特許 6155255 ＦＺＤ１０結合性ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6155255

(24)【登録日】2017年6月9日

(45)【発行日】2017年6月28日

(54)【発明の名称】ＦＺＤ１０結合性ペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20170619BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20170619BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20170619BHJP

   A61K 38/08 20060101ALI20170619BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20170619BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170619BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20170619BHJP

   A61K 49/14 20060101ALI20170619BHJP

   A61K 51/08 20060101ALI20170619BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20170619BHJP

   C07K 14/715 20060101ALN20170619BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   C07K7/08

   C12Q1/04

   A61K38/08

   A61K38/10

   A61P35/00

   A61K49/00

   A61K49/14

   A61K51/08

   G01N33/574 D

   !C07K14/715

【請求項の数】13

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2014-511166(P2014-511166)

(86)(22)【出願日】2013年4月5日

(86)【国際出願番号】JP2013060465

(87)【国際公開番号】WO2013157410

(87)【国際公開日】20131024

【審査請求日】2016年3月15日

(31)【優先権主張番号】特願2012-93982(P2012-93982)

(32)【優先日】2012年4月17日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000113263

【氏名又は名称】ＨＯＹＡ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】000173588

【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】飯森 祐介

(72)【発明者】

【氏名】山形 瑞恵

(72)【発明者】

【氏名】塩野 智隆

(72)【発明者】

【氏名】芝 清隆

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２６８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０９３６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５０９０７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１９３７２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２１７６０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０１００３１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも下記式（１）で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数１１〜１８のペプチド。

【化1】

（式中、Ｘ¹はＬｅｕ又はＭｅｔを示し、
Ｘ²はＰｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕを示し、
Ｘ³はＳｅｒ又はＡｌａを示し、
Ｘ⁴はＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＴｒｐを示し、
Ｘ⁵はＨｉｓ又はＡｌａを示し、
Ｘ⁶はＭｅｔ又はＡｌａを示し、
Ｘ⁷はＴｙｒ又はＰｈｅを示す。）

【請求項2】

少なくとも下記式（２）で表されるアミノ酸配列を有し、アミノ酸数が１２〜１８である請求項１記載のペプチド。

【化2】

（式中、Ｘ^aはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｌａを示し、Ｘ¹〜Ｘ⁷は前記と同じ）

【請求項3】

ＦＺＤ１０結合性を有する請求項１又は２に記載のペプチド。

【請求項4】

請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体を含有する医薬。

【請求項5】

請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体を含有する癌細胞又は癌組織検出薬。

【請求項6】

請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体を含有する癌診断薬。

【請求項7】

請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体を含有する癌治療薬。

【請求項8】

癌細胞又は癌組織を検出するための、請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体。

【請求項9】

癌診断のための、請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体。

【請求項10】

癌治療のための、請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体。

【請求項11】

癌細胞又は癌組織検出薬製造のための、請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体の使用。

【請求項12】

癌診断薬製造のための、請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体の使用。

【請求項13】

癌治療薬製造のための、請求項１又は２に記載のペプチド又はその標識体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−１０（ＦＺＤ１０）に特異的に結合するペプチド及びこれを含有する医薬に関する。

【背景技術】

【0002】

ＦｒｉｚｚｌｅｄタンパクはＷｎｔタンパク質リガンドに対する結合部位を有するＧタンパク質結合受容体のファミリーである。遺伝子解析から、これまで１８種のＷｎｔ遺伝子および１０種のＦｒｉｚｚｌｅｄ遺伝子（ＦＺＤ１〜ＦＺＤ１０）が同定されており、これらは全て構造的に高度に類似していることが明らかになっている。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパクは７回膜貫通型タンパクであり、Ｎ末端に細胞外システインリッチドメインを有する。このシステインリッチドメインがＷｎｔリガンドの結合部位である。ＷｎｔリガンドとＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との結合は必ずしも一対一ではなく、一種のＷｎｔリガンドが複数種のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体と、一種のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に複数種のＷｎｔリガンドが結合することが確認されている。

【0003】

ＷｎｔリガンドとＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体との結合によりＷｎｔシグナル伝達経路が活性化されると言われている。Ｗｎｔシグナル伝達経路にはβ−カテニン経路を活性化させるものと、β−カテニンを介さない経路が数種存在し、ＷｎｔリガンドとＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の組み合わせによって異なる経路を活性化しているものと考えられている。
受容体結合により活性化されたＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体と直接相互作用する細胞質タンパク質であるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）によって仲介されて、β−カテニンの細胞質での安定化および蓄積をもたらす。Ｗｎｔシグナルが存在しない場合、β−カテニンは腫瘍抑制タンパク質である大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）およびオーキシンを含む細胞質の分解複合体に局在する。これらのタンパク質はグリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）−３βがβ−カテニンに結合してリン酸化し、これをユビキチン／プロテアソーム経路を介した分解用に指定するための重大な足場として機能する。Ｄｓｈの活性化がＧＳＫを介して核へ輸送され、そこでＴｃｆ／ＬｅｆファミリーのＤＮＡ結合性タンパク質と相互作用して転写を活性化する（特許文献１）。

【0004】

β−カテニン非依存経路は多数のプロセスに関係していることが示されているが、細胞骨格系の制御に関与する細胞内平面極性（ＰＣＰ）、細胞の運動および接着に関与しているＷｎｔ／Ｃａ^２＋経路、プロテインキナーゼＡを介して筋新生の制御に関与する経路などが存在する。
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は２量体化することができ、この２量体化はＷｎｔシグナル経路の活性化に関与しているとの報告がある（非特許文献１）。
ＦＺＤ１０ ｍＲＮＡは、頸部、消化管および膠芽腫の細胞系統を含む多数の癌細胞系統で、ならびに約４０％の原発性胃癌、原発性結腸癌およびほとんどの滑膜肉腫組織でアップレギュレーションされているとの報告がある（特許文献１、非特許文献２、３）。

【0005】

かかる観点から抗腫瘍剤の開発をめざして、ＦＺＤ１０に対する抗体が報告されている（特許文献１〜４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特表２００９−５１３７０８号公報

【特許文献2】特表２００７−５２６８９１号公報

【特許文献3】特表２００９−５４１２０４号公報

【特許文献4】特表２０１０−５０９３６８号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｃｈａｒｌｅｓ Ｅ Ｄａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１２：８６−９０

【非特許文献2】Ｈ．Ｔｅｒａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００２）９，１０７−１１２

【非特許文献3】Ｓ．Ｎａｇａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，６２０１−６２１２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

抗体医薬による腫瘍の治療においては、標的腫瘍の大部分において過剰発現が認められ、かつ正常組織では発現されないか、最小限しか発現されない細胞タンパクを同定することが重要である。しかしながら、腫瘍において特異的に発現されるタンパク質を同定することは困難であり、そのようなタンパク質に対する抗体を得ることは困難である。また、抗体は分子量が大きく、投与手段が限定されるという問題もある。

【0009】

従って、本発明の課題は、ＦＺＤ１０に特異的かつ高親和性で結合する物質及びそれを含む医薬を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

そこで本発明者は、ファージディスプレイ法を用いてＦＺＤ１０に特異的に結合するペプチドを提示するファージを探索したところ、特定のアミノ酸配列を有するペプチドがリコンビナントヒトＦＺＤ１０タンパク質に特異的に結合すること、及びこのペプチド又はその標識体を用いてＦＺＤ１０を発現する細胞や組織を特異的に検出できることを見出した。さらに、該ペプチド又はその標識体がＦＺＤ１０とＷｎｔとの結合を競合的に阻害することから、該ペプチド又はその標識体は癌治療薬としても有用であることを見出し、本発明を完成した。

【0011】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１８〕を提供するものである。
〔１〕少なくとも下記式（１）で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数１１〜５０のペプチド。

【化1】

（式中、Ｘ^１はＬｕｅ又はＭｅｔを示し、
Ｘ^２はＰｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕを示し、
Ｘ^３はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ又はＬｙｓを示し、
Ｘ^４はＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＴｒｐを示し、
Ｘ^５はＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを示し、
Ｘ^６はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＣｙｓを示し、
Ｘ^７はＴｙｒ又はＰｈｅを示す。）
〔２〕少なくとも下記式（２）で表されるアミノ酸配列を有し、アミノ酸数が１２〜５０である〔１〕記載のペプチド。

【化2】

（式中、Ｘ^ａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｌａを示し、Ｘ^１〜Ｘ^７は前記と同じ）
〔３〕Ｘ^３がＳｅｒ又はＡｌａ、Ｘ^５がＨｉｓ又はＡｌａ、Ｘ^６がＭｅｔ又はＡｌａである〔１〕又は〔２〕記載のペプチド。
〔４〕アミノ酸数の上限が３０である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のペプチド。
〔５〕ＦＺＤ１０結合性を有する〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のペプチド。
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する医薬。
〔７〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌細胞又は癌組織検出薬。
〔８〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌診断薬。
〔９〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌治療薬。
〔１０〕癌細胞又は癌組織を検出するための、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体。
〔１１〕癌診断のための、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体。
〔１２〕癌治療のための、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体。
〔１３〕癌細胞又は癌組織検出薬製造のための、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体の使用。
〔１４〕癌診断薬製造のための、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体の使用。
〔１５〕癌治療薬製造のための、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体の使用。
〔１６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を使用することを特徴とする癌細胞又は癌組織の検出方法。
〔１７〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を使用することを特徴とする癌の診断方法。
〔１８〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を投与することを特徴とする癌の治療方法。
ここで、癌細胞又は癌組織の検出方法、及び癌の診断方法には、インビトロ及びインビボが含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ｄ１２ライブラリーでのパニング実験のアウトプット力価／インプット力価比を示す。

【図2】Ｃ７Ｃライブラリーでのパニング実験のアウトプット力価／インプット力価比を示す。

【図3】ＦＺＤ１０標的パニング４ラウンドで回収したファージが提示しているペプチド配列を示す。

【図4】Ｓ−４０６ファージの固相化タンパクに対する結合性試験結果を示す。

【図5】Ｍ１３ＫＥファージの固相化タンパクに対する結合性試験結果を示す。

【図6】Ｓ−４０６ファージの液相化タンパクに対する結合性試験結果を示す。

【図7】Ｍ１３ＫＥファージの液相化タンパクに対する結合性試験結果を示す。

【図8】アラニン置換ファージの提示ペプチド配列を示す。

【図9】アラニン置換ファージの固相化タンパクに対する結合性試験結果を示す。

【図10】Ｓ−４０６ファージとペプチドＰｅｐ１５の競合試験結果を示す。

【図11】Ｓ−４０６ファージとペプチドＰｅｐ２０の競合試験結果を示す。

【図12】Ｓ−４０６ファージとｒｍＷｎｔ−５ａの競合試験結果を示す。

【図13】Ｓ−４０６ファージとｒｈＩＧＦ−１の競合試験結果を示す。

【図14】アミノ酸置換ファージおよび短鎖ペプチドファージの提示ペプチド配列を示す。

【図15】アミノ酸１個置換ファージの結合性試験結果を示す。

【図16】アミノ酸２個置換ファージの結合性試験結果を示す。

【図17】短鎖ペプチドファージの結合性試験結果を示す。

【図18】ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ結合性試験結果を示す。

【図19】ｒｈＷＮＴ−３ａ添加条件での、ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ結合性試験結果を示す。

【図20】合成ペプチドＰｅｐ２３−ＦのＨＳ−ＳＹ−ＩＩ染色像を示す。

【図21】合成ペプチドＰｅｐ３９−ＦのＨＳ−ＳＹ−ＩＩ染色像を示す。

【図22】合成ペプチドＰｅｐ２３−ＦのＭＣＦ７染色像を示す。

【図23】合成ペプチドＰｅｐ３９−ＦのＭＣＦ７染色像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明のペプチドは、少なくとも下記式（１）で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数１１〜５０のペプチドである。

【0014】

【化3】

【0015】

（式中、Ｘ^１はＬｕｅ又はＭｅｔを示し、
Ｘ^２はＰｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕを示し、
Ｘ^３はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ又はＬｙｓを示し、
Ｘ^４はＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＴｒｐを示し、
Ｘ^５はＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを示し、
Ｘ^６はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＣｙｓを示し、
Ｘ^７はＴｙｒ又はＰｈｅを示す。）

【0016】

上記式（１）中、Ｘ^１はＬｅｕ又はＭｅｔを示すが、Ｌｅｕがより好ましい。
Ｘ^２はＰｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ又はＬｅｕを示すが、Ｐｒｏ又はＩｌｅがより好ましい。
Ｘ^３はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ又はＬｙｓを示すが、このうち、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎが好ましく、Ｓｅｒ、Ａｌａが特に好ましい。
Ｘ^４はＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ又はＴｒｐを示すが、Ｌｅｕがより好ましい。
Ｘ^５はＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｌｅｕ又はＭｅｔを示すが、このうちＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＡｌａが好ましく、Ｈｉｓ、Ａｌａが特に好ましい。
Ｘ^６はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＣｙｓを示すが、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａがより好ましく、Ｍｅｔ、Ａｌａが特に好ましい。
Ｘ^７はＴｙｒ又はＰｈｅを示すが、Ｔｙｒがより好ましい。

【0017】

本発明のペプチドのうち、少なくとも下記式（２）で表されるアミノ酸配列を有し、アミノ酸数が１２〜５０であるペプチドがより好ましい。

【0018】

【化4】

【0019】

（式中、Ｘ^ａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｌａを示し、Ｘ^１〜Ｘ^７は前記と同じ）

【0020】

式（２）中、Ｘ^ａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｌａを示すが、このうちＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ 又はＡｌａが好ましく、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｌａがより好ましく、Ａｒｇ又はＡｌａが特に好ましい。また、式（２）中のＸ^１〜Ｘ^７は、前記のものがより好ましい。

【0021】

式（１）及び（２）中、Ｘ^３はＳｅｒ又はＡｌａ、Ｘ^５はＨｉｓ又はＡｌａ、Ｘ^６はＭｅｔ又はＡｌａが特に好ましい。

【0022】

また、本発明ペプチドのアミノ酸数としては、１１〜５０であるが、１２〜５０がより好ましい。なお、アミノ酸数の上限は４０が好ましく、３０がより好ましく、２０がさらに好ましく、１８が特に好ましい。

【0023】

本発明ペプチドのＸ^１〜Ｘ^７及びＸ^ａの置換は、後記実施例記載の結合性試験結果、保存的置換及び半保存的置換であれば同様の活性を示すことに基づくものである。ここで典型的な保存的置換及び半保存的置換を表１に示す。

【0024】

【表1】

【0025】

本発明のペプチドは、前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いる組み換え技術によって製造することもできるが、有機合成化学的ペプチド合成法によって製造することができる。有機合成化学的ペプチド合成法は、一般的な官能基の保護、カルボキシル基の活性化、ペプチド結合の形成、保護基の脱保護の手段によって行われる。これらの反応は固相法で行うのが好ましい。

【0026】

本発明のペプチドのうち、配列番号２で示されるペプチド（Ｓ−４０６）は、ランダムなペプチド配列を提示させたファージライブラリーからファージディスプレイ法によって、ＦＺＤ１０と結合性を有するペプチドをスクリーニングすることにより選択することができる。ファージディスプレイ法に用いられるファージとしてはＭ１３が好ましい。ファージライブラリーからＦＺＤ１０と強く結合するものを選択するには、ファージ集団をＦＺＤ１０とインキュベートし、ＦＺＤ１０に結合しなかったファージを洗い流した後に、結合したファージを回収する。回収したファージがどのような配列のペプチドを提示しているかは、ファージゲノムの該当部分をシークエンスすればよい。ＦＺＤ１０とペプチドの相互作用がそれほど強いものではない場合には、弱い結合力を持つファージがバックグラウンドとしてつきまとってしまう。そこで、結合→洗浄→回収の一連の流れの後に、再度大腸菌に感染させ、二次ライブラリーを調製し、このライブラリーを用いて再度一連の操作を繰り返すパニング操作を行う。パニングを繰り返していくことによって得られるライブラリーの中には、ＦＺＤ１０に高い結合能力を持ったファージの数が増えてくる。このようにして、目的とするＦＺＤ１０と強い結合性を有するファージが選択できる。

【0027】

本発明のペプチドは、ＦＺＤ１０に特異的に結合する。従って、本発明のペプチド又はその標識体は、ＦＺＤ１０又はＦＺＤ１０を発現している細胞若しくは組織を検出するための試薬として有用である。ここで本発明のペプチドの標識体としては、ＦＺＤ１０に結合したペプチドを検出し得る標識体であればよく、放射性同位体、アフィニティー標識（例えば、ビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）、常磁性原子等が挙げられる。これらの標識体のうち、蛍光標識やポジトロン核種による標識は、例えば大腸癌等のＦＺＤ１０が発現している癌細胞又は癌組織を検出するうえでより好ましい。このとき、本発明のペプチド又はその標識体は、対象細胞、対象組織に直接適用してもよいし、対象患者に投与してもよい。

【0028】

本発明のペプチドの標識体は、ＦＺＤ１０が発現している癌診断、例えば早期癌診断に有用である。例えば、癌組織の存在の有無の確認を目的とした診断においては、対象部位に例えば上記蛍光標識ペプチドを散布又は注射などの手段により接触させた後、洗浄処理により余剰な蛍光成分を除去した後、該当部位に励起光を照射し、蛍光染色された組織の有無を肉眼的又は顕微鏡的に確認することができる。
より好ましい形態としては、本発明の蛍光標識ペプチドを蛍光造影剤として内視鏡による癌診断に用いることである、例えば、蛍光標識ペプチドを経内視鏡的に散布などの手段により組織に接触させた後、洗浄処理を行い、内視鏡光源により励起光を該当部に照射し、蛍光染色された組織の有無を内視鏡的に確認すればよい。これにより早期癌の発見診断に使用可能となるばかりではなく、通常内視鏡的に病変と疑われる部位を染色し、拡大蛍光観察をすることにより蛍光の有無による病変部位と非病変部位の境界を判別することにも使用可能となる。内視鏡の種類は特に限定されないが、内視鏡光源としてフルオレセインのための励起光を照射できる蛍光内視鏡又は、加えて拡大能を有する共焦点内視鏡が好ましい。
また、修飾する蛍光色素はフルオレセインだけではなく、たとえばシアニン系化合物など励起波長の異なる蛍光色素を用いてもよい。蛍光剤としてインドシアニングリーンなどのシアニン系化合物を用いた場合、フルオレセインと比較して励起波長がさらに長波長側にシフトするため、より深部の病変の確認に有効である。またポジトロン核種を本発明ペプチドに修飾させた場合、ＰＥＴやＳＰＥＣＴなどにより検出可能となる。また、ガドリニウムを本発明ペプチドに修飾させた場合、ＭＲＩにより検出可能である。これにより主に消化器などといった経内視鏡的に到達可能な部位の癌のみならず、全身の癌病変において、本発明ペプチドが利用可能となる。癌の診断においては、本発明のペプチド又はその標識体は、対象部位に直接適用してもよいし、対象患者に投与してもよい。

【0029】

また、本発明ペプチド又はその標識体はＦＺＤ１０とＷｎｔとの結合を競合的に阻害することから、上記のような癌細胞検出、癌診断だけでなく、癌の治療にも用いることができる。

【0030】

本発明ペプチドが検出、診断又は治療可能な細胞又は組織としては、ＦＺＤ１０を発現している細胞又は組織であればよく、例えば癌細胞又は癌組織、具体的には、肺癌、乳癌、大腸癌、胃癌、骨肉腫、子宮頸癌、卵巣癌、滑膜肉腫、肝臓癌、胆のう癌、膵臓癌、前立腺癌、頭頚部癌、腎細胞癌、膀胱癌等が挙げられる。

【0031】

本発明のペプチド又はその標識体を癌検出薬、癌診断薬、癌治療薬として用いる場合、本発明ペプチド又はその標識体はそのまま用いることもできるが、薬学的に許容される担体とともに各種投与形態に適した組成物とすることができる。該組成物としては、注射用剤、散布用剤、経口投与用剤、経直腸用剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、水、生理食塩水、各種緩衝剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等が挙げられる。

【0032】

本発明のペプチド又はその標識体を癌治療薬として用いる場合の投与量は、症状、体重等によっても異なるが、通常成人１日あたり０．１ｍｇ〜１０００ｍｇが好ましい。

【実施例】

【0033】

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0034】

実施例１（ファージディスプレイ）
［手順］
１．パニング実験−ラウンド１
９６ｗｅｌｌプレートに５μｇ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ_１ Ｆｃ（ｒｈＩｇＧ_１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ １０ Ｆｃ Ｃｈｅｍｅｒａ（ｒｈＦＺＤ１０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を個別に２００μＬずつ添加し（１μｇ／ｗｅｌｌ）、４℃、一晩、静置インキュベートした（プレートへの固相化）。ウェル内の非固相タンパクを除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）／ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ））を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、１時間、静置インキュベートし、その後、０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）２００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
ペプチド提示ファージライブラリー（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）は、２種類利用し、Ｄ１２ライブラリーは、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示しており、２．７×１０^９種の異なるペプチド配列を持つファージライブラリーである。Ｃ７Ｃライブラリーは、７残基の環状ランダムペプチドを提示しており、１．２×１０^９種の異なるペプチド配列を持つファージライブラリーである。
本実験で用いたｒｈＦＺＤ１０は、その構造にＩｇＧ_１部位が含まれている。そのため、ＩｇＧ_１部位に結合してしまうペプチド提示ファージ（以下ファージと略す）を除去する目的で、まず、ｒｈＩｇＧ_１固相化ウェルに０．１％ＴＢＳＴを１００μＬ添加し、Ｄ１２ファージライブラリー（１×１０^１３ＰＦＵ／ｍＬ）、Ｃ７Ｃファージライブラリー（２×１０^１３ＰＦＵ／ｍＬ）をそれぞれ１０μＬ添加した。ここで、ｒｈＦＺＤ１０固相化ウェルには、乾燥防止のため０．１％ＴＢＳＴを２００μＬ添加した。
＊ＰＦＵ：ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ（プラーク形成単位）

【0035】

室温、１時間、シーソーを用いて振とうインキュベートし、ウェルからｒｈＩｇＧ_１に結合していないファージを含んだ上清を回収し、ｒｈＦＺＤ１０固相化ウェルに添加した。
室温、１時間、シーソーを用いて振とうインキュベートし、固相化したｒｈＦＺＤ１０に結合させた後、ファージ溶液を除去し、０．１％ＴＢＳＴ ２００μＬ／ｗｅｌｌで１０回洗浄した。１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１００μＬ添加し、室温、１０分、振とうインキュベートしファージを溶出させた。溶出液を回収し、回収溶液に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加することで中和した。回収した溶出液の一部を用いてファージの力価を測定した。

【0036】

２．回収ファージの増幅
１の操作で得られたファージ溶出液をＬＢ２０ｍＬ中で対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ’ｌａｃｌ^ｑΔ（ｌａｃＺ） Ｍ１５ ｐｒｏＡ^＋Ｂ^＋ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^Ｒ）／ｆｈｕＡ２ ｓｕｐＥ ｔｈｉΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Δ（ｈｓｄＭＳｍｃｒＢ） ５ （ｒ_ｋ⁻ｍ_ｋ⁻ＭｃｒＢＣ⁻）］に感染させ、振とう培養機を用いて、３７℃で激しく攪拌しながら、４時間３０分インキュベートした。ファージ感染菌培養液を５０ｍＬ遠心チューブに移し、上記サンプルをマイクロ冷却遠心機を用いて、４℃、１０分、８，９００×ｇで遠心した。遠心後、ＥＲ２７３８菌を除去する目的で、上清を新しいチューブに回収した。回収ファージ溶液に３．６ｍＬ（１／５量）のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ Ｐｏｌｙｅｈｔｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ６，０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液）を添加し、ミキサーでよく攪拌して、４℃、１６時間、インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを回収するために、マイクロ冷却遠心機で４℃、１０分、８，９００×ｇで遠心して、上清を除去した。上清を完全除去する目的で、もう一度遠心し、上清を除去した。沈殿ファージに、氷冷ＴＢＳ １ｍＬを加え、懸濁し、マイクロチューブに移した。ファージ懸濁液を、コンパクト高速冷却遠心機を用いて、４℃、５分、１６，０００×ｇで遠心した。上清を別のチューブに回収し、懸濁されない残渣を取り除き、回収溶液に、２００μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを加えて、ミキサーで攪拌した。上記溶液を氷上、１時間、インキュベートしファージを沈殿させた。溶液を高速遠心機で４℃、１０分、１６，０００×ｇ遠心してファージを沈殿させ上清を除去した。この遠心工程を再び行い、上清を完全に除去した。得られたファージ沈殿に、２００μＬの０．０２％ＮａＮ_３／ＴＢＳを加え、完全に懸濁させ、コンパクト冷却遠心機で、４℃、５分、１６，０００×ｇ、遠心し、上清を回収することで懸濁されなかった残渣を除去した。回収ファージ濃縮液の力価を測定した。

【0037】

３．パニング実験−ラウンド２、３、４
濃縮ファージ溶液を用いて、２及び３・４ラウンドのパニング実験を実施した。２回目のパニング実験において、１ラウンドの操作と異なる点は添加ファージ量を２×１０^１１ＰＦＵ／ｗｅｌｌ、洗浄液を０．３％ＴＢＳＴ（０．３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にしたことである。３・４ラウンドのパニング実験では、１ラウンドの操作と異なる点は添加ファージ量を２×１０^１１ＰＦＵ／ｗｅｌｌ、洗浄液を０．５％ＴＢＳＴ（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にしたことである。

【0038】

４．力価測定
ＬＢ ３ｍＬ内でＥＲ２７３８菌を対数増殖期（ＯＤ６００；〜０．５）となるまで培養し、ＥＲ２７３８培養液２００μＬに、必要濃度となるよう希釈したファージ液を１０μＬ添加した。この混合溶液をミキサーでよく攪拌し、室温、５分間インキュベートした後、溶解したトップアガー溶液４ｍＬと混合させ、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上に播種した。
ファージ感染大腸菌播種プレートを３７℃、１６時間、インキュベートした後、得られた青色プラークの数をカウントした。ファージ希釈倍率を用いて、ファージ数を算出した。

【0039】

［結果］
ファージライブラリーを用いた実験のインプット力価（標的分子に加えたファージ力値）とアウトプット力価（洗浄後の標的分子から溶出されたファージ力値）の比の値の変化をＤ１２ライブラリーの結果を図１、Ｃ７Ｃライブラリーの結果を図２に示す。
Ｄ１２ライブラリーを利用した、ｒｈＦＺＤ１０標的パニング実験を４ラウンドまで進めた結果、アウトプット力価／インプット力価比を比較したところ、４ラウンドは１ラウンドの４００倍程度の増加が観察された。したがって、ｒｈＦＺＤ１０特異結合性を示すファージがセレクションされたことが予想された。
Ｃ７Ｃライブラリーを利用した、ｒｈＦＺＤ１０標的パニング実験も４ランドまで進めたが、アウトプット力価／インプット力価比の増加は観察されなかった。

【0040】

実施例２（シークエンス解析）
［手順］
Ｄ１２ライブラリーを用いたパニング実験の４ラウンドで得られたファージを、常法（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｅ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、提示ペプチド領域から９６残基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー［−９６ｇＩＩＩ シーケンシングプライマー（５’−^ＨＯＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）（配列番号１）、Ｓ１２５９Ａ、ＮＥＢ］を用いて、ダイデオキシターミネイト法により決定した（ＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ、ベックマン）。反応産物の泳動とデータ解析には、キャピラリーシーケンサー（ＣＥＱ２０００、ベックマン）を用いた。

【0041】

［結果］
決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列を図３に示す。
この中で、得られたＳ−４０６ファージの提示するペプチド配列（配列番号２）は、４ラウンドで調べた１２個のクローンの中に同じ配列を持つクローンが７個であった（５８％）。Ｓ−４０７ファージ（配列番号３）、Ｓ−４０８ファージ（配列番号４）、Ｓ−４０９ファージ（配列番号５）、Ｓ−４１０ファージ（配列番号６）、Ｓ−４１１ファージ（配列番号７）は各１クローンしか得られなかった。
したがって、パニングの回数が進むにつれ、Ｓ−４０６ファージがセレクションされていることが明らかとなった。特定のファージクローンがセレクションされている理由として、そのファージクローンが標的分子に対し強い結合性を示していることが挙げられる。

【0042】

実施例３（ファージ結合性試験（タンパク固相化条件））
［手順］
標的タンパクであるｒｈＦＺＤ１０とｒｈＦＺＤ１０に標識されたＦｃ部位であるｒｈＩｇＧ_１、標準タンパクとしてＢＳＡを１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μＬ添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（Ｓ−４０６又はＭ１３ＫＥ（ペプチド非提示ファージ））を１×１０^１０ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを１０回洗浄後、０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μＬ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。

【0043】

［結果］
固相化法による結合性試験のインプット力価／アウトプット力価比の変化についてＳ−４０６ファージの結果を図４に、Ｍ１３ＫＥファージの結果を図５に示す。
Ｓ−４０６のＦＺＤ１０への結合性は、Ｆｃ部であるｒｈＩｇＧ_１より１９２８倍高く、標準タンパクであるＢＳＡよりも９９３倍高いことが明らかとなった。
Ｍ１３ＫＥファージでは、固相化したタンパク間に結合性の差は見られず、どれも低い値であった。
図４の結果からＳ−４０６ファージは、タンパク固相化条件においてＦＺＤ１０に特異的に結合することが明らかとなった。
また、Ｓ−４０６ファージとＭ１３ＫＥファージのＦＺＤ１０への結合性を比較すると、Ｓ−４０６の方が１２１９８倍高い事が明らかとなった。この結果より、Ｓ−４０６ファージの提示するペプチド配列がＦＺＤ１０との結合に関与している可能性が示唆された。

【0044】

実施例４（ファージ結合性試験（タンパク液相化条件））
［手順］
マイクロチューブに０．０１％ＰＢＳＴ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）を２００μＬ分注、ＰｒｏｔｅｉｎＡがコートしてある磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＡ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０μＬ添加してピペッティングで混合し、磁石をマイクロチューブ側面に押し当て、上清を除去した。その後、磁石をマイクロチューブから離し、０．０１％ ＰＢＳＴを２００μＬ添加してピペッティングで混合し、磁石をマイクロチューブに押し当て、上清を除去した。上記工程を３回繰り返し、磁気ビーズを洗浄した。０．０１％ ＰＢＳＴを２００μＬ添加し、新しいマイクロチューブへ移し、磁石を用いて上清を除去した。５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／０．０１％ ＰＢＳＴで５μｇ／ｍＬに調製したｒｈＦＺＤ１０を２００μＬ添加し、Ｖｏｌｔｅｘで混合後、室温で１時間、マイクロチューブ撹拌機を用い磁気ビーズと反応させた。反応後、磁石をマイクロチューブに押し当てながら上清を除去した後、磁石をマイクロチューブから離して、０．０１％ ＰＢＳＴを２００μＬ添加してピペッティングで混合し、磁石をマイクロチューブに押し当て、上清を除去した。上記工程を３回繰り返し、洗浄した。０．０１％ ＰＢＳＴを２００μＬ添加し、新しいマイクロチューブへ移し、磁石を用いて上清を除去した。上記マイクロチューブに増幅ファージ液（Ｓ−４０６又はＭ１３ＫＥ）を１×１０^１０ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、マイクロチューブ撹拌機を用い反応させた。磁石を用い反応液を除去し、０．０１％ ＰＢＳＴ ２００μＬで５回洗浄した。０．０１％ ＰＢＳＴを２００μＬ添加し、新しいマイクロチューブへ移し、磁石を用いて上清を除去した。０．２ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をマイクロチューブに１００μＬ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間マイクロチューブ撹拌機を用い撹拌した。その後、ピペッティングを行い、磁石を用いて上清を新しいマイクロチューブへ回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。

【0045】

［結果］
液相化法による結合性試験のインプット力価／アウトプット力価比の値の変化をＳ−４０６ファージの結果は図６、Ｍ１３ＫＥファージの結果は図７に示す。
Ｓ−４０６ファージは、ＦＺＤ１０を結合させた磁気ビーズに強く結合しており、ＦＺＤ１０を結合させていない場合（磁気ビーズのみ）と比較すると、２２２９倍高い結合性を示した。
Ｍ１３ＫＥファージでは、ＦＺＤ１０の有無で結合性に大きな変化は無く、どれも低い値を示した。
図６に示すように、Ｓ−４０６ファージはＦＺＤ１０に特異的に結合する事が明らかとなった。
また、Ｓ−４０６ファージとＭ１３ＫＥファージのＦＺＤ１０への結合性を比較すると、Ｓ−４０６の方が９２２０倍高い事が明らかとなり、Ｓ−４０６ファージの提示するペプチドがＦＺＤ１０の結合に大きく関与している事が示唆された。
上記結果は、実施例３の固相化条件でも同様の結果が得られており、Ｓ−４０６ファージはＦＺＤ１０の構造状態に関わらず、特異的にＦＺＤ１０を認識している可能性がある。

【0046】

実施例５（アラニン置換ファージ作製）
［手順］
１．部位特異的変異誘発
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＳＭＫ−１０１、ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、Ｍ１３ＫＥファージのペプチド提示部分のアミノ酸をアラニンに置換したファージの作製を行った。提示ペプチド配列のヌクレオチド配列に所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを受託合成した（日本遺伝子研究所）。合成プライマーは、ＨＰＬＣにて精製した脱塩オリゴヌクレオチドである。今回合成したプライマーは、長さ２４〜２７ｂｐであり、ＧＣ含量が５０−６０％となるよう設計した。今回使用したＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔでは、ＰＣＲ産物のセルフライゲーションと同時にリン酸化を行うことができるので、プライマーのリン酸化はしていない。鋳型プラスミドＤＮＡはＳ−４０６ファージ感染ＥＲ２７３８菌より、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ ｋｉｔを用いて精製した。
鋳型プラスミドＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いて、［９４℃、２分］→｛［９８℃、１０秒］→［６８℃、７．５分］｝×８サイクル→［４℃、Ｈｏｌｄ］条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラー（ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ、ＴＡＫＡＲＡ）を利用した。ＰＣＲ反応条件は増幅サイズを基に設定した。
ＤｐｎＩ処理により鋳型プラスミドの消化を行ない、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ処理によりＰＣＲ産物のセルフライゲーションを行った。

【0047】

２．形質転換
６０μＬのＸＬ−１Ｂｌｕｅコンピテント細胞に対し、Ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ処理済み溶液を１０μＬ添加し、混合した。氷上、３０分間、インキュベートした後、４２℃、９０秒間、ヒートブロック上でインキュベートし、氷上で２分間、インキュベートした。１５ｍＬコニカルチューブ内で、ＥＲ２７３８菌のＯ／Ｎカルチャー１００μＬに、上記ＸＬ−Ｂｌｕｅ菌を１μＬ添加し、混合した。１５ｍＬコニカルチューブ内に、残りのＸＬ−１Ｂｌｕｅ菌を入れた。上記それぞれのサンプルに、トップアガーを４ｍＬ添加し、ボルテックスで混合した。上記大腸菌サンプルをＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上に播種し、３７℃、１６時間、インキュベートした。

【0048】

３．変異体のシークエンス解析
得られたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上の青プラークを、常法に（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｎｕａｌ，Ｃｏｌｅ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を確認した。

【0049】

［結果］
図８に示す配列番号８〜１９のアラニン置換ファージを得た。

【0050】

実施例６（アラニン置換ファージの結合性試験）
［手順］
標的タンパクｒｈＦＺＤ１０を１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μＬ添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（Ｓ−４０６ファージ又は実施例５で作製したアラニン置換ファージ）を１×１０^１０ ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを１０回洗浄した後、０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μＬ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。

【0051】

［結果］
アラニン置換ファージの結合性試験のインプット力価／アウトプット力価比の値の変化を図９に示す。
図９から分かるように、Ｓ−４０６ファージに比べ結合性が低下したファージは８種存在し、二・三・九番目のＬ（ロイシン）、四番目のＳ（セリン）、五番目のＰ（プロリン）、七番目のＥ（グルタミン酸）、八番目のＷ（トリプトファン）、十二番目のＹ（チロシン）をアラニンに置換したファージである。
特に、二・三番目のＬ、八番目のＷをアラニンで置換したファージの結合性が顕著に低下した。
上記結果より、ＦＺＤ１０との結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、二・三・九番目のＬ、四番目のＳ、五番目のＰ、七番目のＥ、八番目のＷ、十二番目のＹであることが明らかとなった。
その中でも、特にＦＺＤ１０との結合に関与していると考えられるアミノ酸は、二・三番目のＬ、八番目のＷであった。

【0052】

実施例７（競合試験）
［手順］
標的タンパクｒｈＦＺＤ１０を１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μＬ添加した。上記ウェルにＳ−４０６増幅ファージ液を１×１０^１０ＰＦＵになるように添加し、次に、Ｓ−４０６ファージ提示ペプチド（配列番号２）を人工的に合成した合成ペプチドＰｅｐ１５（純度９０％＜，ＨＰＬＣグレード，ＡｎｙＧｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を１００μＭ、１ｍＭの濃度に、ｒｈＦＺＤ１０との結合には無関係な合成ペプチドＰｅｐ２０（ＧＡＡＳＲＴＹＬＨＥＬＩ：配列番号２０）（純度９０％＜，ＨＰＬＣグレード，ＡｎｙＧｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を１ｍＭの濃度になるように添加し、ピペッティングで混合した。どちらも添加せず、Ｓ−４０６のみの反応をコントロールとした。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを１０回洗浄した。その後、０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μＬ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。

【0053】

［結果］
Ｓ−４０６ファージとＰｅｐ１５の競合試験のインプット力価／アウトプット力価比の値の変化を図１０に、Ｓ−４０６ファージとＰｅｐ２０の結果を図１１に示す。
図１０からわかるように、Ｐｅｐ１５がＳ−４０６ファージのＦＺＤ１０への結合を濃度依存的に阻害していることが明らかとなった。
図１１を見ると、Ｓ−４０６ファージのインプット力価／アウトプット力価比は、Ｐｅｐ２０を１ｍＭの濃度で添加しても高い値を保っている。
Ｐｅｐ２０は、Ｓ−４０６ファージとＦＺＤ１０の結合に全く関与しないため高濃度でもＳ−４０６ファージのインプット力価／アウトプット力価比の低下が見られなかったが、Ｓ−４０６ファージの提示するペプチド配列を持つ合成ペプチドＰｅｐ１５は、濃度依存的にＳ−４０６ファージとＦＺＤ１０の結合を阻害していることが明らかとなった。この結果から、Ｓ−４０６ファージの提示するペプチドはペプチド単体であっても、Ｓ−４０６ファージがＦＺＤ１０に結合するのと同じ部位に結合している可能性が高いと考えられる。

【0054】

実施例８（ｒｍＷｎｔ−５ａとＳ−４０６ファージの競合試験）
［手順］
標的タンパクｒｈＦＺＤ１０を１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを３００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを３回洗浄した。０．５％ＴＢＳＴで各濃度（１ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ）に希釈したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ Ｗｎｔ５ａ（ｒｍＷｎｔ５ａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μＬ又は、ＦＺＤ１０との結合に関与しないタンパクとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １（ｒｈＩＧＦ−１、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を１μＭになるように添加し、室温で１時間穏やかに振とうさせた。ここでｒｍＷｎｔ−５ａを用いたのは、ｒｈＦＺＤ１０の添付文書中においてｒｈＦＺＤ１０に対し結合性を示すことが明記されているからである。ウェルにＳ−４０６ファージ増幅液を１×１０^１０ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１５分間穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ ２００μＬでウェルを１０回洗浄した後、０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μＬ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。

【0055】

［結果］
Ｗｎｔ−５ａとＳ−４０６ファージの競合試験のインプット力価／アウトプット力価比の値の変化を図１２に、ＩＧＦ−１とＳ−４０６ファージの結果を図１３に示す。
Ｗｎｔ−５ａを添加した場合、添加濃度が増加するにつれ、Ｓ−４０６ファージのＦＺＤ１０への結合性が減少した。
一方、ＩＧＦ−１を添加した場合は、Ｓ−４０６ファージとＦＺＤ１０の結合には影響を与えなかった。
上記結果より、Ｓ−４０６ファージの結合性がＷｎｔ−５ａの添加濃度依存的に減少している事から、Ｗｎｔ−５ａがＳ−４０６ファージのＦＺＤ１０への結合を阻害している事が明らかとなった。つまり、Ｓ−４０６ファージはＷｎｔ−５ａのＦＺＤ１０への結合を阻害できるとも考えられ、Ｓ−４０６ファージの提示するペプチドはＷｎｔ−５ａの阻害剤になりうる。

【0056】

実施例９（アミノ酸置換ファージ作製）
［手順］
１．部位特異的変異誘発
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＳＭＫ−１０１、ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、Ｍ１３ＫＥファージのペプチド提示部分のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したファージ、及び、提示ペプチドのアミノ酸数個を離脱させたファージ（短鎖ペプチド提示ファージ）の作製を行った。提示ペプチド配列のヌクレオチド配列に所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを受託合成した（日本遺伝子研究所）。合成プライマーは、ＨＰＬＣにて精製した、脱塩オリゴである。今回合成したプライマーは、長さ２０〜２７ｂｐであり、ＧＣ含量が５０〜６０％程度となるよう設計した。今回使用したＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔでは、ＰＣＲ産物のセルフライゲーションと同時にリン酸化を行うことができるので、プライマーのリン酸化はしていない。以下、アラニン置換ファージ作製（実施例５）の作業手順を参照とする。

【0057】

２．形質転換
アラニン置換ファージ作製（実施例５）の作業手順を参照とする。

【0058】

３．変異体のシークエンス解析
得られたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上の青プラークを、常法に（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｎｕａｌ，Ｃｏｌｅ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。

【0059】

［結果］
図１４に示す配列番号２１〜３３のアミノ酸置換ファージを得た。

【0060】

実施例１０（アミノ酸置換ファージの結合性試験）
［手順］
標的タンパクｒｈＦＺＤ１０を１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ ２００μｌでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μｌ添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（Ｓ−４０６ファージ又は実施例９で作成したアミノ酸置換ファージ）を１×１０^１０ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ ２００μｌでウェルを１０回洗浄した後、０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μｌ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μｌ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。

【0061】

［結果］
１．アミノ酸１個置換ファージ
アミノ酸１個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図１５に示す。
Ｓ−４０６とＳ−４０６のアミノ酸１個置換ファージ群のＦＺＤ１０に対する結合性を比較したところ、Ｓ−４０６の結合性と同等あるいはそれ以上の結合性を示すファージが合計９種存在した。それらファージは、三番目のＬ（ロイシン）をＭ（メチオニン）五番目のＰ（プロリン）をＩ（イソロイシン）、Ｖ（バリン）、Ｍ（メチオニン）、Ｌ（ロイシン）、九番目のＬ（ロイシン）をＭ（メチオニン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｆ（フェニルアラニン）、十二番目のＹ（チロシン）をＦ（フェニルアラニン）に置換した場合（配列番号２１〜２９）であった。その中でも、五番目のＰをＩに置換したファージ（Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉ、配列番号２３）のＦＺＤ１０に対する結合性は、Ｓ−４０６に比べ約１０倍高い値を示した。

【0062】

上記結果より、オリジナル配列であるＳ−４０６のＦＺＤ１０に対する結合性と同等あるいはそれ以上の結合性を示すものが現れたことから、性質の似たアミノ酸で置換可能であることが示唆された。例えば、五番目のＰをＩ、Ｖ、Ｌ、Ｍで置換した場合、どのアミノ酸であっても結合性の低下は見られず、ＩおよびＶで置換したファージでは４〜１０倍高い結合性を示す事が分かっている。そこで、置換したＩ、Ｖ、Ｌ、Ｍ、全てのアミノ酸を比べてみると、どれもアルキル鎖を持ち、疎水性であり、さらに構造の類似がみらる。但し、実施例６の結果からＰをＡに置換した場合は結合性が約４０倍低くなっていることから、少なくともＶ以上の長さが必要であると考えられる。

【0063】

２．アミノ酸２個置換ファージ
アミノ酸２個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図１６に示す。
Ｓ−４０６の結合性と比較しての３倍高い結合性を示したアミノ酸２個置換ファージは、三番目のＬをＭ、五番目のＰをＩに置換したファージ（Ｓ−４０６ Ｌ３Ｍ／Ｐ５Ｉ、配列番号３０）であり、２．５倍高い結合性を示したファージは、五番目のＰをＶ、九番目のＬをＭに置換したファージ（Ｓ−４０６ Ｐ５Ｖ／Ｌ９Ｍ、配列番号３１）であり、ほぼ同等の結合性を示したファージは、三番目のＬをＭに九番目のＬをＷに置換したファージ（Ｓ−４０６ Ｌ３Ｍ／Ｌ９Ｗ、配列番号３２）であった。

【0064】

アミノ酸１個置換で結合性の変化が少なかったパターンを組み合わせ、アミノ酸２箇所を置換したファージの結合性は、１個置換の結合性結果と矛盾が無く、ＦＺＤ１０への結合性を保持していることが明らかとなった。

【0065】

３．Ｓ−４０６短鎖ペプチドファージ
Ｓ−４０６短鎖ペプチドファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図１７に示す。
二番目のＬから十二番目のＹ（Ｓ−４０６ Ｌ２−Ｙ１２、配列番号３３）の１１残基からなるペプチドを提示しているファージは、Ｓ−４０６の結合性と比較して同等の結合性を示した。

【0066】

上記結果より、Ｓ−４０６のペプチド配列の中でＦＺＤ１０に結合するために必要な部位は二番目のＬから十二番目のＹ（Ｌ２−Ｙ１２）までであることが明らかとなった。図示していないが、Ｓ−４０６ Ｌ２−Ｙ１２の配列の一部がかけているファージ（例Ｌ２−Ｌ９、Ｌ３−Ｙ１２等）では、結合性が大きく失われる結果が得られていることからも明らかである。

【0067】

実施例１１（半定量的ＲＴ−ＰＣＲ）

【0068】

［手順］
１．ｍＲＮＡ抽出
ＭＣＦ７；ヒト乳腺癌細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）、及び、ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ；ヒト滑膜肉腫細胞（理化学研究所バイオリソースセンター）を用いて、ＲＮｅａｓｅｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコルに従い、ｍＲＮＡを抽出した。今回、ゲノム由来のＤＮＡを除去する目的で、ｍＲＮＡ抽出過程において、ＲＮｅａｓｙスピンカラム上でＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＤＮａｓｅ Ｉ処理を２回実施した。また、抽出ｍＲＮＡの溶液条件において、ＤＮａｓｅ Ｉ処理を１回実施した。

【0069】

２．ｃＤＮＡ合成
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従い、ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した。

【0070】

３．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
（１）プライマー、プローブ設計
Ｈｕｍａｎ ＦＺＤ１０ ｍＲＮＡ情報（ＮＭ＃００７１９７．２）より、５’−ＴＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号３４）、５’−ＴＣＣＧＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号３５）の２つのオリゴを合成した（日本遺伝子研究所）。配列番号３４と配列番号３５で示されたプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行なうためのプローブは、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ＃７４；ＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号３６）をロシュ社より購入し、使用した。
通常、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡとの区別を行なう目的でイントロンを挟んだ部位でのプライマーを設計することが望まれるが、ＦＺＤ１０はイントロンを持たない遺伝子であるので、今回、イントロンを挟んだ部位でのプライマーは設計できなかった。
コントロールとして用いたＨｕｍａｎ β−Ａｃｔｉｎのプライマー、及び、プローブはロシュより購入した（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ， Ｈｕｍａｎ ＡＣＴＢ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ）。

【0071】

（２）コントロールプラスミド作製（ＴＡクローニング）
ＦＺＤ１０ベクター（ＦＺＤ１０／ｐＣＭＶ６−ＸＬ４）を鋳型として、購入したプライマーを利用し、ＴａｑＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲを実施した。ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、得られたＰＣＲ産物より、コントロールプラスミドベクターの作成を試みた。得られたクローンは、Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号３７）とＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号３８）を用いてシークエンス解析を実施し、確認を行なった。

【0072】

（３）リアルタイムＰＣＲ反応
ＬｉｇｔｈＣｙｃｌｅｒ^ＴＭ ４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）と各種プライマー（β−Ａｃｔｉｎ、ＦＺＤ１０）、プローブを用いて、ｃＤＮＡ変換サンプルのリアルタイムＰＣＲを実施した。検出には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^ＴＭ ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。

【0073】

［結果］
リアルタイムＰＣＲ反応により得られた結果を表２に示す。

【0074】

【表2】

【0075】

表２より、今回使用した条件では、ＦＺＤ１０に関してＨＳ−ＳＹ−ＩＩでＰＣＲ反応が進み、Ｃｐ値を得ることができた。しかし、ＭＣＦ７ではＰＣＲ反応が進まなかった。２細胞ともに、コントロールであるβ−ＡｃｔｉｎのＰＣＲ反応は進んでいることから、ＰＣＲ反応自体に問題はない。
今回、ＦＺＤ１０のｍＲＮＡ発現はＨＹ−ＳＹ−ＩＩで確認され、ＭＣＦ７ではほとんど発現していないものと予想される結果となった。

【0076】

実施例１２（結合性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ））
実施例７より、ＦＺＤ１０遺伝子発現が最も高いＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞株を標的として、Ｓ−４０６および実施例１０においてＳ−４０６よりもＦＺＤ１０に対し高い結合性を示した、五番目のＰをＩに置換したファージペプチド（Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉ）の結合性試験を実施した。

【0077】

［手順］
１．ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞
６ウェル培養プレートにＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件で一晩培養した。プレートを４℃で３０分間インキュベートした後、各ウェルの培地を除去し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ １ｍＬで２回洗浄処理を行った。Ｓ−４０６とＳ−４０６ Ｐ５Ｉファージ及び、Ｍ１３ＫＥファージを力価１×１０^１０ＰＦＵとなるように１０％ＦＢＳ培地（増殖培地）１ｍＬに希釈し、各ウェルに添加し、４℃で６０分間インキュベートした。反応後、反応液を除去し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ １ｍＬで１０回洗浄処理を行い、非結合のファージを除去した。０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で５分間インキュベートし、増殖培地を９００μＬ添加し、細胞ごと回収し回収ファージ液とした。各回収ファージ液の力価を測定した。

【0078】

［結果］
図１８に各ファージのインプット力価とアウトプット力価の比を示す。Ｓ−４０６ファージの力価比はＭ１３ＫＥファージと比較して５倍高かった。これに対し、Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉファージの力価比はＭ１３ＫＥファージに対し２５倍高かった。

【0079】

次に、ＦＺＤのリガンドタンパクであるＷｎｔタンパクを添加し、標的細胞であるＨＳ−ＳＹ−ＩＩのＷｎｔシグナル経路を活性化するような条件下で、Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉファージペプチドを用いた結合性試験を実施した。
［手順］
２．ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞（Ｗｎｔタンパクの添加有り）
６ウェル培養プレートに細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件で一晩培養した。Ｒｅｃｏｍｂｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＷＮＴ−３ａ（ｒｈＷＮＴ−３ａ、ＳｔｅｍＲＤ）を５００ｎｇ／ｍｌになるように各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２条件で一晩培養した。プレートを４℃で３０分間インキュベートした後、各ウェルの培地を除去し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ １ｍＬで２回洗浄処理を行った。Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉファージ及び、Ｍ１３ＫＥファージを力価１×１０^１０ＰＦＵとなるように１０％ＦＢＳ培地（増殖培地）１ｍＬに希釈し、各ウェルに添加し、４℃で６０分間インキュベートした。反応後、反応液を除去し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ１ｍＬで１０回洗浄処理を行い、非結合のファージを除去した。０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で５分間インキュベートし、増殖培地を９００μＬ添加し、回収ファージ液とした。各回収ファージ液の力価を測定した。

【0080】

［結果］
図１９に各ファージのインプット力価とアウトプット力価の比を示す。Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉファージの力価比はＭ１３ＫＥファージに対し６３倍高かった。

【0081】

図１８から、ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞株においても、Ｓ−４０６はペプチド非提示ファージ（Ｍ１３ＫＥ）よりも高い結合性を示し、Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉはさらに高い結合性を示す事が明らかとなり、両者ともＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞の発現するＦＺＤ１０に結合していると考えられる。
さらに、Ｓ−４０６ Ｐ５Ｉにおいては、ｒｈＷＮＴ−３ａを添加することにより、その結合性はＭ１３ＫＥよりも６３倍高い値を示した。この結果からＷｎｔ非添加条件よりも高い結合性を得られたため、ｒｈＷＮＴ−３ａ添加効果が示された。
上記は、ＦＺＤは二量化することでＷｎｔシグナル経路の活性化に関与していることが報告されていることや（非特許文献１）、ファージディスプレイで標的としたＦＺＤ１０が二量体であることから、ｒｈＷＮＴ−３ａ添加によりＷｎｔシグナル経路が活性化され、細胞が発現するＦＺＤの二量化が促された可能性が考えられる。

【0082】

実施例１３（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍａｇｉｎｇ）
［手順］
トリプルウェルガラスベースディッシュ（ウェル内径φ１１ｍｍ）にＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞を７．５×１０^４Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌ、ＭＣＦ７細胞を５×１０^４ Ｃｅｌｌｓ／Ｗｅｌｌになるように播種し、３７℃、ＣＯ_２条件下で一晩培養した。各ウェルに、ｒｈＷＮＴ−３ａが５００ｎｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃、ＣＯ_２条件下で一晩培養した。培養後のウェルの培養液を除去後、３７℃の増殖培地５０μＬで３回洗浄した。ペプチドのＮ末端にアミノカプロン酸リンカーを連結させて、連結されたリンカーの反対側にＦＩＴＣを標識したＳ−４０６ Ｐ５Ｉペプチド（Ｐｅｐ２３−Ｆ（配列番号２３）（純度８０％＜，ＨＰＬＣグレード，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓ−４０６ファージのランダム配列ペプチドＰｅｐ３９−Ｆ（ＹＬＰＬＷＲＬＳＥＳＨＭ：配列番号３９））（純度８０％＜，ＨＰＬＣグレード，ＡｎｙＧｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を増殖培地で１００μＭに調製し、５０μＬ添加して３７℃で１時間インキュベートした。ペプチド溶液を除去し、３７℃の増殖培地５０μＬで１０回洗浄し、最後に培地を５０μＬ添加した。観察は、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ２）を用い、励起光のレーザー波長は４８８ｎｍを照射し蛍光観察を行った。

【0083】

［結果］
１． ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞
図２０に、Ｐｅｐ２３−Ｆで染色し、共焦点顕微鏡で観察した結果を示す。
撮影条件は、励起光が４８８ｎｍで蛍光受光側を５００〜５３５ｎｍに設定し、対物レンズは６３倍オイルレンズ（ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ ６３ｘ ＯＩＬ、Ｌｅｉｃａ）を使用し、Ｇａｉｎ値７００Ｖｏｌｔで撮影した像である。
ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞の細胞内において、ドット状に強く染色されるている様子が観察できる。細胞質や核内部の一様な染色は見られない。
図２１に、Ｐｅｐ３９−Ｆで染色し、共焦点顕微鏡で観察した結果を示す。
撮影条件は、Ｐｅｐ２３−Ｆと同様であるが、ドット状の染色は見られず、こちらは細胞質、核内部が薄らと染色されていることが分かる。
２．ＭＣＦ７細胞
図２２、図２３に、Ｐｅｐ２３−ＦおよびＰｅｐ３９−Ｆで染色し、共焦点顕微鏡で観察した結果を示す。
どちらにも、ほとんど染色性が見られない。

【0084】

ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞でのＰｅｐ２３−ＦとＰｅｐ３９−Ｆの染色を比較すると、Ｐｅｐ２３−Ｆでのみドット状の強い染色性がみられる。
また、実施例１１においてＦＺＤ１０の遺伝子発現が見られなかったＭＣＦ７細胞の染色性は、どちらのペプチドにおいても染色性は見られなかった。
上記結果より、ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞で見られたＰｅｐ２３−Ｆによるドット状の染色は、ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞が発現するＦＺＤ１０によるものであると考えられ、Ｐｅｐ２３−Ｆは細胞が発現するＦＺＤ１０に結合していると思われる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]