特許 6155251 核酸の検出方法、そのキット及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6155251

(24)【登録日】2017年6月9日

(45)【発行日】2017年6月28日

(54)【発明の名称】核酸の検出方法、そのキット及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170619BHJP

   B82Y 15/00 20110101ALI20170619BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170619BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   B82Y15/00

   C12N15/00 A

【請求項の数】6

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2014-501395(P2014-501395)

(86)(22)【出願日】2011年4月12日

(65)【公表番号】特表2014-515601(P2014-515601A)

(43)【公表日】2014年7月3日

(86)【国際出願番号】CN2011072682

(87)【国際公開番号】WO2012129821

(87)【国際公開日】20121004

【審査請求日】2013年11月22日

【審判番号】不服2015-19617(P2015-19617/J1)

【審判請求日】2015年10月30日

(31)【優先権主張番号】201110078665.0

(32)【優先日】2011年3月30日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】511020151

【氏名又は名称】ナショナル センター フォー ナノサイエンス アンド テクノロジー

(73)【特許権者】

【識別番号】513240353

【氏名又は名称】ベイジン エントリー−エグジット インスペクション アンド クォランティーン ビューロー，ピー．アール．チャイナ

(74)【代理人】

【識別番号】100075409

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久一

(74)【代理人】

【識別番号】100129757

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久彦

(74)【代理人】

【識別番号】100115082

【弁理士】

【氏名又は名称】菅河 忠志

(74)【代理人】

【識別番号】100125243

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 浩彰

(72)【発明者】

【氏名】リアン，シンジェ

(72)【発明者】

【氏名】チェ，チージュン

(72)【発明者】

【氏名】リュウ，ヤンファ

(72)【発明者】

【氏名】ドン，ファ

(72)【発明者】

【氏名】グオ，フイリン

(72)【発明者】

【氏名】マー，シァオウェイ

(72)【発明者】

【氏名】リ，チャン

(72)【発明者】

【氏名】ティアン，ジエ

【合議体】

【審判長】 大宅 郁治

【審判官】 松田 芳子

【審判官】 高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−１４８２４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１０４７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０７４８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ． Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉ．， ２００９， Ｖｏｌ．８， Ｎｏ．２， ｐ．１２０−３１

【文献】 Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２００７， Ｖｏｌ．１７， Ｎｏ．５， ｐ．８０６−１１

【文献】 Ｂｉｏｓｅｎｓ． Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．， ２０１１．１．１３， Ｖｏｌ．２６， ｐ．３３９８−４０４

【文献】 Ｂｉｏｓｅｎｓ． Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．， ２０１０， Ｖｏｌ．２６， ｐ．１７３６−４２

【文献】 Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２， Ｖｏｌ．２９７， ｐ．１５３６−４０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12Q 1/68

ＣＡＰｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＣＲバッファ溶液中の非対称ＰＣＲ反応条件下で、一対のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸を分析物の核酸と接触させる工程、
接触後の産物をプローブ含有溶液と混合する工程、並びに
色変化の観察によって分析物の核酸が標的核酸を含むかどうかを判定する工程を含み、検出方法が裸眼による比色分析により行われ、
標的核酸が炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のゲノムＤＮＡの少なくとも一部であり、
標的核酸を増幅し得る前記一対のプライマーが律速プライマー及び非律速プライマーを含み、律速プライマー配列が配列番号１であり、非律速プライマー配列が配列番号２であり、律速プライマーと非律速プライマーのモル比が１：１０〜１００であり、
プローブ含有溶液中のプローブが金ナノ粒子とオリゴヌクレオチドにより形成される２つの複合物からなり、第一複合物がＡｕＮＰと配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドにより形成されるものであり、第二複合物がＡｕＮＰと配列番号４により示されるオリゴヌクレオチドにより形成されるものであり、第一複合物と第二複合物のモル比が１：０．８〜１．２であり、複合物中の２つのナノ粒子が同一であり、ナノ粒子が５〜１００ｎｍの直径を有し、
ＰＣＲバッファ溶液の添加量が接触後の産物溶液の５〜５０％であり、ＰＣＲバッファ溶液のｐＨが８．５〜９．５であり、分析物の核酸の添加量が０．００１〜１０００ｎＭであり、添加されるＤＮＡポリメラーゼが０．０１〜０．２Ｕ／μＬであり、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸の添加量がそれぞれ５０〜５００μＭであり、プライマーの添加量が０．１〜５μＭであり、
プローブ含有溶液中のプローブ濃度が５００〜１５００ｎＭであり、
接触後の産物とプローブ含有溶液の混合が２２〜２５℃で３〜１０分間であり、
無機塩ＭＸ（ＭはＮａ及び／又はＫ、ＸはＣｌ、Ｂｒ、及びＩの１つ以上である）の存在下で、接触後の産物とプローブ含有溶液とを混合し、ＭＸ濃度が０．５〜１．５Ｍである核酸の検出方法。

【請求項2】

非対称ＰＣＲ反応条件において、プレ変性温度が９０〜９８℃、変性温度が９０〜９８℃、アニーリング温度が４０〜６０℃、伸長温度が７０〜７５℃、サイクル数が１０より多い請求項１に記載の方法。

【請求項3】

サイクル数が３０〜４０である請求項２に記載の方法。

【請求項4】

分析物の核酸の添加量が接触後の産物溶液量に対して１〜３００ｎＭであり、添加されるＤＮＡポリメラーゼが０．０１〜０．１Ｕ／μＬであり、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸の添加量がそれぞれ１００〜３００μＭであり、プライマーの添加量が０．３〜３μＭである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

（１）標的核酸を増幅し得る一対のプライマーであって、律速プライマーと非律速プライマーを含み、律速プライマーと非律速プライマーのモル比が非対称ＰＣＲ反応の要件を満たし、独立して又は混合して保存される一対のプライマー、
（２）前記一対のプライマーから独立して保存されるプローブ含有溶液又はその混合物を含み、
標的核酸が炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のゲノムＤＮＡの少なくとも一部であり、
前記律速プライマー配列が配列番号１であり、前記非律速プライマー配列が配列番号２であり、律速プライマーと非律速プライマーのモル比が１：１０〜１００であり、
プローブ含有溶液中のプローブが金ナノ粒子とオリゴヌクレオチドにより形成される２つの複合物からなり、第一複合物がＡｕＮＰと配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドにより形成されるものであり、第二複合物がＡｕＮＰと配列番号４により示されるオリゴヌクレオチドにより形成されるものであり、第一複合物と第二複合物のモル比が１：０．８〜１．２であり、複合物中の２つのナノ粒子が同一であり、ナノ粒子が５〜１００ｎｍの直径を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法を適用する核酸検出のためのキット。

【請求項6】

ＰＣＲバッファ溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸の１つ以上をさらに含み、ＤＮＡポリメラーゼが独立して保存され、残りが独立して又は１つ以上の成分を含む混合物で保存される請求項５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸の検出方法、当該方法を適用する核酸の検出のためのキット、検査及び検疫のためのキットの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

分子診断は現代の生物学的分析における最先端技術であり、特定の核酸配列の検出は生物学的分析の重要な部分である。従来の分子同定方法、例えば蛍光定量的ＰＣＲ(非特許文献１)、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、非特許文献２)、遺伝子チップ及び配列決定は、複雑であり、大きく高価な設備及び長時間を要する。これらは、炭疽菌等の、ある病原性微生物（生物学的兵器）を迅速に検出することができない。従って、医療現場で用いるための、代替的、簡便、安価、効率的、設備がいらない分析手段の開発は、非常に重要な実際的意義を有する。金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）は、直径１〜１００ｎｍを有するコロイド状生体分子マーカーであり、光学、電子、及びイメージングにおいて広く使用され、良好な安定性、低サイズ効果、表面効果、量子効果、光学効果、独自の生物学的親和性の利点がある(非特許文献３)。ＡｕＮＰは、高い透過係数を有し、１３ｎｍの直径を有する粒子は、約５２０ｎｍの波長でシャープな吸収ピークを有する。その自己集合した凝集物は、吸収ピークを有意に変更することができ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、色変化をもたらすことができる。一方で、ＡｕＮＰは、広範囲の生物学的親和性を有し、ＤＮＡ分子と結合し、自己集合プロセスに関与し、最終的にはＡｕＮＰ溶液（又はコロイド状金溶液）の物性、例えば色及び吸光度に影響を及ぼす。Ｍｉｒｋｉｎは、初めてＡｕＮＰを生物学的検出に適用し、ＡｕＮＰ−ＤＮＡ粒子の自己集合凝集及びＤＮＡの特異的ハイブリダイゼーションにより生じるコロイド状溶液の色変化を見出した(非特許文献４)。ＡｕＮＰは、検出プローブを形成するチオール変性短鎖ＤＮＡと結合することができ、相補的で同一長のＤＮＡが溶液中に存在する場合、秩序的かつ可逆的な凝集反応が生じ、メッシュ状に２次元、３次元凝集構造を形成し、ルビーレッド〜紫紺の色変化が生じる(非特許文献５)。このＡｕＮＰの裸眼で見える効果は、生体検出における迅速、容易な方法の前兆となる。

【0003】

ｓｓＤＮＡ(一本鎖ＤＮＡ)及びｄｓＤＮＡ(二本鎖ＤＮＡ)は、ＡｕＮＰの吸着が異なり、前者はＡｕＮＰの負に帯電した表面に対して電解質塩イオンの凝集効果がない安定な状態で吸着し(非特許文献６)、こうしてＬｉはＡｕＮＰ凝集反応に基づく核酸ハイブリダイゼーション比色分析検出を設計した。従来のＰＣＲは、二本鎖産物を得る不整脈の標的遺伝子に対して行われる。次に、コロイド状金溶液及びプローブを添加し、変性アニーリングの後、コロイド状金溶液が、特定の標的核酸が増幅される場合にルビーレッドから紫紺になり、特定の標的核酸が増幅されない場合にルビーレッドのままとなる(非特許文献７)。この核酸検出の新規概念は、ＡｕＮＰ及びプローブの共有修飾を必要としない非架橋様式である。しかしながら、実際の操作において、プローブとＰＣＲ産物の比は、制御することは容易ではなく、数多くのプレテスト又は精製及び未知の濃度の分析物の定量的測定を要するため、本方法を適用することができない。

【0004】

最近、ＡｕＮＰのＳＰＲ効果とＰＣＲの組み合わせにより、ナノＰＣＲ検出方法が生み出されている。Ｃａｉは従来のプライマーに取って代わるオリゴヌクレオチドプローブが結合したＡｕＮＰを使用し、ＰＣＲを用いてＨＩＶ ｇｐ１４０のエキソン配列を増幅し、裸眼による比色分析検出を行う。これは、迅速かつ容易であるが(非特許文献８)、色変化は有意ではなく、適用が限定される。

【0005】

上記により、明らかな色変化を用いた単純かつ容易な核酸検出方法が求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｑｉ Ｙ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，６７（８）：３７２０−３７２７

【非特許文献2】Ｓ．Ｒ． Ｋｌｅｅ．Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００６，１００，１３６４−５０７２

【非特許文献3】ＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒＭ．Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＩＩ，１９８１：９−３１

【非特許文献4】Ｍｉｒｋｉｎ Ｃ Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８２（６５９２）：６０７−６０９

【非特許文献5】Ｅｌｇｈａｎｉａｎ Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７７（２２）：１０７８−１０８１

【非特許文献6】Ｌｉ Ｈ．ＰＮＡＳ，２００４，１０１（３９）：１４０３６−１４０３９

【非特許文献7】Ｌｉ Ｈ．Ｊ．，Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，２１６：１０９５８−１０９６１，２００４

【非特許文献8】Ｍｉａｏ Ｃａｉ．Ｎａｎｏ Ｒｅｓ．２０１０，３：５５７−５６３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、先行技術の欠点を克服する目的で、有意な色変化を用いた単純、迅速、裸眼で見える核酸の検出方法、前記方法に依存したキット、検査及び検疫における前記方法及び前記キットの適用を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の発明者らは、核酸検出方法における現在利用可能なＡｕＮＰのわずかな色変化は、主にプローブと検出される核酸との間での不十分な結合のためであり、プローブとＡｕＮＰによるＳＰＲ効果が低くなることを見出した。多くの方法は、結合を強めるために使用することができるが、方法自体の複雑性、ましてや各測定時の検出システムの模索及び最適化のために許容されるのはわずかである。

【0009】

本発明の発明者らは、従来のＰＣＲの代わりに非対称ＰＣＲを用いて、ｓｓＤＮＡが多い分析物の核酸を得て、プローブと分析物の核酸との間でのハイブリダイゼーションの効率を増大させることができ、プローブとＡｕＮＰによるＳＰＲ効果及び色変化をさらに高めることができることを見出した。

【0010】

本発明は、ＰＣＲバッファ溶液中の非対称ＰＣＲ反応条件下で、一対のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸を分析物の核酸と接触させる工程、接触後の産物をプローブ含有溶液と混合する工程、並びに生成した混合物の色又は色変化の観察によって分析物の核酸が標的核酸を含む否かを判定する工程を含む、核酸の検出方法を提供する。

【0011】

本発明はまた、（１）標的核酸を増幅し得る一対のプライマーであって、非対称ＰＣＲ反応の要件を満たすモル比を有する上流プライマーと下流プライマーを含み、一対のプライマーが混合物の形態で独立して保存又は保管される一対のプライマー、（２）前記一対のプライマーから独立して保存されるプローブ含有溶液またはその混合物を含む、上記核酸検出方法のためのキットを提供する。

【0012】

さらに、本発明はまた、検査及び免疫のための上記方法またはキットの使用を含む。

【0013】

本発明の要旨は、以下の通りである：
［１］ ＰＣＲバッファ溶液中の非対称ＰＣＲ反応条件下で、一対のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸を分析物の核酸と接触させる工程、
接触後の産物をプローブ含有溶液と混合する工程、並びに
色変化の観察によって分析物の核酸が標的核酸を含むかどうかを判定する工程を含む、核酸の検出方法。
［２］ 非対称ＰＣＲ反応条件において、プレ変性温度が９０〜９８℃、変性温度が９０〜９８℃、アニーリング温度が４０〜６０℃、伸長温度が７０〜７５℃、サイクル数が１０より多く、標的核酸を増幅し得る前記一対のプライマーが律速プライマー及び非律速プライマーを含み、律速プライマーと非律速プライマーのモル比が１：５〜２４０である前記方法。
［３］ サイクル数が３０〜４０であり、律速プライマーと非律速プライマーとのモル比が１：１０〜１００である前記方法。
［４］ ＰＣＲバッファ溶液の添加量が接触後の産物溶液の５〜５０％であり、ＰＣＲバッファ溶液のｐＨが８．５〜９．５であり、分析物の核酸の添加量が０．００１〜１０００ｎＭであり、添加されるＤＮＡポリメラーゼが０．０１〜０．２Ｕ／μＬであり、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸の添加量がそれぞれ５０〜５００μＭであり、プライマーの添加量が０．１〜５μＭである前記方法。
［５］ 分析物の核酸の添加量が接触後の産物溶液量に対して１〜３００ｎＭであり、添加されるＤＮＡポリメラーゼが０．０１〜０．１Ｕ／μＬであり、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸の添加量がそれぞれ１００〜３００μＭであり、プライマーの添加量が０．３〜３μＭである前記方法。
［６］ 無機塩ＭＸ（ＭはＮａ及び／又はＫ、ＸはＣｌ、Ｂｒ、及びＩの１つ以上である）の存在下で、接触後の産物とプローブ含有溶液とを混合し、ＭＸの添加により０．５〜１．５ＭのＭＸ濃度となる前記方法。
［７］ 接触後の産物とプローブ含有溶液との混合が１０℃以上の温度で１〜６０分である前記方法。
［８］ プローブ含有溶液中のプローブ濃度が５００〜１５００ｎＭである前記方法。
［９］ プローブ含有溶液中の前記プローブが複数の複合物を含み、各複合物が１つのナノ粒子及び１つ以上のオリゴヌクレオチドにより形成され、各オリゴヌクレオチドが標的核酸の１つの鎖の一部に少なくとも部分的に相補的である前記方法。
［１０］ プローブ含有溶液中の前記プローブが２つの複合物を含み、各複合物が１つのナノ粒子及び１つのオリゴヌクレオチドにより形成され、２つのナノ粒子が同一であり、２つのオリゴヌクレオチドが異なり、２つの複合物のモル比が１：０．８〜１．２である前記方法。
［１１］ 前記オリゴヌクレオチドが１０〜５０ヌクレオチド長である前記方法。
［１２］ 前記複合物中のナノ粒子が５〜１００ｎｍの直径を有する前記方法。
［１３］ 前記複合物中のナノ粒子がＡｕＮＰである前記方法。
［１４］ 標的核酸が炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、野兎病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｕｌａｒｅｎｓｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、天然痘ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ）、黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、発疹熱群リケッチア（ｔｙｐｈｕｓ ｇｒｏｕｐ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、鳥類病クラミディア（ｏｒｎｉｔｈｏｓｉｓ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、ブドウ球菌腸毒素（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）、コクシジオイデス イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒストプラスマ カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）の少なくとも１つのゲノムの少なくとも一部である前記方法。
［１５］ 標的核酸配列が炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のゲノムＤＮＡであり、律速プライマー配列が配列番号１であり、非律速プライマー配列が配列番号２であり、律速プライマーと非律速プライマーのモル比が１：１０〜１００であり、プローブが金ナノ粒子とオリゴヌクレオチドにより形成される２つの複合物からなり、第一複合物がＡｕＮＰと配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドにより形成され、第二複合物がＡｕＮＰと配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドにより形成され、第一複合物と第二複合物のモル比が１：０．８〜１．２である前記方法。
［１６］ 検出方法が、裸眼による比色分析により行われる前記方法。
［１７］ （１）標的核酸を増幅し得る一対のプライマーであって、律速プライマーと非律速プライマーを含み、律速プライマーと非律速プライマーのモル比が非対称ＰＣＲ反応の要件を満たし、独立して又は混合して保存される一対のプライマー、
（２）前記一対のプライマーから独立して保存されるプローブ含有溶液又はその混合物を含む、前記記載の方法を適用する核酸検出のためのキット。
［１８］ 律速プライマーと非律速プライマーのモル比が１：５〜２４０である前記キット。
［１９］ ＰＣＲバッファ溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸の１つ以上をさらに含み、ＤＮＡポリメラーゼが独立して保存され、残りが独立して又は１つ以上の成分を含む混合物で保存される前記キット。
［２０］ 検査及び検疫のための、前記方法又は前記キットの使用。

【0014】

本発明の方法を用いて炭疽菌のゲノムＤＮＡ断片を検出する場合、以下の通りに行う：第一に、非対称ＰＣＲを行う鋳型として分析物の核酸を使用し、非対称ＰＣＲ産物と炭疽菌のゲノムの特異的ＤＮＡ断片を含むプローブハイブリダイゼーション溶液とを混合し、色が２分以内に有意に変化するが、断片が存在しない場合には色変化は生じない。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、迅速かつ容易であり、感度が高くかつ特異的であり、設備がいらず、裸眼で見える核酸検出方法が提供される。当該方法の高感度及び単純な性質を示す事例は、０．０１ｎｇの鋳型核酸を用いる５０μＬの非対称ＰＣＲ反応について、５μＬの非対称ＰＣＲ産物を取り出し、１．５μＭのプローブ濃度での１０μＬのプローブ溶液と混合する条件で、有意な色変化を生じることができるというものである。前記方法はまた、マウスβアクチン及びコレラ菌のＤＮＡ断片の検出に適用することができ、当該方法のある程度の普遍性を示す。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、本発明の一態様で使用されるＡｕＮＰ粒子のＴＥＭ図である。

【図2】図２は、本発明の一態様における非対称ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の図である。

【図3】図３は、本発明の一態様における非対称ＰＣＲ産物とプローブ溶液の混合後の色変化である。

【図4】図４は、本発明の一態様における感度評価の結果である。

【図5】図５は、本発明の一態様における特異性評価の結果である。

【図6】図６は、本発明の別態様における非対称ＰＣＲ産物とプローブ溶液の混合後の色変化である。

【図7】図７は、本発明のさらなる態様における非対称ＰＣＲ産物とプローブ溶液の混合後の色変化である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、ＰＣＲバッファ溶液中の非対称ＰＣＲ反応条件下で、一対のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸を分析物の核酸と接触させる工程、接触後の産物をプローブ含有溶液と混合する工程、並びに生成した混合物の色又は色変化の観察によって分析物の核酸が標的核酸を含むかどうかを判定する工程を含む、核酸の検出方法を提供する。

【0018】

前記分析物の核酸は、任意の核酸試料、例えば標本から抽出された核酸試料；ＰＣＲ増幅から得られた核酸試料；又は人工的に合成されて得られた核酸試料であってもよい。

【0019】

本発明によれば、前記非対称ＰＣＲは当該技術分野で周知の方法であり、ＰＣＲ増幅において等量でない一対のプライマーを用いて多量の一本鎖ＤＮＡを作製する。一対のプライマーは、非律速プライマー（ｎｏｎ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）及び律速プライマー（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）を含む。ＰＣＲ反応の早期段階は、二本鎖ＤＮＡを主に作製し、律速プライマー（低濃度プライマー）が枯渇した後、非律速プライマー（高濃度プライマー）によるＰＣＲで多量のｓｓＤＮＡが作製される。非対称ＰＣＲの重要な点は、律速プライマーの絶対量を制御することである。本発明は、標的核酸を増幅し得る非律速プライマー及び律速プライマーの従来の概念に従うものである。

【0020】

本発明によれば、非対称ＰＣＲの反応条件は、当該技術分野で従来の条件であるが、分析物の核酸に依存して変化する。標的核酸の存在は、検出時の問題となり、非対称ＰＣＲが生じるかもしれないし、生じないかもしれない。同一の非対称ＰＣＲは、分析物の核酸が標的核酸を含むかどうかに関わらずに行われるべきである。従って、添加成分及び反応条件が非対称ＰＣＲの要件に従っているとしても、全システムが非対称ＰＣＲ又は従来のＰＣＲの反応プロセスを行うとしても、非対称ＰＣＲ又は従来のＰＣＲの実施は、必ずしも増幅を達成できるとは限らないことに留意すべきである。

【0021】

本発明によれば、非対称ＰＣＲ反応条件としては、以下のものが挙げられる：プレ変性温度は９０〜９８℃であってもよく、変性温度は９０〜９８℃であってもよく、アニーリング温度は４０〜６０℃であってもよく、伸長温度は７０〜７５℃であってもよく、サイクル数は好ましくは１０より多く、より好ましくは３０〜４０であり；律速プライマーと非律速プライマーのモル比は、非対称ＰＣＲ要件を満たす場合にのみ、標的核酸に依存して変化し、好ましくは１：５〜２４０、より好ましくは１：１０〜１００である。律速プライマーと非律速プライマーの特異的配列は、広く受け入れられている方法を用いて選択することができ、標的核酸は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ, Ｏｌｉｇｏ又はＤＮＡＭＡＮ等のバイオロジーソフトウェアを用いて設計され、最適化することができる。

【0022】

本発明によれば、非対称ＰＣＲ反応で添加される成分は、現在利用可能なものと同一であってもよく、ＰＣＲバッファ溶液はＤＮＡポリメラーゼ反応で使用されるものに対応する。一般に、ＰＣＲバッファ溶液は、市販製品の寄贈品として供給され、ＰＣＲバッファ溶液に添加する量は寄贈品バッファの濃度に依存する。通常、バッファ溶液の添加量は、接触後の産物量の５〜５０％である。例えば、寄贈品ＰＣＲバッファが２×ＰＣＲバッファ溶液である場合、添加量は接触後の産物溶液の５０％である。ＰＣＲバッファ溶液のｐＨは、好ましくは８．５〜９．５であり、より好ましくは８．５〜８．８である。分析物の核酸の添加量は、続くプローブ溶液との混合について十分な量であり、有意に色変化する場合にのみ、０．００１〜１０００ｎＭの比較的広い範囲内で変化する。本発明によれば、分析物の核酸は短い合成断片、ＰＣＲ増幅産物、又は長いゲノムＤＮＡであってもよい。分析物の核酸が短い合成断片又はＰＣＲ増幅産物である場合、分析物の核酸の最終濃度は好ましくは０．０１〜１０ｎＭである。分析物の核酸がゲノムＤＮＡである場合、分析物の核酸の最終濃度は好ましくは１０〜３００ｎＭであり、さらに好ましくは０．０１〜３００ｎＭである。質量で計る場合、５０μｌの非対称ＰＣＲ反応システムとすれば、添加される分析物の核酸は、好ましくは１０ｐｇ〜１μｇ、より好ましくは０．１ｎｇ〜１００ｎｇである。添加されるＤＮＡポリメラーゼの種類及び量は、現在利用可能な方法と同一であってもよく、すなわち０．０１〜０．２Ｕ／μＬ、好ましくは０．０２〜０．０３Ｕ／μＬの最終濃度であってもよい。本発明により使用されるＰｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（２×）増幅システムは、０．０２５Ｕ／μＬのポリメラーゼ最終濃度を有する。通常、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸(すなわち,４×ｄＮＴＰ)の添加量は、従来の範囲、例えば５０〜５００μＭ、より好ましくは１００〜３００μＭであり、本発明において、ｄＮＴＰの最終濃度は２００μＭである。上記条件のもと、標的核酸のためのプライマーの全量は、本発明において好ましくは０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．３〜３μＭである。

【0023】

本発明によれば、接触後の産物とプローブ溶液との混合は、好ましくは無機塩ＭＸ（ＭはＮａ及び／又はＫであり、ＸはＣｌ、Ｂｒ又はＩの１つ以上であり、ＭＸは好ましくはＮａＣｌ）の存在下で行う。好ましくは、添加される無機塩ＭＸは、０．５〜１Ｍ、最も好ましくは０．８〜１ＭのＭＸ最終濃度を達成することができる。本発明の発明者らは、ＮａＣｌの上記濃度範囲により、検出システムが非常に有意な色変化を示すことができることを見出した。本発明によれば、ＭＸの全濃度を算出する場合、ＰＣＲバッファ溶液中のＭＸの存在をバッファ中のＭＸに含入することが必要である。しかしながら、特に非対称ＰＣＲ産物の一部のみを取り出してプローブ溶液と混合する場合、ＰＣＲバッファ溶液中のＭＸは、非常に低い。この様に、ＰＣＲバッファ中のＭＸは無視することができる。本明細書に含まれるＭＸは、主に混合を行う場合に添加されるか又はＭＸは前もってプローブ溶液と混合することができる。

【0024】

本発明によれば、接触後の産物及びプローブ溶液の混合条件は、厳密ではなく、非常に低い温度は、ハイブリダイゼーションをもたらさず、ブラウン分子運動を有意に低下することがあるため、温度は、１０℃未満であるべきではない。温度の上限は、ハイブリダイズする配列のＴｍ値より低く、一般に、混合温度は、１５〜５５℃であってもよく、好ましくは２０〜５０℃、最も好ましくは室温、すなわち２２〜２５℃である。接触後の産物とプローブ溶液の混合時間は、１〜６０分であってもよく、好ましくは３〜１０分である。当該技術分野の技術者は、混合時間は色変化を生じる最短時間であり、長い時間はより有意な色変化を生じる場合があることを知っている。

【0025】

本発明によれば、混合物量として、プローブ溶液中のプローブ濃度は、好ましくは５００〜１５００ｎＭ、より好ましくは６００〜１０００ｎＭであり、長期保存のため、高い濃度、すなわち２〜４μＭがストック溶液において推奨される。

【0026】

本発明によれば、プローブ溶液中のプローブ分子は、複数の複合物を含んでいてもよく、それぞれが１種のナノ粒子及び１つ以上のオリゴヌクレオチドにより形成される。オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、標的核酸の１つの鎖の一部に相補的であってもよい。好ましくは、２つのオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、標的核酸の同一鎖の一部に相補的であり、オリゴヌクレオチドは標的核酸の一部に完全に相補的であってもよい。又はオリゴヌクレオチドの一部は標的核酸の一部に相補的であり、他の部分は相補的ではない。例えば、オリゴヌクレオチドがナノ粒子に近づく部分は、標的核酸に相補的ではなく、粒子から離れた部分が相補的であり、相補性の程度は、ハイブリッドの安定性に基づく。本発明の本質は、プローブと標的核酸との結合能を改善することによって、プローブ上で金ナノ粒子のＳＰＲ効果を高めることである。従って、ナノ粒子部分から離れた相補物はプローブと標的核酸との結合能を高め、非相補物はオリゴヌクレオチドの立体障害又は剛性により粒子のＳＰＲ効果の低減を回避する。本発明の指針をもとに、当該技術分野の技術者は、本発明を十分に実現するプローブ／オリゴヌクレオチド配列及び結合方法を調節又は改変することができる。これらは本発明の範囲内としてみなされるべきである。

【0027】

複合物は、ナノ粒子とオリゴヌクレオチドの結合により生じる産物である。結合の概念は、当該技術分野で周知であり、すなわち２つの化学部分（又はユニット）が結合して１分子を生成する有機反応であり、結合方法は、当該技術分野で周知なものであってもよく、例えばナノ粒子がＡｕＮＰである場合、オリゴヌクレオチドの５’末端はメルカプトで変性することができ（５’末端塩基上のＣ６）、ＡｕＮＰと接触して安定なＡｕ−Ｓ結合を形成することができる。５’末端メルカプト変性は、当該分野で従来の合成方法、例えばＤＮＡ合成器を用いた固相合成により達成することができ、又は市販品として得ることもできる。

【0028】

本発明によれば、プローブ分子は、２つの複合物又は複数の複合物であってもよい。１つの複合物は、１つのナノ粒子と１つのオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。あるいは１つの複合物は、１つのナノ粒子と複数のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、好ましくはプローブ含有溶液中の前記プローブは２つの複合物を含み、各複合物は、１つのナノ粒子と１つのオリゴヌクレオチドにより形成される。１：０．８〜１．２のモル比を有する２つの複合物は、同一のナノ粒子と異なるオリゴヌクレオチドを有する。同一プロセス及び同一供給量により、同一濃度の２つの複合物とする。この様に、実際の適用において、同量の２つの複合物の混合によりモル比が上記要件を満たすことになる。正確なモル比は、２６０ｎｍ又は５２０ｎｍでの吸光度を測定することにより得ることができる。本発明は、吸光度を測定することにより１：１での上記要件を満たす。

【0029】

本発明によれば、オリゴヌクレオチドの長さは、特に限定されないが、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチドであり、最適結合効率を達成することができる。オリゴヌクレオチドプローブの設計の原理として、オリゴヌクレオチドの３’末端は、自己相補又はヘアピン構造形成の可能性がない複数のＣ又はＧを含まない。

【0030】

本発明によれば及び上記条件を基に、複合物中のナノ粒子の直径は特に限定されないが、好ましくは５〜１００ｎｍ、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。

【0031】

本発明の本質によれば、任意のナノ粒子が空間距離の変化により色変化を生じることができる場合のみ、任意のナノ粒子が本発明に適用される。現在、好ましく選択される粒子は、ＡｕＮＰであり、より好ましくは、単純かつ安定な調製、直径の違いがほとんどない、均一な形態、良好な安定性；５２０ｎｍでのシャープかつ狭い吸収ピーク、ピークシフトの場合ＳＰＲ効果による有意かつ裸眼で見える色変化の点で、約１３ｎｍの直径を有する。しかし、本発明は、このナノ粒子に限定されない。

【0032】

本発明によれば、標的核酸は、任意の生物学的種の核酸又は核酸の部分であってもよい。核酸の特徴的配列部分の検出は、有害なウイルス及び細菌の検査及び検疫において、分析物の核酸の所有主を同定するのに役立ち、標的核酸は炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ），コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ），ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ），野兎病菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｕｌａｒｅｎｓｅ），チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ），ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ），天然痘ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ），黄熱ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ），東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ），西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ），発疹熱群リケッチア（ｔｙｐｈｕｓ ｇｒｏｕｐ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ），ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ），鳥類病クラミディア（ｏｒｎｉｔｈｏｓｉｓ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ），ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ），ブドウ球菌腸毒素（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ），コクシジオイデスイミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ），ヒストプラスマ カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）の少なくともゲノムの少なくとも一部であってもよい。好ましくは、標的核酸は、炭疽菌又はコレラ菌のゲノムの少なくとも一部である。本発明の本質によれば、本発明の標的核酸は、上記に加えて多くの種に適用される。システムの可能性を証明するため、本発明の発明者は、ハウスキーピング遺伝子研究が新規システムの調査で広く受け入れられているモデルであり、その結果が他の遺伝子に対して正当であるため、対象としてマウスβアクチンのハウスキーピング遺伝子を選択した。また、有害なウイルス又は細菌の存在又は非存在を知らずに多くのプローブの同時添加により陽性結果が生じる場合に存在を確認できると考えられる。

【0033】

例えば、標的核酸配列は、炭疽菌のゲノムＤＮＡ（又は配列断片）であってもよく、律速プライマー配列は配列番号１であってもよく、非律速プライマー配列は配列番号２であってもよく、律速プライマーと非律速プライマーのモル比は１：１０〜１００であり、好ましくはモル比は増幅標的配列に依存して変化し、特異的標的配列のために、より好ましくはモル比は、従来の試験方法により得ることができる。プローブは、金ナノ粒子及びオリゴヌクレオチドにより形成される２つの複合物からなり、第一複合物は、ＡｕＮＰと配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドにより形成され、第二複合物は、ＡｕＮＰと配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドにより形成され、第一複合物と第二複合物のモル比は、１：０．８〜１．２、より好ましくは１：１である。

【0034】

本発明によれば、検出方法は、分光測光及び／又は視覚比色分析であってもよく、好ましくはさらなる設備なしで容易かつ迅速な視覚比色分析である。標的核酸に結合しない複合物は、５２４ｎｍで最大吸収ピークを有する。複合物が標的核酸に結合する場合、赤方偏移が、７ｎｍより大きい場合に視覚で見え、ＳＰＲ効果により生じる。本発明の赤方偏移は、マウスβアクチンに関し５７５ｎｍであり、炭疽菌のゲノムＤＮＡに関し５３７ｎｍであり、両方が視覚で容易に見える。通常、低濃度の単分散ＡｕＮＰによりＡｕＮＰの凝集が吸収ピークの強度を減少させるため、有意な色変化は２〜１０分以内に生じ、一晩より長いと、紫紺から透明に溶液の色が変化する。この時に、上清の最大吸収ピーク波長は経時変化し、検出できなくなるまで最大吸収ピーク強度はさらに減少する。

【0035】

結合の早期段階で、赤−青変化は、裸眼で見ることができ、長時間に渡って透明に変化する溶液を裸眼で見ることができ、すなわち分析物の核酸が十分で検出可能な量の標的核酸を含む限り、本発明の検出方法は明白な視覚結果を提供できることが分かる。

【0036】

本発明はまた、（１）標的核酸を増幅し得る一対のプライマーであって、律速プライマーと非律速プライマーを含み、律速プライマーと非律速プライマーのモル比が非対称ＰＣＲ反応の要件を満たし、具体的に律速プライマーと非律速プライマーのモル比は１：５〜２４０、より好ましくは１：１０〜１００であり、独立して保存される又は混合物の形態で保管され、好ましくは混合物の形態で保管される一対のプライマー、（２）前記一対のプライマーから独立して保存されるプローブ含有溶液又はその混合物を含む、核酸を検出するための上記方法を使用するキットを提供する。

【0037】

キットの各成分量は、実際の適用に応じて調節可能である。

【0038】

本発明によれば、キットは、当該分野での容易な入手可能性及び細心な保存要件のため、必ずしもＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲバッファ溶液及び４×ｄＮＴＰを含む必要はない。キットに存在してもよい成分は、ＰＣＲバッファ溶液、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドアデニン三リン酸、デオキシヌクレオチドグアニン三リン酸、デオキシヌクレオチドシトシン三リン酸、及びデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸の1つ以上を含み、ＤＮＡポリメラーゼは、独立して保存され、好ましくは別の低温雰囲気で保存される；残りは独立して保存されるか又は１つ以上の成分を含む混合物で保存される。上記成分の相対量及び濃度は、先の記載と同一であってもよい。

【0039】

本発明に記載される方法及びキットは、検査及び検疫に使用することができ、特に鉄道の駅、空港、税関等の迅速な検出を要する場所で使用することができる。

【実施例】

【0040】

以下の態様は、本発明の詳細な情報を示す。本発明の方法は、広く適用可能であり、マウスβ−アクチン遺伝子、そのＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ番号は、ＮＭ＿００７３９３．２；配列番号５：５’−ＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣ−３’として示されるマウスβ−アクチン遺伝子の一部；炭疽菌のゲノムＤＮＡの特異的配列断片、そのＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ番号は、ＡＦ＿３６０７５０．１；コレラ菌ＣＴＸ−Ａ遺伝子、そのＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ番号は、ＥＵ＿５４６１３６．１等のいくつかの代表的な標的核酸を検出する。炭疽菌及びコレラ菌のゲノムＤＮＡは、Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって贈与された。

【0041】

装置、試薬及び条件としては以下のものが挙げられる：ＴＥＣＮＡＩ Ｇ２ Ｆ３０ ＴＥＭ；トレース紫外可視蛍光分光光度計ｅ−ＳＰＥＣＴ;オリゴヌクレオチド配列(従来物及び５’スルフヒドリル修飾物を含む)はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより合成される；Ｎａｐ−５精製カラムはＧＥから購入される; Ｐｒｏｍｅｇａ ＤＮＡ ポリメラーゼ；Ｐｒｏｍｅｇａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＣＲ Ｍｉｘ（２×）により供給されるＰＣＲバッファ；非対称ＰＣＲ及び従来のＰＣＲにおけるマウスβ−アクチン遺伝子配列及びその断片のクローニング条件：９４℃、２分；９４℃、２０秒；５５℃、２０秒；７０℃、２０秒、３２サイクル、７０℃、３分；非対称ＰＣＲにおける炭疽菌の炭疽病配列断片のクローニング条件：９４℃、３分；９４℃、３０秒；４０℃、３０秒；７２℃、３０秒；４０サイクル、７２℃、５分；非対称ＰＣＲにおけるコレラ菌ＣＴＸ−Ａのクローニング条件：９４℃、３分；９４℃、２５秒；６０℃、２０秒；７２℃、２５秒；４０サイクル；７２℃、５分；Ｐｒｏｍｅｇａ 全ＲＮＡ抽出キットを用いて、マウス肝臓からマウス全ＲＮＡを分離し、逆転写によりｃＤＮＡを得る。本発明に含まれる従来の化学試薬は、分析グレードであり、ナノグレード水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡのＭｉｌｌｉ−Ｑ純水システムにより処理される。他の操作は、試薬の説明書及び“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”(第３版)に従う。

【0042】

調製例１
本調製は、およそ１３ｎｍの粒子直径を有するＡｕＮＰの合成に関するものである。

【0043】

ＡｕＮＰは、古典的な塩化金酸−クエン酸ナトリウム還元方法を用いて調製される。全てのガラス容器を王水に浸し、ナノスケール水で洗浄し、乾燥させる。５０ｍＬの三角フラスコにおいて、４０ｍＬのナノスケール水及び０．４ｍＬの１ｇ／ｍＬ ＨＡｕＣｌ_４（塩化金酸)を添加する。マグネットスターラーを用いて激しく攪拌し、沸騰するまで加熱する。次に１．２ｍＬの１ｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウムを一度に全てを迅速に添加し、溶液を淡黄色から暗赤色に次第に変化させ、１５分間加熱し続け、次に加熱を停止し、攪拌を続けて室温まで冷却させる。溶液を密閉し、遮光して４℃で保存し、紫外可視分光光度計を使用し、５２０ｎｍの最大吸収ピークを測定する。濃度は３ｎＭである。銅メッシュ上に１０μＬの分析物を落とし、真空下で乾ききり、ＴＥＭを行う。結果を図１に示す。ＡｕＮＰの直径は、およそ１３ｎｍであり、丸く、均一であり、良好な単分散である。

【0044】

調製例２
マウスβ−アクチンのｃＤＮＡ配列により、適切なハイブリッド部位を選択し、律速プライマーＰ１、非律速プライマーＰ２、後の分子ハイブリダイゼーションのＯｌｉｇｏ１及びＯｌｉｇｏ２オリゴヌクレオチドを設計する。配列は以下の通りである:
Ｐ１：５’−ＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＡ−３’（配列番号：６)；
Ｐ２：５’−ＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号：７)；
Ｏｌｉｇｏ１：５’−ＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号：８）；
Ｏｌｉｇｏ２：５’−ＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＡ−３’（配列番号：９）；
結合のための、Ｏｌｉｇｏ１及びＯｌｉｇｏ２の５’末端のＣ６は、メルカプト修飾される。本発明の実施例に使用されるオリゴヌクレオチドプローブが市販されていることは言及されるべき事である。

【0045】

調製例３
本調製例は、プローブを含む液体の調製に関するものである。

【0046】

８０μＬのジスルフィド溶解物（１７０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ８．０）中に５ＯＤメルカプト変性オリゴヌクレオチド乾燥粉末を溶解し、完全な溶液とした後、オリゴヌクレオチドの溶液を得る。４つのチューブに溶液を分け、それぞれは２０μＬを含む。ジスルフィド溶解物にＤＴＴ（ジチオスレイトール）を溶解し、新たに調製された０．１Ｍ ＤＴＴ溶液を得る。８０μＬのＤＴＴ溶液を２０μＬのオリゴヌクレオチド溶液に添加し、１００μＬのＤＮＡ ＤＴＴ還元溶液を得る。これをアルミホイルで包み、室温で１時間置き、３０分ごとに５秒間ボルテックスを行う。同時に、少なくとも１０ｍＬの上記ナノグレード水で、Ｎａｐ−５カラムを予め洗浄する。１００μＬのＤＮＡ ＤＴＴ還元溶液をＮａｐ−５精製カラムに供給し、４００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加してカラムを洗浄し、最終的に５００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加して、溶出し、メルカプト基含有オリゴヌクレオチド分析物を得る。１．５ｍｌの遠心チューブに分析物を回収し、紫外可視分光光度計を使用し、ＯＤ₂₆₀の定量的測定を行う。９０００×ｇ、４℃で、１５分間遠心し、１７ｎＭまでＡｕＮＰを濃縮し、Ａｕ−ＮＰＳ＝２００：１のモル比でメルカプト基含有オリゴヌクレオチドと混合する。混合物をアルミホイルで包み、室温で１６時間又は３７℃で８時間、低速で水平に震とうする。リン酸バッファ溶液を０．１ＭのＮａＣｌ濃度及び１０ｍＭのリン酸濃度（ｐＨ＝７．０）に調節し、連続する結合のために室温で４０時間インキュベートする。得られた複合物を１４０００ｒｐｍで２５〜４０分間遠心分離し、上清を除去し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ＝７．０）を含むリン酸バッファで懸濁し、３回遠心分離し、洗浄し、沈殿し、十分に未結合ｓｓＤＮＡを除去する。最終的に、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０１％アジ化ナトリウム、１０ｍＭリン酸（ｐＨ＝７．０）のリン酸バッファ溶液中に複合物を溶解し、４℃の暗所で保存する。正常機能のＡｕＮＰの色は、凝集せずにルビーレッドであり、修飾前と同じである。

【0047】

上記方法により、それぞれＯｌｉｇｏ１及びＯｌｉｇｏ２とＡｕＮＰとの複合物に対応するプローブ１及びプローブ２を含む液体を調製する(即ち、メルカプト変性オリゴヌクレオチド粉末は、それぞれＯｌｉｇｏ１及びＯｌｉｇｏ２である)、参照としてプローブを含有する液体量を考慮すると、プローブ１及びプローブ２は１．５μＭの濃度を有する。

【0048】

実施例１
非対称ＰＣＲを行い、５０μＬの非対称ＰＣＲ反応システムを確立し、添加される物質を表１に示す。

【0049】

【表1】

【0050】

鋳型は、マウスｃＤＮＡ又は配列番号５のＤＮＡ等のマウスｃＤＮＡの断片であり得る。本実施例に使用される鋳型は、配列番号５に示されるＤＮＡ配列であり、市販されている。

【0051】

実施例２
非対称ＰＣＲを行い、添加される物質を表２に示す。

【0052】

【表2】

【0053】

本実施例に使用される鋳型は、配列番号５に示されるＤＮＡ配列である。

【0054】

実施例３
非対称ＰＣＲを行い、添加される物質を表３に示す。

【0055】

【表3】

【0056】

本実施例に使用される鋳型は、マウスｃＤＮＡである。

【0057】

比較例１
非対称ＰＣＲを行い、添加される物質を表４に示す。

【0058】

【表4】

【0059】

非対称ＰＣＲシステムには、ネガティブ対照として作用する鋳型を添加しない。

【0060】

比較例２
従来のＰＣＲを行い、添加される物質を表５に示す。

【0061】

【表5】

【0062】

鋳型は配列番号５のＤＮＡ配列である。

【0063】

比較例３
非対称ＰＣＲを行い、添加される物質を表６に示す。

【0064】

【表6】

【0065】

鋳型は配列番号５のＤＮＡ配列である。

【0066】

実施例４〜５
添加されるＰ１の最終濃度が、それぞれ０．００２５μＭ及び０．００６μＭであることを除き、実施例１に記載される方法に従って非対称ＰＣＲ反応を行う。

【0067】

実施例６〜１０
添加される鋳型の最終濃度が、それぞれ２ｎｇ／μＬ、０．２ｎｇ／μＬ、０．０２ｎｇ／μＬ、０．００２ｎｇ／μＬ、０．０００２ｎｇ／μＬであることを除いて、実施例１に記載される方法に従って、非対称ＰＣＲ反応を行う。

【0068】

試験例１
実施例１〜５の産物及び比較例１〜３の産物から各５μＬを取り、アガロースゲル電気泳動を行い、結果を図２に示す。レーンＭは、マーカーであり、下部から上部のバンドは、それぞれ５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ及び５００ｂｐを表示する。レーン１〜５は、実施例１〜５の産物であり、レーン６は、鋳型なしのネガティブ対照、即ち比較例１の産物であり、レーン７は従来ＰＣＲの対照、即ち比較例２の産物であり、レーン８は、律速プライマーとしてＰ１及び非律速プライマーとしてＰ２を用いる対照、即ち比較例３の非対称ＰＣＲ産物である。

【0069】

試験例２
実施例３の産物及び比較例１〜３の産物から各５μＬを取り、プローブを含む調製例３から１０μＬを取り、室温（２５℃）で２分間４μＬの４Ｍ ＮａＣｌと混合し、観察し、写真を撮る。結果を図３に示す。チューブ１〜４はそれぞれ実施例３と比較例１〜３に対応する。産物の吸収ピーク波長及び吸光度を測定する。実施例３及び比較例１〜３の産物の吸収ピーク波長及び吸光度はそれぞれ（５７５ｎｍ，１．５２）、（５２４ｎｍ，０．７４）、（５２４ｎｍ，０．６９）、（５２４ｎｍ，０．７９）である。

【0070】

試験例３
実施例６〜１０の産物及び比較例１の産物から各５μＬを取り、プローブを含む調製例３から１０μＬを取り、室温（２５℃）で１０分間４μＬの４Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合し、観察し、写真を撮る。結果を図４に示す。チューブ１〜６は、それぞれ実施例６〜１０及び比較例１に対応する。産物の吸収ピーク波長及び吸光度を測定する。実施例６〜１０の産物の吸収ピーク波長及び吸光度は（５７５ｎｍ，１．６３）、（５７５ｎｍ，１．５１）、（５７５ｎｍ，１．３９）、（５７５ｎｍ，１．２６）、（５７５ｎｍ，０．９２）である。

【0071】

試験例４
実施例１〜２の産物並びに比較例１及び３の産物から各５μＬを取り、プローブを含む調製例３から１０μＬを取り、室温（２５℃）で２分間４μＬの４Ｍ ＮａＣｌと混合し、観察し、写真を撮る。結果を図５に示す。チューブ１〜３は、それぞれ実施例１並びに比較例１及び３に対応する。産物の吸収ピーク波長及び吸光度を測定する。実施例１〜２及び４〜５の産物の吸収ピーク波長及び吸光度は、（５７５ｎｍ，１．５９）、（５７５ｎｍ，１．５６）、（５７５ｎｍ，１．４３）及び（５７５ｎｍ，１．４０）である。

【0072】

調製例４
炭疽菌のゲノムＤＮＡ配列断片により、適切なハイブリダイゼーション部位を選択し、律速プライマーＰ３、非律速プライマーＰ４、後の分子ハイブリダイゼーションのためのＯｌｉｇｏ３及びＯｌｉｇｏ４オリゴヌクレオチドを設計する。配列は以下の通りである:
Ｐ３：５’−ＣＧＴＡＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡ−３’（配列番号：１）；
Ｐ４：５’−ＣＴＧＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＡＧＧＡＧＧＡ−３’（配列番号：２）；
Ｏｌｉｇｏ３：５’−ＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＣＴ−３’（配列番号：３）；
Ｏｌｉｇｏ４：５’−ＡＡＴＴＣＧＡＴＴＧＣＧＡＴＡＧＧＡＧＴ−３’（配列番号：４）

【0073】

調製例５
プローブ３及びプローブ４を含む溶液を、調製例３に記載の方法に従って調製する。プローブ３及びプローブ４は、それぞれＯｌｉｇｏ３及びＯｌｉｇｏ４の複合物である。プローブを含む液体量に対して、上記プローブ３及びプローブ４の濃度は同様に１．９μＭである。

【0074】

実施例１１
非対称ＰＣＲを行い、５０μＬの非対称ＰＣＲ反応システムを確立し、添加される物質を表７に示す。

【0075】

【表7】

【0076】

鋳型は、炭疽菌のゲノムＤＮＡ、又は炭疽菌の遺伝子配列の特別な部分であってもよい。実施例の鋳型は、炭疽菌のゲノムＤＮＡである。

【0077】

実施例１２〜１５
非対称ＰＣＲを行い、５０μＬの非対称ＰＣＲ反応システムを確立し、添加される物質を表８に示す。

【0078】

【表8】

【0079】

鋳型は炭疽菌のゲノムＤＮＡである。

【0080】

試験例５
実施例１１〜１５の産物及び比較例１の産物から各５μＬを取り、プローブを含む調製例５から１０μＬを取り、室温（２５℃）で２分間４μＬの４Ｍ ＮａＣｌと混合し、観察し、写真を撮る。結果を図６に示す。チューブ１及び２はそれぞれ、実施例１１及び比較例１に対応する。産物の吸収ピーク波長及び吸光度を測定する。実施例１１〜１５の産物の吸収ピーク波長及び吸光度は、（５３７ｎｍ，２．９７）、（５３７ｎｍ，３．２７）、（５３７ｎｍ，２．９１）、（５３７ｎｍ，２．７９）及び（５３７ｎｍ，２．５３）である。

【0081】

調製例６
炭疽菌のゲノムＤＮＡ配列断片により、適切なハイブリダイゼーション部位を選択し、非律速プライマーＰ５、律速プライマーＰ６、後の分子ハイブリダイゼーションのためのＯｌｉｇｏ５及びＯｌｉｇｏ６オリゴヌクレオチドを設計する。配列は以下の通りである:
Ｐ５：５’−ＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧ−３’（配列番号：１０）；
Ｐ６：５’−ＧＴＣＣＧＡＡＴＧＣＧＡＴＴＧＡＴＴ−３’（配列番号：１１）；
Ｏｌｉｇｏ５：５’−ＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＴＴＡＴＧＡＣＣＡＡ−３’（配列番号：１２）；
Ｏｌｉｇｏ６：５’−ＡＡＴＴＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＴＴＴＧＧＡ−３’（配列番号：１３）．

【0082】

調製例７
プローブ５及びプローブ６を含む溶液を、調製例３に記載の方法に従って調製する。プローブ５及びプローブ６は、それぞれＯｌｉｇｏ５及びＯｌｉｇｏ６の複合物である。プローブを含有する液体量に対して、上記プローブ３及びプローブ４の濃度は、同様に１．２μＭである。

【0083】

実施例１６
非対称ＰＣＲを行い、５０μＬの非対称ＰＣＲシステムを確立し、添加される物質を表９に示す。

【0084】

【表9】

【0085】

鋳型は炭疽菌のゲノムＤＮＡである。

【0086】

実施例１７〜２０
非対称ＰＣＲを行い、添加される物質を表１０に示す。

【0087】

【表10】

【0088】

前記鋳型は、炭疽菌のゲノムＤＮＡである。

【0089】

試験例６
実施例１６〜２０の産物から各５μＬを取り、プローブを含む調製例７から１０μＬを取り、室温（２５℃）で２分間４μＬの４Ｍ ＮａＣｌと混合する。産物の吸収ピーク波長及び吸光度を測定する。実施例１６〜２０の産物の吸収ピーク波長及び吸光度は、（５３７ｎｍ，２．９２）、（５３７ｎｍ，３．１１）、（５３７ｎｍ，２．８３）、（５３７ｎｍ，２．６６）及び（５３７ｎｍ，２．５１）である。

【0090】

調製例８
コレラ菌ＣＴＸ−Ａ遺伝子配列により、適切なハイブリダイゼーション部位を選択し、非律速プライマーＰ７、律速プライマーＰ８、後の分子ハイブリダイゼーションのためのＯｌｉｇｏ７及びＯｌｉｇｏ８オリゴヌクレオチドを設計する。配列は以下の通りである:
Ｐ７：５’−ＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＴＡＴＣＣ−３’（配列番号：１４）；
Ｐ８：５’−ＡＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号：１５）；
Ｏｌｉｇｏ７：５’−ＧＧＡＡＣＴＣＡＧＡＣＧＧＧＡＴＴＴＧＴ−３’（配列番号：１６）；
Ｏｌｉｇｏ８：５’−ＣＣＴＴＴＡＴＧＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＡ−３’（配列番号：１７）．

【0091】

調製例９
プローブ７及びプローブ８を含む溶液を、調製例３に記載の方法に従って調製する。プローブ７及びプローブ８は、それぞれＯｌｉｇｏ７及びＯｌｉｇｏ８の複合物である。プローブを含有する液体量に対して、上記プローブ７及びプローブ８の濃度は、同様に１μＭである。

【0092】

実施例２１
非対称ＰＣＲを行い、添加される物質を表１１に示す。

【0093】

【表11】

【0094】

鋳型は、コレラ菌のゲノムＤＮＡ又はコレラ菌のＣＴＸ−ＡのＤＮＡ断片であってもよい。実施例の鋳型は、コレラ菌のゲノムＤＮＡである。

【0095】

実施例２２〜２５
非対称ＰＣＲを行い、添加される物質を表１２に示す。

【0096】

【表12】

【0097】

鋳型は、コレラ菌のゲノムＤＮＡである。

【0098】

試験例７
実施例２１〜２５の産物から各５μＬを取り、プローブを含む調製例７から１０μＬを取り、室温（２５℃）で２分間４μＬの４Ｍ ＮａＣｌと混合し、観察し、写真を撮る。結果を図７に示す。チューブ１及び２は、それぞれ実施例２１及び比較例１に対応する。産物の吸収ピーク波長及び吸光度を測定する。実施例２１〜２５の産物の吸収ピーク波長及び吸光度は（５３７ｎｍ，２．７７）、（５３７ｎｍ，２．９１）、（５３７ｎｍ，２．７６）、（５３７ｎｍ，２．３３）及び（５３７ｎｍ，２．１８）である。

【0099】

図１は、調製例１により得られ、均一で良好な単分散性を有するＡｕＮＰを示す。

【0100】

図２は、実施例１〜５が非特異的なバンドがなく、マーカーと比較して正しい位置で、所定量のｓｓＤＮＡを含む非対称ＰＣＲ産物を得ることができることを示す。比較例１のネガティブ対照において、即ちレーン６は、いかなるバンドも示さない。従来のＰＣＲにおいて、即ちレーン７は非常に明白なバンドが現れ、実施例１〜５のものと進み方が遅い。相補的な一本鎖を得る比較例３において、即ち、レーン８は、実施例１〜５と同一の位置で明らかなバンドが見える。これらは、本発明の方法によりもたらされる良好な特異性及び安定性を示す。

【0101】

図３は、実施例３の産物の試験に関するものであり、チューブ１に示されるように２分以内に有意な色変化を示す。５７５ｎｍでの紫外可視分光光度計により、１．５２の強度を有する吸収ピークが見出される。一方で、比較例１〜３に対応するチューブ２〜４は、色変化を示さない。これらは、実際の状況と完全に一致し、即ち実施例３の産物は、色変化を示し得る標的核酸を本当に含み、一方で、比較例１〜３は、（二重鎖又はアンチセンス標的核酸を含み得る）標的核酸を含まず、色変化を示すことができない。これらは、本発明の方法は非常に信頼性が高いことを示す。一方で、電気泳動結果により、実施例３（即ちレーン３、図２）の標的核酸の含有量は、比較例１（レーン１）及び比較例２（即ちレーン２）と比較して高くないが、実施例３はそれでも検出において有意な色変化を示し、本発明の方法の高い感度を示す。

【0102】

図４は、鋳型の１０倍連続希釈後の非対称ＰＣＲから得られた鋳型感度の試験結果を示す。実施例６〜１０の産物と、プローブ含有溶液との混合は、２〜５分以内に有意な色変化並びに０．９２〜１．６３の強度を有する５７５ｎｍでの吸収ピークを示し、一方で比較例１の対照チューブ６は、一晩後でも有意な色変化を示さない。上記は、本発明の核酸検出方法が迅速であり、感度が高く、信頼性が高いことを示す。

【0103】

図５は、鋳型のない比較例１ではなく、又は標的核酸の相補的配列を得る比較例３ではなく、実施例１の標的核酸含有産物だけが色変化を示す点で特異性を示し、本発明の方法によりもたらされる高い特異性を示す。

【0104】

図６は、炭疽菌のゲノムＤＮＡの配列断片に対する試験例５の結果を示し、全ての非対称ＰＣＲ産物は、鋳型濃度に関らず、有意に陽性結果を示す。これにより、本発明の方法が炭疽菌のゲノムＤＮＡの配列断片を検出するための非常に良好な感度及び安定性を有することが明らかにされる。

【0105】

試験例６は、炭疽菌のゲノムＤＮＡの別の配列断片に対するものである。同様に、全ての非対称ＰＣＲ産物は、鋳型濃度に関らず、２．５１〜３．１１の強度を有する５３７ｎｍでの有意な陽性結果を示す。これは、本発明が広く応用できることを示す。

【0106】

図７は、コレラ菌ＣＴＸ−Ａ遺伝子のＤＮＡ配列断片に対する試験例７の結果を示し、全ての非対称ＰＣＲ産物は、鋳型濃度に関らず、２．１８〜２．９１の吸収ピーク強度を有する５３７ｎｍでの有意な陽性結果、裸眼で見えることを示す。これは、さらに本発明の方法は、迅速であり、感度が高く、信頼性が高く、広く応用できることを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]