特許 6162326 標的指向増幅型抗癌ナノ粒子及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6162326

(24)【登録日】2017年6月23日

(45)【発行日】2017年7月12日

(54)【発明の名称】標的指向増幅型抗癌ナノ粒子及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/14 20060101AFI20170703BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20170703BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 33/24 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170703BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/14

   A61K9/51

   A61K47/42

   A61K47/22

   A61K31/337

   A61K33/24

   A61K31/7068

   A61K31/704

   A61P35/00

【請求項の数】14

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-511662(P2016-511662)

(86)(22)【出願日】2013年5月15日

(65)【公表番号】特表2016-517881(P2016-517881A)

(43)【公表日】2016年6月20日

(86)【国際出願番号】KR2013004297

(87)【国際公開番号】WO2014178468

(87)【国際公開日】20141106

【審査請求日】2015年11月11日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0049297

(32)【優先日】2013年5月2日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】515304503

【氏名又は名称】ジニス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100121382

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 託嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100117422

【弁理士】

【氏名又は名称】堀川 かおり

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヒョン ジン

(72)【発明者】

【氏名】ホン，ソン チュル

(72)【発明者】

【氏名】チョン，ヘ ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジュ，ミン ギュ

(72)【発明者】

【氏名】チョ，ヘ グク

(72)【発明者】

【氏名】ホン，ジニー

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５０１９３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５１３６０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 International Journal of Pharmaceutics，２０１２年，Vol.422，p.472-478

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗癌剤、ナノ粒子基底材としての血清アルブミン及び標的指向物質としてのポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子であって、
前記抗癌ナノ粒子の中心部は抗癌剤からなり、表皮部は血清アルブミン及びポルフィリン系化合物からなる標的指向増幅型抗癌ナノ粒子。

【請求項2】

前記血清アルブミンは哺乳動物由来の血清アルブミンで、抗癌ナノ粒子を安定化させ、透過残留性向上（ＥＰＲ）現象による癌標的指向性を有する請求項１に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子。

【請求項3】

前記ポルフィリン系化合物は癌細胞に過発現している受容体を通じて癌組織に選択的に蓄積される請求項１に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子。

【請求項4】

前記ポルフィリン系化合物は、プロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＩＸ）、ヘム（ｈｅｍｅ）、ヘミン（ｈｅｍｉｎ）、亜鉛プロトポルフィリン（Ｚｉｎｃ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、マグネシウムプロトポルフィリン（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ベンゾポルフィリン（ｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、メタロポルフィリン（ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎｓ）、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、バクテリオクロリン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ）、フタロシアニン（ｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、ナフタロシアニン（ｎａｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）及びこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上である請求項１に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子。

【請求項5】

前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子は、前記ポルフィリン系化合物の活性化の際、透過残留性向上（ＥＰＲ）現象によって標的指向性が増幅する請求項１に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子。

【請求項6】

前記抗癌剤は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ドキソフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキソフルリジン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、テガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ベロテカン（ｂｅｌｏｔｅｃａｎ）、アナステロゾール（ａｎａｓｔｅｒｏｚｏｌｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、グリーベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、スプレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、セドロール（ｃｅｄｒｏｌ）及びこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上である請求項１に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子。

【請求項7】

抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法であって、
（ａ）血清アルブミン溶液に抗癌剤溶液を添加し、混合して混合液を製造する段階；
（ｂ）前記混合液に有機溶媒を滴加しながら混合させることで、抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液を製造する段階；
（ｃ）抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液に温度変化を加えて再配置を誘導することで、中心部には抗癌剤、表皮部には血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子を製造する段階；
（ｄ）前記中心部には抗癌剤、前記表皮部には血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子にポルフィリン系化合物溶液を添加し、混合反応させることで、非共有的に結合された血清アルブミン−ポルフィリン複合体が抗癌剤を封入する標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を製造する段階；
（ｅ）前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を濾過し、遠心分離した後、沈澱した標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を回収する段階；及び
（ｆ）前記回収された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を凍結乾燥させることで、構造的に安定化した標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を得る段階を含む標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法。

【請求項8】

前記血清アルブミン１００重量部に対し、前記抗癌剤は１０〜３００重量部、前記ポルフィリン系化合物は０．０１〜１０重量部を添加する請求項７に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法。

【請求項9】

前記温度変化を加えて再配置を誘導する段階は、抗癌剤が疎水性の場合は加熱し、抗癌剤が親水性の場合は冷却させる請求項７に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法。

【請求項10】

前記加熱は、４０〜６０℃の温度、前記冷却は−１０〜−７０℃の温度で行う請求項９に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法。

【請求項11】

濾過前に標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を超音波で処理して標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の粒径を調節する段階をさらに含む請求項７に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法。

【請求項12】

前記抗癌剤は、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ドキソフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキソフルリジン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、テガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ベロテカン（ｂｅｌｏｔｅｃａｎ）、アナステロゾール（ａｎａｓｔｅｒｏｚｏｌｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、グリーベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、スプレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、セドロール（ｃｅｄｒｏｌ）及びこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上である請求項７に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法。

【請求項13】

前記ポルフィリン系化合物は、プロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＩＸ）、ヘム（ｈｅｍｅ）、ヘミン（ｈｅｍｉｎ）、亜鉛プロトポルフィリン（Ｚｉｎｃ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、マグネシウムプロトポルフィリン（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ベンゾポルフィリン（ｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、メタロポルフィリン（ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎｓ）、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、バクテリオクロリン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ）、フタロシアニン（ｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、ナフタロシアニン（ｎａｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）及びこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上である請求項７に記載の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法。

【請求項14】

請求項１及び３〜６のいずれか一項の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を含む抗癌医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は癌組織に対する標的指向性が向上した抗癌ナノ粒子及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は現代人が最も怖がっている疾患で、効果的でありながらも副作用が少ない治療方法がなく、完治が難しい。癌の発病の際、効果的な治療が易しくないため、手術、放射線科光治療、及び抗癌剤薬物療法が単独でまたは複合的に用いられている。
薬物療法に使われる抗癌剤は、動物実験において非常に優れた癌細胞死滅能を持つ抗癌物質であるが、実際の臨床では癌を完治させることができない。それは薬物の低い癌組織伝達率／標的化率（ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）のためである。抗癌剤は、体内への投与の際、血液内で循環しながら、体内を構成する細胞、血管、基質などの正常組織に主に大部分の薬物が留まり、極一部だけ癌組織まで伝達される。このように癌組織への低い抗癌剤伝達率のため、癌組織での抗癌剤濃度が癌細胞を効果的に殺すには難しい水準であるが、正常組織に伝達された抗癌剤量は多すぎる。それで、抗癌剤を癌患者に投与すれば、実際に大部分正常組織に伝達されて正常細胞を殺すことになるので、骨髓機能の低下、胃膓障害、脱毛症、免疫機能の低下などの多様な副作用が現れることになる。抗癌剤の低い標的化率は結局正常組織での非特異的毒性と多剤耐性（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）につながり、癌の完治が非常に困難となる。

【0003】

したがって、抗癌剤の低い薬効及び副作用の問題を解決することができる効果的な方法は、抗癌剤の癌組織への伝達率は高め、正常組織への伝達率は低めることである。このために、癌組織にもっと選択的に抗癌剤を伝達する標的指向（ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）法に関する多様な基盤研究が進められてきた。
最も代表的な標的指向法は、癌組織の透過残留性向上（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ， ＥＰＲ）現象を用いる方法である（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ，２０００，６５：２７１−２８４）。癌組織は正常組織に比べて血管細胞間隙が大きく、１０〜１，０００ｎｍサイズの内皮細孔（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｏｒｅｓ）が血管組織によく発達されている。この内皮細孔を通過することができるナノ粒子のサイズに抗癌剤を製造して投与すれば、このナノ粒子抗癌剤は内皮細孔が発達することができなかった正常組織によく抜け出ることができないが癌組織には容易に抜け出る。また、癌組織ではリンパ管が退化しているため、血液から癌組織に抜け出たナノ粒子が長く残留し、結局癌組織に選択的に蓄積される。このような現象を癌組織の透過残留性向上現象といい、ＥＰＲ現象を用いた抗癌ナノ粒子伝達法を受動的標的指向と言う（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，２０１１，６３：１３６−１５１；Ｄａｎｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ，２０１０，１４８：１３５−１４６）。

【0004】

受動的標的指向ナノ粒子の中で、臨床試験によって商用化に成功した最初の事例はＣｅｌｇｅｎｅ社の転移性乳房癌治療剤アブラキサンである（アメリカ特許登録第６５０６４０５号、同第６５３７５７９号）。アブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））は細胞分裂阻害抗癌剤であるパクリタキセルを血清アルブミンに結合させたナノ粒子である。アブラキサンは受動的標的指向を目的で製作されたので、抗癌剤であるパクリタキセルとナノ粒子基底材である血清アルブミンの二種の物質のみで抗癌ナノ粒子が構成されている。アブラキサンは、癌組織に直接標的指向性を付与することができる標的指向物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）なしに、単に癌組織の透過残留性向上（ＥＰＲ）によって受動的に抗癌剤を伝達する。それで、アブラキサンの癌伝達率／標的化率はパクリタキセルに比べて最大１．５〜３倍程度改善されたが、正常組織に影響を及ぼす副作用の問題を解決するのには依然として低い水準である（Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００６， １２：１３１７−１３２４）。

【0005】

理論的に最も理想的な抗癌ナノ粒子は、癌組織にだけ抗癌ナノ粒子が正確に伝達されるようにするナノ粒子である。このためには、抗癌ナノ粒子の表面に標的指向物質が付着されているとともにナノ粒子が構造的に安定化して、構造的安全性によって受動的標的指向性が可能であるとともに標的指向物質による能動的標的指向性が可能な抗癌ナノ粒子でなければならないであろう。このような理由で、世界各国の研究チームでは標的指向物質を抗癌ナノ粒子の表面に付着させた多様な種類のナノ粒子を開発したが（Ａ． Ｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｉｍａｇｉｎｇ， Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２． Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｄ Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ｐ９〜２９， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２０１２）、次のような理由で“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”の商業化には失敗した。

【0006】

抗癌剤と基底材の２種成分のみで構成された受動的標的指向抗癌ナノ粒子を製作するためには、封入しようとする抗癌剤の物質的特性に相応な基底材さえ選択すれば、共有結合なしに比較的容易に、２種の物質を単一ナノ粒子に構成することができる。しかし、抗癌剤、基底材、標的指向物質の３種の相異なる化合物が完璧に調和して非共有結合のみで単一抗癌ナノ粒子を構成することは実際に非常に困難である。よって、抗癌剤、基底材及び標的指向物質が結合された抗癌ナノ粒子を構成するためには、標的指向物質及び抗癌剤のいずれか一つを基底材に、あるいは相互間に共有結合で結合させた後、抗癌ナノ粒子を製作した。しかし、抗癌ナノ粒子の構成過程で導入された共有結合は次のような問題点を引き起こす。１）共有結合によって新に形成された物質は元の共有結合とは違う新物質が生成することである。例えば、水素と酸素が共有結合すれば、水素と酸素の特性が変形して水が生成されることが代表的な例である。このような共有結合の特性のため、ナノ粒子の構成成分間の共有結合（例えば、ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の際、新規の化合物（ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ， ＮＣＥ）の生成を避けることができない。共有結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）過程で形成された新規化合物は新しい物理化学的特性を持つため、以前になかった毒性が新しく現れる可能性が非常に高い。２）抗癌剤を共有結合させれば、抗癌剤の化学構造の変形によって抗癌効能が低くなる。３）標的指向物質を共有結合させれば、標的指向物質の化学構造の変形によって期待した標的指向性が低くなる。

【0007】

“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”が商業化に失敗したことの他の理由は、標的指向性を向上させるためにナノ粒子に付着させた標的指向物質がむしろナノ粒子の構造的安全性及びナノ粒子の受動的標的指向能力を低減させ、窮極に抗癌ナノ粒子の標的指向能力を深刻に減少させるからである。
“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”が商業化に失敗したことのさらに他の理由は、抗癌剤と基底材に加えて標的指向物質までの３種の相異なる化合物にｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎのような共有結合を導入しても単一ナノ粒子に構成することが非常に難しいからである。このような理由のために、金属などの非生物学的物質を基底材として活用し、この基底材に標的指向物質又は抗癌剤を付着させたナノ粒子も多数開発された（アメリカ特許登録第７３６４９１９号、同第７８２９３５０号、同第８２３６２８４号、同第８２４６９９５号、ヨーロッパ特許第１６７１６２５号、国際特許ＷＯ／２００２／０９８３６４、同ＷＯ／２０１２／１０６７１３、同ＷＯ／２０１２／０７５０８７及びアメリカ特許公開第２０１２００５２００６号）。しかし、これらの非生物学的物質は実験動物には大きな毒性なしに良好な抗癌効能を現したが、人では深刻な毒性を誘発して商業化に成功することができなかった。

【0008】

標的指向物質をナノ粒子に共有結合させればどのくらいの否定的な影響があるかは、ポルフィリン系の物質を血清アルブミンに共有結合させた抗癌ナノ粒子の例から分かる（Ｃｈａｎｇｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２０１２， ２９：７９５〜８０５）。このナノ粒子の製作に使用された血清アルブミンは無害であるとともにいろいろの多様な有機化学物質と非共有結合で結合する能力があるので、抗癌ナノ粒子を製作するのに理想的な基底材であり、ポルフィリンもヘムの前駆物質で、大部分の癌細胞に対して標的指向性を有する代表的な標的指向物質の一つである。
したがって、ポルフィリンをアルブミンに共有結合させたナノ粒子の場合、抗癌剤を血清アルブミンのみで封入した受動的抗癌ナノ粒子に比べて抗癌剤伝達効率がずっと改善されなければならないが、前述した理由で、実際にはポルフィリンを結合させる前に比べて抗癌効能がほとんど改善されなかった。すなわち、ポルフィリンを血清アルブミンに共有結合させた後、抗癌剤を封入した抗癌ナノ粒子は、癌組織に抗癌剤を伝達する効率が、抗癌剤を単に血清アルブミンに封入したアブラキサンよりずっと良くなかった（Ｃｈａｎｇｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２０１２， ２９：７９５〜８０５；Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６；１２：１３１７〜１３２４）。

【0009】

前述したように、標的指向物質が抗癌ナノ粒子の表面に共有結合によって付着した抗癌ナノ粒子は、受動的標的指向抗癌ナノ粒子よりずっと理想的なナノ粒子とすることができるが、“標的指向物質付着ナノ粒子”の構成過程における問題のため、実際に常用化したことはない。
これまで常用化した抗癌ナノ粒子はアブラキサン以外にもＤｏｘｉｌ、Ｍｙｏｃｅｔ、Ｄａｕｎｏｘｏｍｅのようにいずれも基底材と抗癌剤が非共有結合だけで連結された受動的標的指向抗癌ナノ粒子である。したがって、無毒性の基底材を用い、非共有結合によって標的指向物質が抗癌ナノ粒子の表面に付着し、同時に構造的に安定した“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”の開発が切実に要求されている。

【0010】

本発明者らは前記問題点を解決するために鋭意検討した結果、無毒性基底材として血清アルブミンを用いてナノ粒子を構成し、ポルフィリン系化合物を標的指向物質として活用して抗癌ナノ粒子の表面に非共有結合で付着させ、構造的に安定化させる段階を経れば、抗癌剤及びポルフィリン系化合物の化学構造の変化が発生しないので、１）抗癌剤の抗癌効能がそのまま維持され；２）ナノ粒子の表面に付着した標的指向物質の固有な標的指向性も保存されて能動的標的指向性が維持され；３）構造的に安定化したナノ粒子によって受動的標的指向性を有する標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を製造することができるということを確認して本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

理想的な抗癌ナノ粒子は、能動的標的指向性を付与することができる標的指向物質が抗癌ナノ粒子の表面に付着して能動的標的指向性があり、同時に抗癌ナノ粒子が構造的に安定化して受動的標的指向性を有するので、能動的及び受動的標的指向の組合せによって癌組織にだけ抗癌ナノ粒子が正確に伝達される。しかし、既存に製作された“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”は最も理想的な抗癌ナノ粒子になる可能性にもかかわらず、本発明の背景技術で記述したさまざまな限界点を克服しなかったので、いまだに常用化することができない。
したがって、本発明者らは前述した問題点を解決するために、無毒性の基底材を用い、非共有結合だけで標的指向物質が抗癌ナノ粒子の表面に付着し、同時に構造的に安定した抗癌ナノ粒子を発明しようとした。
また、受動的標的指向性と能動的標的指向性に加え、標的指向性を格段に増幅させる機能を追加させることで、末期の癌も完治させるほどにすぐれた抗癌効能を有する革新的概念の“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を発明しようとした。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は、抗癌剤、ナノ粒子基底材としての血清アルブミン及び標的指向物質としてのポルフィリン系化合物が非共有的に結合された、標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を提供する。

【0013】

また、本発明は、（ａ）血清アルブミン溶液に抗癌剤溶液を添加し、混合して混合液を製造する段階；（ｂ）前記混合液に有機溶媒を滴加しながら混合させることで、抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液を製造する段階；（ｃ）抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液に温度変化を加えて再配置を誘導することで、中心部には抗癌剤、表皮部には血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子を製造する段階；（ｄ）抗癌剤及び血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子にポルフィリン系化合物溶液を添加し、コートすることで、抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を製造する段階；（ｅ）前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を濾過し、遠心分離した後、沈澱した標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を回収する段階；及び（ｆ）前記回収された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を凍結乾燥させることで、構造的に安定化した標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を得る段階を含む、抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法を提供する。

【0014】

本発明は、前記製造方法によって製造され、抗癌剤、ナノ粒子基底材としての血清アルブミン及び標的指向物質としてのポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を提供する。
本発明は、前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を含む抗癌医薬組成物を提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明による“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は、抗癌剤を無毒性の血清アルブミンに封入した後、ナノ粒子の表面をポルフィリン系の物質で非共有結合でコートして製造したものであるため、新規化合物の生成及びナノ粒子の各構成物質の変形がない。
したがって、本発明の“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は、１）抗癌ナノ粒子でよく現れる毒性副作用を予防することができ；２）抗癌剤の化学構造の変更がなくて抗癌剤の固有の特性及び機能が維持されるため、抗癌剤の薬効減少を防ぐことができ；３）標的指向物質であるポルフィリン系化合物が抗癌ナノ粒子の表面に非共有結合だけで付着してポルフィリン固有の能動的標的指向性がそのまま維持され；４）構造的に安定化して癌組織に対する受動的標的指向性があるため、受動的及び能動的標的指向の組合せによって癌伝達率／標的化率が最大限に発揮させる効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の実施例１によって製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の透過電子燎微鏡（ＴＥＭ）の高配率観察写真である（Ａ：パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｂ：セドロール封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子）。

【図2】本発明の実施例１によって製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を低倍率原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）と透過電子燎微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果である（Ａ：原子間力燎微鏡写真、Ｂ：透過電子燎微鏡写真）。

【図3】本発明の実施例２によって製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の透過電子燎微鏡（ＴＥＭ）の高配率観察写真である（Ａ：ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｂ：オキサリプラチン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｃ：ゲムシタビン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子）。

【図4】本発明の実施例１及び２によって製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を水溶液化させ、１２時間及び６０時間後の構造的安全性を確認した写真である（Ａ：パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｂ：ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｃ：オキサリプラチン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｄ：ゲムシタビン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子）。

【図5】実施例１によって製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の正常組織及び癌組織に対する薬物伝達率を示したグラフである（灰色バー：Ｃｅｌｇｅｎｅ社のＡｂｒａｘａｎｅ、濃い灰色バー：パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、黒色バー：ＬＥＤ＋パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子）。

【図6】本発明の実施例１によって製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の毒性を評価したグラフである（Ａ：正常マウスにおけるパクリタキセル（遊離薬物）のＬＤ５０測定グラフ、Ｂ：正常マウスにおける “パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”のＬＤ５０測定グラフ、Ｃ：癌が誘導されたマウスにおける“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”のＬＤ５０測定グラフ）。

【図7】本発明の実施例１によって製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”によって増幅されたＥＰＲ効果を確認するための写真及び吸光度グラフである。

【図8】本発明の実施例１によって製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の初期癌治療効能確認のためのマウスモデルの写真である。

【図9】本発明の実施例１によって製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を投与し、電磁気波でポルフィリン活性化段階を付け加えるときの末期癌治療効能の確認のためのマウスモデルの写真である。

【図10】本発明の実施例２によって製造された“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を投与し、電磁気波でポルフィリン活性化段階を付け加えるときの時末期癌治療効能確認のためのマウスモデルの写真である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

抗癌ナノ粒子の表面に標的指向物質が付着している抗癌ナノ粒子は理想的な抗癌ナノ粒子であると推定してきたが、実際に現在まで開発された標的指向物質が抗癌ナノ粒子の表面に付着されたすべての抗癌ナノ粒子の場合、抗癌効能に問題があるとか毒性問題のため、商用化に成功した場合がなかった。
本発明者らは既存の“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”が期待に達しない理由が既存の“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”の製作過程で導入した共有結合である事実を認知し、非共有結合だけで“標的指向物質付着抗癌ナノ粒子”を製造する場合、標的指向物質と抗癌剤の固有な化学的機能がそのまま維持され、癌組織に抗癌剤を伝達する効率が革新的に改善できるという事実を確認しようとした。
そこで、本発明では、１）無毒性の標的指向物質としてポルフィリン系化合物を、ナノ粒子基底材として血清アルブミンを選択し；２）標的指向物質の固有な癌標的指向性が維持されるように標的指向物質を抗癌ナノ粒子の表皮（ｓｈｅｌｌ）に付着させ；３）表皮で包まれた中心（ｃｏｒｅ）に抗癌剤を封入した後；４）抗癌剤と標的指向物質の固有な機能がそのまま維持されるように抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を製造し、製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は抗癌剤及びポルフィリン系化合物の化学構造の変化が発生しないので、１）抗癌剤の抗癌効能がそのまま維持され；２）ナノ粒子の表面に付着した標的指向物質の固有な標的指向性も保存されて能動的標的指向性が維持され；３）構造的に安定化したナノ粒子によって受動的標的指向性を有し；４）“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の投与後、電磁気波を照らすと、抗癌ナノ粒子の標的指向性が増幅して抗癌剤の癌伝達率が革新的に向上することを確認することができた。

【0018】

すなわち、本発明の一実施例においては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液に、パクリタキセル（）をエタノールのような有機溶媒に溶かした溶液を添加して混合液を製造した後、有機溶媒を滴加しながら混合することで、非共有的に結合されたパクリタキセル−ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ナノ凝集粒子を形成し、この溶液に温度変化過程を与えて、抗癌剤は中心部に、ヒト血清アルブミンは周辺部に位置するようにナノ粒子構成成分を再配置させ、このナノ粒子をプロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）溶液でコートすることで、パクリタキセル；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びプロトポルフィリンが非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を製造し、これを濾過して遠心分離させた後、凍結乾燥過程によって構造的に安定化した“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を製造した。そして、製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”が構造的に安定的で、癌組織に対する標的指向性が著しく増幅することから、初期癌はもちろんのこと、末期癌においも抗癌効果が非常に優れることを確認した。

【0019】

したがって、本発明は、一観点において、抗癌剤、ナノ粒子基底材としての血清アルブミン及び標的指向物質としてのポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子に関するものである。
前記抗癌剤、ナノ粒子基底材としての血清アルブミン及び標的指向物質としてのポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子は、抗癌ナノ粒子の中心部は抗癌剤で構成され、表皮部は血清アルブミン及びポルフィリン系化合物で構成されたことを特徴とする。
前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の中心は抗癌剤の構造及び特性の変化がないように封入された構造のもので、特に血清アルブミンまたはポルフィリン系化合物との共有結合なしに封入されたことを特徴とする。
そして、前記標的指向物質であるポルフィリン系化合物は抗癌ナノ粒子の表皮に非共有結合で付着して、標的指向物質の固有な癌標的指向性が維持されることを特徴とする。

【0020】

前記血清アルブミンは抗癌ナノ粒子を安定化させて、透過残留性向上（ＥＰＲ）現象による癌標的指向性を有するもので、特に制限されないが、哺乳動物由来の血清アルブミンであることが好ましい。
前記血清アルブミンは親水性で水に非常によく溶けるので、溶液状態で自ら結合して重合体を形成しないが、血清アルブミン溶液にポルフィリン系化合物を添加すれば、溶液状態の血清アルブミンにポルフィリン系化合物が結合し、ポルフィリン系化合物と血清アルブミンが互いに非共有結合を維持しながら重合体を形成することを特徴とする。

【0021】

本発明において、抗癌剤としては癌細胞に対して薬理効果を有するいずれの抗癌剤も用いることができ、タキセン（ｔａｘｅｎｅ）、抗代謝化剤（ａｎｔｉｍｅｔｂｏｌｉｔｅ ａｇｅｎｔｓ）、プラチナ化剤（ｐｌａｔｉｎｕｍ ａｇｅｎｔｓ）、カルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、アンスタサイクリン抗生剤（ａｎｔｈｔａｃｙｃｌｉｎｅａｎｔｉ ｂｉｏｔｉｃｓ）、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、プロテアソーム阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、マクロライド（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）、及びトポイソメラーゼ阻害剤（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）からなる群から選択されたいずれか１種が好ましいが、これに限定されない。
具体的な例としては、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、バルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ドキソフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキソフルリジン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、テガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ベロテカン（ｂｅｌｏｔｅｃａｎ）、アナステロゾール（ａｎａｓｔｅｒｏｚｏｌｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、グリーベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、スプレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、メクロレタミン（ｍｅｃｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、プレドニソン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、アスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）、サリチルレート（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅｓ）、イブブロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）、フェノプロフェン（ｆｅｎｏｐｒｏｆｅｎ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、フェニルブタゾン（ｐｈｅｎｙｌｂｕｔａｚｏｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニソロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、コーチゾン（ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、セドロール（ｃｅｒｄｒｏｌ）及びこれらそれぞれの誘導体からなる群から選択されたものが好ましいが、これらに限定されない。

【0022】

本発明において、前記ポルフィリン系化合物は癌細胞にあまり発現している受容体を通じて癌組織に選択的に蓄積されるもので、プロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＩＸ）、ヘム（ｈｅｍｅ）、ヘミン（ｈｅｍｉｎ）、亜鉛プロトポルフィリン（Ｚｉｎｃ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、マグネシウムプロトポルフィリン（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ヘマトポルフィリン（ｈｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ベンゾポルフィリン（ｂｅｎｚｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、メタロポルフィリン（ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、５−アミノレブリン酸（５−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃａｃｉｄ）、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎｓ）、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、プルプリン（ｐｕｒｐｕｒｉｎｓ）、バクテリオクロリン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ）、フタロシアニン（ｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、ナフタロシアニン（ｎａｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）及びこれらの誘導体を例示することができるが、これらに限定されない。

【0023】

前記ポルフィリン系化合物は血管生成が活発な癌組織に選択性を持ち、癌組織に過発現している低密度タンパク質（ＬＤＬ）受容体との作用で癌細胞中に入り、癌組織に選択的に蓄積されるので、抗癌ナノ粒子に標的指向性を付与することができる。
また、前記ポルフィリン系化合物は、ナノ粒子基底材である血清アルブミンと非共有的に結合してナノ粒子表皮を構成してナノ粒子を構造的に安定化させることで、癌組織の透過残留性向上（ＥＰＲ）現象による受動的標的指向性を付与することができる。
本発明による抗癌剤、ナノ粒子基底材としての血清アルブミン及び標的指向物質としてのポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子はポルフィリン系化合物と血清アルブミンが非共有的に結合するため、ポルフィリン系化合物の固有な構造及び特性の変形がなく、癌組織に対する能動的標的指向性を持ち、適切な電磁気波の処理による活性化の際、透過残留性向上（ＥＰＲ）と標的指向性が追加的に増幅される特徴がある。

【0024】

本発明は、他の観点において、（ａ）血清アルブミン溶液に抗癌剤溶液を添加し、混合して混合液を製造する段階；（ｂ）前記混合液に有機溶媒を滴加しながら混合させることで、抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液を製造する段階；（ｃ）抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液に温度変化を加えて再配置を誘導することで、中心部には抗癌剤、表皮部には血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子を製造する段階；（ｄ）抗癌剤及び血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子にポルフィリン系化合物溶液を添加し、コートすることで、抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を製造する段階；（ｅ）前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を濾過して、遠心分離した後、沈澱した標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を回収する段階；及び（ｆ）前記回収された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を凍結乾燥させることで、構造的に安定化した標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を得る段階を含む、抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の製造方法に関するものである。

【0025】

本発明において、前記血清アルブミン１００重量部に対し、前記抗癌剤は１０〜３００重量部、前記ポルフィリン系化合物は０．０１〜１０重量部を添加することを特徴とする。
前記血清アルブミン、抗癌剤及びポルフィリン系化合物の添加比が前記範囲を外れる場合にはナノ粒子のサイズがあまり大きくなるとか小さくなる問題が発生することができる。
前記抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物は、ＮａＣｌ溶液、水、エタノール、メタノール、アセトン、ジクロロメタンなどの有機または無機溶媒を単独で使うとかこれらの混合溶媒を溶液化して使うことができ、溶液の濃度は特に制限されるものではないが、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
前記血清アルブミン溶液に抗癌剤溶液を添加し、混合して混合液を製造する段階は、ｐＨ５．０〜９．０、抗癌剤が疎水性の場合には常温、親水性の場合には０℃〜常温で行うことが好ましい。前記ｐＨ及び温度条件の範囲を外れる場合にはナノ粒子のサイズ調節がうまくできない問題が発生することができる。
前記混合液に有機溶媒を滴加しながら混合させることで、抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液を製造する段階において、有機溶媒は抗癌剤と血清アルブミンの凝集を誘導するためのもので、特に制限されないが、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどを例示することができ、前記有機溶媒は０．１〜０．９ｍｌ／ｍｉｎの速度で６〜１３分間滴加することが好ましい。

【0026】

本発明において、前記抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液に温度変化を加えて再配置を誘導することで、中心部には抗癌剤、表皮部には血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子を製造する段階は、抗癌剤が疎水性の場合は加熱し、抗癌剤が親水性の場合は冷却させることを特徴とする。
すなわち、パクリタキセルのような疎水性抗癌剤を封入する場合は、４０〜６０℃の熱を加えて有機溶媒を蒸発させることで、疎水性である抗癌剤をナノ粒子の中心部に互いに堅たく結合させ、血清アルブミンをナノ粒子の表面から突出させることができる。
一方、ドキソルビシンのような親水性抗癌剤を封入する場合は、抗癌剤及び血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液に有機溶媒が含有されているので、親水性抗癌剤は溶媒親和度が低下するため、少ないがある程度に互いに結晶をなす傾向がある。よって、−１０℃〜−７０℃の温度に冷却すれば、抗癌剤は結晶化して堅くなり、物理化学的性質が変わり、血清アルブミンが外部に結合することによってナノ粒子の表面から突出させることができる。
前記加熱温度が４０℃未満の場合には有機溶媒の蒸発が十分でなく、６０℃を超える場合には変性が発生し、中心部には抗癌剤、表皮部には血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子を製造することができない。前記冷却温度が−１０℃以上の場合には抗癌剤及びアルブミンの再配置効果が低く、−７０℃未満の場合には特別な実益がない。

【0027】

本発明において、抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液は、常温で前記抗癌剤及び血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子にポルフィリン系化合物溶液を添加し、掻きまぜながらコートすることで、製造することができる。
抗癌剤、血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を濾過し、遠心分離させれば、標的指向増幅型抗癌ナノ粒子が沈澱する。

【0028】

本発明では、標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の生成効率を高めるために、濾過前に標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を超音波で処理して、互いに縺れている標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を分離し、標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の粒径を調節する段階をさらに含むことを特徴とする。
すなわち、標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を超音波で処理すれば、抗癌ナノ粒子が粉砕されて分散される。前記超音波は１０〜３０ＫＨｚで３０秒の間隔で２分以上処理することが好ましい。超音波による粉砕段階を経た前記溶液は０．４５μｍのフィルターで濾過した後、遠心分離法で回収する。
前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子は、体内への薬物伝達効果に優れるように、１０〜１，０００ｎｍの平均粒径、好ましくは５０〜４００ｎｍの平均粒径を持つように調節することが好ましい。

【0029】

最後に、回収された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を凍結乾燥させることで、構造的に安定化させることができる。
すなわち、ポルフィリン系化合物は溶液状態の血清アルブミンに結合する特性を持ち、単一血清アルブミン分子に多数のポルフィリン系化合物が結合することができるので、水溶液状態で血清アルブミンとポルフィリン物質を結合させた後、凍結乾燥による水分除去過程を経ると、ポルフィリンと血清アルブミンの間が非共有結合を維持しながら重合体を形成した後、この重合体が安定に維持できる。

【0030】

凍結乾燥されて構造的に安定化した標的指向増幅型抗癌ナノ粒子は、使用直前に０．９％の生理食塩水に溶解して使用することができる。
本発明は、さらに他の観点において、前記製造方法によって製造された、抗癌剤、ナノ粒子基底材としての血清アルブミン及び標的指向物質としてのポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子に関するものである。
本発明は、さらに他の観点において、前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を含む抗癌医薬組成物に関するものである。
前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子またはこれを含む抗癌医薬組成物の投与量及び投与方法は含有された抗癌剤の公知の文献によって容易に決定して使うことができる。
前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子またはこれを含む抗癌医薬組成物を用いた抗癌治療は、ポルフィリン系化合物を活性化させる電磁気波処理過程のように用いることができる。前記電磁気波は電場と磁場が時間によって変わるときに発生する波動で、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線、マイクロ波、電波などを例示することができ、可視光線としてはＬＥＤ人工光源を用いることが好ましい。

【0031】

本発明において、前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子はポルフィリン系化合物が非共有的に結合されているから、ポルフィリン系化合物の固有な構造及び特性が維持されるので、適切な電磁気波の処理による活性化の際、透過残留性向上（ＥＰＲ）と標的指向性がさらに増幅されることができる。
すなわち、前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子またはこれを含む抗癌医薬組成物を患者に投与した後、電磁気波で処理すれば、癌組織に蓄積されたポルフィリン系化合物がエネルギーを吸収して酸素に転移させることによって活性酸素が生成し、これは癌組織での透過残留性向上（ＥＰＲ）の増幅、抗癌剤の癌組織伝達率／標的化率の向上につながり、もっと効果的な抗癌治療が可能になる。
また、前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子またはこれを含む抗癌医薬組成物は電磁気波を含む治療を先に受けた患者にも投与することもでき、この場合にも前述したような抗癌治療効果を得ることができる。
前記標的指向増幅型抗癌ナノ粒子またはこれを含む抗癌医薬組成物の投与に関連した電磁気波治療法は公知の文献によって容易に決定して使うことができる。

【実施例】

【0032】

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明しようとする。これら実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものに解釈されないことは当該分野での通常の知識を持った者に明らかであろう。

【0033】

実施例１：疎水性抗癌剤を封入した“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の製造
疎水性抗癌剤、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びポルフィリンが非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を下記の方法で製造した。
ＨＳＡ（ＬＥＥ ＢＩＯＳＯＬＵＴＩＯＮＳ， ＩＮＣ， ＵＳＡ）８８ｍｇを１０ｍＭのＮａＣｌ溶液１０ｍＬに入れ、常温にて磁気攪拌機で徐々に掻きまぜながら溶かした後、１ＮのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．０〜８．５に調整した。ついで、パクリタキセル（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＵＳＡ）１０ｍｇを純粋エタノール１ｍＬに添加した後、磁気攪拌機が回転している１０ｍＬのＨＳＡ溶液に０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度で落として混合した。
ヒト血清アルブミンとパクリタキセルが混合した前記溶液を４時間以上常温で掻きまぜた後、この溶液にエタノールを０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度でナノ粒子が生成するまで落としながら混合した。およそ４ｍＬのエタノールが添加されれば、パクリタキセル−ヒト血清アルブミンナノ凝集粒子が生成しながら透明な溶液が不透明のやや濁っている色に変わった。
このナノ凝集粒子溶液は、回転蒸発濃縮機で４５℃の熱を加えながらエタノールを徐々に蒸発させることで、自然に疎水性抗癌剤がナノ粒子の中心部に堅たく結合し、アルブミンはナノ粒子の表面から突出するようにした。
パクリタキセル−ヒト血清アルブミンナノ粒子が形成された後、この溶液に１ｍｇのプロトポルフィリンＩＸ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）が０．５ｍＬの純粋エタノールに溶けているプロトポルフィリンＩＸ溶液を添加して、パクリタキセル−ヒト血清アルブミンナノ粒子にプロトポルフィリンＩＸをコートすることで、パクリタキセル、ヒト血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を製造した。

【0034】

次いで、パクリタキセル−ヒト血清アルブミン−プロトポルフィリンＩＸが非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を２０ＫＨｚの超音波で３０秒の間隔で２分以上処理してナノ粒子を粉碎した後、このナノ粒子分散液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、５０，０００ｇで２０分間遠心分離した。
遠心分離法によって沈澱したナノ粒子は１ｍＬの１０ｍＭ ＮａＣｌ溶液に溶かした後にすぐ凍結乾燥してナノ粒子の構造的安定性を強化した。凍結乾燥された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”はその状態で保管してから、必要時に０．９％生理食塩水に溶かして使った。“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”はさび色であった。

【0035】

前記過程によって製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は原子間力燎微鏡（ＡＦＭ）あるいはＴＥＭ電子燎微鏡で粒径を分析して、“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の形態的特性を観察した。
また、パクリタキセル以外にも、疎水性を有する抗癌剤も基本的に前述した方法において各抗癌剤のみを取り替えて適用することができる。本発明では、セドロール（ｃｅｄｒｏｌ）を使って同一方法で“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を製造した。表１は疎水性抗癌剤を封入した“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の平均粒径を示し、図１は疎水性抗癌剤を封入した“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の高配率透過電子燎微鏡（ＴＥＭ）観察写真、図２は低倍率原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）及び透過電子燎微鏡（ＴＥＭ）の観察写真である。

【0036】

【表1】

【0037】

実施例２：親水性抗癌剤を封入した“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の製造
親水性抗癌剤、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びポルフィリンが非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を下記の方法で製造した。
ＨＳＡ（ＬＥＥ ＢＩＯＳＯＬＵＴＩＯＮＳ， ＩＮＣ， ＵＳＡ）８８ｍｇとドキソルビシン（ＣＨＥＭＩＥＬＩＶＡ， ＣＨＩＮＡ）２０ｍｇを１０ｍＭのＮａＣｌ溶液１０ｍＬに一緒に入れ、常温で磁気攪拌機で徐々に掻きまぜながら溶かした後、１ＮのＮａＯＨ溶液でｐＨを８．０〜８．５に調整した。
次いで、磁気攪拌機が回転している前記ヒト血清アルブミン−ドキソルビシン溶液の温度を４℃に冷却し、１時間の間に磁気攪拌機で混合した後、４℃で磁気攪拌機でこの溶液を掻きまぜながらエタノールを０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度でナノ凝集粒子が生成するまで落としながら混合した。およそ１０ｍＬのエタノールが添加されれば、ドキソルビシン−ヒト血清アルブミンナノ凝集粒子生成し、透明な溶液が不透明のやや濁っている色に変わった。
ドキソルビシン及びヒト血清アルブミンが凝集したナノ粒子溶液を−２０℃に凍結させた後、氷片上で２時間以上放置し、徐々に溶かすことで、ドキソルビシン結晶はナノ粒子の中心部に、ヒト血清アルブミンはナノ粒子の周辺部に位置するようにした。
ドキソルビシン及びヒト血清アルブミンが非共有的に結合されたナノ粒子が形成された後、この溶液に１ｍｇプロトポルフィリンＩＸ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）が０．５ｍＬ純粋エタノールに溶けているプロトポルフィリンＩＸ溶液を添加して、ドキソルビシン−ヒト血清アルブミンナノ粒子にプロトポルフィリンＩＸをコートすることで、ドキソルビシン、ヒト血清アルブミン及びポルフィリン系化合物が非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を製造した。

【0038】

ドキソルビシン−ヒト血清アルブミン−プロトポルフィリンＩＸが非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子溶液を２０ＫＨｚの超音波で３０秒の間隔で２分以上処理してナノ粒子を粉碎し、このナノ粒子分散液を０．４５μｍのフィルターで濾過した後、５０，０００ｇで２０分間遠心分離した。
遠心分離法によって沈澱したナノ粒子は１ｍＬの１０ｍ ＭＮａＣｌ溶液に溶かした後にすぐ凍結乾燥してナノ粒子の構造的安定性を強化した。凍結乾燥された“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”はその状態で保管してから、必要時に０．９％生理食塩水に溶かして使った。“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”はさび色であった。
前記過程によって製造された“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は原子間力燎微鏡（ＡＦＭ）あるいはＴＥＭ電子燎微鏡で粒径を分析して、“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の形態的特性を観察した。
また、ドキソルビシン以外にも、親水性を持つ抗癌剤の中でオキサリプラチン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）及びゲムシタビンから同一方法で標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を製造し、粒径を下記表２に示した。
図３は親水性抗癌剤（ドキソルビシン、オキサリプラチン及びゲムシタビン）、ヒト血清アルブミンナノ粒子及びプロトポルフィリンＩＸが非共有的に結合された標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の透過電子燎微鏡（ＴＥＭ）観察写真である。

【0039】

【表2】

【0040】

実験例１：“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の構造的安全性の確認
実施例１及び２で製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の構造的安全性を確認するために、水溶液でのナノ粒子構造維持可否を確認した。このために、粉末状の“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を生理食塩水に溶かして得たナノ粒子溶液を常温で１２時間及び６０時間放置した後、沈澱や変色などの変化を観察して図４に示した。
図４に示したように、“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（Ａ：パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｂ：ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｃ：オキサリプラチン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子、Ｄ：ゲムシタビン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子）は６０時間以上構造的及び形態的特徴を安定的に維持していることを示した。

【0041】

実験例２：“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の癌組織標的指向性（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の確認
実施例１及び２で製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の癌組織標的指向性を確認するために、人間の乳房癌モデルであるヌードマウスに本発明の“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を注射した後、癌組織と正常組織での抗癌剤分布を測定した。
乳房癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＫＣＬＢ（登録商標），Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を培養した後、５×１０^６の細胞を６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードマウス（ダムルサイエンス）の皮下に注射し、無菌条件でマウスを育てて癌組織が１００ｍｍ^３以上成長すれば、実施例１及び２で製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を１０ｍｇ／ｋｇ／日の容量で静脈注射した。薬物静脈注射の後、１６時間が経った後、各マウス群はそれぞれ臓器別に引き離し、そのマウスの臓器をビードビーターでまったく擦った。ビードビーターでまったく擦れた組織はアセトニトリル溶媒で抽出し、その溶媒をＬＣ／ＭＳで分析して各組織内の薬物の濃度を測定した。各マウスにおいて、薬物投与量（ＩＤ）に対する伝達された薬物の濃度を正常組織と癌組織で測定し、その結果を表３に示した。

【0042】

【表3】

【0043】

表３から、対照区である遊離薬物の癌組織への伝達率は正常組織伝達率にほぼ同じ水準で、標的指向性がほとんどないが、実施例１及び２で製造された“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は癌組織に対する標的指向性が著しく増加したことを確認することができた。
また、実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を標的指向物質が付いていない既存のパクリタキセル−ヒト血清アルブミンナノ粒子である抗癌剤Ａｂｒａｘａｎｅ（Ｃｅｌｇｅｎｅ社）と比較し、各組織別に薬物伝達率を測定した。
実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の癌組織標的指向増幅性を確認するために、“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を癌が誘導されたマウスに静脈注射してから４時間後、癌組織に６３０ｎｍ波長のＬＥＤ光源を１００ｍｍｏｌ／ｍ^２ｓ^２の条件で３０分間照射し、マウス組織に対する薬物伝達率を確認した。
図５に示したように、Ａｂｒａｘａｎｅの場合、人間の乳房癌モデルヌードマウスの正常組織と癌組織での薬物濃度の差がなく、標的指向性が低かった。しかし、“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）の場合には、肝、心臓、肺、脾臓、筋肉、頭脳、胃、腎臓の正常組織での薬物濃度は０．１〜２．４％ＩＤ／ｇｒａｍであるが、癌組織での薬物濃度は７〜９％ＩＤ／ｇｒａｍであった。特に、“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の投与後、そのマウスにＬＥＤ光を照射すれば、癌組織標的指向が１９〜２６％ＩＤ／ｇｒａｍの程度に増加したことを確認した。

【0044】

実験例３：“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の正常組織に対する毒性評価
実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の正常組織に対する毒性を評価した。
乳房癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＫＣＬＢ， Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を培養した後、５×１０^６の細胞を６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードマウス（ダムルサイエンス）の皮下に注射した後、無菌条件でマウスを育てて癌組織が２００ｍｍ^３程度に成長するようにして、癌（ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）動物モデルを樹立した。
ヌードマウスでの癌誘導が完了した後、腫瘍誘導ヌードマウスと正常ヌードマウスを一群当たり（ｎ＝６）で準備し、次のように決定された量のパクリタキセルと本発明の“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を静脈注射した。パクリタキセルに対する毒性評価は、正常ヌードマウスを７群に分けた後、各群のマウス当たり２０、４０、６０、８０、１００、１２０、２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの量のパクリタキセルをそれぞれ注射した。
“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”に対する毒性評価は、正常ヌードマウスと腫瘍誘導ヌードマウスをそれぞれ１０群に分けた後、各群のマウス当たり２０、４０、６０、８０、１００、１２０、２５０、３００、３５０及び４００ｍｇ／ｋｇ／ｄの量の“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”をそれぞれ注射した。注射後、すべてのマウスの体重と物理的変化を１４日間観察し、死んだマウスからパクリタキセルと“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”のＬＤ５０（５０％致死量）を測定して、パクリタキセルと“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”に対する毒性を評価して図６に示した。

【0045】

図６に示すように、本発明の“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”ＬＤ５０は９１ｍｇ／ｋｇ／ｄで、パクリタキセルのＬＤ５０である３０ｍｇ／ｋｇ／ｄに比べて３倍以上増加して、正常組織に対する毒性が著しく減少したことが分かった。
特に、本発明の“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は癌組織に抗癌剤が伝達される効率が画期的に向上し、正常組織には抗癌剤がほとんど伝達されなく（図５）、腫瘍誘導ヌードマウスの場合、ＬＤ５０値がおよそ１９４ｍｇ／ｋｇ／ｄに増加することから、癌がかかったマウスの、毒性がもっと画期的に減少することが分かった（図６のＣ）。

【0046】

実験例４：“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の透過残留性向上の効果
本発明の“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は抗癌剤、血清アルブミン、ポルフィリン系化合物が全て非共有的に結合されており、ポルフィリン系化合物がナノ粒子の表面に分布することが最大の特徴である。よって、ポルフィリン系化合物の固有な化学構造及び特性がそのまま保存されるので、抗癌ナノ粒子投与後、電磁気波を照らすと、抗癌ナノ粒子の標的指向性が増幅して抗癌剤の癌伝達率が増加することに予測された。
実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）が癌細胞株を移植させた実験動物に投与した後、ヒト血清アルブミンに結合するエバンスブルー染料（ＥＢＤ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）が癌細胞にどのくらい蓄積されるかを観察することにより、透過残留性向上の効果を確認した。
まず、ヌードマウス（ダムルサイエンス）に肺癌細胞株（ＫＣＬＢ、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を移植した後、癌組織が５０ｍｇ以上まで成長するようにヌードマウスを育てた。癌組織が誘導されたマウスに対照群である生理食塩水、アブラキサン（ＣｅｌｇｅｎｅのＡｂｒａｘａｎｅ）及び実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を２０ｍｇ／ｋｇ容量で静脈注射した。
ついで、“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”が投与されたマウスに、波長６３０ｎｍ、光強度１００ｍｍｏｌ／ｍ^２ｓ^２のＬＥＤ光を各マウスに３０分間照射した。ＬＥＤ光処理の終了後、そのマウスに直ちにエバンスブルー染料（１ｍｇ／ｍｌ，２００μｌ）を静脈注射した。６時間後、癌組織を抽出し、ホルムアミド３ｍｌを盛っているチューブに入れ、６０℃恒温水槽に４８時間入れ、抽出したエバンスブルー染料の量を分光光度計（６２０ｎｍ）で測定し、その結果を図７に示した。

【0047】

図７から、実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）は対照群及びアブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）に比べて透過残留性向上効果が著しく向上したことを確認することができた。

【0048】

実験例５：“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を用いた初期癌治療効能の評価
実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の初期癌治療効能を次の方法で評価した。
乳房癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＫＣＬＢ， Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を培養した後、５×１０^６の細胞を６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードマウス（ダムルサイエンス）の皮下に注射した後、無菌条件でマウスを育て、癌組織が１００ｍｍ^３以上成長するようにして、治療効能を研究するための初期癌移植動物モデルを樹立した。
対照群である生理食塩水、アブラキサン（ＣｅｌｇｅｎｅのＡｂｒａｘａｎｅ）及び実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を１０ｍｇ／ｋｇ／日の容量で０、３、７、１０日にそれぞれ静脈注射し、３週間観察した。
癌組織のサイズを分析するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）発現癌細胞株の生物発光画像法（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を遂行した。癌細胞を発光させるために、Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ １５０ｍｇをｌｕｃｉｆｅｒｉｎ／ｋｇの濃度でマウスに腹腔注射し、イソフルレンガス（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ｇａｓ）と酸素を混合して吸入痲酔させた後、Ｘｅｎｏｇｅｎ ｉｍａｇｅｒ（ＩＶＩＳ２００）で発光された癌細胞を重畳撮影し、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅで分析し、その結果を図８に示した。

【0049】

図８から、最初癌組織のサイズと２１日後の癌組織のサイズを比較した結果、生理食塩水対照群の場合、癌組織のサイズが急に増加し、アブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）処理群でも依然として癌組織が成長しており、無処理対照群と大きな差がないことを確認することができた。一方、本発明の実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）は癌組織がまったくなくなるほどに効能が優れることを確認することができた。

【0050】

実験例６：“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を用いた末期癌治療効能の評価
標的指向増幅型抗癌ナノ粒子を投与した後、電磁気波を照らすと、標的指向性が画期的に増幅して、現在まで不可能な末期癌も治療する可能性がある。よって、実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の末期癌治療効能を次の方法で評価した。
肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０−ｌｕｃ２（Ｃａｌｉｆｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培養し、５×１０^６の細胞を６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードマウス（ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）（ダムルサイエンス）の皮下に注射した後、癌組織が５００ｍｍ３以上成長するようにして、末期癌の治療効能を研究するための癌移植動物モデルを樹立した。
対照群である生理食塩水、アブラキサン（ＣｅｌｇｅｎｅのＡｂｒａｘａｎｅ）及び実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を１０ｍｇ／ｋｇ／日の容量で０、３、７、１０、１４日にそれぞれ静脈注射し、４週間観察した。
同時に、本発明の標的指向増幅型抗癌ナノ粒子の癌組織標的指向増幅性を確認するために、“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を末期癌が誘導されたマウスに静脈注射した後、癌組織に６３０ｎｍ波長のＬＥＤ光を１００ｍｍｏｌ／ｍ^２ｓ^２の条件で３０分ずつ照射する段階を付け加えた実験も同時にそれぞれ進行した。
癌組織のサイズを分析するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）発現癌細胞株の生物発光画像法（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）を遂行した。癌細胞を発光させるために、Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ １５０ｍｇをｌｕｃｉｆｅｒｉｎ／ｋｇの濃度でマウスに腹腔注射し、イソフルレンガス（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ｇａｓ）と酸素を混合して吸入痲酔させた後、Ｘｅｎｏｇｅｎ ｉｍａｇｅｒ（ＩＶＩＳ２００）で発光された癌細胞を重畳撮影し、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅで分析し、その結果を表４及び図９に示した。

【0051】

【表4】

※注：０．８Ｅ＋０８の値は癌組織が全然ないときの背景値程度である

【0052】

表４から、末期癌組織の最初サイズと２８日後の癌組織のサイズを比較した結果、対照群である生理食塩水とアブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ（Ｃｅｌｇｅｎｅ社））処理群の場合、癌組織のサイズが急に増加した一方、実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）処理群は癌組織が非常に減ることが分かった。
また、図９から、最初癌組織のサイズと４週後の癌組織のサイズを生物発光画像法で比較した結果、生理食塩水対照群の場合、癌が急に大きくなり、アブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）処理群でも依然として癌組織が成長しており、対照群と大きな差がないことを確認することができた。一方、本発明の実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）は癌組織が非常に減ることを確認した。
また、癌組織に蓄積されたポルフィリンを電磁気波ＬＥＤ処理で標的指向性を増幅させたマウス（（＋）表示）の場合、ＬＥＤ光を照射しなかったマウス（（−）表示）と比較するとき、抗癌効能がもっと優れたことを確認することができた。特に、本発明の実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を投与し、ＬＥＤの照射でポルフィリンを活性化させたマウスは２１日から２８日の間に癌がまったくなくなったことを確認することができた。

【0053】

実験例７：“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”を用いた末期癌治療効能の評価
アブラキサン（ＣｅｌｇｅｎｅのＡｂｒａｘａｎｅ）及び実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）の代わりにそれぞれドキソルビシン（ＣＨＥＭＩＥＬＩＶＡ， ＣＨＩＮＡ）及び実施例２で製造された“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を使ったことを除き、実験例６と同様な方法で末期癌に対する治療能を評価し、その結果を図１０に示した。
図１０から、末期癌ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスにおいて、癌組織の最初サイズと２８日後の癌組織のサイズを生物発光画像法で比較した結果、生理食塩水対照群の場合、癌が急に大きくなり、ドキソルビシン処理群でも依然として癌組織が大きく成長しており、対照群とは大きな差がないことを確認することができた。
一方、本発明の実施例２で製造された“ドキソルビシン封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）を処理しながら同時に電磁気波の一種であるＬＥＤ光で標的指向性を増幅させれば、癌組織のサイズがめっきり減ってからまったくなくなることを確認した。
これは本発明の実施例１で製造された“パクリタキセル封入標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”（ＪＩＮＩＳナノ粒子）の投与後にポルフィリンを活性化させた実験例６の結果と一致する。

【0054】

以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当該分野の通常の知識を持った者にとってこのような具体的な記述はただ好適な実施様態であるだけ、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。

【産業上の利用可能性】

【0055】

現在まで開発された何の抗癌薬物療法も癌を完治するほどに効能が優れた薬物はない。特に、癌の増殖速度が幾何級数的に速くなる末期癌の場合には、現在まで開発された何の抗癌剤や抗癌ナノ粒子を投与しても癌組織を死滅する効果が低くて癌治療効果がほとんどない。このような理由で病院では末期癌には抗癌薬物療法を一般的に行っていない。
本発明で提供する“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”はそのものでも既存に開発されたどんな抗癌ナノ粒子に比較することができないほどに卓越した抗癌効能があるが、特に、本発明の“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”の投与後、光や放射線のような電磁気波を照らすと、抗癌ナノ粒子の標的指向性がもっと増幅して末期癌も完治するほどに革新的な抗癌効能がある。したがって、本発明の“標的指向増幅型抗癌ナノ粒子”は人類を癌の恐怖から解放させることができると期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】