣｓが生成していることを確認する。

【0025】

５．神経新生試験
プレート播種およびＭＴＴアッセイにより活性を確認する。
ポリ−Ｌ−リジンコートした９６ｗｅｌｌプレートに、前記のＮＳＣ／ＮＰＣｓを２×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ播種した。１日後、成長因子（ｂＦＧＦ）を除いた培地に置き換え、試験サンプルを添加して３日間培養した。
被験物質添加培地からＭＴＴ培地に交換して３時間インキュベートした後、培地を除去し、ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを添加した。沈殿したホルマザンを溶解させた後、５７０ｎｍの吸光度を測定した。被験物質の溶媒のみを添加したウエルの吸光度を対照として、吸光度比の上昇した被験物質を神経新生活性を有する化合物と判定する。

【0026】

６．末粉抽出物からの分画の神経新生活性
前記の試験試料は、次に示す分画操作によって得られた各分画物を下記表１の濃度になるように各ウエルに添加した。

【0027】

【表1】

【0028】

神経新生活性測定結果を図１、図２に示す。各抽出物に神経新生活性は分散していたが、５％エタノールによる分画が最も活性が高かった。

【0029】

７．高速液体クロマトグラフィーによる活性物質の単離と活性測定
前記の分画で最も活性の高い５％エタノール分画物を用いて、ＯＤＳカラム（株式会社資生堂）を装着したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析装置により分離を行った。活性画分はＦｒ１〜６の６つのピークに分離できた。
クロマトグラムを図３に示す。
各フラクション（Ｆｒ１〜６）は凍結乾燥し、神経新生活性を測定した。神経新生活性測定に当たっては陽性対照として神経新生作用を有することが知られている線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を最終濃度２０μｇ／ｍＬになるように添加した。

【0030】

各フラクションの神経新生活性を図４に示す。各フラクションはいずれも神経新生活性を有していたが、フラクション２、３、６が高い活性を有していた。

【0031】

８．各フラクションの構造決定。
分離できたフラクション１〜６についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析装置のマススペクトルデータ及びＮＭＲによる解析を行い構造決定した。各フラクションの構造を図５に示す。
フラクション１はアデノシン、フラクション２はタキオシドという慣用名を持つ化合物であった。
フラクション１を除くすべての物質は、神経新生作用が知られていない化合物であった。

【0032】

以上の試験からコムギ末粉抽出物中に存在する神経新生作用を有する物質は、いずれも神経新生剤として利用可能であることが明らかとなった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】