特許 6155196 新規フコシルトランスフェラーゼおよびそれらの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6155196

(24)【登録日】2017年6月9日

(45)【発行日】2017年6月28日

(54)【発明の名称】新規フコシルトランスフェラーゼおよびそれらの用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170619BHJP

   C12P 19/12 20060101ALI20170619BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20170619BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12P19/12

   !C12N9/10

【請求項の数】6

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-549748(P2013-549748)

(86)(22)【出願日】2011年12月30日

(65)【公表番号】特表2014-504874(P2014-504874A)

(43)【公表日】2014年2月27日

(86)【国際出願番号】EP2011074291

(87)【国際公開番号】WO2012097950

(87)【国際公開日】20120726

【審査請求日】2014年1月27日

(31)【優先権主張番号】11151571.4

(32)【優先日】2011年1月20日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511149751

【氏名又は名称】イェネヴァイン ビオテヒノロギー ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100156845

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 威一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(72)【発明者】

【氏名】パルコット ユリア

(72)【発明者】

【氏名】ヒュフナー エリック

(72)【発明者】

【氏名】イェンネヴァイン シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】エリング ロター

(72)【発明者】

【氏名】エンゲルス レオニー

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 Mol. Cell. Probes，２００７年，Vol.21，pp.295-302

【文献】 Accession No. ABE98421, DEFINITION: glycosyltransferase [Escherichia coli], [online], 掲載日: 2007/6/15, 検索日: 2015/4/9, Database UniProt/GeneSeq, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/93115460?sat=11&satkey=9417779>

【文献】 J. Clin. Microbiol.，２００３年，Vol.41, No.7，pp.3379-3383

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
ａ）添付の配列表の配列番号１；
ｂ）ａ）で定義した核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
から成る群より選択される配列を含むポリヌクレオチドの、または
前記ポリヌクレオチドを含有するベクターの、または
ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；および
ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列であって、前記対立遺伝子変異体が、配列番号１で示される核酸分子の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされているものであるアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの、
２’−フコシルラクトースの生産のための使用。

【請求項2】

前記２’−フコシルラクトースの生産が、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの異種または同種発現によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

２’−フコシルラクトースを生産するための方法であって、
ａ）ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；および、ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列であって、前記対立遺伝子変異体が、配列番号１で示される核酸分子の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされているものであるアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する段階、
ｂ）段階ａのα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを、フコース残基を含むドナー基質とラクトースを含むアクセプター基質との混合物と、該ポリペプチドが、該ドナー基質からの該アクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する条件下で接触させ、それによって２’−フコシルラクトースを生産する段階
を含む方法。

【請求項4】

２’−フコシルラクトースを生産するための方法であって、
ａ）２’−フコシルラクトースの生産が可能かつα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が可能な適する栄養条件下で、宿主細胞を増殖させる段階であって、前記宿主細胞がポリヌクレオチドから成る配列を含有し、該ポリヌクレオチドから成る配列が、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしており、ｉ）添付の配列表の配列番号１、またはｉｉ）ｉ）で定義した核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列から成る群より選択される配列であって、該宿主細胞に対して異種の配列であり、該宿主細胞のゲノムに組み込まれている配列を含むものである、段階；
ｂ）段階ａと同時にまたは段階ａの後に、フコース残基を含むドナー基質と、ラクトースを含むアクセプター基質とを提供する段階であって、その結果、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドが、該ドナー基質から該アクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それによって２’−フコシルラクトースを生産する段階；および
ｃ）宿主細胞またはその増殖培地から、前記２’−フコシルラクトースを単離する段階
を含む方法。

【請求項5】

ドナー基質がＧＤＰ−フコースであることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

ＧＤＰ−フコースが、宿主細胞において同時に発現される酵素によって、または宿主細胞の代謝によって提供されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規フコシルトランスフェラーゼおよびその用途に関する。

【0002】

多くの（糖）タンパク質、（糖）脂質またはオリゴ糖は、特定の生物学的活性を呈示するために、特定のフコシル化構造の存在を必要とする。例えば、多くの細胞間認識機序は、フコシル化オリゴ糖を必要する。例えば、Ｌ−セレクチンなどの細胞接着分子が結合するためには、特定の細胞構造がフコシル化炭水化物を含まなければならない。生物学的機能を有するフコシル化構造についての別の例は、ＡＢＯ血液型系を形成する構造である。さらに、それらの薬物動態特性および安定性がそれらのグリカンによるものであることから、治療用（糖）タンパク質は、最も急成長している類の製薬用試薬の代表である。

【0003】

複合糖質の化学合成は、それらの複雑な性質および固有の化学的特性のため、大きな課題であり相当な困難が伴う。タンパク質および核酸については自動合成装置が市販されているが、複合糖質は言うまでもなく、グリカンは、一般の市販システムを使用して合成することが（まだ）できない。立体化学を制御するための要件に加えて、特異的結合の形成も今以て困難である。

【0004】

複合糖質の化学合成または酵素／化学併用合成に伴う複雑さに鑑みて、最近のアプローチは、グリコシルトランスフェラーゼを使用して、オリゴ糖残基を含む（糖）タンパク質および（糖）脂質を酵素的に合成してきた。

【0005】

グリコシルトランスフェラーゼの酵素ファミリーに属するフコシルトランスフェラーゼは、脊椎動物、無脊椎動物、植物および細菌において広く発現される。これらは、ドナー、一般にグアノシン二リン酸フコース（ＧＤＰ−フコース）から、オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を含むアクセプターへのフコース残基の転移を触媒する。このようにフコシル化されたアクセプター基質は、様々な生物学的および病理学的プロセスに関与する。

【0006】

フコース付加の部位に基づき、フコシルトランスフェラーゼは、α−１，２−、α−１，３／４−およびＯ−フコシルトランスフェラーゼに分類される。いくつかのα−１，２−フコシルトランスフェラーゼが、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）菌および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、哺乳動物、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）およびマンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）において、ならびに植物において同定されている。これらの酵素の大部分は、細菌系において活性形態で発現されることができないか、ラクトースをアクセプターとして使用することができない。

【0007】

哺乳動物では、ＧＤＰ−フコースは、細胞質においてデノボ合成およびサルベージ経路により合成される。デノボ合成で、ＧＤＰ−マンノースは２種類の酵素によりＧＤＰ−フコースに変換され、同時に遊離細胞質フコースがサルベージ経路により基質として利用される。細胞では、ＧＤＰ−フコースは、小胞内に濃縮され、フコシルトランスフェラーゼによりドナー基質として認識される。しかし、真核生物グリコシルトランスフェラーゼおよび特にフコシルトランスフェラーゼの原核生物発現系での異種機能性発現は難しいと分かっている。原核生物源からの哺乳動物オリゴ糖および特にヒトオリゴ糖、例えばＨＭＯは知られておらず、それ故、これらのオリゴ糖を作るグリコシルトランスフェラーゼを発見する可能性は極めて低くなる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

多くの商業的に重要なオリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質の生物学的活性は、特定のフコース残基の存在に依存するので、現在の技術水準では、所望のオリゴ糖残基を有する複合糖質を効率的に合成または生産することが必要とされる。

【0009】

それ故、本発明の目的は、大量の所望の基質を生じさせる、効率的かつ時間および費用を節約した形でフコシル化基質を生産することができるツールおよび方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明によると、この目的は、とりわけ、ポリヌクレオチドの提供により解決され、該ポリヌクレオチドは、例えば、単離されたポリヌクレオチド、組み換えポリヌクレオチドまたは合成ポリヌクレオチドであり得、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしており、以下ものから成る群より選択される配列を含む、または該配列から成る：
ａ）添付の配列表の配列番号１；
ｂ）配列番号１に相補的な核酸配列；
ｃ）ａ）およびｂ）で定義した核酸配列またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列。

【0011】

本発明によるポリヌクレオチド（配列番号１参照）は、大腸菌種血清群Ｏ１２６のフコシルトランスフェラーゼを表す。

【0012】

この新たに同定されたフコシルトランスフェラーゼには驚くべき効果がある。それらを使用することにより、それらの供給源生物において自然に発生しない反応を行うことができるからである。本発明の範囲内で、上記のように同定されたα−１，２−フコシルトランスフェラーゼはラクトースを基質として使用でき、フコシル化オリゴ糖、特に２’−フコシルラクトースを生産できることが判明した。今日までに、細菌から単離された既知α−１，２−フコシルトランスフェラーゼで、フコシルラクトースの生産に天然基質としてラクトースを使用することが証明されているものはない。したがって、フコシル化オリゴ糖の生産のための使用へのこの新たに同定されたフコシルトランスフェラーゼの適性は非常に驚くべきものであり、したがってその使用は、例えば、フコシルラクトースなどの人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を、簡単に、効率的に、かつ費用を節約して生産するための優れたツールとなる。今日、ＨＭＯに属する８０を超える化合物が構造解析されており、これらは、プレバイオティクスとして機能する類の複合オリゴ糖の代表である。さらに、上皮細胞エピトープとのＨＭＯの構造的相同性により、病原菌に対する防御性が説明される。乳児消化管内のＨＭＯは、選択された菌株の増殖を選択的に助長するので、母乳栄養児の場合、特有の腸内微生物叢の発達を誘発する。

【0013】

これまで、これらのオリゴ糖の構造の複雑さによりそれらの合成生産が阻まれてきたため、ＨＭＯの主要供給源は今以て人乳である。それ故、容易かつ簡単に得ることができるＨＭＯが必要とされており、該ＨＭＯを本明細書に提示する驚くほど好適なフコシルトランスフェラーゼの使用により提供することができる。

【0014】

本発明によると、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡである場合もあり、修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡである場合もある。「ポリヌクレオチド」には、限定ではないが、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ；１本鎖領域と２本鎖領域との混合物または１本鎖領域と２本鎖領域と３本鎖領域との混合物であるＤＮＡ；１本鎖および２本鎖ＲＮＡ；ならびに１本鎖領域と２本鎖領域との混合物であるＲＮＡ；１本鎖または、より典型的には２本鎖もしくは３本鎖領域であり得るまたは１本鎖領域と２本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、本明細書において用いる場合、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡ両方を含む３本鎖領域を指す。かかる領域内の鎖は、同じ分子からのものであることもあり、異なる分子からのものであることもある。上記領域は、１つ以上の分子の全てを含むこともあるが、より一般的にはいくつかの分子の１領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、多くの場合、オリゴヌクレオチドである。本明細書において用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、１つ以上の修飾塩基を含有する、上記したようなＤＮＡまたはＲＮＡも含む。したがって、安定性のためにまたは他の理由で修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書においてこの用語が意図されるところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、この用語を本明細書において用いる場合、２つだけ例を挙げると、通常のものでない塩基、例えばイノシン、または修飾された塩基、例えばトリチル化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、ポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡに、非常に多岐にわたる修飾が施されていることが理解されよう。用語「ポリヌクレオチド」は、それを本明細書において用いる場合、かかる化学的に、酵素的にまたは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞（例えば、単純および複雑型細胞を含む）に特有の化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドと多くの場合呼ばれる短鎖ポリヌクレオチドも包含する。

【0015】

「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結された２以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般にタンパク質と呼ばれるより長鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有することもある。「ポリペプチド」は、天然プロセス、例えば、プロセシングおよび他の翻訳後修飾によって修飾されたものを含むが、化学的修飾技術によって修飾されたものも含む。かかる修飾は、基礎的教科書や、より詳細な研究書や、大量の研究文献に十分に記載されており、当業者に周知である。同じタイプの修飾が、１つの所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同程度にまたは様々な程度に存在することがあることが理解されよう。また、１つの所与のポリペプチドが、多くのタイプの修飾を含有することもある。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのあらゆる位置で生じ得る。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在付加、例えばアルギニン化およびユビキチン化が挙げられる。ポリペプチドは、分岐ポリペプチドであることもあり、分岐を伴うもしくは伴わない環状ポリペプチドであることもある。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスの結果として生ずることもあり、完全に合成法によっても作られることもある。

【0016】

「単離（された）」とは、その天然の状態から「人間の手によって」改変されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、それが変化させられた、もしくはその元の環境から取り出された、または両方であることを意味する。例えば、この用語を本明細書において用いる場合、生体内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。同様に、「合成」配列は、この用語を本明細書において用いる場合、合成により生成され配列であって、天然源から直接単離されたものでない任意の配列を意味する。「組み換え」とは、ある種からの遺伝子を異なる種の宿主生物の細胞に移植またはスプライシングすることにより調製された遺伝子操作ＤＮＡを意味する。かかるＤＮＡは、宿主の遺伝子構造の一部となり、複製される。

【0017】

用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本明細書において用いる場合、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチド、特にα−１，２−フコシルトランスフェラーゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語は、コーディングおよび／または非コーディング配列を含有することもある追加の領域と共に、上記ポリペプチドをコードする単一連続領域または複数の非連続領域（例えば、組み込まれているファージまたは挿入配列またはエディティングが介在している）を含むポリヌクレオチドも包含する。

【0018】

「変異体」は、この用語を本明細書において用いる場合、本質的な特性を保持するが、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。あるポリヌクレオチドの典型的変異体と別の参照ポリヌクレオチドとは、ヌクレオチド配列の点で異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化により、参照ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列が改変されることもあり、されないこともある。ヌクレオチド変化は、以下で論ずるように、参照配列によりコードされたポリペプチドのアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーションを生じさせる結果となり得る。あるポリペプチドの典型的変異体と別の参照ポリペプチドとは、アミノ酸配列点で異なる。一般に、参照ポリペプチドの配列と変異体の配列が全体的に近似しており、多くの領域内で同一であるように、相違が限定される。変異体および参照ポリペプチドは、任意の組み合わせでの１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされていることもあり、されていないこともある。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に存在する変異体であることもあり、天然に存在することが知られていない変異体であることもある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術によって、直接的合成によって、および当業者に既知の他の組み換え法によって作ることができる。

【0019】

用語「α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ」、または「フコシルトランスフェラーゼ」、または「α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ」もしくは「フコシルトランスフェラーゼ」をコードする核酸／ポリヌクレオチドは、α−１，２−連結におけるドナー基質、例えばＧＤＰ−フコースからのアクセプター分子へのフコースの転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。上記アクセプター分子は、炭水化物、オリゴ糖、タンパク質もしくは糖タンパク質、または脂質もしくは糖脂質であり得、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース、ラクトースまたはこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明の範囲内では、配列番号１からの核酸または配列番号２からのアミノ酸配列によってコードされたポリペプチドと、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００または１０００アミノ酸以上の領域にわたり、約６０％より高いアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、核酸／ポリヌクレオチドおよびポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログも、これらの用語に含まれる。

【0020】

さらに、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドをペプチド配列の付加または欠失によって改変して、その活性を修飾することができる。例えば、ポリペプチド配列をα−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドに融合させて、さらなる酵素活性を生じさせることができる。あるいは、アミノ酸を欠失させて、タンパク質の活性を除去または修飾することができる。α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ酵素活性は無いが、その構造の三次元構造をなお保持するように、タンパク質を修飾することができる。かかる修飾は、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドに対する抗体の産生に有用であるものと思われる。

【0021】

加えて、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物は、機能的に等価の遺伝子産物に相当するタンパク質またはポリペプチドを含み得る。かかる等価のα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物は、上記したようなα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列によってコードされたアミノ酸配列内にアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有することがあるが、これは、結果としてサイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）となり、それ故、機能的に等価のα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物が生産される。アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ、平面型中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ、正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられ、負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本発明に関連して本明細書において用いる場合の「機能的に等価の」は、酵素活性ばかりでなく、抗原性、すなわち抗α−１，２−フコシルトランスフェラーゼに結合する能力、免疫原性、すなわちα−１，２−フコシルトランスフェラーゼタンパク質またはポリペプチドを結合することができる抗体を産生する能力も含む（しかしこれに限定されない）多数の基準のいずれかによって判断して、上記したα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列によってコードされた内因性α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物と実質的に同様のｉｎ ｖｉｖｏ活性を呈示することができるポリペプチドを指す。

【0022】

翻訳中または翻訳後に別様に修飾されるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼタンパク質、ポリペプチドおよび誘導体（断片を含む）は、本発明の範囲内に含まれる。さらに、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体をα−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチド配列への置換または付加として導入することができる。

【0023】

当該技術分野において周知の技術を用いて組み換えＤＮＡ技術によりα−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドを生産することができる。当業者に周知である方法を用いて、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼコーディング配列と適切な転写翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている技術を参照のこと。

【0024】

「オリゴ糖」は、この用語を本明細書において用いる場合、およびこの用語が現在の技術水準で一般に理解されているように、少数、一般には３から１０個の単純な糖、すなわち単糖を含有する糖ポリマーを指す。

【0025】

本発明の別の態様に従うと、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記したような核酸配列を含有するベクターが提供され、この場合、該核酸配列は、該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている。特に好ましい実施形態において、上記ベクターは発現ベクターであり、本発明の別の態様によると、上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、リポソームまたはウイルスの形態で存在し得る。

【0026】

また、本発明は、本発明による上記したようなポリヌクレオチドから成る配列を含有する宿主細胞に関し、この場合、該配列は、該宿主細胞にとって外来の配列であり、該配列は、該宿主細胞のゲノムに組み込まれている。それに関して、「宿主細胞にとって外来の」は、その配列が該宿主細胞中に天然に存在しない、すなわち、その配列が該宿主細胞に対して異種であることを意味する。異種配列は、例えば、トランスフェクション、形質転換または形質導入によって、宿主細胞のゲノムに安定的に導入することができ、適用され得る技術は、その配列を導入することとなる宿主に依存する。様々な技術が当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上掲に開示されている。したがって、異種配列が導入された宿主細胞は、本発明によるポリヌクレオチドがコードされた異種タンパク質を生産することとなる。

【0027】

組み換え産生の場合、宿主細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはその一部分または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上掲に記載されている方法によって果たすことができる。

【0028】

したがって、例えば、宿主細胞に安定的に形質転換／トランスフェクトすることができるベクターに、本発明によるポリヌクレオチドを含めることができる。ベクター内では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば誘導性プロモーターの制御下にあるので、遺伝子／ポリヌクレオチドの発現を特異的に標的にすることができ、必要に応じて、このようにして遺伝子を過発現させることができる。

【0029】

本発明のポリペプチドを生産するために、多種多様な発現系を使用することができる。かかるベクターとしては、数ある中でも、染色体由来、エピソーム由来およびウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、トランスポゾンに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、挿入エレメントに由来するベクター、酵母染色体エレメントに由来するベクター、ウイルスに由来するベクター、およびこれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、例えばコスミドおよびファージミドに由来するものが挙げられる。上記発現系構築物は、発現を生じさせるばかりでなく調節もする制御領域を含有し得る。一般に、この点から、ポリヌクレオチドの維持、伝播もしくは発現に適する、および／または宿主におけるポリペプチドの発現に適する任意の系またはベクターを発現に使用することができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記参照）に示されているものなどの、様々な周知の常例的な技術のいずれかによって、適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入することができる。

【0030】

したがって、本発明は、次のものから成る群より選択されるアミノ酸配列から成る、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する単離されたポリペプチドにも関する：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列であって、上記対立遺伝子変異体が、配列番号１で示される核酸分子の反対の鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされているものであるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のオルソログのアミノ酸配列であって、上記オルソログが、配列番号１で示される核酸分子の反対の鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされているものであるアミノ酸配列；および
（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する断片。

【0031】

用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、状況によって異なる。長い配列ほど、高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）より約１５℃低くなるように選択される。上記Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡時に標的配列にハイブリダイズする（既定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。例示的ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、次のとおりであり得る：６５℃でインキュベートしながら、５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでの洗浄。

【0032】

また、本発明は、上で定義したとおりのベクターを含有する宿主細胞、または該宿主細胞のゲノムに導入された異種配列として本発明によるポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、ならびに特に、真菌（酵母を含む）、細菌、昆虫、動物および植物細胞から成る群より選択される宿主細胞に言及する。宿主が大腸菌細胞であれば、特に好ましい。

【0033】

本明細書において用いる場合、用語「宿主細胞」を、外因性ポリヌクレオチド配列によって形質転換もしくはトランスフェクトされた、または形質転換もしくはトランスフェクトされ得る細胞と今般定義する。

【0034】

本発明のα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子コーディング配列を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を利用することができる。かかる宿主発現系は、対象となるコーディング配列を生産し、その後、精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換またはトランスフェクトされたときにｉｎ ｓｉｔｕで本発明のα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子産物を提示する細胞も表す。

【0035】

例えば、ヘリコバクター・ピロリからのα−１，２−フコシルトランスフェラーゼを扱っているＷＯ／００２６３８３および欧州特許第１２４３６４７号（これらの公報は、本明細書で明確に参照される）の中で多数の適する発現系および宿主を見つけることができる。

【0036】

本発明の別の態様によると、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする上記核酸は、それぞれの細胞のコドン使用頻度に適合している。

【0037】

本発明は、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生産のための、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターまたはポリペプチドそれぞれの使用にさらに関する。

【0038】

それに関して、上記使用の態様によると、上記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生産を、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼをコードする上記ポリヌクレオチドの異種または同種発現によって行う。

【0039】

上記使用の別の態様によると、上記フコシル化オリゴ糖は、人乳から既知のオリゴ糖、例えば２’−フコシルラクトースである。

【0040】

本発明は、以下の段階を含む、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質の生産方法にも関する：
ａ．本発明によるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する段階、
ｂ．段階ａのα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを、フコース残基を含むドナー基質、および単糖、オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質と、該ポリペプチドが、該ドナー基質から該アクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する条件下で接触させ、それによってフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生産する段階。

【0041】

本発明によると、上記フコシル化オリゴ糖生産方法を、無細胞系で行うことができ、または細胞を含有する系において行うことができる。酵素反応生成物の形成を可能にするのに十分な時間にわたって、十分な条件下で、上記基質をα−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドと反応させる。上記系が無細胞系であろうと、細胞に基づく系であろうと、これらの条件が、上記基質および酵素の量および純度に依存して変わることとなることが理解されよう。これらの変数は、当業者によって容易に調整されよう。

【0042】

無細胞系に関しては、本発明によるポリペプチドと、アクセプター基質と、ドナー基質と、場合により他の反応混合物成分（他のグリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素を含む）とを水性反応媒体中で混合により併せる。上記酵素を溶液中で遊離状態で利用することができ、またはポリマーなどの支持体に結合させるもしくは固定化することができ、上記基質を上記支持体に付加させてもよい。上記支持体を、例えば、カラムに充填してもよい。

【0043】

フコシル化オリゴ糖の合成のための細胞含有系としては、組み換え修飾宿主細胞を挙げることができる。

【0044】

したがって、本発明は、以下の段階を含む、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質の生産方法にも関する：
ａ．フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生産が可能かつα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現が可能な適する栄養条件下で、上記したような宿主細胞を増殖させる段階；
ｂ．段階ａと同時にまたは段階ａの後に、フコース残基を含むドナー基質と、オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質とを提供する段階であって、その結果、上記宿主細胞において発現されたα−１，２−フコシルトランスフェラーゼが、該ドナー基質から該アクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それによってフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生産する段階；および
ｃ．上記宿主細胞またはその増殖培地から、上記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質を単離する段階。

【0045】

本発明による上記方法において、上記ドナー基質はＧＤＰ−フコースであり得る。上記ドナー基質がＧＤＰ−フコースであれば、特に好ましい。

【0046】

本発明の１つの態様によると、上記アクセプター基質は、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース、ラクトースまたはそれらの任意の組み合わせから選択される。特に、ラクトースがアクセプター基質として好ましい。

【0047】

用語「基質」は、本明細書において用いる場合、本発明のポリペプチドによる作用を受けてフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生じさせることができる、任意の材料または異なる材料の組み合わせを意味する。

【0048】

上記基質と上記α−１，２−フコシルトランスフェラーゼポリペプチドとを、酵素反応生成物の形成を可能にするのに十分な時間にわたって、十分な条件下で反応させる。これらの条件は、上記系が無細胞系であろうと、細胞に基づく系であろうと、基質および酵素の量および純度に依存して変わることとなる。これらの変数は、当業者によって容易に調整される。

【0049】

本発明による方法の１つの態様によると、上記ドナー基質は、それを宿主細胞内で生産させることにより段階ｂにおいて得られる。そうすると、例えば上記宿主細胞に添加することとなるフコースをＧＤＰ−フコースに変換する酵素が、上記宿主細胞において同時に発現される。この酵素は、例えば、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）からのＦｋｐのような二機能性フコースキナーゼ／フコース−１−リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、またはホモサピエンス、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）およびドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）をはじめとするいくつかの種から既知であるような、１つの個別のフコースキナーゼと１つの個別のフコース−１−リン酸グアニリルトランスフェラーゼとの組み合わせであり得る。

【0050】

あるいは、段階ｂにおいて、上記ドナー基質を上記培地／宿主細胞に添加してもよく、または上記ドナー基質が上記細胞自体の代謝によって生産されることもある。

【0051】

またさらなる実施形態において、本発明は、以下の段階を含む方法に関する：
ａ）ｉ）添付の配列表からの配列番号１、ｉｉ）配列番号１に相補的な核酸配列、ならびにｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）で定義した核酸配列またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列から選択される核酸配列を含むように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を適する栄養条件下で増殖させる段階であって、その結果、ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）から選択される上記核酸配列が、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するペプチドとして発現されることとなる段階；
ｂ）段階ａと同時にまたは段階ａの後に、フコース残基を含むドナー基質と、オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を含むアクセプター基質とを提供する段階であって、その結果、上記宿主細胞において発現されたα−１，２−フコシルトランスフェラーゼが、該ドナー基質から該アクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒し、それによってフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質または（糖）脂質を生産する段階；および
ｃ）上記宿主細胞またはその増殖培地から上記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質を単離する段階。

【0052】

本発明による上記方法において、宿主細胞で発現されるペプチドは、α−１，２−フコシルトランスフェラーゼ活性を提示し、したがって、ドナー、例えばグアノシン−二リン酸フコース（ＧＤＰ−フコース）から、オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を含むアクセプターへ、フコース残基を転移させる。このようにして、このようにフコシル化されたアクセプター基質を、ベビーフードの栄養補助のための食品添加物として、または治療活性化合物もしくは医薬活性化合物のいずれかとして使用することができる。この新規の方法を用いると、複雑で時間および費用がかかる合成プロセスの必要なく、フコシル化産物を容易かつ有効に得ることができる。

【0053】

本明細書において用いる場合、用語「単離する」は、本発明によるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼによって生産された産物を遺伝子発現系から採取、回収または分離することを意味する。

【0054】

したがって、本発明はまた、本発明による方法によって得られるフコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質に関することはもちろん、フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生産のための、ポリヌクレオチド、上記したようなベクターまたはポリペプチドの使用にも関する。

【0055】

さらに別の実施形態によると、上記フコシル化オリゴ糖、（糖）タンパク質および／または（糖）脂質の生産を、上記α−１，２−フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドの異種または同種（過）発現によって行う。

【0056】

別の定義が無い限り、本明細書において用いるすべての技術および科学用語は、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書において用いる命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学に関する実験手順、ならびに上記および下記のハイブリダイゼーションは、当該技術分野において周知の一般に用いられているものである。核酸およびペプチド合成には標準的技術を用いる。一般に、酵素反応および精製段階は、それらの製造者の仕様書に従って行われる。

【0057】

本発明は、本明細書に開示されているポリヌクレオチド配列の断片も包含する。

【0058】

さらなる利点は、本実施形態の説明および添付の図面から分かる。

【0059】

本発明の範囲を逸脱することなく、上述の特徴および以下でさらに説明する特徴を、それぞれ明記する組み合わせばりでなく他の組み合わせでも、または独自にでも用いることができることは、言うまでもない。

【0060】

本発明のいくつかの実施形態を図で示し、後続の記述でさらに詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0061】

図１Ａは、大腸菌Ｏ１２６からのα−１，２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬをコードする遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

【0062】

図１Ｂは、ｐＥＴ２２ｂＨＩＳ６ＰｒｏｐｗｂｇＬ、すなわち、Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇをコードする１８ｂｐおよびスタフィロコッカス・ヒイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）リパーゼのプロペプチドからの６２１ｂｐが予めＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ（下の説明を参照のこと）によって付加されたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ国ダルムシュタット）に（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにより）にクローニングされた新規α−１，２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬをコードする大腸菌Ｏ１２６からのコドン最適化遺伝子ｗｂｇＬのベクターマップを示す。

【0063】

図１Ｃは、ｐＡＣＹＣ−ｗｂｇＬ、すなわち、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ）によりクローニングされた新規α−１，２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬをコードする大腸菌Ｏ１２６からのコドン最適化遺伝子ｗｂｇＬのベクターマップを示す。

【0064】

図２は、ＩＭＡＣ Ｎｉ²⁺−ＮＴＡセファロースカラムによるＷｂｇＬ精製のクロマトグラムを示す（青色：２８０ｎｍでの吸収、赤色：電気伝導度；カラムから溶出するＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬを含有する画分をＩＭＡＣプールと呼ぶ）。

【0065】

図３は、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＥＴ２２ｂＨＩＳ６ＰｒｏｐｗｂｇＬの粗抽出物および不溶性画分における、ならびにＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの精製および精製Ｈｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの洗浄画分におけるＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【0066】

図４は、ＤＡＢ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国マンハイム）とのインキュベーション後の、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたモノクローナル抗Ｈｉｓ₆抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国マンハイム）を使用する免疫ブロットでのＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの検出を示す。

【0067】

図５は、ＮＡＤＨの酸化に起因する３４０ｎｍでの吸収の減少によって活性を検出することができる、０．４ｍＭ ＧＤＰ− −Ｌ−フコースおよび５ｍＭラクトースを用いる精製Ｈｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの連続分光アッセイを示す。

【0068】

図６は、２’フコシルラクトースが存在しない反応開始時のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによるＷｂｇＬ反応からの２’−フコシルラクトース生産（Ａ）；ならびに２ｍＭ ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースおよび５ｍＭラクトースとの１時間のＷｂｇＬ反応後に生産された２’−フコシルラクトース（Ｂ）の検出を示す。

【0069】

図７は、２ｍＭ ＧＤＰ−フコースおよび５ｍＭラクトースおよびＷｂｇＬで開始した反応混合物についての、ＧＤＰ− −Ｌ−フコースしか検出することができない反応開始時（Ａ）、およびＷｂｇＬの活性によって放出されたＧＤＰの分解生成物としてのグアノシンしか検出することができない１６時間の反応後（Ｂ）の、キャピラリー電気泳動法による分析を示す。

【0070】

図８は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の異なるｐＨ値（ｐＨ６．８から８．４）でのＷｂｇＬの相対活性を示す。

【0071】

図９は、２ｍＭ ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースおよび５ｍＭラクトースで開始したＷｂｇＬ反応において１６時間の反応過程の異なる時点で測定された２’−フコシルラクトース濃度の増加を示す。

【0072】

図１０は、ＨＰＬＣクロマトグラム；溶離剤として水を用いるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒｅｚｅｘ ＲＣＭ Ｃａ２＋カラムによる分離（３０分間、８０℃で０．６ｍＬ／分）、および屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ国）による検出（Ａ）；ならびにＨＰＬＣクロマトグラム；溶離剤としてアセトニトリル／水（６８：３２）を用いるＲｅｐｒｏｓｉｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅカラム、５μｍ、２５０×４．６ｍｍによる分離（２０分間、３５℃で１．４ｍＬ／分；屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ国）により検出）（Ｂ）を示す。

【0073】

図１１は、ＷｂｇＬによって生産された２’−フコシルラクトースのＮＭＲスペクトルを示す。

【実施例】

【0074】

（実施例）

【0075】

遺伝子のクローニング

【0076】

推定α−１，２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬの細胞質発現用に、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ国ダルムシュタット）を修飾した。そのために、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを使用して、大腸菌における周辺質発現をもたらすｐｅｌＢリーダー配列を切り離した。プライマー５’−ＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡ−ＣＣＡＣＡＡＴＧＡＴＴＣＧＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＡＣ−３’（配列番号５）および３’−ＧＧＡＴＣＣＧＴ−ＡＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＴＣＧＣＴＴＧ−５’（配列番号６）を使用して、プラスミドｐＬＧａｌＴ ３８からＳ．ヒイカス（Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ）のリパーゼのプロペプチド遺伝子配列（配列番号３）（Ｓａｕｅｒｚａｐｆｅ，Ｂ．、Ｄ．Ｊ．Ｎａｍｄｊｏｕら（２００８）：「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−１，４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｐｒｅ−ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ５０（２−４）：１２８−１４０）を増幅し、上記修飾ｐＥＴ２２ｂベクターに融合し、その結果、ベクターｐＥＴ２２ｂＨＩＳ６Ｐｒｏｐを得た。得られたベクターをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化した。制限部位ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを含む、大腸菌Ｏ１２６からの推定α−１，２−フコシルトランスフェラーゼＷｂｇＬをコードする遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ（ドイツ国レーゲンスブルク）によって合成された。ベクターｐＥＴ２２ｂＨＩＳ６Ｐｒｏｐへのライゲーションによって発現ベクターｐＥＴＨＩＳ６ＰｒｏｐｗｂｇＬ（図１参照）を得た。この発現ベクターは、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共に誘導すると、大腸菌の細胞質においてＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬ（５１３アミノ酸）を生成させる。あるいは、プライマー５’−ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号７）および５’−ＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号８）を使用して増幅した後、遺伝子ｗｂｇＬをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩによってベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ国ダルムシュタット）にクローニングして、ベクターｐＡＣＹＣ−ｗｂｇＬを生じさせた（図１Ｂ参照）。プラスミド大腸菌Ｎｏｖａ Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ国ダルムシュタット）または大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ国ダルムシュタット）の増殖のために、およびＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの発現のために、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、米国マディソン）を使用した。

【0077】

培養およびフコシルトランスフェラーゼの発現

【0078】

１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する２０ｍＬ ＬＢ培地が入っている１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコの中で形質転換体を増殖させ、一晩、３７℃および１３０ｒｐｍでインキュベートした。タンパク質生産のために、１０００ｍＬのＴＢ培地が入っている５Ｌエルレンマイヤーフラスコの中で細胞を３７℃および８０ｒｐｍで増殖させた。その培養物にＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭ（ＯＤ₆₀₀＝０．６〜０．８）まで添加することによって、ｌａｃＺプロモーターの誘導を行った。インキュベーションを２０時間、２５℃で継続し、最後に遠心分離によって細胞を採取した。

【0079】

酵素精製

【0080】

５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．６中の大腸菌細胞の４０％（ｗ／ｗ）細胞懸濁液を超音波処理（４×１５秒）によって破壊した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分）後、それらのペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる封入体の生産についての分析のために保存した。１００ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６と予め平衡させておいたＮｉ⁺²−ＮＴＡセファロース（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、ドイツ国ハイデン）（緩衝液Ａ）を使用して、その粗抽出物（１５ｍＬ）をＩＭＡＣカラム（０．８ｃｍ²×１０ｃｍ、１．５ｍＬ／分）に負荷した。０．３Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液Ｂでの洗浄段階の後、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび３００ｍＭイミダゾール）中３００ｍＭの濃度のイミダゾールによってタンパク質を溶離した。すべての画分をタンパク質濃度について分析し、酵素活性についてアッセイした。緩衝液Ｃでの溶離からの活性可溶性ＷｂｇＬを含有するすべての画分をプールし、得られた溶液をＩＭＡＣプールと呼んだ（図２参照）。

【0081】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタンブロットによる検出

【0082】

Ｈｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってモニターした。そのために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、英国ペーズリー）のゲルキャスティング法説明書に従ってキャストした１０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。タンパク質試料（４０μｇ）を上記ゲルの各スロットに負荷した。Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（登録商標）、リトアニア国ヴィリニュス）を分子量の測定に使用した。上記タンパク質ゲルをクマシーブルーで染色した（図３参照）。

【0083】

特定の抗Ｈｉｓ₆抗体を使用して免疫ブロットを行って、Ｈｉｓ₆ＰｒｏｐＷｂｇＬを検出した。そのために、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）の細胞破壊片、粗抽出物、およびＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬのＩＭＡＣ画分の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＮｕＰＡＧＥ Ｗｅｓｔｅｒｎ転写プロトコル（ＢｉｏＲａｄ、ドイツ国ミュンヘン）によってＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中の３％ＢＳＡでブロックした。特異的結合については、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたモノクローナル抗Ｈｉｓ₆抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国マンハイム）を使用した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ緩衝液での洗浄段階の後、ブロットをＤＡＢ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ国マンハイム）と共にインキュベートし、溶液の除去および蒸留水の添加によってＨＲＰ反応を停止させた（図４参照）。

【0084】

活性アッセイ

【0085】

粗抽出物およびＩＭＡＣ画分中のＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの酵素活性を、２’フコシルラクトースの分光アッセイおよびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によって測定した。

【0086】

放出されたＧＤＰの検出のためにピルビン酸キナーゼ／乳酸デヒドロゲナーゼ系を使用して分光アッセイを行った（Ｂａｒｒａｔｔ，Ｄ．Ｈ．、Ｌ．Ｂａｒｂｅｒら（２００１）、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ，ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｐｅａ」、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２７（２）：６５５−６６４）。マイクロタイタープレートアッセイのための反応混合物は、合計量２５０μＬで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、２ｍＭ ＧＤＰ−β−Ｌ−フコース、５ｍＭラクトース、１ｍＭホスホエノールピルビン酸塩、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ｍＭ ＮＡＤＨ、２ｍＭ ＭｎＣｌ₂、５Ｕピルビン酸キナーゼ、および５Ｕ乳酸デヒドロゲナーゼを含有した。１００μＬ酵素溶液の添加によって反応を開始させ、続いて３０℃で、３４０ｎｍで行った。副次的活性の検出のための対照実験をアクセプター基質ラクトースなしで行った（図５参照）。

【0087】

２’−フコシルラクトースの検出のためにＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によって酵素活性も測定した。このアッセイ溶液は、合計量１７５μＬで２ｍＭ ＧＤＰ− −Ｌ−フコースと、５ｍＭラクトースと、２ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６と、１ｍＭ ＤＴＴと、１Ｕアルカリホスファターゼとを含有し、この溶液を、１７５μＬの粗抽出物および精製酵素溶液の添加後、３０℃でインキュベートした。転化速度が線形である様々な時点で５分間の９５℃での加熱により反応を停止させた。遠心分離した試料を、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）６．４０ソフトウェアを使用してＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムでのＤｉｏｎｅｘ ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州サニーヴェール）により分析した。５０ｍＭ ＮａＯＨを用いて３０℃で溶離を行った（流量１ｍＬ／分、注入量５０μＬ）。生成された三糖２’−フコシルラクトースの濃度を市販の２’−フコシルラクトースでの標準較正曲線によって判定し、後の酵素活性計算に使用した（図６参照）。

【0088】

ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤアッセイおよび分光アッセイ両方について、１ＵのＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬは、標準アッセイ条件下で毎分１μｍｏｌの生成物（ＧＤＰまたは２’−フコシルラクトース）を生成する酵素の量である。

【0089】

ＧＤＰ−β−フコースおよびその消費を、ＵＶ検出器を装備したＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（ドイツ国クレーフェルド）からのＰ／ＡＣＥ ＭＤＱ装置でのキャピラリー電気泳動によって分析した。活性化ドナー基質ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースの判定のための試料を５分間の加熱（９５℃）によって停止させ、１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離した（Ｒｏｔｉｎａ ３５Ｒ、Ｈｅｔｔｉｃｈ、ドイツ国トゥットリンゲン）。５０ｍＭ Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇×１０Ｈ₂Ｏ／６４ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．９を用いて、未処理石英ガラスキャピラリー（Ｉ．Ｄ．７５ｍｍ、全キャピラリー長５７ｃｍ、検出器まで５０ｃｍ）で検出を遂行した。泳動および検出の条件は、それぞれ、２５．８℃で２５ｋＶ（２３ｍＡ）、および２５４ｎｍでのＵＶ検出であった。試料を加圧（順方向に０．５ｐｓｉで５．０秒）により注入した（図７参照）。ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースおよび生成されたグアノシンの同一性を市販の基質によって確認した。

【0090】

ｐＨ最適値および金属イオン依存性

【0091】

組み換えＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの活性にとって最適なｐＨ値を検討するために、ｐＨ６．８から８．４にわたる５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の様々なｐＨ値でアッセイを行った。最適ｐＨ値は、７．６であった（図８参照）。標準アッセイに金属イオンＭｎ²⁺を加えることにより、金属イオン依存性を調査することができた。すべての試料を、上記したようにＨＡＰＡＥＣ−ＰＡＤで分析した。上記酵素は、Ｍｎ²⁺イオンに依存しないことが明らかになった。

【0092】

速度分析

【0093】

アクセプター基質ラクトースおよびドナー基質ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースについてのＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの速度定数を、上記した分光アッセイを用いる様々な基質濃度での初期速度分析から導出した。ＧＤＰ−β−フコースを一定濃度の１０ｍＭラクトースで０．０２ｍＭから４ｍＭまで変動させ、ラクトースを一定濃度の２ｍＭ ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースで０．０５から４０ｍＭまで変化させた。すべてのデータを、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ １０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＧｍｂＨ、ドイツ国エルクラート）を使用してミカエリス・メンテン式による非線形回帰分析によって測定した。

【0094】

【表1】

【0095】

アクセプター基質スペクトル研究

【0096】

組み換えＨｉｓ₆−プロペプチド−ＷｂｇＬの基質スペクトルを、上記した活性アッセイに従ってＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。５ｍＭラクトースの代わりに、様々なアクセプター基質を試験して、ラクトースと比較して相対活性を測定した。

【0097】

【表2】

【0098】

フコシル化化合物の生産

【0099】

適切なフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有するｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１で細胞大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｌａｃＺ ｐＤＥＳＴ１４−ｆｋｐ ｐＣＯＬＡ−ｌａｃＹ−ｆｕｃＰを形質転換した。適切な抗生物質を用いて２ＹＴプレート上でコロニーを増殖させた。５ｍＬ一夜培養物（抗生物質を伴う２ＹＴ）を株ごとにを増殖させ、この培養物から１５ｍＬ無機培地に、それぞれを１％まで接種した。炭素源としてグリセロールを使用して細胞を増殖させ、ＯＤ６００＝０．５で０．１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導し、４０ｍＭラクトースおよび３０ｍＭフコースを添加した。培養物を３０℃および１２０ｒｐｍでインキュベートした。２’−フコシルラクトースの生産をＨＰＬＣ分析によってモニターした。大腸菌Ｏ１２６からのＷｂｇＬの発現と比較した、ヘリコバクター・ピロリからのＦｕｃＴ２の発現によって生産された２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）の量の比較を次の表３に示す。

【0100】

【表3】

【0101】

表３から分かるように、フコシル化産物２’−フコシルラクトースの量は、本発明によるα−１，２−フコシルトランスフェラーゼ、すなわち大腸菌Ｏ１２６からのＷｂｇＬを使用すると、現在の技術水準であるヘリコバクター・ピロリからのα−１，２−フコシルトランスフェラーゼＦｕｃＴ２と比較して有意に高かった。

【0102】

フコシル化産物の精製

【0103】

上記したように生産した２’−フコシルラクトースを数段階で精製した。第一段階は、活性炭への吸着による精製であった。生産段階からの培養上清を活性炭床に適用した。フロースルーを回収し、分析したが、残存２’−フコシルラクトースは検出されなかった。非特異的結合培地化合物、例えば、塩およびアミノ酸などの除去のために、その床を蒸留水で洗浄した（フロースルー中に２’−ＦＬなし）。次いで２’−ＦＬならびに残存ラクトースおよびフコースを９６％エタノールで溶離した。その後、ロータリーエバポレーターでエタノールを蒸発させ、残留物を１０ｋＤａクロスフロー型モジュール（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ Ｎａｄｉｒ、ドイツ国）によって濾過した。残存塩を電気透析によって除去し、その後、内毒素を、クロスフロー型モジュール（Ｐａｌｌ、ドイツ国）を使用する濾過により除去した。次に、フリット入りの５２０ｍｍ×４２８ｍｍガラスカラムに充填されたゲル透過クロマトグラフィー材料Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ−２（ＢｉｏＲａｄ、ドイツ国）を使用して、２’−ＦＬをラクトースおよびフコースからグラムスケールで分離した。薄層クロマトグラフィーによって２’−ＦＬの精製をモニターした。２’−フコシルラクトースのみを含有する画分をプールし、凍結乾燥させた。

【0104】

産物の同一性の確認

【0105】

本発明において提供するフコシルトランスフェラーゼを使用して生産した精製２’−フコシルラクトースを１Ｈ−ＮＭＲによって分析した（図１１参照）。得られたスペクトルは、２’−ＦＬ標準物質（Ｄｅｘｔｒａ、英国レディング）について受け取ったスペクトルと一致した。それに加えて、異なるＨＰＬＣ法を適用して、得られた２’−ＦＬの同一性を検証した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを上記したとおり適用した。他の方法は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒｅｚｅｘ ＲＣＭ Ｃａ２＋カラムを使用し、溶離剤として水を用いる分離（３０分、８０℃で０．６ｍＬ／分；屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ国）によって検出））（図１０Ａ参照）、およびＲｅｐｒｏｓｉｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ、５μｍ、２５０×４．６ｍｍを使用し、溶離剤としてアセトニトリル／水（６８：３２）を用いる分離（２０分間、３５℃で１．４ｍＬ／分；屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ国）によって検出）（図１０Ｂ参照）であった。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]