特許 6158511 抗ＴＩＭ−３抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6158511

(24)【登録日】2017年6月16日

(45)【発行日】2017年7月5日

(54)【発明の名称】抗ＴＩＭ−３抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20170626BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20170626BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170626BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20170626BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170626BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170626BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170626BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170626BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170626BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170626BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20170626BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170626BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20170626BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20170626BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20170626BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170626BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C07K16/46

   C12N15/00 A

   C12P21/08

   C12N1/21

   C12N1/19

   C12N1/15

   C12N5/10

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61P43/00 105

   A61K49/00 A

   A61P35/00

   A61P37/00

   A61P37/08

   A61P35/02

   G01N33/53 D

【請求項の数】14

【全頁数】81

(21)【出願番号】特願2012-519439(P2012-519439)

(86)(22)【出願日】2011年6月10日

(86)【国際出願番号】JP2011063396

(87)【国際公開番号】WO2011155607

(87)【国際公開日】20111215

【審査請求日】2014年6月10日

(31)【優先権主張番号】61/353836

(32)【優先日】2010年6月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】000001029

【氏名又は名称】協和発酵キリン株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100090343

【弁理士】

【氏名又は名称】濱田 百合子

(74)【代理人】

【識別番号】100129160

【弁理士】

【氏名又は名称】古館 久丹子

(74)【代理人】

【識別番号】100177460

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 智子

(74)【代理人】

【識別番号】100108589

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 利光

(72)【発明者】

【氏名】高柳 晋一郎

(72)【発明者】

【氏名】戸村 ひとみ

(72)【発明者】

【氏名】俵 知紀

(72)【発明者】

【氏名】稲垣 好昌

(72)【発明者】

【氏名】久保田 麗夫

(72)【発明者】

【氏名】赤司 浩一

(72)【発明者】

【氏名】菊繁 吉謙

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５１０２２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２６０１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３０５６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００２／０３１１４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０００／０６１７３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特許第５８４８８６３（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２０１０／１１７０５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，２００９年，Vol.106, No.9，p.3396-3401

【文献】 Clin. Cancer Res.，２００６年，Vol.12, No.9，p.2879-2887

【文献】 Science，２００７年，Vol.318, No.5853，p.1141-1143

【文献】 Biochem. Biophys. Res. Commun.，２００７年，Vol.353 No.1，p.211-216

【文献】 J. Heapatol.，２０１０年 １月 ６日，Vol.52, No.3，p.322-329

【文献】 Eur. J. Immunol.，２００９年，Vol.39, No.9，p.2492-2501

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｐ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ−３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、６７番から１０５番目のアミノ酸配列、６７番から９６番目のアミノ酸配列または６７番から８７番目のアミノ酸配列に結合し、かつＡＤＣＣ活性を有するモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片であって、
モノクローナル抗体が、以下の（ｉ）〜（ｖ）から選ばれるいずれか１である、モノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片。
（ｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体。
（ｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４〜１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体。
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２４〜２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体。
（ｉｖ）配列番号８で表されるアミノ酸配列の２０番目から１４０番目のアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列の２１番目から１２７番目のアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体。
（ｖ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列の２０番目から１４０番目のアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列の２３番目から１２９番目のアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体。

【請求項2】

モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片。

【請求項3】

遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれるいずれか１の遺伝子組換え抗体である、請求項２に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片。

【請求項4】

Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗原結合活性を有する抗体断片である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原結合活性を有する該抗体断片。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片をコードするＤＮＡ。

【請求項6】

請求項５に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。

【請求項7】

請求項６に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。

【請求項8】

請求項７に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片の製造方法。

【請求項9】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片を用いるヒトＴＩＭ−３の免疫学的検出又は測定方法（ただし、ヒトのインビボでの使用を除く）。

【請求項10】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片を含むヒトＴＩＭ−３の検出又は測定用試薬。

【請求項11】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片を含むヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の診断薬。

【請求項12】

ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片の使用。

【請求項13】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片を含むヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療薬。

【請求項14】

ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合活性を有する該抗体断片の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｍｕｃｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−３（以下、ＴＩＭ−３と記す）の細胞外領域に結合し、かつ抗体依存的細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＡＤＣＣ活性と記す）を発揮するモノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬に関する。

【背景技術】

【0002】

ＴＩＭ遺伝子ファミリーはマウスでは８つ、ヒトでは３つの遺伝子から構成され、それぞれ１１番染色体と５ｑ３３領域に存在する（非特許文献１）。これらの遺伝子領域は、自己免疫疾患及びアレルギー疾患に関連する。ＴＩＭ蛋白質は構造的に保存されたイムノグロブリン・バリアブル［ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ（ＩｇＶ）］ドメイン及びムチンドメインを有するＩ型膜貫通蛋白質である。

【0003】

ＴＩＭ蛋白質は、当初Ｔ細胞上に特異的に発現し、それらの活性を直接的に制御していると考えられてきたが、最近では抗原提示細胞上での発現及び機能も報告されている（非特許文献２）。結晶構造解析により、ＴＩＭ蛋白質は保存された構造をもち、ＩｇＶドメイン内にリガンド結合部位を持つことが知られている。

【0004】

ＴＩＭ−３は、Ｔｈ２細胞に発現せずにマウスＴｈ１細胞特異的に発現する分子として同定された（非特許文献３）。ＴＩＭ−３のＤＮＡ配列、アミノ酸配列及び立体構造は、公的データベース上に公開されており、例えばＮＭ＿０３２７８２、ＮＭ＿１３４２５０（ＧｅｎＢａｎｋ）等のアクセッション番号から参照可能である。ＴＩＭ−３は、別名ＨＡＶＣＲ２とも呼ばれている。

【0005】

ＴＩＭ−３は、ヒトでも、マウスと同様に、Ｔ細胞に発現しており、マクロファージまたは樹状細胞など、貪食細胞にも発現している。ＴＩＭ−３は、リガンドとなる蛋白質（例えば、ガレクチン−９）との結合により、Ｔｈ１細胞にアポトーシスを誘導するなどのメカニズムでＴｈ１応答を阻害し、例えば、末梢性寛容を誘導する。

【0006】

ヒトＴＩＭ−３に対するｓｉＲＮＡによる発現の減弱またはブロッキング抗体による阻害により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌の亢進などが認められており、ＴＩＭ−３がヒトＴ細胞における阻害的な役割をすることを支持している。また、貪食細胞上においては、ＴＩＭ−３はアポトーシス細胞を認識する受容体として機能する。

【0007】

臨床検体を用いた解析では、自己免疫疾患患者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞ではＴＩＭ−３の発現が見られなかった。特に、多発性硬化症患者の脳脊髄液由来のＴ細胞クローンでは、健常人由来のクローンに比べてＴＩＭ−３の発現が低く、ＩＦＮγの分泌が高かった（非特許文献４）。また、ＴＩＭ−３は、アレルギーまたは喘息疾患との関連も示唆されている（特許文献１及び２）。

【0008】

さらに、急性骨髄性白血病（以下、ＡＭＬと記す）の造血幹細胞と正常な造血幹細胞とのマイクロアレイ解析から、ＡＭＬ幹細胞上にはＴＩＭ−３が発現しており、血液腫瘍との関連も示されている（非特許文献５及び特許文献３）。

【0009】

これまでに確立されている抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体には、抗ヒトＴＩＭ−３ラットモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ ３４４８２３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｆ３８−２Ｅ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）などが知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】国際公開９６／２７６０３号

【特許文献2】国際公開２００３／０６３７９２号

【特許文献3】国際公開２００９／０９１５４７号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｈａｆｌｅｒ ＤＡら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５：２６９９−７０１（２００８）

【非特許文献2】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１１４１−３（２００７）

【非特許文献3】Ｍｏｎｎｅｙ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３６−４１．（２００２）

【非特許文献4】Ｋｏｇｕｃｈｉ Ｋら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０３：１４１３−８．（２００６）

【非特許文献5】Ｍａｊｅｔｉ Ｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９ Ｍａｒ ３；１０６（９）：３３９６−４０１．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

しかしながら、ＡＤＣＣ活性を有するヒトＴＩＭ−３に対するモノクローナル抗体は知られていない。したがって、本発明は、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、かつＡＤＣＣ活性を発揮するモノクローナル抗体又はその抗体断片を提供することを課題とする。また、本発明は、該モノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗ヒトＴＩＭ−３抗体を探索することにより、高ＡＤＣＣ活性を有する抗ヒトＴＩＭ−３抗体を提供することを課題とする。

【0013】

さらに、本発明は、前記抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明の要旨は以下である。
（１）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれる１の抗体と競合してヒトＴＩＭ−３の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ｉ）相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
（ｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４〜１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２４〜２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（２）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれる１の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）の抗体と、競合してヒトＴＩＭ−３の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
（４）前記（ａ）または（ｂ）の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、（３）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（５）遺伝子組換え抗体である、（１）〜（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（６）ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（５）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（７）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（ｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４〜１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２４〜２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（８）以下の（ａ）または（ｂ）であるモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（９）配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ−３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、６７番から１０５番目のアミノ酸配列、６７番から９６番目のアミノ酸配列または６７番から８７番目のアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体および該抗体断片。
（１０）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（９）のいずれか１に記載の抗体断片。
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（１２）（１１）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（１３）（１２）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１４）（１３）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
（１５）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＴＩＭ−３の免疫学的検出又は測定方法。
（１６）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ−３の検出又は測定用試薬。
（１７）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
（１８）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ−３陽性細胞を検出又は測定することを含む、ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
（１９）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ−３を検出又は測定することを含む、ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
（２０）ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の使用。
（２１）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含むヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
（２２）（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてヒトＴＩＭ−３陽性細胞の細胞死を誘導することを含む、ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療方法。
（２３）ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、（１）〜（１０）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の使用。

【発明の効果】

【0015】

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域における特定のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する。本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片が認識するヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列またはその立体構造は、従来の抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列またはその立体構造と相違しており、このことにより高いＡＤＣＣ活性を発揮することができると考えられる。ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域に特異的に結合し、かつ高いＡＤＣＣ活性を有する本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ヒトＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療および診断等に非常に有用である。

【0016】

また、本発明は、前記抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、設計した８２１３抗体のＨ鎖可変領域ＨＶ０、ＨＶ３、ＨＶ４、ＨＶ５、ＨＶ６、ＨＶ７、ＨＶ８、ＨＶ１０、ＨＶ１２のアミノ酸配列を示す。

【図2】図２は、設計した８２１３抗体のＬ鎖可変領域ＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ４、ＬＶ５、ＬＶ６、ＬＶ７、ＬＶ９のアミノ酸配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明におけるヒトＴＩＭ−３としては、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列を含み、かつヒトＴＩＭ−３の機能を有するポリペプチド、ならびに配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＴＩＭ−３の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。

【0019】

配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法 ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９、（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。

【0020】

欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。

【0021】

ヒトＴＩＭ−３をコードする遺伝子としては、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列が挙げられる。配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトＴＩＭ−３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＴＩＭ−３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＴＩＭ−３の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のヒトＴＩＭ−３をコードする遺伝子に包含される。

【0022】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。

【0023】

具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物またはオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、（１９９５）］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。

【0024】

前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号５２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。

【0025】

真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＴＩＭ−３をコードする遺伝子に包含される。

【0026】

本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７、６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。

【0027】

デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ） ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｔｓ］ がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。

【0028】

配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号５２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。

【0029】

また、上記の方法で作製されるポリペプチド又はＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。

【0030】

さらに、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、又は配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。

【0031】

本発明におけるヒトＴＩＭ−３の細胞外領域としては、例えば、配列番号５３で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉ／ｓｏｓｕｉ＿ｓｕｂｍｉｔ．ｈｔｍｌ）、ＴＭＨＭＭ ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）又はＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）などを用いて予測された領域などが挙げられる。

【0032】

本発明におけるヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列としては、ＳＭＡＲＴにおいて予測される細胞外ドメインである、配列番号５３で表されるアミノ酸配列の１番目から２０１番目までが挙げられる。

【0033】

本発明におけるヒトＴＩＭ−３の細胞外領域の立体構造としては、配列番号５３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２で示されるアミノ酸配列を含むヒトＴＩＭ−３の細胞外領域が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域が天然状態でとりうる立体構造とは、細胞膜上に発現しているヒトＴＩＭ−３の天然型の立体構造のことをいう。

【0034】

本発明においてヒトＴＩＭ−３の機能としては、リガンドとなる蛋白質（例えば、ガレクチン−９）との結合により、Ｔｈ１細胞にアポトーシスを誘導するなどのメカニズムでＴｈ１応答を阻害し、例えば末梢性寛容を誘導することをいう。また、貪食細胞上においては、受容体としてアポトーシス細胞を認識することをいう。

【0035】

本発明のモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体ともいう。）又はその抗体断片が、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合することは、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、又は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたヒトＴＩＭ−３を発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法などの特定の抗原を発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法により確認することができる。

【0036】

例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法、又はＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法が挙げられる。

【0037】

また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。

【0038】

ヒトＴＩＭ−３を発現した細胞としては、該ＴＩＭ−３を発現していればいずれの細胞でもよく、例えばヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、又は遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。

【0039】

ヒト体内に天然に存在する細胞としては、例えば、がん、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の患者体内において該ＴＩＭ−３が発現している細胞が挙げられ、具体的には、Ｔｈ１細胞、マクロファージ及び樹状細胞などが挙げられる。

【0040】

ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、例えば、前記のがん患者から得られた該ＴＩＭ−３が発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ＴＩＭ−３を発現している細胞株が挙げられる。例えば、ヒトから樹立された細胞株である急性骨髄性白血病由来細胞株ＫＧ−１［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＣＬ−２４６］又はバーキットリンパ腫由来細胞株Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１３）などが挙げられる。

【0041】

遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、例えば、該ＴＩＭ−３をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞又は動物細胞などに導入することにより得られる、該ＴＩＭ−３を発現した細胞などが挙げられる。

【0042】

また本発明は、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、ＡＤＣＣ活性を発揮するモノクローナル抗体に関する。

【0043】

本発明におけるＡＤＣＣ活性とは、細胞表面のヒトＴＩＭ−３に結合した抗体が、Ｆｃ部分を介して主にナチュラルキラー細胞（以下ＮＫ細胞と表記する）表面のＦｃγＲＩＩＩａに結合し、その結果、ＮＫ細胞から放出されるパーフォリンまたはグランザイムなどの細胞傷害性分子によって生じる細胞融解反応である［Ｃｌａｒｋ Ｍ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）；Ｇｏｒｔｅｒ Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２０，５７６（１９９９）］。

【0044】

本発明の抗体としては、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体またはその抗体断片、もしくはヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、ＡＤＣＣ活性を有するモノクローナル抗体または抗体断片であればいずれの抗体も包含される。

【0045】

本発明の抗体としては、具体的には、配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ−３のアミノ酸配列における、１番目〜２０１番目のアミノ酸配列からなる細胞外領域のうち、好ましくは６７番目〜１０５番目のアミノ酸配列、より好ましくは６７番目〜９６番目のアミノ酸配列、さらに好ましくは６７番目〜８７番目のアミノ酸配列、から選ばれるいずれかのアミノ酸配列、またはその立体構造に結合する抗体が挙げられる。

【0046】

前記抗体として、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のモノクローナル抗体およびその抗体断片が挙げられる。
（ｉ）相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１１〜１３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１４〜１６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号２４〜２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片

【0047】

また、本発明のモノクローナル抗体としてより具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）のモノクローナル抗体及びその抗体断片が挙げられる。
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片

【0048】

さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体と競合して、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片、並びに前記モノクローナル抗体が結合するヒトＴＩＭ−３の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片を挙げることができる。

【0049】

本発明において、モノクローナル抗体と競合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体と同一または部分的に同一のヒトＴＩＭ−３の細胞外領域にエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトＴＩＭ−３のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。

【0050】

本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、又は抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。

【0051】

モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。

【0052】

エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列及び糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。

【0053】

本発明のモノクローナル抗体は、配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列のうち、２２番目〜１３１番目のアミノ酸配列で表されるヒトＴＩＭ−３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列に結合することが好ましい。具体的には、本発明のモノクローナル抗体が結合するアミノ酸配列は、配列番号５３の６７番目〜１０５番目のアミノ酸配列であることが好ましく、６７番目〜９６番目のアミノ酸配列であることがより好ましく、６７番目〜８７番目のアミノ酸配列であることがさらに好ましい。

【0054】

本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、配列番号５３で表されるヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列のうち、２２番目〜１３１番目のアミノ酸配列で表されるヒトＴＩＭ−３のＩｇＶドメインに含まれることが好ましい。具体的には、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、６７番目〜１０５番目のアミノ酸配列の中に含まれることが好ましく、６７番目〜９６番目までのアミノ酸配列の中に含まれることがより好ましく、６７番目〜８７番目までのアミノ酸配列の中に含まれることがさらに好ましい。

【0055】

本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列は、ヒトＴＩＭ−３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、配列番号５３の６７番目〜８７番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含むことが好ましく、６７番目、７４番目、７６番目、７８番目、７９番目、８１番目、８３番目および８５番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含むことがより好ましい。

【0056】

また、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列は、ヒトＴＩＭ−３のＩｇＶドメインのアミノ酸配列のうち、配列番号５３の６７番目〜８７番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した２以上のアミノ酸を含むことが好ましく、６７番目、７４番目、７６番目、７８番目、７９番目、８１番目、８３番目および８５番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含み、かつ配列番号５３の６７番目〜８７番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した２以上のアミノ酸を含むことがより好ましい。

【0057】

具体的には、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列としては、配列番号５３の６７番目〜７４番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目〜７６番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目〜７８番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目〜７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目〜８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目〜８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、６７番目〜８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７４番目〜７６番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目〜７８番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目〜７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目〜８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目〜８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７４番目〜８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７６番目〜７８番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目〜７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目〜８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目〜８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７６番目〜８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７８番目〜７９番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７８番目〜８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７８番目〜８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７８番目〜８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
７９番目〜８１番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７９番目〜８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、７９番目〜８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
８１番目〜８３番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、８１番目〜８５番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列、または、
８３番目〜８５番のアミノ酸を含むアミノ酸配列、などが挙げられる。

【0058】

ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトＴＩＭ−３を発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体を取得することができる。

【0059】

抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。

【0060】

本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体又は抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。

【0061】

ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とからなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0062】

ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。

【0063】

本発明のヒト型キメラ抗体として具体的には、配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつが配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。

【0064】

さらに、本発明のキメラ抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するキメラ抗体及び上述のキメラ抗体が結合するヒトＴＩＭ−３の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するキメラ抗体を挙げることができる。

【0065】

ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0066】

ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。

【0067】

本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、具体的には、ＣＤＲ１〜３が配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１〜３が配列番号２４〜２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。

【0068】

本発明のヒト化抗体として、具体的には、以下の（ａ）ＶＨおよび（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列、または配列番号６７のアミノ酸配列の１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ
（ｂ）配列番号６９のアミノ酸配列、または配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕ、１３番目のＡｌａ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ

【0069】

更に、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）〜（８）が好ましい。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、および７４番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、および９８番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ

【0070】

前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６７のアミノ酸配列中の、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、または１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。

【0071】

１２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号６７のアミノ酸配列中の、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列が挙げられる。

【0072】

１１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１２）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列

【0073】

１０個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（８）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列

【0074】

８個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１３）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列

【0075】

７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列

【0076】

６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列

【0077】

５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列

【0078】

４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（８）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列

【0079】

３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列

【0080】

２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（２１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４０番目のＡｌａをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号６７のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＡｒｇに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列

【0081】

１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１２）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６７のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６７のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６７のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６７のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６７のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６７のアミノ酸配列中の６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６７のアミノ酸配列中の６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６７のアミノ酸配列中の７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６７のアミノ酸配列中の７２番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６７のアミノ酸配列中の７４番目のＴｈｒをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６７のアミノ酸配列中の９８番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６７のアミノ酸配列中の１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列

【0082】

また、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、以下の（１）〜（６）が好ましい。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕ、１３番目のＡｌａ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、および８５番目のＴｈｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４６番目のＬｅｕ、および７１番目のＰｈｅが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒ、および４４番目のＰｒｏが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ

【0083】

前記ＶＬのアミノ酸配列としては、配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。

【0084】

９個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列が挙げられる。

【0085】

８個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列

【0086】

７個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列

【0087】

６個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列

【0088】

５個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列

【0089】

４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列

【0090】

３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列

【0091】

２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、および３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、および３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４３番目のＡｌａをＳｅｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号６９のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに、および４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列

【0092】

１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号６９のアミノ酸配列中の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号６９のアミノ酸配列中の１３番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号６９のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号６９のアミノ酸配列中の３６番目のＴｙｒをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号６９のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号６９のアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号６９のアミノ酸配列中の４６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号６９のアミノ酸配列中の７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号６９のアミノ酸配列中の８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換したアミノ酸配列

【0093】

また、本発明のヒト化抗体の具体例としては、抗体のＶＨが配列番号６７および／または抗体のＶＬが配列番号６９のアミノ酸配列を含むヒト化抗体、抗体のＶＨが配列番号６７および／または抗体のＶＬが図２で示されるいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化抗体、または、抗体のＶＨが図１で示されるいずれかのアミノ酸配列および／または抗体のＶＬが配列番号６９のアミノ酸配列を含むヒト化抗体などが挙げられる。

【0094】

さらに、本発明のヒト化抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するヒト化抗体及び上述のヒト化抗体が結合するヒトＴＩＭ−３の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するヒト化抗体を挙げることができる。

【0095】

ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。

【0096】

ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。

【0097】

ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。

【0098】

ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。

【0099】

上述の抗体又は抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ上述の抗体又はその抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体又はその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に包含される。

【0100】

欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１〜数十個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。

【0101】

上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入又は付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入又は付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。

【0102】

天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、又はＬ−システインなどが挙げられる。

【0103】

以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４−ジアミノブタン酸、２、３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
ｇ群：フェニルアラニン、チロシン

【0104】

本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。

【0105】

Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0106】

本発明のＦａｂは、ヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。

【0107】

Ｆ（ａｂ’）_２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。

【0108】

本発明のＦ（ａｂ’）_２は、ヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させ、作製することもできる。

【0109】

Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）_２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するＦ（ａｂ’）_２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。

【0110】

ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。

【0111】

本発明のｓｃＦｖは、本発明のヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0112】

ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。

【0113】

本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0114】

ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。

【0115】

本発明のｄｓＦｖは、本発明のヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0116】

ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。

【0117】

本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のヒトＴＩＭ−３を特異的に認識し、かつ該細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。

【0118】

本発明のモノクローナル抗体には、本発明のヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、又は抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。

【0119】

本発明における、抗体の誘導体は、本発明のヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側またはＣ末端側、抗体又はその抗体断片中の適当な置換基または側鎖、さらにはモノクローナル抗体又はその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、蛋白質又は抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。

【0120】

また、本発明のヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質又は抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。

【0121】

放射性同位元素としては、例えば、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^６４Ｃｕ、^９９Ｔｃ、^７７Ｌｕ、又は^２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。

【0122】

低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗がん剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、又はハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。

【0123】

抗がん剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３（Ｆｌｔ３）阻害剤、Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、マイタンシノイド、又はその誘導体、などが挙げられる。

【0124】

低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、又は水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。

【0125】

高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、又はヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を抗体又は抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的または生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失又は抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのe−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、又はアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。

【0126】

免疫賦活剤としては、例えば、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、又はαガラクトシルセラミドなどが挙げられる。

【0127】

蛋白質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子、又は毒素蛋白質などが挙げられる。

【0128】

サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）などが挙げられる。

【0129】

毒素蛋白質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、又はＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するために蛋白質に変異を導入した蛋白毒素も含まれる。

【0130】

抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原又は免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。

【0131】

抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｃｌａｓｓ ＩＩ、又はＥｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。

【0132】

腫瘍の病態形成に関わる抗原又は免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、又はＢ７−Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、又はＢＴＬＡ）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、又はＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、又はＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ−２５、葉酸受容体４、サイトカイン［ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、又はＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、又はＣＴＡＣＫなど）、又はこれらのケモカインの受容体が挙げられる。

【0133】

病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ−１、又はこれらの受容体などが挙げられる。

【0134】

蛋白質又は抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体又は抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。

【0135】

上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬又は診断薬として使用する場合に、本発明のヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体が挙げられる。

【0136】

標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。

【0137】

また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有するＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療薬に関する。

【0138】

ＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患としては、ＴＩＭ−３が発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば、がん、自己免疫疾患、アレルギー性疾患が挙げられる。

【0139】

がんとしては、例えば、血液がん、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌又は膵臓癌などが挙げられ、好ましくは血液がん、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌又は前立腺癌が挙げられる。

【0140】

血液がんとしては、例えば、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞性リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＰＴＣＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＡＬＣＬ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＬＬ）、その他リンパ性白血病、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は、バーキットリンパ腫をはじめとする非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。

【0141】

自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植後拒絶反応自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、天疱瘡および悪性貧血などが挙げられる。

【0142】

アレルギー性疾患としては、例えば、急性又は慢性気道過敏症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、ＰＩＥ症候群、食物アレルギー、花粉症、アレルギー性鼻、気管支喘息、アトピー性皮膚炎およびアナフィラキシーショックなどが挙げられる。

【0143】

本発明の治療剤としては、上述した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する。

【0144】

本発明の抗体又は該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

【0145】

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与を挙げられる。

【0146】

投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。

【0147】

投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、及び体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。

【0148】

さらに、本発明は、ＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有する、ＴＩＭ−３の免疫学的検出又は測定方法、ＴＩＭ−３の免疫学的検出用又は測定用試薬、ＴＩＭ−３が発現する細胞の免疫学的検出又は測定方法、及びＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の診断薬に関する。

【0149】

本発明においてＴＩＭ−３の量を検出又は測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出又は測定方法などが挙げられる。

【0150】

免疫学的検出又は測定方法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫学的検出又は測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などが挙げられる。

【0151】

本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いてＴＩＭ−３が発現した細胞を検出又は測定することにより、ＴＩＭ−３が関連する疾患を診断することができる。

【0152】

該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、又は免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども用いることができる。

【0153】

本発明においてＴＩＭ−３を検出又は測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、又は培養液など、ＴＩＭ−３が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。

【0154】

本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行うための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行うための試薬としては、例えば、緩衝剤、塩などが挙げられる。検出用試薬としては、例えば、該モノクローナル抗体若しくはその抗体断片、又はこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、又は標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出又は測定法に用いられる試薬が挙げられる。

【0155】

以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。

【0156】

１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＴＩＭ−３又はＴＩＭ−３を発現させた細胞は、ＴＩＭ−３全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＴＩＭ−３を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからＴＩＭ−３を精製し、得ることが出来る。また、該腫瘍培養細胞、又は該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＴＩＭ−３の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。

【0157】

本発明で用いられるＴＩＭ−３は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＴＩＭ−３をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。

【0158】

まず、ＴＩＭ−３をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。

【0159】

発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。

【0160】

宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。

【0161】

大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＴＩＭ−３をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。

【0162】

該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。

【0163】

また、該ＴＩＭ−３をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＴＩＭ−３の生産率を向上させることができる。

【0164】

発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８、６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３、２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。

【0165】

プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。

【0166】

宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。

【0167】

宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ、１７、１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８、１１１（１９７９）］ が挙げられる。

【0168】

動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、又はｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。

【0169】

プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。

【0170】

宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０８、９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５５、５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、４１、１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８、１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４８、２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ、６、１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ、ＩＩ（ｐｐ．８８３−９００））、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ−３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）、などが挙げられる。

【0171】

宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などが挙げられる。

【0172】

以上のようにして得られるＴＩＭ−３をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＴＩＭ−３を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＴＩＭ−３を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

【0173】

真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＴＩＭ−３を得ることができる。

【0174】

誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。

【0175】

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８、３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシンまたはペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。

【0176】

ＴＩＭ−３をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。

【0177】

ＴＩＭ−３の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、または生産させるＴＩＭ−３の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。

【0178】

ＴＩＭ−３が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．、４、１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＴＩＭ−３を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。

【0179】

また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２−２２７０７５号公報）を利用してＴＩＭ−３の生産量を上昇させることもできる。

【0180】

得られたＴＩＭ−３は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。

【0181】

ＴＩＭ−３が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。

【0182】

前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。

【0183】

ＴＩＭ−３が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＴＩＭ−３の不溶体を回収する。回収した該ＴＩＭ−３の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＴＩＭ−３を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。

【0184】

ＴＩＭ−３又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＴＩＭ−３又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

【0185】

また、本発明において用いられるＴＩＭ−３は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル−ベガ社製、パーセプチブ社製、又は島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。

【0186】

（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＴＩＭ−３ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。

【0187】

免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。

【0188】

抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。

【0189】

抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。

【0190】

（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８、１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２３、１５４８（１９７９）］、又はＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）］などが用いられる。

【0191】

該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０^７個以上の細胞数を確保する。

【0192】

（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。

【0193】

沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。

【0194】

培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＴＩＭ−３を含む抗原に反応し、ＴＩＭ−３を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。

【0195】

（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。

【0196】

また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラム又はプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。

【0197】

抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。

【0198】

（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。

【0199】

（６−ａ）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）で得られるＴＩＭ−３をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチドまたは部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ又はＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。

【0200】

抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。

【0201】

また、本発明の抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体と競合してＴＩＭ−３に結合するモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。

【0202】

さらに、本発明のＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。

【0203】

（６−ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。

【0204】

得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。又は、ヒトＴＩＭ−３をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。

【0205】

２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。

【0206】

ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。

【0207】

動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、１７３（１９９０）］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、７９（１９９３）］などを用いる。

【0208】

動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７）］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３）］などを用いる。

【0209】

遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号公報）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８）］などを用いる。

【0210】

（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。

【0211】

非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。

【0212】

前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。

【0213】

非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。

【0214】

ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４、３（１９８７）］、又はＲＮＡ ｅａｓｙ ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。

【0215】

全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、又はＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。

【0216】

ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、又はＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、またはＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。

【0217】

ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ ＥｘＰｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７、９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ、４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘ Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、２８０（１９８３）］、又はｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ、３３、１０３（１９８５）］などを用いる。

【0218】

ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９、４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１１８（１９６６）］、又はＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ、３８、２７５（１９８５）］などを用いる。

【0219】

ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープまたは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。

【0220】

また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。

【0221】

選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。

【0222】

決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。

【0223】

分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。

【0224】

また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ又はＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。

【0225】

（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。

【0226】

非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。

【0227】

作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。

【0228】

また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。

【0229】

（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。

【0230】

非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。

【0231】

例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。

【0232】

次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。

【0233】

設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。

【0234】

また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。

【0235】

又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。

【0236】

ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。

【0237】

（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、９、２６６（１９９１）］。

【0238】

ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。

【0239】

抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５（１９７７）］又はコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。

【0240】

ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。

【0241】

（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。

【0242】

例えば、（４）及び（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。

【0243】

（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。

【0244】

発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２８３（１９９１）］。

【0245】

ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、（１９９１）］、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などを用いる。

【0246】

発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。

【0247】

（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）及び（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。

【0248】

宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］などを用いる。

【0249】

遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、５５（１９８６）］、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。

【0250】

また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質、又は細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下又は欠失した宿主細胞、例えばα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。

【0251】

発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。

【0252】

動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。

【0253】

得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。

【0254】

遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。

【0255】

精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）］、又はウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。

【0256】

３．精製モノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。

【0257】

ＴＩＭ−３発現細胞株に対する結合活性は、前述の１−（６ａ）記載のバインディングアッセイ及び（６ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。

【0258】

抗原陽性培養細胞株に対する補体依存性傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と記す）、又はＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］により測定する。

【0259】

４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
本発明の抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、または抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明の抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。

【0260】

エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、またはマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＰ活性）などが知られている。

【0261】

抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。

【0262】

一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。

【0263】

また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。

【0264】

さらに、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。

【0265】

５．本発明の抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＴＩＭ−３陽性細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。

【0266】

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。

【0267】

投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。

【0268】

経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などでが挙げられる。

【0269】

乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。

【0270】

カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。

【0271】

非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤又は噴霧剤などが挙げられる。

【0272】

注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。

【0273】

座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。

【0274】

噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。

【0275】

さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

【0276】

６．本発明の抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いた疾患の診断方法
本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いて、ＴＩＭ−３又はＴＩＭ−３が発現した細胞を検出又は測定することにより、ＴＩＭ−３が関連する疾患を診断することができる。

【0277】

ＴＩＭ−３が関連する疾患の一つであるがんの診断は、例えば、以下のようにＴＩＭ−３の検出又は測定して行うことができる。

【0278】

患者体内のがん細胞に発現しているＴＩＭ−３をフローサイトメーターなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。

【0279】

免疫学的手法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などを用いる。

【0280】

放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。

【0281】

酵素免疫測定法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。

【0282】

酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、又はビオチン標識などを用いる。

【0283】

サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出又は測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出又は測定したい抗原を認識する抗体又は抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体又は抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体又は抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、又はビオチンなどで標識しておく。

【0284】

上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞又はその破砕液、組織又はその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、又は眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体又は抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。

【0285】

サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）_２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体又は抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体又は抗体断片との組み合わせでもよい。

【0286】

蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識が挙げられる。例えば、ＦＩＴＣ、又はＲＩＴＣなどが挙げられる。

【0287】

発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光 臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどが挙げられる。

【0288】

ウェスタンブロット法は、抗原又は抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜又はニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体又は抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、又はビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体又は結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。

【0289】

配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞または組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりの蛋白量として０．１〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動された蛋白質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１〜１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。

【0290】

ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５〜０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号５３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。

【0291】

物理化学的手法は、例えば、抗原であるＴＩＭ−３と本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などが挙げられる。

【0292】

ラテックス免疫比濁法は、抗体又は抗原を感作させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。

【0293】

一方、ＴＩＭ−３が発現している細胞の検出又は測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、例えば、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法又は蛍光抗体染色法などが挙げられる。

【0294】

免疫沈降法は、ＴＩＭ−３を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。又は以下のような方法によっても行なうことができる。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。

【0295】

抗体が、例えばハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン−Ａ又はプロテインＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。次に、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＴＩＭ−３を発現している細胞または組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。

【0296】

免疫細胞染色法又は免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞又は組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤またはメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識又はビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体又はその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。

【0297】

また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フローサイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。

【0298】

特に、ＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合する、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。

【0299】

また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体−抗原複合体と、抗体−抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体又は抗原とを分離することなく、抗原量又は抗体量を測定できる。

【0300】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0301】

［実施例１］
（ヒトＴＩＭ−３ ｃＤＮＡの分子クローニングと安定発現株作製）
ヒトＴＩＭ−３のｃＤＮＡはＨｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ（クローンテック社製）を鋳型にＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ法により増幅した。プライマーは、ＴＩＭ−３ Ｆｗ２（配列番号３１）及びＴＩＭ−３ Ｒｅ２（配列番号３２）を用いた。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ挿入し、ＴＯＰ１０ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（インビトロジェン社製）に形質転換し増幅させた後、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。

【0302】

精製したプラスミドＤＮＡについて、プライマーＴＩＭ−３ Ｆｗ２及びＴＩＭ−３ Ｒｅ２を用いたＤＮＡ配列解析を行い、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２のコーディングリージョンと同一の塩基配列を有するクローンを選定した。選定したクローンのインサートをｐＭＣｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）へ組換え（ｈＴＩＭ−３／ｐＭＣｓ−ＩＧ）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用い、ヒトＴＩＭ−３レトロウイルスを調製した。

【0303】

このヒトＴＩＭ−３レトロウイルスを、あらかじめフローサイトメトリー解析で内在的にＴＩＭ−３が発現していないことを確認したＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２０６３）、ＥｏＬ−１細胞（ＲＩＫＥＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ番号：ＲＣＢ０６４１）及びＬ９２９細胞（シグマアルドリッチ社製）へそれぞれ感染させた。数回の継代の後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてＴＩＭ−３陽性細胞を採取した。さらに数回の継代の後、再度ＦＡＣＳＡｒｉａにてＴＩＭ−３陽性細胞を採取することによって、ヒトＴＩＭ−３安定発現細胞株を作製した。

【0304】

［実施例２］
（可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３ヒトＦｃ融合蛋白質発現ベクターの調製）
ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを実施例１で構築したｈＴＩＭ−３／ｐＭＣｓ−ＩＧを鋳型にＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ法で増幅した。プライマーはｐＭＣｓ−Ｆｗ（配列番号３３）及びＴＩＭ３ＥＤ−ＦｃＲｅＸｂａ（配列番号３４）を用いた。

【0305】

得られたＰＣＲ産物をｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ｈｕｍａｎＦｃベクター［ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ（インビトロジェン社製）のＸｂａ Ｉ部位とＡｐａ Ｉ部位にＦＬＡＧ及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を導入した改変ベクター］に挿入し、ＴＯＰ１０ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（インビトロジェン社製）に形質転換し増幅させた後、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡ（ｓＴＩＭ−３−ＦＬＡＧ−Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ）を抽出した。

【0306】

精製したｓＴＩＭ−３−ＦＬＡＧ−Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶは、Ｔ７（配列番号３５）及びｈＴＩＭ−３ Ｆｗ１（配列番号３６）をプライマーとしたＤＮＡ配列解析により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２の当該領域と同一の塩基配列を有することを確認した。インサート（ＥｃｏＲＩ認識部位の後ろからＡｐａＩ認識部位直前まで）の配列は配列番号３７のとおりであった。

【0307】

［実施例３］
（可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３発現ベクターの調製）
ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを実施例２で構築したｓＴＩＭ−３−ＦＬＡＧ−Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶを鋳型にＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ法で増幅した。プライマーはＴＩＭ−３ Ｆｗ２（配列番号３１）及びＴＩＭ３ＥＤ−ＦＬＡＧ４ａａ（配列番号３９）を用いた。

【0308】

次に、得られたＰＣＲ産物を鋳型に、ＴＩＭ−３ Ｆｗ２（配列番号３１）及びＣ−ＦＬＡＧ−ＮｏｔＲ２（配列番号４０）をプライマーとしたＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）によるＰＣＲ法によりＦＬＡＧ ｅｐｉｔｏｐｅを連結した。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、ＴＯＰ１０ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（インビトロジェン社製）に形質転換し増幅させた後、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡ（ｓＴＩＭ−３−ＦＬＡＧ／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ）を抽出した。

【0309】

精製したｓＴＩＭ−３−ＦＬＡＧ／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣは、Ｔ７（配列番号３５）及びＢＧＨ−Ｒ（配列番号４１）をプライマーとしたＤＮＡ配列解析により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２の当該領域と同一の塩基配列を有することを確認した。インサート（Ｎｏｔ Ｉ認識部位の後ろからＮｏｔ Ｉ認識部位直前まで）の配列は配列番号４２のとおりであった。

【0310】

［実施例４］
（可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３ヒトＦｃ融合蛋白質及び可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３の調製）
実施例２及び実施例３で得られたｓＴＩＭ−３−ＦＬＡＧ−Ｆｃ／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶプラスミドＤＮＡ及びｓＴＩＭ−３−ＦＬＡＧ／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣプラスミドＤＮＡをそれぞれＨＥＫ２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に導入し、一過性に発現させた。６日後、細胞上清を回収し、蛋白精製に用いた。

【0311】

可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３ヒトＦｃ融合蛋白質又は可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３を含む培養上清を遺伝子導入から６日後に遠心分離により回収し、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙｇｅｌ（シグマ社製）を用いて作製したＡｎｔｉ−ＦＬＡＧカラムとＦＬＡＧペプチド（シグマ社製）を用いてマニュアルに従い精製した。

【0312】

溶出液を分画し、各フラクションを還元条件化でＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色及びウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングには、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマ社製）とアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を用いた。目的の蛋白質が認められたフラクションをアミコンウルトラ−４ １０Ｋ（ミリポア社製）を用いて濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｇｐ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。

【0313】

分画し、各フラクションを還元条件化でＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色及びウェスタンブロッティングを行った。目的の蛋白質が認められたフラクションを濃縮し、ＰＢＳ ０．５ｍＬで洗浄した。孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社製）でろ過滅菌し、可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３ヒトＦｃ融合蛋白質又は可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３を得た。エンドトキシン測定用専用試薬である、リムルスＥＳ−ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。

【0314】

［実施例５］
（ヒト抗体産生マウスの作製）
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製された。

【0315】

系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、２０００ Ｖｏｌ９７：７２２］に記載されている。

【0316】

また、系統Ｂは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（トランスジェニックマウス）であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告［Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９６、１４：８４５］に記載されている。

【0317】

系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、または系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される個体［Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ、ＩＢＣ’ｓ １１ｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０００］を、以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウス（以下、ＫＭマウスと記す）は、契約を結ぶことによって、協和発酵キリン株式会社より入手可能である。

【0318】

［実施例６］
（ヒトＴＩＭ−３に対するヒトモノクローナル抗体の作製）
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのＴＩＭ−３は、実施例１で得られたＴＩＭ−３発現Ｌ９２９細胞又は実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３ヒトＦｃ融合蛋白質を用いた。被免疫動物は、上記ＫＭマウスを用いた。

【0319】

まず、ＫＭマウスに、ＴＩＭ−３発現Ｌ９２９細胞をマウス１匹あたり１×１０^７個腹腔内に免疫した。初回免疫から以降、同細胞を３回又はそれ以上免疫した。脾臓を取得する３日前に、実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３ヒトＦｃ融合蛋白質２０μｇ／マウス個体を尾静脈投与した。免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得した後、ＰＢＳ ４ｍＬ中に脾臓を入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でシリンジのピストンを用いてつぶした。

【0320】

メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心分離して細胞を沈澱させた後、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）１ｍＬで再懸濁した。室温で５分間のインキュベーションの後、５０単位／ｍＬ ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、無血清ＤＭＥＭ培地と記す）１０ｍＬを加え、遠心分離により細胞を沈澱させた。

【0321】

沈殿した細胞を、再度、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。一方、ミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５８１）は１０％ ＦＣＳ（インビトロジェン社製）、５０単位／ｍＬ ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、血清入りＤＭＥＭ培地と記す）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０^６細胞／ｍＬを越えないように培養した。

【0322】

ＳＰ２／０細胞を脾臓由来細胞と同様に無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍＬで洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。これら脾臓由来細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心分離後、上清を完全に除去した。このぺレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍＬを、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬをゆっくり添加した。さらに５ｍＬ及び１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地をゆっくり添加した。その後、３７℃、５％炭酸ガス存在下で５分間静置した。

【0323】

遠心分離後、上清を除去して得られた融合細胞を、１０％ ＦＣＳ（インビトロジェン社製）、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（インビトロジェン社製、カタログ番号１０３７８−０１６を１００倍希釈）、ＩＬ−６（５ｎｇ／ｍＬ）、２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社製、カタログ番号２１９８５−０２３を１０００倍希釈）を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、ＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地と記す）５０ｍＬに懸濁し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。

【0324】

翌日、細胞をピペッティングにより回収し、遠心分離により沈殿した細胞ペレットを１０ｍＬのＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地に再懸濁した。翌日、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（以下、ＨＡＴと記す、シグマ社製）を添加し、約７−１０日後、培養上清を回収し、ハイブリドーマスクリーニングに用いた。

【0325】

［実施例７］
（ヒトＴＩＭ−３に対するマウスモノクローナル抗体の作製）
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら、講談社発行、１９９１年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのＴＩＭ−３は、実施例１で得られたＴＩＭ−３発現Ｌ９２９細胞又は実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３を用いた。被免疫動物は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（日本チャールズ・リバー社から購入）を用いた。

【0326】

まず、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、ＴＩＭ−３発現Ｌ９２９細胞をマウス１匹あたり１×１０^７個腹腔内に免疫した。初回免疫から以降、同細胞を３回又はそれ以上免疫した。脾臓を取得する３日前に、実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３ ２０μｇ／マウス個体を尾静脈投与した。免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得した後、ＰＢＳ ４ｍＬ中に脾臓を入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社製）上でシリンジのピストンを用いてつぶした。

【0327】

メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心分離して細胞を沈澱させた後、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）１ｍＬで再懸濁した。室温で５分間のインキュベーションの後、無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを加え、遠心分離により細胞を沈澱させた。沈殿した細胞を、再度、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。一方、ミエローマ細胞 ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５８１）は血清入りＤＭＥＭ培地にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で細胞濃度が１×１０^６細胞／ｍＬを越えないように培養した。

【0328】

ＳＰ２／０細胞を脾臓由来細胞と同様に無血清ＤＭＥＭ培地１０ｍＬで洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁した。これら脾臓由来細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心分離後、上清を完全に除去した。このぺレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社製）１ｍＬを、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地１ｍＬをゆっくり添加した。

【0329】

この細胞懸濁液に５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地をゆっくり添加した後、さらに１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地を添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で５分間静置した。遠心分離後、上清を除去して得られた融合細胞を、ＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地５０ｍＬに懸濁し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。翌日、細胞をピペッティングにより回収し、遠心分離により沈殿した細胞ペレットを１０ｍＬのＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地に再懸濁した。翌日、ＨＡＴ（シグマ社製）を添加し、約７−１０日後、培養上清を回収し、ハイブリドーマスクリーニングに用いた。

【0330】

［実施例８］
（ヒトＴＩＭ−３に結合するヒト及びマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング）
実施例６及び７で作製した細胞上清を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行った。方法は、ヒトＴＩＭ−３安定発現細胞株を利用したフローサイトメトリー法で行った。まず、実施例１で得られたヒトＴＩＭ−３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞又はＥｏＬ−１細胞をステイニングメディウム（２％ ＦＣＳ及び０．０５％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄し、１ｍＬあたり１×１０^７個になるように再びステイニングメディウムで懸濁した。細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１０μＬずつ移した。

【0331】

さらに、ハイブリドーマの上清５０μＬを加え、４℃、３０分間静置した。ステイニングメディウムで２回洗浄後、ステイニングメディウムで２００倍希釈した標識抗体を５０μＬずつ加え、４℃、３０分間静置した。標識抗体は、ヒトモノクローナル抗体に対してはＧｏａｔ Ｆ（ａｂ’）_２ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（γ ｃｈａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）−Ｒ−ＰＥ（サザンバイオテック社製）を、マウスモノクローナル抗体に対してはＧｏａｔ Ｆ（ａｂ’）_２ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｒ−ＰＥ、（サザンバイオテック社製）を用いた。

【0332】

ステイニングメディウムで２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析し、一次スクリーニングとした。ポジティブクローンを拡大培養した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でクローンソーティングし、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（以下、ＨＴと記す、シグマ社製）を含んだＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地で約７日培養した。

【0333】

回収した上清について、一次スクリーニングと同様にスクリーニングを行い、抗ヒトＴＩＭ−３ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ及び抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングし、モノクローナル抗体の精製に用いた。

【0334】

［実施例９］
（ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体の精製）
実施例８で取得した抗ヒトＴＩＭ−３ヒト又はマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、抗ＴＩＭ−３ヒト又はマウスモノクローナル抗体を精製した。簡単には、ＣＥＬＬｉｎｅ 抗体産生システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、高濃度に抗ＴＩＭ−３抗体を含むハイブリドーマ上清を調製し、抗ヒトＴＩＭ−３モノクローナル抗体を精製した。まず、クローン化されたハイブリドーマを無血清培地に馴化させるために、ＨＴを含んだＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地とＢＤ Ｃｅｌｌ ＭＡｂ 無血清培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１：１で混合した培地で数日間培養し、１：２で混合した培地でさらに数日間培養した。

【0335】

その後、ＢＤ Ｃｅｌｌ ＭＡｂ 無血清培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で培養し、ハイブリドーマを無血清化した。無血清化したハイブリドーマはＣＬ−１０００フラスコなどにてマニュアルに従い培養し、高濃度に抗ＴＩＭ−３抗体を含むハイブリドーマ上清を回収した。ハイブリドーマ上清からの抗体精製はＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた標準的な方法で実施した。

【0336】

具体的には、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア社製）をオープンカラムに詰め、ＰＢＳで２倍希釈した上清を通過させ、０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて溶出し、アミコンウルトラ（ミリポア社製）を用いて濃縮した。その後、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥヘルスケア社製）でＰＢＳに置換し、濾過滅菌することで、精製抗ヒトＴＩＭ−３ヒトモノクローナル抗体を４クローン（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体）、精製抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体を１クローン（８２１３抗体）取得した。

【0337】

［実施例１０］
（抗ＴＩＭ−３ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプの決定）
実施例９で得られた抗ＴＩＭ−３ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプは、抗原固相ＥＬＩＳＡ法及びフローサイトメトリー法により決定した。
具体的には、抗原固相ＥＬＩＳＡ法では、まず、実施例４で得られた可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３を１μｇ／ｍＬ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）に調製したものを５０μＬ、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ヌンク社製）の各ウェルに加えた。４℃で一晩インキュベートし、可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３をマイクロプレートに吸着させた。

【0338】

上清を捨てた後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＴＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を加えて室温で１０分間インキュベートし、さらにハイブリドーマ培養上清５０μＬを添加し、室温で３０分間インキュベートした。各ウェルを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄後、ＨＲＰで標識されたマウス抗ヒトＩｇＧ１抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ２抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ３抗体又はマウス抗ヒトＩｇＧ４抗体（１０％ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ含有ＴＢＳ−Ｔでそれぞれ２０００、２０００、２０００、４０００倍希釈したもの。ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）をそれぞれ５０μＬ加え、室温下で３０分間インキュベートした。

【0339】

各ウェルをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、基質緩衝液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ加え、室温下で２０分間インキュベートした後、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸（和光純薬工業株式会社製）を５０μＬ加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、モレキュラーデバイス社製）で測定した。

【0340】

また、フローサイトメトリー法では、まず、実施例１で得られたヒトＴＩＭ−３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞をステイニングメディウムで洗浄後、ハイブリドーマの上清５０μＬを加え、４℃、３０分間静置した。洗浄後、ステイニングメディウムで１００倍程度に希釈したＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１−ＰＥ、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２−ＰＥ、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ３（Ｈｉｎｇｅ）−ＰＥ及びＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ４（Ｆｃ）−ＰＥ（全てサザンバイオテック社製）をそれぞれ５０μＬずつ加え、４℃、３０分間静置し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。

【0341】

以上の結果から、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体のアイソタイプはそれぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２であることが明らかとなった。

【0342】

［実施例１１］
（ヒトＴＩＭ−３に対するマウスモノクローナル抗体のアイソタイプの決定）
実施例９で得られた抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体のアイソタイプは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて決定した。実施例８で得られた抗ＴＩＭ−３抗体を含むハイブリドーマ上清を用い、マニュアルに従って操作した。その結果、８２１３抗体のアイソタイプはＩｇＧ２ｂであることが明らかとなった。

【0343】

［実施例１２］
（抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体遺伝子の単離）
実施例９で取得された抗ヒトＴＩＭ−３ヒト又はマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから抗ＴＩＭ−３ヒト又はマウスモノクローナル抗体遺伝子を単離した。トータルＲＮＡの抽出は、クローン化したハイブリドーマから、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、マニュアルに従い実施した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローンテック社製）を用い、添付の説明書に従って行った。

【0344】

ヒトモノクローナル抗体重鎖（ＶＨ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｈ−６（配列番号４４）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｈ−３（配列番号４５）を用いた。ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。

【0345】

その結果、５１２抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号５４、アミノ酸配列が５５で表され、６４４抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号５８、アミノ酸配列が５９で表され、４５４５抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号７、アミノ酸配列が配列番号８で表され、４１７７抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号１７、アミノ酸配列が配列番号１８で表されることが明らかとなった。得られた各可変領域とヒトＩｇＧ１の定常領域とを発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃ社製）に組み込み、連結した。

【0346】

ヒトモノクローナル抗体軽鎖（ＶＬ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｋ−２（配列番号４６）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｈｋ−６（配列番号４７）を用いた。ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。

【0347】

その結果、５１２抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号５６、アミノ酸配列が５７で表され、６４４抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号６０、アミノ酸配列が６１で表され、４５４５抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号９、アミノ酸配列が配列番号１０で表され、４１７７抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号１９、アミノ酸配列が配列番号２０で表されることが明らかとなった。得られた各可変領域とκ鎖の定常領域とを発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃ社製）に組み込み、連結した。

【0348】

マウスモノクローナル抗体重鎖（ＶＨ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｍＨ＿Ｒｖ１（配列番号４８）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社）とプライマーｍＨ＿Ｒｖ２（配列番号４９）を用いた。

【0349】

ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。

【0350】

その結果、８２１３抗体のＶＨは、塩基配列が配列番号２７、アミノ酸配列が配列番号２８で表されることが明らかとなった。得られた可変領域とマウスＩｇＧ２ａ定常領域とを連結し、発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃ社製）に組み込んだ。

【0351】

マウスモノクローナル抗体軽鎖（ＶＬ）のＰＣＲには、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｍＫ＿Ｒｖ１（配列番号５０）を用い、さらに、この反応液の一部を鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；クローンテック社製）とプライマーｍＫ＿Ｒｖ２（配列番号５１）を用いた。ＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などを用いてクローニングし、ベクターのユニバーサルプライマー（例えば、Ｔ７またはＭ１３Ｒプライマー）を用いて塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。

【0352】

その結果、８２１３抗体のＶＬは、塩基配列が配列番号２９、アミノ酸配列が配列番号３０で表されることが明らかとなった。得られた可変領域とマウスκ鎖の定常領域とを連結し、上述の８２１３抗体のＶＨを組み込んだ発現ベクターに挿入した。

【0353】

また、陰性コントロールとして抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）ヒトＩｇＧ１抗体を得るため、抗重鎖（ＶＨ）の塩基配列（配列番号６２）、抗体軽鎖（ＶＬ）の塩基配列（配列番号６４）、ヒトＩｇＧ１及びκ鎖の定常領域を発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃ社製）に組み込んだ。

【0354】

［実施例１３］
（組換抗ＴＩＭ−３ヒトモノクローナルデフコース抗体の精製）
実施例１２で構築した組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞は、既報に従い、ＦＵＴ８^−／− ＣＨＯ細胞を用いた（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６：１２（９）Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．）。まず、実施例１２で得られた５１２、６４４、４５４５、又は、４１７７の発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を用いてＦＵＴ８^−／− ＣＨＯ細胞にそれぞれ導入した。ＦＵＴ８^−／− ＣＨＯ細胞は、シェーカーを用いてＣＯ_２ ５％、３７℃の環境下で培養し、約５日後に培養上清を回収した。

【0355】

回収した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥヘルスケア社製）及び精製量に応じて０．８×４０ｃｍカラム（バイオラッド社製）などを用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２ｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。

【0356】

調製された抗体溶液は、ＮＡＰ−２５（ＧＥヘルスケア社製）及びアミコンウルトラ（１００００カット、ミリポア社製）を用いてＰＢＳに置換及び濃縮し、ろ過滅菌した後、組換抗ＴＩＭ−３ヒトモノクローナルデフコース抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体）を得た。リムルスＥＳ−ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。
また、実施例１２で得られた抗ＤＮＰ抗体の発現ベクターをＣＨＯ−ＤＧ４４細胞に導入した。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、シェーカーを用いてＣＯ_２ ５％、３７℃の環境下で培養し、約５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清を、同様に精製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥヘルスケア社製）及び精製量に応じて０．８×４０ｃｍカラム（バイオラッド社製）などを用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２ｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。調製された抗体溶液は、ＮＡＰ−２５（ＧＥヘルスケア社製）及びアミコンウルトラ（１００００カット、ミリポア社製）を用いてＰＢＳに置換及び濃縮し、ろ過滅菌した後、組換抗ＤＮＰ抗体を得た。リムルスＥＳ−ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。

【0357】

［実施例１４］
（組換抗ＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体の精製）
実施例１２で得られた８２１３抗体の発現ベクターは、２９３フェクチン（インビトロジェン社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に導入した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、シェーカーを用いてＣＯ_２ ５％、３７℃の環境下で培養し、約５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥヘルスケア社製）及び精製量に応じて０．８×４０ ｃｍ カラム（バイオラッド社製）などを用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２ｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．７、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を用いてアフィニティー精製した。

【0358】

溶出画分は０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。調製された抗体溶液は、ＮＡＰ−２５（ＧＥヘルスケア社製）及びアミコンウルトラ（１００００カット、ミリポア社製）を用いてＰＢＳに置換及び濃縮し、ろ過滅菌した後、組換抗ＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体（８２１３抗体）を得た。リムルスＥＳ−ＩＩキットワコー（和光純薬社製）を用いて精製度を測定し、十分に精製されていることを確認した。

【0359】

［実施例１５］
（精製モノクローナル抗体の蛍光標識）
ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体および組換モノクローナル抗体の蛍光標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、マニュアルに従い実施した。標識操作後、ＴＩＭ−３発現細胞に対するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、各抗体がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（以下、Ａｌｅｘａ−６４７と記す）で標識されていることを確認した。

【0360】

［実施例１６］
（競合試験によるエピトープ分類−１）
実施例１３及び１４で得られた抗体、並びに市販の抗ＴＩＭ−３抗体である３４４８２３抗体（Ｃｌｏｎｅ ３４４８２３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）のエピトープの関係を競合試験で検討した。簡単には、被験抗体を実施例１で得られたＴＩＭ−３発現細胞に反応させ、標識した別の抗ＴＩＭ−３抗体がＴＩＭ−３発現細胞にさらに結合しうるかをフローサイトメトリー法で評価した。

【0361】

第一段階として、実施例１３及び１４で作製したモノクローナル抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体、８２１３抗体）と３４４８２３抗体との競合の有無をそれぞれ検討した。まず、ステイニングメディウムで洗浄したヒトＴＩＭ−３発現ＥｏＬ−１細胞と親株ＥｏＬ−１細胞に精製した被験モノクローナル抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体、８２１３抗体）をそれぞれ反応させた（４℃ ３０分間）。終濃度は１０μｇ／ｍＬとした。続いて、ＰＥ標識３４４８２３抗体（Ｃｌｏｎｅ ３４４８２３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、反応させた（４℃ ３０分間）。ステイニングメディウムで洗浄後、７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。

【0362】

その結果、陽性対照として用いたヤギ由来抗ヒトＴＩＭ−３ ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び６４４抗体はＰＥ標識３４４８２３抗体のＴＩＭ−３発現細胞への結合をほぼ完全に阻害した。一方で、５１２、４５４５及び８２１３抗体はＰＥ標識３４４８２３抗体のＴＩＭ−３発現細胞への結合を阻害しなかった。また、４１７７抗体は、ＰＥ標識３４４８２３抗体のＴＩＭ−３発現細胞への結合を阻害したが、その阻害は６４４抗体に比べると極めて低かった。従って、６４４抗体は３４４８２３抗体と競合する一方で、５１２、４５４５及び８２１３抗体は３４４８２３抗体と競合せず、４１７７抗体は３４４８２３抗体と競合するものの、その競合は部分的であることが明らかとなった。

【0363】

第二段階として、これまでテストした抗ＴＩＭ−３モノクローナル抗体のうち、３４４８２３抗体と競合しなかった、５１２、４５４５及び８２１３抗体の競合の有無を検討した。方法は、標識抗体として実施例１５で得られたＡｌｅｘａ−６４７標識５１２抗体又はＡｌｅｘａ−６４７標識８２１３抗体を用いた以外は、第一段階と同様に行った。その結果、４５４５及び８２１３抗体は、Ａｌｅｘａ−６４７標識５１２抗体のＴＩＭ−３発現細胞への結合を阻害しなかった。

【0364】

一方で、４５４５抗体は、Ａｌｅｘａ−６４７標識８２１３抗体のＴＩＭ−３発現細胞への結合を阻害した。従って、４５４５抗体と８２１３抗体は競合する一方で、これら２抗体は５１２抗体と競合しないことが明らかとなった。この結果は、５１２抗体は、３４４８２３抗体及び８２１３抗体と異なるエピトープを認識することを示唆している。

【0365】

第三段階として、第一段階で３４４８２３抗体と部分的に競合することが明らかとなった４１７７抗体について、５１２及び８２１３抗体との競合の有無を検討した。方法は、第二段階と同様に行った。その結果、４１７７抗体は、Ａｌｅｘａ−６４７標識５１２抗体のＴＩＭ−３発現細胞への結合を阻害しない一方で、Ａｌｅｘａ−６４７標識８２１３抗体のＴＩＭ−３発現細胞への結合を阻害したことから、４１７７抗体は５１２抗体と競合せず、８２１３抗体と競合することが明らかとなった。

【0366】

以上の結果から、実施例１３及び１４で得られた５抗体のうち、６４４抗体は３４４８２３抗体が認識するエピトープの近傍を認識し、５１２抗体は３４４８２３抗体または他の４抗体（６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体、８２１３抗体）が認識するエピトープと異なるエピトープを認識することが示唆された。

【0367】

また、８２１３抗体は３４４８２３抗体または５１２抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識することが示唆された。４５４５抗体はこの８２１３抗体が認識するエピトープの近傍を認識することが示唆された。一方、４１７７抗体は８２１３抗体が認識するエピトープの近傍と共に、３４４８２３抗体が認識するエピトープの近傍もわずかに認識することが示唆された。

【0368】

［実施例１７］
（組換抗ＴＩＭ−３ヒトモノクローナルデフコース抗体による抗体依存的細胞傷害活性試験）
抗体を介した細胞性の細胞傷害活性は、抗体の存在下でエフェクターとしてヒト末梢血由来単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ、以下、ＰＢＭＣと記す）を用い、ターゲット細胞へのＡＤＣＣ活性の測定を実施した。まず、健康なボランティアより末梢血を採取し、抗凝固剤を添加した。この血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）の上に静置し、界面を乱さないように大型遠心分離機（ＣＦ９ＲＸ、日立工機社製）を用いて２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。

【0369】

細胞が含まれる中間層を集めＰＢＳを用いて洗浄し、９００ｒｐｍ ２０分間の遠心分離により血小板を除いたものをＰＢＭＣとして測定に用いた。次に、ターゲット細胞に用いるＤａｕｄｉ細胞とＰＢＭＣをエフェクター／ターゲット比＝５０で混合した。

【0370】

実施例１３及び１４で得られた組換抗ＴＩＭ−３ヒトモノクローナルデフコース抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、４１７７抗体）およびヒトＩｇＧ１コントロールとして抗ＤＮＰ抗体をそれぞれ培地に懸濁し、終濃度１μｇ／ｍＬ、トータル１００μＬとなるように添加した。混合後、３７℃、５％ ＣＯ_２存在下で４時間培養した。培地中に放出されたＬＤＨ量から、ターゲット細胞の溶解度を評価した。ＬＤＨの測定と溶解度の算出は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）を用い、マニュアルに従った。有意差検定は標準的なＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、危険率（ｐ）が０．０５以下のものを有意に異なるものとした。

【0371】

Ｄａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定した結果、抗ＤＮＰ抗体と比較して、４５４５抗体及び４１７７抗体は、ターゲット細胞溶解率の顕著な増加が認められた。この結果は、抗ＴＩＭ−３マウス抗体８２１３、および、抗ＴＩＭ−３マウス抗体８２１３と競合する抗ＴＩＭ−３抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有することを示唆している。

【0372】

同様に、実施例１３で得られた、組換抗ＴＩＭ−３ヒトモノクローナルデフコース抗体（４５４５抗体、４１７７抗体）、市販抗ヒトＴＩＭ−３モノクローナル抗体である３４４８２３抗体、および、ネガティブコントロールとして抗ＤＮＰ抗体を用い、同様にＡＤＣＣ活性の測定を実施した。

【0373】

まず、健康なボランティアより末梢血を採取し、抗凝固剤を添加した。この血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）の上に静置し、界面を乱さないように大型遠心分離機（ＣＦ９ＲＸ、日立工機社製）を用いて２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。細胞が含まれる中間層を集めＰＢＳを用いて洗浄し、９００ｒｐｍ ２０分間の遠心分離により血小板を除いたものをＰＢＭＣとして測定に用いた。

【0374】

次に、ターゲット細胞に用いるＤａｕｄｉ細胞とＰＢＭＣをエフェクター／ターゲット比＝２５で混合した。４５４５抗体、４１７７抗体、３４４８２３抗体、抗ＤＮＰ抗体およびＰＢＳを培地に懸濁し、終濃度１μｇ／ｍＬ、トータル１００μＬとなるように添加した。混合後、３７℃、５％ ＣＯ_２存在下で４時間培養した。培地中に放出されたＬＤＨ量から、ターゲット細胞の溶解度を評価した。

【0375】

ＬＤＨの測定と溶解度の算出は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）を用い、マニュアルに従った。有意差検定は標準的なＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、危険率（ｐ）が０．０５以下のものを有意に異なるものとした。Ｄａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定した結果、４５４５抗体、および、４１７７抗体は、抗ＤＮＰ抗体と比較して、ターゲット細胞溶解率の有意な増加が認められた。一方、３４４８２３抗体は、抗ＤＮＰ抗体およびＰＢＳと比較して、ターゲット細胞溶解率の有意な増加は認められなかった。

【0376】

［実施例１８］
（抗ＴＩＭ−３抗体を用いた結合解離定数の算出）
抗ＴＩＭ−３抗体の結合解離定数を、表面プラズモン共鳴の原理による解析装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ ヘルスケア社製）を用いて解析した。簡単には、抗ヒト抗体または抗マウス抗体をＣＭ５センサーチップに固相化し、次に抗ＴＩＭ−３ヒトまたはマウス抗体を流して結合させ、次いで実施例４で作製した可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３を流すことによって、抗ＴＩＭ−３抗体に対するＴＩＭ−３の結合解離を観察した。全実験工程を通して、基本的にはＧＥ ヘルスケア社の結合解離定数算出のための実験方法を参照した。

【0377】

具体的には、センサーチップはＣＭ５（リサーチグレード、ＧＥヘルスケア社製）を用いた。まず、ＣＭ５チップを４００ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＣ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を等量混合したものをＣＭ５チップに流して活性化させた。次に、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）付属の抗ヒト抗体抗体をキット付属の溶液に希釈して流し、ＣＭ５チップにヒト抗体に対する抗体を必要量固相化させた。

【0378】

また、マウス抗体に関しては、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）付属のマウス抗体に対する抗体をキット付属の溶液に希釈して流し、ＣＭ５チップに必要量固相化させた。次に、１ｍｏｌ／Ｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを流し、活性化したチップ表面をブロッキングし不活化させた。

【0379】

次に、抗ＴＩＭ−３抗体を１フローセルに１種類ずつＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥヘルスケア社製）に希釈して流し、固相化されたヒト抗体に対する抗体またはマウス抗体に対する抗体に結合させた。次に、可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３を流した。結合した抗ＴＩＭ−３抗体及び可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３を解離させるため、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ付属の３ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２、またはＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ付属のｐＨ１．７ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌをキット付属の量を流した。

【0380】

ここまでの工程を１ステップとし、同様の工程を可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３について複数の濃度で繰り返すことで、結合解離定数を算出するためのデータ（センサーグラム）を取得した。アナライトとして流した可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３の濃度は、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬ を１．４ＯＤとして算出した。

【0381】

可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３の分子量は、電気泳動の泳動度から、約４２．８ ｋＤａと算出した。解析は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフト（ＧＥヘルスケア社製）を用い、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照した。具体的には、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析の同時解析を実施し、基本的に１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ｂｉｎｄｉｎｇの反応モデルを採用してフィッティングし、結合速度定数（Ｋａ）及び解離速度定数（Ｋｄ）を算出し、Ｋｄ／Ｋａの計算により解離定数Ｋ_Ｄ値を算出した。

【0382】

抗ヒトＴＩＭ−３ヒトモノクローナル抗体のＫ_Ｄ値は、多くの抗体で１０^−９ｍｏｌ／Ｌオーダーとなった。このことから、ＴＩＭ−３を標的にしたＡＤＣＣ活性と結合親和性の間に相関は認められなかった。

【0383】

抗ヒトＴＩＭ−３マウスモノクローナル抗体は、観察した限りにおいて（例えば解離相を３０分程度観察）、抗原である可溶型細胞膜外ヒトＴＩＭ−３との解離が認められなかった。このことから、ヒトＴＩＭ−３に対し、極めて高い結合性を有するモノクローナル抗体を作製しうることが示された。

【0384】

［実施例１９］
（競合試験によるエピトープ分類−２）
抗ＴＩＭ−３抗体である、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体、Ｆ３８−２Ｅ２抗体、および、コントロールの抗ＤＮＰ抗体のエピトープを競合試験で検討した。簡単には、未標識の被験抗体を実施例１で得られたＴＩＭ−３発現細胞に反応させ、蛍光標識した別の抗ＴＩＭ−３抗体がＴＩＭ−３発現細胞にさらに結合しうるかをフローサイトメトリー法で評価した。

【0385】

ステイニングメディウムで洗浄したヒトＴＩＭ−３発現ＥｏＬ−１細胞に精製した被験モノクローナル抗体［抗ＤＮＰ抗体、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｆ３８−２Ｅ２抗体（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）］をそれぞれ反応させた（４℃ ３０分間）。終濃度は１０μｇ／ｍＬとした。続いて、Ａｌｅｘａ−６４７またはＡＰＣ標識抗ＴＩＭ−３抗体［３４４８２３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｆ３８−２Ｅ２抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）］を添加し、反応させた（４℃ ３０分間）。ステイニングメディウムで洗浄後、７−ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。

【0386】

結果を表１に示す。表１において、未標識抗ＴＩＭ−３抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合がネガティブコントロールと同程度に認められた場合を「＋」、未標識抗ＴＩＭ−３抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が減弱しながらも認められた場合を「＋／−」、未標識抗ＴＩＭ−３抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が認められなかった場合を「−」で表した。

【0387】

【表1】

【0388】

表１に示すように、Ａｌｅｘａ−６４７標識５１２抗体は、その他の未標識抗ＴＩＭ−３抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が認められたことから、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体、Ｆ３８−２Ｅ２抗体とは競合しない、独立したエピトープを認識することが示唆された。

【0389】

Ａｌｅｘａ−６４７標識６４４抗体は、未標識抗ＴＩＭ−３抗体３４４８２３抗体またはＦ３８−２Ｅ２抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が認められない、もしくは減弱したことから、３４４８２３抗体、Ｆ３８−２Ｅ２抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。

【0390】

Ａｌｅｘａ−６４７標識４５４５抗体は、未標識抗ＴＩＭ−３抗体８２１３抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が認められなかったことから、８２１３抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。

【0391】

Ａｌｅｘａ−６４７標識８２１３抗体は、未標識抗ＴＩＭ−３抗体４５４５抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が認められなかったことから、４５４５抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。

【0392】

ＡＰＣ標識３４４８２３抗体は、未標識抗ＴＩＭ−３抗体６４４抗体またはＦ３８−２Ｅ２抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が認められない、もしくは減弱したことから、６４４抗体またはＦ３８−２Ｅ２抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。

【0393】

ＡＰＣ標識Ｆ３８−２Ｅ２抗体は、未標識抗ＴＩＭ−３抗体６４４抗体または３４４８２３抗体の結合したＴＩＭ−３発現細胞への結合が認められなかったことから、６４４抗体または３４４８２３抗体と競合する、互いに近接したエピトープを認識することが示唆された。

【0394】

［実施例２０］
（マウスＴＩＭ−３ ｃＤＮＡの分子クローニング）
マウスＴＩＭ−３のｃＤＮＡは実施例１と同様に取得した。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨髄細胞からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いて鋳型ｃＤＮＡを合成した。プライマーは、ｍＴｉｍ−３ Ｆｗ３（配列番号７０）及びｍＴｉｍ−３ Ｒｅ３（配列番号７１）を用いた。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ挿入後、ＤＮＡ配列解析により、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４５０２４１のコーディングリージョンと同一の塩基配列を有するクローンを選定した。

【0395】

選定したクローンを鋳型としたＰＣＲにより、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣベクター（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩ部位に挿入した（ｍＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ）。ＰＣＲのプライマーには、ｍＴｉｍ−３ Ｆｗ４ＮｏｔＩ（配列番号７２）およびｍＴｉｍ−３ Ｒｅ４ＮｏｔＩ（配列番号７３）を用いた。

【0396】

［実施例２１］
（ｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
実施例１で作製したｈＴＩＭ−３／ｐＭＣｓ−ＩＧ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡとｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣをそれぞれＮｏｔＩで消化し、ヒトＴＩＭ−３発現ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ベクターを構築した（ｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ）。ＤＮＡ配列解析を行い、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２７８２のコーディングリージョンと同一の塩基配列を有することを確認した。

【0397】

［実施例２２］
（抗ヒトＴＩＭ−３抗体のマウスＴＩＭ−３抗体への交差性評価）
実施例２０および実施例２１で作製したｍＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、ｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ、および、コントロールの空ベクターを実施例４と同様にＨＥＫ２９３Ｆ細胞にそれぞれトランスフェクションした。２日後、実施例１５と同様にＡｌｅｘａ−６４７標識した抗ヒトＴＩＭ−３抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体）、ＡＰＣ標識市販抗ヒトＴＩＭ−３抗体（３４４８２３抗体およびＦ３８−２Ｅ２抗体）およびＰＥ標識市販抗マウスＴＩＭ−３抗体（ＲＭＴ３−２３抗体、バイオレジェンド社製）のヒトＴＩＭ−３およびマウスＴＩＭ−３に対する結合性をフローサイトメトリーで評価した。

【0398】

その結果、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体およびＦ３８−２Ｅ２抗体はヒトＴＩＭ−３発現２９３Ｆ細胞にのみ結合した。一方、ＲＭＴ３−２３抗体はマウスＴＩＭ−３発現２９３Ｆ細胞にのみ結合した。このことから、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、３４４８２３抗体およびＦ３８−２Ｅ２抗体はマウスＴＩＭ−３には交差反応しないことが分かった。

【0399】

［実施例２３］
（ＩｇＶドメインをマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質発現系の構築）
ｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＲ１プライマー（配列番号７４）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＦ１プライマー（配列番号７５）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。ｍＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＦ１プライマー（配列番号７６）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＲ１プライマー（配列番号７７）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0400】

得られた２つのＰＣＲ産物をＧＥＮＥＡＲＴ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＩｇＶ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号７８）。

【0401】

［実施例２４］
（ＭｕｃｉｎドメインをマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質発現系の構築）
ｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＲ２プライマー（配列番号８０）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＦ２プライマー（配列番号８１）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。ｍＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＦ２プライマー（配列番号８２）および、ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＲ２プライマー（配列番号８３）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0402】

得られた２つのＰＣＲ産物をＧＥＮＥＡＲＴ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（Ｍｕｃｉｎ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号８４）。

【0403】

［実施例２５］
（ＩｇＶドメインをマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質およびＭｕｃｉｎドメインをマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質への抗ＴＩＭ−３抗体の結合性評価）
実施例２３および２４で作製したＩｇＶ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、Ｍｕｃｉｎ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、ｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、ｍＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ、および、コントロールの空ベクターを実施例４と同様にＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。２日後、実施例２２と同様に抗ＴＩＭ−３抗体の結合性をフローサイトメトリーで評価した。

【0404】

その結果、５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、４１７７抗体、３４４８２３抗体およびＦ３８−２Ｅ２抗体は、ヒトＴＩＭ−３発現細胞とＭｕｃｉｎ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３発現細胞のみに結合した。一方、ＲＭＴ３−２３抗体はマウスＴＩＭ−３発現細胞とＩｇＶ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３発現細胞のみに結合した。

【0405】

このことから、テストした全ての抗ヒトＴＩＭ−３抗体（５１２抗体、６４４抗体、４５４５抗体、８２１３抗体、４１７７抗体、３４４８２３抗体、Ｆ３８−２Ｅ２抗体）およびマウスＴＩＭ−３抗体（ＲＭＴ３−２３抗体）はＩｇＶドメインを認識することが示された。

【0406】

［実施例２６］
（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の２２から４７番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｆ１プライマー（配列番号８６）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｒ１プライマー（配列番号８７）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0407】

得られたＰＣＲ産物を鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｆ２プライマー（配列番号８８）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｒ２プライマー（配列番号８９）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0408】

得られたＰＣＲ産物を鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｆ３プライマー（配列番号９０）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｒ３プライマー（配列番号９１）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0409】

３度目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号９２）。

【0410】

［実施例２７］
（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の５７から６６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型に、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いてリン酸化したｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７−６６Ｆプライマー（配列番号９４）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７−６６Ｒプライマー（配列番号９５）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0411】

得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＬｉｇａＦａｓｔ^ＴＭ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号９６）。

【0412】

［実施例２８］
（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の６７から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５、と記す）を構築した。ｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型としてｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｆプライマー（配列番号９８）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｒプライマー（配列番号９９）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0413】

ｍＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型としてｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｆプライマー（配列番号１００）および、ｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｒプライマー（配列番号１０１）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。得られた２つのＰＣＲ産物をＧＥＮＥＡＲＴ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１０２）。

【0414】

［実施例２９］
（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の７４から８１番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４−８１Ｆプライマー（配列番号１０４）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４−８１Ｒプライマー（配列番号１０５）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0415】

得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１０６）。

【0416】

［実施例３０］
（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の８８から９６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８−９６Ｆプライマー（配列番号１０８）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８−９６Ｒプライマー（配列番号１０９）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0417】

得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１１０）。

【0418】

［実施例３１］
（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの構築）
ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の９６から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質を発現させるための発現ベクター（以下、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５、と記す）を構築した。方法は、実施例２１で作製したｈＴｉｍ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを鋳型に、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６−１０５Ｆプライマー（配列番号１１２）および、ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６−１０５Ｒプライマー（配列番号１１３）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲで増幅した。

【0419】

得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化後、アガロース電気泳動した。ＤＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＡＲＴ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、結合させた。形質転換体から得られたクローンの配列を解析し、目的の配列であることを確認した（ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣ、配列番号１１４）。

【0420】

［実施例３２］
（ＩｇＶドメインの一部をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質への抗ＴＩＭ−３抗体の結合性評価）
実施例２６から３１で作製した各種ＴＩＭ−３キメラ蛋白質の発現ベクター、および、コントロールの空ベクターを実施例４と同様にＨＥＫ２９３Ｆ細胞にそれぞれトランスフェクションした。導入された発現ベクターおよび当該ベクターにより発現するＴＩＭ−３キメラ蛋白質は次の通りである。
（１）ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７：ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の２２から４７番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質
（２）ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６：ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の５７から６６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質
（３）ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５：ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の６７から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質
（４）ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１：ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の７４から８１番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質
（５）ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６：ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の８８から９６番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質
（６）ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５：ヒトＴＩＭ−３（配列番号５３）の９６から１０５番目に相当するアミノ酸をマウスＴＩＭ−３に置換したＴＩＭ−３キメラ蛋白質
トランスフェクションした２日後、実施例２２と同様に抗ＴＩＭ−３抗体の結合性をフローサイトメトリーで評価した。

【0421】

その結果を表２に示す。表２において、トランスフェクションした細胞への抗体の結合が認められた場合を「＋」、トランスフェクションした細胞への抗体の結合が減弱しながらも認められた場合を「＋／−」、トランスフェクションした細胞への抗体の結合が認められなかった場合を「−」で表した。

【0422】

【表2】

【0423】

表２に示すように、４５４５抗体および８２１３抗体は、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５をトランスフェクションした細胞に結合した。一方、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５をトランスフェクションした細胞に結合しなかった。

【0424】

５１２抗体は、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５、および、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１をトランスフェクションした細胞に結合した。一方、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７をトランスフェクションした細胞に結合しなかった。

【0425】

６４４抗体、３４４８２３抗体、および、Ｆ３８−２Ｅ２抗体は、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５、および、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１をトランスフェクションした細胞に結合した。一方、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６をトランスフェクションした細胞に結合しなかった。
４１７７抗体は、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５、および、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１をトランスフェクションした細胞に結合した。また、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５をトランスフェクションした細胞に弱く結合した。

【0426】

以上の結果と、実施例１６および実施例１９の結果から、４５４５抗体および８２１３抗体は、ヒトＴＩＭ−３の６７から８７番目のアミノ酸に結合することが示された。さらに、ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１をトランスフェクションした細胞に結合しなかったことから、４５４５抗体および８２１３抗体のヒトＴＩＭ−３への結合に必要なアミノ酸が７４番目から８１番目のアミノ酸に含まれていることが示唆された。

【0427】

また、５１２抗体は、ヒトＴＩＭ−３の４７番目までのアミノ酸に結合すること、６４４抗体、３４４８２３抗体、および、Ｆ３８−２Ｅ２抗体は、ヒトＴＩＭ−３の５７から６６番目のアミノ酸に結合することが示唆された。

【0428】

さらに、４１７７抗体は、４５４５抗体または８２１３抗体は結合する一方、５１２抗体、６４４抗体、３４４８２３抗体、および、Ｆ３８−２Ｅ２抗体は結合しない、ヒトＴＩＭ−３の６７から８７番目のアミノ酸に含まれるアミノ酸のうち、７４から８１番目を除くアミノ酸にも結合することが示唆された。

【0429】

［実施例３３］
（抗ヒトＴＩＭ−３ ８２１３抗体ヒト化抗体の作製）
（１）８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。８２１３抗体ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号２１〜２３）の移植に適したヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。

【0430】

カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩ〜ＩＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列と８２１３抗体ＶＨのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。

【0431】

相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、およびＨＳＧＩＩＩの相同性はそれぞれ７７．０％、５５．２％、５８．６％であった。従って、８２１３抗体ＶＨのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。

【0432】

以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、８２１３抗体ＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２１〜２３）を移植した。このようにして、配列番号６７で表される抗ヒトＴＩＭ−３ ８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列８２１３抗体ＨＶ０を設計した。

【0433】

次に、８２１３抗体ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。８２１３抗体ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号２４〜２６）を移植に適したヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を、以下のようにして選択した。

【0434】

カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＶ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩ〜ＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列と８２１３抗体ＶＬのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。

【0435】

相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ、およびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ７６．３％、６１．３％、６１．３％、６８．８％であった。従って、８２１３抗体ＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。

【0436】

以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、８２１３抗体ＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２４〜２６）を移植した。このようにして、配列番号６９で表される抗ヒトＴＩＭ−３ ８２１３抗体ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列８２１３抗体ＬＶ０を設計した。

【0437】

上記で設計した８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列８２１３抗体ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列８２１３抗体ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に、マウスモノクローナル抗体である８２１３抗体のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。

【0438】

しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単にヒト抗体のＦＲへマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するのみでは、結合活性が低下してしまうことが多い。このような結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定し、改変することとした。

【0439】

まず、上記で設計した８２１３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列８２１３抗体ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列８２１３抗体ＬＶ０より成る抗体Ｖ領域（以下、ＨＶ０ＬＶ０と表す）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（アクセルリス社）を用いた。また、８２１３抗体のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。

【0440】

更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、８２１３抗体と異なっているアミノ酸残基を選択し、８２１３抗体のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製した８２１３抗体、ＨＶ０ＬＶ０および改変体の各Ｖ領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。

【0441】

その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、
８２１３抗体ＨＶ０では、１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４０番目のＡｌａ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、７２番目のＡｌａ、７４番目のＴｈｒ、９８番目のＡｒｇ、および１１３番目のＶａｌを、８２１３抗体ＬＶ０では、１１番目のＬｅｕ、１３番目のＡｌａ、１５番目のＶａｌ、３６番目のＴｙｒ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、４６番目のＬｅｕ、７１番目のＰｈｅ、および８５番目のＴｈｒを、それぞれ選択した。

【0442】

これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を８２１３抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。

【0443】

具体的には、ＶＨについては、配列番号６７のアミノ酸配列の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４０番目のＡｌａをＡｒｇに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、７２番目のＡｌａをＶａｌに、７４番目のＴｈｒをＬｙｓに、９８番目のＡｒｇをＧｌｙに、または１１３番目のＶａｌをＬｅｕに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。

【0444】

また、ＶＬについては、配列番号６９のアミノ酸配列の１１番目のＬｅｕをＭｅｔに、１３番目のＡｌａをＶａｌに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３６番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４４番目のＰｒｏをＰｈｅに、４６番目のＬｅｕをＧｌｙに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８５番目のＴｈｒをＡｓｐに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。

【0445】

ＨＶ０ＬＶ０のＦＲに存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基を改変した８２１３抗体ヒト化抗体の抗体Ｖ領域として、ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ２、ＨＶ０ＬＶ４、ＨＶ０ＬＶ５、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ０ＬＶ７、ＨＶ０ＬＶ９、ＨＶ３ＬＶ０、ＨＶ３ＬＶ２、ＨＶ３ＬＶ４、ＨＶ３ＬＶ５、ＨＶ３ＬＶ６、ＨＶ３ＬＶ７、ＨＶ３ＬＶ９、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ２、ＨＶ４ＬＶ４、ＨＶ４ＬＶ５、ＨＶ４ＬＶ６、ＨＶ４ＬＶ７、ＨＶ４ＬＶ９、ＨＶ５ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ２、ＨＶ５ＬＶ４、ＨＶ５ＬＶ５、ＨＶ５ＬＶ６、ＨＶ５ＬＶ７、ＨＶ５ＬＶ９、ＨＶ６ＬＶ０、ＨＶ６ＬＶ２、ＨＶ６ＬＶ４、ＨＶ６ＬＶ５、ＨＶ６ＬＶ６、ＨＶ６ＬＶ７、ＨＶ６ＬＶ９、ＨＶ７ＬＶ０、ＨＶ７ＬＶ２、ＨＶ７ＬＶ４、ＨＶ７ＬＶ５、ＨＶ７ＬＶ６、ＨＶ７ＬＶ７、ＨＶ７ＬＶ９、ＨＶ８ＬＶ０、ＨＶ８ＬＶ２、ＨＶ８ＬＶ４、ＨＶ８ＬＶ５、ＨＶ８ＬＶ６、ＨＶ８ＬＶ７、ＨＶ８ＬＶ９、ＨＶ１０ＬＶ０、ＨＶ１０ＬＶ２、ＨＶ１０ＬＶ４、ＨＶ１０ＬＶ５、ＨＶ１０ＬＶ６、ＨＶ１０ＬＶ７、ＨＶ１０ＬＶ９、ＨＶ１２ＬＶ０、ＨＶ１２ＬＶ２、ＨＶ１２ＬＶ４、ＨＶ１２ＬＶ５、ＨＶ１２ＬＶ６、ＨＶ１２ＬＶ７、およびＨＶ１２ＬＶ９をそれぞれ設計した。

【0446】

Ｈ鎖可変領域ＨＶ３、ＨＶ４，ＨＶ５，ＨＶ６、ＨＶ７、ＨＶ８，ＨＶ１０、ＨＶ１２、およびＬ鎖可変領域ＬＶ２、ＬＶ４、ＬＶ５、ＬＶ６、ＬＶ７、ＬＶ９のアミノ酸配列をそれぞれ図１および２に示した。

【0447】

（２）８２１３抗体ヒト化抗体の作製
８２１３抗体ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、８２１３抗体ＶＨおよび８２１３抗体ＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号２７、２９）で用いられているコドンを利用して設計し、アミノ酸改変を行う場合には、哺乳動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて設計し、各々作製した。

【0448】

これらＤＮＡ配列を用いて、抗体発現ベクターの構築およびヒト化抗体の発現を行った。

【0449】

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年６月１１日付で出願された米国仮出願（６１／３５３８３６）に基づいており、その全体が引用により援用される。

【産業上の利用可能性】

【0450】

本発明によれば、ヒトＴＩＭ−３の細胞外領域のアミノ酸配列、またはその立体構造に結合し、かつＡＤＣＣ活性を発揮するモノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することができる。

【配列表フリーテキスト】

【0451】

配列番号１：Ｈｕｍａｎ４５４５ Ｈ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２：Ｈｕｍａｎ４５４５ Ｈ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３：Ｈｕｍａｎ４５４５ Ｈ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４：Ｈｕｍａｎ４５４５ Ｌ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５：Ｈｕｍａｎ４５４５ Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６：Ｈｕｍａｎ４５４５ Ｌ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｈｕｍａｎ４１７７ Ｈ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１２：Ｈｕｍａｎ４１７７ Ｈ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｈｕｍａｎ４１７７ Ｈ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４：Ｈｕｍａｎ４１７７ Ｌ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｈｕｍａｎ４１７７ Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６：Ｈｕｍａｎ４１７７ Ｌ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１：Ｍｏｕｓｅ８２１３ Ｈ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２２：Ｍｏｕｓｅ８２１３ Ｈ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２３：Ｍｏｕｓｅ８２１３ Ｈ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２４：Ｍｏｕｓｅ８２１３ Ｌ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２５：Ｍｏｕｓｅ８２１３ Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２６：Ｍｏｕｓｅ８２１３ Ｌ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３１：プライマー ＴＩＭ−３ Ｆｗ２の塩基配列
配列番号３２：プライマー ＴＩＭ−３ Ｒｅ２の塩基配列
配列番号３３：プライマー ｐＭＣｓ−Ｆｗの塩基配列
配列番号３４：プライマー ＴＩＭ３ＥＤ−ＦｃＲｅＸｂａの塩基配列
配列番号３５：プライマー Ｔ７の塩基配列
配列番号３６：プライマー ｈＴＩＭ−３ Ｆｗ１の塩基配列
配列番号３７：インサート ｈＴＩＭ−３ ＥＣＤ Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎの塩基配列
配列番号３８：インサート ｈＴＩＭ−３ ＥＣＤ Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎのアミノ酸配列
配列番号３９：プライマー ＴＩＭ３ＥＤ−ＦＬＡＧ４ａａの塩基配列
配列番号４０：プライマー Ｃ−ＦＬＡＧ−ＮｏｔＲ２の塩基配列
配列番号４１：プライマー ＢＧＨ−Ｒの塩基配列
配列番号４２：インサート ｈＴＩＭ−３ ＥＣＤの塩基配列
配列番号４３：インサート ｈＴＩＭ−３ ＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号４４：プライマー ｈｈ−６の塩基配列
配列番号４５：プライマー ｈｈ−３の塩基配列
配列番号４６：プライマー ｈｋ−２の塩基配列
配列番号４７：プライマー ｈｋ−６の塩基配列
配列番号４８：プライマー ｍＨ＿Ｒｖ１の塩基配列
配列番号４９：プライマー ｍＨ＿Ｒｖ２の塩基配列
配列番号５０：プライマー ｍＫ＿Ｒｖ１の塩基配列
配列番号５１：プライマー ｍＫ＿Ｒｖ２の塩基配列
配列番号６６：８２１３抗体 ＨＶ０可変領域の塩基配列
配列番号６７：８２１３抗体 ＨＶ０可変領域のアミノ酸配列
配列番号６８：８２１３抗体 ＬＶ０可変領域の塩基配列
配列番号６９：８２１３抗体 ＬＶ０可変領域のアミノ酸配列
配列番号７０：プライマー ｍＴｉｍ−３ Ｆｗ３の塩基配列
配列番号７１：プライマー ｍＴｉｍ−３ Ｒｅ３の塩基配列
配列番号７２：プライマー ｍＴｉｍ−３ Ｆｗ４ＮｏｔＩの塩基配列
配列番号７３：プライマー ｍＴｉｍ−３ Ｒｅ４ＮｏｔＩの塩基配列
配列番号７４：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＲ１の塩基配列
配列番号７５：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｖｅｃＦ１の塩基配列
配列番号７６：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＦ１の塩基配列
配列番号７７：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＩｇＶ＿ｉｎｓＲ１の塩基配列
配列番号７８：インサート ＩｇＶ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号７９：インサート ＩｇＶ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号８０：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＲ２の塩基配列
配列番号８１：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｖｅｃＦ２の塩基配列
配列番号８２：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＦ２の塩基配列
配列番号８３：プライマー ｈＴＩＭ３＋ｍＭｕｃｉｎ＿ｉｎｓＲ２の塩基配列
配列番号８４：インサート Ｍｕｃｉｎ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号８５：インサート Ｍｕｃｉｎ ｃｈｉｍｅｒａＴＩＭ−３／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号８６：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｆ１の塩基配列
配列番号８７：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｒ１の塩基配列
配列番号８８：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｆ２の塩基配列
配列番号８９：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｒ２の塩基配列
配列番号９０：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｆ３の塩基配列
配列番号９１：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ２２−４７Ｒ３の塩基配列
配列番号９２：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号９３：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ２２−４７／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号９４：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７−６６Ｆの塩基配列
配列番号９５：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ５７−６６Ｒの塩基配列
配列番号９６：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号９７：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ５７−６６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号９８：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｆの塩基配列
配列番号９９：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｒの塩基配列
配列番号１００：プライマー ｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｆの塩基配列
配列番号１０１：プライマー ｍＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ６７−１０５Ｒの塩基配列
配列番号１０２：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１０３：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ６７−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号１０４：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４−８１Ｆの塩基配列
配列番号１０５：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ７４−８１Ｒの塩基配列
配列番号１０６：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１０７：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ７４−８１／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号１０８：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８−９６Ｆの塩基配列
配列番号１０９：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ８８−９６Ｒの塩基配列
配列番号１１０：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１１１：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ８８−９６／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列
配列番号１１２：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６−１０５Ｆの塩基配列
配列番号１１３：プライマー ｈＴＩＭ３ｃｈｉｍｅｒａ９６−１０５Ｒの塩基配列
配列番号１１４：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣの塩基配列
配列番号１１５：インサート ＴＩＭ−３ ｃｈｉｍｅｒａ ９６−１０５／ｐＥＦ６ Ｍｙｃ＿ＨｉｓＣのアミノ酸配列

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]