特許 6156144 親和性複合体に対する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6156144

(24)【登録日】2017年6月16日

(45)【発行日】2017年7月5日

(54)【発明の名称】親和性複合体に対する抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/42 20060101AFI20170626BHJP

   C07K 16/44 20060101ALI20170626BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170626BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20170626BHJP

   C07K 16/26 20060101ALN20170626BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170626BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/42

   C07K16/44

   G01N33/53 H

   G01N33/53 N

   G01N33/531 A

   !C07K16/26

   !C12N15/00 AZNA

【請求項の数】7

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2013-534624(P2013-534624)

(86)(22)【出願日】2012年7月4日

(86)【国際出願番号】JP2012067062

(87)【国際公開番号】WO2013042426

(87)【国際公開日】20130328

【審査請求日】2015年6月23日

(31)【優先権主張番号】特願2011-206162(P2011-206162)

(32)【優先日】2011年9月21日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2012-6359(P2012-6359)

(32)【優先日】2012年1月16日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】306008724

【氏名又は名称】富士レビオ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(72)【発明者】

【氏名】小見 和也

(72)【発明者】

【氏名】安藤 豪

(72)【発明者】

【氏名】内田 好昭

(72)【発明者】

【氏名】碁石 勝利

(72)【発明者】

【氏名】岡 麻子

(72)【発明者】

【氏名】白川 貴志

(72)【発明者】

【氏名】佐久 拓弥

【審査官】 森井 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００１−１７４４６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表昭６１−５０１６５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０６６３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２３９９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０１１６４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭６３−１１２５９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０９９９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１３６９７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nucleic Acids Res. (Feb 2011) vol.39, no.3, e14

【文献】 YAKUGAKU ZASSHI (2007) vol.127, no.1, p.81-89

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

親和性複合体に対して特異的に結合し得る全長モノクローナル抗体であって、
前記全長モノクローナル抗体が、ニワトリＩｇＭの可変領域を有し、
親和性複合体が、（１）２５ＯＨビタミンＤ３および抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体、または（２）２５ＯＨビタミンＤ２および抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む、
全長モノクローナル抗体。

【請求項2】

前記全長モノクローナル抗体がニワトリＩｇＭ抗体である、請求項１記載の全長モノクローナル抗体。

【請求項3】

前記全長モノクローナル抗体がＤＴ４０細胞のニワトリＩｇＭ抗体である、請求項１または２記載の全長モノクローナル抗体。

【請求項4】

以下の結合率を示す、請求項１〜３のいずれか一項記載の全長モノクローナル抗体：
２５ＯＨビタミンＤ３および抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ−１）または２５ＯＨビタミンＤ２および抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ−２）に対する、親和性複合体ＩＩＩ−１またはＩＩＩ−２に対して特異的に結合し得る全長モノクローナル抗体（抗体ＩＩＩ）の結合率を１００％として算出した場合、１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３および該抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体または該抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ’）、あるいは１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ２および該抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体または該抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ’’）に対する抗体ＩＩＩの結合率が１０％以下である。

【請求項5】

以下を含む、２５ＯＨビタミンＤ３および／または２５ＯＨビタミンＤ２の測定用キット：
（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項記載の全長モノクローナル抗体；ならびに
（ｉｉ）抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体および／または抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか一項記載の全長モノクローナル抗体を用いて、親和性複合体を測定することを含む、親和性複合体の測定方法。

【請求項7】

親和性複合体がサンドイッチ法により測定される、請求項６記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、親和性複合体に対する抗体、および親和性複合体に対する抗体を用いた、親和性複合体を構成する因子のアッセイ等に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、ホルモン、医薬、ペプチドといった低分子物質の免疫測定法を利用した定量が、頻繁に行われている。測定対象物質が低分子物質である場合、競合阻害法と呼ばれる定量法が利用される。

【0003】

競合阻害法の測定感度は、使用する抗体の抗原に対する親和性に依存するが、一般的に、低分子物質に対する抗体を作製した場合には、高親和性の抗体が得られにくいことが知られている。また、競合阻害法では、１種類の抗体の反応性に基づきその特異性が発揮されるため、高特異性の抗体を獲得する必要があるが、このような抗体を獲得するためには困難が伴う。つまり、競合阻害法による測定に際しては、測定の感度および特異性を満たす抗体の選択のために多大な労力を要する。また、運良く抗体を選択できた場合でも、競合阻害法は、測定対象物質が低濃度および高濃度の場合に、測定精度および測定感度が低い、サンプルと標識抗原との競合条件決定が煩雑といった欠点がある。

【0004】

競合阻害法における上記欠点は、抗原の異なるエピトープを認識する２種の抗体を用いて測定するサンドイッチ法により解消できる。しかし、低分子物質の場合、エピトープは１ヶ所しか存在せず、２種の抗体間で立体障害が生じるため、一般的なサンドイッチ法を利用して低分子物質を定量することは困難であるとされてきた。

【0005】

低分子物質をサンドイッチ法で測定するための方法としては、抗原抗体複合体を認識する抗体を用いる測定法が報告されている。抗体の作製方法としては、動物を用いるｉｎ ｖｉｖｏ法（例、ハイブリドーマ法）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ法（例、ファージディスプレイ法）が知られている。例えば、非特許文献１には、マウス免疫法により、低分子ハプテン（Δ９−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ：ＭＷ３１４．５）−抗体複合体抗体の取得に成功したこと、ならびに、５回の融合実験を実施により、約２００クローンの抗マウス抗体（イディオタイプ）抗体が樹立されたが、複合体認識抗体はわずか１クローンであったことが記載されている。

【0006】

なお、サンドイッチ法による低分子物質の測定方法について、特許文献１、２、非特許文献１〜４に開示される方法が知られている。また、抗体および抗体産生細胞の作製技術について、特許文献３に開示される方法が知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００８／１２５７３３号

【特許文献2】特開２００１−１７４４６０号公報

【特許文献3】国際公開第２００４／０１１６４４号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｕｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，１１８４−８９（１９９３）

【非特許文献2】Ｔａｍｍら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（９），１５１１−１５１８（２００８）

【非特許文献3】Ｏｇｕｒｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２５（２５），７６０８−７６１２（２００３）

【非特許文献4】Ｓｅｌｆら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（１１），２０３５−２０４１（１９９４）

【非特許文献5】Ｒｏｓｓｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８２，８８３８−８８４３（２０１０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、低分子物質等の物質をサンドイッチ法で高感度かつ特異的に測定することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、鋭意検討した結果、親和性複合体（例、低分子物質およびそれに対する抗体を含む複合体）と所定の方法とを組み合せて用いることにより、親和性複合体に特異的に結合し得る良質な抗体を得ること、ならびに、このような抗体を用いて、親和性複合体を構成する因子（例、低分子物質等の物質）をサンドイッチ法で高感度かつ特異的に測定することに成功し、本願発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体。
〔２〕前記抗体が全長抗体である、〔１〕の抗体。
〔３〕前記抗体が、遺伝子変換の能力を有する動物のイムノグロブリンに由来する領域を有する、〔１〕の抗体。
〔４〕遺伝子変換の能力を有する動物のイムノグロブリンに由来する領域が、相補性決定領域、枠組み領域、または可変領域である、〔３〕の抗体。
〔５〕親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子が低分子物質である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの抗体。
〔６〕親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子がタンパク質である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの抗体。
〔７〕親和性複合体が、低分子物質およびそれに対する抗体を含む複合体である、〔１〕〜〔６〕のいずれかの抗体。
〔８〕低分子物質が、（ａ）ステロイド化合物、（ｂ）アミノ酸化合物、または（ｃ）ビタミンである、〔７〕の抗体。
〔９〕以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、〔８〕の抗体：
（ａ）ステロイド化合物が卵胞ホルモンである；
（ｂ）アミノ酸化合物が甲状腺ホルモンである；または
（ｃ）ビタミンがビタミンＤである。
〔１０〕以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、〔９〕の抗体：
（ａ）卵胞ホルモンがエストラジオールである；
（ｂ）甲状腺ホルモンがトリヨードチロニンである；または
（ｃ）ビタミンＤが２５ＯＨビタミンＤ３または２５ＯＨビタミンＤ２である。
〔１１〕以下（ａ）〜（ｃ）の結合率を示す、〔１０〕の抗体：
（ａ）エストラジオールおよび抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ）に対する、親和性複合体Ｉに対して特異的に結合し得る抗体（抗体Ｉ）の結合率を１００％として算出した場合、エストロンおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’）、エストリオールおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’）、エストラジオール抱合体および該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’’）、エストラムスチンおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’’’）、またはエストロムスチンおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’’’’）に対する抗体Ｉの結合率が１０％以下である；
（ｂ）トリヨードチロニンおよび抗トリヨードチロニン抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩ）に対する、親和性複合体ＩＩに対して特異的に結合し得る抗体（抗体ＩＩ）の結合率を１００％として算出した場合、ジヨードチロニンおよび該抗トリヨードチロニン抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩ’）、またはチロキシンおよび該抗トリヨードチロニン抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩ’’）に対する抗体ＩＩの結合率が１０％以下である；あるいは
（ｃ）２５ＯＨビタミンＤ３および抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ−１）または２５ＯＨビタミンＤ２および抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ−２）に対する、親和性複合体ＩＩＩ−１またはＩＩＩ−２に対して特異的に結合し得る抗体（抗体ＩＩＩ）の結合率を１００％として算出した場合、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３および該抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体または該抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ’）、あるいは１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２および該抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体または該抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ’’）に対する抗体ＩＩＩの結合率が１０％以下である。
〔１２〕親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を培養して、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を得ることを含む方法により作製される、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの抗体。
〔１３〕以下を含む、セット：
（ｉ）親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体；および
（ｉｉ）親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子。
〔１４〕下記である、〔１３〕のセット：
（ｉ’）低分子物質またはタンパク質、およびそれに対する抗体を含む親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体；ならびに
（ｉｉ’）低分子物質またはタンパク質に対して特異的に結合し得る抗体。
〔１５〕親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を用いて、親和性複合体を測定することを含む、親和性複合体の測定方法。
〔１６〕親和性複合体がサンドイッチ法により測定される、〔１５〕の方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明により、抗原（例、低分子物質）抗体複合体等の親和性複合体に特異的に結合し得る抗体が提供される。
本発明により、競合阻害法で従来測定していた低分子物質を、サンドイッチ法で測定することができる。サンドイッチ法での測定により、測定感度の上昇、特異性の向上、測定精度の改善、測定系構築の迅速化などが期待できる。また、抗体取得の操作が簡便であるため、操作の自動化による低コスト化、迅速化が容易である。
本発明はまた、低分子物質の測定のみならず、低分子物質以外の因子の測定、および所定の因子を治療標的とする医薬の開発に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、本発明の方法により得られた細胞クローン（Ｎｏ．１〜４３）を示す図である。２種の細胞クローンが、抗原抗体複合体（エストロゲンおよび抗エストロゲン抗体を含む親和性複合体）に対して特異的に結合し得る抗体を産生した。

【図2】図２は、本発明の方法により得られた細胞クローン（Ｎｏ．４４〜８８）を示す図である。１種の細胞クローンが、抗原抗体複合体（エストロゲンおよび抗エストロゲン抗体を含む親和性複合体）に対して特異的に結合し得る抗体を産生した。

【図3】図３は、本発明の方法により得られた細胞クローン（Ｎｏ．１〜５６）を示す図である。１種の細胞クローンが、抗原抗体複合体（Ｔ３および抗Ｔ３抗体を含む親和性複合体）に対して特異的に結合し得る抗体を産生した。

【図4】図４は、本発明の方法により得られた細胞クローン（Ｎｏ．５７〜１４４）を示す図である。５種の細胞クローンが、抗原抗体複合体（Ｔ３および抗Ｔ３抗体を含む親和性複合体）に対して特異的に結合し得る抗体を産生した。

【図5】図５は、本発明の抗体を用いた測定におけるＴ３に対する感度を示す図である。

【図6】図６は、本発明の方法により得られた細胞クローン（Ｎｏ．１〜８６）を示す図である。４種の細胞クローンが、抗原抗体複合体（２５ＯＨビタミンＤ３および抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を含む親和性複合体）に対して特異的に結合し得る抗体を産生した。

【図7】図７は、本発明の方法により得られた細胞クローン（Ｎｏ．８７〜１７４）を示す図である。２種の細胞クローンが、抗原抗体複合体（２５ＯＨビタミンＤ３および抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を含む親和性複合体）に対して特異的に結合し得る抗体を産生した。

【図8】図８は、本発明の抗体を用いた測定における２５ＯＨビタミンＤ３に対する感度を示す図である。

【図9】図９は、競合系による固相抗体（一次抗体：抗Ｅ２抗体）の特異性の評価を示す図である。

【図10】図１０は、サンドイッチ法によるＥ２測定における特異性の改善を示す図である。

【図11】図１１は、競合系による固相抗体（一次抗体：抗２５（ＯＨ）ビタミンＤ２抗体）の特異性の評価を示す図である。

【図12】図１２は、サンドイッチ法による抗２５（ＯＨ）ビタミンＤ２およびＤ３測定における特異性の改善を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

（１．抗体）
本発明は、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を提供する。

【0015】

用語「親和性複合体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、２以上の因子の会合または凝集（即ち、非共有結合）により形成される複合体をいう。一方、親和性複合体と異なる複合体としては、共有結合性複合体が挙げられる。用語「共有結合性複合体（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、２以上の因子の共有結合により形成される複合体をいう。このような共有結合性複合体としては、例えば、免疫原性のない低分子物質（即ち、ハプテン）と、キャリア（例、ＢＳＡ、ＫＬＨ等のタンパク質）とが、共有結合を介して結合したコンジュゲ−ト（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が挙げられる。換言すれば、共有結合性複合体は、免疫原性のない低分子物質（即ち、ハプテン）に対する免疫を動物において惹起し、それにより、低分子物質に対する抗体を取得するために、従来から動物に投与されている、免疫されるべき複合体（即ち、免疫複合体）であり得る。従来は、このような共有結合性複合体を用いて、低分子物質に対する抗体が作製されていたが、副産物として、共有結合性複合体に対して特異的に結合し得る抗体（共有結合部分周辺を認識する抗体）も得られていたと考えられる。しかしながら、このようなコンジュゲートを抗原として用いることにより作製された、共有結合性複合体に対する抗体は、親和性複合体そのものを抗原として用いることにより作製された本発明の抗体と、異なる。この理由は、例えば、共有結合部分の人為的な導入により作製された共有結合性複合体の立体構造は、共有結合部分の存在および位置により、ならびに共有結合部分の導入に起因する立体構造（例、フォールディングおよび／またはコンホメーション）の潜在的な変化等により、自然な会合（即ち、非共有結合）により形成される親和性複合体のものと異なるためである。

【0016】

親和性複合体は、同種の因子が会合または凝集したホモ複合体、または異種の因子が会合または凝集したヘテロ複合体である。親和性複合体はまた、天然に生じる親和性複合体、または天然に生じ得ない、人為的に作製された親和性複合体であってもよい。天然に生じる親和性複合体としては、例えば、ウイルスまたは生物（例、微生物、昆虫、植物、動物）において見出される親和性複合体、および環境中に存在し得る親和性複合体が挙げられる。親和性複合体はさらに、多量体（例、二量体、三量体、四量体）である。親和性複合体を構成する因子としては、例えば、タンパク質、低分子物質、糖、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、金属ならびにそれらの誘導体が挙げられる。

【0017】

親和性複合体を構成する因子は、好ましくは、タンパク質であってもよい。このようなタンパク質としては、親和的結合の能力を有するタンパク質、凝集能を有するタンパク質が挙げられる。親和的結合の能力を有するタンパク質としては、例えば、リガンド依存性タンパク質〔例、Ｇタンパク質共役型レセプター等の細胞膜上レセプター、ならびに可溶性レセプター（例、免疫グロブリン、細胞膜上レセプターから切断された細胞外ドメイン）、および核内レセプター〕、核酸結合タンパク質（例、転写因子、核酸の保護または輸送タンパク質）、タンパク質複合体を形成するタンパク質（例、アダプタータンパク質）、細胞外マトリクスタンパク質（例、細胞間接着タンパク質）、酵素〔例、チロシンキナーゼ（レセプターまたは非レセプター）、セリン／スレオニンキナーゼ等のキナーゼ〕、糖タンパク質が挙げられる。凝集能を有するタンパク質としては、例えば、変性タンパク質、病原性タンパク質（例、βアミロイド等の神経変性タンパク質）が挙げられる。

【0018】

親和性複合体を構成する因子であるタンパク質は、好ましくは、抗体であってもよい。親和性複合体を構成する抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよい。このような抗体はまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（例、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体）であってもよい。親和性複合体を構成する抗体は、自己抗原に対する抗体であってもよい。このような抗体はまた、後述するような全長抗体、または抗体断片であってもよい。抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体が挙げられる。

【0019】

親和性複合体を構成する因子はまた、好ましくは、低分子物質であってもよい。用語「低分子物質（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」とは、分子量１，５００未満の化合物をいう。低分子物質は、天然物質または合成物質である。低分子物質の分子量は、１，２００未満、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満または３００未満であってもよい。低分子物質の分子量はまた、５０以上、１００以上、１５０以上または２００以上であってもよい。低分子物質としては、例えば、リガンド、ホルモン、脂質、脂肪酸、ビタミン、オピオイド、神経伝達物質（例、カテコールアミン）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、およびオリゴペプチド、あるいは医薬、毒物、および代謝産物が挙げられる。ホルモンとしては、例えば、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ペプチドホルモンが挙げられる。

【0020】

一実施形態では、低分子物質は、ステロイド化合物であってもよい。ステロイド化合物とは、ステロイド骨格（シクロペンタノペルヒドロフェナントレン骨格）を有する化合物をいう。ステロイド化合物としては、ステロイドホルモン、およびステロイド骨格を保持するその誘導体（例、タンパク質同化ステロイド、抗男性ホルモン剤および抗卵胞ホルモン剤等の合成ステロイド）が挙げられる。ステロイドホルモンとしては、例えば、男性ホルモン、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、コルチコイド（例、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド）が挙げられるが、卵胞ホルモンが好ましい。卵胞ホルモンとしては、例えば、エストロン、エストラジオール、エストリオールが挙げられる。低分子物質はまた、ステロイド化合物の代謝産物であってもよい。ステロイド化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなステロイド化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および抱合体が挙げられる。抱合体としては、例えば、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体（例、エストラジオールの３位もしくは１７位のいずれかのヒドロキシル基、または３位および１７位の双方のヒドロキシル基に硫酸基が抱合された化合物）、グルタチオン抱合体、アセチル抱合体、アミノ酸抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、ステロイド化合物類似治療用薬物（例、エストラムスチン）またはその代謝産物（例、エストロムスチン）であってもよい。

【0021】

【化1】

【0022】

別の実施形態では、低分子物質は、アミノ酸化合物であってもよい。アミノ酸化合物とは、アミノ基およびカルボキシル基を有する化合物をいう。アミノ酸化合物としては、例えば、α−アミノ酸（例、グリシン、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン、シトルリン）、β−アミノ酸（例、β−アラニン）、γ−アミノ酸（例、γ-アミノ酪酸）、ならびに、アミノ基およびカルボキシル基を保持するそれらの誘導体が挙げられる。アミノ酸化合物は、Ｌ体またはＤ体であってもよい。低分子物質はまた、アミノ酸化合物の代謝産物であってもよい。アミノ酸化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなアミノ酸化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、アミノ酸化合物類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。

【0023】

好ましくは、アミノ酸化合物は、式（Ｉ）：Ｒ−ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨで表される化合物であってもよい。Ｒとしては、以下が挙げられる：
（ｉ）炭化水素基；
（ｉｉ）アリール基；
（ｉｉｉ）炭化水素−アリール基；
（ｉｖ）アリール−炭化水素基；
（ｖ）炭化水素オキシ−炭化水素基、アリールオキシ−炭化水素基、炭化水素オキシ−アリール基、またはアリールオキシ−アリール基；
（ｖｉ）炭化水素チオ−炭化水素基、アリールチオ−炭化水素基、炭化水素チオ−アリール基、またはアリールチオ−アリール基；
（ｖｉｉ）モノまたはジ（炭化水素）アミノ−炭化水素基、モノまたはジ（アリール）アミノ−炭化水素基、モノまたはジ（炭化水素）アミノ−アリール基、あるいはモノまたはジ（アリール）アミノ−アリール基。

【0024】

炭化水素基は、直鎖、分岐鎖または環状の非芳香族炭化水素基であり、その炭素原子数は、例えば１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜９個、特に好ましくは１〜６個である。このような炭化水素基としては、例えば、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル）、アルケニル基（例、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、５−ヘキセニル）、アルキニル基（例、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル）、シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル）が挙げられる。炭化水素も、炭化水素基と同様である。

【0025】

アリール基は、芳香族炭化水素基であり、その炭素原子数は、例えば１〜１４個である。アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、ビフェニル基が挙げられる。アリールも、アリール基と同様である。

【0026】

Ｒは、１〜８個、好ましくは１〜６個の置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、シアノ基、ニトロ基、オキソ基、イミド基、カルボキシル基、アミド基、スルホニル基、ニトロ基、ホルミル基、炭素原子数１〜６の炭化水素基が挙げられる。

【0027】

より好ましくは、式（Ｉ）で表される化合物は、式（ＩＩ）：Ｒ^１−Ｘ−Ｒ^２−ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨで表される化合物であってもよい。Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、上述した炭化水素基または上述したアリール基を示し、好ましくは上述したシクロアルキル基または上述したアリール基を示し、特に好ましくは上述したアリール基を示す。−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−または結合手を示し、好ましくは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を示し、より好ましくは−Ｏ−または−Ｓ−を示し、特に好ましくは−Ｏ−を示す。Ｒ^１は、１〜４個、好ましくは１〜３個の置換基を有していてもよい。Ｒ^２は、１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個の置換基を有していてもよい。Ｒ^１およびＲ^２についての置換基は、Ｒについて上述したものと同様である。

【0028】

さらにより好ましくは、式（ＩＩ）で表される化合物は、以下に示すように、チロシンから生合成されるチロシン誘導体であってもよい。チロシン誘導体としては、甲状腺ホルモン（例、トリヨードチロニン、チロキシン）が挙げられる。チロシン誘導体はまた、甲状腺ホルモンの代謝産物であってもよい。甲状腺ホルモンの代謝産物としては、例えば、甲状腺ホルモンにヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、甲状腺ホルモン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。

【0029】

【化2】

【0030】

さらに別の実施形態では、低分子物質は、ビタミンであってもよい。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋが挙げられる。好ましくは、ビタミンは、脂溶性ビタミン（例、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ）であり、より好ましくは、以下に示すようなビタミンＤである。低分子物質はまた、ビタミンの代謝産物であってもよい。ビタミンの代謝産物としては、例えば、上述したようなビタミンにヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、ビタミン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。

【0031】

【化3】

【0032】

親和性複合体は、上述したような２以上の因子を含む複合体である。具体的には、親和性複合体としては、低分子物質およびタンパク質（例、抗体）を含む複合体、２以上のタンパク質を含むタンパク質複合体、タンパク質および核酸を含む複合体、タンパク質および金属を含む金属要求性タンパク質複合体、タンパク質凝集体、相補的な２以上の核酸を含む核酸複合体（例、二重鎖、三重鎖）、金属錯体が挙げられる。

【0033】

親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を効率的に作製するという観点からは、親和性複合体は、親和性複合体を構成する因子間で強い結合親和性を有するものが好ましい。したがって、抗体の効率的作製の観点から、親和性複合体は、親和性複合体を構成する因子間の結合親和性により特定されてもよい。好ましい結合親和性としては、１０^−５Ｍ未満、５×１０^−５Ｍ未満、１０^−６Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、５×１０^−１１Ｍ未満または１０^−１１Ｍ未満の解離定数（即ち、Ｋｄ）を有する親和性が挙げられる。解離定数はまた、１０^−１５Ｍ以上、５×１０^−１５Ｍ以上、１０^−１４Ｍ以上、５×１０^−１４Ｍ以上、１０^−１３Ｍ以上、５×１０^−１３Ｍ以上、１０^−１２Ｍ以上、５×１０^−１２Ｍ以上、１０^−１１Ｍ以上、５×１０^−１１Ｍ以上、１０^−１０Ｍ以上または５×１０^−１０Ｍ以上であってもよい。なお、親和性複合体を構成する因子間の結合親和性が低い場合であっても、溶液中の因子の濃度を増加させることにより、親和性複合体の形成を促進することができるため、抗体を効率的に作製できる。したがって、親和性複合体を構成する因子間の結合親和性は、必ずしも重要ではない。

【0034】

表現「親和性複合体に対して特異的に結合し得る〔ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎ（ｔｈｅ） ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ〕」とは、親和性複合体に対して、親和性複合体を構成する各因子よりも、優先的に結合する能力を有することをいう。例えば、本発明の抗体は、親和性複合体に結合する能力を有し、かつ親和性複合体を構成する各因子に結合する能力を実質的に有し得ない。したがって、本発明の抗体は、親和性複合体を構成する各因子（例、低分子物質、タンパク質）またはその類似因子（例、低分子物質のアナログ、ホモログタンパク質）に対する交差反応性により特定されてもよい。例えば、目的の親和性複合体に対する本発明の抗体の結合率を１００％として算出した場合、親和性複合体を構成する各因子またはその類似因子、あるいは類似因子を含む親和性複合体（類似親和性複合体）に対する本発明の抗体の結合率は、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％、０．１％、または０．０５％以下であってもよい。

【0035】

例えば、本発明の抗体は、以下（ａ）〜（ｃ）の結合率を示すものであってもよい：
（ａ）エストラジオールおよび抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ）に対する、親和性複合体Ｉに対して特異的に結合し得る抗体（抗体Ｉ）の結合率を１００％として算出した場合、エストロンおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’）、エストリオールおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’）、エストラジオール抱合体および該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’’）、エストラムスチンおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’’’）、またはエストロムスチンおよび該抗エストラジオール抗体を含む親和性複合体（親和性複合体Ｉ’’’’’）に対する抗体Ｉの結合率が上記値以下である；
（ｂ）トリヨードチロニンおよび抗トリヨードチロニン抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩ）に対する、親和性複合体ＩＩに対して特異的に結合し得る抗体（抗体ＩＩ）の結合率を１００％として算出した場合、ジヨードチロニンおよび該抗トリヨードチロニン抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩ’）、またはチロキシンおよび該抗トリヨードチロニン抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩ’’）に対する抗体ＩＩの結合率が上記値以下である；あるいは
（ｃ）２５ＯＨビタミンＤ３および抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ−１）または２５ＯＨビタミンＤ２および抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ−２）に対する、親和性複合体ＩＩＩ−１またはＩＩＩ−２に対して特異的に結合し得る抗体（抗体ＩＩＩ）の結合率を１００％として算出した場合、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３および該抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体または該抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ’）、あるいは１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２および該抗２５ＯＨビタミンＤ３抗体または該抗２５ＯＨビタミンＤ２抗体を含む親和性複合体（親和性複合体ＩＩＩ’’）に対する抗体ＩＩＩの結合率が上記値以下である。

【0036】

親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体はまた、親和性複合体に対して、共有結合性複合体（共有結合性複合体を構成する各因子は、親和性複合体を構成する各因子と同一である）よりも、優先的に結合する能力を有し得る。本発明の抗体は親和性複合体そのものを抗原として用いて作製されたものであることから、本発明の抗体は、共有結合性複合体よりも、親和性複合体に対して、特異的に結合し得る。したがって、本発明の抗体は、親和性複合体に対する結合親和性により特定されてもよい。親和性複合体に対する本発明の抗体の結合親和性としては、１０^−５Ｍ未満、５×１０^−５Ｍ未満、１０^−６Ｍ未満、５×１０^−７Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、５×１０^−８Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、５×１０^−９Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、５×１０^−１０Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、５×１０^−１１Ｍ未満または１０^−１１Ｍ未満の解離定数（即ち、Ｋｄ）を有する親和性が挙げられる。親和性複合体に対する本発明の抗体の解離定数はまた、１０^−１５Ｍ以上、５×１０^−１５Ｍ以上、１０^−１４Ｍ以上、５×１０^−１４Ｍ以上、１０^−１３Ｍ以上、５×１０^−１３Ｍ以上、１０^−１２Ｍ以上、５×１０^−１２Ｍ以上、１０^−１１Ｍ以上、５×１０^−１１Ｍ以上、１０^−１０Ｍ以上、５×１０^−１０Ｍ以上、１０^−９Ｍ以上または５×１０^−９Ｍ以上であってもよい。

【0037】

本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり得る。本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよいが、例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭである。

【0038】

本発明の抗体は、遺伝子変換の能力を有する動物のイムノグロブリンに由来する領域（例、可変領域、相補性決定領域、枠組み領域、定常領域）を有していてもよい。遺伝子変換の能力を有する動物のイムノグロブリンに由来する領域としては、例えば、可変領域（ＶＲ）および定常領域（ＣＲ）、ならびにＶＲ中に見出される相補性決定領域（ＣＤＲ）および枠組み領域（ＦＲ）が挙げられる。ＶＲとしては、例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）軽鎖可変領域（ＶＬ）が挙げられる。ＣＲとしては、例えば、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含むＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）が挙げられる。

【0039】

用語「遺伝子変換（ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」とは、Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成を受けた可変領域遺伝子が、Ｖ遺伝子上流に存在する偽遺伝子に置換されることをいう。ニワトリ等の鳥類、ウシ、ヒツジ、ウサギ等の哺乳動物などの動物（遺伝子変換の能力を有する動物）では、抗体産生細胞における抗体遺伝子の可変領域は、部位特異的組換えであるＶ（Ｄ）Ｊ再編成、および相同組換えの一種である遺伝子変換の双方によって多様化され得る。一方、ヒト、マウス等の哺乳動物（遺伝子変換の能力を有しない動物）では、抗体産生細胞における抗体遺伝子の可変領域は、Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成によって多様化されるものの、遺伝子変換によっては多様化され得ない。後述するような本発明の抗体の作製方法では、多様性に富む抗体産生細胞の集団（即ち、多様な抗体を産生する能力を有する多様な抗体産生細胞の集団）が好ましく使用されることから、このような抗体産生細胞により産生される本発明の抗体は、遺伝子変換の能力を有する動物のイムノグロブリンに由来する領域を有し得る。
本明細書中以降、遺伝子変換の能力を有する動物を、動物Ｘと省略することがある。また、遺伝子変換の能力を有しない動物を、動物Ｙと省略することがある。

【0040】

本発明者らが把握している限り、動物Ｘでは、複合体（特に、親和性複合体）に対する抗体は、人為的に作製されていないようである。したがって、動物Ｘのイムノグロブリンに由来する領域を有する本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで作製される従来の抗体に対して新規であると考えられる。

【0041】

本発明の抗体は、動物Ｘのイムノグロブリンに由来する第１の領域（例、ＶＲ、ＣＲ、ＣＤＲ、ＦＲ）、および／または動物Ｙのイムノグロブリンに由来する第２の領域（例、ＶＲ、ＣＲ、ＣＤＲ、ＦＲ）を有していてもよい。例えば、本発明の抗体は、動物Ｘのイムノグロブリンに由来する第１の領域として、ＣＤＲ、ＦＲ、またはＣＤＲおよびＦＲの双方を含むＶＲを有し、かつ、動物Ｙのイムノグロブリンに由来する第２の領域として、ＣＲ、ＦＲ、またはＣＲおよびＦＲの双方を有していてもよい。このような抗体は、後述する抗体等に対応し得る。
好ましくは、本発明の抗体は、（Ｉ）（ａ）動物Ｘのイムノグロブリン（例、ＩｇＭ）に由来する第１の領域（例、ＶＲ、ＣＤＲ、ＦＲ）、および動物Ｙのイムノグロブリン（例、ＩｇＧ）に由来する第２の領域（例、ＣＲ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する重鎖、ならびに（ｂ）動物Ｘのイムノグロブリン（例、ＩｇＭ）に由来する第１の領域（例、ＶＲ、ＣＤＲ、ＦＲ）、および動物Ｙのイムノグロブリン（例、ＩｇＧ）に由来する第２の領域（例、ＣＲ）を有する軽鎖（例、λ鎖、κ鎖、ならびにλ鎖およびκ鎖のキメラ鎖）、あるいは（ＩＩ）（ａ）動物Ｘのイムノグロブリン（例、ＩｇＭ）に由来する第１の領域（例、ＶＲ、ＣＤＲ、ＦＲ、ＣＲ、ＣＨ１）、および動物Ｙのイムノグロブリン（例、ＩｇＧ）に由来する第２の領域（例、ＣＲ、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する重鎖、ならびに（ｂ）動物Ｘのイムノグロブリン（例、ＩｇＭ）に由来するＶＲおよびＣＲを有する軽鎖（例、λ鎖、κ鎖）を有していてもよい。
より好ましくは、本発明の抗体は、（Ｉ’）（ａ’）ニワトリＩｇＭに由来するＶＲ、および動物Ｙ（例、マウス、ヒト）ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１）に由来するＣＲ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有する重鎖、ならびに（ｂ’）ニワトリＩｇＭに由来するＶＲ、および動物Ｙ（例、マウス、ヒト）ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１）に由来するＣＲを有する軽鎖（例、λ鎖、κ鎖、ならびにλ鎖およびκ鎖のキメラ鎖）、あるいは（ＩＩ’）（ａ’）ニワトリＩｇＭに由来するＶＲおよびＣＨ１、および動物Ｙ（例、マウス、ヒト）のＩｇＧ（例、ＩｇＧ１）に由来するＣＨ２およびＣＨ３を有する重鎖、ならびに（ｂ’）ニワトリＩｇＭに由来するＶＲおよびＣＲを有する軽鎖（例、λ鎖、κ鎖）を有していてもよい。
上述した動物のイムノグロブリン遺伝子のヌクレオチド配列が知られているため、当業者は、遺伝子工学的な手法を用いることにより、このような抗体を適宜作製することができる（例、実施例５、６を参照）。（Ｉ）および（Ｉ’）の抗体は、後述するキメラＩ型抗体に対応し得る。（ＩＩ）および（ＩＩ’）の抗体は、後述するキメラＩＩ型抗体に対応し得る。

【0042】

本発明の抗体は、全長抗体であってもよい。用語「全長抗体」とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。本発明の抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、本発明の全長抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖが挙げられる。

【0043】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製される従来の抗体は、慣行的には、いわゆる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、定常領域を有し得ない。したがって、本発明の全長抗体またはその抗体断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製される従来の抗体に対して新規であると考えられる。なお、単鎖抗体を全長抗体に改変する場合、一般論として、抗原に対する結合力および／または特異性は、喪失または著しく低下することが知られている。したがって、本発明の全長抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製される従来の単鎖抗体、およびそれから誘導される可能性がある全長抗体に対して優れる。なお、後述する本発明の方法は、全長抗体が取得できる、短期間（数日）で、多様な抗体産生細胞の集団（抗体のライブラリ）を調製できる、ならびに１回のスクリーニング操作で真の陽性クローンを取得できる（おそらく、アッセイに用いられる抗体産生細胞（例、ＤＴ４０細胞）の大きさに起因して、非特異的反応が抑制され得るため）等の利点がある。

【0044】

本発明の抗体はまた、親和性複合体の表面上に露出している部分に対して特異的に結合し得る抗体（即ち、複合体に対する中和抗体）であり得る。後述するような本発明の方法によれば、このような抗体を作製できる。例えば、親和性複合体が、生体内でヘテロ多量体（例、３種のタンパク質によるヘテロ３量体）を形成して作用を示すものである場合、ヘテロ多量体のうち互いに会合する２量体（親和性複合体）に対して特異的に結合し得る抗体を用いることにより、ヘテロ多量体の形成により媒介される生物学的シグナルの発生を妨げることができる。

【0045】

本発明の抗体はまた、免疫原性の親和性複合体、または免疫原性のない親和性複合体（即ち、ハプテン）に対して特異的に結合し得る抗体であり得る。免疫原性とは、動物における抗体応答を誘発する能力をいう。後述するような本発明の方法によれば、免疫原性の親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体のみならず、免疫原性のない親和性複合体（即ち、ハプテン）に対して特異的に結合し得る抗体もまた、作製できる。本発明の方法は、多様な抗体産生細胞の集団（多様な抗体のライブラリと同義）から、親和性複合体に対して結合し得る抗体を産生している抗体産生細胞を得るものである。したがって、親和性複合体自体に免疫原性がない場合であっても、親和性複合体に対して結合し得る抗体を産生している抗体産生細胞を得ることができる。

【0046】

本発明の抗体はまた、任意の動物に由来する因子を含む複合体に対して特異的に結合し得る抗体であり得る。後述するような本発明の方法によれば、親和性複合体を構成する因子の一部または全部が任意の動物に由来する場合であっても、このような親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を作製できる。動物を用いる従来の方法では、同種の動物に由来する因子に対する免疫応答を誘導し得ないため（例、抗原およびそれに対するマウス抗体を含む複合体を、マウスに免疫する場合）、このような因子に対する抗体を作製し得ない。しかしながら、本発明の方法によれば、任意の動物に由来する因子を含む複合体に対して特異的に結合し得る抗体を作製できる。

【0047】

本発明の抗体はまた、親和性複合体における因子間の会合部分、および／または、会合により引き起こされる、因子の変化した立体構造（例、フォールディングおよび／またはコンホメーション）を特異的に認識することにより、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体であり得る。

【0048】

本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。

【0049】

キメラ抗体とは、ＶＲおよびＣＲが互いに異なる動物種のイムノグロブリンに由来するモノクローナル抗体を意味する。例えば、キメラ抗体は、動物Ｘ（例、ニワトリ）のイムノグロブリンに由来するＶＲ、かつ、動物Ｙ（例、ヒト）のイムノグロブリンに由来するＣＲを有するキメラ（動物Ｘ／動物Ｙ）抗体であり得る。動物Ｙのイムノグロブリン由来のＣＲは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＹ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有する。本発明のキメラ抗体のＣＲは、いずれのアイソタイプに属していてもよい。

【0050】

キメラ抗体は、自体公知の方法により作製できる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照）。具体的には、キメラ抗体は、以下のとおり作製できる。先ず、動物Ｘに由来する抗体産生細胞から単離した動物Ｘモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得したＶ_Ｈ遺伝子（Ｈ鎖ＶＲをコードするＶＤＪ遺伝子）の下流に、動物ＹイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣ_Ｈ遺伝子（Ｈ鎖ＣＲをコードするＣ遺伝子）を連結し、動物Ｘに由来する抗体産生細胞から単離した動物Ｘモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得したＶ_Ｌ遺伝子（Ｌ鎖ＶＲをコードするＶＪ遺伝子）の下流に動物ＹイムノグロムリンをコードするＤＮＡから取得したＣ_Ｌ遺伝子（Ｌ鎖ＣＲをコードするＣ遺伝子）を連結する。次いで、これらの連結物を、各々発現可能なように１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養することにより作製することができる（例、実施例５、６を参照）。本発明はまた、本発明の抗体を、キメラ抗体に変換することを含む、キメラ抗体の作製方法を提供する。

【0051】

ヒト化抗体とは、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、例えば、ＣＤＲの一部又は全部が動物Ｘ（例、ニワトリ）モノクローナル抗体に由来し、ＦＲおよびＣＲがヒトイムノグロブリンに由来するモノクローナル抗体を意味する。ＣＤＲは、抗体のＶＲ中の超可変領域（ＨＶＲ）に存在する、抗原と相補的に結合する部分（例、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）であり、ＦＲは、ＣＤＲの前後に介在する比較的保存された部分（例、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）である。換言すれば、ヒト化抗体は、動物Ｘ（例、ニワトリ）モノクローナル抗体のＣＤＲの一部又は全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域で置換されたモノクローナル抗体を意味する。

【0052】

ヒト化抗体は、自体公知の方法により作製できる〔例えば、ＣＤＲ移植（欧州特許第２３９，４００号；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を参照〕。なお、ＦＲ中のアミノ酸残基は、抗原結合性の維持（好ましくは、改善）の観点より、ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換されてもよい。ＦＲ中における置換されるべきアミノ酸残基は、当該分野で周知の方法によって決定することができ、例えば、抗原結合に重要なＦＲ中のアミノ酸残基を同定するためのＣＤＲおよびＦＲの相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なＦＲアミノ酸残基を同定するための配列比較によって、決定することができる〔例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照〕。具体的には、ヒト化抗体は、以下のとおり作製できる。先ず、動物Ｘモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞から、動物ＸのＨ鎖ＣＤＲ遺伝子、およびそれに対応する動物ＸのＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、そして、ヒトイムノグロブリン遺伝子から、動物ＸのＨ鎖ＣＤＲに対応する、ヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子、および動物ＸのＬ鎖ＣＤＲに対応する、ヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。次いで、ＣＤＲを移植する。その後、ＣＤＲが移植されたヒトＨ鎖遺伝子、およびＣＤＲが移植されたヒトＬ鎖遺伝子を、各々発現可能なように１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養することにより作製することができる。本発明はまた、本発明の抗体を、ヒト化抗体に変換することを含む、ヒト化抗体の作製方法を提供する。

【0053】

ヒト抗体とは、イムノグロブリンを構成するＨ鎖及びＬ鎖のＶＲおよびＣＲを含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体を意味する。

【0054】

ヒト抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子またはそれを含む染色体を、非ヒト動物（例、動物Ｘ、非ヒト動物Ｙ）に組込むことにより（例えば、相同組換えにより、非ヒト動物の遺伝子座中に組み込むことにより）作製されたトランスジェニック動物から単離された抗体産生細胞、またはヒトイムノグロブリン遺伝子またはそれを含む染色体が導入されたトランスジェニック抗体産生細胞を用いることにより、作製することができる。トランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、かつ内因性免疫グロブリンを発現しない動物であってもよい。ヒト抗体を産生するトランスジェニック動物（および／またはヒト抗体を産生するトランスジェニック抗体産生細胞）が、マウス、ウシ等の動物（および／または抗体産生細胞）について知られている。このようなトランスジェニック動物（および／または細胞）の作製、ならびに／あるいはヒト抗体の作製は、例えば、ＷＯ９８／３７７５７、ＷＯ００／１０３８３、ＷＯ００／０７５３００、ＷＯ２００２／０７０６４８、ＷＯ２００３／０４７３３６、ＷＯ２００３／０８５１０７、ＷＯ２００５／１０４８３５、ＷＯ２００６／０４７３６７、特開２００１−２３１４０３、特開２００９−８２０３３、米国特許第５，９３９，５９８号、ならびに／あるいはＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号に開示されている。なお、本発明の抗体（例、ヒト化抗体およびヒト抗体）は、抗原／抗体反応にｐＨ依存性を付与するように作製された、抗原／抗体反応を繰り返し遮断できるリサイクリング抗体であってもよい（例、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，１２０３−１２０７（２０１０）を参照）。本発明はまた、ヒト抗体の作製方法を提供する。

【0055】

本発明の抗体は、そのヌクレオチド配列を決定することで、当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照）を用いて操作され、例えば、アミノ酸残基が変異（例、置換、欠失、および／または挿入）されてもよい。本発明の抗体はまた、後述するように、他の部分または物質、あるいは支持体等の固相と連結されていてもよい。

【0056】

本発明の抗体は、免疫グロブリン等のタンパク質について公知の方法により、単離または精製することができる。このような方法としては、例えば、クロマトグラフィー（例、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、透析、ならびに溶解度の差異を利用する方法が挙げられる。本発明の抗体はまた、抗体の定常領域（例、特定のアイソタイプの定常領域）に親和性を有する物質（例、タンパク質）を用いることにより、あるいは異種ポリペプチド配列に融合することにより、容易に精製することができる。

【0057】

（２．抗体産生細胞）
本発明は、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を提供する。当該抗体産生細胞により産生され得る、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体は、上述したとおりである。

【0058】

用語「抗体産生細胞（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ）」とは、抗体を産生する能力を有する細胞をいう。抗体産生細胞は、抗体を産生する能力を有する動物に由来し得る細胞であり、Ｂ細胞が挙げられる。抗体産生細胞は、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物に由来する細胞であり得る。抗体産生細胞としては、初代培養細胞、細胞株が挙げられるが、細胞株が好ましい。

【0059】

抗体産生細胞は、好ましくは、Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成に加えて、可変領域中のさらなる変異を引き起こし得る抗体産生細胞であり得る。可変領域中のさらなる変異を引き起こし得る抗体産生細胞の一例は、遺伝子変換の能力を有する動物に由来する、かかる能力を保持する抗体産生細胞である。可変領域中のさらなる変異を引き起こし得る抗体産生細胞の別の例は、可変領域中の体細胞突然変異を引き起こし得る抗体産生細胞である。可変領域中の体細胞突然変異を引き起こし得る抗体産生細胞として、可変領域中の体細胞突然変異の頻度が著しく亢進し得る抗体産生細胞が報告されており、例えば、リンパ腫（例、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞リンパ腫）由来の細胞を用いることができる。このような抗体産生細胞の作製は、例えば、Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅら〔ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９０）９：９２１−９２７〕、ＷＯ２００４／０１１６４４、ＷＯ２００４／０５８９６４、ＷＯ２００２／１００９９８等の先行文献に開示されている。

【0060】

抗体産生細胞は、好ましくは、遺伝子変換の能力を有する動物に由来し得る。遺伝子変換の能力を有する動物に由来する抗体産生細胞は、ノックアウト細胞であってもよい。このようなノックアウト細胞としては、ＸＲＣＣ（例、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３等の１以上のＸＲＣＣ分子種）のノックアウト細胞が挙げられる。より好ましくは、抗体産生細胞は、ＤＴ４０細胞等のファブリキウス嚢リンパ腫細胞である。ＤＴ４０細胞は、ニワトリ由来Ｂ細胞株であり、当該細胞の保有する染色体に変異（例、特定の遺伝子の組換え、挿入、削除等）が導入された、誘導体株および亜株（Ｓｕｂｌｉｎｅ）もまた含まれる（例、ＷＯ２００４／０１１６４４を参照）。

【0061】

抗体産生細胞は、特定のアイソタイプの免疫グロブリンを産生するように、抗体遺伝子座において相同組換えが生じている細胞であってもよい。特定のアイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＹが挙げられる。

【0062】

抗体産生細胞はまた、本発明の抗体または他のタンパク質の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより作製される形質転換体であってもよい。発現ベクターによる外来遺伝子の発現は、一過的または恒常的（すなわち、安定的）であり得る。宿主細胞としては、例えば、細菌（例、大腸菌）、酵母等の微生物、ならびに昆虫細胞、鳥類細胞および哺乳動物細胞（例、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞）等の動物細胞が挙げられる。本発明はまた、形質転換体の作製に用いられる、このような発現ベクターを提供する。

【0063】

発現ベクターで用いられるプロモーターは、導入される細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、微生物および動物細胞中で機能し得るプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、ウイルスプロモーター（例、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター）、哺乳動物由来の構成遺伝子プロモーター（例、β−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター）が挙げられる。

【0064】

発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル（すなわち、ターミネーター領域）を含む。さらに、発現ベクターは、薬剤（例、アンピシリン、カナマイシン、Ｇ４１８）に対する耐性遺伝子を含んでいてもよい。

【0065】

外来の遺伝子を癌細胞に導入するために用いられる発現ベクターの基本ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス等のウイルス由来ベクター）であり得る。

【0066】

（３．抗体産生細胞の作製方法）
本発明は、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞の作製方法を提供する。本方法は、親和性複合体を用いて、多様な抗体産生細胞の集団から、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を調製することを含む。親和性複合体、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体、および抗体産生細胞は、上述したとおりである。例えば、このような調製は、多様な抗体産生細胞を異なるウェル中に播種し、培養した後、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体が培養上清中に存在するか否かを評価することにより、行われる。あるいは、このような調製は、多様な抗体産生細胞の集団から、親和性複合体に結合する能力を有する抗体産生細胞を選別することにより、行われる。このような調製は、培地、緩衝液、水等の溶液中で行われ得る。すなわち、このような調製は、インビトロで行われ得る。

【0067】

本発明では、目的の工程に応じた任意の適切な培地が用いられる。例えば、所定の細胞について、培地の調製に用いられる基礎培地としては、例えば、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、ハム培地、ＲＰＭＩ培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。培地は、例えば、血清（例えば、ニワトリ血清、ＦＣＳ等のウシ血清）、血清代替物（例、ＫＳＲ）、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むことができる。培養温度、ＣＯ_２濃度等の他の培養条件は、適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３９．５℃である。また、ＣＯ_２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。培養における細胞数、各種因子の濃度等のその他の条件は、適宜設定できる。本発明で用いられ得る所定の細胞としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）由来の細胞（例、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞）、鳥類（例、ニワトリ）由来の細胞（例、ＤＴ４０細胞）、昆虫由来の細胞が挙げられる。

【0068】

本発明では、目的の工程に応じた任意の適切な緩衝液が用いられる。このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液（例、ＰＢＳ、ＰＢＳＴ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（例、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、塩等の物質をさらに含んでいてもよい。緩衝液のｐＨは、目的の工程に応じて適宜調整され、例えばｐＨ４．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．０〜９．０、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらにより好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。

【0069】

好ましくは、多様な抗体産生細胞の集団からの、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞の調製は、親和性複合体を用いて、多様な抗体産生細胞の集団から、親和性複合体に結合する能力を有する抗体産生細胞を選別することにより、行われる。親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞は、会合する能力を保持する、天然の因子の一部（例、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、可溶性レセプター）を含む親和性複合体を用いて、作製してもよい。親和性複合体は、後述するような検出用物質で、標識されていてもよい。親和性複合体は、直接的に、またはリンカー（例、プロテインＧ）を介して間接的に、固体に固定されていてもよい。固体は、後述するような検出用物質で、標識されていてもよい。親和性複合体が固定され得る固体としては、例えば、粒子（例、磁性粒子、蛍光標識粒子）が挙げられる。具体的には、調製は、以下のとおり行われてもよい。先ず、多様な抗体産生細胞の集団を、親和性複合体が固定された固体と、溶液（例、緩衝液）中で混合し、所定の温度（例えば、０〜４０℃、好ましくは２〜１０℃）で、所定の時間（例えば、５〜３００分、好ましくは１５〜６０分）、反応させる。溶液中の抗体産生細胞の濃度は、例えば、１．０×１０^５〜１．０×１０^１０細胞／ｍｌ、１．０×１０^６〜１．０×１０^９細胞／ｍｌ、または１．０×１０^７〜５．０×１０^８細胞／ｍｌであってもよい。親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体ではなく、親和性複合体を構成する各因子に対して結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞の取得を防止するという観点（即ち、ブロッキング）のため、反応用溶液は、親和性複合体に加えて、親和性複合体を構成する少なくとも１つまたは複数の因子を含んでいてもよい。次いで、固体に固定された親和性複合体と結合した抗体産生細胞を、任意の手法（例、磁気的または蛍光的方法）により、多様な抗体産生細胞の集団から回収する。必要に応じて、回収された抗体産生細胞を培地中に分散させて、抗体産生細胞と、親和性複合体が固定された固体とを解離させ、その後、抗体産生細胞を培養する。得られた抗体産生細胞は、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生し得る。

【0070】

得られた抗体産生細胞が、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生するか否かを確認してもよい。このような確認は、例えば、親和性複合体を用いて行うことができる。具体的には、確認は、以下のとおり行われてもよい。先ず、支持体（例、プレート）上に、親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子を固定する。次いで、親和性複合体を形成する他の因子の存在下および非存在下において、抗体産生細胞の培養上清を添加する。最後に、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体の検出手段〔例、当該抗体の定常領域に結合し得る抗免疫グロブリン（例、ＩｇＭ）抗体に結合した酵素（例、ＨＲＰ）およびその基質（例、ＴＭＢ）〕を用いて、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体が、抗体産生細胞の培養上清中に含まれているか否かを評価する。

【0071】

抗体産生細胞により産生される抗体の、ヘテロ複合体に対する特異性は、上述した方法論により確認できる。一方、抗体産生細胞により産生される抗体の、ホモ複合体に対する特異性は、上述した方法論により確認し得ない。なぜなら、ホモ複合体を構成する同種の因子（単量体）は、溶液中で、自律的に会合して複合体を形成し、単量体として存在し得ないためである。したがって、抗体産生細胞により産生される抗体がホモ複合体に特異的であり、ホモ複合体を形成し得る単量体には結合し得ないことについて、さらなる評価が必要である。このような評価は、例えば、ｉ）因子間の会合部分に会合不能となるようなアミノ酸変異（例、置換、欠失、挿入）を導入した変異因子を作製し、変異因子に対して本発明の抗体が結合しないことを確認することにより、ｉｉ）因子間の会合を阻害するように、因子にタンパク質（例、ＧＦＰ、ＧＳＴ）を付加した融合因子を作製し、融合因子に対して本発明の抗体が結合しないことを確認することにより、あるいはｉｉｉ）因子が親和性複合体を形成しないように調製された溶液を用いて確認することにより、行うことができる。ｉｉｉ）で述べた溶液の調製は、例えば、塩濃度、ｐＨ値等の条件の調整、あるいは、同種の因子ａ間の結合強度よりも、因子ａと高い結合強度を示し得る異種の因子ｂを、溶液中に添加することにより、または因子ａと会合し得る異種の因子ｂを溶液中に過剰に添加することにより、行うことができる。

【0072】

本発明の方法は、互いに親和性を有する２以上の因子を会合させて、親和性複合体を調製することをさらに含んでいてもよい。会合は、溶液（例、緩衝液）中で行われ得る。親和性複合体を構成する因子は、上述したとおりである。２以上の因子のうち少なくとも１つの因子は、予め固体に固定されていてもよい。この場合、調製される親和性複合体は、固体に固定されたものであってもよい。因子は、例えば、リンカーを介して、固体に固定されてもよい。例えば、因子がイムノグロブリンである場合、因子は、イムノグロブリンに親和性を有するタンパク質（例、プロテインＧ）を介して、固体に固定されてもよい。互いに親和性を有する２以上の因子を会合させる場合、溶液中の各因子の濃度は、親和性複合体が形成される限り特に限定されないが、例えば、０．００１〜１００，０００μＭ、０．０１〜１０，０００μＭ、０．０５〜１０００μＭ、または０．１〜１００μＭであってもよい。なお、本発明の方法において用いられる親和性複合体は、種々の種類の親和性複合体を含むライブラリであってもよく、アレイ様式で用いられてもよい。

【0073】

本発明の方法は、多様な抗体産生細胞の集団を提供することをさらに含んでいてもよい。多様な抗体産生細胞の集団は、予め調製されたものを用いてもよいし、新たに調製されたものを用いてもよい。多様な抗体産生細胞の集団は、好ましくは、Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成に加えて、可変領域中のさらなる変異を引き起こし得る抗体産生細胞の集団であり得る。多様な抗体産生細胞の集団としては、例えば、上述したような、遺伝子変換の能力を有する動物に由来する、かかる能力を保持する抗体産生細胞の集団、ならびに可変領域中の体細胞突然変異を引き起こし得る抗体産生細胞の集団が挙げられる。これらの集団の調製は、例えば、先に列挙した文献中に記載される方法により、行うことができる。

【0074】

本発明の方法は、培地中において、遺伝子変換の能力を有する抗体産生細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤で処理して、多様な抗体産生細胞の集団を調製することをさらに含んでいてもよい。このような処理により、先ず、抗体産生細胞の染色体におけるクロマチン構造の弛緩が促進される。次いで、クロマチン構造の弛緩により、抗体遺伝子座における相同組換えが促進され、多様な抗体を産生する多様な抗体産生細胞の集団が得られる。ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤としては、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性を抑制する活性を有する抗体等のタンパク質因子、ならびにトリコスタチンＡ、ブチル酸およびバルプロ酸等の化合物が挙げられる。遺伝子変換の能力を有する抗体産生細胞から多様な抗体産生細胞の集団を調製する方法の詳細は、例えば、ＷＯ２００４／０１１６４４を参照のこと。なお、このような技術の一例は、ＡＤＬｉｂ（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ）システムとして知られている。

【0075】

本発明の方法は、親和性複合体を用いて、多様な抗体産生細胞の集団から、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を調製する前に、親和性複合体を構成する因子を用いて、多様な抗体産生細胞の集団から、親和性複合体を構成する因子に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を除去することを含んでいてもよい。このような方法論により、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を、効率的に取得できる。例えば、目的の抗体産生細胞が、親和性複合体に結合する能力を有する抗体産生細胞である場合、除去は、以下のとおり行われてもよい。先ず、溶液中において、親和性複合体を構成する因子を、支持体（例、プレート）上に固定する。次いで、多様な抗体産生細胞の集団を溶液中に添加し、一定時間放置して、親和性複合体を構成する因子に結合する能力を有する抗体産生細胞を、支持体上の因子に結合させる。支持体に結合しなかった抗体産生細胞の集団を含む溶液を回収した後、親和性複合体を用いて、多様な抗体産生細胞の集団から、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を調製する。除去は、親和性複合体を構成する１つの種類の因子に対して行われてもよく、または複数回繰り返されることにより、親和性複合体を構成する２以上（例、全て）の種類の因子に対して行われてもよい。

【0076】

本発明の抗体は、上述したように、親和性複合体における因子間の会合部分、および／または、会合により引き起こされる、因子の変化した立体構造（例、フォールディングおよび／またはコンホメーション）を特異的に認識する可能性がある。したがって、本発明の方法は、本発明の抗体を、親和性複合体における因子間の会合部分に特異的に結合し得る抗体、または会合により引き起こされる、因子の変化した立体構造（例、フォールディングおよび／またはコンホメーション）に特異的に結合し得る抗体、あるいは上記特性の双方を有する抗体に分類することを、さらに含んでいてもよい。

【0077】

本発明の方法は、以上の工程を全てまたは一部繰り返すことにより、行なわれてもよい。例えば、以上の工程を、２回以上繰り返すことにより、親和性複合体に対してより良質の抗体を産生する抗体産生細胞を調製することができる。本発明の方法はまた、異なる方法論の組合せにより、行なわれてもよい。例えば、ＡＤＬｉｂシステムに内在する方法論を、上述したような体細胞突然変異の誘発法と組み合せることにより、親和性複合体に対して至適化された抗体を産生する抗体産生細胞を調製することができる。勿論、本発明の方法はそれ自体優れたものであることから、必ずしも他の方法論と併用される必要はない。目的抗体のより迅速な取得という観点からは、本発明の方法は、単独で用いることができる。

【0078】

（４．抗体の作製方法）
本発明は、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体の作製方法を提供する。本方法では、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を培養することにより、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体が得られる。親和性複合体、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体、および抗体産生細胞は、上述したとおりである。

【0079】

抗体産生細胞の培養は、培地中で行うことができる。例えば、動物細胞については、上述した培地を用いることができる。また、微生物については、培地は、微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが挙げられ、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機又は有機物質が挙げられ、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類などを添加してもよい。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、抗体産生細胞から抗体が大量に産生されるように適宜選択される。培養温度は、例えば３０〜４０℃である。

【0080】

抗体の作製方法は、培地中において、多様な抗体産生細胞の集団から、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体を産生する能力を有する抗体産生細胞を得ることをさらに含んでいてもよい。このような工程は、本発明の抗体産生細胞の作製方法と同様にして行うことができる。

【0081】

（５．抗体の用途）
本発明の抗体は、例えば、試薬（例、診断試薬、実験試薬）および医薬として、ならびに因子のスクリーニングに有用である。

【0082】

例えば、本発明の抗体は、試薬として、親和性複合体のイムノアッセイ（定性的または定量的測定）に用いられ得る。イムノアッセイとしては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法が挙げられる。

【0083】

試薬として用いられる場合、本発明の抗体は、検出用物質に連結されていてもよい。本発明の抗体は、検出用物質に直接的または間接的（即ち、リンカーの使用により）に連結され得る。検出用物質としては、例えば、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ）が挙げられる。検出用物質に連結された本発明の抗体は、イムノアッセイに有用である。

【0084】

試薬として用いられる場合、本発明の抗体は、支持体上に固定されていてもよい。支持体としては、例えば、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレート（例、マルチウェルプレート）が挙げられる。支持体上に固定された本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイ、および親和性複合体の精製に有用である。

【0085】

好ましくは、本発明の抗体は、非競合測定法に用いられる。非競合測定法としては、例えば、サンドイッチ法が挙げられる。好ましくは、本発明の抗体がサンドイッチ法に用いられる場合、因子（例、低分子物質、タンパク質）に対する第１の抗体、ならびに因子およびそれに対する第１の抗体を含む親和性複合体に対して特異的に結合し得る第２の抗体（即ち、抗体の組合せ）の使用もまた、好ましい。

【0086】

本発明の抗体はまた、医薬として、生体内に存在する親和性複合体に結合することにより、その親和性複合体の機能を喪失させ得、または、その親和性複合体の体内動態を変更し得る。例えば、本発明の抗体は、生体内に存在する、少なくとも３つの因子から構成される親和性複合体の形成阻害に用いられ得る。具体的には、生体内に存在する親和性複合体が因子ａ（例、リガンド）、因子ｂ（例、レセプター）および因子ｃ（例、コアクチベーターおよびコリプレッサー等のコファクター）から構成される場合、本発明の抗体は、因子ａおよび因子ｂから構成される親和性複合体に対して、競合的に結合することにより、因子ａおよび因子ｂから構成される親和性複合体と因子ｃとの間の結合を阻害し、それにより、因子ａ、因子ｂおよび因子ｃから構成される親和性複合体の形成により媒介される生物学的シグナル（例、増殖シグナル）を調節し得る。例えば、因子ｃがコアクチベーターである場合、本発明の抗体は、生物学的シグナルを低減し得る。一方、因子ｃがコリプレッサーである場合、本発明の抗体は、生物学的シグナルを増強し得る。あるいは、生体内に存在する親和性複合体を構成する因子に、生物学的シグナル（例、増殖シグナル）を増強するような変異が生じた場合、本発明の抗体は、親和性複合体の形成を阻害することにより、生物学的シグナルを低減し得る。

【0087】

医薬として用いられる場合、本発明の抗体は、治療に有用な物質に連結されていてもよい。本発明の抗体は、治療に有用な物質に直接的または間接的（即ち、リンカーの使用により）に連結され得る。治療に有用な物質としては、例えば、抗癌剤、毒素（例、細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性）、タンパク質（例えば、増殖因子、サイトカイン）、放射性金属〔例、αエミッター（例、^２１３Ｂｉ）〕、アポトーシス促進剤、安定化剤（例、ＰＥＧ）が挙げられる。このような物質を抗体に連結する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８５）を参照のこと。

【0088】

医薬として用いられる場合、本発明の抗体は、医薬上許容され得る担体を含む医薬組成物として投与される。医薬組成物は、経口的または非経口的に投与される（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与）。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

【0089】

医薬として用いられる場合、本発明の抗体の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。

【0090】

本発明の抗体は、親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子と組み合わされて用いられてもよい。この場合、本発明の抗体は、（ｉ）親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体、および（ｉｉ）親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子を含むセットとして提供される。親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子は、親和性複合体を構成する上述した因子と同様である。本発明のセットはまた、（ｉ’）因子（例、低分子物質、タンパク質）、およびそれに対する抗体を含む親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体、および（ｉｉ’）因子（例、低分子物質、タンパク質）に対して特異的に結合し得る抗体を含むものであってもよい。本発明のセットは、キットとして提供されてもよい。

【0091】

本発明のセットは、例えば、親和性複合体を構成し得る因子の検出および／または定量に有用である。本発明の抗体がこのようなセットして提供される場合、本発明の抗体は、上述したように、検出用物質に連結されていてもよい。あるいは、本発明の抗体が検出用物質に連結されていない場合、本発明のセットは、検出用物質、および／または検出用物質に連結されている、本発明の抗体の検出用タンパク質（例、抗イムノグロブリン抗体、またはプロテインＧ）を、さらに含んでいてもよい。例えば、親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子がタンパク質である場合、本発明のセットは、サンドイッチ法に有用である。

【0092】

あるいは、親和性複合体を構成する少なくとも１つの因子が抗体等のタンパク質である場合、本発明のセットは、親和性複合体を構成する別の因子（例、低分子物質、タンパク質）を治療標的とするサンドイッチ療法（例、２重抗体療法）に用いられる。
例えば、抗体は、低分子物質に対する高い特異性を必ずしも有しない。しかしながら、低分子物質に対して特異的に結合し得る抗体を、低分子物質およびそれに対して特異的に結合し得る抗体を含む親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体と組み合せることで、２重の特異性が達成され、特異性が増幅される。このような抗体の組合せは、低分子物質に対して、抗体単独よりも特異的である。したがって、本発明のセットは、低分子物質に対する抗体療法に有用である。
また、抗体は、高度の相同性を有する複数のタンパク質のうちの特定の標的タンパク質に対して高い特異性を必ずしも有しない。例えば、治療標的が天然タンパク質ａであり、かつ、天然タンパク質ａに対して高い相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上のアミノ酸配列同一性）を有する天然タンパク質ｂ（ホモログ）が存在する場合、天然タンパク質ａに対してより選択的に作用させるため、このような抗体の組合せを用いることができる。したがって、本発明のセットは、高度の相同性を有する複数の天然タンパク質のうち、特定の天然タンパク質を治療標的とする抗体療法に有用である。
さらに、抗体は、変異タンパク質に対して高い特異性を必ずしも有しない。このような変異タンパク質としては、例えば、天然タンパク質に対して、１または数個のアミノ酸残基が変異（例、置換、欠失、挿入、および／または付加）したタンパク質が挙げられる。例えば、癌において、正常細胞に発現している非変異タンパク質ａ（天然タンパク質ａ）を治療標的とすることが所望されておらず、かつ、異常細胞に発現している変異タンパク質ａ’のみを治療標的とすることが所望されている場合、変異タンパク質ａ’に対してより選択的に作用させるため、このような抗体の組合せを用いることができる。したがって、本発明のセットは、変異タンパク質のみを治療標的とする抗体療法に有用である。

【0093】

本発明のセットは、親和性複合体を形成し得る因子のスクリーニングに有用である。本発明のセットはまた、異なる作用機序を有するリガンド（例、低分子物質、タンパク質）のスクリーニングに有用である。所定のレセプターに対するリガンドとしては、異なる作用機序を有するもの（例、アゴニスト、アンタゴニスト、リバースアゴニスト）が知られている。所定のレセプターに対するこのようなリガンドの作用機序の差異は、レセプターおよびリガンドの会合により引き起こされ得るレセプターの立体構造（例、フォールディングおよび／またはコンホメーション）の変化に起因し得る。したがって、本発明の抗体として、会合により引き起こされる、因子の変化した立体構造（例、フォールディングおよび／またはコンホメーション）を特異的に認識し得るものを用いた場合には、リガンドの作用機序の種類の同定に役立つ可能性がある。

【0094】

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。

【実施例】

【0095】

実施例１：親和性複合体（Ｅ２抗Ｅ２抗体複合体）に対する抗体の取得
ｉｎ ｖｉｔｒｏニワトリＩｇＭ取得技術〔（ＡＤＬｉｂ（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ）システム：例えば、ＷＯ２００４／０１１６４４を参照〕を利用して、以下の方法を行なうことにより、Ｅ２抗Ｅ２抗体複合体に対する抗体を取得した。なお、本明細書中以降において、Ｅ１（エストロン）、Ｅ２（エストラジオール）、Ｅ３（エストリオール）と表記することがある。また、以下において、Ｅ２について、１μｇ／ｍＬは３．７μＭに相当し、Ｆ１８−３抗体について、１μｇ／ｍＬは６．７ｎＭに相当し、Ｆ１２−３３抗体について、１μｇ／ｍＬは６．７ｎＭに相当し、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）について、１μｇ／ｍＬは３．３μＭに相当する。

【0096】

（１）ＤＴ４０細胞の多様化
多様化させたＤＴ４０細胞は、以下の手順により作製されたものを用いた。
・９％ＦＢＳ，１％ニワトリ血清含有ＩＭＤＭ培地〔ＣＳ（Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｓｅｒｕｍ）^＋培地〕５０ｍＬを計り取り、１５ｃｍディッシュに加えた。
・トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を２．５ｎｇ／ｍＬとなるように加えた。
・１．５×１０^７個のＤＴ４０細胞を加え、３９．５℃に設定したＣＯ_２インキュベータ内で１日培養した。

【0097】

（２）ＤＴ４０細胞の継代
以下の手順により、ＤＴ４０細胞を継代した。
・１日培養した細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに取り、４℃，１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。
・上清除去後、１０ｍＬのＣＳ^＋培地で再び懸濁した。
・ＣＳ^＋培地９５０μＬに細胞懸濁液５０μＬを加えて２０倍希釈し、撹拌した。
・生細胞数をカウントした。
・新しい１５ｃｍディッシュにＣＳ^＋培地５０ｍＬを加えた。
・１．５×１０^７個のＤＴ４０細胞を加え、３９．５℃に設定したＣＯ_２インキュベータ内で１日培養した。
・目的抗体を産生する細胞の選択前に、ＴＳＡ処理を２回行った。ＴＳＡ処理は、２．５ｎｇ／ｍＬ ＴＳＡを含有するＣＳ^＋培地中で、３９．５℃で一晩培養することにより、行った。

【0098】

（３）抗原結合粒子の調製
以下の手順により、抗原結合粒子を調製した。
・ＰｒｏｔｅｉｎＧが固定されている磁性粒子〔Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（粒子径：２．８μｍ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手、カタログ番号：１００．０３Ｄ〕を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１３．５ｍｇ／ｍＬ）に、３００μｇ／ｍＬの抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）を加えた。なお、抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）は、自社において樹立したマウスモノクローナル抗体である。なお、Ｅ２に対する抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）の結合は、種々のデータより、１０^−９Ｍから１０^−１２Ｍ程度と類推される。
・４℃，１ｈで反応させてＦ１８−３を粒子上に固相化した。
・０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで粒子を４回洗浄した。
・１．１μｇ／ｍＬのＥ２を含むＰＢＳ中に粒子を分散させた。
・４℃，１ｈで放置して、抗原および抗体が会合した抗原抗体複合体（Ｅ２および抗Ｅ２抗体を含む親和性複合体）を形成させた。
・０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで粒子を４回洗浄した。

【0099】

（４）目的抗体を産生する細胞の培養
以下の手順により、目的抗体を産生する細胞を培養した。
・１５ｃｍディッシュ２枚にＣＳ^＋培地５０ｍＬをそれぞれ加えた。
・１．５×１０^７個の細胞を各培地に加え、１日培養した。
・細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに回収し、４℃，１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。
・上清除去後、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄して１．５ｍＬチューブに回収した。
・４℃，３５００ｒｐｍ，５ｍｉｎで遠心して上清を除去した。
・（３）で調製した抗原結合粒子を１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。
・細胞（９ｘ１０^７細胞／ｍＬ）と抗原結合粒子（７５μｇ／ｍＬ）とを混合し、４℃，３０ｍｉｎ反応させた。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄し、余剰の細胞を除去した。
・ＣＳ⁻培地で細胞・粒子を分散させた。
・９６ｗｅｌｌプレートにまき、１週間培養した。

【0100】

（５）目的抗体を産生する細胞の選別
選別は、抗原抗体複合体固相ＥＬＩＳＡにより実施した。Ｅ２を加えた場合と加えなかった場合での発色の差によって、細胞が目的抗体を産生しているか否かを評価した。手順は、以下のとおりであった。
・アッセイプレートに１μｇ／ｍＬの抗Ｅ２抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートして固相化した。
・０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（０．０５％ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。
・１％ スキムミルク／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・２００ｎｇ／ｍＬ Ｅ２またはバッファーのみを２５μＬ加えた。
・培養上清２５μＬを加えて１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・抗ニワトリ（ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ）ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0101】

（６）結果
Ｅ２非存在下、Ｅ２存在下（１００ｎｇ／ｍＬ）において、抗原抗体複合体（Ｅ２および抗Ｅ２抗体を含む親和性複合体）に結合する抗体を産生する細胞クローンを高率に得ることに成功した（３／８８＝３．４％：図１、２を参照）。このような抗体作製効率は、従来の抗体作製方法では達成し得ない。例えば、従来の動物免疫法（ハイブリドーマ法）による抗体作製効率は、上記効率に到底及ばない。また、従来の動物免疫法では、そもそも、親和性複合体そのものに対する抗体を作製し得ない。したがって、本発明の方法は、効率的に親和性複合体そのものに対する抗体を作製できることが示された。

【0102】

実施例２：抗Ｅ２抗体およびＥ２抗Ｅ２抗体複合体に対する目的抗体の特異性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、特異性を評価した。
・アッセイプレートに２種の抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３、Ｆ１２−３３）、抗ＡＦＰ抗体（ネガティブコントロール）をそれぞれ２μｇ／ｍＬの濃度で加え、３７℃で１時間インキュベートして固相化した。なお、抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３、Ｆ１２−３３）は、自社において樹立したマウスモノクローナル抗体である。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ スキムミルク／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・２ｎｇ／ｍＬ Ｅ１、２ｎｇ／ｍＬ Ｅ２またはバッファーのみを２５μＬ加えた。
・上記手法で樹立したクローン（２−１、２−２、２−３、２−４、２−５および２−６）の培養上清を２５μＬ加え、１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・抗ニワトリＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加え、発色反応を停止した。
・ＯＤ_４５０を測定した。

【0103】

（２）結果
結果は、表１に示したとおりである。クローン２−１、２−３および２−５は、抗原〔Ｅ２抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）複合体〕に対して特異的に結合した（＊を参照）。一方、クローン２−２、２−４および２−６は、抗原〔Ｅ２抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）複合体〕に対して結合せず、Ｆ１８−３抗体に結合した。なお、クローン２−１、２−３および２−５は、実施例１のクローン４、９および４６にそれぞれ対応し、クローン２−２、２−４および２−６は、実施例１のクローン８、３４および７７にそれぞれ対応していた。
以上より、本発明の方法により、複合体に特異的に結合し得る抗体が得られることが確認された。

【0104】

【表1】

【0105】

実施例３：Ｅ２に対する目的抗体の特異性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、Ｅ２に対する目的抗体の特異性を評価した。
・アッセイプレートにＥ２−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）複合体を各濃度で加え、３７℃で１時間インキュベートして固相化した。Ｅ２ではなく、Ｅ２−ＢＳＡ複合体を用いた理由は、Ｅ２は低分子化合物であり、単独ではアッセイプレート上に吸着しないためである。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ スキムミルク／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１００ｎｇ／ｍＬ Ｅ２またはバッファーのみを２５μＬずつ加えた。
・実施例１で樹立し、実施例２で評価されたクローン（２−１、２−２、２−３、２−４、２−５および２−６）の培養上清を２５μＬ加え、１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・抗ニワトリＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加え、発色反応を停止した。
・ＯＤ_４５０を測定した。

【0106】

（２）結果
結果は、表２に示したとおりである。Ｅ２（Ｅ２−ＢＳＡ）単独を固相したＥＬＩＳＡでは、陽性を示すクローンは見出されなかった。したがって、クローン２−１、２−２、２−３、２−４、２−５および２−６は、Ｅ２に対して結合し得る抗体を産生しないと考えられる。

【0107】

【表2】

【0108】

実施例４：類似物質に対する交差反応性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、類似物質に対する抗体の交差反応性を評価した。
・５μｇ／ｍＬ 抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）を固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ スキムミルク／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・Ｅ１，Ｅ３，Ｅ２を各濃度で調製し、２５μＬずつ加えた。
・３種の抗体を含む培養上清（クローン２−１、２−３、２−５）を各２５μＬずつ加え、１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・抗ニワトリＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加え、発色反応を停止した。
・ＯＤ_４５０を測定した。

【0109】

（２）結果
結果は、表３に示したとおりである。表３では、交差反応性（％）は、目的の親和性複合体に対する本発明の抗体の結合率を１００％として算出した場合、親和性複合体を構成する各因子またはその類似因子に対する本発明の抗体の結合率に基づき算出している。３種の抗体（クローン２−１、２−３、２−５）は、Ｅ１、Ｅ３に殆ど結合しなかった。

【0110】

【表3】

【0111】

以上より、３種の抗体（クローン２−１、２−３、２−５）は、抗原抗体複合体〔Ｅ２−抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）を含む複合体〕に特異的に結合できることが示された。したがって、本発明により、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体の開発が可能であることが実証された。また、サンドイッチ法による低分子物質の測定も可能であることが実証された。

【0112】

実施例５：組換えＩ型キメラ抗体の作製
ニワトリＩｇＭ抗体をマウスＩｇＧ抗体に変換して、組換えＩ型キメラ抗体を作製した。組換えＩ型キメラ抗体は、Ｅ２−抗Ｅ２抗体複合体に対するニワトリＩｇＭ抗体のμ鎖およびλ鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の下流に、マウス定常領域（ＣＨ、ＣＬ）を連結した抗体である〔重鎖：ニワトリＩｇＭ（μ鎖）由来のＶＨ−マウスＩｇＧ１（γ１鎖）由来のＣＨ；軽鎖：ニワトリＩｇＭ（λ鎖）由来のＶＬ−マウスＩｇＧ１（κ鎖）由来のＣＬ〕。以下、必要に応じて、「キメラＩ型（抗体）」と呼称する。

【0113】

（１）キメラＩ型重鎖発現ベクターの作製
以下の手順により、キメラＩ型重鎖発現ベクターを作製した。
ａ）Ｅ２−抗Ｅ２抗体複合体結合ニワトリＩｇＭ抗体（クローン２−３）のμ鎖ｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＡとプライマーＢを用いてＰＣＲを行い、ニワトリμ鎖可変領域を増幅した。
ｂ）抗ＴＮＦマウスＩｇＧ１抗体のγ鎖ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＣとプライマーＤを用いてＰＣＲを行い、マウスＩｇＧ１の定常領域を増幅した。
ｃ）ａ）およびｂ）で増幅したＤＮＡ断片の混合物を鋳型としてプライマーＡとプライマーＤを用いてアセンブルＰＣＲを行い、ニワトリμ鎖可変領域とマウスＩｇＧ１ γ鎖定常領域が連結された１本のＤＮＡ断片を調製した。
ｄ）ｃ）で得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＮｏｔ Ｉで処理した後、市販（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１のＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入した。

【0114】

（２）キメラＩ型軽鎖発現ベクターの作製
以下の手順により、キメラＩ型軽鎖発現ベクターを作製した。
ｅ）Ｅ２−抗Ｅ２抗体複合体結合ニワトリＩｇＭ抗体（クローン２−３）のλ鎖ｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＥとプライマーＦを用いてＰＣＲを行い、ニワトリλ鎖可変領域を増幅した。
ｆ）抗ＴＮＦマウスＩｇＧ１抗体のκ鎖ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＧとプライマーＨを用いてＰＣＲを行い、マウスκ鎖定常領域を増幅した。
ｇ）ｅ）およびｆ）で増幅したＤＮＡ断片の混合物を鋳型として、プライマーＥとプライマーＨを用いてアセンブルＰＣＲを行い、ニワトリλ鎖可変領域とマウスκ鎖定常領域が連結された１本のＤＮＡ断片を調製した。
ｈ）ｇ）で得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＮｏｔ Ｉで処理した後、市販（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺｅｏのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入した。

【0115】

（３）組換えキメラＩ型抗体の作製および発現確認
以下の手順により、組換えキメラＩ型抗体を作製した。
ｉ）キメラＩ型重鎖発現ベクター、およびキメラＩ型軽鎖発現べクターで形質転換された大腸菌コロニーをそれぞれ１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１５０ｍｌのＬＢ培地中で３７℃一晩振蕩培養した後、Ｑｕｉａｇｅｎ社のＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いてプラスミドを調製した。
ｊ）ｉ）で調製したキメラＩ型重鎖発現ベクター、およびキメラＩ型軽鎖発現べクターをそれぞれ４μｇ用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００により、１０^６個のＣＨＯ細胞を形質転換した。
ｋ）ｊ）で形質転換したＣＨＯ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ Ｆ−１２倍地を用いて、ＣＯ_２インキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。
ｌ）キメラＩ型抗体の発現を確認するため、ｋ）の培養上清中にキメラＩ型抗体が分泌されているかを、ＥＬＩＳＡ法にて確認した。すなわちＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に抗マウスＩｇＧを固相化し、これに（１／２）ｎ希釈した培養上清を反応させ、次いでＰＯＤ標識された抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ社）で検出した。なお、陽性対照としてマウスモノクロ抗体（ａｎｔｉ ＴＮＦ３６）を、陰性対照としてＣＨＯ培養上清を用いた。その結果、キメラＩ型抗体の発現が確認された（表４）。

【0116】

【表4】

【0117】

実施例６：組換えＩＩ型キメラ抗体の作製
ニワトリＩｇＭ抗体をマウスＩｇＧ抗体に変換して、組換えＩＩ型キメラ抗体を作製した。組換えＩＩ型キメラ抗体は、Ｅ２−抗Ｅ２抗体複合体に対するニワトリＩｇＭ抗体のλ鎖（ＶＬおよびＣＬ）とμ鎖可変領域（ＶＨ）およびＣＨ１ドメインの下流に、マウスＩｇＧ１のＨｉｎｇｅ領域以降の領域（Ｈｉｎｇｅ領域、ＣＨ２およびＣＨ３）を連結した抗体である〔重鎖：ニワトリＩｇＭ（μ鎖）由来のＶＨおよびＣＨ１−マウスＩｇＧ１（γ１鎖）由来のＨｉｎｇｅ領域、ＣＨ２およびＣＨ３；軽鎖：ニワトリＩｇＭ（λ鎖）由来のＶＬおよびＣＬ〕。以下、必要に応じて、「キメラＩＩ型（抗体）」と呼称する。

【0118】

（１）キメラＩＩ型重鎖発現ベクターの作製
以下の手順により、キメラＩＩ型重鎖発現ベクターを作製した。
ａ’）Ｅ２−抗Ｅ２抗体複合体結合ニワトリＩｇＭ抗体（クローン２−３）のμ鎖ｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＩとプライマーＪを用いてＰＣＲを行い、ニワトリμ鎖可変領域およびＣＨ１を増幅した。
ｂ’）抗ＴＮＦマウスＩｇＧ１抗体のγ鎖ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＫとプライマーＤを用いてＰＣＲを行い、マウスγ鎖のＨｉｎｇｅ領域以降の領域（Ｈｉｎｇｅ領域、ＣＨ２およびＣＨ３）を増幅した。
ｃ’）ａ’）およびｂ’）で増幅したＤＮＡ断片の混合物を鋳型として、プライマーＩとプライマーＤを用いてアセンブルＰＣＲを行い、ニワトリμ鎖可変領域およびＣＨ１とマウスγのＨｉｎｇｅ領域以降の領域（Ｈｉｎｇｅ領域、ＣＨ２およびＣＨ３）が連結された１本のＤＮＡ断片を調製した。
ｄ’）ｃ’）で得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｎｈｅ ＩとＮｏｔ Ｉで処理した後、市販（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１のＮｈｅ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入した。

【0119】

（２）キメラＩＩ型軽鎖発現ベクターの作製
以下の手順により、キメラＩＩ型軽鎖発現ベクターを作製した。
ｅ’）Ｅ２−抗Ｅ２抗体複合体結合ニワトリＩｇＭ抗体（クローン２−３）のλ鎖ｃＤＮＡを鋳型としてプライマーＥとプライマーＬを用いてＰＣＲを行い、ニワトリλ鎖を増幅した。
ｆ’）ｅ’）で増幅したＤＮＡ断片をＨｉｎｄ ＩＩＩとＮｏｔ Ｉで処理した後、市販（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺｅｏのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入した。

【0120】

（３）組換えキメラＩＩ型抗体の作製および発現確認
以下の手順により、組換えキメラＩＩ型抗体を作製した。
ｇ’）キメラＩＩ型重鎖発現ベクター、およびキメラＩＩ型軽鎖発現ベクターで形質転換された大腸菌コロ二ーをそれぞれ１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１５０ｍｌのＬＢ培地中で３７℃一晩振蕩培養した後、Ｑｕｉａｇｅｎ社のＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いてプラスミドを調製した。
ｈ’）ｇ’）で調製したキメラＩＩ型重鎖発現ベクター、およびキメラＩＩ型軽鎖発現べクターをそれぞれ４μｇ用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００により、１０^６個のＣＨＯ細胞を形質転換した。
ｉ’）ｈ’）で形質転換したＣＨＯ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＨａｍ Ｆ−１２倍地を用いて、ＣＯ_２インキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。
ｊ’）キメラＩＩ型抗体の発現を確認するため、ｉ’）の培養上清中にキメラＩＩ型抗体が分泌されているかを、ＥＬＩＳＡ法にて確認した。すなわちＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に抗マウスＩｇＧを固相化し、これに（１／２）ｎ希釈した培養上清を反応させ、次いでＰＯＤ標識された抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ社）で検出した。なお、陽性対照としてマウスモノクロ抗体（ａｎｔｉ ＴＮＦ３６）を、陰性対照としてＣＨＯ培養上清を用いた。その結果、キメラＩＩ型抗体の発現が確認された（表５）。

【0121】

【表5】

【0122】

【表6】

【0123】

実施例７：親和性複合体（Ｔ３−抗Ｔ３抗体複合体）に対する抗体の取得
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ニワトリＩｇＭ取得技術（ＡＤＬｉｂシステム）を利用して、以下の方法を行なうことにより、Ｔ３−抗Ｔ３抗体複合体に対する抗体を取得した。なお、本明細書中以降において、Ｔ２（ジヨードチロニン）、Ｔ３（トリヨードチロニン）、Ｔ４（チロキシン）と表記することがある。また、以下において、Ｔ３について、１μｇ／ｍＬは１．５μＭに相当し、Ｔ３−９２抗体について、１μｇ／ｍＬは６．７ｎＭに相当し、Ｔ３−３１抗体について、１μｇ／ｍＬは６．７ｎＭに相当する。

【0124】

（１）ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０ライブラリの多様化
多様化されたＤＴ４０細胞は、実施例１（１）の手順により調製した。

【0125】

（２）ＤＴ４０ライブラリの継代
ＤＴ４０細胞の継代は、実施例１（２）の手順により行った。

【0126】

（３）抗原結合粒子の調製
以下の手順により、抗原結合粒子を調製した。
・ＰｒｏｔｅｉｎＧが固定化してある磁性粒子に３００μｇ／ｍＬの抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２）を加えた。
・４℃，１ｈで反応させてＴ３−９２を固相化した。
・０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで粒子を４回洗浄した。
・３００μｇ／ｍＬのＴ３を含むＰＢＳで粒子を分散させた。
・４℃，１ｈで反応させて抗原抗体複合体を形成させた。
・０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで粒子を４回洗浄した。

【0127】

（４）目的抗体を産生する細胞の培養
以下の手順により、目的抗体を産生する細胞を培養した。
・１５ｃｍディッシュ２枚にＣＳ^＋培地５０ｍＬをそれぞれ加えた。
・１．５Ｘ１０^７個の細胞を加え、１日培養した。
・細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに回収し、４℃，１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。
・上清除去後、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄して１．５ｍＬチューブに回収した。
・４℃，３５００ｒｐｍ，５ｍｉｎで遠心して上清を除去した。
・（３）で調製した抗原結合粒子を１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。
・細胞と抗原結合粒子とを混合し、４℃，３０ｍｉｎ反応させた。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄し、余剰の細胞を除去した。
・ＣＳ⁻培地で細胞・粒子を分散させた。
・９６ｗｅｌｌプレートにまき、１週間培養した。

【0128】

（５）目的抗体を産生する細胞の選別
選別は、抗原抗体複合体固相ＥＬＩＳＡにより実施した。Ｔ３を加えた場合と加えなかった場合での発色の差によって、細胞が目的抗体を産生しているか否かを評価した。手順は、以下のとおりであった。
・アッセイプレートに１μｇ／ｍＬの抗Ｔ３抗体を加え、固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・５０ｎｇ／ｍＬ Ｔ３またはバッファーのみを５０μＬ加え、Ｔ３を固相抗体に結合させた。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＤＴ４０培養上清５０μＬを加えて１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0129】

（６）結果
Ｔ３非存在下、Ｔ３存在下（５０ｎｇ／ｍＬ）で反応性に顕著な差のあるクローン（Ｗｅｌｌ Ｎｏ．２３，９１，９４，１０１，１１０，１２１）を高率に得ることに成功した（６クローン／１４４＝４．２％：図３、４を参照）。

【0130】

実施例８：親和性複合体（Ｔ３−抗Ｔ３抗体複合体）抗体の特異性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、特異性を評価した。
・アッセイプレートに２種の抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２，Ｔ３−３１）、抗ＡＦＰ抗体をそれぞれ２μｇ／ｍＬで固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・Ｔ３，Ｔ２，Ｔ４を１００ｎｇ／ｍＬに調製し、それぞれ５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・上記手法で樹立した抗体を各クローン５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加え、発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0131】

（２）結果
結果は、表７に示したとおりである。クローン６−１９、５−３、５−６、５−１３および５−２２は、抗原〔Ｔ３抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２）複合体〕に対して特異的に結合した（＊を参照）。クローン５−３３はＴ２抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２）複合体と弱い交差反応があった。検出抗体にクローン５−３３を用いた場合はＴ２との交差反応性が認められたことから、固相抗体Ｔ３−９２がＴ２にも弱く交差反応することを示唆している。一方、クローン５−３２は、抗原〔Ｔ３抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２）複合体〕だけではなく、Ｔ３−９２抗体のみにも結合した。５−３２はＴ３−３１抗体には結合しなかったこことからＴ３−９２抗体に特異的に結合するクローンであった。なお、クローン６−１９、５−３、５−６、５−１３および５−２２は、実施例７のクローン２３、９１、９４、１０１および１１０にそれぞれ対応し、クローン５−３３は、実施例７のクローン１２１に対応し、クローン５−３２は、実施例７のクローン１２０に対応する。

【0132】

【表7】

【0133】

実施例９：Ｔ３に対する目的抗体の特異性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、Ｔ３に対する目的抗体の特異性を評価した。
・アッセイプレートにＴ３−ＢＳＡコンジュゲートを５μｇ／ｍＬ固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・上記手法で樹立した抗体を各クローン５０μＬずつ加え、１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・１次反応にマウス抗体を用いた場合は、ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加え、発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0134】

（２）結果
結果は、表８に示したとおりである。Ｔ３（Ｔ３−ＢＳＡ）単独を固相したＥＬＩＳＡでは、陽性を示すクローンは見出されなかった。したがって、クローン６−１９、５−３、５−６、５−１３、５−２２および５−３３は、Ｔ３に対して結合し得る抗体を産生しないと考えられる。

【0135】

【表8】

【0136】

実施例１０：類似物質に対する交差反応性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、類似物質に対する抗体の交差反応性を評価した・アッセイプレートに２μｇ／ｍＬ 抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２）を固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・Ｔ３、Ｔ２、Ｔ４を各濃度に調製し、それぞれ５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・上記手法で樹立した抗体を各クローン５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加え、発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0137】

（２）結果
結果は、表９に示したとおりである。表９では、交差反応性（％）は、目的の親和性複合体に対する本発明の抗体の結合率を１００％として算出した場合、親和性複合体を構成する各因子またはその類似因子に対する本発明の抗体の結合率に基づき算出している。５種の抗体（クローン５−３、５−６、５−１３、６−１９および５−２２）は、Ｔ２、Ｔ４に殆ど結合しなかった。検出抗体にクローン５−３３を用いた場合はＴ２と弱い交差反応があった。この結果は、固相抗体Ｔ３−９２がＴ２にも交差反応することを示しており、５種の抗体（クローン５−３、５−６、５−１３、６−１９および５−２２）は類似親和性複合体と親和性複合体を識別していることを示している。

【0138】

【表9】

【0139】

以上より、５種の抗体（クローン５−３、５−６、５−１３、５−２２および６−１９）は、抗原抗体複合体〔Ｔ３−抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２）を含む複合体〕に特異的に結合できることが示された。したがって、本発明により、親和性複合体に対して特異的に結合し得る抗体の開発が可能であることが実証された。また、サンドイッチ法による低分子物質の測定も可能であることが実証された。

【0140】

実施例１１：Ｔ３に対する感度の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、Ｔ３に対する感度を評価した。
・アッセイプレートに２μｇ／ｍＬ 抗Ｔ３抗体（Ｔ３−９２）を固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・Ｔ３を各濃度に調整し、５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・上記手法で樹立した抗体を５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加え、発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0141】

（２）結果
結果は、表１０、図５に示したとおりである。作製した抗体（クローン５−３−１）を用いたサンドイッチ法により、１ｐｇ／ｍＬ以下のＴ３の検出が可能であった。なお、クローン５−３−１は、実施例７のクローン５−３に対応する。

【0142】

【表10】

【0143】

実施例１２：親和性複合体（２５ＯＨビタミンＤ３−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体複合体）に対する抗体の取得
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ニワトリＩｇＭ取得技術（ＡＤＬｉｂシステム）を利用して、以下の方法を行なうことにより、２５ＯＨビタミンＤ３−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体複合体に対する抗体を取得した。また、以下において、２５ＯＨビタミンＤ３について、１μｇ／ｍＬは２．５μＭに相当し、抗２５ＯＨビタミンＤ抗体について、１μｇ／ｍＬは６．７ｎＭに相当する。

【0144】

（１）ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０ライブラリの多様化
多様化されたＤＴ４０細胞は、実施例１（１）の手順により調製した。

【0145】

（２）ＤＴ４０ライブラリの継代
ＤＴ４０細胞の継代は、実施例１（２）の手順により行った。

【0146】

（３）抗原結合粒子の調製
以下の手順により、抗原結合粒子を調製した。
・ＰｒｏｔｅｉｎＧが固定化してある磁性粒子に３００μｇ／ｍＬの抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を加えた。
・４℃，１ｈで反応させて抗体を固相化した。
・０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで粒子を４回洗浄した。
・３００μｇ／ｍＬの２５ＯＨビタミンＤ３を含むＰＢＳで粒子を分散させた。
・４℃，１ｈで反応させて抗原抗体複合体を形成させた。
・０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで粒子を４回洗浄した。

【0147】

（４）目的抗体を産生する細胞の培養
以下の手順により、目的抗体を産生する細胞を培養した。
・１５ｃｍディッシュ２枚にＣＳ^＋培地５０ｍＬをそれぞれ加えた。
・１．５Ｘ１０^７個の細胞を加え、１日培養した。
・細胞懸濁液を５０ｍＬチューブに回収し、４℃，１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。
・上清除去後、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄して１．５ｍＬチューブに回収した。
・４℃，３５００ｒｐｍ，５ｍｉｎで遠心して上清を除去した。
・（３）で調製した抗原結合粒子を１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。
・細胞と抗原結合粒子とを混合し、４℃，３０ｍｉｎ反応させた。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで５回洗浄し、余剰の細胞を除去した。
・ＣＳ⁻培地で細胞・粒子を分散させた。
・９６ｗｅｌｌプレートにまき、１週間培養した。

【0148】

（５）目的抗体を産生する細胞の選別
選別は、抗原抗体複合体固相ＥＬＩＳＡにより実施した。２５ＯＨビタミンＤ３を加えた場合と加えなかった場合での発色の差によって、細胞が目的抗体を産生しているか否かを評価した。手順は、以下のとおりであった。
・アッセイプレートに１μｇ／ｍＬの抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を加え、固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１μｇ／ｍＬ ２５ＯＨビタミンＤ３またはバッファーのみを５０μＬ加え、２５ＯＨビタミンＤ３を固相抗体に結合させた。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＤＴ４０培養上清５０μＬを加えて１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ｂｉｏｔｉｎを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを加え、３次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0149】

（６）結果
２５ＯＨビタミンＤ３非存在下、存在下（１μｇ／ｍＬ）で反応性に顕著な差のあるクローン（Ｗｅｌｌ Ｎｏ．４， ５２， ８０， ８１， ９４， １２０）を高率に得ることに成功した（６クローン／１７４＝３．４％：図６、７を参照）。

【0150】

実施例１３：親和性複合体（２５ＯＨビタミンＤ３−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体複合体）抗体の特異性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、特異性を評価した。
・アッセイプレートに抗２５ＯＨビタミンＤ抗体、抗Ｔ３抗体をそれぞれ１μｇ／ｍＬで固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・２５ＯＨビタミンＤ３、ならびにその類似物質である２５ＯＨビタミンＤ２、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２をそれぞれ２００ｎｇ／ｍＬに調製し５０μＬずつ加えインキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・上記手法で樹立した抗体を各クローン５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ｂｉｏｔｉｎを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを加え、３次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0151】

（２）結果
結果は、表１１に示したとおりである。クローン３−２Ｄ１−１２および３−２Ｄ１−２２は、抗原とした２５ＯＨビタミンＤ３−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体複合体および２５ＯＨビタミンＤ２−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体複合体に対して特異的に結合した（＊を参照）。クローン３−２Ｄ１−１２および３−２Ｄ１−２２は、ネガティブコントロールとして用いた抗Ｔ３抗体には結合しなかった。なお、クローン３−２Ｄ１−１２および３−２Ｄ１−２２は、実施例１２で得られたクローン４のサブクローンに対応する。

【0152】

【表11】

【0153】

実施例１４：２５ＯＨビタミンＤ３に対する目的抗体の特異性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、２５ＯＨビタミンＤ３に対する目的抗体の特異性を評価した。
・アッセイプレートに２５ＯＨビタミンＤ３−ＢＳＡコンジュゲートを１μｇ／ｍＬ固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・上記手法で樹立した抗体を各クローン５０μＬずつ加え、１次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ｂｉｏｔｉｎを加え、２次反応を行った。
・１次反応に抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を用いた場合は、抗ＩｇＧ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを加え、３次反応を行った。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0154】

（２）結果
結果は、表１２に示したとおりである。クローン３−２Ｄ１−１２および３−２Ｄ１−１２は、２５ＯＨビタミンＤ３−ＢＳＡ固相ＥＬＩＳＡでは反応しなかった。このことは、これらのクローンが、２５ＯＨビタミンＤ３単独と結合しないことを示す。

【0155】

【表12】

【0156】

参考例１：抗２５ＯＨビタミンＤ抗体の交差反応性の確認
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、類似物質に対する抗２５ＯＨビタミンＤ抗体の交差反応性を評価した。
・アッセイプレートに１μｇ／ｍＬ 抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・アルカリホスファターゼ標識−２５ＯＨビタミンＤ３ ２００ｎｇ／ｍｌと２５ＯＨビタミンＤ３、２５ＯＨビタミンＤ２、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２、ビタミンＤ３またはビタミンＤ２を各濃度に調製して混合し、それぞれ５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ミリＱ水で２回洗浄した。
・ＰＮＰＰを加えて、発色反応を行った。
・２．５ｍＭ ＥＤＴＡを加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４０５を測定した。

【0157】

（２）結果
結果は、表１３に示したとおりである。表１３では、交差反応性（％）は、２５ＯＨビタミンＤ３に対する抗２５ＯＨビタミンＤ抗体の結合率を１００％として算出した場合、２５ＯＨビタミンＤ３類似因子に対する抗２５ＯＨビタミンＤ抗体の結合率に基づき算出している。抗２５ＯＨビタミンＤ抗体は、２５ＯＨビタミンＤ２、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３、および１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２と高い交差反応性を示したが、ビタミンＤ３およびビタミンＤ２とは実質的に交差反応性を示さなかった。

【0158】

【表13】

【0159】

実施例１５：類似物質に対する目的抗体の交差反応性の評価
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、類似物質に対する目的抗体の交差反応性を評価した。
・アッセイプレートに１μｇ／ｍＬ 抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・２５ＯＨビタミンＤ３、２５ＯＨビタミンＤ２、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３または１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２を各濃度に調製し、それぞれ５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・クローン３−２Ｄ１−１２をそれぞれに５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ｂｉｏｔｉｎを加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0160】

（２）結果
結果は、表１４に示したとおりである。表１４では、交差反応性（％）は、目的の親和性複合体（２５ＯＨビタミンＤ３−抗２５ＯＨビタミンＤ抗体複合体）に対する本発明の抗体の結合率を１００％として算出した場合、親和性複合体を構成する各因子またはその類似因子に対する本発明の抗体の結合率に基づき算出している。単独の抗２５ＯＨビタミンＤ抗体のみを使用する競合阻害アッセイでは、２５ＯＨビタミンＤ３、２５ＯＨビタミンＤ２、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２、および１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を識別することができなかったが、本発明の抗体を用いたサンドイッチアッセイにより、２５ＯＨビタミンＤ３および２５ＯＨビタミンＤ２を識別して測定することができた。

【0161】

【表14】

【0162】

実施例１６：目的抗体を用いた測定における２５ＯＨビタミンＤ３に対する感度
（１）方法
ＥＬＩＳＡを以下の手順により行って、目的抗体を用いた測定における２５ＯＨビタミンＤ３に対する感度を評価した。
・アッセイプレートに１μｇ／ｍＬ 抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を固相化した。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・１％ ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・２５ＯＨビタミンＤ３を各濃度に調製し、５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・クローン３−２Ｄ１−１２を５０μＬずつ加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＭ−ｂｉｏｔｉｎを加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを加え、インキュベーションした。
・ＰＢＳＴで３回洗浄した。
・ＴＭＢを加え、発色反応を行った。
・１Ｎ 硫酸を加えて発色反応を停止した。
・ＯＤ４５０を測定した。

【0163】

（２）結果
結果は、表１５、図８に示したとおりである。樹立した抗体、クローン３−２Ｄ１−１２を用いたサンドイッチ法により、３ｎｇ／ｍｌ以下の２５ＯＨビタミンＤ３の検出が可能であった。

【0164】

【表15】

【0165】

実施例１７：Ｅ２および抗Ｅ２抗体の複合体に対する本発明の抗体の特異性
（１７−１）競合法による固相抗体（１次抗体）の特異性の評価
本発明の抗体の特異性を評価するため、先ず、Ｅ２に対する一次抗体の特異性を評価した。

【0166】

（Ａ）方法
（ｉ）１次抗体の固相化
以下の手順により、抗Ｅ２抗体（Ｆ１８−３）を固相化した。
・ＮＵＮＣ Ｐｏｌｙｓｏｒｐに抗Ｅ２抗体（０．５μｇ／ｍｌ）を加え、一晩インキュベートした。
・抗Ｅ２抗体を固相化したプレートを５％スキムミルクでブロッキングした（３７Ｃ，１ｈｒ）。
（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ
以下の手順により、ＥＬＩＳＡを行った。なお、Ｅ２−３ ｓｕｌｆａｔｅは、Ｅ２の３位の水酸基中の水素原子が硫酸基で置換された化合物である。
・抗原：Ｅ２（６ｎｇ／ｍｌから３ｎ倍希釈）と類似抗原：Ｅ１，Ｅ３，Ｅ２−３ ｓｕｌｆａｔｅ（５４ｎｇ／ｍｌから３ｎ倍希釈）を調製した。
・標識抗原：Ｅ２−３位ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）融合体（４６ｎｇ／ｍｌ）を調製した。
・固相プレートに抗原または類似抗原（各５０μｌ）と標識抗原（５０μｌ）を添加した。
・固相プレートを３７℃で１ｈインキュベートした。
・固相プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。
・ｐＮＰＰで発色させ、吸光度を測定した。
・抗原または類似抗原の添加なしを１００％として、各濃度の抗原または類似抗原を添加した際の阻害率（％ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を算出した。

【0167】

（Ｂ）結果
本測定法に用いた１次抗体は、Ｅ１およびＥ３への交差反応性は認められなかったが（図９）、Ｅ２−３ ｓｕｌｆａｔｅには１０％程度の交差反応性が認められた（図９）。したがって、この一次抗体は、Ｅ２に対する特異性が必ずしも高くないことが示された。

【0168】

（１７−２）サンドイッチ法による測定の特異性の改善（１）
本発明の抗体を用いることで、生体内類似物質に対するＥ２の特異的な測定の改善が可能かどうかを評価した。

【0169】

（Ａ）方法
（ｉ）１次抗体の固相化
以下の手順により、抗Ｅ２抗体〔上記（１７−１）で用いたものと同じ〕を固相化した。
・ＮＵＮＣ Ｐｏｌｙｓｏｒｐに抗Ｅ２抗体（２．５μｇ／ｍｌ）を加え、一晩インキュベートした。
・抗Ｅ２抗体を固相化したプレートを５％スキムミルクでブロッキングした（３７Ｃ，１ｈｒ）。

【0170】

（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ
以下の手順により、ＥＬＩＳＡを行った。
・抗原：Ｅ２（２ｎｇ／ｍｌから３ｎ倍希釈）と類似抗原：Ｅ１，Ｅ３，Ｅ２−３ｓ（５４ｎｇ／ｍｌから３ｎ倍希釈）を調製した。
・固相プレートに抗原、類似抗原（各５０μｌ）と２次抗体（ニワトリ由来Ｅ２抗Ｅ２抗体複合体抗体（クローン２−１）：５０μｌ）を添加した。
・固相プレートを３７℃で１ｈインキュベートした。
・固相プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。
・固相プレートに抗ニワトリ（ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ） ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・固相プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。
・ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）で発色させ、吸光度を測定した。

【0171】

（Ｂ）結果
本発明の抗体は、「Ｅ２および１次抗体の複合体」と「Ｅ２−３ ｓｕｌｆａｔｅおよび１次抗体の複合体」を判別可能であった（図１０）。すなわち、本発明の抗体は、Ｅ２＋１次抗体の複合体中のＥ２−３位のｓｕｌｆａｔｅ基の有無を特異的に認識していると考えられる。したがって、本発明の抗体を用いることで、生体内類似物質に対するＥ２の特異的な測定が改善されることが示された。

【0172】

（１７−３）サンドイッチ法による測定の特異性の改善（２）
本発明の抗体を用いることで、治療用薬物に対するＥ２の特異的な測定の改善が可能かどうかを評価した。

【0173】

（Ａ）方法
（ｉ）１次抗体の固相化
以下の手順により、抗Ｅ２抗体〔上記（１７−１）で用いたものと同じ〕を固相化した。
・ＮＵＮＣ Ｐｏｌｙｓｏｒｐに抗Ｅ２抗体（２．５μｇ／ｍｌ）を加え、一晩インキュベートした。
・抗Ｅ２抗体を固相化したプレートを５％スキムミルクでブロッキングした（３７Ｃ，１ｈｒ）。

【0174】

（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ
・抗原：Ｅ２（２ｎｇ／ｍｌから３ｎ倍希釈）とＥ２類似治療用薬物（１００ｎｇ／ｍｌ）を調製した。Ｅ２類似治療用薬物としては、エストロムスチンおよびエストラムスチンを用いた。
・固相プレートに抗原、類似抗原（各５０μｌ）と２次抗体（ニワトリ由来Ｅ２抗Ｅ２抗体複合体抗体（クローン２−１）：５０μｌ）を添加した。
・固相プレートを３７℃で１ｈインキュベートした。
・固相プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。
・固相プレートに抗ニワトリ（ａｎｔｉ Ｃｈｉｃｋｅｎ） ＩｇＭ−ＨＲＰを加え、２次反応を行った。
・固相プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。
・ＴＭＢで発色させ、吸光度を測定した。
・Ｅ２測定時の吸光度に基づき類似薬物への交差反応性（％）を計算した。

【0175】

（Ｂ）結果
本発明の抗体は、「Ｅ２および１次抗体の複合体」と「Ｅ２類似治療用薬物および１次抗体の複合体」を判別可能であった（表１６）。したがって、本発明の抗体を用いることで、Ｅ２類似治療用薬物に対するＥ２の特異的な測定が改善されることが示された。

【0176】

【表16】

【0177】

実施例１８：２５（ＯＨ）ビタミンＤ２またはＤ３およびそれに対する抗体の複合体に対する本発明の抗体の特異性
（１８−１）競合法による固相抗体（１次抗体）の特異性の評価
本発明の抗体の特異性を評価するため、先ず、２５（ＯＨ）ビタミンＤ２に対する一次抗体の特異性を評価した。

【0178】

（Ａ）方法
（ｉ）１次抗体の固相化
以下の手順により、抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を固相化した。
・ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐに抗２５ＯＨビタミンＤ抗体（１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１ｈｒインキュベートした。
・抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を固相化したプレートを１％ ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした（３７Ｃ，１ｈｒ）。

【0179】

（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ
・抗原：２５ＯＨビタミンＤ３（１１１ｎｇ／ｍｌから３ｎ倍希釈）と類似抗原：２５ＯＨビタミンＤ２、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２（１１１ｎｇ／ｍｌから３ｎ倍希釈）を調製した。
・標識抗原：２５ＯＨビタミンＤ３−３位ＡＬＰ融合体（２０ｎｇ／ｍｌ）を調製した。
・固相プレートに抗原、類似抗原（各５０μｌ）と標識抗原（５０μｌ）を添加した。
・３７℃，１ｈｒインキュベーション
・ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）でｗａｓｈｘ３
・ｐＮＰＰで発色させ、吸光度を測定した。
・抗原または類似抗原の添加なしを１００％として、各濃度の抗原または類似抗原を添加した際の阻害率（％ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を算出した。

【0180】

（Ｂ）結果
本測定法に用いた１次抗体は、２５（ＯＨ）ビタミンＤ２、２５（ＯＨ）ビタミンＤ３、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２、および１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３に対して同程度の反応性を示した（図１１）。したがって、この一次抗体は、特定のビタミンＤに対する特異性が低いことが示された。

【0181】

（１８−２）サンドイッチ法による測定の特異性の改善
本発明の抗体を用いることで、生体内類似物質に対する特定のビタミンＤの特異的な測定の改善が可能かどうかを評価した。

【0182】

（Ａ）方法
（ｉ）１次抗体の固相化
以下の手順により、抗２５ＯＨビタミンＤ抗体〔上記（１８−１）で用いたものと同じ〕を固相化した。
・ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐに抗２５ＯＨビタミンＤ抗体（１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１ｈｒインキュベートした。
・抗２５ＯＨビタミンＤ抗体を固相化したプレートを１％ ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした（３７Ｃ，１ｈｒ）。

【0183】

（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ
・抗原：２５ＯＨビタミンＤ３（３７０ｎｇ／ｍｌから５ｎ希釈）と類似抗原：２５（ＯＨ）ビタミンＤ２（３７０ｎｇ／ｍｌから５ｎ希釈）、１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３、１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ２（３７０００ｎｇ／ｍｌから５ｎ希釈）を調製した。
・固相プレートに抗原、類似抗原（各５０μｌ）を添加した。
・ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）でｗａｓｈｘ３
・固相プレートに二次抗体（ニワトリ由来２５（ＯＨ）ビタミンＤ抗２５（ＯＨ）ビタミンＤ複合体抗体：５０μｌ）を添加した。
・固相プレートを３７℃で１ｈｒインキュベーションした。
・固相プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。
・固相プレートに抗ニワトリＩｇＧ抗体−ストレプトアビジン（５０μｌ）を添加した。
・固相プレートを３７℃で１ｈｒインキュベーションした。
・固相プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。
・固相プレートにストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）（５０μｌ）を添加した。
・固相プレートを３７℃で１ｈｒインキュベーションした。
・ＴＭＢで発色させ、吸光度を測定した。

【0184】

（Ｂ）結果
本発明の抗体は、「２５ＯＨビタミンＤ２またはＤ３および１次抗体の複合体」と「１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２またはＤ３および１次抗体の複合体」を判別可能であった（図１２）。すなわち、本発明の抗体は、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２またはＤ３および１次抗体の複合体中の１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２またはＤ３の１位のＯＨ基の有無を特異的に認識していると考えられる。したがって、本発明の抗体を用いることで、生体内類似物質に対する１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ２およびＤ３の特異的な測定が改善されることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]