特許 6158124 微生物計測システム、微生物計測方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6158124

(24)【登録日】2017年6月16日

(45)【発行日】2017年7月5日

(54)【発明の名称】微生物計測システム、微生物計測方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20170626BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20170626BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20170626BHJP

   G01N 21/76 20060101ALI20170626BHJP

   G01N 21/77 20060101ALI20170626BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/34 D

   C12Q1/06

   G01N33/50 P

   G01N21/76

   G01N21/77 D

【請求項の数】12

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2014-57498(P2014-57498)

(22)【出願日】2014年3月20日

(65)【公開番号】特開2015-181346(P2015-181346A)

(43)【公開日】2015年10月22日

【審査請求日】2016年8月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】595145050

【氏名又は名称】株式会社日立プラントサービス

(74)【代理人】

【識別番号】110001807

【氏名又は名称】特許業務法人磯野国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】宮下 野恵

(72)【発明者】

【氏名】田中 真

【審査官】 藤井 美穂

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−０１７８５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２１１７８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平９−１８２６００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−１４４５８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of the Society of Dairy Technology，１９９４年，Vol.47, No.4，pp.117-120

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００ − ３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の微生物に所定の試薬を供給することによって前記微生物の細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光反応手段と、
前記発光反応させた微生物の発光強度を計測する光学計測手段と、
前記光学計測手段で計測された発光強度の計測値を、ＡＴＰ量に換算するとともに演算結果を蓄積し、統計処理を行う演算制御手段と、
を有する微生物計測システムにおいて、
前記演算制御手段は、
正常状態において平板培養法により行われたＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果を入力する工程と、
前記ＣＦＵ計数と同時期に前記発光反応手段および前記光学計測手段を用いて行われたＡＴＰ測定の繰り返し測定の結果を入力する工程と、
前記ＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果に基づき、前記試料中に含まれるＣＦＵ数の確率密度関数の係数を決定する工程と、
前記ＡＴＰ測定の繰り返し測定の結果に基づき、１ＣＦＵあたりに含まれるＡＴＰ量の確率密度関数の係数を決定する工程と、
前記決定した２種類の確率密度関数の係数を用いて、正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する工程と、
前記決定した確率密度関数の妥当性について統計学的検定を行う工程と、
あらかじめ設定した汚染状態のＣＦＵ数に対応する汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する工程と、
前記決定した正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を用いて、あらかじめ設定した偽陽性確率以下となる警告基準値を算出する工程と、
前記決定した汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を用いて、あらかじめ設定した偽陰性確率以下となる警報基準値を算出する工程と、
ＡＴＰ測定が行われる度に、ＡＴＰ測定値に対し、警告基準値、警報基準値を満たすか検定する工程と、を実行する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項2】

請求項１に記載の微生物計測システムにおいて、
ＡＴＰ測定値の確率密度関数は、複数種類用意されており、
前記演算制御手段は、
更に、前記ＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果に基づき、ＡＴＰ測定値の確率密度関数の種類を選択する工程を、実行する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項3】

請求項１または２に記載の微生物計測システムにおいて、
前記演算制御手段は、
前記汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を、前記正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数の係数と同じ係数を用いて決定する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項4】

請求項１または２に記載の微生物計測システムにおいて、
前記演算制御手段は、
前記汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を、一般的な指標菌株を用いてあらかじめ求めた、平均ＡＴＰ量と標準偏差を係数として用いて決定する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、
前記演算制御手段は、
更に、前記ＣＦＵ計数とＡＴＰ測定の繰り返し測定結果が、統計学的検定を実施するに充分量格納されているか検定する工程を、実行する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、
前記演算制御手段は、
更に、所定期間の測定結果を用いて算出したＡＴＰ測定値の確率密度関数を、ＡＴＰ測定値の確率密度関数として用いる
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、
キー操作などでデータや管理条件の入力を行うデータ入力手段を、更に備え、
前記演算制御手段は、
更に、前記データ入力手段を用いて入力した前記汚染状態のＣＦＵ数、前記偽陽性確率、および前記偽陰性確率を用いる
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項8】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、
キー操作などでデータや管理条件の入力を行うデータ入力手段を、更に備え、
前記演算制御手段は、
更に、前記ＡＴＰ測定の際に、前記データ入力手段を用いて入力した試料に関する情報を用いる
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、
前記演算制御手段は、
更に、前記ＡＴＰ測定が行われる度に、ＡＴＰ測定値に対し、前記警告基準値、前記警報基準値を満たすか検定する工程の結果を踏まえて、警告または警報の動作を行う工程を、実行する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、
測定結果の印字出力を行う印刷手段を、更に備え、
前記演算制御手段は、
更に、前記ＡＴＰ測定結果とその解析に必要な情報を、前記印刷手段を用いて出力する工程を、実行する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、
前記演算制御手段は、
更に、前記ＡＴＰ測定結果の解析に必要な情報を、一方は改ざん不可能な保護形式、他方は解析作業が可能な非保護形式のデータファイルとして作成する工程を、実行する
ことを特徴とする微生物計測システム。

【請求項12】

試料中の微生物に所定の試薬を供給することによって前記微生物の細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光反応手段と、
前記発光反応させた微生物の発光強度を計測する光学計測手段と、
前記光学計測手段で計測された発光強度の計測値を、ＡＴＰ量に換算するとともに演算結果を蓄積し、統計処理を行う演算制御手段と、を有する微生物計測システムにおける微生物計測方法であって、
前記演算制御手段は、
正常状態において平板培養法により行われたＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果を入力する工程と、
前記ＣＦＵ計数と同時期に前記発光反応手段および前記光学計測手段を用いて行われたＡＴＰ測定の繰り返し測定の結果を入力する工程と、
前記ＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果に基づき、前記試料中に含まれるＣＦＵ数の確率密度関数の係数を決定する工程と、
前記ＡＴＰ測定の繰り返し測定の結果に基づき、１ＣＦＵあたりに含まれるＡＴＰ量の確率密度関数の係数を決定する工程と、
前記決定した２種類の確率密度関数の係数を用いて、正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する工程と、
前記決定した確率密度関数の妥当性について統計学的検定を行う工程と、
あらかじめ設定した汚染状態のＣＦＵ数に対応する汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する工程と、
前記決定した正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を用いて、あらかじめ設定した偽陽性確率以下となる警告基準値を算出する工程と、
前記決定した汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を用いて、あらかじめ設定した偽陰性確率以下となる警報基準値を算出する工程と、
ＡＴＰ測定が行われる度に、ＡＴＰ測定値に対し、警告基準値、警報基準値を満たすか検定する工程と、を実行する
ことを特徴とする微生物計測方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬品、食品などの製品、原材料、およびその製造環境中の微生物計測システムに関し、特にＡＴＰ法などの迅速微生物計測法を用いて微生物管理を行うための管理基準値の設定やその運用の技術に関する。

【背景技術】

【0002】

各種臨床医学施設や食品工場、医薬品製造工場、基礎研究の現場等の、無菌性や生物的清浄度が要求される施設では、製品の微生物汚染やヒトへの感染を回避するため、製品、原材料、および環境空気中の微生物の計数が成される。微生物の計数方法として、培養法が知られている。しかし、培養法による微生物の計数は、周知のとおり、その作業に多大な時間および労力が必要である。

【0003】

これに対し、より迅速で感度の高い微生物計測方法として、発光試薬や蛍光試薬を用いて微生物細胞の構成物を特異的に標識し、発光強度を計測して微生物数を求める方法が提案されている。このうち、ＡＴＰ法は、生きた細胞が含有する化学物質ＡＴＰ（Adenosine Triphosphate：アデノシン３リン酸）を微生物数の指標とする方法であり、数〜数十分程度で計測が可能である。

【0004】

ＡＴＰ法には、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応が用いられ、基質ルシフェリンと酵素ルシフェラーゼを含む発光試薬と、微生物の細胞から抽出したＡＴＰを含むサンプル溶液を混合し、反応させることにより生ずる光の発光量からＡＴＰ量を求めるというものである。特許文献１には、このような発光反応を利用して生菌の量を計測するためのキットが開示されている。

【0005】

ところで、培養法によって得られる微生物量は、寒天培地上に形成されたコロニーの数であるＣＦＵ（Colony Forming Unit：コロニー形成単位）で示される。各対象物や環境中に許容されるＣＦＵ数は局法やガイドライン等で規定されており、当業者はこれに逸脱することなく信頼性の高い製品を提供するために、注意喚起を行うアラートレベル、異常状態と判断し、再検査や生産ラインの稼働停止などの対応（アクション）を行うアクションレベルなどの管理基準値を経験則に基づいて設定し、管理している。

【0006】

特許文献１に開示されているキットによる生菌数の計測方法は、計測時間の短縮として確かな効果を挙げることができる。しかし、ＡＴＰ法で得られた結果を用いて実際に微生物管理を行うためには、ＡＴＰ量としての管理基準値を適切に設定する必要がある。

【0007】

微生物細胞が含有する１細胞あたりのＡＴＰ量は、微生物の種類によって異なる。試料中の微生物の種類が明らかな場合には、既知量の微生物を含む試料を用いて作成した検量線を利用し、ＣＦＵへ換算することができる。
試料中に複数種の微生物が混在している場合であっても、例えば特許文献２に開示されているように、標的微生物特異的抗体を用いて微生物を分離した後にＡＴＰ法で定量することにより、標的とする微生物数を求めることができる。しかしながら、この方法では、標的以外の微生物が含まれていてもこれを検出することができない。

【0008】

一方、特許文献３には、あらかじめ設定した任意の換算係数値を用いてＡＴＰ測定値をモデル微生物のＣＦＵに換算して逸脱の有無を検定すると同時に、測定結果を過去の測定結果と比較し、突発的な増加や連続的な増加の有無を検定することにより微生物管理を行う方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特許第３７７３１５１号公報

【特許文献2】特開２００６−８１５０６号公報

【特許文献3】特許第５０３００１５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

しかしながら、前述の特許文献１〜３に開示されているような方法では、以下の３点の理由から、適切な管理基準値を設定することが難しい。

【0011】

１点目に、ＣＦＵは微生物の増殖活性を指標に微生物量を定義しているのに対し、ＡＴＰ法は微生物の代謝活性を指標にしており、いずれも生理活性を指標にしているため相関が無いわけではないが、指標とする活性が異なることにより、ＡＴＰ量からＣＦＵへの換算には誤差が生じる。

【0012】

２点目に、生物細胞が含有する１細胞あたりのＡＴＰ量は、微生物の種類によって異なるが、同じ微生物種であってもその活性状態によって大きく変化する場合があるため、例えば設定した換算係数よりも極端にＡＴＰ量の少ない微生物が増殖してもそれを検知できないなど、微生物量の変化を適切にとらえられないおそれがある。

【0013】

３点目に、自然界の生態系は常に複数の微生物種で構成されているのが一般的で、ここで測定対象としている製品、原材料、および環境空気も同じであると考えられるが、その内訳や構成比は環境毎に異なり、また一定でない。従って、仮に一般的な微生物種の換算係数を用いたとしても、固定の換算係数でＡＴＰ測定値をＣＦＵに換算することは大きな誤差を生む可能性が高い。

【0014】

以上に示したような誤差要因や不確定要素が複数存在することから、これまで、微生物の管理基準値を適切に設定することは難しく、また、その管理精度がどれだけの範囲内に収まっているのか把握できないという問題があった。

【0015】

本発明の課題は、ＡＴＰ法など、従来の培養法と異なる計測単位の迅速微生物計測法を用い、製品、原材料、およびその製造環境中の微生物を計測するシステムにおいて、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、かつ、その管理精度を所望の範囲内に収め、これを用いた微生物管理を実現することである。

【課題を解決するための手段】

【0016】

前記課題を解決するために、請求項１に記載の微生物計測システムは、試料中の微生物に所定の試薬を供給することによって前記微生物の細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光反応手段と、前記発光反応させた微生物の発光強度を計測する光学計測手段と、前記光学計測手段で計測された発光強度の計測値を、ＡＴＰ量に換算するとともに演算結果を蓄積し、統計処理を行う演算制御手段と、を有する微生物計測システムにおいて、前記演算制御手段は、正常状態において平板培養法により行われたＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果を入力する工程と、前記ＣＦＵ計数と同時期に前記発光反応手段および前記光学計測手段を用いて行われたＡＴＰ測定の繰り返し測定の結果を入力する工程と、前記ＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果に基づき、前記試料中に含まれるＣＦＵ数の確率密度関数の係数を決定する工程と、前記ＡＴＰ測定の繰り返し測定の結果に基づき、１ＣＦＵあたりに含まれるＡＴＰ量の確率密度関数の係数を決定する工程と、前記決定した２種類の確率密度関数の係数を用いて、正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する工程と、前記決定した確率密度関数の妥当性について統計学的検定を行う工程と、あらかじめ設定した汚染状態のＣＦＵ数に対応する汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する工程と、前記決定した正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を用いて、あらかじめ設定した偽陽性確率以下となる警告基準値を算出する工程と、前記決定した汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を用いて、あらかじめ設定した偽陰性確率以下となる警報基準値を算出する工程と、ＡＴＰ測定が行われる度に、ＡＴＰ測定値に対し、警告基準値、警報基準値を満たすか検定する工程と、を実行することを特徴とする。
請求項１４についても同様である。

【0017】

また、請求項２に記載の微生物計測システムは、請求項１に記載の微生物計測システムにおいて、ＡＴＰ測定値の確率密度関数は、複数種類用意されており、前記演算制御手段は、更に、前記ＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果に基づき、ＡＴＰ測定値の確率密度関数の種類を選択する工程を、実行することを特徴とする。

【0018】

また、請求項３に記載の微生物計測システムは、請求項１または２に記載の微生物計測システムにおいて、前記演算制御手段は、前記汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を、前記正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数の係数と同じ係数を用いて決定することを特徴とする。

【0019】

また、請求項４に記載の微生物計測システムは、請求項１または２に記載の微生物計測システムにおいて、前記演算制御手段は、前記汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を、一般的な指標菌株を用いてあらかじめ求めた、平均ＡＴＰ量と標準偏差を係数として用いて決定することを特徴とする。

【0020】

また、請求項５に記載の微生物計測システムは、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、前記演算制御手段は、更に、前記ＣＦＵ計数とＡＴＰ測定の繰り返し測定結果が、統計学的検定を実施するに充分量格納されているか検定する工程を、実行することを特徴とする。

【0021】

また、請求項６に記載の微生物計測システムは、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、前記演算制御手段は、更に、所定期間の測定結果を用いて算出したＡＴＰ測定値の確率密度関数を、ＡＴＰ測定値の確率密度関数として用いることを特徴とする。

【0022】

また、請求項７に記載の微生物計測システムは、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、キー操作などでデータや管理条件の入力を行うデータ入力手段を、更に備え、前記演算制御手段は、更に、前記データ入力手段を用いて入力した前記汚染状態のＣＦＵ数、前記偽陽性確率、および前記偽陰性確率を用いることを特徴とする。

【0023】

また、請求項８に記載の微生物計測システムは、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、キー操作などでデータや管理条件の入力を行うデータ入力手段を、更に備え、前記演算制御手段は、更に、前記ＡＴＰ測定の際に、前記データ入力手段を用いて入力した試料に関する情報を用いることを特徴とする。

【0024】

また、請求項９に記載の微生物計測システムは、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、前記演算制御手段は、更に、前記ＡＴＰ測定が行われる度に、ＡＴＰ測定値に対し、前記警告基準値、前記警報基準値を満たすか検定する工程の結果を踏まえて、警告または警報の動作を行う工程を、実行することを特徴とする。

【0025】

また、請求項１０に記載の微生物計測システムは、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、測定結果の印字出力を行う印刷手段を、更に備え、前記演算制御手段は、更に、前記ＡＴＰ測定結果とその解析に必要な情報を、前記印刷手段を用いて出力する工程を、実行することを特徴とする。

【0026】

また、請求項１１に記載の微生物計測システムは、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物計測システムにおいて、前記演算制御手段は、更に、前記ＡＴＰ測定結果の解析に必要な情報を、一方は改ざん不可能な保護形式、他方は解析作業が可能な非保護形式のデータファイルとして作成する工程を、実行することを特徴とする。

【発明の効果】

【0027】

本発明によれば、ＡＴＰ法など、従来の培養法と異なる計測単位の迅速微生物計測法を用い、製品、原材料、およびその製造環境中の微生物を計測するシステムにおいて、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、かつ、その管理精度を所望の範囲内に収め、これを用いた微生物管理を実現することができる。具体的には、次の通りである。

【0028】

請求項１、１４に記載の発明によれば、ＣＦＵ計数とＡＴＰ測定の繰り返し測定結果に基づいて正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を求め、所望の偽陽性確率以下となる警告基準値、および所望の偽陰性確率以下となる警報基準値を決定し、ＡＴＰ測定値に対する管理を行うので、ＡＴＰ量からＣＦＵ計数値への換算誤差の影響がなく、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、所望の管理精度で微生物管理を行うことができる。
また、請求項１、１４に記載の発明によれば、求めた確率密度関数の妥当性を統計学的に検定した上で運用するので、確率分布モデル（確率密度関数）と実際の確率分布との差異を所定の範囲内に収めることができ、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、微生物管理を行うことができる。

【0029】

測定対象物中の微生物量が少ない場合には、対象物中の微生物種やその構成比、活性状態によるばらつきの影響が相対的に大きくなるため、ＡＴＰ測定値は微生物量が充分に多い場合とは異なる確率分布を示すと考えられる。
請求項２に記載の発明によれば、ＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果に基づき、ＡＴＰ測定値の確率分布モデル（確率密度関数）の種類を選択するので、測定対象物中の平均ＣＦＵ数に基づき、各微生物量における最適な確率分布モデルを設定し、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、微生物管理を行うことができる。

【0030】

クリーンルームなどの閉鎖的な環境や、ｐＨなど微生物にとっての生育環境として特徴的な性質をもつものを測定対象とした場合、そこで検出される微生物種はある程度限定される場合がある。この場合、測定対象物の汚染状態とは、正常状態の時と菌種やその構成比などの状態が変わらないまま、菌数が増えていることが予想される。
請求項３に記載の発明によれば、汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を、正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数の係数と同じ係数を用いて決定するので、前述の、正常状態と汚染状態とで菌の状態が変わらない測定対象物のＡＴＰ測定において、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、微生物管理を行うことができる。

【0031】

一方、前述のように一般的な生態系と同様、測定対象部中の微生物種の内訳や構成比は環境毎に異なり、また一定でないことから、正常状態の時と汚染状態の時との間でこれらが大きく変わる可能性は大きい。
請求項４に記載の発明によれば、汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を、指標菌株等を用いてあらかじめ求めた、平均ＡＴＰ量と標準偏差を係数として用いて決定するので、前述の、正常状態と汚染状態とで菌の状態が変わる測定対象物のＡＴＰ測定において、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、微生物管理を行うことができる。

【0032】

本発明の微生物計測システムにおいて、ＡＴＰ測定値の確率分布モデル（確率密度関数）は、ＣＦＵ計数とＡＴＰ測定の繰り返し測定において、検出されたデータに基づいて構築するので、例えば清浄度が高く、検出件数の少ない状態で確率密度関数を求めても実際との差異が大きくなってしまう。
請求項５に記載の発明によれば、ＡＴＰ測定の繰り返し測定が終了した時点で、これを用いて求める確率密度関数の妥当性を確認する統計学的検定を行うのに充分量のデータが蓄積されているか検定するので、少ないデータで誤差の大きい確率分布モデルを構築するおそれがなく、従来よりも精度よく管理基準値を設定し、微生物管理を行うことができる。

【0033】

前述のとおり、一般的な生態系と同様、測定対象部中の微生物種の内訳や構成比は環境毎に異なり、また一定でないため、例えば施設のブレーク後（メンテナンス後）や、季節の変動などの要因により、測定対象物中のＡＴＰ測定値の確率分布が変化する可能性がある。
請求項６に記載の発明によれば、所定期間の測定結果を用いて算出したＡＴＰ測定値の確率密度関数を演算制御手段が用いるので、過去の関数と比較することができ、前述のような、ＡＴＰ測定値の長期な変動を検証し、必要に応じて管理基準値を設定し直すことにより、従来よりも精度よく微生物管理を行うことができる。

【0034】

一般に微生物の管理基準値は、製品汚染やヒトへの感染のリスクの大きさに応じて設定され、それぞれに対して求める管理精度もリスクの大きさに応じて異なる。
請求項７に記載の発明によれば、データ入力手段を用いて入力した汚染状態のＣＦＵ数、偽陽性確率、および偽陰性確率を演算制御手段が用いるので、測定対象物毎にこれを設定して、個別の微生物管理運用ができ、従来よりも精度よく微生物管理を行うことができる。

【0035】

無菌性や生物的清浄度が要求される施設では、製品や原材料、環境など複数種類の対象物について、微生物測定を行う場合が多く、同じ測定対象にについて複数のサンプル採取位置を設けることも珍しくない。各測定結果と測定物の情報とが正しく関連づけて記録されなければ、測定結果の考察をあやまるおそれがある。

【0036】

更に、ＡＴＰ法など試薬を用いる微生物計測法を用いる場合には、製品の適切な品質管理を行うために、測定に用いた試薬のロット情報などが追跡確認できる必要がある。
請求項８に記載の発明によれば、ＡＴＰ測定の際に、データ入力手段を用いて入力した測定対象物の種類、測定位置、試薬のロット情報などの試料に関する情報を演算制御手段が用いるので、測定結果と試料に関する情報を間違った組み合わせで記録してしまうおそれがなく、従来よりも精度よく微生物管理を行うことができる。

【0037】

無菌性や生物的清浄度が要求される施設の微生物管理では、生物学的汚染が発生した場合、その被害を最小限におさえるために、迅速な対応をとることが求められる。
請求項９に記載の発明によれば、ＡＴＰ測定値が管理基準値を満たすか検定した結果に基づき、警告または警報の動作を起動するので、あらかじめ設定した管理基準に則って、これを逸脱した場合にはヒトの判断を介さずに迅速な対応をとることができ、従来よりも精度よく微生物管理を行うことができる。

【0038】

一般に、医薬品など製品の高い品質保証が求められる製造施設では、その微生物管理における測定結果は重要な意味を持ち、改ざんや損失など測定結果が損なわれた場合には、適正な品質保証ができなくなる。
請求項１０に記載の発明によれば、ＡＴＰ測定の結果とその解析に必要な情報が、紙に印字されて出力されるので、改ざんの余地がなく、従来よりも精度よく微生物管理を行うことができる。
また、請求項１１に記載の発明によれば、ＡＴＰ測定の結果とその解析に必要な情報が、保護形式のデータファイルとして保存できるので、改ざんおよび損失のおそれがなく、従来よりも精度よく微生物管理を行うことができる。

【0039】

一方で、無菌性や生物的清浄度が要求される施設の微生物管理では、微生物管理の継続的な改善によりその質を高めていくために、微生物測定のデータを用いて、より多面的な解析を行う場合がある。
請求項１１に記載の発明によれば、記録、保管用のデータファイルとは別に非保護形式のデータファイルを保存できるので、これを用いて、自由に解析、考察を行うことができ、従来よりも精度よく微生物管理を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】本発明の実施形態における微生物計測システムの構成説明図である。

【図2】本発明の実施形態における微生物計測システムの、偽陽性および偽陰性と管理基準値との関係を示す説明図である。

【図3A】本発明の実施形態における微生物計測システムの管理基準値設定の概略を示すフローチャートの前半部分である。

【図3B】本発明の実施形態における微生物計測システムの管理基準値設定の概略を示すフローチャートの後半部分である。

【図4】本発明の実施形態における微生物計測システムの、運用方法の概略を示すフローチャートである。

【図5A】本発明の実施形態における微生物計測システムの、長期的変動解析用グラフ（形式Ａ）の概略説明図である。

【図5B】本発明の実施形態における微生物計測システムの、長期的変動解析用グラフ（形式Ｂ）の概略説明図である。

【図6】本発明の実施形態における微生物計測システムの、結果報告書を説明する概略図である。

【図7】本発明の実施形態における微生物計測システムの、データの格納と出力結果ファイルの構成を示す概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

次に、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
以下では、本発明の実施形態に係る微生物計測システムの全体構成と動作について説明した後に、本発明の微生物計測システムにおけるＡＴＰ測定値の確率分布モデルと、これを用いた実際の管理基準値の設定手順および運用方法について説明する。

【0042】

＜微生物計測システム＞
図１に示すように、微生物計測システム１は、後記する複数の要素からなり、液状の試料２中の微生物をフィルタ３０ａ上に回収するろ過回収部３と、ＡＴＰ法で用いる一連の試薬を分取分注する試薬分注部４と、ＡＴＰ発光の発光測定を行う発光測定部５と、後述するポンプやモータの動作を制御する制御部６と、測定結果から試料２中のＡＴＰ量の算出や管理基準値設定のための演算を行う演算部７と、キー操作などでデータの入力が可能なデータ入力部８と、測定結果を印字して出力する印刷部９と、測定工程の進捗状況や測定結果が表示される表示部１０と、を備えて構成されている。
なお、本発明の請求項１、１４における発光反応手段がろ過回収部３および試薬分注部４に、光学計測手段が発光測定部５に、演算制御手段が演算部７に、それぞれ相当する。

【0043】

（ろ過回収部）
ろ過回収部３は、液状の試料２の中から微生物を分離・回収するものである。ろ過回収部３は、フィルタ３０ａを内部に有する回収容器３０と、回収容器ホルダ３１と、回収容器３０の内容物を、フィルタ３０ａを介して真空引きするろ過装置３２と、を備えている。
回収容器３０は、これに投入される試料２に含まれる微生物を分離すると共に、この分離した微生物のＡＴＰを抽出して回収するものである。

【0044】

回収容器３０は、ロート状に形成された本体の底部にフィルタ３０ａが設けられて構成されている。本実施形態でのフィルタ３０ａは、図示しないが、親水性フィルタと、疎水性フィルタの二枚重ねになっており、二枚重ねの上側に親水性フィルタが配置され、二枚重ねの下側に疎水性フィルタが配置されている。

【0045】

このように構成された回収容器３０は、次に説明するろ過装置３２の吸引ヘッド３２ａを介して吸引しない限りは、本体に投入された試料２をフィルタ３０ａ上に保持するようになっている。また、吸引ヘッド３２ａで吸引すると、フィルタ３０ａは、試料２のうち微生物（図示省略）をフィルタ３０ａ上に残して、その液状成分を、フィルタ３０ａを介して吸引ヘッド３２ａ側に排出できるようになっている。
なお、回収容器３０は、微生物計測システム１内に設けられる処理ステージ１００の所定の位置に着脱自在に取り付けられる。

【0046】

ろ過装置３２は、吸引ヘッド３２ａと、吸引ヘッド３２ａを上下移動させるナット３２ｂ、ボールネジ軸３２ｃ、およびモータ３２ｄと、吸引ヘッド３２ａを介して回収容器３０の内容物を真空引きする吸引ポンプ３２ｅと、を備えている。

【0047】

吸引ヘッド３２ａは、前記したように、上下移動可能になっており、回収容器３０の内容物をフィルタ３０ａでろ過する場合には、吸引ヘッド３２ａが上昇して吸引ヘッド３２ａと回収容器３０とを連結させる。また、回収容器３０を処理ステージ１００に取り付け、又は処理ステージ１００から取り外す際には、吸引ヘッド３２ａは下降して吸引ヘッド３２ａと回収容器３０との連結を解く。

【0048】

そして、このような吸引ヘッド３２ａに連結された吸引ポンプ３２ｅが起動することで、前記したように、回収容器３０内の液状成分は、フィルタ３０ａ、吸引ヘッド３２ａ、及び吸引ポンプ３２ｅを介して微生物計測システム１の図示しない廃液貯留槽内に排出される。
なお、吸引ポンプ３２ｅの駆動及び停止、並びにモータ３２ｄの駆動及び停止は、制御部６の駆動制御部６１及びろ過制御部６２によって制御される。

【0049】

（試薬分注部）
試薬分注部４は、ノズル４０と、微生物計測システム１の筐体内でノズル４０を移動させるＸＹ軸アクチュエータ４１ａおよびＺ軸アクチュエータ４１ｂと、ノズル４０に所定量の液体を吸引させ、又は排出させるポンプ４２と、試薬を貯留する試薬チューブ４３および試薬チューブホルダ４４と、を備えている。

【0050】

この試薬分注部４によれば、そのノズル４０が、後記する試料２のＡＴＰ量を測定する工程において、試薬チューブ４３のＡＴＰ消去試薬（不図示）とＡＴＰ抽出試薬（不図示）を、試料２が入った回収容器３０に分注し、得られた反応液１１０ａの所定量を、次に説明する発光測定部５の構成要素である測定チューブ５０に分注するようになっている。また、ノズル４０は、試薬チューブ４３のＡＴＰ発光試薬１１０ｄを測定チューブ５０に分注するようになっている。

【0051】

また、ノズル４０は、後記するブランクサンプル液１１０ｂのＡＴＰ量を測定する際には、試薬チューブ４３のＡＴＰ消去試薬とＡＴＰ抽出試薬を図示しないブランクサンプル容器に分注し、得られたブランクサンプル液１１０ｂを測定チューブ５０に分注するとともに、試薬チューブ４３のＡＴＰ発光試薬１１０ｄを測定チューブ５０に分注する。

【0052】

また、ノズル４０は、後記するＡＴＰ標準試薬１１０ｃのＡＴＰ量を測定する際には、試薬チューブ４３のＡＴＰ標準試薬１１０ｃを測定チューブ５０に分注するとともに、試薬チューブ４３のＡＴＰ発光試薬１１０ｄを測定チューブ５０に分注する。なお、前述した反応液１１０ａ、ブランクサンプル液１１０ｂおよびＡＴＰ標準試薬１１０ｃは、いずれもＡＴＰの測定対象となる液である。

【0053】

また、試薬分注部４のＸＹ軸アクチュエータ４１ａおよびＺ軸アクチュエータ４１ｂによるノズル４０の三次元的な移動は、駆動制御部６１による所定の制御によって実現される。回収容器３０および試薬チューブ４３の各試薬充填部には液面を検知するセンサ（不図示）が搭載されており、その情報に基づいて分取分注時のノズル４０のＺ軸方向の位置が制御される。また、分取分注量の調節は、試薬分注制御部６０による所定の制御によって実現される。

【0054】

（発光測定部）
発光測定部５は、反応液１１０ａ、ブランクサンプル液１１０ｂ、およびＡＴＰ標準試薬１１０ｃのいずれかと、ＡＴＰ発光試薬１１０ｄとを受け入れて発光反応させる測定チューブ５０と、測定チューブホルダ５１と、これらの発光反応時の発光強度を検出する光電子増倍管等を有するフォトンカウンティングユニット５２と、を備えて構成されている。

【0055】

フォトンカウンティングユニット５２は、測定チューブ５０におけるＡＴＰ発光強度の検出信号を演算部７に出力する。つまり、フォトンカウンティングユニット５２は、「反応液のＡＴＰ発光強度」の検出信号と、「ブランクサンプル液のＡＴＰ発光強度」の検出信号と、「ＡＴＰ標準試薬のＡＴＰ発光強度」の検出信号と、をそれぞれ出力する。

【0056】

（演算部）
演算部７は、フォトンカウンティングユニット５２から出力される「反応液のＡＴＰ発光強度」の検出信号と、「ブランクサンプル液のＡＴＰ発光強度」の検出信号とに基づいて、それぞれのＡＴＰ発光強度同士の差分発光強度を演算する。また、演算部７は、この差分発光強度と「ＡＴＰ標準試薬のＡＴＰ発光強度」に基づいて、試料２中の微生物に含まれるＡＴＰの量を演算して求める。

【0057】

測定結果は、試料２のＡＴＰ測定時にデータ入力部８から入力された、試料の情報と関連づけた形で演算部７内のメモリ７０に格納される。なお、この試料の情報には、請求項における、正常状態のＣＦＵ計数の繰り返し測定の工程においては、ＣＦＵ計数結果も含まれる。

【0058】

また、演算部７のメモリ７０には、微生物管理における偽陽性や偽陰性の許容値などの条件値が格納されており、ＡＴＰ測定結果とこれを用いて、測定対象物のＡＴＰ測定値の確率モデル構築のための一連の計算や管理基準値の算出を行う。これについては後で詳しく説明する。

【0059】

＜微生物計測システムの動作及びＡＴＰの定量原理＞
次に、微生物計測システム１の動作及びＡＴＰの定量原理について説明する。

【0060】

微生物計測システム１では、回収容器３０が処理ステージ１００に配置され、次いでこの回収容器３０に検査対象となる試料２が注入された後、図示しない起動スイッチがオンにされることで制御部６が次の手順を実行する。

【0061】

吸引ヘッド３２ａは上昇して回収容器３０と連結する。次に、吸引ポンプ３２ｅが起動し、回収容器３０の内容物（試料２）のろ過を開始する。このろ過工程によって、フィルタ３０ａ上に微生物が回収されると共に、試料２中の液体成分は、吸引ヘッド３２ａ側に排出される。この際、試料２液体成分に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰの大部分、及び後のＡＴＰの発光反応を阻害する物質もこの液体成分と共に排出される。

【0062】

次に、回収容器３０の内容物のろ過が完了した後、回収容器３０内にバッファ液が注入され、再度吸引ポンプ３２ｅが起動して、回収容器３０の内容物をろ過する。
これにより回収容器３０の内表面などに付着していた微生物もフィルタ３０ａ上に回収される。このバッファ液としては、ＡＴＰを含まない滅菌水等が好適に使用される。

【0063】

次のステップでは、回収容器３０内にＡＴＰ消去試薬が分注される。
ＡＴＰ消去試薬は、試薬チューブ４３に配置されており（不図示）、前記の試薬分注部４のノズル４０によって、回収容器３０に所定量分注される。
このＡＴＰ消去試薬の分注によって、微生物の細胞外に存在するＡＴＰは、より確実に消去される。このＡＴＰ消去試薬としては、例えば、ＡＴＰ分解酵素が挙げられる。

【0064】

次いで、試薬分注部４のノズル４０は、試薬チューブ４３に配置されたＡＴＰ抽出試薬（不図示）の所定量を回収容器３０内に分注する。
このＡＴＰ抽出試薬の分注によって、微生物に含まれるＡＴＰが抽出されて回収容器３０内に反応液１１０ａが作製される。

【0065】

このＡＴＰ抽出試薬としては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸、トリス緩衝液等を好適に使用することができる。

【0066】

次いで、試薬分注部４のノズル４０は、回収容器３０内の反応液１１０ａを分取し、発光測定部５の測定チューブ５０に分注する。

【0067】

更に、試薬分注部４のノズル４０は、試薬チューブ４３に配置されたＡＴＰ発光試薬１１０ｄを発光測定部５の測定チューブ５０に分注する。
このＡＴＰ発光試薬１１０ｄとしては、例えば、ルシフェラーゼ・ルシフェリン試薬が挙げられる。
これにより、測定チューブ５０内では反応液１１０ａのＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬１１０ｄの反応によって発光を生じる。

【0068】

次に、演算部７は、フォトンカウンティングユニット５２がＡＴＰの発光強度を検出して出力した検出信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する。
そして、この発光強度の値（データ）は、メモリ７０に一旦格納される。

【0069】

次に、ノズル４０は、試薬チューブ４３に配置されているＡＴＰ消去試薬を同じく試薬チューブ４３に配置されているブランクサンプル容器（不図示）に分注する。

【0070】

また、ノズル４０は、試薬チューブ４３に配置されているＡＴＰ抽出試薬をブランクサンプル容器に分注する。
このＡＴＰ抽出試薬の分注によって、試薬や容器由来の測定対象外となるＡＴＰ、を含むブランクサンプル液１１０ｂがブランクサンプル容器に作製される。

【0071】

次いで、測定チューブ５０は新たなものと取り替えられる。そして、ノズル４０は、ブランクサンプル容器内のブランクサンプル液１１０ｂを分取し、発光測定部５の測定チューブ５０に分注する。

【0072】

また、ノズル４０は、試薬チューブ４３に配置されているＡＴＰ発光試薬１１０ｄを測定チューブ５０に分注する。
これにより、測定チューブ５０内ではブランクサンプル液１１０ｂ中のＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬１１０ｄとの反応によって発光を生じる。

【0073】

次に、演算部７は、フォトンカウンティングユニット５２がＡＴＰの発光強度を検出して出力した検出信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する。
そして、この発光強度の値（データ）は、メモリ７０に一旦格納される。

【0074】

次いで、測定チューブ５０は新たなものと取り替えられる。そして、ノズル４０は、試薬チューブ４３に配置されているＡＴＰ標準試薬１１０ｃを分取し、測定チューブ５０に分注する。

【0075】

また、ノズル４０は、試薬チューブ４３に配置されているＡＴＰ発光試薬１１０ｄを測定チューブ５０に分注する。
これにより、測定チューブ５０内ではＡＴＰ標準試薬１１０ｃ中のＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬１１０ｄとの発光反応によって発光を生じる。

【0076】

次に、演算部７は、フォトンカウンティングユニット５２がＡＴＰの発光強度を検出して出力した検出信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する。
そして、この発光強度の値（データ）は、メモリ７０に一旦格納される。

【0077】

次に、演算部７は、メモリ７０を参照して、試料２の発光強度と、ブランクサンプルの発光強度の差分発光強度を演算する。更に、演算部７は、ＡＴＰ標準試薬の発光強度に基づいて、前記差分発光強度に対応するＡＴＰ量（ａｍｏｌ）を演算し、測定結果を表示部１０に表示するとともに、測定結果を印刷部９から出力する。これにより、微生物計測システム１における一連のＡＴＰ測定工程が終了する。

【0078】

以上で説明した一連のＡＴＰ測定工程は、本発明の実施形態における微生物計測システム１の管理基準値設定の概略を示すフローチャートを示した、図３Ａ、図３ＢにおけるステップＳ２に相当する。
なお、この一連の工程に先立って、図示しないデータ入力部８を用いて、測定対象物の種類やサンプリング位置、用いた試薬のロットなど、試料２に関する情報がメモリ７０に格納される。

【0079】

また、前記したように、試料２のＡＴＰ測定結果と関連づけてメモリ７０に格納される情報には、ＡＴＰ測定とあわせてＣＦＵ計数（手作業または機械計数）を行った場合の測定結果も含まれる。
このＣＦＵ計数工程は、本発明の実施形態における微生物計測システム１の管理基準値設定の概略を示すフローチャートを示した、図３Ａ、図３ＢにおけるステップＳ１（以下、「図３Ａ、図３Ｂにおける」の記載は適宜省略）に相当し、測定結果は、ＡＴＰ測定の工程（ステップＳ２）とは独立に、メモリ７０に格納される。

【0080】

＜ＡＴＰ測定値の確率分布モデル＞
ここでは本実施形態におけるＡＴＰ測定値の確率分布モデルの基本となる確率密度関数について説明する。測定対象物の状態によって主に以下の２種類のモデルのうち適切なものを選択して使用する。

【0081】

（複合ポワソンモデル）
本モデルは、サンプル中の菌数が少ない環境に対応する。
ＡＴＰ測定値Ｓは、捕集した菌のＡＴＰ量の和であり、次式（１）で表される。

【数1】

ここで、Ｎは捕集菌数、Ｘ_ｉは１菌あたりのＡＴＰ量、Ｘ^０は菌が捕集されなかったときのＡＴＰ量測定値であり、Ｎ、Ｘ_ｉ、Ｘ^０ともにある確率分布に従う確率変数である。

【0082】

（１）捕集菌数Ｎの分布
捕集菌数Ｎはポアソン分布に従うと考えられ、確率密度関数ｆ_Ｎ（ｋ）は以下の式（２）のようになる。

【数2】

λは確率モデルのパラメータであり、環境における捕集菌数の期待値によって決まる。

【0083】

（２）ＡＴＰ量の分布
菌に含まれるＡＴＰ量Ｘ_ｉはそれぞれ独立にある分布に従うと考えられる。Ｘ_ｉの分布は菌種や菌活性の状態で変わり、また分布の中には試薬反応のばらつきなど測定装置に起因するばらつきも含まれる。本手法ではガンマ分布でＸ_ｉを近似する。確率密度関数ｆ_ｘ（ｘ）は以下の通りである。

【数3】

μ、σは確率モデルのパラメータであり、それぞれ、１菌あたりのＡＴＰ量の平均値、標準偏差を表す。μ、σは捕集される菌の種類など測定環境によって変わる。

【0084】

ここで、菌がｋ個捕集されたときのＡＴＰ量Ｘ^ｋを考える。

【数4】

Ｘ^ｋは、ガンマ分布の再生性から、以下の式（３）のようなガンマ分布となる。

【数5】

【0085】

（３）菌が捕集されなかったときのＡＴＰ量Ｘ^０
Ｘ^０は装置のブランク測定値のばらつきに相当すると考えられ、以下の式（４）のように正規分布で近似する。

【数6】

ここで、μ_ｂ、σ_ｂは、それぞれ、バイオメイテクター（登録商標。日立製作所製の高感度ＡＴＰ測定装置）でブランク測定を行った際の平均、標準偏差で、装置仕様で定められる。

【0086】

（４）ＡＴＰ測定値の確率密度関数
式（２）、（３）、（４）を用い、ＡＴＰ量の測定値Ｓの確率密度関数ｆ_Ｓ（ｘ）は次式（５）で求められる。

【数7】

なお、実際の計算では、実用上問題が無いと考えられる菌数ｋ_ｍａｘで計算を打ち切る。

【0087】

（正規分布モデル）
平均捕集菌数が多い環境では、ＡＴＰ量測定値の分布はほぼ正規分布で近似できると考える。２．１節の複合ポアソン分布における平均μ_Ｓ＝λμ、分散σ_Ｓ^２＝λ（μ^２＋σ^２）から、パラメータの整合性を考慮して、ＡＴＰ測定値Ｓを次式（６）で近似する。

【数8】

λは捕集菌数の期待値に関するパラメータ、μ、σは、捕集される菌の種類など測定環境によって定まるパラメータである。

【0088】

＜ＡＴＰ測定値の確率分布モデルのパラメータ設定＞
本実施形態の微生物計測システム１では、実際に運用を開始する前に確率モデルのパラメータを推定する必要がある。そこで、本運用前に環境が正常な状態で繰り返し測定を行い、正常状態でのパラメータを推定する。推定のために必要なデータは、培養法で測定した捕集菌数と、微生物計測システム１で測定したＡＴＰ量である。

【0089】

【0090】

事前に行ったＡＴＰ量の繰り返し測定値がｘ_１、ｘ_２、・・・、ｘ_ｍのとき、菌のＡＴＰ量分布に関するパラメータμ、σは、次式（８）の対数尤度関数ｌ（λ、μ、σ）を最大にするように調整する。

【数9】

【0091】

【0092】

＜確率モデルの検証および事前測定の回数＞
（確率モデルの検証）
推定した確率モデルについてＧ検定を行う。検定は菌数分布（ポアソン分布）とＡＴＰ分布（複合ポアソン分布）の両方について行う。菌数分布は標本からの推定値個数が１（λ）なので、階級数４、自由度２のＧ検定を行う。ＡＴＰ分布標本からの推定値個数は２（μ、σ）であることから、階級数４、自由度１のＧ検定を行う。

【0093】

なお、Ｇ検定における階級数、自由度、推定値個数との間には、以下のような関係が成り立つ。
自由度＝階級数−１−推定値個数
そして、自由度は１以上が必要なので、自由度が１以上となるように階級数を設定する。
菌数分布のほうは、階級数を３にしてもよいが、パラメータ数（推定値個数）が２の他の確率モデルを採用する可能性も考慮すると、階級数を４にしておく必要がある。

【0094】

【0095】

ここで、ｙ_ε／２は標準正規分布の上側ε／２点である。μ、σは、それぞれ、１菌あたりのＡＴＰ量平均値、標準偏差である。事前測定はトータル捕集菌数ｎ_Ｆが所望の精度を満足する個数になるまで続けることが望ましい。精度を決めるのは捕集菌数であるため、清浄度が高く捕集菌数の少ない環境では多くの事前測定が必要で、清浄度が低く捕集菌数が多い環境では事前測定回数は比較的少なくて済む。

【0096】

＜ＡＴＰ測定値の管理基準値設定手順＞
図２は、本発明の実施形態における微生物計測システム１の、偽陽性および偽陰性と管理基準値との関係を示す説明図である。

【0097】

（警告基準値の設定）
測定値Ｓを使い、正常状態（＝帰無仮説）を有意水準ε_１で右側検定する。この検定が棄却された場合、有意水準ε_１で正常状態ではないと考えられる。検定が採択された場合は、「正常状態ではない」とは言い切れないということになる。

【数10】

ｘ_ｃ１を（１０）式により求め、正常状態の棄却域を次のように定める。
Ｓ＞ｘ_ｃ１
ｘ_ｃ１を警告基準値とする。

【0098】

（警報基準値の設定）
λ_ｅ、μ_ｅ、σ_ｅを汚染状態のＡＴＰ量確率分布モデルのパラメータとし、検定を行う。λ_ｅは汚染状態の菌数の想定値であり、元々培養法で基準としている菌数などを採用すればよい。μ_ｅ、σ_ｅは、正常状態と菌の状態が変わっていないとするならば正常状態と同じ値を採用する。または、一般的な菌の平均ＡＴＰ量、標準偏差を用いることもできる。

【0099】

測定値Ｓを使い、想定した汚染状態（＝帰無仮説）を有意水準ε_２で左側検定する。この検定が棄却された場合は有意水準ε_２で汚染状態ではないと考えられる。採択された場合は「汚染状態ではない」とは言い切れないということになる。

【数11】

・・・（１１）
ｘ_ｃ２を（１１）式により求め、汚染状態の棄却域を次のように定める。
Ｓ＜ｘ_ｃ２
ｘ_ｃ２を警報基準値とする。

【0100】

なお、有意水準のε_１やε_２としては、例えば、０．０１（１％）や０．０５（５％）などの統計学上の一般的な数字を使うこともできるが、ε_１は汚染していないのに汚染していると判断してしまう偽陽性の確率であり、ε_２は汚染しているのに汚染していないと判断してしまう偽陰性の確率であるので、運用の実情に合わせて、管理作業者が適切な値を設定することが望ましい（詳細は後記）。

【0101】

＜ＡＴＰ測定値の管理基準値の設定手順＞
続いて、実際の管理基準値設定手順について図３Ａ、図３Ｂを参照しながら説明する。図３Ａ、図３Ｂは、本発明の実施形態における微生物計測システム１の管理基準値設定の概略を示すフローチャートである。

【0102】

はじめに、測定対象物が正常な状態においてＣＦＵ計数の繰り返し測定（ステップＳ１）とＡＴＰ測定の繰り返し測定（ステップＳ２）を行う。ＡＴＰ測定の際には、測定に先立って、データ入力部８を用いて、サンプリング位置、用いた試薬のロットなど、試料２に関する情報がメモリ７０に格納される。

【0103】

ＣＦＵ計数の測定結果は、データ入力部８を介して微生物計測システム１のメモリ７０に格納される。一方、ＡＴＰ測定は微生物計測システム１を用いて測定され、その結果がメモリ７０に格納される（ステップＳ３）。
これらの繰り返し測定では、ＣＦＵ計数（ステップＳ１）とＡＴＰ測定（ステップＳ２）は同時に行われることが望ましいが、同じ対象物の正常な状態のデータであれば、必ずしも同時に行われたものである必要はない。

【0104】

次いで、演算部７はメモリ７０に格納された繰り返し測定結果について、データ量がＧ検定実施に充分量であるかの検定を行う（ステップＳ４）。具体的には、前述したように、各階級での度数期待値が５以上であることを基準に判定する。
ステップＳ４での判定がＮｏの場合は、ＣＦＵ計数とＡＴＰ測定の繰り返し測定に戻り、測定回数を増やす（ステップＳ５）

【0105】

ステップＳ４での判定がＹｅｓの場合は、演算部７が、ＣＦＵ計数の繰り返し測定の結果に基づき、ＡＴＰ測定値の確率分布モデルの種類を選択する（ステップＳ６）。具体的には、ＣＦＵ計数の繰り返し測定における平均捕集菌数が１００ＣＦＵ以下の場合は複合ポワソン分布モデル、１００ＣＦＵより大きい場合は正規分布モデルを選択する。ここでは仮に複合ポワソン分布モデルを選択した場合のフローを説明していく。

【0106】

次いで、演算部７は、試料中に含まれるＣＦＵ数の確率密度関数（式（２））の係数λを、式（７）を用いて決定する（ステップＳ７）。また、１ＣＦＵあたりに含まれるＡＴＰ量の確率密度関数（式（３））の係数μ、σを、式（８）を用いて決定する（ステップＳ８）。なお、ステップＳ７とステップＳ８は、逆の順序で行ってもよいし、または、並行して行ってもよい。

【0107】

更に、演算部７は、決定した係数を式（５）に代入して、正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する（ステップＳ９）。

【0108】

次に、演算部７は、ステップＳ９で決定した正常状態のＡＴＰ測定値の確率モデルについてＧ検定を行う（ステップＳ１０）。前述したように、検定は試料中に含まれるＣＦＵ数分布（ポアソン分布）とＡＴＰ測定値（複合ポアソン分布）の両方についてそれぞれ行い、ＣＦＵ数分布は階級数４、自由度２のＧ検定、ＡＴＰ測定値分布は階級数４、自由度１のＧ検定を行う。

【0109】

ステップＳ１０での判定がＮｏの場合には、選択した確率モデルが対象物のＡＴＰ測定値の確率分布を近似できていないと判断し、確率モデルの再選択を行う（ステップＳ１１、ステップＳ６）。ここでは、前記した確率モデル以外の他の確率モデルを使うことになるが、そのような場合は少ないと考えられるので、他の確率モデルの詳細な説明は省略する。

【0110】

ステップＳ１０での判定がＹｅｓの場合は、汚染状態のＡＴＰ測定値の確率モデルの構築のためのステップに移行する。はじめに、汚染状態のＣＦＵ数の想定値と、微生物管理において許容する偽陽性確率および偽陰性確率が、データ入力部８を介してメモリ７０に格納される（ステップＳ１２）。

【0111】

ここでいう汚染状態のＣＦＵ数の想定値とは、測定対象物が汚染されている場合のＣＦＵ数の想定値であり、従来のＣＦＵ数の管理基準値や、過去の汚染事例での汚染時のＣＦＵ数などを用いることができる。
また、微生物管理において許容する偽陽性確率および偽陰性確率は、微生物管理の精度を定義するものであり、例えば製品そのものの検査や製品に直接暴露される環境など、汚染リスクの大きい対象物については高い精度を設定するなど、測定対象物の種類や検査の目的に応じて設定することができる。

【0112】

次に、演算部７は、ステップＳ１２で入力された汚染状態のＣＦＵ数の想定値と、ステップＳ９で決定した正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を用いて、汚染状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数を決定する（ステップＳ１３）。
具体的には、汚染状態の確率密度関数の係数λ_ｅ、μ_ｅ、σ_ｅのうち、λ_ｅに汚染状態のＣＦＵ数の想定値を入力する。一方、μ_ｅ、σ_ｅは測定対象物によって以下のように設定することが望ましい。

【0113】

第一の方法として、閉鎖的な環境や、ｐＨなど微生物にとっての生育環境として特徴的な性質をもつものを測定対象とした場合は、μ_ｅ、σ_ｅは正常状態のＡＴＰ測定値の確率密度関数と同じ数値を代入する。
前述のような測定対象物の場合は、そこで検出される微生物種はある程度限定される可能性が高く、正常状態の時と菌種やその構成比などの状態が変わらないまま菌数が増えていることが考えられるためである。

【0114】

一方で、前述のように一般的な生態系と同様、測定対象部中の微生物種の内訳や構成比は環境毎に異なり、また一定でないことから、正常状態の時と汚染状態の時との間で菌種やその構成比が大きく変わる可能性は大きい。
そこで、第二の方法として、μ_ｅ、σ_ｅには、指標菌株等を用いてあらかじめ求めた、平均ＡＴＰ量と標準偏差を代入する。

【0115】

続くステップＳ１４では、演算部７が、警告基準値の決定を行う。具体的には式（１０）を用い、ステップＳ１２で入力された許容する偽陽性確率以下となる警告基準値を決定する（ステップＳ１４）。
条件を満たす警告基準値が決定できない場合（ステップＳ１４でＮｏ）、複数回測定による検定で条件を満たす警告基準値を決定する（ステップＳ１５、ステップＳ１４）。具体的には、例えば、１時間毎に測定を行っている場合であれば、ある時刻の測定結果だけでなく、１時間毎の複数回分の測定結果を用いる（ステップＳ１７も同様）。

【0116】

次いで、演算部７が、警報基準値の決定を行う。具体的には式（１１）を用い、ステップ１２で入力された許容する偽陰性確率以下となる警報基準値を決定する（ステップＳ１６）。
条件を満たす警告基準値が決定できない場合（ステップＳ１６でＮｏ）、複数回測定による検定で条件を満たす警告基準値を決定する（ステップＳ１７）。

【0117】

決定した警告基準値と警報基準値は、メモリ７０に格納される（ステップＳ１８）。微生物計測システム１を用いた微生物管理では、毎回のＡＴＰ測定結果をこれらの基準値を参照し、逸脱の有無を検定する。これについては後で詳しく説明する。

【0118】

なお、本実施形態ではステップＳ１２の各数値の格納を、正常状態のＡＴＰ測定値の確率モデルのＧ検定（ステップＳ１０）の後としているが、これに限らず、これらの数値が必要となるステップＳ１３、Ｓ１４、Ｓ１６に先立って格納されるようにすれば他のタイミングでもよい。

【0119】

＜ＡＴＰ測定値の管理基準値を用いた運用方法＞
続いて、ＡＴＰ測定値の管理基準値を用いた微生物管理の実際の運用方法について図４、図５Ａ、図５Ｂ、図６および図７を適宜参照しながら説明する。
図４は、本発明の実施形態における微生物計測システム１の運用方法の概略を示すフローチャートである。

【0120】

はじめに、データ入力部８を用いて、測定対象物の種類、サンプリング位置、用いた試薬のロットなど、試料２に関する情報がメモリ７０に格納される（ステップＳ１００）。次いで、試料２のＡＴＰ測定が行われ（ステップＳ１０１）、測定結果がメモリ７０に格納される（ステップＳ１０２）。この際、ステップＳ１００で入力された測定対象物の種類とサンプリング位置の情報に基づき、測定対象毎に分類されて格納される。

【0121】

続いて、演算部７で、測定結果の検定１が行われる。ここでは、ＡＴＰ測定結果が警報基準値よりも小さいかどうかを検定する（ステップＳ１０３）。
ステップＳ１０３での判定がＮｏの場合、警報が作動する（ステップＳ１０４）。具体的には、表示部１０に測定結果を表示する画面上や、印刷部９から出力する測定結果の報告書面上に警報メッセージを表示することなどが挙げられる（後記するステップＳ１１１で行えばよい）。また、判定をトリガーにすぐに起動する警報ブザーを備えるようにするか、測定結果をオンラインで出力し、離れた場所にいる管理作業者に通報するか、あるいは生産ラインの緊急停止が行われるようにすることなどもできる。

【0122】

ステップＳ１０３での判定がＹｅｓの場合、続いて演算部７で、測定結果の検定２が行われる。ここでは、ＡＴＰ測定結果が警告基準値よりも小さいかどうかを検定する（ステップＳ１０５）。
ステップＳ１０５での判定がＮｏの場合、警告を表示する（ステップＳ１０６）。具体的には、表示部１０に測定結果を表示する画面上や、印刷部９から出力する測定結果の報告書面上に警告メッセージを表示することなどが挙げられる（後記するステップＳ１１１で行えばよい）。

【0123】

次いで、演算部７では、グラフの作成が行われる。はじめに、ステップＳ１００で入力された測定対象物の種類とサンプリング位置の情報に基づき、試料２と同じ測定対象の過去ｎ回分の測定結果の推移グラフと、累積確率グラフが作成される（ステップＳ１０７）。
なお、ｎの値はあらかじめ、データ入力部８を用いて自在に設定できるものとする。

【0124】

次いで、データ数の検定が行われる。ここでは、今回の累積測定回数がＸ×ｎ（Ｘ＝整数）、すなわち、ｎの倍数であるかどうかを判定する（ステップＳ１０８）。ステップＳ１０８での判定がＹｅｓの場合、ステップＳ１０７で作成された累積確率グラフは、長期的変動解析用グラフ（形式Ａ）としてメモリ７０に格納される（ステップＳ１０９）。

【0125】

図５Ａは形式Ａのグラフのデータ区分とグラフを説明する概略説明図である。長期的変動解析用グラフとは、同じ測定対象の過去の測定結果ｎ回毎に作成した累積確率グラフを重ね合わせたもので（Ｌ１〜Ｌ３）、グラフの重なりや形状を目視することにより、施設のブレーク後や、季節の変動などの要因により、測定対象物中のＡＴＰ測定値の確率分布が変化しているかどうかを確認することができる。

【0126】

図５Ｂは形式Ｂのグラフのデータ区分とグラフを説明する概略説明図である。ステップＳ１０８での判定がＮｏの場合、ステップＳ１０７で作成された累積確率グラフは、メモリ７０には格納されず、結果出力用として、直近に作成された最新の長期的変更解析用グラフに、ステップＳ１０７で作成した累積確率グラフを破線などで重ね合わせた形式Ｂのグラフ（Ｌ１〜Ｌ４）が作成される（ステップＳ１１０）。

【0127】

以上により、長期的変動解析用グラフは予め設定したｎ個毎のデータ区切りで累積確率グラフを重ねあわせて作成される。
なお、累積測定回数の初回をどれにするかは、データ入力部８を用いて自在に設定できるものとし、具体的には、管理基準値設定における繰り返し測定の初回のほか、施設のブレーク後や生産ラインの長期停止後などを新たに設定することもできる。

【0128】

測定結果の２つの検定（ステップＳ１０３およびＳ１０５）と、グラフ作成の工程（ステップＳ１０７〜Ｓ１１０）が終了すると最後に、表示部１０に測定結果が表示されるとともに、印刷部９から測定結果報告書が出力される（ステップＳ１１１）。
前述したように、表示部１０には測定結果と合わせて、測定結果の２つの検定（ステップＳ１０３およびＳ１０５）の結果に基づき、警告または警報が表示される。

【0129】

一方、印刷部９から出力される結果報告書には測定結果の他、結果の考察に必要な一連の情報が印字されていることが望ましい。図６は、本発明の実施形態における、微生物計測システム１の結果報告書を説明する概略図である。

【0130】

図６に示すように、結果報告書には、図４のステップＳ１００で入力された試料２の情報（サンプル情報）、設定されている警告基準値（アラートレベル）と警報基準値（アクションレベル）を含む測定結果、図４のステップＳ１０７で作成した過去ｎ回分の測定結果の推移グラフ（過去ｎ回の測定値推移）、および、図４のステップＳ１０９またはＳ１１０で作成した長期的変動解析用グラフ（累積確率グラフ推移）が印字されている。

【0131】

これにより、管理作業者は、測定対象の種類や測定条件を確認し、管理基準値の逸脱の有無を確認するとともに、測定対象の測定結果について長期的な変化がないか考察することができる。また、微生物計測システム１の印刷部９から印字して出力されるので、データ改ざん等のおそれなく保管することができる。

【0132】

一方で、結果報告書は別途電子データとしても保管でき、また、管理作業者が多様な形式で考察できるよう、グラフ作成等ができる形式でも作成される。図７は、本発明の実施形態における微生物計測システム１の、データの格納と出力結果ファイルの構成を示す概略図である。

【0133】

微生物計測システム１のメモリ７０に格納されるデータは大きく分けて３つあり、ひとつは微生物計測システム１を用いたＡＴＰ測定の結果（図３ＡのステップＳ２または図４のステップＳ１０２：符号７０１）、二つ目はこのＡＴＰ測定の際に、データ入力部８を用いて入力される試料２の情報（図３ＡのステップＳ３または図４のステップＳ１００：符号７０２）、三つ目は、管理基準値設定のためのＣＦＵ計数の繰り返し測定結果（図３ＡのステップＳ１：符号７０３）である。

【0134】

後者２つのデータは、対応するＡＴＰ測定の結果と関連づけた形で、かつ、データ入力部８を用いて入力される試料２の情報に基づき、測定対象毎に分類されてメモリ７０に格納される。

【0135】

ＡＴＰ測定が終了すると、演算部７はメモリ７０から必要なデータを引用して、測定結果報告書のデータファイルを作成する。この時、同じデータファイルをひとつは改ざん不可能な保護形式（符号７０４）、他方は、これを用いてグラフ作成などの解析が可能な非保護形式のファイル（符号７０５）として保存する。

【0136】

作成したデータファイルを印刷部９から出力したものが測定結果報告書（原本）となる。一方、ふたつのデータファイルは解析用ＰＣ（符号７０６）にロードすることができ、保護形式のデータファイルは、保管または必要に応じて出力（コピー）することができる（符号７０７）。
一方、非保護形式のデータファイルはこれを用いて、表計算ソフトなどを利用し、グラフ作成などの解析を行い、必要に応じて出力（コピー）することができ、管理作業者のデータ解析や整理に役立てることができる（符号７０８、７０９、７１０）。

【0137】

以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は前記実施形態に限定されず、種々の形態で実施することができる。
例えば、図４の処理では、ステップＳ１０３〜Ｓ１０６とステップＳ１０７〜Ｓ１１０は、逆の順序で行ってもよいし、または、並行して行ってもよい。

【0138】

また、前記実施形態での微生物迅速測定法としては、ＡＴＰ法を想定しているが、これに限定されるものではなく、核酸を染色して微生物の細胞数を顕微鏡下で計数する直接計数法や微生物が含有する生体物質のうち自家蛍光性の物質を指標に微生物を検出する方法など、あらゆる微生物検出法に適用することができる。

【符号の説明】

【0139】

１ 微生物計測システム
２ 試料
３ ろ過回収部
４ 試薬分注部
５ 発光測定部
６ 制御部
７ 演算部
８ データ入力部
９ 印刷部
１０ 表示部
３０ 回収容器
３０ａ フィルタ
３１ 回収容器ホルダ
３２ ろ過装置
３２ａ 吸引ヘッド
３２ｂ ナット
３２ｃ ボールネジ軸
３２ｄ モータ
３２ｅ 吸引ポンプ
４０ ノズル
４１ａ ＸＹ軸アクチュエータ
４１ｂ Ｚ軸アクチュエータ
４２ ポンプ
４３ 試薬チューブ
４４ 試薬チューブホルダ
５０ 測定チューブ
５１ 測定チューブホルダ
５２ フォトンカウンティングユニット
６０ 試薬分注制御部
６１ 駆動制御部
６２ ろ過制御部
７０ メモリ
１００ 処理ステージ
１１０ａ 反応液
１１０ｂ ブランクサンプル液
１１０ｃ ＡＴＰ標準試薬
１１０ｄ ＡＴＰ発光試薬

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】