特許 6162707 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6162707

(24)【登録日】2017年6月23日

(45)【発行日】2017年7月12日

(54)【発明の名称】抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20170703BHJP

   G01N 33/566 20060101ALI20170703BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20170703BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20170703BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20170703BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 31/728 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 47/50 20170101ALI20170703BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20170703BHJP

   C12N 9/26 20060101ALN20170703BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170703BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 S

   G01N33/566

   G01N33/53 Y

   G01N33/574 D

   C07K14/52ZNA

   C07K16/00

   C07K19/00

   A61P35/00

   A61K38/00

   A61K45/00

   A61K31/728

   A61K38/46

   A61K47/50

   A61K47/34

   !C12N9/26 Z

   !C12N15/00 A

【請求項の数】43

【全頁数】177

(21)【出願番号】特願2014-538961(P2014-538961)

(86)(22)【出願日】2012年10月24日

(65)【公表番号】特表2014-532865(P2014-532865A)

(43)【公表日】2014年12月8日

(86)【国際出願番号】US2012061743

(87)【国際公開番号】WO2013063155

(87)【国際公開日】20130502

【審査請求日】2015年7月14日

(31)【優先権主張番号】61/630,765

(32)【優先日】2011年12月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/714,700

(32)【優先日】2012年10月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/628,187

(32)【優先日】2011年10月24日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/559,011

(32)【優先日】2011年11月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509136415

【氏名又は名称】ハロザイム インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100062144

【弁理士】

【氏名又は名称】青山 葆

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100067035

【弁理士】

【氏名又は名称】岩崎 光隆

(72)【発明者】

【氏名】ジアン・ビン

(72)【発明者】

【氏名】エイチ・マイケル・シェパード

(72)【発明者】

【氏名】ホアン・レイ

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５１９３６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１２８４４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２３９９６５（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ａ６１Ｋ ３１／７２８

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ３８／４６

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ４７／３４

Ａ６１Ｋ ４７／５０

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １４／５２

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

直接的またはリンカーを介して間接的に第一多量体化ドメインに結合したＴＳＧ−６結合モジュール(ＬＭ)を含む第一ポリペプチド；および
直接的またはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに結合したＴＳＧ−６−ＬＭを含む第二ポリペプチドを含み、
第一および第二多量体化ドメインは相互作用して２個以上のＴＳＧ−６結合モジュールを含む多量体を形成し；そして
ＴＳＧ−６−ＬＭが配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列または配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を含み、それによりＴＳＧ−６多量体はヒアルロナン(ＨＡ)に少なくとも１０^７Ｍ^−１の結合定数の結合親和性を有する、
ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項2】

結合モジュールが第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドのＴＳＧ−６部分のみである、請求項１に記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項3】

第一および第二ポリペプチドにおける結合モジュールが同一である、請求項１または２に記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項4】

第一および第二ポリペプチドにおける結合モジュールが異なる、請求項１または２に記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項5】

ＴＳＧ−６−ＬＭがヘパリンへの結合を減少または除去するために修飾される、請求項１〜４のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項6】

ＴＳＧ−６−ＬＭが配列番号３６０に示すアミノ酸残基２０、３４、４１、５４、５６、７２または８４に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、ここで、対応するアミノ酸残基は配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭに対するアラインメントにより同定される、請求項５に記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項7】

アミノ酸置換がＡｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｍｅｔ(Ｍ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｙｒ(Ｙ)およびＴｒｐ(Ｗ)から選択される非塩基性アミノ酸残基へのものである、請求項６に記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項8】

ＴＳＧ−６−ＬＭが配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭのアミノ酸置換Ｋ２０Ａ、Ｋ３４ＡまたはＫ４１Ａに対応するアミノ酸置換または他のＴＳＧ−６−ＬＭにおける対応する残基での置換を含む、請求項５〜７のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項9】

ＴＳＧ−６−ＬＭが配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列または配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列と少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸配列を含む、請求項５〜８のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項10】

多量体化ドメインが免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、互換性タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール類ならびに安定な多量体を形成する同一または類似サイズの腔内隆起および代償性腔から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項11】

多量体化ドメインが多量体化をもたらす免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)またはその変異体である、請求項１〜１０のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項12】

第一および第二ポリペプチドがＴＳＧ−６−ＬＭおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項13】

配列番号２１２または２１５のアミノ酸２４〜３４９に示すアミノ酸の配列または配列番号２１２または２１５のアミノ酸２４〜３４９に対して少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項14】

ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体が配列番号２１１、２１４または２１７に示すヌクレオチドの配列または配列番号２１１、２１４または２１７に示すヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列同一性を示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体をコードする核酸分子であって、
該核酸分子は直接的またはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに結合したＴＳＧ−６−ＬＭを含む融合ポリペプチドをコードし、
多量体化ドメインがそれ自体と相互作用して安定なタンパク質−タンパク質相互作用を形成するポリペプチドであり、それによりコードされるタンパク質が少なくとも２個のＴＳＧ−６結合モジュールを含む多量体を形成するものである、
核酸分子。

【請求項16】

配列番号２１１、２１４または２１７に示すヌクレオチドの配列または配列番号２１１、２１４または２１７に示すヌクレオチドに対して少なくとも９０％配列同一性を示すヌクレオチドの配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項17】

請求項１５または１６の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項18】

請求項１５または１６の核酸分子または請求項１７に記載のベクターを含む、単離細胞または細胞培養。

【請求項19】

請求項１５または１６の核酸分子を細胞に導入し、そして
細胞により融合ポリペプチドを発現させる条件下で細胞を培養する
ことを含む、ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体の製造方法。

【請求項20】

請求項１５または１６の核酸分子を細胞に導入し、
細胞により融合ポリペプチドを発現させる条件下で細胞を培養し；そして
所望によりＴＳＧ−６−ＬＭ多量体を回収する
ことを含む、ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体の製造方法。

【請求項21】

請求項１〜１４のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体を含む第一組成物；および
抗ヒアルロナン剤を含む第二組成物
を含む、キット。

【請求項22】

さらにＴＳＧ−６−ＬＭ多量体の検出のための試薬を含む、請求項２１に記載のキット。

【請求項23】

抗ヒアルロナン剤がヒアルロナン分解酵素またはヒアルロナン合成を阻害する薬剤である、請求項２１または２２に記載のキット。

【請求項24】

抗ヒアルロナン剤がヒアルロニダーゼであるヒアルロナン分解酵素である、請求項２３に記載のキット。

【請求項25】

ヒアルロナン分解酵素がＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)付着部位もしくはＧＰＩ付着部位の一部を欠くその切断型である、請求項２４に記載のキット。

【請求項26】

ＰＨ２０またはその切断型が配列番号４〜９、４７、４８、１５０〜１７０および１８３〜１８９のいずれかに示すアミノ酸の配列または配列番号４〜９、４７、４８、１５０〜１７０および１８３〜１８９のいずれかと少なくとも９０％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む、請求項２４に記載のキット。

【請求項27】

抗ヒアルロナン剤がポリマーへのコンジュゲーションにより修飾されているヒアルロナン分解酵素である、請求項２１〜２６のいずれかに記載のキット。

【請求項28】

ポリマーがＰＥＧであり、ヒアルロナン分解酵素はペグ化されている、請求項２７に記載のキット。

【請求項29】

腫瘍または癌を有する対象から予め得た組織または体液サンプルを請求項１〜１４のいずれかに記載のＴＳＧ−６−ＬＭ多量体と接触させ；そして
ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体のサンプルへの結合を検出し、それによりサンプル中のヒアルロナンの量を決定し、サンプル中のヒアルロナンの量が予定した閾値以上であるとき、対象を抗ヒアルロナン剤での処置のために選択する
ことを含む、抗ヒアルロナン剤での腫瘍の処置のために対象を選択する方法であって、
サンプルが体液サンプルであり、予定した閾値をμgＨＡ／mlサンプルで表示したとき、少なくともまたは最低０.０２５μg／ml、０.０３０μg／ml、０.０３５μg／ml、０.０４０μg／ml、０.０４５μg／ml、０.０５０μg／ml、０.０５５μg／ml、０.０６０μg／ml、０.０６５μg／ml、０.０７０μg／ml、０.０８μg／ml、０.０９μg／ml、０.１μg／ml、０.２μg／ml、０.３μg／ml以上であるか；または
サンプルが腫瘍組織サンプルであり、予定された閾値が少なくとも＋２(ＨＡ^＋２)または少なくとも＋３(ＨＡ^＋３)のＨＡスコアであるか；または
サンプルが腫瘍組織サンプルであり、予定した閾値が、少なくとも腫瘍(細胞および間質)対腫瘍組織の全染色のパーセントで少なくとも１０％、１０％〜２５％または２５％を超える、
方法。

【請求項30】

予定した閾値が少なくとも＋３(ＨＡ^＋３)(高レベル)のＨＡスコアである、請求項
２９に記載の方法。

【請求項31】

抗ヒアルロナン剤がヒアルロナン分解酵素またはヒアルロナン合成を阻害する薬物である、請求項２９または３０に記載の方法。

【請求項32】

抗ヒアルロナン剤がヒアルロニダーゼであるヒアルロナン分解酵素である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

抗ヒアルロナン剤が可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはＧＰＩ付着部位の全てまたは一部を欠くヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼの切断型である、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。

【請求項34】

抗ヒアルロナン剤がＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはＧＰＩ付着部位の全てまたは一部を欠くその切断型である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

ＰＨ２０またはその切断型が配列番号４〜９、４７、４８、１５０〜１７０および１８３〜１８９のいずれかに示すアミノ酸の配列または配列番号４〜９、４７、４８、１５０〜１７０および１８３〜１８９のいずれかと少なくとも９０％配列同一性を示すアミノ酸の配列である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

抗ヒアルロナン剤がポリマーへの結合により修飾されているヒアルロナン分解酵素である、請求項２９〜３５のいずれかに記載の方法。

【請求項37】

ポリマーがＰＥＧであり、ヒアルロナン分解酵素がペグ化されている、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

サンプルを得た対象が腫瘍または癌を有する、請求項２９〜３７のいずれかに記載の方法。

【請求項39】

予定されたまたは参照レベルが健常または正常組織または対照対象の体液サンプルに存在するヒアルロナンの中央レベルである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

予定した閾値レベルが０.０１５μgＨＡ／mlサンプルより多い；または
サンプルが腫瘍または組織サンプルであり、予定した閾値がＨＡ^＋１、ＨＡ^＋２またはＨＡ^＋３のＨＡスコアである、
請求項３７または３９に記載の方法。

【請求項41】

サンプルが間質組織サンプルである；または
サンプルが血液、血清、尿、汗、精液、唾液、脳脊髄液またはリンパ液サンプルである体液サンプルである、
請求項２９〜４０のいずれかに記載の方法。

【請求項42】

サンプルが腫瘍からの間質組織サンプルである、請求項２９〜４１のいずれかに記載の方法。

【請求項43】

腫瘍が乳癌、膵癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、非小細胞性肺癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、甲状腺癌、頚部癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、脳の癌、膀胱癌、胃癌、肝細胞腫、黒色腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、中皮腫、骨髄腫、リンパ腫および白血病から選択される癌である、請求項４２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
２０１１年１０月２４日出願の“ヒアルロナン分解酵素治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法”と題する米国仮出願番号６１／６２８,１８７、２０１１年１１月１１日出願の“ヒアルロナン分解酵素治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法”と題する米国仮出願番号６１／５５９,０１１、２０１１年１２月１６日出願の“ヒアルロナン分解酵素治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法”と題する米国仮出願番号６１／６３０,７６５および２０１２年１０月１６日出願の“抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法”と題する米国仮出願番号６１／７１４,７００に対する優先権の利益を主張する。上記出願の各々の対象を、その全体を引用により本明細書に包含させる。

【0002】

本出願は、同日付出願の米国仮出願番号６１／６２８,１８７、６１／５５９,０１１、６１／６３０,７６５および６１／７１４,７００に対する優先権を主張する“抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法”と題する米国特許出願番号１３／６９４,０７１と関連する。
上記出願の対象を、その全体を引用により本明細書に包含させる。

【0003】

電子的に提供した配列表の引用による取り込み
配列表の電子版をここに添付し、その内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる。電子ファイルは２０１２年１０月２４に作成しており、１８２７キロバイトサイズであり、ファイル名3096seqPC1.txtである。

【0004】

発明の分野
ヒアルロナン分解酵素での癌処置の対象を同定するための方法および診断剤を提供する。生物学的サンプル中のヒアルロナンを検出および定量し、ヒアルロナン分解酵素での癌処置のモニタリングするための診断剤を提供する。本方法の実施に際して使用するための組み合わせおよびキットも提供する。

【背景技術】

【0005】

背景
ヒアルロナン分解酵素群は、典型的に他の治療剤と組み合わせて分散剤および展着剤として治療的に使用されている。ヒアルロナン分解酵素群はまたヒアルロナン関連疾患および障害の処置のために単剤治療としても使用できる。例えば、腫瘍および癌はヒアルロナン蓄積と関連し、ヒアルロナン分解酵素での処置は腫瘍増殖を阻止し、血管灌流を高め、化学療法剤の腫瘍への送達を改善する。ヒアルロナン分解酵素群で処置されている患者の処置を改善するための方法および試薬が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

要約
ここで提供されるのは、抗ヒアルロナン剤、例えば、ヒアルロナン分解酵素で腫瘍を処置する対象を選択する方法である。提供される方法において、腫瘍または癌を有する対象からの組織または体液サンプルを、動物軟骨から調製または単離していないヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)と接触させる。ヒアルロナン結合タンパク質のサンプルへの結合を検出し、それによりサンプル中のヒアルロナンの量を決定し、サンプル中のヒアルロナンの量が予定した閾値以上であるとき、該対象を抗ヒアルロナン剤、例えば、ヒアルロナン分解酵素での処置に対して選択する。

【0007】

ここで提供されるのは、腫瘍を抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素で処置するための対象を選択する方法であって、ここで、腫瘍または癌を有する対象からの体液を、動物軟骨から調製または単離していないヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)と接触させ、ＨＡＢＰのサンプルへの結合を比色または蛍光シグナルを伴う固相結合アッセイにより行い、それによりサンプル中のヒアルロナンの量を決定し、これにより、予定した閾値レベルが高ＨＡであるとき、対象を抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での処置に対して選択する。本方法のいくつかの例において、予定した閾値は少なくともまたは最低０.０２５μg ＨＡ／mlのサンプル、０.０３０μg／ml、０.０３５μg／ml、０.０４０μg／ml、０.０４５μg／ml、０.０５０μg／ml、０.０５５μg／ml、０.０６０μg／ml、０.０６５μg／ml、０.０７０μg／ml、０.０８μg／ml、０.０９μg／ml。０.１μg／ml、０.２μg／ml、０.３μg／ml以上である。

【0008】

ここで提供されるのは、腫瘍を抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素で処置するための対象を選択する方法であって、ここで、腫瘍または癌を有する対象からの腫瘍組織サンプルを、動物軟骨から調製または単離していないヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)と接触させ、ＨＡＢＰのサンプルへの結合を組織化学的に行い、それによりサンプル中のヒアルロナンの量を決定し、予定した閾値レベルが、少なくとも＋２(ＨＡ^＋２)または少なくとも＋３(ＨＡ^＋３)のＨＡスコアであるとき、対象を抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での処置に対して選択する。いくつかの例において、予定した閾値レベルは少なくとも＋３(ＨＡ^＋３)(高レベル)のＨＡスコアである。他の例において、予定した閾値レベルが、少なくとも腫瘍(細胞および間質)対腫瘍組織の全染色のパーセントで少なくとも１０％、１０％〜２５％または２５％を超える。例えば、予定した閾値が、少なくとも腫瘍(細胞および間質)対腫瘍組織の全染色のパーセントで少なくとも１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％または４０％である。

【0009】

またここで提供されるのは、腫瘍を抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素で処置するための対象を選択する方法であって、対象を、その後抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素で処置する方法である。いくつかの例において、抗ヒアルロナン剤は、正確にまたは約０.０１μg／kg(対象の)〜５０μg／kg、０.０１μg／kg〜２０μg／kg、０.０１μg／kg〜１５μg／kg、０.０５μg／kg〜１０μg／kg、０.７５μg／kg〜７.５μg／kgまたは１.０μg／kg〜３.０μg／kgの範囲の量の投与量で、投与頻度が１週間に２回、１週間に１回、１４日間毎に１回、２１日間毎に１回または一ヶ月間に１回で投与するヒアルロナン分解酵素である。本方法の具体例において、コルチコステロイドを、ヒアルロナン分解酵素の投与前にまたはヒアルロナン分解酵素の投与後に、典型的に投与したヒアルロナン分解酵素の有害作用を対象において軽減するのに十分な量で投与する。例えば、投与するコルチコステロイドの量は正確にまたは約０.１〜２０mg、０.１〜１５mg、０.１〜１０mg、０.１〜５mg、０.２〜２０mg、０.２〜１５mg、０.２〜１０mg、０.２〜５mg、０.４〜２０mg、０.４〜１５mg、０.４〜１０mg、０.４〜５mg、０.４〜４mg、１〜２０mg、１〜１５mgまたは１〜１０mgである。

【0010】

またここで提供されるのは、対象の抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での処置の効果を予測する方法である。提供される方法において、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素で処置するまたは処置されている対象の組織または体液サンプルを、動物軟骨から調製または単離していないヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)と接触させ、ヒアルロナン結合タンパク質のサンプルへの結合を検出し、それによりサンプル中のヒアルロナンの量を決定し、ここで、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置前または直前の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)処置前と比較してヒアルロナンの減少の検出は処置が有効であることの指標である。

【0011】

またここで提供されるのは、対象の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置をモニタリングする方法である。提供される方法において、腫瘍または癌を有する対象からの組織または体液サンプルを、動物軟骨から調製または単離していないヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)と接触させ、サンプルと結合するヒアルロナン結合タンパク質の量を検出し、それによりサンプル中のヒアルロナンの量を決定し、ヒアルロナンレベルを対照または参照サンプルと比較し、それにより対照または参照サンプルに対するサンプル中のヒアルロナン量を決定し、ここで、ヒアルロナンの量が処置進行の指標である。

【0012】

またここで提供されるのは、対象の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置の効果を予測し、対象の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置をモニタリングする方法であって、ここで、サンプル中のヒアルロナン量が対照または参照サンプルの量以上であれば、処置を継続するか投与量および／または投与スケジュールを増やすことにより増進するまたはサンプル中のヒアルロナン量が対照または参照サンプルの量未満であれば、処置を継続する、投与量および／または投与スケジュールを減らすことにより縮小するまたは終了させるように、対照または参照サンプルに対するサンプル中のヒアルロナンの量の決定に基づき処置を変える。いくつかの例において、対照または参照サンプルは健常対象からのサンプルであり、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置前の対象由来のベースラインサンプルでありまたは最終の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)投与前の対象からのサンプルである。いくつかの例において、対象は腫瘍または癌を有し、サンプルは腫瘍組織サンプルであり、検出を組織化学的に行う。他の例において、対象は腫瘍または癌を有し、サンプルは体液であり、検出を固相結合アッセイにより行う。いくつかの例において、固相結合アッセイはマイクロタイタープレートアッセイであり、結合を比色的にまたは蛍光により検出する。

【0013】

ここに提供する如何なる方法においても、サンプルとＨＡＢＰを接触させる工程はｐＨ５.６〜６.４またはおよそｐＨ５.６〜６.４で行い得る。例えば、サンプルとＨＡＢＰを接触させる工程を約５.８、５.９、６.０、６.１または６.２のｐＨで行う。いくつかの例において、ＨＡＢＰは、(Kd)で少なくともまたは１×１０^−７Ｍ、９×１０^−８Ｍ、８×１０^−８Ｍ、７×１０^−８Ｍ、６×１０^−８Ｍ、５×１０^−８Ｍ、４×１０^−８Ｍ、３×１０^−８Ｍ、２×１０^−８Ｍ、１×１０^−８Ｍ、９×１０^−９Ｍ、８×１０^−９Ｍ、７×１０^−９Ｍ、６×１０^−９Ｍ、５×１０^−９Ｍ、４×１０^−９Ｍ、３×１０^−９Ｍ、２×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍまたはそれより低いKdの結合親和性でＨＡに特異的に結合する。

【0014】

ここに提供する如何なる方法においても、ＨＡＢＰは組み換えにより作製しても、合成により作製してもよい。いくつかの例において、ＨＡＢＰは１個の結合モジュールを含む。他の例において、ＨＡＢＰは２個以上の結合モジュールを含む。さらなる例において、１個または複数個の結合モジュールは分子の唯一のＨＡＢＰ部分である。それゆえに、ここで提供されるのは、ＨＡＢＰがＣＤ４４、ＬＹＶＥ−１、ＨＡＰＬＮ１／結合タンパク質、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８およびＫＩＡＡ０５２７から選択される１個の結合モジュールを含む、方法である。本方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰは、結合モジュールまたはＨＡと結合するのに十分な結合モジュールの一部を含む、ＣＤ４４、ＬＹＶＥ−１、ＨＡＰＬＮ１／結合タンパク質、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８またはＫＩＡＡ０５２７の一部を含む。特定の例において、ＨＡＢＰは腫瘍壊死因子−刺激遺伝子(ＴＳＧ−６)タンパク質またはＴＳＧ−６の結合モジュールまたはＨＡと結合するのに十分なＴＳＧ−６の結合モジュールの一部である。ここに記載する方法の他の例において、ＨＡＢＰはタイプＣヒアルロナン結合タンパク質のＧ１ドメイン、例えば、アグリカンＧ１、バーシカンＧ１、ニューロカンＧ１およびブレビカンＧ１から選択されるＧ１ドメインを含む。具体例において、Ｇ１ドメインは分子の唯一のＨＡＢＰ部分である。

【0015】

ここに提供する方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰは、配列番号２０７、２２２、３６０、３６１、３７１〜３９４、４１６〜４１８および４２３〜４２６のいずれかに示すアミノ酸の配列を有するかまたは配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４、４１６〜４１８および４２３〜４２６のいずれかに示すアミノ酸と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を有しまたはそのＨＡ結合ドメインでありまたはＨＡに特異的に結合するために十分なその一部である。一例において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６結合モジュール(ＬＭ)またはＨＡと特異的に結合するのに十分なその一部を含む。例えば、ＴＳＧ−６−ＬＭは配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列または配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を含む。方法の具体例において、ＨＡＢＰは配列番号２０７に示す結合モジュールまたは配列番号２０７に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸配列を含む。他の例において、ＨＡＢＰは配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、それによりＨＡＢＰがＨＡと特異的に結合する、１個の結合モジュールを含む。

【0016】

ここに提供する方法のいくつかの例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは、ヘパリンへの結合を削減または除去するために修飾される。例えば、ヘパリンへの結合は少なくとも１.２倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍以上削減される。ここに提供する方法のいくつかの例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは配列番号３６０に示すアミノ酸残基２０、３４、４１、５４、５６、７２または８４に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、ここで、対応するアミノ酸残基は配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭに対するアラインメントにより同定される。例えば、アミノ酸置換は配列番号２０７に示すＴＳＧ−６−ＬＭにあり、１箇所または複数個所アミノ酸置換はアミノ酸残基２１、３５、４２、５５、５７、７３または８５である。アミノ酸置換は、Ａｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｍｅｔ(Ｍ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｙｒ(Ｙ)およびＴｒｐ(Ｗ)から選択される非塩基性アミノ酸残基への置換であり得る。さらなる例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭにおけるアミノ酸置換Ｋ２０Ａ、Ｋ３４ＡまたはＫ４１Ａに対応するアミノ酸置換または他のＴＳＧ−６−ＬＭにおける対応する残基での置換を含む。他の例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは、配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭにおけるアミノ酸置換Ｋ２０Ａ、Ｋ３４ＡおよびＫ４１Ａに対応するアミノ酸置換または他のＴＳＧ−６−ＬＭにおける対応する残基の置換を含む。例えば、ＨＡＢＰは配列番号３６１または４１６に示す結合モジュールまたは配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を含む。

【0017】

ここに提供する方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰは配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示す１個の結合モジュールを含み、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合する。具体例において、ＨＡＢＰは配列番号３６１または配列番号４１６に示す１個の結合モジュールを含む。他の例において、結合モジュールはＨＡＢＰのＴＳＧ−６部分のみである。ここに提供する方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰは直接的にまたはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに結合する第一ＨＡ結合ドメインおよび直接的にまたはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに結合する第二ＨＡ結合ドメインを含む多量体である。例えば、ＨＡ結合ドメインは結合モジュールまたはＧ１ドメインである。第一および第二ＨＡ結合ドメインは同一でも異なってもよい。特定の例において、第一および第二ＨＡ結合ドメインはＴＳＧ−６結合モジュール、その変異体またはＨＡに特異的に結合するのに十分なその一部である。例えば、ＴＳＧ−６−ＬＭは配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列またはＨＡと特異的に結合する配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７もしくは４１８に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含むアミノ酸の配列を含む。例えば、結合モジュールは配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合する。ここに提供するいくつかの方法において、結合モジュールは配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列を含む。

【0018】

ここに提供する方法において、ＨＡＢＰ類、ＨＡ結合ドメイン、結合モジュールまたはその一部は免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、互換性タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール類ならびに安定な多量体を形成する同一または類似サイズの腔内隆起(protuberance-into-cavity)および代償性腔(compensatory cavity)から選択される多量体化ドメインに結合できる。特定の例において、多量体化ドメインは多量体化をもたらすＦｃドメインまたはその変異体である。例えば、ＦｃドメインはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来するかまたはＦｃドメインは配列番号３５９に示すアミノ酸の配列を有する。ここに提供する方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６結合モジュールおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含む融合タンパク質である。例えば、ＨＡＢＰは、配列番号２１２に示すアミノ酸の配列または配列番号２１２に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列のような、配列番号２１２に対して少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を有するＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃである。具体例において、ＨＡＢＰは配列番号２１２または２１５に示すアミノ酸の配列を有する。ここに提供するあらゆる方法において、ＨＡＢＰは、配列番号２１５に示すアミノ酸の配列または配列番号２１５に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列のような、配列番号２１５に対して少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を有するＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐであり得る。

【0019】

ここに提供する具体的方法において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６またはそのヒアルロナン結合領域である。ここに提供する方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰまたはＴＳＧ−６は、ＨＡに対して少なくとも１×１０^８Ｍ^−１、２×１０^８Ｍ^−１、３×１０^８Ｍ^−１、４×１０^８Ｍ^−１、５×１０^８Ｍ^−１、６×１０^８Ｍ^−１、７×１０^８Ｍ^−１、８×１０^８Ｍ^−１、９×１０^８Ｍ^−１、１×１０^９Ｍ^−１以上の結合親和性を有する。他の例において、ＨＡＢＰまたはＴＳＧ−６は検出可能に標識されているかまたは検出できる、検出可能部分と結合する。例えば、ＨＡＢＰまたはＴＳＧ−６はビオチニル化されている。

【0020】

ここに提供する方法のいくつかの例において、サンプルは腫瘍からの間質組織サンプルのような間質組織サンプルである。ここに記載する方法でサンプル採取された組織は固定化でき、パラフィン包埋でき、新鮮であってよくまたは凍結できる。いくつかの例において、サンプルは、例えば、針生検、ＣＴ下針生検、吸引生検、内視鏡生検、気管支鏡生検、気管支洗浄、切開生検、切除生検、パンチ生検、薄片生検、皮膚生検、骨髄生検および電気外科的ループ切除法(ＬＥＥＰ)により得た固形腫瘍の生検標本から採る。他の例において、サンプルは、血液、血清、尿、汗、精液、唾液、脳脊髄液またはリンパ液サンプルである体液サンプルである。ここに提供するあらゆる方法において、サンプルは哺乳動物から得ることができる。一例において、哺乳動物はヒトである。

【0021】

ここに提供するあらゆる方法において、腫瘍は乳癌、膵癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、非小細胞性肺癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、甲状腺癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、前立腺癌、精巣癌、脳腫瘍、膀胱癌、胃癌、肝細胞癌、黒色腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、中皮腫、骨髄腫、リンパ腫および白血病から選択される癌であり得る。いくつかの例において、腫瘍は末期癌、転移癌および未分化癌である癌である。

【0022】

ここに提供するあらゆる方法において、抗ヒアルロナン剤はヒアルロナンを分解する薬剤であってよくまたはヒアルロナンの合成を阻害する薬剤であってよい。例えば、抗ヒアルロナン剤はヒアルロナン分解酵素であり得る。他の例において、抗ヒアルロナン剤はヒアルロナン合成を阻害する薬剤である。例えば、抗ヒアルロナン剤はＨＡシンターゼに対するセンスまたはアンチセンス核酸分子のようなヒアルロナン合成を阻害する薬剤または小分子薬物である。例えば、抗ヒアルロナン剤は４−メチルウンベリフェロン(ＭＵ)もしくはその誘導体またはレフルノミドもしくはその誘導体である。このような誘導体は、例えば、６,７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンまたは５,７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンである４−メチルウンベリフェロン(ＭＵ)の誘導体である。

【0023】

ここに提供する方法のさらなる例において、ヒアルロナン分解酵素はヒアルロニダーゼである。いくつかの例において、ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)付着部位もしくはＧＰＩ付着部位の一部を欠くその切断型である。具体例において、ヒアルロニダーゼはヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスまたはモルモットＰＨ２０から選択されるＰＨ２０である。例えば、ヒアルロナン分解酵素は中性活性かつＮ−グリコシル化されたヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼであり、(ａ)完全長ＰＨ２０であるかまたはＰＨ２０のＣ末端切断型であるヒアルロニダーゼポリペプチド(ここで、該切断型は少なくとも配列番号１のアミノ酸残基３６〜４６４、例えば３６〜４８１、３６〜４８２、３６〜４８３を含み、ここで、該完全長ＰＨ２０は配列番号２に示すアミノ酸の配列を有する)；または(ｂ)配列番号２に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたは切断型と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または(ｃ)アミノ酸置換を含む(ａ)または(ｂ)のヒアルロニダーゼポリペプチドであって、配列番号２に示すポリペプチドまたは対応するその切断型と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するヒアルロニダーゼポリペプチドから選択される。一例において、ヒアルロナン分解酵素は、ｒＨｕＰＨ２０と命名された組成物を含むＰＨ２０である。

【0024】

他の例において、抗ヒアルロナン剤はポリマーへの結合により修飾されているヒアルロナン分解酵素である。ポリマーはＰＥＧであり、抗ヒアルロナン剤はペグ化ヒアルロナン分解酵素であり得る。それゆえに、ここに提供するいくつかの例において、ヒアルロナン分解酵素はポリマーへの結合により修飾されている。例えば、ヒアルロナン分解酵素はＰＥＧに結合し、それゆえにヒアルロナン分解酵素はペグ化されている。一例において、ヒアルロナン分解酵素はペグ化ＰＨ２０酵素(ＰＥＧＰＨ２０)である。ここに提供する方法において、コルチコステロイドはコルチゾン類、デキサメサゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類から選択されるグルココルチコイドであり得る。

【0025】

またここで提供されるのは、サンプル中のヒアルロナンの量を検出するためのヒアルロナン結合剤(ＨＡＢＰ)を含むキットであって、ここで、ＨＡＢＰは動物軟骨およびヒアルロナン分解酵素から調製されていない。ＨＡＢＰは組み換えにより製造しても、合成により製造してもよい。いくつかの例において、ＨＡＢＰは１個の結合モジュールを含む。他の例において、ＨＡＢＰは２個以上の結合モジュールを含む。いくつかの例において、１個または複数個の結合モジュールは分子の唯一のＨＡＢＰ部分である。例えば、ＨＡＢＰはＣＤ４４、ＬＹＶＥ−１、ＨＡＰＬＮ１／結合タンパク質、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８およびＫＩＡ０５２７または結合モジュールまたはＨＡと結合するのに十分な結合モジュールの一部を含むこれらの一部から選択される１個の結合モジュールを含む。他の例において、ＨＡＢＰはタイプＣヒアルロナン結合タンパク質のＧ１ドメイン、例えば、アグリカンＧ１、バーシカンＧ１、ニューロカンＧ１およびブレビカンＧ１から選択されるＧ１ドメインを含む。具体例において、Ｇ１ドメインは分子の唯一のＨＡＢＰ部分である。

【0026】

いくつかの例において、キットは、配列番号２０７、２２２、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８および４２３〜４２６のいずれかに示すアミノ酸の配列または配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４、４１６〜４１８および４２３〜４２６のいずれかに示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列またはそのＨＡ結合ドメインまたはＨＡに特異的に結合するために十分なその一部を含むＨＡＢＰを含む。一例において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６結合モジュール(ＬＭ)またはＨＡと特異的に結合するのに十分なその一部を含む。例えば、ＴＳＧ−６−ＬＭは、配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列または配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を含む。いくつかの例において、ＨＡＢＰは配列番号３６０に示すアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有する１個の結合モジュールを含み、それによりＨＡＢＰがＨＡと結合する。具体例において、ＨＡＢＰは配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示す結合モジュールを含む。

【0027】

ここに提供するキットのいくつかの例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは、ヘパリンへの結合を削減または除去するために修飾される。例えば、ヘパリンへの結合は少なくとも１.２倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍以上減少される。ある例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは配列番号３６０に示すアミノ酸残基２０、３４、４１、５４、５６、７２または８４に対応するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、ここで、対応するアミノ酸残基は配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭに対するアラインメントにより同定される。例えば、アミノ酸置換はＡｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｍｅｔ(Ｍ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｙｒ(Ｙ)およびＴｒｐ(Ｗ)から選択される非塩基性アミノ酸残基へのものである。それゆえに、ここで提供されるのは、ＴＳＧ−６結合モジュールが配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭにおけるアミノ酸置換Ｋ２０Ａ、Ｋ３４ＡまたはＫ４１Ａに対応するアミノ酸置換または他のＴＳＧ−６−ＬＭにおける対応する残基での置換を含むキットである。例えば、ＴＳＧ−６結合モジュールは、配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭにおけるアミノ酸置換Ｋ２０Ａ、Ｋ３４ＡおよびＫ４１Ａに対応するアミノ酸置換または他のＴＳＧ−６−ＬＭにおける対応する残基の置換を含む。またここで提供されるのは、ＨＡＢＰが配列番号３６１または４１６に示す結合モジュールまたは配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を含むキットである。例えば、ＨＡＢＰは配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示す１個の結合モジュールを含み、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合する。具体例において、ＨＡＢＰは配列番号３６１または４１６に示す結合モジュールを含む。他の例において、結合モジュールはＨＡＢＰのＴＳＧ−６部分のみである。

【0028】

ここに提供するキットのいくつかの例において、ＨＡＢＰは直接的にまたはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに結合する第一ＨＡ結合ドメインおよび直接的にまたはリンカーを介して間接的に多量体化ドメインに結合する第二ＨＡ結合ドメインを含む多量体である。例えば、ＨＡ結合ドメインは結合モジュールまたはＧ１ドメインである。第一および第二ＨＡ結合ドメインは同一でも異なってもよい。特定の例において、第一および第二ＨＡ結合ドメインはＴＳＧ−６結合モジュール、その変異体またはＨＡに特異的に結合するのに十分なその一部である。例えば、ＴＳＧ−６−ＬＭは配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列またはＨＡと特異的に結合する配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７もしくは４１８に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含むアミノ酸の配列を含む。例えば、結合モジュールは配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合する。ここに提供するいくつかの方法において、結合モジュールは配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列を含む。

【0029】

ここに提供するキットにおいて、ＨＡＢＰ類は免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、適合性タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール類ならびに安定な多量体を形成する同一または類似サイズの腔内隆起および代償性腔から選択される多量体化ドメインにより結合できる。特定の例において、多量体化ドメインは多量体化をもたらすＦｃドメインまたはその変異体である。例えば、ＦｃドメインはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥに由来するかまたはＦｃドメインは配列番号３５９に示すアミノ酸の配列を有する。ここに提供する方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６結合モジュールおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含む融合タンパク質である。例えば、ＨＡＢＰは、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃは配列番号２１２または２１５に示すアミノ酸の配列を有するまたは配列番号２１２または２１５に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列のような、配列番号２１２または２１５に対して少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列である。具体例において、ＨＡＢＰは配列番号２１２または２１５に示すアミノ酸の配列を有する。ここに提供するあらゆる方法において、ＨＡＢＰは配列番号２１５に示すアミノ酸の配列または配列番号２１５に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、これにより、ＨＡＢＰはＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列のような、配列番号２１５に対して少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を有するＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐであり得る。

【0030】

ここに提供するキットの具体例において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６またはそのヒアルロナン結合領域である。ここに提供する方法のいくつかの例において、ＨＡＢＰは、結合定数(Ka)で表して、ＨＡに対して、少なくとも１０^７Ｍ^−１、例えば、少なくとも１×１０^８Ｍ^−１、２×１０^８Ｍ^−１、３×１０^８Ｍ^−１、４×１０^８Ｍ^−１、５×１０^８Ｍ^−１、６×１０^８Ｍ^−１、７×１０^８Ｍ^−１、８×１０^８Ｍ^−１、９×１０^８Ｍ^−１、１×１０^９Ｍ^−１以上の結合親和性を有する。例えば、ＨＡＢＰは、解離定数(Kd)で表して、ＨＡに対して、少なくともまたは１×１０^−７Ｍ、９×１０^−８Ｍ、８×１０^−８Ｍ、７×１０^−８Ｍ、６×１０^−８Ｍ、５×１０^−８Ｍ、４×１０^−８Ｍ、３×１０^−８Ｍ、２×１０^−８Ｍ、１×１０^−８Ｍ、９×１０^−９Ｍ、８×１０^−９Ｍ、７×１０^−９Ｍ、６×１０^−９Ｍ、５×１０^−９Ｍ、４×１０^−９Ｍ、３×１０^−９Ｍ、２×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍまたはそれより低いKdの結合親和性を有する。他の例において、ＨＡＢＰは検出可能に標識されているかまたは検出できる、検出可能部分と結合する。例えば、ＨＡＢＰはビオチニル化されている。

【0031】

またここで提供されるのは、サンプル中のヒアルロナンの量を検出するためのヒアルロナン結合剤(ＨＡＢＰ)を含むキットであって、ここで、ＨＡＢＰは動物軟骨および抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)から調製されていない。ここに提供するキットのいずれも、ＨＡＢＰの検出のための試薬をさらに含み得る。ここに提供するキットの例のいずれかにおいて、抗ヒアルロナン剤は本明細書中に記載する任意のものであり得る。例えば、抗ヒアルロナン剤はヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素であり得る。例えば、ヒアルロナン分解酵素はＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)付着部位もしくはＧＰＩ付着部位の一部を欠くその切断型であり得る。いくつかの例において、ＰＨ２０はヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスまたはモルモットＰＨ２０から選択される。例えば、ヒアルロナン分解酵素は中性活性かつＮ−グリコシル化されたヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼであり、(ａ)完全長ＰＨ２０であるかまたはＰＨ２０のＣ末端切断型であるヒアルロニダーゼポリペプチド(当該切断型は配列番号１の少なくともアミノ酸残基３６〜４６４を含み、完全長ＰＨ２０は配列番号２に示すアミノ酸の配列を含む)；または(ｂ)配列番号２に示すアミノ酸の配列のポリペプチドまたは切断型と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または(ｃ)アミノ酸置換を含む(ａ)または(ｂ)のヒアルロニダーゼポリペプチドであって、配列番号２に示すポリペプチドまたは対応するその切断型と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するヒアルロニダーゼポリペプチドから選択される。具体例において、ヒアルロナン分解酵素は、ｒＨｕＰＨ２０と命名された組成物を含むＰＨ２０である。いくつかの例において、ヒアルロナン分解酵素はポリマー例えば、ＰＥＧへの結合により修飾されており、ヒアルロナン分解酵素はペグ化されている。それゆえにここで提供されるのは、ヒアルロナン分解酵素がペグ化ＰＨ２０酵素(ＰＥＧＰＨ２０)であるキットである。またここで提供されるのは、さらにコルチコステロイドを含むキットである。ここに提供するキットは、いずれもさらにその成分の使用のためのラベルまたは添付文書を含み得る。

【0032】

ここに提供されるのは、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)で腫瘍を処置するための対象を選択するためのヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)の使用方法であって、ここで、ＨＡＢＰは動物軟骨動物軟骨から調製または単離していない。またここで提供されるのは、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)で腫瘍を処置するための対象の選択に使用するためのヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)を含む医薬組成物であって、ここで、ＨＡＢＰは動物軟骨動物軟骨から調製または単離していない。

【0033】

ここに提供されるのは、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での対象の処置の効果を予測するためのヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)の使用方法であって、ここで、ＨＡＢＰは動物軟骨動物軟骨から調製または単離していない。またここで提供されるのは、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での対象の処置の効果を予測するためのヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)を含む医薬組成物であって、ここで、ＨＡＢＰは動物軟骨動物軟骨から調製または単離していない。

【0034】

ここに提供される使用または医薬組成物のいずれにおいても、ＨＡＢＰは１個または複数個の結合モジュールまたはＧ１ドメインを含み得る。いくつかの例において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６結合モジュール(ＬＭ)、その変異体またはＨＡと結合するのに十分なその一部を含む。特定の例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは、ヘパリンへの結合を削減または除去するために修飾される。いくつかの例において、ＨＡＢＰは配列番号２０７、２１２、２１５、２２２、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８および４２３〜４２６のいずれかに示すアミノ酸の配列または配列番号２０７、２１２、２１５、２２２、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８および４２３〜４２６のいずれかに示すアミノ酸の配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列またはそのＨＡ結合ドメインまたはＨＡに特異的に結合するために十分なその一部を含む。

【0035】

またここで提供されるのは、多量体化ドメインに直接的またはリンカーを介して間接的に結合した第一結合モジュールおよび多量体化ドメインに直接的またはリンカーを介して間接的に結合した第二結合モジュールを含むＴＳＧ−６−ＬＭ多量体であって、ここで、第一および第二ポリペプチドはＴＳＧ−６の完全長配列を含まない。いくつかの例において、結合モジュールは第一ポリペプチドおよび第二ポリペプチドのＴＳＧ−６部分のみである。第一および第二結合モジュールは同一でも異なってもよい。いくつかの例において、結合モジュールは配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列または配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を含む。例えば、結合モジュールは配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合する。いくつかの例において、結合モジュールは配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列を含む。

【0036】

いくつかの例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは、ヘパリンへの結合を削減または除去するために修飾される。ヘパリンへの結合は少なくとも１.２倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍以上削減できる。いくつかの例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは配列番号３６０に示すアミノ酸残基２０、３４、４１、５４、５６、７２または８４に対応するアミノ酸の位置にアミノ酸置換を含み、ここで、対応するアミノ酸残基は配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭに対するアラインメントにより同定される。例えば、アミノ酸置換は配列番号２０７に示すＴＳＧ−６−ＬＭにあり、１箇所または複数個所アミノ酸置換はアミノ酸残基２１、３５、４２、５５、５７、７３または８５にある。いくつかの例において、アミノ酸置換はＡｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｍｅｔ(Ｍ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｙｒ(Ｙ)およびＴｒｐ(Ｗ)から選択される非塩基性アミノ酸残基への置換である。例えば、ＴＳＧ−６結合モジュールは配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭにおけるアミノ酸置換Ｋ２０Ａ、Ｋ３４ＡまたはＫ４１Ａに対応するアミノ酸置換または他のＴＳＧ−６−ＬＭにおける対応する残基での置換を含む。特定の例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは、配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭにおけるアミノ酸置換Ｋ２０Ａ、Ｋ３４ＡおよびＫ４１Ａに対応するアミノ酸置換または他のＴＳＧ−６−ＬＭにおける対応する残基の置換を含む。いくつかの例において、結合モジュールは配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列または配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列と少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を含み、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸配列を含む。例えば、結合モジュールは配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合する。具体例において、結合モジュールは配列番号３６１または４１６に示すアミノ酸の配列を含む。

【0037】

またここで提供されるのは、ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体であって、ここで、多量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、ロイシンジッパー、相補的疎水性領域、相補的親水性領域、互換性タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオール類ならびに安定な多量体を形成する同一または類似サイズの腔内隆起および代償性腔から選択される。いくつかの例において、多量体化ドメインは多量体化をもたらすＦｃドメインまたはその変異体である。例えば、ＦｃドメインはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来である。特定の例において、Ｆｃドメインは配列番号３５９に示すアミノ酸の配列を有する。

【0038】

またここで提供されるのは、ＴＳＧ−６結合モジュールおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含むＴＳＧ−６−ＬＭ多量体である。いくつかの例において、ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体は配列番号２１２または２１５に示すアミノ酸の配列または配列番号２１２または２１５に対して少なくとも６５％アミノ酸配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。例えば、ＴＳＧ−６多量体は列番号２１２または２１５に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、ＨＡと特異的に結合するアミノ酸の配列を含む。具体例において、ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体は配列番号２１２または２１５に示すアミノ酸の配列を含む。いくつかの例において、ＴＳＧ−６−ＬＭ多量体はＨＡに対して少なくとも１０^７Ｍ^−１、例えば少なくとも１×１０^８Ｍ^−１、２×１０^８Ｍ^−１、３×１０^８Ｍ^−１、４×１０^８Ｍ^−１、５×１０^８Ｍ^−１、６×１０^８Ｍ^−１、７×１０^８Ｍ^−１、８×１０^８Ｍ^−１、９×１０^８Ｍ^−１、１×１０^９Ｍ^−１以下の結合親和性を有する。

【0039】

またここで提供されるのは、インビボ造影法によりＨＡを検出するためここに提供されるＨＡＢＰのいずれかを使用して、対象の選択、効果の予測および／または処置のモニタリングのための方法である。インビボ造影法は磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、コンピュータ断層撮影法(ＣＴ)、コンピュータ体軸断層撮影法(ＣＡＴ)、電子ビームコンピュータ断層撮影法(ＥＢＣＴ)、高解像度コンピュータ断層撮影法(ＨＲＣＴ)、下環状断層撮影法、陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)、シンチ撮影法、ガンマカメラ、β＋ディテクタ、γディテクタ、蛍光造影、弱光造影、Ｘ線および／または生物発光造影であってよい。このような方法において、ＨＡＢＰはシグナルを提供する分子に直接的または間接的に結合しているかまたはインビボで検出可能なシグナルを惹起する。

【0040】

詳細な記載
概要
Ａ. 定義
Ｂ. ヒアルロナン結合タンパク質およびコンパニオン診断
１. 疾患におけるヒアルロナン蓄積および予後診断との関連
２. 抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での腫瘍の治療および処置に対する応答性
３. ヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ類)試薬および診断
４. コンパニオン診断および予後診断方法
Ｃ. コンパニオン診断として使用するためのヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ類)
１. 結合モジュールまたはＧ１ドメインを有するＨＡ結合タンパク質
ａ. タイプＡ：ＴＳＧ−６サブグループ
ｉ. ＴＳＧ−６
ii. スタビリン−１およびスタビリン−２
ｂ. タイプＢ：ＣＤ４４サブグループ
ｉ. ＣＤ４４
ii. ＬＹＶＥ−１
ｃ. タイプＣ：結合タンパク質サブグループ
ｉ. ＨＡＰＬＮ／結合タンパク質ファミリー
(１) ＨＡＰＬＮ１
(２) ＨＡＰＬＮ２
(３) ＨＡＰＬＮ３
(４) ＨＡＰＬＮ４
(５) アグリカン
(６) ブレビカン
(７) バーシカン
(８) ニューロカン
(９) ホスファカン
２. 結合モジュールを有しないＨＡ結合タンパク質
ａ. ＨＡＢＰ１／Ｃ１ＱＢＰ
ｂ. ライリン
ｃ. ＲＨＡＭＭ
ｄ. その他
３. ＨＡ結合タンパク質の修飾
ａ. ＨＡＢＰの多量体
ｉ. ペプチドリンカー
ii. ヘテロ二官能性結合剤
iii. ポリペプチド多量体化ドメイン
(１) 免疫グロブリンドメイン
(ａ) Ｆｃドメイン
(２) ロイシンジッパー
(３) サブユニット間のタンパク質−タンパク質相互作用
iv. 他の多量体化ドメイン
ｂ. ＨＡ結合を改善するための変異
ｃ. 検出のためのＨＡ結合タンパク質修飾
ｉ. 検出可能タンパク質または部分との結合
４. 診断使用のためのＨＡ結合タンパク質の選択
Ｄ. アッセイおよび分類
１. ヒアルロナン測定のためのアッセイ
ａ. 組織化学的および免疫組織化学的方法
ｂ. 固相結合アッセイ
ｃ. インビボ造影アッセイ
２. 対象の分類
Ｅ. 選択対象の抗ヒアルロナン剤での処置
１. 抗ヒアルロナン剤
ａ. ヒアルロナン合成を阻害する薬剤
ｂ. ヒアルロナン分解酵素群
ｉ. ヒアルロニダーゼ群
(１) 哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群
(ａ) ＰＨ２０
(２) その他のヒアルロニダーゼ群
(３) その他のヒアルロナン分解酵素群
ii. 可溶性ヒアルロナン分解酵素群
(１) 可溶性ヒトＰＨ２０
(２) ｒＨｕＰＨ２０
iii. ヒアルロナン分解酵素群のグリコシル化
iv. 修飾(ポリマー結合型)ヒアルロナン分解酵素群
２. 医薬組成物および製剤
３. 投与量および投与
ａ. ペグ化ヒアルロナン分解酵素の投与
４. 組み合わせ処置
Ｆ. ヒアルロナン分解酵素群およびヒアルロナン結合タンパク質の核酸およびコード化ポリペプチドの製造方法
１. ベクターおよび細胞
２. 発現
ａ. 原核細胞
ｂ. 酵母細胞
ｃ. 昆虫細胞
ｄ. 哺乳動物細胞
ｅ. 植物
３. 精製方法
４. ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドのペグ化
Ｇ. 抗ヒアルロナン剤の活性評価および効果モニタリングの方法
１. 副作用評価方法
２. 抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素活性)の活性と関連するバイオマーカーの評価
ａ. ヒアルロナン分解酵素の活性を評価するためのアッセイ
ｂ. ＨＡ異化産物の測定
ｃ. 腫瘍代謝活性
ｄ. 見かけの拡散増加および腫瘍灌流亢進
３. 腫瘍サイズおよび体積
４. 薬物動態および薬力学的アッセイ
Ｈ. キットおよび製品
Ｉ. 実施例

【0041】

Ａ. 定義
別に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して認識されるものと同じ意味を有する。特に断らない限り、本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイトおよび他の公表物は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。本明細書中で使用する用語に複数の定義があるときは、ここに記載したものが優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスが引用されているとき、このような識別子は変化することがあり、インターネット上の特定の情報は消去または挿入されるが、同等な情報は知られており、例えばインターネットおよび／または適当なデータベースの検索により容易に入手できると解釈すべきである。それらの引用は当該情報が入手可能であることおよび公衆に頒布されていることを証明する。

【0042】

ここで使用するコンパニオン診断は、特定の処置での処置に感受性の対象を同定するためまたは処置をモニターするためおよび／または対象または対象のサブグループもしくは他のグループの有効投与量を同定するために使用する診断方法およびまたは試薬である。本発明の目的のために、コンパニオン診断は、サンプル中のヒアルロナンの検出に使用する修飾ＴＳＧ−６タンパク質のような試薬を言う。コンパニオン診断は試薬およびまた該試薬を用いて行う試験も言う。

【0043】

ここで使用するヒアルロナン(ＨＡ；ヒアルロン酸またはヒアルロネートとしても知られる)は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＤ−グルクロン酸の反復二糖単位の天然に存在するポリマーを言う。ヒアルロナンはある種の腫瘍により産生される。

【0044】

組織または体液サンプル中のＨＡの量またはレベルに関連してここで使用する“高ＨＡ”は、正常または健常組織または体液サンプルと比較した組織または体液サンプル中のＨＡの程度または範囲を言う。ＨＡの量は、対応する正常または健常組織中のＨＡの量またはレベルより少なくとも正確にまたは少なくとも約２.５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍以上の量であるとき、高い。ＨＡの量は固相結合アッセイまたは組織化学的方法のような方法を使用して決定し、定量化または半定量化できる。例えば、量は血漿レベルの比較または組織化学的方法により決定する着色強度(例えば正画素のパーセント)の比較に基づき得る。例えば、組織化学的方法または他の方法によるＨＡスコアがＨＡ^＋３および／または腫瘍切片の２５％を超えるＨＡ着色があるならば、高ＨＡである。例えば、総着色面積の合計に対する強着色(例えば褐色着色)の比が、腫瘍組織の総着色に対して２５％を超える強度の着色があるとき、高ＨＡである。

【0045】

ここで使用するＨＡスコアは、腫瘍の細胞種および間質にかかるＨＡ陽性レベルの半定量的スコアを言う。スコアは、ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織のような腫瘍組織中の、ＨＡＢＰを使用するＨＡのための免疫組織化学的または擬似免疫組織化学的方法のような組織化学的方法による、ＨＡの検出により決定できる。細胞および間質上の染色の程度は、顕微鏡下に目視によりまたは利用可能なコンピュータアルゴリズムプログラムおよびソフトウェアにより決定できる。例えば、画像をＨＡ染色のための画素数アルゴリズム(例えばAperio Spectrumソフトウェアおよび着色の程度を測定または定量または半定量する他の標準的方法)を使用して定量的に分析できる。腫瘍は、腫瘍切片の２５％を超える強ＨＡ着色でＨＡ^高(ＨＡ^＋３)、腫瘍切片の１０〜２５％の強ＨＡ着色でＨＡ^中(ＨＡ^＋２)および腫瘍切片の１０％未満の強ＨＡ着色でＨＡ^低(ＨＡ^＋１)とグレード化またはスコア化される。例えば、強い正の着色(例えば褐色着色)対総着色面積の合計の比を計算およびスコア化でき、該比が総着色の２５％を超える強い正の着色であるとき、腫瘍組織はＨＡ^＋３とスコア化され、該比が総着色の１０〜２５％の強い正の着色であるとき、腫瘍組織はＨＡ^＋２とスコア化され、該比が総着色の１０％未満の強い正の着色であるとき、腫瘍組織はＨＡ^＋１とスコア化され、強い正の染色対総着色の比が０であるとき、腫瘍組織は０とスコア化される。Aperio方法、ならびにそのためのソフトウェアは当業者に知られている(例えば,米国特許番号８,０２３,７１４；米国特許番号７,２５７,２６８参照)。

【0046】

ここで使用するヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡ結合タンパク質；ＨＡＢＰ)またはヒアルアドヘリンは、ＨＡの検出を可能にするようにＨＡと特異的に結合する任意のタンパク質を言う。結合親和性は、少なくとも凡そまたは正確に少なくとも１０^７Ｍ^−１である結合定数Kaを有するものである。ここに提供する方法およびコンパニオン診断製品について、ＨＡ結合タンパク質は組み換えにより産生したまたは合成タンパク質であり、軟骨のような生物学的起源または生理的起源に由来するタンパク質ではない。ＨＡ結合タンパク質は、ＨＡに結合する結合モジュールおよびＨＡの検出を可能とするようにＨＡと特異的に結合するのに十分なその一部を含むＨＡ結合ドメインを含む。それゆえに、ＨＡＢＰ類は、ヒアルロナン結合領域またはドメインまたはＨＡと特異的に結合するのに十分なその一部を含む任意タンパク質を含む。ヒアルロナン結合領域の例は、結合モジュール(結合ドメイン)またはＧ１ドメインである。結合するのに十分な一部は、結合ドメインまたは結合モジュールの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５以上の連続アミノ酸を含む。ＨＡ結合タンパク質はまたＨＡ結合タンパク質および多量体化ドメインを含む１種以上の付加的ポリペプチドを含む融合タンパク質も含む。ＨＡ結合タンパク質の例は、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＴＳＧ−６、ＴＳＧ−６変異体、例えば、ＨＡ結合ドメインおよびＨＡと結合するその結合モジュールを含むポリペプチドを含むここに提供するものを含むが、これらに限定されない。

【0047】

ここで使用するヒアルロナン結合ドメインまたはＨＡ結合ドメインは、少なくとも凡そまたは正確に少なくとも１０^６Ｍ^−１または１０^７Ｍ^−１以上である結合定数Kaまたは多くても１０^−６Ｍまたは１０^−７Ｍ以下である解離定数Kdを有する結合親和性でヒアルロナンと特異的に結合するＨＡＢＰポリペプチドの領域またはドメインを言う。ヒアルロナン結合ドメインの例は、例えば、結合モジュール(ここでは結合ドメインとも言う)またはＧ１ドメインまたはＨＡと特異的に結合するのに十分な結合モジュールまたはＧ１ドメインの一部を含む。

【0048】

ここで使用する“唯一のＨＡＢＰ部分”は結合モジュールまたはＧ１ドメインであるという表現またはその文法的変形は、ＨＡＢＰ分子(例えばＴＳＧ−６結合モジュール)が結合モジュールまたはＧ１ドメインから成りまたは実質的にこれから成り、引用ＨＡＢＰの完全な完全長アミノ酸の配列を含まないことを言う。それゆえに、ＨＡＢＰはヒアルロナン結合領域またはＨＡに特異的に結合するために十分なその一部のみを含む。ＨＡＢＰは、検出可能部分または検出され得る部分または多量体化ドメインに対応する配列を含むが、これらに限定されない付加的非ＨＡＢＰアミノ酸配列を含み得る。

【0049】

ここで使用する修飾ＨＡ結合タンパク質に関する修飾は、ここに提供する診断方法における検出に対するＨＡ結合タンパク質の特性の１種以上を変える、典型的に改善するための修飾を言う。修飾は、ＨＡに対するタンパク質の親和性および／または特異性を高める変異を含む。

【0050】

ここで使用するドメインは、構造的におよび／または機能的に区別可能または限定可能なポリペプチドの部分(３個以上、一般的に５個または７個以上のアミノ酸の配列)を言う。例えば、ドメインは、１個以上の構造モチーフ(例えばループ領域により接続されたアルファ螺旋および／またはベータ鎖の組み合わせ)から成るタンパク質内に独立して折りたたみ構造を形成できるおよび／またはキナーゼ活性のような機能的活性により認識されるものを含む。タンパク質は１個、１個以上の異なるドメインを有し得る。例えば、ドメインは、細胞外ドメインを規定する相同性およびモチーフのような、関連するファミリーメンバーに対するその配列の相同性により同定でき、規定できまたは区別できる。他の例において、ドメインは、酵素活性、例えばキナーゼ活性のようなその機能またはＤＮＡ結合、リガンド結合および二量体化のような生体分子と相互作用する能力により区別できる。ドメインは個々に、ドメインが個々にまたは他の分子と融合して、例えばタンパク分解性活性またはリガンド結合のような活性を実行できるように、機能または活性を示しうる。ドメインはポリペプチド由来の直鎖アミノ酸の配列または非直鎖アミノ酸の配列であり得る。多くのポリペプチドは多数のドメインを含む。

【0051】

ここで使用する融合タンパク質は、直接的または間接的にペプチド結合を介して結合した２個以上のタンパク質またはペプチド由来の２個以上の部分を含むキメラタンパク質を言う。

【0052】

ここで使用する多量体化ドメインは、相補的多量体化ドメインを含む他のポリペプチド分子とのポリペプチド分子の安定な相互作用を促進するアミノ酸の配列を言い、相補的多量体化ドメインは、第一ドメインと安定な多量体を形成するための同一または異なる多量体化ドメインであり得る。一般的に、ポリペプチドは多量体化ドメインと直接的または間接的に結合する。多量体化ドメインの例は、免疫グロブリン配列またはその一部、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、ＰＫＡのＲサブユニットおよびアンカリングドメイン(ＡＤ)のような互換性タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、２分子間の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールおよび腔内隆起(すなわち、ノブ・イントゥ・ホール)および安定な多量体を形成する同一または類似サイズの代償性腔を含む。多量体化ドメインは、例えば、免疫グロブリン定常領域であり得る。免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭ由来のＦｃドメインまたはその一部のような免疫グロブリン定常ドメインであり得る。

【0053】

ここで使用する“ノブ・イントゥ・ホール”(ここでは腔内隆起とも呼ぶ)は、このようなドメイン間の立体的相互作用が、安定な相互作用を促進するだけでなく、また単量体混合物からホモ二量体(またはホモ多量体)よりもヘテロ二量体(または多量体)の形成を促進するように操作された特定の多量体化ドメインを言う。これは、例えば隆起および腔の構築により達成できる。隆起は、第一ポリペプチドの界面の小アミノ酸側鎖を大側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)に置き換えることにより構築できる。隆起と同一または類似サイズの代償性“腔”は、所望により、第二ポリペプチドの界面に、大アミノ酸側鎖を小側鎖(例えば、アラニンまたはスレオニン)に置き換えることにより構築してよい。

【0054】

ここで使用する相補的多量体化ドメインは、２個以上の多量体化ドメインを言い、これらは相互作用して互いにこのようなドメインで結合したポリペプチドの安定な多量体を形成する。相補的多量体化ドメインは同じドメインまたは例えば、Ｆｃ領域、ロイシンジッパーおよびノブ・アンド・ホールのようなドメインのファミリーのメンバーであり得る。

【0055】

ここで使用する“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”または“Ｆｃドメイン”は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン以外の抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドを言う。それゆえに、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの最後の２個の定常領域免疫グロブリンドメインまたはＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３個の定常領域免疫グロブリンドメインを言う。所望により、Ｆｃドメインは、これらのドメインの可動性ヒンジＮ末端の全てまたは一部を含み得るＩｇＡおよびＩｇＭについて、ＦｃはＪ鎖を含み得る。例として、ＩｇＧのＦｃドメインは免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３および所望によりＣγ１とＣγ２の間のヒンジの全てまたは一部を含む。Ｆｃ領域の境界は多様であり得るが、典型的に、少なくともヒンジ領域の部分を含む。さらに、Ｆｃはまたあらゆる対立形質または種変異体またはＦｃＲへの結合を変えるまたはＦｃ仲介エフェクター機能を変えるあらゆる変異体または修飾形態のようなあらゆる変異体または修飾形態も含む。修飾Ｆｃドメインを含む他のＦｃドメインの配列の例は知られている。

【0056】

ここで使用する“Ｆｃキメラ”は、１個以上ポリペプチドが、Ｆｃ領域またはその誘導体に直接的または間接的にしているキメラポリペプチドを言う。典型的に、Ｆｃキメラは、ある免疫グロブリンのＦｃ領域と例えばＥＣＤポリペプチドのような他のポリペプチドを合わせる。Ｆｃポリペプチドの誘導体または修飾は当業者に知られている。

【0057】

ここで使用するヒアルロナン結合タンパク質に関する“多量体”は、複数ＨＡ結合部位、例えば、少なくとも２個、３個または４個のＨＡ結合部位を含むＨＡＢＰを言う。例えば、ＨＡＢＰ多量体は、各々ＨＡに結合できる少なくとも２個の結合モジュールを含むＨＡＢＰを言う。例えば、多量体は、直接的または間接的に２個以上の結合モジュール(例えばＴＳＧ−６結合モジュール)を結合することにより製造できる。結合は、Ｆｃタンパク質のような多量体化ドメインの使用により促進できる。

【0058】

ここで使用する対立形質変異体または対立形質変異は、基準形態の遺伝子と異なる遺伝子によりコードされる(すなわち対立遺伝子によりコードされる)ポリペプチドを言う。典型的に基準形態の遺伝子は、種の基準メンバーの集団または単一のポリペプチドの野生型形態および／または優勢形態をコードする。典型的に、種間の変異体を含む対立形質変異体は、典型的に同じ種の野生型および／または優勢形態と少なくとも８０％、９０％以上のアミノ酸同一性を有し、同一性の程度は遺伝子および比較が種間または種内であるかによる。一般的に、種内対立形質変異体は、野生型および／または優勢形態と少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％以上の同一性を有し、ポリペプチドの野生型および／または優勢形態と９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を含む。

【0059】

ここで使用する種変異体は、種間の同じポリペプチドの変異体を言う。一般的に、種間変異体は、他の種の野生型および／または優勢形態と少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の同一性を有し、ポリペプチドの野生型および／または優勢形態と９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を含む。

【0060】

ここで使用するポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子のヌクレオチドの配列の修飾に関する修飾は、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。

【0061】

ここで使用する組成物はあらゆる混合物を言う。それは溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水溶液、非溶液またはこれらの任意の組み合わせを言う。

【0062】

ここで使用する組み合わせは、２個以上の物品のあらゆる結合を言う。組み合わせは２個の組成物または２個の収集物のような２個以上の別々の物品、２個以上の物品の単一混合物のようなそれらの混合物またはこれらのあらゆる変形であり得る。組み合わせの要素は、一般的に機能的に結合しまたは関連する。キットは、所望により組み合わせまたはその要素の使用支持を含んでよい包装された組み合わせである。

【0063】

ここで使用する正常レベルまたは値は当業者に知られた多様な方法により定義できる。典型的に、正常レベルは、健常集団のＨＡ発現レベルを言う。正常レベル(または参照レベル)は、特定の起源(すなわち血液、血清、組織または他の起源)由来のような健常対象の測定に基づく。しばしば、正常レベルは“正常範囲”として特定され、これは典型的に健常集団の中位９５％の値の範囲を言う。参考値をここでは正常レベルと同義で使用するが、対象または起源により正常レベルと異なり得る。参照レベルは、典型的に特定の集団の一部の正常レベルによる。それゆえに、本発明の目的のために、正常または参照レベルは、被験患者と比較できる予め決定された標準または対照である。

【0064】

ここで使用する増加したレベルは、ＨＡの量または発現の報告されるまたは正常の閾値を越えるあらゆるレベルを言う。

【0065】

ここで使用する生物学的サンプルは、生体起源またはウイルス起源または高分子および生体分子の他の起源から得られるあらゆるサンプルを言い、核酸またはタンパク質または他の高分子を得ることができる対象のあらゆる細胞型または組織を含む。生物学的サンプルは、生物学的起源から直接得られるサンプルまたは加工したサンプルであり得る。例えば、増幅した単離した核酸は生物学的サンプルを構築する。生物学的サンプルは、生検した腫瘍サンプルを含む動物の血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗のような体液、組織および臓器サンプルを含むが、これらに限定されない。

【0066】

ここで使用する検出は、タンパク質の可視化(眼または機器による)を可能にする方法を含む。タンパク質は、該タンパク質に特異的な抗体を使用して可視化できる。タンパク質の検出はまたエピトープタグを含むタグまたは標識とタンパク質との融合により容易になり得る。

【0067】

ここで使用する標識は、標識ポリペプチドを産生するように直接的または間接的にポリペプチドと結合する検出可能な化合物または組成物を言う。標識はそれ自体検出可能(例えば、放射性同位体標識または蛍光標識)であるか、酵素標識の場合、基質化合物の検出可能組成物への化学変換を触媒できる。標識の例は、蛍光部分、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない。

【0068】

ここで使用する親和性は、ヒアルロナン結合タンパク質とヒアルロナンのような２分子間の相互作用の強度を言う。親和性は、しばしば、平衡結合定数(Ka)または平衡解離定数(Kd)により測定する。ここに記載する分子の間の結合親和性は、典型的に少なくとも約１０^６ｌ／mol、１０^７ｌ／mol、１０^８ｌ／mol、１０^９ｌ／mol以上(一般的に１０^７〜１０^８ｌ／mol以上)の結合定数(Ka)の結合親和性を有する。ここに記載する分子の間の結合親和性はまた解離定数(Kd)に基づき、少なくとも多くてもまたは多くてもまたは正確に１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍ以下と言うこともできる。

【0069】

ここで使用するＨＡと結合するのに十分なその一部なる記載は、ＨＡに対して少なくとも正確にまたは少なくとも約１０^７〜１０^８Ｍ^−１のKaまたは１×１０^−７Ｍまたは１×１０^−８Ｍ以下の解離定数(Kd)を示す結合分子を意味する。

【0070】

ここで使用する、ヒアルロナン結合タンパク質とＨＡに関するような２分子に関する特異性(本明細書では選択的とも言う)は、他の分子との親和性と比較して、２分子が互いに大きな親和性を示すことを言う。それゆえに、ＨＡに大きな特異性のヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)は、それがヘパリンのような他の分子に、ＨＡと結合するより低い親和性で結合することを意味する。特異的結合は、典型的に選択的結合となる。

【0071】

ここで使用する“Ｇ１ドメイン”は、タイプＣ ＨＡ結合タンパク質のＨＡ結合ドメインを言う。Ｇ１ドメインはＩｇモジュールおよび２個の結合モジュールを含む。Ｇ１ドメインを含むタンパク質の例は、ＨＡＰＬＮ１／結合タンパク質、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカンおよびホスファカンを含む。

【0072】

ここで使用する結合モジュールまたは結合ドメインは、同義であり、タンパク質に存在し、ＨＡへの結合を促進し、細胞外マトリックスの集合、細胞接着および遊走に関与するヒアルロナン結合ドメインである。例えば、ヒトＴＳＧ−６由来の結合モジュールは、疎水性コアに配置された２個のアルファ螺旋および２個の逆平行ベータシートを含む。これは、ＣＤ４４、ＴＳＧ−６、軟骨結合タンパク質、アグリカンおよびここに記載するその他を含む結合モジュールスーパーファミリーのコンセンサスフォールドを規定する。

【0073】

ここで使用する“Ｉｇモジュール”は、タイプＣ ＨＡＢＰ類間の結合に関与するタイプＣ ＨＡＢＰ類のＧ１ドメインの部分を言う。タイプＣヒアルロナン類のＩｇモジュールは互いに相互作用して、ヒアルロナンと安定な三次構造を形成する。

【0074】

ここで使用する“固相結合アッセイ”は、抗原をリガンドと接触させ、ここでで、抗原またはリガンドの一方が固体支持体と結合している、インビトロアッセイを言う。固相は、成分が固体支持体に物理的に固定化されるものであり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート、膜(例えば、ニトロセルロース)、ビーズ、試験紙、薄層クロマトグラフィープレートまたは他の固体媒体を含むが、これらに限定されない。抗原−リガンド相互作用により、望まないまたは非特異的成分を除去でき(例えば洗浄により)、抗原−リガンド複合体を検出する。

【0075】

ここで使用するヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤での処置の効果を予測は、コンパニオン診断が、ヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤での処置の予後診断指標であり得ることを意味する。例えば、コンパニオン診断でのヒアルロナンまたは他のマーカーの検出の結果に基づき、ヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤での処置が、処置対象において何らかの効果を有する可能性があることを検出できる。

【0076】

ここで使用する予後診断指標は、処置が特定の疾患または対象に有効である可能性のような特定の成績の可能性を示すパラメータを言う。

【0077】

ここで使用するサンプル中の上昇したＨＡは、健常サンプルからの対応するサンプルに存在するレベルと比較してまたは予め決定した標準と比較して増加しているサンプル中のＨＡの量を言う。

【0078】

ここで使用する上昇したヒアルロナンレベルは、該疾患の結果としてまたは該疾患で別に観察される、疾患または状態によって特定の組織、体液または細胞における、ヒアルロナンの量である。例えば、ヒアルロナン富腫瘍の存在の結果として、ヒアルロナン(ＨＡ)レベルは血液、尿、唾液および血清のような体液および／または腫瘍性組織または細胞で上昇し得る。レベルを、腫瘍を有しない対象のようなＨＡ関連疾患を有しない対象からの同等なサンプルのような標準または他の適切な対照と比較できる。

【0079】

ここで使用する対応する残基は、整列させた座に生じる残基を言う。関連するまたは変異体ポリペプチドを、当業者に知られた任意の方法で整列する。このような方法は、典型的に適合を最大化し、手動整列を使用するようなおよび多くの利用可能な整列プログラム(例えば、ＢＬＡＳＴＰ)および当業者に知られたその他を使用するような方法を含む。ポリペプチドの配列の整列により、当業者は、保存されたおよび同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して対応する残基を同定できる。対応する位置また、例えばタンパク質構造のコンピュータ・シミュレーションした配列を使用することによる、構造配列にも基づき得る。他の例において、対応する領域を同定できる。

【0080】

ここで使用する抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン(ＨＡ)合成または分解を調節し、それにより組織または細胞中のヒアルロナンレベルを変えるあらゆる薬剤を言う。本発明の目的のために、抗ヒアルロナン剤は、該薬剤の非存在下と比較して組織または細胞のヒアルロナンレベルを減少させる。このような薬物は、ＨＡシンターゼ(ＨＡＳ)および他の酵素群をコードする遺伝子材料またはヒアルロナン代謝に関与する受容体の発現を調節するまたはＨＡＳ機能または活性を含むヒアルロナンを合成または分解するタンパク質を調節する化合物を含む。薬物は、小分子、核酸、ペプチド、タンパク質または他の化合物を含む。例えば、抗ヒアルロナン剤は、アンチセンスまたはセンス分子、抗体、酵素群、小分子阻害剤およびＨＡＳ基質アナログを含むが、これらに限定されない。

【0081】

ここで使用するヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンポリマー(ヒアルロン酸またはＨＡとも呼ぶ)の小分子量フラグメントへの開裂を触媒する酵素である。ヒアルロナン分解酵素群の例は、ヒアルロニダーゼ群およびヒアルロナンを脱重合する能力を有する特定のコンドロイチナーゼ群およびリアーゼ群である。ヒアルロナン分解酵素群であるコンドロイチナーゼ群の例は、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ(コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られる)、コンドロイチンＡＣリアーゼ(コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる)およびコンドロイチンＣリアーゼを含むが、これらに限定されない。コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエンドリアーゼ(EC 4.2.2.20)およびコンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ(EC 4.2.2.21)の２酵素群を含む。コンドロイチン硫酸ＡＢＣエンドリアーゼ群およびコンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ群の例は、プロテウス・ブルガリスおよびペドバクター・ヘパリナス由来のもの(プロテウス・ブルガリスコンドロイチン硫酸ＡＢＣエンドリアーゼは配列番号９８に示す；Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)を含むが、これに限定されない。細菌由来のコンドロイチナーゼＡＣ酵素群の例は、ペドバクター・ヘパリナス(配列番号９９に示す)、ビクチバリス・バデンシス(配列番号１００に示す)およびアルスロバクター・アウレッセンス(Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)由来のものを含むが、これらに限定されない。細菌由来のコンドロイチナーゼＣ酵素群の例は、ストレプトコッカス属およびフラボバクテリウム属由来のものを含むが、これらに限定されない(Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4;Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)。

【0082】

ここで使用するヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素群のクラスを言う。ヒアルロニダーゼ群は、細菌ヒアルロニダーゼ群(EC 4.2.2.1またはEC 4.2.99.1)、ヒル類、他の寄生虫、および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.36)、および哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.35)を含む。ヒアルロニダーゼ群は、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、サカナ、カエル、細菌を含むが、これらに限定されないすべての非ヒト起源、およびヒル類、他の寄生虫、および甲殻類のすべてを含む。非ヒトヒアルロニダーゼ群の例は、ウシ(配列番号１０、１１、６４およびＢＨ５５(米国特許５,７４７,０２７および５,８２７,７２１)、スズメバチ(配列番号１２および１３)、ミツバチ(配列番号１４)、北米産スズメバチ(配列番号１５)、アシナガバチ(配列番号１６)、マウス(配列番号１７〜１９、３２)、ブタ(配列番号２０〜２１)、ラット(配列番号２２〜２４、３１)、ウサギ(配列番号２５)、ヒツジ(配列番号２６、２７、６３および６５)、チンパンジー(配列番号１０１)、アカゲザル(配列番号１０２)、オランウータン(配列番号２８)、カニクイザル(配列番号２９)、モルモット(配列番号３０)、アルスロバクター属(株ＦＢ２４)(配列番号６７)、ブデロビブリオ・バクテリオヴォルス(配列番号６８)、プロピオニバクテリウム・アクネス(配列番号６９)、ストレプトコッカス・アガラクチア(配列番号７０)；１８ＲＳ２１(配列番号７１)；血清型Ｉａ(配列番号７２)；血清型III(配列番号７３)、黄色ブドウ球菌(株COL)(配列番号７４)；株MRSA252(配列番号７５および７６)；株MSSA476(配列番号７７)；株NCTC 8325(配列番号７８)；株ウシＲＦ１２２(配列番号７９および８０)；株USA300(配列番号８１)、肺炎レンサ球菌(配列番号８２)；株ATCC BAA-255/R6(配列番号８３)；血清型２、株D39/NCTC 7466(配列番号８４)、Ａ群溶血レンサ球菌(血清型Ｍ１)(配列番号８５)；血清型Ｍ２、株MGAS10270(配列番号８６)；血清型Ｍ４、株ＭGAS10750(配列番号８７)；血清型Ｍ６(配列番号８８)；血清型M12、株MGAS2096(配列番号８９および９０)；血清型Ｍ１２、株MGAS9429(配列番号９１)；血清型Ｍ２８(配列番号９２)；豚レンサ球菌(配列番号９３〜９５)；ビブリオ・フィッシェリ(株ATCC 700601/ES114(配列番号９６))由来のヒアルロニダーゼ群、およびヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を開裂しないストレプトマイセス・ヒアルロノリチクスヒアルロニダーゼ酵素を含むが、これらに限定されない(Ohya, T. and Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)。ヒアルロニダーゼ群はまたヒト起源のものを含む。ヒトヒアルロニダーゼ群の例は、ＨＹＡＬ１(配列番号３６)、ＨＹＡＬ２(配列番号３７)、ＨＹＡＬ３(配列番号３８)、ＨＹＡＬ４(配列番号３９)およびＰＨ２０(配列番号１)を含む。ヒアルロニダーゼ群に含まれるのはまた、ヒツジおよびウシＰＨ２０、可溶性ヒトＰＨ２０および可溶性ｒＨｕＰＨ２０を含む可溶性ヒアルロニダーゼ群である。市販のウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼ群の例は、Vitrase(登録商標)(ヒツジヒアルロニダーゼ)、Amphadase(登録商標)(ウシヒアルロニダーゼ)およびHydase^ＴＭ(ウシヒアルロニダーゼ)を含む。

【0083】

ここで使用する“精製ウシ精巣ヒアルロニダーゼ”は、ウシ精巣抽出物から精製したウシヒアルロニダーゼを言う(米国特許番号２,４８８,５６４、２,４８８,５６５、２,８０６,８１５、２,８０８,３６２、２,６７６,１３９、２,７９５,５２９、５,７４７,０２７および５,８２７,７２１参照)。市販の精製ウシ精巣ヒアルロニダーゼ群の例は、Amphadase(登録商標)およびHydase^ＴＭおよびSigma Aldrich、Abnova、EMD Chemicals、GenWay Biotech, Inc.、Raybiotech, Inc.およびCalzymeから入手可能なものを含むが、これらに限定されないウシヒアルロニダーゼ群を含む。また包含されるのは、配列番号１９０〜１９２のいずれかに示した核酸分子の発現により産生されるものを含むが、これに限定されない、組み換えにより産生したウシヒアルロニダーゼ群である。

【0084】

ここで使用する“精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ”は、ヒツジ精巣抽出物から精製したヒツジヒアルロニダーゼを言う(米国特許番号２,４８８,５６４、２,４８８,５６５および２,８０６,８１５および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００５／１１８７９９参照)。市販の精製ヒツジ精巣抽出物の例は、Vitrase(登録商標)およびSigma Aldrich、Cell Sciences、EMD Chemicals、GenWay Biotech, Inc.、Mybiosource.comおよびRaybiotech, Inc.から入手可能なものを含むが、これらに限定されないヒツジヒアルロニダーゼ群を含む。また包含されるのは、配列番号６６および１９３〜１９４のいずれかに示した核酸分子の発現により産生されるものを含むが、これに限定されない、組み換えにより産生したヒツジヒアルロニダーゼ群である。

【0085】

ここで使用する“ＰＨ２０”は、精子に存在し、天然に活性のヒアルロニダーゼのタイプを言う。ＰＨ−２０は精子表面および内部アクロソーム膜に結合する場所であるリソソーム由来アクロソームで発生する。ＰＨ２０は、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ウシ、ヒツジ、モルモット、ウサギおよびラット起源のものを含むが、これらに限定されず、あらゆる起源のものを含む。ＰＨ２０ポリペプチドの例は、ヒト(配列番号１)、チンパンジー(配列番号１０１)、アカゲザル(配列番号１０２)、カニクイザル(配列番号２９)、ウシ(配列番号１１および６４)、マウス(配列番号３２)、ラット(配列番号３１)、ウサギ(配列番号２５)、ヒツジ(配列番号２７、６３および６５)およびモルモット(配列番号３０)のものを含む。

【0086】

ヒアルロナン分解酵素群の記載は、前駆体ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドおよび成熟ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド(例えばシグナル配列が除去されているもの)、活性を有するその切断型を含み、対立形質変異体および種変異体、スプライス変異体によりコードされる変異体および配列番号１および１０〜４８、６３〜６５、６７〜１０２に示す前駆体ポリペプチドまたはその成熟形態と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示すポリペプチドを含む、他の変異体を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素の記載は、配列番号５０〜５１に示すヒトＰＨ２０前駆体ポリペプチド変異体も含む。ヒアルロナン分解酵素群はまた化学的または翻訳後修飾を含むものおよび化学的または翻訳後修飾を含まないものも含む。このような修飾は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化および当分野で知られる他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。切断型ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、その任意のＣ末端短縮形態、特に切断され、Ｎ−グリコシル化されたとき中性活性である形態である。

【0087】

ここで使用する“可溶性ＰＨ２０”は、生理学的条件下で可溶性であるＰＨ２０のあらゆる形態を言う。可溶性ＰＨ２０は、例えば、３７℃でのTriton(登録商標)X-114溶液の水相へのその分配により同定できる(Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7)。ＧＰＩ固定ＰＨ２０を含む脂質固定ＰＨ２０のような膜固定ＰＨ２０は、界面活性剤富相に分配するが、ホスホリパーゼ−Ｃでの処理後界面活性剤貧または水相に分配する。可溶性ＰＨ２０に含まれるのは、ＰＨ２０の膜へのアンカリングと関連する１個以上の領域が除去または修飾されており、ここで、可溶性形態はヒアルロニダーゼ活性を維持する、膜固定ＰＨ２０である。可溶性ＰＨ２０はまた組み換え可溶性ＰＨ２０および、例えばヒツジまたはウシの精巣抽出物のような天然起源に含まれるまたはそこから精製されたものを含む。このような可溶性ＰＨ２０の例は可溶性ヒトＰＨ２０である。

【0088】

ここで使用する可溶性ヒトＰＨ２０またはｓＨｕＰＨ２０は、発現により、ポリペプチドが生理学的条件下で可溶性となるように、Ｃ末端のグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカー配列の全てまたは一部を欠くＰＨ２０ポリペプチドを言う。溶解度は、生理学的条件下溶解度を証明する任意の適切な方法で評価できる。このような方法の例は、水相への分配を評価し、本明細書に記載するTriton(登録商標)X-114アッセイである。さらに、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、ＣＨＯ−Ｓ細胞のようなＣＨＯ細胞で産生されるならば、発現され、細胞培養培地に分泌されるポリペプチドである。可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、しかしながら、ＣＨＯ細胞で産生されるものに限定されず、あらゆる細胞でまたは組み換え発現およびポリペプチド合成を含むあらゆる方法で産生できる。ＣＨＯ細胞における分泌の記載は定義されている。それゆえに、ポリペプチドがＣＨＯ細胞で発現および分泌され、可溶性であるならば、すなわちTriton(登録商標)X-114で中移出したとき水相に分配されるならば、このように産生されたかどうかに係らず可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドの前駆体ポリペプチドは異種または非異種(すなわち天然)シグナル配列のようなシグナル配列を含み得る。前駆体の例は、アミノ酸位置１〜３５の天然３５アミノ酸シグナル配列(例えば、配列番号１のアミノ酸１〜３５参照)のようなシグナル配列を含むものである。

【0089】

ここで使用する“拡大可溶性ＰＨ２０”または“ｅｓＰＨ２０”は、ｅｓＰＨ２０が生理学的条件下で可溶性であるように、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列までの残基およびＧＰＩアンカー結合シグナル配列からの１個以上の近接残基を含む、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを言う。生理学的条件下の溶解度は当業者に知られたあらゆる方法で決定できる。例えば、上におよび実施例に記載したTriton(登録商標)X-114アッセイで評価できる。さらに、上記のとおり、可溶性ＰＨ２０は、ＣＨＯ−Ｓ細胞のようなＣＨＯ細胞で産生されるならば、発現され、細胞培養培地に分泌されるポリペプチドである。可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチド、しかしながら、ＣＨＯ細胞で産生されるものに限定されず、あらゆる細胞でまたは組み換え発現およびポリペプチド合成を含むあらゆる方法で産生できる。ＣＨＯ細胞における分泌の記載は定義されている。それゆえに、ポリペプチドがＣＨＯ細胞で発現および分泌され、可溶性であるならば、すなわちTriton(登録商標)X-114で中移出したとき水相に分配されるならば、このように産生されたかどうかに係らず可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。ヒト可溶性ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、残基３６〜４９０に加えて、得られたポリペプチドが可溶性であるように、配列番号１のアミノ酸残基位置４９１からの１個以上の近接アミノ酸を含む。ヒトｅｓＰＨ２０可溶性ポリペプチドの例は、配列番号１のアミノ酸３６〜４９１、３６〜４９２、３６〜４９３、３６〜４９４、３６〜４９５、３６〜４９６および３６〜４９７に対応するアミノ酸残基を有するものである。これらの例は、配列番号１５１〜１５４および１８５〜１８７のいずれかに示すアミノ酸配列を有するものである。また包含されるのは、中性活性を維持し、可溶性である、配列番号１５１〜１５４および１８５〜１８７の対応するポリペプチドと４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性のいずれかのような対立形質変異体および他の変異体である。配列同一性の記載は、アミノ酸置換を有する変異体を言う。

【0090】

ここで使用する“ｅｓＰＨ２０ｓ”は、前駆体ｅｓＰＨ２０ポリペプチドおよび成熟ｅｓＰＨ２０ポリペプチド(例えばシグナル配列が除去されているもの)、酵素活性(完全長形態の少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上を維持)を有するその切断型を含み、可溶性であり、対立形質変異体および種変異体、スプライス変異体によりコードされる変異体および配列番号１および３に示す前駆体ポリペプチドまたはその成熟形態と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む他の変異体を含む。

【0091】

ここで使用する“ｅｓＰＨ２０ｓ”はまた化学的または翻訳後修飾を含むものおよび化学的または翻訳後修飾を含まないものを含む。このような修飾ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化および当分野で知られる他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。

【0092】

ここで使用する“可溶性組み換えヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)”は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で組み換えにより発現され、分泌された可溶性形態のヒトＰＨ２０を含む組成物を言う。可溶性ｒＨｕＰＨ２０はシグナル配列を含む核酸分子によりコードされ、配列番号４９に示す。可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸は成熟ポリペプチドを分泌するＣＨＯ細胞で発現される。培養培地で産生されたら、Ｃ末端が不均一であり、それゆえに、生成物は種々の豊富さでＰＨ２０のアミノ酸３６〜４８１および３６〜４８２の任意の１個以上(例えば、配列番号４〜配列番号９)を含み得る、種々の混合物を含む。

【0093】

同様に、ｅｓＰＨ２０ｓのような他の形態のＰＨ２０について、組み換えにより発現されたポリペプチドおよびその組成物は、Ｃ末端が不均一である多様な種を含み得る。例えば、アミノ酸３６〜４９７を有するｅｓＰＨ２０をコードする配列番号１５１のポリペプチドの発現により産生した組み換えにより発現したｅｓＰＨ２０の組成物は、３６〜４９６、３６〜４９５のような少ないアミノ酸の形態を含み得る。

【0094】

ここで使用する“Ｎ結合部分”は、ポリペプチドの翻訳後修飾によりグリコシル化できるポリペプチドのアスパラギン(Ｎ)アミノ酸残基を言う。ヒトＰＨ２０のＮ結合部分の例は、配列番号１に示すヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３を含む。

【0095】

ここで使用する“Ｎ−グリコシル化ポリペプチド”は、少なくとも３個のＮ結合したアミノ酸残基、例えば、配列番号１のアミノ酸残基Ｎ２３５、Ｎ３６８およびＮ３９３に対応するＮ結合部分のオリゴ糖結合を含む、ＰＨ２０ポリペプチドまたはその切断型を言う。Ｎ−グリコシル化ポリペプチドは、３個、４個、５個および最大で全てのＮ結合部分がオリゴ糖に結合しているポリペプチドを含む。Ｎ結合オリゴ糖類はオリゴマンノース、複合体、ハイブリッドまたは硫酸化オリゴ糖類または他のオリゴ糖類および単糖類を含む。

【0096】

ここで使用する“一部Ｎ−グリコシル化されたポリペプチド”は、少なくとも３個のＮ結合部分に結合したＮ−アセチルグルコサミングリカンを最小限に含むポリペプチドを言う。一部グリコシル化されたポリペプチドは、ポリペプチドをＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２および／またはＥｎｄｏＦ３で処理して形成したものを含む、単糖類、オリゴ糖類および分枝糖形態を含む、種々のグリカン形態を含み得る。

【0097】

ここで使用する“脱グリコシル化ＰＨ２０ポリペプチド”は、グリコシル化可能なすべての部位より少ない部位がグリコシル化されているＰＨ２０ポリペプチドを言う。脱グリコシル化は、例えば、グリコシル化を除きもしくは妨げることによりまたはグリコシル化部位を除去するようにポリペプチドを修飾することにより行うことができる。特定のＮ−グリコシル化部位は活性に必要ないが、他の部位は必要である。

【0098】

ここで使用する“ペグ化”は、典型的に、ヒアルロナン分解酵素の半減期を延長するための、ポリエチレングリコール(ペグ化部分ＰＥＧ)のような重合体分子の、ヒアルロニダーゼ群のようなヒアルロナン分解酵素群への共有結合または他の安定な結合を言う。

【0099】

ここで使用する“コンジュゲート”は、１個以上の他のポリペプチドまたは化学的部分に直接的または間接的に結合したポリペプチドを言う。このようなコンジュゲートは、化学的結合により産生された融合タンパク質および任意の他の方法で産生された融合タンパク質を含む。例えば、コンジュゲートは、１個以上の他のポリペプチドまたは化学的部分に直接的または間接的に結合した可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを言い、これにより、コンジュゲートがヒアルロニダーゼ活性を維持する限り、少なくとも１個の可溶性ＰＨ２０ポリペプチドが他のポリペプチドまたは化学的部分に直接的または間接的に結合する。

【0100】

ここで使用する“融合”タンパク質は、１個の核酸分子由来のコーディング配列および他の核酸分子由来のコーディング配列を含む核酸配列によりコードされたポリペプチドを言い、ここで、これらのコーディング配列は、融合構築物が宿主細胞で転写および翻訳されるとき同じ読み取り枠にあり、害タンパク質は２個のタンパク質を含んで産生される。２個の分子は構築物で隣接しているかまたは、１個、２個、３個以上であるが、典型的に１０個、９個、８個、７個または６個より少ないアミノ酸を含むリンカーポリペプチドで離されていてよい。融合構築物によりコードされるタンパク質産物は融合ポリペプチドと言う。

【0101】

ここで使用する“ポリマー”は、ポリペプチドに結合、すなわち直接的またはリンカーを介して間接的に安定に結合しているあらゆる高分子量の天然または合成部分を言う。このようなポリマー類は、典型的に血清半減期を延長し、シアル酸部分、ペグ化部分、デキストランおよびグリコシル化のためのような糖および他の部分を含むが、これらに限定されない。例えば、可溶性ＰＨ２０またはｒＨｕＰＨ２０のようなヒアルロニダーゼ群はポリマーと結合できる。

【0102】

ここで使用するヒアルロニダーゼ基質は、ヒアルロニダーゼ酵素により開裂および／または脱重合する基質(例えばタンパク質または多糖)を言う。一般的に、ヒアルロニダーゼ基質はグリコサミノグリカンである。ヒアルロニダーゼ基質の例はヒアルロナン(ＨＡ)である。

【0103】

ここで使用するヒアルロナン関連疾患、障害または状態は、ヒアルロナンレベル上昇が疾患または状態の原因として、結果としてまたは他態様で観察されるあらゆる疾患または状態を言う。ヒアルロナン関連疾患および状態は、組織または細胞の上昇したヒアルロナン発現、上昇した間質性流体圧、低下した血管容積および／または組織中の上昇した含水量と関連する。ヒアルロナン関連疾患、障害または状態は、ヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤を含む組成物を単独でまたは他の処置および／または薬物と組み合わせてまたは加えて投与することにより処置できる。疾患および状態の例は、炎症性疾患および高ヒアルロナン腫瘍を含むが、これに限定されない。高ヒアルロナン腫瘍は、例えば、末期癌、転移癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、前立腺癌、膵癌、非小細胞性肺癌、乳癌、結腸癌およびその他の癌のような固形腫瘍を含む腫瘍である。またヒアルロナン関連疾患および状態の例は、排出圧および浮腫と関連する疾患、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷またはその他の傷害が原因の浮腫のような上昇した間質性流体圧と関連する疾患を含む。ヒアルロナン関連疾患および状態の例は、癌、排出圧および浮腫を含む、上昇した間質性流体圧、低下した血管容積および／または組織における上昇した含水量と関連する疾患および状態を含む。一例として、ヒアルロナン関連状態、疾患または障害の処置は、上昇した間質性流体圧(ＩＦＰ)、低下した血管容積および組織における上昇した水含量の１種以上の改善、軽減または他の有益な効果を含む。

【0104】

ここで使用する“活性”は、完全長(完全)タンパク質と関連するポリペプチドまたはその一部の１種またはそれ以上の機能的活性を言う。例えば、ポリペプチドの活性フラグメントは完全長タンパク質の活性を示し得る。機能的活性は、生物活性、触媒的または酵素活性、抗原性(ポリペプチドと結合する抗ポリペプチド抗体に対して結合を競合する能力)、免疫原性、多量体形成能およびポリペプチドに対する受容体またはリガンドと特異的に結合する能力を含むが、これらに限定されない。

【0105】

ここで使用する“ヒアルロニダーゼ活性”は、ヒアルロン酸の開裂を酵素的に触媒する能力を言う。米国薬局方(ＵＳＰ)XXIIのヒアルロニダーゼアッセイは、酵素を３０分間、３７℃でＨＡを反応させた後の(ＨＡ)基質である高分子量ヒアルロン酸またはヒアルロナンの量を測定することにより間接的にヒアルロニダーゼ活性を測定する(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD)。あらゆるヒアルロニダーゼの相対的活性を単位で確認するために、アッセイにおいて標品溶液を使用できる。可溶性ＰＨ２０およびｅｓＰＨ２０を含むＰＨ２０のようなヒアルロニダーゼ群のヒアルロニダーゼ活性を測定するためのインビトロアッセイは当分野で知られ、ここに記載されている。アッセイの例は、非開裂ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合したときに形成される不溶性沈殿を検出することによりヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸開裂を間接的に測定する微少濁度アッセイおよびストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発色性基質を用いてマイクロタイタープレートウェルに非教諭結合的に結合した残っているビオチニル化−ヒアルロン酸を間接的に検出することによりヒアルロン酸の開裂を測定するビオチニル化−ヒアルロン酸アッセイである。試験するヒアルロニダーゼの活性を単位で決定するために、例えば、標準曲線を作成するために、標品を使用できる。

【0106】

ここで使用する比活性は、タンパク質mgあたりの活性の単位を言う。ヒアルロニダーゼのミリグラムは、Ｍ^−１cm^−１の単位で分子吸光係数を約１.７として、２８０nmにおける溶液吸光度により規定する。

【0107】

ここで使用する“中性活性”は、中性ｐＨ(例えば正確にまたは約ｐＨ７.０)でヒアルロン酸開裂を酵素的に触媒するＰＨ２０ポリペプチドの能力を言う。一般的に、中性活性および可溶性ＰＨ２０、例えば、Ｃ末端切断されたまたは一部Ｎ−グリコシル化されたＰＨ２０は、Ｃ末端切断または一部Ｎ−グリコシル化されていない対応する中性活性ＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性と比較して、正確にまたは約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％以上の活性を有する。

【0108】

ここで使用する“ＧＰＩアンカー結合シグナル配列”は、ＥＲの管腔内のポリペプチドへの予め形成されたＧＰＩアンカーの付加を指示するＣ末端アミノ酸の配列を言う。ＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、ＧＰＩ固定ＰＨ２０ポリペプチドのようなＧＰＩ固定ポリペプチドの前駆体ポリペプチドに存在する。Ｃ末端ＧＰＩアンカー結合シグナル配列は、典型的にω−部位またはＧＰＩアンカー結合部位の直ぐ下流に、８〜１２アミノ酸の親水性スペーサー領域が先行する８〜２０アミノ酸の優勢疎水性領域を含む。ＧＰＩアンカー結合シグナル配列は当分野で周知の方法を使用して同定できる。これらは、インシリコ法およびアルゴリズム(例えばUdenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758, Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392)であり、ExPASy Proteomics tools site (e.g., the WorldWideWeb site expasy.ch/tools/参照)ようなウェブサイトを含む。

【0109】

ここで使用する“核酸”はペプチド核酸(ＰＮＡ)およびそれらの混合物を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類似体を含む。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。所望により蛍光または放射標識のような検出可能な標識で標識されていてよいプローブまたはプライマーを言うとき、一本鎖分子が意図される。このような分子は、典型的にライブラリーのプロービングまたはプライミングのために、その標的が統計学的に独特であるような長さまたは低コピー数(典型的に多くても５、一般的に多くても３)である。一般的にプローブまたはプライマーは、目的の遺伝子に相補的または同一の少なくとも１４個、１６個または３０個の近接ヌクレオチドの配列を含む。プローブおよびプライマーは１０、２０、３０、５０、１００以上の核酸長であり得る。

【0110】

ここで使用するペプチドは、２以上のアミノ酸長でありおよび４０以下のアミノ酸長であるポリペプチドを言う。

【0111】

ここに記載する種々のアミノ酸配列に存在するアミノ酸は、周知の、３文字または１文字略語で示す(表１)。種々の核酸フラグメントにおける溶液存在するヌクレオチドは、当分野で慣用的に使用されている標準１文字記号により記載する。

【0112】

ここで使用する“アミノ酸”は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは２個以上のアミノ酸を含む。本発明の目的上、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログ(すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸)を含む。

【0113】

ここで使用する“アミノ酸残基”は、ポリペプチドのペプチド結合の化学分解(加水分解)により形成されたアミノ酸を言う。ここに記載するアミノ酸残基は、“Ｌ”異性体形態であると推定される。“Ｄ”異性体形態の残基は、その旨が表記されているが、所望の機能的特性がポリペプチドにより維持する限り、何れかのＬ−アミノ酸残基と置き換えられ得る。ＮＨ_２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を言う。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を言う。J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載され、37 C.F.R. §§ 1.821-1.822に再用された標準ポリペプチド命名法を遵守して、アミノ酸残基の略語を表１に示す。

【表1】

【0114】

ここで使用する式で表されるアミノ酸配列は、全て、左から右に、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう通常の向きで表されている。また、“アミノ酸残基”という表現は、対応表(表１)に挙げたアミノ酸ならびに修飾アミノ酸および異常アミノ酸、例えば３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§§１.８２１〜１.８２２で使用され引用により本明細書に組み込まれるものを包含すると定義される。さらにまた、アミノ酸配列の最初または最後にあるハイフン記号は、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合、アミノ末端基(例えばＮＨ_２)またはカルボキシル末端基(例えばＣＯＯＨ)へのペプチド結合を示す。

【0115】

ここで使用する“天然に存在するα−アミノ酸”とは、ヒトにおけるその関連するｍＲＮＡコドンによる負荷ｔＲＮＡ分子の特異的認識によりタンパク質に取り込まれる天然に見られる２０種のα−アミノ酸の残基である。天然に存在しないアミノ酸は、それゆえに、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸のアナログを含み、アミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、これに限定されない。天然に存在しないアミノ酸の例はここに記載されており、当業者に知られている。

【0116】

ここで使用するＤＮＡ構築物は、ＤＮＡのセグメントが自然界には見いだされない形で組み合わされ隣接して配置されている一本鎖または二本鎖の線状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、人為的操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。

【0117】

ここで使用するＤＮＡセグメントは、指定された属性を持つ、より大きなＤＮＡ分子の一部分である。例えば、指定されたポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミドフラグメントのような、より長いＤＮＡ分子の一部であって、５’から３’に向かう方向に読んだ場合に、指定されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードするものである。

【0118】

ここで使用する用語ポリヌクレオチドは、５’端から３’端に向かって読み取られるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドにはＲＮＡおよびＤＮＡが包含され、自然起源から単離するか、インビトロで合成するか、天然分子と合成分子の組合せから製造することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書では、ヌクレオチド(“ｎｔ”と略記)または塩基対(“ｂｐ”と略記)で記載される。ヌクレオチドという用語は、文脈に応じて、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であると理解される。二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖の長さがわずかに異なり得ること、およびそれらの末端がずれていてもよいこと、したがって二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対を形成しているとは限らないことは、当業者が理解している。そのような非対合末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。

【0119】

ここで使用する２つのタンパク質または核酸間の“類似性”とは、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の類縁性を言う。類似性は、残基の配列およびそこに含まれる残基の同一性および／または相同性の度合いに基づくことができる。タンパク質間または核酸間の類似性の度合いを評価するための方法は、当業者には知られている。例えば、配列類似性を評価する一方法では、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、それら配列間の同一性が最大レベルになるように整列させる。“同一性”とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が不変である程度を言う。アミノ酸配列の整列では(また、ある程度はヌクレオチド配列の整列でも)、アミノ酸(またはヌクレオチド)の保存的相違および／または頻繁な置換も考慮することができる。保存的相違とは、関与する残基の物理化学的性質が維持されるような相違である。整列はグローバル(配列の全長にわたり、全ての残基を含む、比較配列の整列)またはローカル(配列のうち、最も類似する１または複数の領域だけを含む部分の整列)であり得る。

【0120】

“同一性”そのものは、当技術分野で認められている意味を持ち、公表された技法を使って算出することができる(例えばComputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)参照)。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するための方法はいくつか存在するが、“同一性”という用語は当業者にはよく知られている(Carrillo, H. and Lipton, D., (1988) SIAM J AppliedMath 48:1073)。

【0121】

ここで使用する相同(核酸および／またはアミノ酸配列に関して)は、約２５％以上の配列相同性、典型的には、２５％以上の、４０％以上の、５０％以上の、６０％以上の、７０％以上の、８０％以上の、８５％以上の、９０％以上のまたは９５％以上の配列相同性を意味し、必要であれば正確なパーセンテージを指定することができる。ここで使用するは、“相同性”および“同一性”という用語は、別段の表示がない限り、しばしば互換的に使用される。一般に、相同率または同一率を決定するには、最も高度な一致が得られるように配列が整列される(例えばComputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991参照)。配列相同性により、保存されているアミノ酸の数は、標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムで決定され、各供給者によって設定されたデフォルトギャップペナルティに従って使用することができる。実質的に相同な核酸分子は、典型的には、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、目的とする対象の核酸の全長にわたってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重したコドンを含有する核酸分子も意図される。

【0122】

任意の２分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％“同一”または“相同”なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を持つかどうかは、“ＦＡＳＴＡ”プログラムなどの公知コンピュータアルゴリズムを使用し、例えばPearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444に記載されているデフォルトパラメータを使って決定することができる(他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Altschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)。例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センターデータベースのＢＬＡＳＴ機能を使って同一性を決定することができる。他の市販プログラムまたは公に利用可能なプログラムには、DNAStar “MegAlign” program (Madison, WI)およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) “Gap” program (Madison WI)などがある。タンパク質分子および／または核酸分子の相同率または同一率は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム(例えばNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, as revised by Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482)を使って配列情報を比較することによって決定することができる。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは、類似性を、整列させた記号(すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸)のうち、類似しているもの数を、それら２つの配列の短い方の配列中の記号の総数で割ったものと定義する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータとしては、(１)Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載されているように、単項比較マトリックス(unary comparison matrix)(一致に対して１の値を、不一致に対して０の値を含む)およびGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス(weighed comparison matix)；(２)各ギャップに対して３.０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して０.１０の追加ペナルティ；ならびに(３)エンドギャップ(end gap)に対するペナルティなしを挙げることができる。

【0123】

したがって、ここで使用する“同一性”または“相同性”という用語は、試験ポリペプチドまたは試験ポリヌクレオチドと基準ポリペプチドまたは基準ポリヌクレオチドの間の比較を表す。本明細書で使用する“〜に少なくとも９０％同一”という用語は、そのポリペプチドの基準核酸配列または基準アミノ酸配列に対する９０〜９９.９９％の同一率を言う。９０％以上のレベルの同一性とは、例えば、比較される試験ポリペプチドと基準ポリペプチドの長さが１００アミノ酸であるとすると、基準ポリペプチド中のアミノ酸と異なる試験ポリペプチド中のアミノ酸が１０％(すなわち１００個中１０個)を上回らないことを示す。同様の比較を、試験ポリヌクレオチドと基準ポリヌクレオチドの間でも行うことができる。そのような相違は、ポリペプチドの全長にわたってランダムに分布する点突然変異として現れる場合も、許容される最大値までの、例えば１００個中１０個のアミノ酸相違(約９０％の同一性)までの、種々の長さを持つ１つ以上の位置にクラスターを形成する場合もあり得る。相違は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失と定義される。約８５〜９０％を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果が、プログラムにも、設定されたギャップパラメータにも、依存しないはずであり、そのような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに頼らなくても手動での整列によって、容易に評価することができる。

【0124】

ここで使用する、整列された配列とは、ヌクレオチド配列中またはアミノ酸配列中の対応する位置の整列させるために使用した相同性(類似性および／または同一性)を言う。典型的には、５０％以上が同一である関係する２つ以上の配列が整列される。整列された一組の配列とは、対応する位置で整列させた２つ以上の配列を指し、ＲＮＡに由来する配列、例えばＥＳＴおよび他のｃＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ配列と整列させたものを含んでもよい。

【0125】

ここで使用する“プライマー”は、適当な条件下(例えば、４種のヌクレオシド三リン酸類およびＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合化剤の存在下)、適当な緩衝液中、適切な温度で鋳型指示ＤＮＡ合成の開始点として作用できる核酸分子である。当然ながら、ある種の核酸分子は“プローブ”および“プライマー”として作用できる。プライマーは、しかしながら、伸長のために３’ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写酵素(ＲＴ)−ＰＣＲ、ＲＮＡ ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、捕獲ＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’および５’ＲＡＣＥ、インサイチュＰＣＲ、ライゲーション仲介ＰＣＲおよび他の増幅プロトコルを含む種々の方法において使用できる。

【0126】

ここで使用する“プライマー対”は、増幅すべき(例えばＰＣＲによる)配列の５’末端の補体とハイブリダイズする５’(上流)プライマーおよび増幅すべき配列の３’末端とハイブリダイズする３’(下流)プライマーを含む一組のプライマーを言う。

【0127】

ここで使用する“特異的にハイブリダイズする”は、核酸分子(例えばオリゴヌクレオチド)の標的核酸分子への相補的塩基対形成によるアニーリングを言う。当業者は、特定の分子の長さおよび組成のような特異的ハイブリダイゼーションに影響するインビトロおよびインビボパラメータを熟知する。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメータは、さらにアニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成および塩濃度を含む。高ストリンジェンシーで特異的に結合していない核酸分子を除去するための洗浄条件の例は、０.１×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、６５℃および中ストリンジェンシーで０.２×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、５０℃である。同等なストリンジェンシー条件は当分野で知られる。当業者は、特定の適用に適切な核酸分子の標的核酸分子への特異的ハイブリダイゼーションを達成するためのこれらのパラメータを容易に調節できる。相補的とは、２個のヌクレオチド配列について述べるとき、２個のヌクレオチド配列が、典型的に２５％、１５％または５％未満のミスマッチで対立ヌクレオチドとハイブリダイズできることを意味する。必要であれば、相補性のパーセンテージを特定する。典型的に２分子は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように選択する。

【0128】

ここで使用するある生成物と実質的に同一とは、十分に類似しているので、その生成物の代わりに実質的に同一な生成物を使用しても、問題とする性質が十分に維持できることを意味する。

【0129】

また、ここで使用する“実質的に同一”または“類似する”用語は、当業者に知られているように、文脈によってさまざまである。

【0130】

ここで使用する対立遺伝子変異型または対立遺伝子変異は、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の変異形態のいずれかを言う。対立遺伝子変異は突然変異によって自然に発生し、集団内の表現型多型をもたらし得る。遺伝子突然変異はサイレント(コードされるポリペプチドを変化させない)であるか、変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードすることができる。“対立遺伝子変異型”という用語は、本明細書では、ある遺伝子の対立遺伝子変異型によってコードされるタンパク質を表すためにも使用される。典型的に、基準型の遺伝子は、ある集団から得られるまたはある種の単一の基準メンバーから得られるポリペプチドの野生型および／または優勢型をコードする。典型的に、対立遺伝子変異型(２種間および３種以上の間での変異型を含む)は、同じ種から得られる野生型および優勢型と、典型的には少なくとも８０％、９０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を持つ。また、同一性の度合いは、遺伝子に依存し、比較が種間比較であるか種内比較であるかにも依存する。一般に、種内対立遺伝子変異型は、野生型および／または優勢型と少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％以上の同一性(野生型および／または優勢型のポリペプチドと９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を含む)を持つ。本明細書において対立遺伝子変異型は、一般に、同じ種内のメンバー間でのタンパク質中の変異を言う。

【0131】

ここで使用する“対立遺伝子”は、本明細書では“対立遺伝子変異型”と可換的に使用され、遺伝子またはその一部の変異型を言う。対立遺伝子は相同染色体上の同じ座または位置を占める。ある対象がある遺伝子について２つの同一対立遺伝子を持っている場合、その対象はその遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合であるという。ある対象がある遺伝子について２つの異なる対立遺伝子を持っている場合、その対象はその遺伝子についてヘテロ接合であるという。ある特定遺伝子の対立遺伝子は互いに１個のヌクレオチドが異なる場合または数個のヌクレオチドが異なる場合があり、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含む場合もある。ある遺伝子の対立遺伝子は、突然変異を含有する遺伝子の一形態であることもできる。

【0132】

ここで使用する種変異型は、マウスとヒトのような異なる哺乳動物種間を含む異なる種間のポリペプチドにおける変異型を言う。例えばＰＨ２０について言えば、ここに提供する種変異体の例は、ヒト、チンパンジー、マカクおよびカニクイザルを含むが、これらに限定されない、霊長類ＰＨ２０である。一般的に、種変異体は７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％以上の配列同一性を有する。種変異体間の対応する残基は、例えば、配列間の同一性が９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上となるように、マッチするヌクレオチドまたは残基数が最大になるように配列を比較および整列することにより決定できる。次いで、目的の位置に参照核酸分子の番号を割り当てる。整列は、特に、配列同一性が８０％を超えるとき、手動で、特に目視により行うことができる。

【0133】

ここで使用するヒトタンパク質は、ヒトのゲノムに存在する、ＤＮＡのような核酸分子によりコードされるものであり、全てのその対立形質変異体および保存的変異を含む。タンパク質の変異体または修飾体は、修飾がヒトタンパク質の野生型または著名な配列に基づくならば、ヒトタンパク質である。

【0134】

ここで使用するスプライス変異体は、ゲノムＤＮＡの一次転写物の異なる処理により生じる、１種を超えるｍＲＮＡをもたらす変異体を言う。

【0135】

ここで使用する修飾はポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子のヌクレオチドの配列の修飾を言い、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置き換え(例えば置換)を言う。修飾の例はアミノ酸置換である。アミノ酸置換ポリペプチドは、アミノ酸置換を含まないポリペプチドと６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％以上の配列同一性を示し得る。アミノ酸置換は保存的でも非保存的でもよい。一般的に、ポリペプチドへのあらゆる修飾はポリペプチドの活性を維持する。ポリペプチドを修飾する方法は、組換えＤＮＡ法を用いる方法など、当業者にとっては日常的である。

【0136】

ここで使用するアミノ酸の適切な保存的置換は当業者に知られ、一般的に得られた分子の生物活性を変えることなく実施できる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域の一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変えないことを認識する(例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224参照)。このような置換は、次の表２に示すものに従い実施できる。

【表2】

【0137】

他の置換も可能であり、経験的にまたは既知の保存的置換に従って決定できる。

【0138】

ここで使用する用語プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写開始を起すＤＮＡ配列を含む遺伝子を意味する。プロモータ配列は、必ずとは言えないが一般的に、遺伝子の５’非コーディング領域に見られる。

【0139】

ここで使用する単離されたまたは精製されたポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物活性部分は、そのタンパク質が得られる細胞または組織に由来する細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成された場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。当業者が純度を評価するために使用する薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの標準的分析方法で検定した場合に調製物が容易に検出できる不純物を含まないと判断されるか、または調製物が十分に純粋であって、さらなる精製を行ってもその物質の物理的および化学的性質(例えば酵素活性および生物活性)が検出できるほどには変化しない場合に、調製物は不純物を実質的に含まないと決定できる。化合物を精製して実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための方法は、当業者に知られている。ただし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であることもある。そのような場合は、さらなる精製により、化合物の比活性が向上することもある。

【0140】

それゆえに、例えば実質的に精製された可溶性ＰＨ２０のような実質的に精製されたポリペプチドが記載されているとき、それはタンパク質がその単離起源または組換え生産起源となった細胞の細胞構成成分を含む細胞物質から分離されている、タンパク質の調製物である。ある態様において、細胞物質を実質的に含まないという用語は、約３０％未満(乾燥重量で)の非酵素タンパク質(ここでは夾雑タンパク質ともいう)、一般的には約２０％未満の非酵素タンパク質または約１０％未満の非酵素タンパク質または約５％未満の非酵素タンパク質を含む酵素タンパク質の調製物を包含する。酵素タンパク質が組換え生産される場合、それは培養培地も実質的に含まない。すなわち培養培地は、酵素タンパク質調製物の体積の約または正確に２０％、１０％もしくは５％未満に相当する。

【0141】

本明細書で使用する、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないという用語は、タンパク質がそのタンパク質の合成に関与した化学的前駆体または他の化学物質から分離されている酵素タンパク質の調製物を包含する。この用語は、含まれる化学的前駆体または非酵素化学物質もしくは構成成分が約３０％(乾燥重量で)、２０％、１０％、５％またはそれ以下より少ない酵素タンパク質の調製物を包含する。

【0142】

ここで使用する例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドなどに関していう合成とは、組換え法および／または化学合成法によって製造される核酸分子またはポリペプチド分子を言う。

【0143】

ここで使用する組み換え手段または組換えＤＮＡ法を使った生産とは、クローン化されたＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させるために、分子生物学で周知の方法を使用することを意味する。

【0144】

ここで使用するベクター(またはプラスミド)は、異種核酸をその発現またはその複製を目的として細胞中に導入するために使用される個々の成分を言う。ベクターは典型的に、エピソームであり続けるが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその一部の組込みが達成されるように設計することもできる。酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考えられる。そのような運搬体の選択と使用は当業者にはよく知られている。

【0145】

ここで使用する発現ベクターは、当該ＤＮＡフラグメントの発現を達成する能力を持つプロモーター領域などの調節配列に作動的に連結されたＤＮＡを発現させる能力を持つベクターを包含する。そのような追加セグメントはプロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、場合によっては、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルも含むことができる。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導されるか、または両方の要素を含むことができる。したがって、発現ベクターとは、適当な宿主細胞に導入された時にクローン化されたＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を言う。適当な発現ベクターは当業者にはよく知られており、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能なものや、エピソームであり続けるもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものがある。

【0146】

ここで使用するベクターは、“ウイルスベクター”または“ウイルス様ベクター”も包含する。ウイルス様ベクターは、(運搬体またはシャトルとして)細胞中に外来遺伝子を導入するためにそれら外来遺伝子に作動的に連結された工学的改変ウイルスである。

【0147】

ここで使用するＤＮＡセグメントに関して“作動可能に連結”または“作動的に連結”とは、複数のセグメントが、その意図された目的のために、それらが協力して機能するように、例えば転写がプロモーターの下流かつ任意の転写配列の上流で開始するように、配置されることを意味する。プロモーターとは、通常、転写機構がそこに結合して転写を開始するドメインであり、転写はコードセグメントを経てターミネーターまで進行する。

【0148】

本明細書で使用する、“評価する“という用語は、サンプル中に存在する酵素またはそのドメインのようなタンパク質の活性について絶対値を得るという意味での、そしてまた活性のレベルを示す指数、比、パーセンテージ、視覚化または他の値を得るという意味での、定量的および定性的決定を包含するものとする。評価は直接的または間接的であり得る。例えば、実際に検出する化学的種は、当然、それ自体酵素開裂産物である必要はなく、例えばその誘導体または何らかのさらなる物質であり得る。例えば、開裂産物の検出は、蛍光部分のような検出可能部分であり得る。

【0149】

ここで使用する生物活性とは、化合物のインビボ活性、または化合物、組成物もしくは他の混合物をインビボ投与した時に起こる生理学的応答を言う。したがって生物活性は、そのような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬理活性を包含する。生物活性は、そのような活性を試験または使用するために設計されたインビトロ系で観察することができる。それゆえに、本発明の目的のためにヒアルロニダーゼ酵素の生物活性は、そのヒアルロン酸分解である。

【0150】

２つの核酸配列に関してここで使用する等価とは、問題の２つの配列が同じアミノ酸配列または等価なタンパク質をコードすることを意味する。２つのタンパク質またはペプチドに関して等価という場合、それは、それら２つのタンパク質またはペプチドが実質的に同じアミノ酸配列を持ち、そのタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないアミノ酸置換だけを有することを意味する。等価が性質を指す場合、その性質は同程度に存在する必要はないが(例えば２つのペプチドは同じタイプの酵素活性を異なる比率で示すことができる)、それらの活性は通常、実質的に同じである。

【0151】

ここで使用する“調節する”および“調節”または“改変”は、タンパク質のような分子の活性の変更を言う。活性の例は、シグナル伝達のような生物活性を含むが、これに限定されない。調節は活性上昇(すなわち、上方制御またはアゴニスト活性)、活性低下(すなわち、下方制御または阻害)または活性の何らかの他の変更(例えば周期性、頻度、持続時間、動力学または他のパラメータの変更)を含み得る。調節は状況に依存的であり得て、典型的に調節は指摘した状態、例えば、野生型タンパク質、構成的状態のタンパク質または指摘した細胞型または状態で発現されるタンパク質にと比較する。

【0152】

ここで使用する組成物はあらゆる混合物を意味する。これは溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはこれらの任意の組み合わせであり得る。

【0153】

ここで使用する組合せは、２つまたはそれ以上の物の間の任意の関連を言う。組合せは、２つまたはそれ以上の別々の品目、例えば２つの組成物であるか、その混合物、例えばそれら２つまたはそれ以上の品目の単一混合物であるか、それらの任意の変更物であることができる。組合せの要素は、一般に、機能的に関連または関係する。例えば、組み合わせは、ここで提供する組成物の組み合わせであり得る。

【0154】

ここで使用するキットは、ここに記載する組成物と、再構成、活性化および生物活性または特性の送達、投与、診断および評価のための機器／デバイスを目的とするが、これに限定されない他の物品の組み合わせのような要素の組み合わせである。キットは、所望により使用指示書を含んでよい。

【0155】

ここで使用する“疾患または障害”は、感染、後天的状態、遺伝的状態などを含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状を特徴とする、ある生物における病理学的状態を言う。ここで目的とする疾患および障害はヒアルロナン関連疾患および障害である。

【0156】

ここで使用する、ある疾患または状態を持つ対象を“処置する”とは、処置後に、その対象の症状が部分的にまたは完全に治癒すること、または静的状態を保つことを意味する。したがって、処置は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防とは、潜在的疾患の防止および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の防止を言う。

【0157】

ここで使用する医薬有効剤は、任意の治療剤または生物活性剤、例えば化学療法剤、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、従来の治療薬(小分子薬および治療用タンパク質を含む)を包含するが、これらに限定されない。

【0158】

ここで使用する処置は、ある状態、障害もしくは疾患または他の適応の症状を寛解するか他の有益な形で変化させる、任意の方法を意味する。

【0159】

ここで使用する治療効果は、疾患または状態の症状を変化(典型的に、改善または寛解)させるか、疾患または状態を治癒させる、対象の処置に起因する効果を意味する。治療有効量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす、組成物、分子または化合物の量を言う。

【0160】

本明細書で使用する“対象”という用語は、ヒトなどの哺乳動物を含む動物を言う。
ここで使用する患者は、疾患または障害の症状を示すヒト対象を言う。
ここで使用する“個体”は対象であり得る。

【0161】

ここで使用するほぼ同じは、当業者が同じまたは許容される誤差範囲と見なす量の範囲内を意味する。例えば、典型的に、医薬組成物について、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％または１０％以内の量はほぼ同じと見なす。このような量は、対象による特定の組成物の多様性に対する耐容性により変わり得る。

【0162】

ここで使用する投与レジメは薬物、例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えば可溶性ヒアルロニダーゼまたは他の薬物を含む組成物の投与量および投与頻度を言う。投与レジメは処置する疾患または状態に相関し、それゆえに変わり得る。

【0163】

ここで使用する投与頻度は、処置剤を連続的投与間隔の時間を言う。例えば、頻度は日、週または月であり得る。例えば、頻度は１週間に１回を超え、例えば、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回または毎日であり得る。頻度はまた１週間、２週間、３週間または４週間であり得る。特定の頻度は処置する特定の疾患または状態の関数である。一般的に、頻度は１週間に１回を声、一般的に１週間に２回である。

【0164】

ここで使用する“投与サイクル”は、連続的投与で繰り返される本酵素および／または第二剤の投与の投与レジメの反復スケジュールを言う。例えば、投与サイクルの例は、１週間に２回、３週間の投与、続く１週間の休薬の２８日サイクルである。

【0165】

ここで使用するmg／対象のkgに基づく投与量の記載について、平均ヒト対象は約７０kg〜７５kg、例えば７０kgの体重を有するとする。

【0166】

ここで使用する医薬組成物または他の治療剤の投与のような処置による特定の疾患または障害の症状の、永続的であるか一時的であるか、持続的であるか一過性であるかを問わない改善、または、例えばペグ化されたヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素の投与と関連する、または投与により起こる有害作用の減少のような有害作用の減少を言う。

【0167】

ここで使用する防止または予防は、疾患または状態が発生するリスクを低下させる方法を言う。

【0168】

ここで使用する“治療有効量”または“治療有効用量”は、少なくとも、治療効果をもたらすのに十分な、薬物、化合物、物質、または化合物を含有する組成物の量を言う。したがって、これは、疾患または障害を防止し、治癒させ、寛解させ、抑止し、または部分的に抑止するのに必要な量である。

【0169】

ここで使用する単位投与形態は、当技術分野で知られているように、ヒトおよび動物対象に適し、個別に包装された、物理的に不連続な単位を言う。

【0170】

ここで使用する一投与量製剤は、１回投与量としての製剤を言う。
ここで使用する直接投与用製剤は、該組成物が投与のためのさらなる希釈を必要としないことを意味する。

【0171】

ここで使用する“製品”は、製造され販売される物品である。本願の全体にわたって使用されるこの用語は、包装品に含まれる抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素および第二剤組成物を意図包含することを意図する。

【0172】

ここで使用する流体は、流動し得る任意の組成物を言う。したがって流体は、半固形、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそれに類する組成物の形態をとる組成物を包含する。

【0173】

ここで使用する細胞抽出物またはライセートは、溶解または破壊された細胞から製造された調製物または画分を言う。

【0174】

ここで使用する動物には、任意の動物、例えば限定するわけではないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；マウスおよびラットなどの齧歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタおよび他の動物が含まれる。非ヒト動物として想定される動物にヒトは含まれない。本明細書に記載するヒアルロニダーゼ群は、任意の供給起源、動物、植物、原核生物および真菌に由来する。大半の酵素は哺乳動物由来を含む動物由来である。一般的にヒアルロニダーゼ群はヒト起源である。

【0175】

ここで使用する抗癌処置は、癌の処置のための薬物および他の薬物の投与およびまた手術および放射線療法のような処置プロトコルを含む。抗癌処置は抗癌剤投与を含む。

【0176】

ここで使用する抗癌剤は、抗癌処置に使用されるあらゆる薬物または化合物を言う。これらは、腫瘍および癌の臨床的症状または診断マーカーを、単独でまたは他の化合物と組み合わせて使用したとき、軽減、減少、寛解、予防または寛解状態にするまたは維持するあらゆる薬物を含み、ここに提供する組み合わせおよび組成物で使用できる。抗癌剤の例は、単独でまたは化学療法剤、ポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子または遺伝子治療ベクター、ウイルスまたはＤＮＡのような他の抗癌剤と組み合わせで使用される、ここに提供するペグ化ヒアルロナン分解酵素群のようなヒアルロナン分解酵素群を含むが、これらに限定されない。

【0177】

ここで使用する対照は、それが試験パラメータで処置されない点以外は、またはそれが血漿サンプルである場合は、対象が目的とする状態を有していない健常ボランティアから得られたものである点以外は、試験サンプルと実質的に同一なサンプルを言う。対照は内部対照であることもできる。

【0178】

ここで使用する使用する単数表現は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。したがって、例えば“細胞外ドメイン”を含むまたは包含する化合物への言及は、１つまたは複数の細胞外ドメインを持つ化合物を包含する。

【0179】

ここで使用する範囲および量は、特定の値または範囲の“約”と表現する場合がある。この“約”には、まさにその量も包含される。したがって“約５塩基”は“約５塩基”を意味すると共に“５塩基”も意味する。一般的に“約”は、実験誤差の範囲内であると推定される量を含む。

【0180】

ここで使用する“任意”または“所望により”は、それに続けて述べられる事象または状況が起こることまたは起こらないこと、およびその説明が、該事象または状況が起こる場合と起こらない場合を包含することを意味する。例えば、場合により置換されている基とは、その基が無置換であるか、または置換されていることを意味する。

【0181】

ここで使用する、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物の略号は、別段の表示がない限り、その一般的使用法、広く認識されている略号、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会((1972) Biochem. 11:1726参照)に従う。

【0182】

Ｂ. ヒアルロナン結合タンパク質およびコンパニオン診断
ここに提供されるのは、疾患と関連する、特に腫瘍組織の細胞外マトリックス(ＥＣＭ)におけるヒアルロナン(ＨＡ)レベルを検出し、密接にモニターする感受性かつ特異的な方法である。ここに提供されるコンパニオン診断方法は、ＨＡ蓄積が、特に癌に関して高悪性度疾患と特に相関し、予測的であるとの知見に基づく。さらに、ここに提供されるコンパニオン診断方法はまたＨＡがヒアルロニダーゼシンターゼ群またはヒアルロニダーゼ群のようなヒアルロナン関連疾患および状態と関連するＨＡ代謝経路に含まれる他のマーカーと比較して、特に優れた予後診断および処置選択情報を提供するとの知見に基づく。それゆえに、ここに提供する方法は、ＨＡの特異的かつ感受性の検出のための特異性、高親和性および低変化性を示す改善されたヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)試薬を使用する。またここで提供されるのは、改善されたＨＡＢＰ試薬。

【0183】

一例として、セクションＣに記載するいずれかのようなここに提供する改善されたＨＡＢＰ類は、セクションＥに記載するいずれか(例えばヒアルロニダーゼまたはペグ化ＰＨ２０、すなわちＰＥＧＰＨ２０のような修飾ヒアルロニダーゼ)のような抗ヒアルロナン剤またはヒアルロナン分解酵素で処置するためのＨＡ関連疾患、例えばＨＡ関連腫瘍を有する患者を選択するためのコンパニオン診断であり得る。このような例において、方法は、癌治療のような治療の選択ための患者の分類に有用であり、特に進行腫瘍の患者の処置のための、ＰＥＧＰＨ２０での治療のような抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素治療での治療の応答性と相関するＨＡレベルの測定と相関する。

【0184】

他の例において、セクションＣに記載するいずれかのようなここに提供する改善されたＨＡＢＰ類はまた処置中のＨＡのレベルを検出することによる、セクションＥに記載するいずれか(例えばヒアルロニダーゼまたはペグ化ＰＨ２０、すなわちＰＥＧＰＨ２０のような修飾ヒアルロニダーゼ)のような抗ヒアルロナン剤またはヒアルロナン分解酵素での処置に対する効果または応答性のモニタリングの方法にも使用できる。それゆえに、改善されたＨＡＢＰは、ＨＡレベルをモニターし、臨床的応答と相関する方法で特定の患者および疾患の経過によって、患者の個々の処置を個別化するために治療を調節および／または変更するために、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素治療での治療と組み合わせで使用できる。

【0185】

またここで提供されるのは、ＨＡ関連疾患および状態、特に癌の選択、モニタリングおよび／または処置に使用するための、ヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤(例えば下のセクションＥにおいてここで提供するいずれか)および改善されたＨＡＢＰ(例えば下のセクションＣにおいてここで提供するいずれか)および所望により他の付随試薬を含む組み合わせおよびキットである。

【0186】

１. 疾患におけるヒアルロナン蓄積および予後診断との関連
ヒアルロナン(ＨＡ；ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ぶ)は、ＧｌｃＵＡ−β１,３−ＧｌｃＮＡｃ−β１,４−結合を介する反復したＮ−アセチルグルコサミンおよびＤ−グルクロン酸二糖サブユニットを含む直鎖グリコサミノグリカン(ＧＡＧ)ポリマーである。ヒアルロナンはヒアルロナンシンターゼ群のクラスであるＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３により合成される。これらの酵素群は、細胞から押し出されるように、新生多糖にグルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを付加することによりヒアルロナンを伸長することにより作用する。ＨＡシンターゼ群に加えて、ＨＡのレベルは、通常、ヒアルロニダーゼ群、特異的にターンオーバー酵素ヒアルロニダーゼ１(Ｈｙａｌ１)によるその異化反応により維持される。ＨＡの動的ターンオーバーは、正常組織における一定濃度を維持するために生合成および異化反応によりバランスを取っている。

【0187】

ＨＡは細胞外マトリックス(ＥＣＭ)の成分である。これは組織に遍在性に分散し、細胞外、細胞周囲マトリックスならびに細胞内部に局在する。ＨＡは、組織恒常性および生体力学、細胞増殖、免疫接着および動的細胞過程中の活性化および細胞遊走に関与するように広範な生物学的機能を有する。これらの過程は、ＨＡとＴＳＧ−６、バーシカン、インターアルファ−トリプシン阻害剤、ＣＤ４４、リンパ管内皮ＨＡ受容体(ＬＹＶＥ−１−１)およびＲＨＡＭＭのようなヒアルアドヘリン類として知られるＨＡ結合タンパク質の相互作用が仲介する。

【0188】

ヒアルロナン蓄積は多くの悪性および自己免疫性疾患状態と関連する(Jaervelaeinen H, et al. (2009) Pharmacol Rev 61: 198-223; Whatcott CJ, et al. (2011) Cancer Discovery 1:291-296)。例えば、炎症性疾患および癌を含むある種の疾患は、ヒアルロナンの発現および／または産生と関連する。ＨＡは、このような疾患の進行に関与する種々の生物学的過程と関連する(例えばItano et al. (2008) Semin Cancer Biol 18(4):268-274; Tammi et al. (2008) Semin Cancer Biol 18(4):288-295参照)。

【0189】

特に、ＨＡは腫瘍マトリックスの要素であり、多くの固形腫瘍に存在する。腫瘍巣内のＨＡの蓄積は、細胞−細胞接触を阻止し、上皮性−間葉性遷移を促進し、その受容体ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４を介してｐ５３腫瘍サプレッサー経路に関与し、腫瘍関連マクロファージを集める(Itano et al. (2008) Cancer Sci 99: 1720-1725; Camenisch et al. (2000) J Clin Invest 106:349-360; Thompson et al. (2010) Mol. Cancer Ther. 9:3052-64)。ＨＡに富む細胞周囲マトリックスの集合は、転移行動を促進できる間葉性細胞の増殖および遊走のための必要条件である。ＨＡ蓄積により特徴付けられる腫瘍はまた腫瘍水取り込みを示し、高間質性流体圧(ＩＦＰ)を有し、これは化学療法剤のような全身性に適用された治療剤の腫瘍への浸透および接近性を阻止し得る。さらに、Ｈｙａｌ１の分解により産生されたＨＡオリゴマーも腫瘍病因に関与し得る血管形成またはアポトーシスをもたらすことが示されている。

【0190】

ＨＡの蓄積は、ＨＡＳ遺伝子発現および／またはＨＹＡＬ遺伝子発現と関連付けられている(Kosaki et al. (1999) Cancer Res. 59:1141-1145; Liu et al. (2001) Cancer Res. 61:5207-5214; Wang et al. (2008) PLoS 3:3032; Nykopp et al. (2010) BMC Cancer 10:512)。当分野での研究は、ＨＡ、ＨＡＳまたはＨｙａｌ１が癌の予後診断指標として使用できることをさまざまに示す。また、アンチセンス方法によるようなＨｙａｌ１の選択的阻害または４−メチルウンベリフェロンを使用するようなＨＡＳによるヒアルロナン合成の選択的阻害は、腫瘍の処置方法であることを示す研究もある(Kakizaki et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:33281-33289)。さらに、下記のＰＨ２０のようなヒアルロニダーゼ群もヒアルロナン関連疾患および状態の処置に使用されている(例えばThompson et al. (2010) Mol. Cancer Ther 9:3052-3064)。

【0191】

実施例に示すとおり、細胞のＨＡ表現型および特に腫瘍細胞周囲マトリックスの形態が、腫瘍高攻撃性と相関し、ＨＡレベルのアッセイが特異的にＨＡ合成腫瘍細胞が細胞周囲マトリックスを形成する能力を予測することが本発明により判明した。特異的に、ＨＡＳ１、２,３；Ｈｙａｌ１または２；またはＨＡを含むＨＡ蓄積の可能性のあるマーカーの中で、ＨＡ決定のみが細胞周囲マトリックス形成と相関し、それによりＨＡ−アグリカン仲介細胞周囲マトリックスを形成する腫瘍細胞コンピテンス、それゆえに腫瘍高攻撃性を予測することが本発明により判明した。それゆえに、腫瘍治療の予測または予後診断のための診断の目的で、ＨＡ結合タンパク質(ＨＡＢＰ)が意図される。ここに記載するとおり、腫瘍ＨＡ産生は、プローブとしてＨＡＢＰを使用して定量的に測定でき、ヒアルロナンに対するＨＡＢＰは細胞周囲マトリックス形成と相関を示すが、細胞周囲マトリックス形成と関連ＨＡＳまたはＨｙａｌ ｍＲＮＡのレベルには相関が見られなかった。これらの知見は腫瘍細胞関連ＨＡの直接の測定を示し、他のマーカーはＨＡ代謝経路に関連しておらず、細胞周囲マトリックス形成の信頼できる予測因子を提供することを示す。

【0192】

２. 抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での腫瘍の治療および処置に対する応答性
測定したＨＡ蓄積の量または程度はまた、抗ヒアルロナン剤、例えばＰＨ２０のようなヒアルロナン分解酵素での処置の応答性と相関することも本発明により判明した。抗ヒアルロナン剤、例えばＰＨ２０のようなヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナン(ヒアルロン酸、ＨＡ)の蓄積を示す疾患および状態の単剤または組み合わせ治療に有用な特性を示す。このようなヒアルロナン関連疾患、条件および／または障害は癌および炎症性疾患を含む。高ヒアルロナン腫瘍は、固形腫瘍、例えば、末期癌、転移癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、前立腺癌、膵癌、非小細胞性肺癌、乳癌、結腸癌および他の癌を含む腫瘍を含むが、これらに限定されない。

【0193】

例えば、ヒアルロニダーゼ、例えばＰＨ２０のようなＨＡ分解酵素群はＨＡを腫瘍から除去し、腫瘍体積減少、ＩＦＰ減少、腫瘍細胞増殖遅延および腫瘍浸透増加を可能とすることによる併用化学療法剤および生物学的製剤の効果増強をもたらす(例えば米国公開出願番号２０１００００３２３８および国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９／１２８９１７；Thompson et al. (2010) Mol. Cancer Ther 9:3052-3064参照)。

【0194】

ＰＨ２０のようなヒアルロニダーゼが、ヒアルロナン関連疾患および障害の治療剤として作用するようにＨＡを分解する能力は、全身性半減期を延長するように修飾することにより利用できる。延長した半減期はＨＡの除去だけでなく、血漿への継続した存在およびＨＡ分解能により、腫瘍のような疾患組織内のＨＡの再生の程度を減少または低下できる。それゆえに、血漿酵素レベル維持は、腫瘍ＨＡのようなＨＡ除去をできるだけでなく、ＨＡ再合成と対抗する。ペグ化は、体内での治療剤タンパク質の半減期延長に使用され、それゆえに全身性処置プロトコルに使用することを可能とする確立した技術である。ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素群のような抗ヒアルロナン剤のペグ化は、体内でのその半減期を１分間未満から約４８〜７２時間まで延長し、ＨＡに富む腫瘍の全身性処置を可能とする(例えば米国公開出願番号２０１００００３２３８および国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９／１２８９１７；Thompson et al. (2010) Mol. Cancer Ther 9: 3052-3064参照)。

【0195】

抗ヒアルロナン剤および特にＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０のようなヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ群の腫瘍細胞に対する増殖阻害活性はＨＡレベルの程度と相関することが本発明により判明した。実施例に示すとおり、腫瘍は、腫瘍のＨＡの発現量に基づき表現型群(例えばＨＡ^＋１、ＨＡ^＋２、ＨＡ^＋３)に特徴づけできる。高腫瘍関連ＨＡ(スコア化ＨＡ^＋３)は、動物モデルで腫瘍増殖加速およびヒアルロナン分解酵素(例えばＰＥＧＰＨ２０)による大きな腫瘍阻害となった。例えば、ＨＡ^＋３表現型と関連する腫瘍増殖阻害は９７％であったのに対し、腫瘍ＨＡ^＋２またはＨＡ^＋１表現型ではそれぞれわずか４４％および１６％であった。本データは、ある腫瘍の継続した増殖は、腫瘍微小環境のＨＡの密度および量に依存し、ＨＡ富(例えばＨＡ^＋３)腫瘍からのＨＡ除去は、ＨＡが中程度または少ない腫瘍(例えば、ＨＡ^＋２、ＨＡ^＋１)またはＨＡ欠損腫瘍からのＨＡの枯渇より腫瘍増殖に効果が促進されることを示す。それゆえに、ここに示すとおり、ＨＡＢＰを使用して測定して、腫瘍組織中のＨＡ蓄積の程度は、抗ヒアルロナン剤(例えば、ＰＥＧＰＨ２０)が仲介するインビボでの腫瘍増殖阻害のレベルの予測である。

【0196】

３. ヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ類)試薬および診断
上記のおよび実施例の結果に基づき、ＨＡＢＰを使用して検出したバイオマーカーＨＡは、抗ヒアルロナン処置、例えばヒアルロナン分解酵素処置(例えばＰＥＧＰＨ２０)に対する応答と特異的に相関する。それゆえに、ここで提供されるのは、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロニダーゼまたはペグ化ＰＨ２０、すなわちＰＥＧＰＨ２０のような修飾ヒアルロニダーゼ)に対する予後診断およびまた感受性、それゆえに応答性を予測するためにＨＡＢＰを使用する方法である。

【0197】

試薬としての価値から、ＨＡＢＰの感受性および特異性ならびに同時に低変化性による再現性が望ましい。例えば、組織中のＨＡの検出および測定は既存試薬を使用して限界がある。現在、免疫組織学的染色を使用して組織中のＨＡの検出または測定に使用される方法は、主に動物軟骨組織由来ＨＡ結合タンパク質またはドメインに依存する。これらは、４ＭグアニジンＨＣｌでの抽出と続くＨＡ結合樹脂を使用する親和性クロマトグラフィーによるウシ鼻軟骨プロテオグリカンから精製されたＨＡＢＰを含む。得られた動物由来ＨＡは２つの主要な成分であるアグリカンＧ１ドメインおよび結合モジュールから成る。バッチ間偏差、ならびにＨＡＢＰ調製法で使用される種々の修飾のために、ＨＡＢＰ染色パターンの差の点で技術に可変性があり、染色プロファイルの違いは試験間の比較を困難とする。それゆえに、複数成分の不均一混合物として存在し、その産生についての検証された方法が存在しないため、疾患の予後診断のためのコンパニオン診断および抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)と関連した処置の効果の予測において使用するための代替的天然ＨＡＢＰタンパク質をここに提供する。

【0198】

それゆえに、ここに提供する方法において使用するためのＨＡＢＰ試薬は、動物軟骨から精製した、例えばE-Laurent et al. (1985) Ann. Rheum. Dis. 44:83-88)により記載された方法またはその修飾方法を使用して骨鼻軟骨から精製したＨＡＢＰではないあらゆるＨＡＢＰを含む。ここでの方法に使用するためのＨＡＢＰ類の例はセクションＣに記載する。このようなタンパク質は、例えば、ＨＡと結合するための１個以上の結合モジュールを含む、１個以上のＨＡ結合ドメインを含む、ＨＡＢＰ類である。いくつかの例において、ＨＡＢＰは、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＨＡＰＬＮ−１、ＨＡＰＬＮ−２、ＨＡＰＬＮ−３、ＨＡＰＬＮ−４、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡＡ０５２７またはＴＳＧ−６タンパク質のＨＡ結合ドメイン(例えば結合モジュール)を含む。いくつかの例において、ＨＡＢＰはアグリカンＧ１ドメイン、バーシカンＧ１ドメイン、ニューロカンＧ１ドメイン、ブレビカンＧ１ドメインまたはホスファカンＧ１ドメインを含む。いくつかの例において、ＨＡＢＰはアグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカンまたはホスファカンのＧ１ドメインおよびＨＡＰＬＮ−１、ＨＡＰＬＮ−２、ＨＡＰＬＮ−３またはＨＡＰＬＮ−４から選択される結合タンパク質を含む。いくつかの例において、ＨＡＢＰはＴＳＧ−６、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８またはＫＩＡＡ０５２７の１個の結合モジュールを含む。

【0199】

いくつかの例において、ＨＡＢＰは、例えば修飾アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＨＡＰＬＮ−１、ＨＡＰＬＮ−２、ＨＡＰＬＮ−３、ＨＡＰＬＮ−４、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡＡ０５２７または例えばＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃのようなＴＳＧ−６タンパク質のような、修飾ＨＡＢＰである。いくつかの例において、ＨＡＢＰは、例えば、ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃΔＨｅｐのように、ＨＡへの結合が改善するように修飾された修飾ＨＡＢＰである。

【0200】

特に、ここに提供するＨＡＢＰは、１)哺乳動物発現系のような発現系で組み換えにより産生できる；２)安定性および／または溶解度のような改善された生物物理学的特性を示す；３)１工程親和性精製方法のような単純精製方法で精製できる；４)結合アッセイおよび特に免疫組織化学またはＥＬＩＳＡ方法と互換性を生じることにより検出できる；５)ＨＡに対する増加したまたは高い親和性を示すように多量体形態(例えば二量体化を介して)で発現できる；および／または６)他のＧＡＧｓと比較してＨＡに特異性を示す。

【0201】

一例として、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、発現系で組み換えにより産生できる単一モジュールＨＡタンパク質であるＨＡＢＰ類である。特に、ここで提供されるのは、結合モジュールを含むＨＡＢＰ試薬である。例えば、ここで提供されるＨＡＢＰ類は、結合モジュール(ＬＭ)またはヒアルロナンと結合するのに十分なその一部のみを含むタイプＡクラスのＨＡＢＰ類である。このようなＨＡＢＰ類の例は腫瘍壊死因子−刺激遺伝子(ＴＳＧ)−６−ＬＭ(配列番号３６０に示す結合モジュール)、スタビリン−１−ＬＭまたはスタビリン−２−ＬＭ(それぞれ配列番号３７１または３７２に示す結合モジュール)、ＣＡＢ６１３５８−ＬＭ(配列番号３７３に示す結合モジュール)またはＫＩＡＡ０５２７−ＬＭ(配列番号３７４に示す結合モジュール)である。

【0202】

他の例において、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、多量体化ドメインに直接的または間接的に結合するＨＡＢＰ類である。ＨＡＢＰ類の結合モジュールのようなＨＡ結合ドメインは、２個以上のＨＡ結合ドメインの多量体を形成するために、共有結合的結合、非共有結合的結合または化学的結合のように直接的または間接的に結合する。ＨＡ結合ドメインは同一でも異なってもよい。特に、ＨＡ結合ドメインは、結合ドメインまたはモジュールである。それゆえに、多量体は、２個以上の結合ドメインの二量体化により形成できる。一例として、多量体は、異なるＨＡ−結合ドメイン上のシステイン残基間で形成されたジスルフィド結合により結合できる。例えば、多量体化ドメインは、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の部分のような免疫グロブリン分子の部分を含み得る。他の例において、多量体は、共有結合または非共有結合的相互作用を介して、ポリペプチドに融合したペプチド部分と結合したＨＡ結合ドメインを含む。このようなペプチドは、多量体化を促進する特性を有するペプチドリンカー(スペーサー)またはペプチドであり得る。さらなる例において、多量体は、例えば、ヘテロ二官能性リンカーを使用するような、化学的結合を介する２個のポリペプチドで形成できる。多量体化ドメインは下に記載する。ＨＡＢＰ多量体の例は、Ｆｃに融合した結合モジュール(ＬＭ)である。例えば、ここでの方法に使用するためのＨＡＢＰ試薬の例はＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃである。

【0203】

さらなる例において、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、他のＧＡＧｓと比較して、ヒアルロナンへの高い特異性を示すようにアミノ酸置換のような修飾をされたＨＡＢＰである。例えば、ここで提供されるのは、アミノ酸残基２０、３４、４１、５４、５６、７２および／または８４および特にアミノ酸残基２０、３４、４１および／または５４(配列番号２０６に示すアミノ酸残基に対応)でのアミノ酸置換を含む変異体ＴＳＧ−６−ＬＭである。置換アミノ酸はあらゆる他のアミノ酸残基でよく、一般的に非塩基性アミノ酸残基へである。例えば、アミノ酸置換はＡｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｍｅｔ(Ｍ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｙｒ(Ｙ)またはＴｒｐ(Ｗ)へであり得る。１箇所または複数個所アミノ酸置換はヘパリンへの結合を減少させる。アミノ酸置換を含まないＴＳＧ−６−ＬＭのヘパリンへの結合と比較して、結合は少なくとも１.２倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍以上減少できる。ここで提供される方法において試薬として使用するためのＴＳＧ−６−ＬＭ変異体の例は、Ｋ２０Ａ／Ｋ３４Ａ／Ｋ４１Ａである。それゆえに、例えば、ヘパリンへの結合は、ヒアルロナンへの特異性が高まるように減少される。変異体ＴＳＧ−６−ＬＭは多量体化ドメインに直接的または間接的に結合して、多量体を産生する。例えば、ここでの方法に使用するための試薬の例はＴＳＧ−６−ＬＭ(Ｋ２０Ａ／Ｋ３４Ａ／Ｋ４１Ａ)−Ｆｃである。

【0204】

試薬のいずれもコンパニオン診断方法において単独でまたは組み合わせて使用できる。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡまたは競合的ＥＬＩＳＡにおいて、上記試薬の２種以上を使用できる。下記のとおり、ここに提供するＨＡＢＰ類のいずれも検出可能な部分に直接的または間接的に結合できる。いくつかの例において、例えば腫瘍サンプル中のＨＡに結合するＨＡＢＰ類は、ＨＡＢＰに結合する抗体のような二次的試薬を使用して検出できる。いくつかの例において、ＨＡＢＰ類はＨＡ結合の検出が可能となるように修飾される。例えば、ＨＡＢＰ類は、直接的検出または修飾ＨＡＢＰ類と結合し、かつ蛍光プローブのような検出可能タンパク質またはホースラディッシュペルオキシダーゼのような検出可能な酵素群と結合している抗体のような二次的薬物を介する検出を可能にする検出可能分子と結合できる。

【0205】

４. コンパニオン診断および予後診断方法
ここに提供するＨＡＢＰ類は、ヒアルロナン関連疾患または状態を有するかまたはヒアルロナン関連疾患または状態を有するリスクがあるまたは有することが疑われる患者の種々の生物学的サンプルでの結合アッセイを使用した診断、予後診断またはモニタリング方法に個々にまたは組み合わせて使用できる。例えば、ＨＡＢＰ類は、固形腫瘍を有するまたは固形腫瘍または他の癌を発症するリスクにある患者のアッセイに使用できる。具体例において、ＴＳＧ−６−ＬＭ、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃまたはヘパリンへの結合が減少し、ヒアルロナンに対する特異性が高いもののようなその変異体または突然変異体をここでの方法に使用する。診断および予後診断方法は、処置に対して患者を分類および／または選択するまたは処置の経過を改変または修飾するためにヒアルロナン分解酵素での治療と組み合わせて使用できる。

【0206】

ここに提供する方法の例において、診断および予後診断方法は、ヒアルロナン分解酵素のようなＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０のような抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼまたは修飾ヒアルロニダーゼでの治療に対するコンパニオン方法である。ＨＡ検出は処置選択、開始、投与量カスタマイゼーションまたは停止の情報を提供でき、それゆえに抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での処置の個別化のために働く。

【0207】

例えば、ＨＡＢＰコンパニオン診断方法は、ヒアルロナン関連疾患または状態(例えば癌)に罹りやすいまたはヒアルロナン関連疾患または状態(例えば癌)を有する対象が、ヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤での処置の投与に応答するか否かを予測する。本方法において、ヒアルロナン関連疾患または状態(例えば癌)に罹りやすいまたは罹患していることが知られた対象由来のサンプルから発現されるＨＡのレベルを決定し、対象由来のサンプルで発現されるＨＡのレベルを予め決定したＨＡレベルと比較し、これは抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での応答性を分類する。ヒアルロナン分解酵素での処置に対する応答性を分類するためのＨＡの閾値レベルの決定は当業者のレベルの範囲内である。例えば、本発明により、上昇したＨＡ蓄積と腫瘍増殖阻害に顕著な相関が存在し、それによって腫瘍増殖阻害応答は、腫瘍組織の免疫組織化学により定量されたＨＡ^＋３表現型と相関することが判明した。それゆえに、ここに提供されるコンパニオン診断方法において、腫瘍サンプルを、ＨＡレベルについてここで提供されるＨＡＢＰ試薬を使用して免疫組織化学的方法またはスコア化に適する他の方法で評価する。当業者に知られ、ここに記載する方法で決定してＨＡ表現型がＨＡ^＋３であるならば、対象をヒアルロニダーゼまたは修飾ヒアルロニダーゼ(例えばＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０)のようなヒアルロナン分解酵素での処置の候補として選択する。類似の定量化および分類方法を血液または血漿のような体液中のＨＡの評価に利用できる。処置のためのＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０のようなヒアルロナン分解酵素の投与量およびレジメンをここに提供する。

【0208】

ここに提供するＨＡＢＰ試薬は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)またはサンドイッチＥＬＩＳＡまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを含む他の類似の免疫アッセイ；免疫組織化学(ＩＨＣ)；フローサイトメトリーまたはウェスタンブロットを含むが、これらに限定されない当業者に知られたあらゆる結合アッセイを使用してＨＡを検出できる。結合アッセイは、血漿、尿、腫瘍または疑われる腫瘍組織(新鮮な、凍結し、固定またはパラフィン包埋組織を含む)、リンパ節組織または骨髄からのものを含む、あらゆるタイプの患者体液、細胞または組織サンプルから得たサンプルで実行できる。

【0209】

サンプル中のＨＡの量が決定されたら、その量を対照または閾値レベルと比較し得る。例えば、サンプル中でのＨＡの量が高いと決定されたら、対象を腫瘍治療候補として選択する。処置のために対象を診断、予後診断または選択するための腫瘍サンプルまたは体液サンプルの層別化のための方法の例をここに提供する。

【0210】

一例として、診断方法は、患者からのタンパク質を含む腫瘍組織、腫瘍細胞または体液のサンプルを使用する。本方法において、ＨＡの存在および発現レベルをここに提供するＨＡＢＰ、例えばＴＳＧ−６−ＬＭ、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃまたはその変異体または突然変異体を使用して決定できる。ＨＡの発現レベルを、決定および／または疾患と関連する予め決定したＨＡ表現型と比較してスコア化する。下記のとおり、これらの予め決定した値は、同じ検出アッセイで同じＨＡＢＰ試薬を使用して決定した対応する正常サンプルにおけるＨＡレベルの比較または知識により決定できる。特定の疾患、ＨＡ検出に使用するアッセイおよび／または使用するＨＡＢＰ検出試薬により疾患診断の閾値レベルを決定することは当業者のレベルの範囲内である。例えば、血漿のような体液において、０.０１５μg／mLを超えるおよび一般的に０.０２μg／mL、０.０３μg／mL、０.０４μg／mL、０.０５μg／mL、０.０６μg／mLを超えるまたはそれ以上のＨＡレベルは腫瘍または癌の存在と相関する。他の例において、免疫組織化学的方法においてＨＡ^＋２またはＨＡ^＋３のスコアの腫瘍組織は疾患の決定因であり得る。レベルが疾患を指示するならば、患者を腫瘍を有すると診断する。

【0211】

他の例において、予後診断方法は、患者からのタンパク質を含む腫瘍組織、腫瘍細胞または体液のサンプルを使用する。本方法において、ＨＡの存在および発現レベルをここに提供するＨＡＢＰ、例えばＴＳＧ−６−ＬＭ、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃまたはその変異体または突然変異体を使用して決定できる。ＨＡの発現レベルを、決定および／または疾患と関連する予め決定したＨＡ表現型と比較してスコア化する。下記のとおり、これらの予め決定した値は、同じ検出アッセイで同じＨＡＢＰ試薬を使用して決定した対応する対応する正常サンプルまたは疾患対象サンプルにおけるＨＡレベルの比較または知識により決定できる。特定の疾患、ＨＡ検出に使用するアッセイおよび／または使用するＨＡＢＰ検出試薬により疾患予後診断の閾値レベルを決定することは当業者のレベルの範囲内である。ＨＡ発現レベルは、患者における予測される疾患の経過進行を示す。例えば、定量的スコアスキームを使用した免疫組織化学的方法で評価して高ＨＡレベル(例えばＨＡ^＋３)は、多様な癌タイプにわたる悪性疾患の存在と相関する。他の例において、０.０６μg／mL ＨＡより高い血漿のような体液中のＨＡレベルはまた進行疾患段階と相関する。

【0212】

コンパニオン診断方法のさらなる例において、投与量またはスケジュールを最適化するために、予めヒアルロナン分解酵素で処置した対象由来のサンプルで発現されるＨＡのレベルをモニターして、投与されている対象が薬物の有効な血液レベルとなっているか否かを決定できる。

【0213】

次のセクションは診断および予後診断方法および特に抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での治療のコンパニオンとして使用するための、ＨＡ検出方法を実施するためのＨＡＢＰ試薬およびアッセイを記載する。さらに記載されるのは、処置ヒアルロナン関連疾患および障害の処置に使用するためのヒアルロナン分解酵素剤を含む抗ヒアルロナン剤ならびにＨＡＢＰ試薬とこのような薬物(例えばヒアルロナン分解酵素群)のキットおよび組み合わせである。上記方法のいずれも記載するＨＡＢＰ試薬およびアッセイ検出方法を単独でまたは抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での治療と組み合わせて使用して実施できる。

【0214】

Ｃ. コンパニオン診断として使用するためのヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ類)
ここで提供される方法は、ヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)を使用する、腫瘍を有するまたは腫瘍を有することが疑われる対象由来の腫瘍または体液サンプルのようなサンプルにおけるヒアルロナンの定量的または半定量的測定に関する。ここに記載するとおり、上昇したまたは高レベルのヒアルロナンを発現する腫瘍は抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置に応答性であり、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での腫瘍阻害の程度ヒアルロナン蓄積の程度または量と相関し、内在性ヒアルロナンシンターゼ群またはヒアルロニダーゼ群の発現のような他のマーカーと相関しない。セクションＤに記載するその検出のためのアッセイとともにここに提供する方法において使用するために提供されるＨＡＢＰ類は、サンプル中のＨＡの特異的かつ感受性の検出を可能にする。

【0215】

ここに提供するＨＡＢＰコンパニオン診断は、処置に応答することが予測される患者の選択または同定および／または処置および処置の効果のモニターのためにヒアルロナン分解酵素治療剤またはセクションＥに記載するいずれかのような抗ヒアルロナン剤での治療と組み合わせて使用でき、それによりヒアルロナン関連疾患または状態の改善した処置レジメンを提供する。例えば、ここで提供するＨＡＢＰコンパニオン診断は、腫瘍または癌を有する対象または患者の選択および／またはモニターに使用できる。さらに、ＨＡＢＰコンパニオン診断はまた腫瘍または癌のようなヒアルロナン関連疾患または状態の他の診断および予後診断方法に使用できる。

【0216】

ここで提供されるのは、サンプル中のヒアルロナンの検出および定量のためのここに提供する方法で使用するためのヒアルロナン結合タンパク質である。ヒアルロナン結合タンパク質は完全長ＨＡＢＰポリペプチドまたはＨＡＢＰ類のＨＡ結合ドメインまたはＨＡと結合するのに十分なその一部を含み得る。典型的に、ＨＡＢＰ類またはＨＡ結合ドメインを含むその一部またはＨＡと結合するのに十分なその一部またはその変異体または多量体は、解離定数(Kd)で少なくとも多くてもまたは多くてもまたは正確に１×１０^−７Ｍおよび一般的に少なくとも多くてもまたは多くてもまたは正確に９×１０^−８Ｍ、８×１０^−８Ｍ、７×１０^−８Ｍ、６×１０^−８Ｍ、５×１０^−８Ｍ、４×１０^−８Ｍ、３×１０^−８Ｍ、２×１０^−８Ｍ、１×１０^−８Ｍ、９×１０^−９Ｍ、８×１０^−９Ｍ、７×１０^−９Ｍ、６×１０^−９Ｍ、５×１０^−９Ｍ、４×１０^−９Ｍ、３×１０^−９Ｍ、２×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍまたはそれより低いKdの結合親和性を示す。ここに記載するとおり、示される親和性は、一般的に最適または最適に近いヒアルロナンへの結合が達成できる条件下で示される。一例として、ｐＨ条件は結合に影響し得る。例えば、ここでのコンパニオン診断として、ＴＳＧ−６−ＬＭまたはＨＡと結合するのに十分なその一部、その変異体およびその多量体を含むＴＳＧ−６試薬を使用する結合アッセイは、一般的に約または正確にｐＨ６.０のような正確にまたは約ｐＨ５.８〜６.４のｐＨで行う。

【0217】

ヒアルロナン結合タンパク質は、１個または２個の結合モジュールを含むＨＡ結合ドメインを有するヒアルロナン結合タンパク質および結合モジュールではないＨＡ結合ドメインを有するヒアルロナン結合タンパク質の２種である。具体例において、ここで提供されるコンパニオン診断は、ＨＡ結合に関与する１個のみの結合ドメインを有するＨＡＢＰ結合分子に由来し、これは発現、産生および精製方法を単純化できる。

【0218】

ここに提供するＨＡＢＰ類は既知ＨＡＢＰ類由来であってよくまたは合成により産生できる。ある例において、ＨＡＢＰ類は、知られたＨＡＢＰ類のＨＡ結合ドメイン保存残基に基づき合成により産生できる。ここに提供するＨＡＢＰ類は、またファージディスプレイまたは親和性に基づくスクリーニング方法のようなＨＡ結合タンパク質のスクリーニング方法から産生されるＨＡＢＰ類である。

【0219】

ここに提供するＨＡＢＰ類のＨＡ結合ドメインまたはＨＡに結合するのに十分なその一部を含むＨＡＢＰ類は、ここに提供する方法において使用するためのＨＡＢＰ類の１個以上の特性を改善するために修飾できる。例えば、ここに提供するＨＡＢＰ類またはそのＨＡ結合フラグメントは、ＨＡに対する結合能を維持する限り、哺乳動物発現系におけるタンパク質発現増加、安定性および溶解度のような生物物理学的特性改善、タンパク質精製および検出改善、ＨＡに対する特異性増加および／またはＨＡに対する親和性増加のために改善できる。例えば、本方法において使用するためにここに提供するＨＡＢＰまたはそのＨＡ結合フラグメントを、他のグリコサミノグリカン類と比較してヒアルロナンへの特異性を高めるために修飾できる。他の例において、本方法において使用するためにここに提供するＨＡＢＰまたはそのＨＡ結合フラグメントは、分子上のＨＡ結合部位数を増やすために多量体化ドメインと直接的または間接的に結合でき、それによりＨＡに対する結合親和性を高める。

【0220】

さらに、ここでのコンパニオン診断として使用するために、ＨＡＢＰ類またはその一部(例えば結合モジュールまたはＨＡと結合するのに十分なその一部)のいずれも検出を容易にするために修飾できる。例えば、コンパニオン診断は、直接的または間接的に、ビオチン、蛍光部分、放射性標識または他の検出可能な標識と結合することにより修飾する。

【0221】

ここでのコンパニオン診断として使用するためのＨＡＢＰ類およびその修飾体を下に提供する。

【0222】

１. 結合モジュールまたはＧ１ドメインを有するＨＡ結合タンパク質
ここに提供する方法において使用するためのコンパニオン診断試薬としてここに提供されるのは、少なくとも１個の結合モジュールまたは結合ドメインを含み、一般的に少なくとも２個以上結合モジュールを含むＨＡ結合タンパク質(ＨＡＢＰ)またはその一部である。いくつかの例において、ＨＡＢＰは２個の結合モジュールを含むＧ１ドメインを含む。ＨＡへの結合は結合モジュールが仲介する。結合モジュールは、プロテオグリカンタンデムリピートとも呼ばれ、約１００アミノ酸(ａａ)長であり、パターンＣｙｓ１−Ｃｙｓ４およびＣｙｓ２−Ｃｙｓ３でジスルフィド結合している４個のシステインを含む。結合モジュールの三次元構造は、２個のアルファ−螺旋および２個の三本鎖逆平行ベータ−シートから成る。

【0223】

結合モジュール含有タンパク質は、単一結合モジュールを含むＡドメイン型タンパク質、ＮおよびＣ末端フランキング領域で伸長した単一結合モジュールを含むＢドメイン型タンパク質および１個のＮ末端Ｖ型Ｉｇ様ドメインと続く２個の結合モジュールの近接対を含むＧ１ドメインと呼ばれる伸長された構造を有するＣドメイン型タンパク質の３カテゴリーが存在する。モデリングおよび比較試験により、ＨＡの相互作用と相関する結合モジュール含有タンパク質間のある種のアミノ酸の高程度の分割および保存が証明されている(Blundell et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:18189-18201)。例えば、配列番号３６０に示すＴＳＧ−６−ＬＭを参照にしたナンバリングでＴｙｒ５９およびＴｙｒ７８に対応する中心ＨＡ結合アミノ酸残基は、ＴＳＧ−６−ＬＭ(例えば配列番号３６０に示す)との整列に基づき対応する位置で結合モジュール含有ＨＡＢＰ類で同一または保存的アミノ酸(例えば、ＧｌｃＮＡｃ環に対してまた積み重ねることができる芳香族または大および平面表面疎水性残基、例えば、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＶａｌ)で保存されている。また、配列番号３６０に示す位置１１および８１に対応する位置の塩基性残基も、整列により決定して他の結合モジュールで見られる。

【0224】

ここに提供する方法で使用するための結合モジュールを含むＨＡ結合タンパク質は、ＴＳＧ−６(例えば前駆体として配列番号２０６におよびシグナル配列を欠く成熟タンパク質として配列番号２２２に示す；または文献で報告されているとおり種々の長さのＬＭを示す、配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すＬＭ)、スタビリン−１(例えば配列番号２２３に示すまたはその成熟形態；または配列番号３７１に示すＬＭ)、スタビリン−２(例えば配列番号２２４に示すまたはその成熟形態；または配列番号３７２に示すＬＭ)、ＣＤ４４(例えば配列番号２２７に示すまたはその成熟形態；または配列番号３７５に示すＬＭ)、ＬＹＶＥ−１(例えば配列番号２２８に示すまたはその成熟形態；または配列番号３７６に示す結合モジュール)、ＨＡＰＬＮ１(例えばＨＡＰＬＮ１−１およびＨＡＰＬＮ１−２；例えば、配列番号２２９に示すまたはその成熟形態；または配列番号３７７または３７８に示す１個または複数個のＬＭ)、ＨＡＰＬＮ２(例えばＨＡＰＬＮ２−１およびＨＡＰＬＮ２−２；例えば配列番号２３０に示すまたはその成熟形態；または配列番号３７９または３８０に示す１個または複数個のＬＭ)、ＨＡＰＬＮ３(例えばＨＡＰＬＮ３−１およびＨＡＰＬＮ３−２；例えば配列番号２３１に示すまたはその成熟形態；または配列番号３８１または３８２に示す１個または複数個のＬＭ)、ＨＡＰＬＮ４(例えばＨＡＰＬＮ４−１およびＨＡＰＬＮ４−２；例えば配列番号２３２に示すまたはその成熟形態；または配列番号３８３または３８４に示す１個または複数個のＬＭ)、アグリカン(例えばアグリカン１、アグリカン２、アグリカン３およびアグリカン４；例えば配列番号２３３に示すまたはその成熟形態；または配列番号３８５、３８６、３８７または３８８に示す１個または複数個のＬＭ)、バーシカン(例えばバーシカン１およびバーシカン２；例えば配列番号２３５に示すまたはその成熟形態；または配列番号３９１または３９２に示す１個または複数個のＬＭ)、ブレビカン(例えばブレビカン１およびブレビカン２；例えば配列番号２３４に示すまたはその成熟形態；または配列番号３８９または３９０に示す１個または複数個のＬＭ)、ニューロカン(例えばニューロカン１およびニューロカン２；例えば配列番号２３６に示すまたはその成熟形態；例えば配列番号３９３または３９４に示す１個または複数個のＬＭ)およびホスファカン(例えば配列番号３４０に示すまたはその成熟形態)を含むが、これらに限定されない。ここでの方法において使用するために提供されるＨＡＢＰの例はＴＳＧ−６である。

【0225】

ここでの具体例において、ここでの方法に使用するＨＡＢＰは少なくとも１個の結合モジュールを含み、ある場合には少なくとも２個または少なくとも３個の結合モジュールを含む。ＨＡＢＰは結合モジュールを含む完全長ＨＡＢＰであり得る。例えば、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断試薬は、配列番号２０６および２２３〜２３６のいずれかに示すアミノ酸の配列、その成熟形態または配列番号２０６および２２３〜２３６のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み得る。例えば、ここでのコンパニオン診断として使用するためのＨＢＰＡは、配列番号２２２に示すアミノ酸の配列または配列番号２２２に示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する完全長ＴＳＧ−６であり得る。

【0226】

他の例において、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断試薬は、配列番号２０６および２２３〜２３６のいずれかに示す完全長ＨＡＢＰまたはその成熟形態(シグナル配列を欠く)に由来する結合モジュールまたはＨＡに結合するのに十分な結合モジュールの一部のみを含む。いくつかの例において、１個または複数個の結合モジュールを含むＨＡＢＰは、配列番号２０６および２２３〜２３６のいずれかに示すＨＡＢＰの完全配列またはその成熟形態(シグナル配列を欠く)ではない。ＨＡＢＰまたは結合モジュールの部分は、一般的に近接アミノ酸の配列であり、これは一般的に、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００以上のアミノ酸長のような少なくとも５０アミノ酸であることは理解される。いくつかの例において、１個または複数個の結合モジュールコンパニオン診断結合分子の唯一のＨＡＢＰ部分である。例えば、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断試薬完全長ＨＡＢＰの部分のみを含み、配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示すアミノ酸の配列または配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。

【0227】

ここでの例において、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断試薬はＧ１ドメインまたはＨＡと特異的に結合するのに十分なその一部を含む。Ｇ１ドメインを含むＨＡＢＰは配列番号２３３〜２３６のいずれかに示す完全長ＨＡＢＰまたはその成熟形態に由来し得る。いくつかの例において、Ｇ１ドメインを含むＨＡＢＰは、配列番号２３３〜２３６のいずれかに示すＨＡＢＰの完全配列またはその成熟形態ではない。Ｇ１ドメインを含むＨＡＢＰの部分は一般的に近接アミノ酸の配列であり、これは一般的に、１５０、２００、２５０、３００、４００以上のアミノ酸のような少なくとも１００アミノ酸長であることは理解される。いくつかの例において、Ｇ１ドメインコンパニオン診断結合分子の唯一のＨＡＢＰ部分である。例えば、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断試薬完全長ＨＡＢＰの部分のみを含み、配列番号４２３〜４２６のいずれかに示すアミノ酸の配列または配列番号４２３〜４２６のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するＧ１ドメインである。

【0228】

いくつかの例において、コンパニオン診断は、２個または３個の結合モジュールのような１個を超える結合モジュールを含む。結合モジュールは同一または異なるＨＡＢＰに由来し得る。コンパニオン診断は、直接的または間接的に結合して単一ポリペプチドを形成する結合モジュールを含み得る。他の例において、コンパニオン診断は、ジスルフィド結合を介するように化学的結合している、別のポリペプチドとして示される結合モジュールであり得る。ここでの方法において使用するために提供されるＨＡＢＰフラグメントの例は、ＴＳＧ−６の結合ドメイン(ＴＳＧ−６−ＬＭ)またはＨＡと結合するのに十分なその一部である。

【0229】

いくつかの例において、ＨＡＢＰは、二量体または三量体分子を形成し、複数ＨＡ結合部位を産生するための多量体化ドメインを介して直接的または間接的に結合する２個以上の結合モジュールを含む多量体である。例えば、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断は、免疫グロブリンのＦｃ部分のような多量体化ドメインをコードする核酸と直接的または間接的に結合した配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示す結合モジュールまたは配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする核酸分子の発現により製造する。それゆえに、得られたＨＡＢＰ多量体またはＬＭ−多量体は、多量体化ドメインに直接的または間接的に結合した配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示す第一ポリペプチドまたは配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列；および多量体化ドメインに直接的または間接的に結合した配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示す第二ポリペプチドまたは配列番号２０７、３６０、３６１、３７１〜３９４および４１６〜４１８のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。第一および第二ポリペプチドの結合モジュールの配列は同一でも異なってもよい。ここでの方法において使用するために提供されるＨＡＢＰ多量体の例は、２個のポリペプチド鎖を含む多量体であり、それによって各々が多量体化を行うための多量体化ドメインに直接的または間接的に結合したＳＧ−６−ＬＭ、その変異体またはＨＡに結合するのに十分なその一部を含む。例えば、本方法で使用するためにここで提供されるのはＴＳＧ−６−ＬＭ：Ｆｃ分子(例えば配列番号２１２または２１５参照)である。

【0230】

結合ドメインを含むＨＡＢＰ類の構造および機能説明を含む例の記載を下に提供する。記載したＨＡＢＰ類または結合ドメインのみを含むフラグメントまたはＨＡに結合するのに十分なその一部のようなその一部のいずれも、ここでの方法においてコンパニオン診断試薬として使用できる。結合ドメインまたは他のドメインのドメイン組織を記載するために使用する配列番号として示される特異的配列を含むアミノ酸の記載は説明目的であり、提供される態様の範囲を限定することを意図しないことは理解される。ポリペプチドおよびそのドメインの説明は、類似分子との相同性分析および整列により理論的に導いていることは理解される。それゆえに、正確な座位は変わることがあり、各ＨＡＢＰで必ずしも同じではない。それゆえに、特異的結合ドメインのような特異的ドメインは数アミノ酸(１個、２個、３個または４個)長くても短くてもよい。

【0231】

ａ. タイプＡ：ＴＳＧ−６サブグループ
ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断としてここに提供されるのは、ヒアルロナンに結合する単一結合モジュールを含むタイプＡサブグループのメンバーであるＨＡＢＰ類である。タイプＡ ＨＡＢＰ類はＨＡと６糖類、ヘキササッカライド(ＨＡ_６)以上の最小鎖長で結合する。ここに提供する方法においてコンパニオン診断として使用できるタイプＡサブグループのメンバーは、ＴＳＧ−６、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８およびＫＩＡＡ０５２７、その結合モジュールまたはＨＡと結合するのに十分な結合モジュールの一部を含むが、これらに限定されない。

【0232】

ｉ. ＴＳＧ−６
ここで提供される方法においてコンパニオン診断試薬として使用するために提供されるタイプＡサブグループＨＡＢＰの例は、ＴＳＧ−６またはその結合モジュール、ＨＡに結合するのに十分な結合モジュールの一部、その変異体またはその多量体である。腫瘍壊死因子刺激遺伝子−６(ＴＳＧ−６、腫瘍壊死因子アルファ誘発タンパク質６、ＴＮＦＡＩＰ６；配列番号２０６)は、単一Ｎ末端結合モジュールおよびＣ末端ＣＵＢドメインからなる〜３５kDa分泌型糖タンパク質である。ＴＳＧ−６の発現は多くの細胞型でサイトカイン類および増殖因子を含む炎症メディエーターにより誘発される。その結合モジュールを介して、ＴＳＧ−６は、多形核白血球遊走の強力な阻害剤である、ＴＳＧ−６は、セリンプロテアーゼ阻害剤インター−アルファ−阻害剤(ＩαＩ)と安定な複合体を形成し、ＩαＩの抗プラスミン活性を促進する。ＴＳＧ−６はまたＨＡ富細胞周囲コートおよび細胞外マトリックスの形成およびリモデリングに重要である。

【0233】

ヒトＴＳＧ−６転写物(配列番号２０５)は、通常翻訳されて、Ｎ末端に１７アミノ酸シグナル配列を含む２７７アミノ酸前駆体ペプチド(配列番号２０６)を形成する。成熟ＴＳＧ−６(配列番号２２２に示す)は、それ故、配列番号２０６のアミノ酸１８〜２７７を含む２６０アミノ酸タンパク質である(Lee et al. (1992) J Cell Biol 116:545-557)。ＴＳＧ−６は２個の主ドメイン、結合モジュールおよびＣＵＢドメインから成る。ＴＳＧ−６の結合モジュールは、文献で配列番号２０６のアミノ酸３５〜１２９、３６〜１２８、３６〜１２９または３６〜１３２(それぞれ配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示す)に位置するとさまざまに報告されている。ドメインの座位の記載は、配列の差異により数アミノ酸変わり得ることは理解される。それゆえに、本発明の目的のために、ＴＳＧ−６−ＬＭは配列番号２０７、３６０、４１７または４１８に示すいずれかまたはこのような配列から１個、２個または３個のアミノ酸異なるものである。ＣＵＢドメインは、配列番号２０６のアミノ酸１３５〜２４６に位置する。ヒトＴＳＧ−６は、配列番号２０６の残基Ｎ１１８およびＮ２５８に２個の可能性のあるＮ結合グリカン類を有する。さらに、配列番号２０６の残基Ｔ２５９およびＴ２６２はリン酸化される(Molina et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:2199-2204)。ヒトＴＳＧ−６は８個の天然システインを含み、これは、プレタンパク質ＴＳＧ−６(配列番号２０６)の残基Ｃ５８−Ｃ１２７、Ｃ８２−Ｃ１０３、Ｃ１３５−Ｃ１６１およびＣ１８８−Ｃ２１０でジスルフィド結合を形成する。

【0234】

ＴＳＧ−６結合モジュール(配列番号３６０)は相対的に小さいサイズおよび十分に特徴づけされた構造を有する。ＴＳＧ−６結合ドメインの三次元構造は決定され、大疎水性コアの周りに配置された２個のアルファ螺旋および２個の逆平行ベータシートを含む、他の知られた結合モジュールと同じ落ち畳であることが判明した(Kohda et al. (1996) Cell 86:767-775)。さらに、ＴＳＧ−６の結合モジュールとＨＡの相互作用は試験され、ＴＳＧ−６の結合ドメイン(配列番号３６０)のＴｙｒ１２、Ｔｙｒ５９、Ｐｈｅ７０、Ｔｙｒ７８、Ｔｒｐ８８の芳香環および塩基性残基Ｌｙｓ１１、Ｌｙｓ７２、Ａｓｐ７７、Ａｒｇ８１およびＧｌｕ８６がＨＡとの結合に重要であることが明らかにされた(例えば、Kahmann et al. (2000) Structure 8:763-774; Mahoney et al. (2001) J Biol Chem 276:22764-22771; Kohda et al. (1996) Cell, 88:767-775; Blundell et al. (2003) J Biol Chem 278:49261-49270; Lesley et al. (2004) J Biol Chem 279:25745-25754; Blundell et al. (2005) J Biol Chem 280:18189-18201参照)。構造的試験はまた結合モジュールに含まれる唯一の単一ＨＡ結合部位が存在し、これは、構造的マップに基づき分子の残基Ｌｙｓ１１、Ｔｙｒ１２、Ｔｙｒ５９、Ｐｈｅ７０およびＴｙｒ７８の一つの領域に局在し、これがＨＡ結合ともっとも直接的に関与することも示す(例えばMahoney et al. (2001) J Biol Chem 276:22764-22771参照)。

【0235】

ＴＳＧ−６の結合モジュールは、数グリコサミノグリカン類に結合活性を示す。例えば、結合モジュールのＨＡ、コンドロイチン−４−スルフェート(Ｃ４Ｓ)、プロテオグリカンアグリカンのＧ１−ドメイン、ヘパリンおよびＩαＩのビクニン鎖への結合を明らかにする試験がある(例えば、Milner et al. (2003) Journal of Cell Science, 116:1863-1873; Mahoney et al. (2005) Journal of Biological Chemistry, 280:27044-27055参照)。ヘパリンおよびＨＡへのＴＳＧ−６の結合は、ＴＳＧ−６のＬＭの別の結合部位が仲介する。ヒアルロナンへのＴＳＧ−６−ＬＭ結合に関与する残基はＬｙｓ１１、Ｔｙｒ１２、Ｔｙｒ５９、Ｐｈｅ７０およびＴｙｒ７８であり、それによって変異体Ｋ１１Ｑ、Ｙ１２Ｆ、Ｙ５９Ｆ、Ｆ７０ＶおよびＹ７８Ｆは、野生型と比較してＨＡ結合親和性が１０〜１００倍低く、ヘパリンへの結合に関与するＴＳＧ−６−ＬＭ中の残基はＬｙｓ２０、Ｌｙｓ３４、Ｌｙｓ４１、Ｌｙｓ５４、Ａｒｇ５６およびＡｒｇ８４であり、それによって変異体Ｋ２０Ａ、Ｋ３４Ａ、Ｋ４１ＡおよびＫ５４Ａはヘパリン結合特性が障害され、ビクニンへのＴＳＧ−６−ＬＭ結合に関与する残基はＨＡ結合部位と重複するが、同一ではない(Mahoney et al. (2005) Journal of Biological Chemistry, 280:27044-27055)。

【0236】

ＴＳＧ−６のヒアルロナンへの結合はｐＨ依存的であり、結合活性は正確にまたは約ｐＨ５.８〜ｐＨ６.０のような約または正確にｐＨ５.６〜６.４の酸性ｐＨで示される。

【0237】

ここでの方法においてコンパニオン診断として使用するためにここに提供するＴＳＧ−６ポリペプチド、そのＨＡ結合ドメイン、例えば、ＴＳＧ−６結合モジュールまたはＨＡと結合するのに十分なそのフラグメントは、配列番号２０６、２０７、２２２、３６０、４１７または４１８のいずれかまたは配列番号２０６、２０７、２２２、３６０、４１７または４１８のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示す変異体のようなその変異体を含み得る。変異体の例は、例えば、種変異体、保存的および非保存的アミノ酸変異を含む対立形質変異体および変異体を含む。ヒトＴＳＧ−６の天然対立形質変異体は、例えば、アミノ酸置換Ｑ１４４Ｒを含むＴＳＧ−６を含む(配列番号４０７、Nentwich et al. (2002) J Biol Chem 277:15354-15362)。ＴＳＧ−６は種間で高度に保存され、マウスおよびヒトタンパク質は＞９４％同一である。ここで提供する方法においてコンパニオン診断として使用するためのＴＳＧ−６またはそのＨＡ結合フラグメントの種変異体は、マウス(配列番号２５２)、ウサギ(配列番号２５３)、ウシ(配列番号２５４)、ウマ(配列番号４０９)、チンパンジー(配列番号４０８)、イヌ(配列番号４１０)、マウス(配列番号４１１)、ニワトリ(配列番号４１２)、カエルであるアフリカツメガエル(配列番号４１３)、ゼブラフィッシュ(配列番号４１４)、その成熟形態または結合モジュールまたはＨＡと結合するのに十分なその一部を含むが、これらに限定されない。

【0238】

ここで提供する方法において使用するためのＴＳＧ−６の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸置き換え(置換)、欠失または挿入であるアミノ酸修飾された変異体を含む。修飾の例は、配列番号３６０、４１７または４１８に示すＴＳＧ−６の残基に対応するアミノ酸残基４、６、８、１３、２０、２９、３４、４１、４５、５４、６７、７２または９６のいずれかでのアミノ酸置換のようなアミノ酸置換を含む。置換アミノ酸は任意の他のアミノ酸残基であり得る。ここで提供する方法においてコンパニオン診断試薬として使用するためのここに提供するＴＳＧ−６ポリペプチドまたはそのＨＡ結合フラグメントのアミノ酸置換の例は、配列番号３６０、４１７または４１８に示すＴＳＧ−６の残基に対応するＨ４Ｋ、Ｈ４Ｓ、Ｅ６Ａ、Ｅ６Ｋ、Ｒ８Ａ、Ｋ１３Ａ、Ｋ２０Ａ、Ｈ２９Ｋ、Ｋ３４Ａ、Ｋ４１Ａ、Ｈ４５Ｓ、Ｋ５４Ａ、Ｎ６７Ｌ、Ｎ６７Ｓ、Ｋ７２Ａ、Ｈ９６Ｋ、Ｋ３４Ａ／Ｋ５４ＡまたはＫ２０Ａ／Ｋ３４Ａ／Ｋ４１に対応する少なくとも１個のアミノ酸置換を含む修飾ＴＳＧ−６ポリペプチドまたはそのＨＡ結合フラグメントである(例えば、Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055, Blundell et al. (2007) J Biol Chem 282:12976-12988, Lesley et al. (2004) J Biol Chem 279:25745-25754, Kahmann et al. (2000) Structure 15:763-774参照)。上記のまたは当業者に知られたようなＴＳＧ−６のＨＡへの結合に重要なまたは他に必要な残基は、一般的に不変であり、変えることができないことは理解される。それゆえに、例えば、ＴＳＧ−６の結合モジュールにおける配列番号３６０のアミノ酸残基１１、１２、５９、７０、７８および８１は一般的に不変であり、変えない。さらに、結合モジュールの不適切な折りたたみまたは折りたたみの混乱をもたらすアミノ酸修飾は一般的に不変であることは理解される。それゆえに、例えば、ここでの方法に使用するために提供される修飾ＴＳＧ−６は、配列番号３６０のＨ４Ｓ、Ｈ２９Ａ、Ｈ４５Ａ、Ｈ４５Ｋ、Ｒ５６Ａ、Ｄ７７Ａ、Ｒ８４ＡおよびＤ８９Ａの任意の１個以上にアミノ酸修飾を含まない(Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055, Blundell et al. (2007) J Biol Chem 282:12976-12988, Lesley et al. (2004) J Biol Chem 279:25745-25754)。

【0239】

特に、修飾、例えば１箇所または複数個所アミノ酸置換は、修飾を含まないＴＳＧ−６と比較して、改善のような改変された活性を提供するものである。このような変異体は、ＴＳＧ−６のＨＡへの結合親和性を高める、ＴＳＧ−６のＨＡへの特異性を高めるおよび／またはＴＳＧ−６の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものである。例えばここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＴＳＧ−６のヘパリン、コンドロイチン−４−スルフェート、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸を含む他のグリコサミノグリカン類への結合を低下させることによりＴＳＧ−６のＨＡへの特異性を高めたＴＳＧ−６変異体、ＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部である。ヒアルロナンではない他のグリコサミノグリカンへの結合は、修飾を含まないＴＳＧ−６−ＬＭの結合と比較して、少なくとも１.２倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍以上減少できる。例えば、ここで提供されるのは、アミノ酸残基２０、３４、４１、５４、５６、７２および／または８４および特にアミノ酸残基２０、３４、４１および／または５４(配列番号２０６に示すアミノ酸残基に対応)にアミノ酸置換を含む変異体ＴＳＧ−６−ＬＭである。置換アミノ酸はあらゆる他のアミノ酸残基でよく、一般的に非塩基性アミノ酸残基へである。例えば、アミノ酸置換はＡｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｍｅｔ(Ｍ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｙｒ(Ｙ)またはＴｒｐ(Ｗ)へであり得る。１箇所または複数個所アミノ酸置換はヘパリンへの結合を減少させる。例えば、ＴＳＧ−６のヘパリンへの結合能を減少させた変異体は当業者に知られる。このような変異体は、変異体Ｋ３４Ａ／Ｋ５４ＡまたはＫ２０Ａ／Ｋ３４Ａ／Ｋ４１Ａを含む、Ｋ２０Ａ、Ｋ３４Ａ、Ｋ４１ＡおよびＫ５４Ａに対応する少なくとも１個の変異を含むものである(Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055)。ヘパリンへの結合が減少または低下した変異体の例は配列番号３６１または４１６に示す変異体ＴＳＧ−６−ＬＭである。

【0240】

ここで提供される方法において使用するためのここで提供されるＴＳＧ−６ポリペプチドの例は、少なくとも１個のＨＡ結合ドメイン、例えば、ＴＳＧ−６結合モジュールを含むＴＳＧ−６ポリペプチドである。それゆえに、ここで提供されるのは、ここで提供する方法において使用するための、ＴＳＧ−６結合モジュールまたはその変異体である。このようなポリペプチド試薬の例は、配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８に示すアミノ酸の配列を有するものまたは配列番号２０７、３６０、３６１、４１６、４１７または４１８のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９５％、９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するものである。例えば、ＴＳＧ−６結合モジュールは、ＨＡへの結合能が維持されている限り、その特異性、親和性または溶解度を変えるように修飾できる。

【0241】

さらに他の例において、ＴＳＧ−６結合モジュールの親和性は、例えば、Ｆｃドメインのような多量体化ドメインへの融合によるような二量体化または多量体化により高める(下記セクションＣ３参照)。それゆえに、ＴＳＧ−６結合モジュールは２個以上の結合モジュールを含む多量体を産生するように修飾でき、これは多量体化ドメインに直接的または間接的に結合して、二量体または三量体分子の形成および複数ＨＡ結合部位の産生をする。例えば、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断は、免疫グロブリンのＦｃ部分のような多量体化ドメインをコードする核酸に直接的または間接的に結合した配列番号２０７、３６０、３６１、４１７または４１８のいずれかに示す結合モジュールをコードする核酸分子または配列番号２０７、３６０、３６１、４１７または４１８のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸の配列を有する結合モジュールをコードする核酸の発現により産生する。それゆえに、得られたＴＳＧ−６−ＬＭ多量体は、多量体化ドメインと直接的または間接的に結合した配列番号２０７、３６０、３６１、４１７または４１８のいずれかに示す第一ポリペプチドまたは配列番号２０７、３６０、３６１、４１７または４１８のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸の配列；および多量体化ドメインと直接的または間接的に結合した配列番号２０７、３６０、３６１、４１７または４１８または配列番号２０７、３６０、３６１、４１７に示す第二ポリペプチドまたは４１８のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。一般的に、ＬＭまたはＨＡ結合を行うのに十分なその一部は多量体の唯一のＴＳＧ−６部分である。例えば、本方法で使用するためにここで提供されるのはＴＳＧ−６−ＬＭ：Ｆｃ分子(例えば配列番号２１２または２１５参照)である。

【0242】

他の例において、ＴＳＧ−６結合モジュールは、溶解度を高めるためにＦｃドメインと結合する(下記セクションＣ３参照)。

【0243】

ii. スタビリン−１およびスタビリン−２
ここで提供される方法においてコンパニオン診断試薬として使用するために提供されるタイプＡサブグループＨＡＢＰの例は、スタビリン−１またはスタビリン−２またはその結合モジュール、ＨＡに結合するのに十分な結合モジュールの一部、その変異体またはその多量体である。スタビリン−１(別名ＳＴＡＢ１、ＣＬＥＶＥＲ−１、ＫＩＡＡ０２４６、ＦＥＥＬ−１、ＦＥＸ−１およびＦＥＬＥ−１；配列番号２２３)およびスタビリン−２(別名ＳＴＡＢ２、ＦＥＥＬ−２、ＣＤ−４４様前駆体ＦＥＬＬ２、ＤＫＦＺｐ４３４Ｅ０３２１、ＦＥＸ２およびエンドサイトーシス用ヒアルロナン受容体／ＨＡＲＥ；配列番号２２４)は、ファシクリン様ヒアルロナン(ＨＡ)受容体ホモログのファミリーのタイプＩ膜貫通型メンバーである。両者とも７個のファシクリン様接着ドメイン、複数ＥＧＦ様反復およびヒアルロナン結合モジュールを含む。スタビリン−１およびスタビリン−２のいずれも類洞内皮およびマクロファージに発現されるが、各々機能的に異なる。スタビリン−１は受容体仲介エンドサイトーシスおよび再利用ならびにエンドソーム区画とトランスゴルジ網(ＴＧＮ)間の往復の２個の細胞内輸送経路に関与する。スタビリン−２はＨＡおよびＡＧＥ−修飾タンパク質のスカベンジャー受容体として働く。

【0244】

スタビリン−１の前駆体配列は配列番号２２３に示す。スタビリン−１の結合モジュールは配列番号２２３の２２０８〜２３００に位置し、配列番号３７１に示す。スタビリン−２の前駆体配列は配列番号２２４に示し、スタビリン−２の結合モジュールは配列番号２２４のアミノ酸２１９８〜２２９０に位置し、配列番号３７２に示す。

【0245】

ここでの方法においてコンパニオン診断として使用するためのここに提供するスタビリン−１またはスタビリン−２ポリペプチド、そのＨＡ結合ドメイン、例えば、スタビリン−ＬＭモジュールまたはＨＡと結合するのに十分なそのフラグメントは、配列番号３７１または３７２に示す結合モジュールまたは配列番号３７１または３７２のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示すその変異体を含む。変異体は、ＨＡへの特異的結合を示す変異体を含む。変異体は、対立形質変異体、種変異体またはアミノ酸修飾(例えばＨＡへの親和性または特異性を挙げるため)を含む他の変異体を含む。ここでの方法において使用するために提供されるスタビリン−１の種変異体は、マウス(配列番号２５５)およびウシ(配列番号２５６)を含が、これらに限定されず、ここでの方法において使用するために提供されるスタビリン−２の種変異体は、マウス(配列番号２５７)およびラット(配列番号２５８)を含むが、これらに限定されない。

【0246】

ここでの方法においてコンパニオン診断として使用するためにまたここで提供されるのはＨＡに対する親和性が増加したスタビリン−１−ＬＭまたはスタビリン−１−ＬＭ多量体である。例えば、ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断は、免疫グロブリンのＦｃ部分のような多量体化ドメインをコードする核酸に直接的または間接的に結合した、配列番号３７１または３７２のいずれかに示す結合モジュールをコードする核酸分子または配列番号３７１または３７２のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する結合モジュールをコードする核酸の発現により産生するものである。それゆえに、得られたＬＭ多量体は、多量体化ドメインと直接的または間接的に結合した配列番号３７１または３７２に示す第一ポリペプチドまたは配列番号３７１または３７２のいずれかに示す配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列；および多量体化ドメインと直接的または間接的に結合した配列番号３７１または３７２に示す第二ポリペプチドまたは配列番号３７１または３７２のいずれかの配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８４％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。

【0247】

ｂ. タイプＢ：ＣＤ４４サブグループ
ここでの方法において使用するためのコンパニオン診断試薬としてここに提供するのは、ヒアルロナンと結合するＮ−およびＣ−末端伸張を有する単一結合モジュールを含むＨＡ結合ドメインを有するタイプＢサブグループのメンバーであるＨＡＢＰ類である。タイプＡ／ＴＳＧ−６サブグループのＨＡ結合ドメインと異なり、結合ドメインのフランキング配列が、タイプＢドメインの構造的完全性に必須であり、ＨＡへの結合に必要である。ここに提供する方法において使用するためのＨＡＢＰ類のタイプＢサブグループのメンバーは、ＣＤ４４およびＬＹＶＥ−１またはそのＨＡ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。

【0248】

ｉ. ＣＤ４４
ここでの方法において使用するために提供されるタイプＢサブグループＨＡＢＰは、ＣＤ４４、ＣＤ４４のＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部である。ＣＤ４４は、ヒアルロナンおよび種々の細胞外および細胞表面リガンドと結合する８０〜２５０kDaタイプＩ膜貫通型糖タンパク質である。ＣＤ４４は多様な機能を有し、細胞外マトリックスの付着、組織およびターンオーバーに関与し、炎症中のリンパ球遊走を仲介する。ＣＤ４４がＨＡと相互作用する能力は、受容体クラスター形成および細胞外ドメインのグリコシル化の変化を含む因子により制限される。ＣＤは、１０個の変異体エクソンの交互のスプライシングにより多数のアイソフォームで存在し、その全てが結合モジュールを含むヒアルロナン結合ドメインを含む。ＣＤ４４完全長配列の例は配列番号２２７に示す。ＣＤ４４のヒアルロナン結合ドメインは約１６０アミノ酸長(配列番号３４１)であり、ジスルフィド結合(配列番号３４１に示すＣＤ４４ ＨＡ結合ドメインのＣｙｓ９およびＣｙｓ１１０)により結合したＮ−およびＣ末端伸張が横にある結合モジュールを含む。Ａｒｇ４１およびＡｒｇ７８はＨＡ結合に重要であり(配列番号３４１に示すＣＤ４４ ＨＡ結合ドメインのアミノ酸Ａｒｇ２２およびＡｒｇ５９に対応)、Ｔｙｒ４２およびＴｙｒ７９(配列番号３４１に示すＣＤ４４ ＨＡ結合ドメインのアミノ酸Ｔｙｒ２３およびＴｙｒ６０に対応)はＣＤ４４機能的活性に必須である。ＣＤ４４の結合ドメインは配列番号３７５に示す。それゆえにここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持するＣＤ４４のフラグメント、例えば、結合ドメインおよびＮ−およびＣ末端フランキングドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むＣＤ４４のフラグメントである。

【0249】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ここに提供する方法において使用するためのＣＤ４４の種変異体は、マウス(配列番号２５９)、ラット(配列番号２６０)、ウシ(配列番号２６１)、イヌ(配列番号２６２)、ウマ(配列番号２６３)、ハムスター(配列番号２６４)、ヒヒ(配列番号２６５)およびゴールデンハムスター(配列番号２６６)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＣＤ４４の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＣＤ４４と比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＣＤ４４のＨＡへの結合親和性を高める、ＣＤ４４のＨＡへの特異性を高めるおよび／またはＣＤ４４の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0250】

ii. ＬＹＶＥ−１
ここで提供される方法において使用するためにここで提供されるのは、ＬＹＶＥ−１、ＬＹＶＥ−１のＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＢサブグループＨＡＢＰである。リンパ管内皮ヒアルロナン(ＨＡ)受容体−１(ＬＹＶＥ−１、ＣＲＳＢＰ−１、ＨＡＲおよびＸＬＫＤ１とも呼ばれる；配列番号２２８)は、リンパ性内皮の管腔側および反管腔側表面の両者およびまた肝臓血管類洞内皮上に発現される６０kDaタイプＩ膜貫通型糖タンパク質である。ＬＹＶＥ−１は、ＨＡの分解および組織からリンパ管管腔への輸送のためのＨＡ内部移行に関与する。リンパ性表面へのＬＹＶＥ−１指向ＨＡ局在化はまた免疫応答または腫瘍転移の側面にも影響する。ＬＹＶＥ−１の結合モジュールは配列番号２２８のアミノ酸４０〜１２９に位置し、配列番号３７６に示す。それゆえにここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持するＬＹＶＥ−１のフラグメント、例えば、結合ドメインおよびＮ−およびＣ末端フランキングドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むＬＹＶＥ−１のフラグメントである。

【0251】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ＬＹＶＥ−１の種変異体は、マウス(配列番号２６７)およびウシ(配列番号２６８)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＬＹＶＥ−１の変異体またはそのＨＡ結合フラグメント、は、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＬＹＶＥ−１と比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＬＹＶＥ−１のＨＡへの結合親和性を高める、ＬＹＶＥ−１のＨＡへの特異性を高めるおよび／またはＬＹＶＥ−１の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0252】

ｃ. タイプＣ：結合タンパク質サブグループ
ここでの方法においてコンパニオン診断試薬として使用するために提供されるのは、結合タンパク質と他のタイプＣ ＨＡ結合タンパク質およびいずれもＨＡへの結合への結合に必要な２個の結合モジュールの結合を仲介する免疫グロブリン(Ｉｇ)ドメインを含むＨＡ結合ドメインを有するタイプＣサブグループのメンバーであるＨＡＢＰ類である。Ｉｇドメインおよび２個の結合モジュールは、集合してタイプＣ ＨＡＢＰ類のＧ１ドメインを構成する。ここに提供する方法において使用するためのＨＡＢＰ類のタイプＣサブグループのメンバーは、ＨＡＰＬＮ１／結合タンパク質、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカンおよびホスファカンまたはそのＨＡ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。

【0253】

ｉ. ＨＡＰＬＮ／結合タンパク質ファミリー
ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質(ＨＡＰＬＮ)ファミリーは、ヒアルロナンに結合し、１個のＩｇ型Ｃ２セットドメインおよび２個の結合ドメインを含む４個の分泌型プロテオグリカン類から成る。

【0254】

(１) ＨＡＰＬＮ１
ここでの方法に使用するためのここに提供するタイプＣサブグループＨＡＢＰは、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ１のＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部である。ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質１(ＨＡＰＬＮ１、結合タンパク質およびＣＲＴＬ１；配列番号２２９とも呼ぶ)は、ＨＡとコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類の相互作用安定化により細胞外マトリックス安定性および柔軟に関与する。ＨＡＬＰＮ１は、ＨＡに結合する２個の結合モジュール(配列番号２２９のアミノ酸１５９〜２５３およびアミノ酸２６０〜３５０)およびアグリカンのＧ１ドメインのＩｇモジュールに結合するＩｇモジュール(配列番号２２９のアミノ酸５３〜１６０)を含む。ＨＡＰＬＮ１は、ＨＡ直鎖骨格と垂直結合したアグリカンおよびＨＡＰＬＮ１を含む三元複合体の形成により、ＨＡとアグリカンの結合を安定化する。アグリカンおよびＨＡＰＬＮ１は互いに平衡に位置するが、ＨＡは２個のＨＡＰＬＮ１結合モジュールおよび２個のアグリカン結合モジュールの間にある。複合体は、変形に抵抗性のゲル様物質を創製する。ＨＡＰＬＮ１はまた、ＨＡと、同様にアグリカンに類似したＩｇモジュールおよび２個の結合モジュールを含むＧ１ドメインを有するバーシカン、ニューロカンおよびブレビカンのような他のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類の相互作用も安定化する。

【0255】

ＨＡＰＬＮ１のＧ１ドメインはＩｇドメインおよび２結合モジュールを含む。ＨＡＰＬＮ１のＧ１ドメインのＩｇドメインは、配列番号２２９のアミノ酸５３〜１６０に位置する。ＨＡＰＬＮ１のＧ１ドメインの結合モジュールは、配列番号２２９のアミノ酸１５９〜２５３および２５９〜３５０に位置し、配列番号３７７および３７８に示す。それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むＨＡＰＬＮ１のフラグメントであるＨＡＰＬＮ１のフラグメントである。例えば、ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、少なくとも２個の結合モジュールを含むＨＡ結合ＨＡＰＬＮ１のフラグメントである。

【0256】

典型的に、ＨＡの検出のための診断として使用されるために、ＨＡＰＬＮ１は、例えば、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカンまたはホスファカンのような他のタイプＣ ＨＡＢＰのＧ１ドメインのような、ＨＡ結合領域を含む他のＨＡ結合タンパク質との組み合わせで提供される。

【0257】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ＨＡＰＬＮ１の種変異体は、ウシ(配列番号２６９および２７３)、マウス(配列番号２７０)、ラット(配列番号２７１)、ニワトリ(配列番号２７２)、ウマ(配列番号２７４)およびブタ(配列番号２７５)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＨＡＰＬＮ１の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＨＡＰＬＮ１と比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＨＡＰＬＮ１のＨＡへの結合親和性を上げる、ＨＡＰＬＮ１のＨＡへの特異性を上げるおよび／またはＨＡＰＬＮ１の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0258】

(２) ＨＡＰＬＮ２
ここで提供される方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ２のＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＣサブグループＨＡＢＰである。ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質２(ＨＡＰＬＮ２；配列番号２３０)は、脳結合タンパク質１としても知られ、脳で優勢に発現される。ＨＡＰＬＮ２のＧ１ドメインはＩｇドメインおよび２結合モジュールを含む。ＨＡＰＬＮ２のＧ１ドメインのＩｇドメインは、配列番号２３０のアミノ酸４９〜１４９に位置する。ＨＡＰＬＮ２のＧ１ドメインの結合モジュールは、配列番号２３０のアミノ酸１４８〜２４１および２４７〜３３７に位置し、配列番号３７９および３８０に示す。

【0259】

それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むＨＡＰＬＮ２のフラグメントであるＨＡＰＬＮ２のフラグメントである。例えば、ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、少なくとも２個の結合モジュールを含むＨＡ結合ＨＡＰＬＮ２のフラグメントである。典型的に、ＨＡの検出のための診断として使用されるために、ＨＡＰＬＮ２は、例えば、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカンまたはホスファカンのような他のタイプＣ ＨＡＢＰのＧ１ドメインのような、ＨＡ結合領域を含む他のＨＡ結合タンパク質と組み合わせて提供される。

【0260】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ＨＡＰＬＮ２の種変異体は、マウス(配列番号２７６)、ラット(配列番号２７７)およびウシ(配列番号２７８)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＨＡＰＬＮ２の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＨＡＰＬＮ２と比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＨＡＰＬＮ２のＨＡへの結合親和性を上げる、ＨＡＰＬＮ１のＨＡへの特異性を上げるおよび／またはＨＡＰＬＮ２の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0261】

(３) ＨＡＰＬＮ３
ここでの方法に使用するためのここに提供するタイプＣサブグループＨＡＢＰは、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ３のＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部である。ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質３(ＨＡＰＬＮ３；配列番号２３１)はヒアルロン酸結合および細胞接着において機能する。ＨＡＰＬＮ３は乳癌で上方制御され、それゆえに、癌発生および転移と関連している可能性がある。ＨＡＰＬＮ３のＧ１ドメインはＩｇドメインおよび２結合モジュールを含む。ＨＡＰＬＮ３のＧ１ドメインのＩｇドメインは、配列番号２３１のアミノ酸６２〜１６７に位置する。ＨＡＰＬＮ３のＧ１ドメインの結合モジュールは配列番号２３１のアミノ酸１６６〜２６０および２６６〜３５７に位置し、配列番号３８１および３８２に示す。

【0262】

それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むＨＡＰＬＮ３のフラグメントである、ＨＡＰＬＮ３のフラグメントである。例えば、ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、少なくとも２個の結合モジュールを含むＨＡ結合ＨＡＰＬＮ３のフラグメントである。典型的に、ＨＡの検出のための診断として使用されるために、ＨＡＰＬＮ３は、例えば、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカンまたはホスファカンのような他のタイプＣ ＨＡＢＰのＧ１ドメインのような、ＨＡ結合領域を含む他のＨＡ結合タンパク質と組み合わせて提供される。

【0263】

また、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ＨＡＰＬＮ３の種変異体は、マウス(配列番号２７９)、ラット(配列番号２８０)およびウシ(配列番号２８１)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＨＡＰＬＮ３の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＨＡＰＬＮ３と比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＨＡＰＬＮ３のＨＡへの結合親和性を上げる、ＨＡＰＬＮ３のＨＡへの特異性を上げるおよび／またはＨＡＰＬＮ３の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0264】

(４) ＨＡＰＬＮ４
ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡＰＬＮ４、ＨＡＰＬＮ４のＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＣサブグループＨＡＢＰである。ヒアルロナンおよびプロテオグリカン結合タンパク質４(ＨＡＰＬＮ４；配列番号２３２)は脳結合タンパク質２としても知られ、脳で優勢に発現される。ＨＡＰＬＮ４は、ニューロン周囲マトリックスの発達に関与する。ヒトおよびマウスＨＡＰＬＮ４は９１％アミノ酸配列同一性を共有する。ＨＡＰＬＮ４のＧ１ドメインはＩｇドメインおよび２結合モジュールを含む。ＨＡＰＬＮ４のＧ１ドメインのＩｇドメインは、配列番号２３２のアミノ酸６０〜１６４に位置する。ＨＡＰＬＮ４のＧ１ドメインの結合モジュールは、配列番号２３２のアミノ酸１６３〜２６７および２７３〜３６４に位置し、配列番号３８３および３８４に示す。

【0265】

それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むＨＡＰＬＮ４のフラグメントである、ＨＡＰＬＮ４のフラグメントである。例えば、ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、少なくとも２個の結合モジュールを含むＨＡＰＬＮ４のＨＡ結合フラグメントである。典型的に、ＨＡの検出のための診断として使用されるために、ＨＡＰＬＮ４は、例えば、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカンまたはホスファカンのような他のタイプＣ ＨＡＢＰのＧ１ドメインのような、ＨＡ結合領域を含む他のＨＡ結合タンパク質と組み合わせて提供される。

【0266】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、ＨＡＰＬＮ４の変異体である。ＨＡＰＬＮ４の種変異体は、マウス(配列番号２８２)、ウシ(配列番号２８３)およびラット(配列番号２８４)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＨＡＰＬＮ４の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＨＡＰＬＮ４と比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＨＡＰＬＮ４のＨＡへの結合親和性を上げる、ＨＡＰＬＮ４のＨＡへの特異性を上げるおよび／またはＨＡＰＬＮ４の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0267】

(５) アグリカン
ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、アグリカン、アグリカンのＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＣサブグループＨＡＢＰである。アグリカン(配列番号２３３)はコンドロイチン硫酸(ＣＳ)プロテオグリカンファミリーに属し、これはまたバーシカン、ブレビカン、ニューロカンおよびホスファカンを含む。各アグリカン分子は、それぞれ約１００個および３０個のケラタン硫酸およびグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)側鎖を含む。アグリカンは、そのＮ末端において結合モジュールおよびＩｇドメインを介してヒアルロナンと非共有結合的に結合している。軟骨でもっとも豊富なプロテオグリカンであり、この組織の耐荷重性能力に関与する。

【0268】

アグリカンのＧ１ドメインは配列番号２３３のアミノ酸４５〜３５２に位置する。アグリカンのＧ１ドメインのＩｇドメインは配列番号２３３のアミノ酸４５〜１５４に位置し、配列番号４２３に示す。アグリカンのＧ１ドメインの結合モジュールは、配列番号２３３のアミノ酸１５３〜２４７および２５４〜３４９に位置し、配列番号３８５および３８６に示す。結合モジュール３および４は配列番号３８７および３８８に示す。それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むアグリカンのフラグメントであるアグリカンのフラグメントである。

【0269】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、アグリカンの変異体である。アグリカンの種変異体は、ブタ(配列番号２８５)、ニワトリ(配列番号２８６)、マウス(配列番号２８７)、ウシ(配列番号２８８)、イヌ(配列番号２８９)、ラット(配列番号２９０)およびウサギ(配列番号２９１)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのアグリカンの変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まない修飾を含まないアグリカンと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このようなは、アグリカンのＨＡへの結合親和性を上げる、アグリカンのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはアグリカンの溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0270】

(６) ブレビカン
ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ブレビカン、ブレビカンのＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＣサブグループＨＡＢＰである。ブレビカン(配列番号２３４)は、マトリックスタンパク質のアグリカン／バーシカンプロテオグリカンファミリーの１６０kDaメンバーである。脳由来であり、ヒアルロナンとテネイシン類およびフィビュリン類のような他のマトリックス分子の間のリンカーとして働く。ブレビカンのＧ１ドメインは、配列番号２３４のアミノ酸５１〜３５６に位置し、配列番号４２４に示す。ブレビカンのＧ１ドメインのＩｇドメインは配列番号２３４のアミノ酸５１〜１５８に位置する。ブレビカンのＧ１ドメインの結合モジュールは、配列番号２３４のアミノ酸１５７〜２５１および２５８〜３５３に位置し、配列番号３８９および３９０に示す。それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むブレビカンのフラグメントである、ブレビカンのフラグメントである。例えば、ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、少なくとも２個の結合モジュールを含む、ブレビカンのＨＡ結合フラグメントである。

【0271】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含むブレビカンの変異体である。ブレビカンの種変異体は、ラット(配列番号２９２)、マウス(配列番号２９３)、ウシ(配列番号２９４)およびネコ(配列番号２９５)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのブレビカンの変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないブレビカンと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ブレビカンのＨＡへの結合親和性を上げる、ブレビカンのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはブレビカンの溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0272】

(７) バーシカン
ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、バーシカン、バーシカンのＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＣサブグループＨＡＢＰである。バーシカン(配列番号２３５)は、種々の組織に存在する大細胞外マトリックスプロテオグリカンである。重要な構造的役割を有し、発達および疾患の間、緩い、水和されたマトリックスを形成する。これはまた細胞と直接的または間接的に相互作用し、細胞接着、生存、増殖および運動性のような生理学的過程を制御する。バーシカンのＧ１ドメインは、配列番号２３５のアミノ酸３８〜３４９に位置し、配列番号４２５に示す。バーシカンのＧ１ドメインのＩｇドメインは、配列番号２３５のアミノ酸３８〜１５１に位置する。バーシカンのＧ１ドメインの結合モジュールは、配列番号２３５のアミノ酸１５０〜２４４および２５１〜３４６に位置し、配列番号３９１および３９２に示す。それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むバーシカンのフラグメントである、バーシカンのフラグメントである。例えば、ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、少なくとも２個の結合モジュールを含む、バーシカンのＨＡ結合フラグメントである。

【0273】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、バーシカンの変異体である。バーシカンの種変異体は、マウス(配列番号２９６)、ラット(配列番号２９７)、ブタオザル(配列番号２９８)、ウシ(配列番号２９９)およびニワトリ(配列番号３００)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのバーシカンの変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないバーシカンと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、バーシカンのＨＡへの結合親和性を上げる、バーシカンのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはバーシカンの溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0274】

(８) ニューロカン
ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ニューロカン、ニューロカンのＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＣサブグループＨＡＢＰである。ニューロカンは、ＣＳＰＧ３および１Ｄ１(配列番号２３６)としても知られ、中枢神経系において主に発現される分泌型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ヒトニューロカンはＭｅｔ６３５後に開裂され、Ｎ末端(ニューロカン−１３０)およびＣ末端(ニューロカン−Ｃ)フラグメントを生じると予測される。ニューロカンおよびニューロカン−Ｃはアストロサイトにより産生され、軸索束および神経細胞体を囲むマトリックスに蓄積する。ニューロカン−１３０は主にグリア細胞質で見られる。ニューロカンは、種々のマトリックスおよび膜貫通型分子との相互作用を介して神経細胞接着および神経突起成長を阻害する。ニューロカンのＧ１ドメインは配列番号２３６のアミノ酸５３〜３５９に位置し、配列番号４２６に示す。ニューロカンのＧ１ドメインのＩｇドメインは配列番号２３６のアミノ酸５３〜１６１に位置する。ニューロカンのＧ１ドメインの結合モジュールは配列番号２３６のアミノ酸１６０〜２５４および２６１〜３５６に位置し、配列番号３９３および３９４に示す。それゆえに、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、ＨＡへの結合能を維持する、例えば、Ｇ１ドメインまたはＨＡへの結合を行うのに十分なその一部を含むニューロカンのフラグメントである、ニューロカンのフラグメントである。例えば、ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、少なくとも２個の結合モジュールを含む、ニューロカンのＨＡ結合フラグメントである。

【0275】

ここで提供する方法において使用するためにまたここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ニューロカンの種変異体は、マウス(配列番号３０１)、ラット(配列番号３０２)およびチンパンジー(配列番号３０３)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのニューロカンの変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないニューロカンと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ニューロカンのＨＡへの結合親和性を上げる、ニューロカンのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはニューロカンの溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0276】

(９) ホスファカン
ここで提供される方法において使用するためにここで提供されるのは、ホスファカン、ホスファカンのＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部であるタイプＣサブグループＨＡＢＰである。ホスファカン(配列番号３４０)は、神経細胞および神経細胞−接着分子に結合し、細胞表面および細胞外マトリックス分子へのヘテロフィリック結合を介しておよび膜貫通型ホスファターゼのリガンドと競合することにより、神経組織における細胞相互作用および他の発生過程を調節するラット脳から単離されたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ホスファカンは、ヒト受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ(ＲＰＴＰゼータ／ベータ)の細胞外部分と７６％同一性を示し、大膜貫通型タンパク質のｍＲＮＡスプライシング変異体である。

【0277】

またここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ホスファカンの種変異体は、ラットホスファカン(配列番号２３７)を含むが、これに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのホスファカンの変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないホスファカンと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ホスファカンのＨＡへの結合親和性を上げる、ホスファカンのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはホスファカンの溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0278】

２. 結合モジュールを有しないＨＡ結合タンパク質
ある例において、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、結合モジュールを含まないＨＡ結合タンパク質である。ここに提供する方法において使用するための結合モジュールがないＨＡ結合タンパク質は、ＨＡＢＰ１／Ｃ１ＱＢＰ、ライリン、ＲＨＡＭＭ、ＩαＩ、ＣＤＣ３７、ＰＨＢＰ、ＳＰＡＣＲ、ＳＰＡＣＲＣＡＮ、ＣＤ３８、ＩＨＡＢＰ４およびＰＥＰ−１またはそのＨＡ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。

【0279】

ａ. ＨＡＢＰ１／Ｃ１ＱＢＰ
ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、ヒアルロナン結合タンパク質１、ＨＡＢＰ１のＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部である。ヒアルロナン結合タンパク質１(ＨＡＢＰ１；配列番号２４０)はまたＣ１ｑＢＰ／Ｃ１ｑＲおよびｐ３２としても知られ、精子形成におよび炎症誘発性分子の受容体として機能する遍在性の酸性糖タンパク質である。ＨＡＢＰ１は、細胞外ヒアルロナン、ビトロネクチン、補体成分Ｃ１ｑ、ＨＭＷキニノーゲンおよび細菌およびウイルスタンパク質と結合する。細胞内ＨＡＢＰ１は、Ｃ１ｑ球状ドメイン、ＰＫＣの多数のアイソフォーム、ミトコンドリアＨｒｋ、アドレナリンおよびＧＡＢＡ−Ａ受容体、ｍＲＮＡスプライシング因子ＡＳＦ／ＳＦ２およびＣＢＦ転写因子を含む分子と結合する。

【0280】

またここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ここで提供する方法において使用するためのＨＡＢＰ１の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＨＡＢＰ１と比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＨＡＢＰ１のＨＡへの結合親和性を上げる、ＨＡＢＰ１のＨＡへの特異性を上げるおよび／またはＨＡＢＰ１の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0281】

ｂ. ライリン
ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、ライリン、ライリンのＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部である。ライリン(配列番号２３８および２３９)は、Ｃ型レクチン類と相同性を有する膜貫通型タンパク質であり、その膜貫通型セグメントＬ−Ａ−Ｙ−Ｉ−Ｌ−Ｉの６アミノ酸モチーフから名づけられた。ライリンはヒアルロナンと特異的に結合し、ほとんどの動物組織およびの細胞外マトリックスおよび体液に見られる。それは、それゆえに組織リモデリング、発達、恒常性および疾患中の細胞行動および機能を調節できる。

【0282】

またここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ライリンの種変異体は、マウス(配列番号３０４)、チャイニーズハムスター(配列番号３０５)およびラット(配列番号３０６)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのライリンの変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないライリンと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ライリンのＨＡへの結合親和性を上げる、ライリンのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはライリンの溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0283】

ｃ. ＲＨＡＭＭ
ここでの方法に使用するためにここで提供されるのは、ＲＨＡＭＭ、ＲＨＡＭＭのＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部である。ＨＡ仲介運動性のための受容体(ＲＨＡＭＭ；配列番号２４２)は、〜５９〜８０kDaの範囲のサイズの膜関連タンパク質である。ＲＨＡＭＭはほとんどの細胞型で発現され、ＨＡ結合に応答した接着および細胞運動性の仲介のために機能する。またここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。ＲＨＡＭＭの種変異体は、マウス(配列番号３０７)およびラット(配列番号３０８)を含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＲＨＡＭＭの変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＲＨＡＭＭと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＲＨＡＭＭのＨＡへの結合親和性を上げる、ＲＨＡＭＭのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはＨＡＢＰ１の溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0284】

ｄ. その他
ここで提供する方法において使用できるＨＡに結合し、そのいくつかはヒアルロナン結合ドメインを含む他のＨＡＢＰ類は、ＩαＩ(配列番号２４３−２４５)、ＣＤＣ３７(配列番号２５０)、ＰＨＢＰ(配列番号２５１)、ＳＰＡＣＲ(配列番号２４６)、ＳＰＡＣＥＲＣＡＮ(配列番号２４７)、ＣＤ３８(配列番号２４８)、ＩＨＡＢＰ４(配列番号２４９)およびＰＥＰ−１(配列番号２４１)またはＨＡ結合ドメインまたはＨＡへの結合に十分なその一部を含むが、これらに限定されない。またここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、変異体でＨＡへの結合能が維持される限り、対立形質変異体、種変異体およびアミノ酸修飾を含む他の変異体を含む、変異体である。種変異体は、マウス(配列番号３０９−３１１)およびウシ(配列番号３１２−３１４)由来のＩαＩ、パン酵母(配列番号３２６)、ショウジョウバエ(配列番号３２７)、ラット(配列番号３２８)、マウス(配列番号３２９)、分裂酵母(配列番号３３０)、ショウジョウバエ(配列番号３３１)、ニワトリ(配列番号３３２)、ウシ(配列番号３３３)、カンジダ・アルビカンス(配列番号３３４)、線虫(配列番号３３５)およびミドリフグ(配列番号３３６)由来のＣＤＣ３７、ニワトリ(配列番号３１５)およびマウス(配列番号３１６)由来のＳＰＡＣＲ、マウス(配列番号３１７)、ラット(配列番号３１８)およびニワトリ(配列番号３１９)由来のＳＰＡＣＲＣＡＮ、マウス(配列番号３２０)、ラット(配列番号３２１)およびウサギ(配列番号３２２)由来のＣＤ３８、マウス(配列番号３２４)およびニワトリ(配列番号３２５)由来のＩＨＡＢＰ４およびマウス(配列番号３３７)、ラット(配列番号３３８)およびウシ(配列番号３３９)由来のＰＨＢＰを含むが、これらに限定されない。ここで提供する方法において使用するためのＨＡＢＰ類の変異体またはそのＨＡ結合フラグメントは、アミノ酸修飾を含み、修飾を含まないＨＡＢＰと比較して、改善のような変えられた活性を示す変異体を含む。このような変異体は、ＨＡＢＰのＨＡへの結合親和性を上げる、ＨＡＢＰのＨＡへの特異性を上げるおよび／またはＩαＩ、ＣＤＣ３７、ＰＨＢＰ、ＳＰＡＣＲ、ＳＰＡＣＲＣＡＮ、ＣＤ３８、ＩＨＡＢＰ４およびＰＥＰ−１またはそのＨＡ結合フラグメントのようなＨＡＢＰの溶解度を上げるアミノ酸修飾を含むものを含む。

【0285】

３. ＨＡ結合タンパク質の修飾
修飾ＨＡＢＰ類は、ここに提供する方法において使用するためのＨＡＢＰ類の１個以上の特性の改善のためにここで提供される。このような特性は、哺乳動物発現系におけるタンパク質発現増加、安定性および溶解度のような生物物理学的特性改善、タンパク質精製および検出改善および／またはＨＡに対する融合タンパク質の二量体化を介する親和性増加の修飾を含む。

【0286】

ａ. ＨＡＢＰの多量体
ここに提供する方法において使用するために提供されるＨＡＢＰ類は、多量体化ドメインと直接的または間接的に結合できる。多量体化ドメインの産生は、ＨＡＢＰ類またはそのＨＡ結合ドメインの多量体を産生し、分子上のＨＡ結合部位を増加できる。これは、ＨＡに対するＨＡＢＰの親和性を増加できる。例えば、ＨＡＢＰ多量体の親和性は、多量体化ドメインを含まないＨＡＢＰポリペプチドと比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍以上増加できる。ＨＡに対するＨＡＢＰ多量体の親和性は、解離定数(Kd)として示したとき、一般的に少なくとも多くてもまたは多くてもまたは正確に１×１０^−８Ｍ〜１×１０^−１０Ｍ、例えば少なくとも多くてもまたは多くてもまたは正確に９×１０^−９Ｍ、８×１０^−９Ｍ、７×１０^−９Ｍ、６×１０^−９Ｍ、５×１０^−９Ｍ、４×１０^−９Ｍ、３×１０^−９Ｍ、２×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、９×１０^−１０Ｍ、８×１０^−１０Ｍ、７×１０^−１０Ｍ、６×１０^−１０Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、４×１０^−１０Ｍ、３×１０^−１０Ｍ、２×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１０Ｍまたはそれより低いKdである。

【0287】

ここで提供されるのは、第一ＨＡＢＰのＨＡ結合ドメインまたはＨＡに結合するのに十分なその一部第二ＨＡＢＰのおよびＨＡ結合ドメインまたはＨＡに結合するのに十分なその一部を含む多量体を含み、ここで、第一および第二ＨＡ結合ドメインは、多量体化ドメインに直接的またはリンカーを介して間接的に結合している。第一および第二ＨＡ結合ドメインは同じＨＡＢＰ由来でも異なるＨＡＢＰ由来でもよい。例えば、ＨＡ結合ドメインが同一であるならば、ホモ二量体またはホモ三量体が産生できる。ＨＡ結合ドメインが異なるならば、ヘテロ二量体またはヘテロ三量体が産生できる。例えば、ＨＡＢＰ類の結合ドメインまたはモジュールのようなＨＡ結合ドメインは、２個以上のＨＡ結合ドメインの多量体を形成するために共有結合的結合していても、非共有結合的結合していても、化学的結合していてもよい。結合モジュールは結合して、二量体、三量体またはそれ以上の多量体を形成できる。ある例においては、多量体は、各々ＨＡ結合ドメインを含む２個以上のＨＡＢＰポリペプチドの二量体化により形成できる。

【0288】

ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰのあらゆる部分を多量体パートナーとして使用できる。例えば、上記ＨＡＢＰ類のいずれかまたは配列番号２０６〜２０７、２２２〜３４０、４０７〜４１４に示すいずれかまたはＨＡ結合ドメイン、例えば、結合ドメインまたはモジュールを含むＨＡＢＰのあらゆる部分および配列番号３４１および３７１〜３９４に示すＨＡ結合ドメインのいずれかを含むその変異体を使用して、キメラＨＡＢＰポリペプチドを賛成でき、ここで、ＨＡＢＰポリペプチドの全てまたは一部は多量体化ドメインに結合する。典型的に、ＨＡＢＰ部分の少なくとも１個、しかししばしば両者は、多量体化ドメインに結合するＨＡに結合するために十分なＨＡＢＰの全てまたは一部である。多量体化パートナーとして使用するＨＡＢＰ類またはその一部の例は本明細書の上に記載し、配列番号２０６〜２０７、２２２〜３４１、３７１〜３９４、４０７〜４１４、４１６〜４１８または４２３〜４２６に示すいずれかである。ある例において、多量体パートナーの少なくとも１個は、ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰの全てまたは一部である。例えば、多量体ＨＡＢＰポリペプチドの例は、アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、ホスファカン、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、スタビリン−１、スタビリン−２、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡＡ０５２７またはＴＳＧ−６タンパク質のＨＡ結合ドメイン(例えば結合ドメインまたは結合モジュール)またはその一部の間で形成される多量体である。さらに、ＨＡＢＰ多量体の形成に使用するためのキメラＨＡＢＰポリペプチドは、多量体化ドメインに結合したハイブリッドＨＡＢＰポリペプチドを含む。ここで提供される多量体の例は、ＴＳＧ−６の結合モジュール(ＬＭ)またはＨＡに結合するのに十分なその一部の多量体化により産生されたホモ二量体のような多量体である。

【0289】

２個のＨＡＢＰポリペプチド間の多量体化は、自然に起こることができまたは２個以上のポリペプチドの強制的結合により起こり得る。一例として、多量体は、異なるＨＡＢＰポリペプチドまたはドメインまたはＨＡに結合するのに十分なその一部上のシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により結合され得る。他の例において、多量体は、各ポリペプチドに融合したペプチド部分に共有結合的または非共有結合的相互作用を介して結合しているＨＡＢＰポリペプチドまたはドメインまたはＨＡに結合するのに十分なその一部を含み得る。このようなペプチドは、多量体化促進特性を有するペプチドリンカー(例えばスペーサー)またはペプチドであり得る。さらなる例において、多量体は、例えば、ヘテロ二官能性リンカーを使用するような、２個のポリペプチド間の化学的結合を介して形成できる。

【0290】

ｉ. ペプチドリンカー
ペプチドリンカーを使用して、例えば少なくとも１個の多量体化パートナーがＨＡ結合ドメイン(例えば、結合ドメインまたはモジュール)を含む多量体のような、ＨＡＢＰポリペプチド多量体を産生できる。一例として、ペプチドリンカーを第一ポリペプチドのＣ末端および第二ポリペプチドのＮ末端に融合できる。この構造を、少なくとも１個の、好ましくは２個、３個、４個またはそれ以上のポリペプチドが、互いにその各末端でペプチドリンカーを介して結合するように、複数回繰り返し得る。例えば、多量体ポリペプチドは配列Ｚ_１−Ｘ−Ｚ_２(ここで、Ｚ_１およびＺ_２は、各々ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰの全てまたは一部の配列であり、Ｘはペプチドリンカーの配列である)を有し得る。ある例においては、Ｚ_１および／またはＺ_２は、ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰの全てである。他の例において、Ｚ_１および／またはＺ_２はＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰの一部である。Ｚ_１およびＺ_２は同一であるかまたは異なる。他の例において、ポリペプチドはＺ_１−Ｘ−Ｚ_２(−Ｘ−Ｚ)_ｎの配列を有し、ここで“ｎ”は任意の整数、すなわち一般的に１または２である。

【0291】

典型的に、ペプチドリンカーは、一方または両方のＨＡ結合ドメインをヒアルロナン基質に結合させるのにまたはＨＡ結合ドメインの間の相互作用(例えばタイプＣ ＨＡＢＰ類のＧ１ ＨＡ結合ドメインの２個のＩｇモジュールの相互作用)を可能にするのに十分な長さである。ペプチドリンカーの例は、−Gly−Gly−、GGGGG(配列番号３４２)、GGGGSまたは(GGGGS)n(配列番号３４３)、SSSSGまたは(SSSSG)n(配列番号３４４)、GKSSGSGSESKS(配列番号３４５)、GGSTSGSGKSSEGKG(配列番号３４６)、GSTSGSGKSSSEGSGSTKG(配列番号３４７)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号３４８)、EGKSSGSGSESKEF(配列番号３４９)またはAlaAlaProAlaまたは(AlaAlaProAla)n(配列番号３５０)(ここで、ｎは１〜６、例えば１、２、３または４である)を含むが、これらに限定されない。リンカーの例は次のものを含む。
(１) ＮｃｏＩ末端を有するGly4Ser(配列番号３５１)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GCCATGG
(２) ＮｃｏＩ末端を有する(Gly4Ser)2(配列番号３５２)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GGCGGCGGCG GCTCTGCCAT GG
(３) ＮｃｏＩ末端を有する(Ser4Gly)4(配列番号３５３)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG
(４) ＮｃｏＩ末端を有する(Ser4Gly)2(配列番号３５４)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG

【0292】

結合部分は、例えば、Huston et al. (1988) PNAS 85:5879-5883, Whitlow et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995, and Newton et al., (1996) Biochemistry 35:545-553に記載されている。他の適切なペプチドリンカーは、本明細書に引用により包含させる米国特許番号４,７５１,１８０または４,９３５,２３３に記載のあらゆるものを含む。所望のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、適切な慣用の技術のいずれかを使用して、ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドの間におよび同じ読み取り枠内に挿入できる。一例として、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーにより分けられた、ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰポリペプチドの全てまたは一部であるものを含む、２〜４個のＨＡＢＰポリペプチドに由来する。

【0293】

ii. ヘテロ二官能性結合剤
ヘテロ多量体融合ポリペプチドを産生するためのＨＡＢＰポリペプチドの他のＨＡＢＰポリペプチドへの結合は直接的でも間接的でもよい。例えば、２個以上のＨＡＢＰポリペプチドの結合は、化学的結合により達成できまたは当分野で知られたまたはここに提供するいずれかのようなヘテロ二官能性リンカーにより促進され得る。

【0294】

アミノ基およびチオール基の間に共有結合的結合を形成するおよびチオール基をタンパク質に導入するために使用する多数のヘテロ二官能性架橋試薬は当業者に知られている(例えば、このような試薬の製造および使用を記載し、このような試薬の販売元を紹介するthe PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993参照；また、例えば、Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:397-401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924-5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. 84:308-312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163-170; Wawrzynczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66:361-366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589参照)。これらの試薬は、ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰポリペプチドのＮ末端部分とＨＡ結合ドメインを含む他のＨＡＢＰポリペプチドのＣ末端部分の間またはこれらの部分の各々およびリンカーの間の共有結合的結合を形成するのに使用できる。これらの試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー)；スルホスクシンイミジル６−[３−(２−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート(スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ)；スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェート(ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー)；スクシンイミジル６−[３−(２−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート(ＬＣ−ＳＰＤＰ)；スルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)；スクシンイミジル３−(２−ピリジルジチオ)ブチレート(ＳＰＤＢ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー)；スルホスクシンイミジル２−(７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド)エチル−１,３’−ジチオプロピオネート(ＳＡＥＤ)；スルホ−スクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート(ＳＡＭＣＡ)；スルホスクシンイミジル−６−[アルファ−メチル−アルファ−(２−ピリジルジチオ)トルアミド]−ヘキサノエート(スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ)；１,４−ジ−[３’−(２’−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン(ＤＰＤＰＢ)；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(２−ピリジルチオ)トルエン(ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー)；スルホスクシンイミジル−６−[α−メチル−α−(２−ピリミジルジ−チオ)トルアミド]ヘキサノエート(スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ)；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル(ＭＢＳ)；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル(スルホ−ＭＢＳ)；Ｎ−スクシンイミジル(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー)；スルホスクシンイミジル−(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(スルホ−ＳＩＡＢ)；スクシンイミジル−４−(ｐ−マレイミドフェニル)ブチレート(ＳＭＰＢ)；スルホスクシンイミジル−４−(ｐ−マレイミド−フェニル)ブチレート(スルホ−ＳＭＰＢ)；アジドベンゾイルヒドラジド(ＡＢＨ)を含むが、これらに限定されない。これらのリンカーは、例えば、柔軟性または溶解度を増加させるまたは立体的障害物のためにまたはそれを除去するために提供されるもののようなペプチドリンカーと組み合わせて使用できる。ポリペプチド分子を他の分子に結合させることが当業者に知られているあらゆる他のリンカーを用いることができる。一般的特性は、得られた分子がＨＡに結合することである。ＨＡＢＰ試薬のインビボ診断使用のために、一般的にリンカーは、ヒトを含む動物への投与のために生体適合性でなければならない。

【0295】

iii. ポリペプチド多量体化ドメイン
２個以上のＨＡＢＰポリペプチドの相互作用は、それら自体安定な構造を形成するために相互作用できる、任意の部分または他のポリペプチドへの直接的または間接的結合により促進できる。例えば、別々にコードされるＨＡＢＰポリペプチド鎖を多量体化により結合でき、それによってポリペプチドの多量体化は多量体化ドメインが仲介する。典型的に、多量体化ドメインは、第一ＨＡＢＰポリペプチドと第二ＨＡＢＰポリペプチドの安定なタンパク質−タンパク質相互作用の形成のために提供される。ＨＡＢＰポリペプチドは、例えば、ＨＡＢＰのＨＡ結合ドメイン(例えば結合ドメインまたはモジュール)をコードする核酸と多量体化ドメインをコードする核酸の結合(直接的または間接的)を含む。典型的に、少なくとも１個の多量体化パートナーは、多量体化ドメインと直接的または間接的に結合したＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰの全てまたは一部をコードする核酸であり、それゆえにキメラ分子を形成する。ホモまたはヘテロ多量体ポリペプチドは別々のＨＡＢＰポリペプチドの同時発現により産生できる。第一および第二ＨＡＢＰポリペプチドは同一でも異なってもよい。

【0296】

一般的に、多量体化ドメインは、安定なタンパク質−タンパク質相互作用を形成できるあらゆるものを含む。多量体化ドメインは免疫グロブリン配列(例えばＦｃドメイン；例えば、国際特許公開番号ＷＯ９３／１０１５１およびＷＯ２００５／０６３８１６；米国公開番号２００６／００２４２９８；米国特許番号５,４５７,０３５)、ロイシンジッパー(例えば核トランスフォーミングタンパク質ｆｏｓおよびｊｕｎまたは癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃ由来または窒素の一般的コントロール(ＧＣＮ４)由来)、疎水性領域、親水性領域またはホモまたはヘテロ多量体のキメラ分子間の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して相互作用できる。さらに、多量体化ドメインは、例えば、米国特許番号５、７３１,１６８；国際特許公開番号ＷＯ９８／５０４３１およびＷＯ２００５／０６３８１６；Ridgway et al. (1996) Protein Engineering, 9:617-621に記載のもののような、穴を含むアミノ酸配列に相補的な隆起を含むアミノ酸配列を含み得る。このような多量体化領域は、立体的相互作用が安定な相互作用を促進するだけでなく、さらにキメラ単量体の混合物からホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を促進するようにも操作できる。一般的に、隆起は、第一ポリペプチドの界面の小アミノ酸側鎖の大側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)での置き換えにより構築する。隆起と同一または類似サイズの代償性腔は、所望により第二ポリペプチドの界面上に、大アミノ酸側鎖を小アミノ酸(例えば、アラニンまたはスレオニン)で置き換えることにより構築する。多量体化ドメインの例は下に記載する。

【0297】

ＨＡＢＰのあらゆるＨＡ結合ドメイン(例えば、結合ドメインまたはモジュール)を含む、例えばここに提供するいずれかのようなＨＡＢＰポリペプチドはどこでも結合できるが、典型的にキメラポリペプチドを形成するように、そのＮ末端またはＣ末端を介し、多量体化ドメインのＮ末端またはＣ末端へである。結合は直接的でもリンカーを介して間接的でもよい。また、キメラポリペプチドは融合タンパク質であってよくまたは共有結合または非共有結合相互作用を介するような化学的結合により形成してよい。例えば、多量体化ドメインを含むキメラポリペプチドを製造するとき、ＨＡ結合ドメインを含むＨＡＢＰの全てまたは一部をコードする核酸を、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に、直接的または間接的にまたは所望によりリンカードメインを介して、作動可能に結合できる。典型的に、構築物は、ＨＡＢＰポリペプチドのＣ末端が多量体化ドメインのＮ末端に結合するキメラタンパク質をコードする。ある例においては、構築物は、ＨＡＢＰポリペプチドのＮ末端が多量体化ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合するキメラタンパク質をコードできる。

【0298】

ポリペプチド多量体は、同一または異なるＨＡＢＰポリペプチドの２個を、多量体化ドメインに直接的または間接的に結合させることにより製造した、キメラタンパク質を含む。ある例において、多量体化ドメインがポリペプチドであるとき、ＨＡＢＰ−多量体化ドメインキメラポリペプチドをコードする遺伝子融合体を適当な発現ベクターに挿入する。得られたＨＡＢＰ−多量体化ドメインキメラタンパク質は該組み換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞で発現でき、多量体に集合し、ここで、多量体化ドメインは相互作用して多価ポリペプチドを形成する。多量体化ドメインのＨＡＢＰポリペプチドへの化学的結合は、上記のとおりヘテロ二官能性リンカーを使用して行い得る。

【0299】

得られたキメラポリペプチドおよびそこから形成された多量体を、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上の親和性クロマトグラフィーのような任意の適切な方法で精製できる。異なるＨＡＢＰキメラポリペプチドをコードする２個の核酸分子を細胞に形質転換したとき、ホモおよびヘテロ二量体の形成が起こる。発現のための条件は、ヘテロ二量体形成がホモ二量体形成より優先されるように調節できる。

【0300】

(１) 免疫グロブリンドメイン
多量体化ドメインは、さらなるアミノ酸配列の多量体化ドメインと分子間ジスルフィド結合を形成するように反応できる遊離チオール部分を含むものである。例えば、多量体化ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはＩｇＥ由来のような免疫グロブリン分子の一部を含み得る。一般的に、このような一部は免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)である。抗体由来ポリペプチドの種々の部分(Ｆｃドメインを含む)に融合したポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は記載されており、例えば、Ashkenazi et al. (1991) PNAS 88: 10535; Byrn et al. (1990) Nature, 344:667; and Hollenbaugh and Aruffo, (1992)“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins,” in Current Protocols in Immunology, Ch.10, pp. 10.19.1-10.19.11を参照のこと。

【0301】

抗体は、特異的抗原に結合し、ジスルフィド結合により共有結合的に結合した２個の同一重鎖および２個の同一軽鎖を含む。重鎖および軽鎖のいずれも、抗原と定常(Ｃ)領域を結合する可変領域を含む。いずれの鎖においても、一ドメイン(Ｖ)は、該分子の抗体特異性に依存する可変アミノ酸配列を含む。他のドメイン(Ｃ)は、むしろ同じクラスの分子で共通する定常配列である。ドメインは、アミノ末端側から順に番号付けされる。例えば、ＩｇＧ軽鎖は、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ(それぞれ軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを言う)の順でＮ末端からＣ末端に結合した２個の免疫グロブリンドメインから成る。ＩｇＧ重鎖は、Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３(それぞれ可変重ドメイン、定常重ドメイン１、定常重ドメイン２および定常重ドメイン３を言う)の順でＮ末端からＣ末端に結合した４個の免疫グロブリンドメインからなる。得られた抗体分子は４鎖分子であり、ここで、各重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に結合し、２個の重鎖が互いにジスルフィド結合により結合している。重鎖の結合は、ヒンジ領域として知られる、重鎖の可動性領域が仲介する。抗体分子のフラグメントを、例えば、酵素開裂によるように産生できる。例えば、パパインによるプロテアーゼ開裂により、重鎖定常領域、Ｆｃドメインの二量体は２個のＦａｂ領域(すなわち可変領域を含む部分)から開裂される。

【0302】

ヒトにおいて、その重鎖により分類されるデルタ(δ)、ガンマ(γ)、ミュー(μ)およびアルファ(α)およびイプシロン(ε)と命名される５種の抗体アイソタイプが存在し、それぞれＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥクラスの抗体を生じる。ＩｇＡおよびＩｇＧクラスはサブクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。免疫グロブリン重鎖間の配列差異は、例えば、Ｃドメイン数、ヒンジ領域の存在および鎖間ジスルフィド結合の数位置が異なる、種々のアイソタイプをもたらす。例えば、ＩｇＭおよびＩｇＥ重鎖は、ヒンジ領域を置き換える余分のＣドメイン(Ｃ４)を含む。ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡのＦｃ領域は、互いにそのＣγ３、Ｃδ３およびＣα３ドメインを介して対となり、一方、ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、そのＣμ４およびＣε４ドメインを介して二量体化する。ＩｇＭおよびＩｇＡは、それぞれ１０個および４個の抗原結合部位を有する多量体構造を形成する。

【0303】

ここで提供するＨＡＢＰ免疫グロブリンキメラポリペプチドは、完全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、免疫グロブリンポリペプチドは、完全長より短く、すなわち重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ＦｖまたはＦｃを含む。一例として、ＨＡＢＰ免疫グロブリンキメラポリペプチは単量体またはヘテロまたはホモ多量体および特に二量体または四量体として集合する。種々の構造の鎖または基本単位は単量体およびヘテロおよびホモ多量体の集合に利用できる。例えば、ＨＡＢＰポリペプチドは、免疫グロブリン分子のＣ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインの全てまたは一部を含む、免疫グロブリン分子の全てまたは一部と融合できる(例えば、米国特許番号５,１１６,９６４参照)。キメラＨＡＢＰポリペプチドは、適当な核酸分子で形質転換した哺乳動物細胞により容易に産生および分泌され得る。分泌型形態は、ＨＡＢＰポリペプチドが重鎖二量体；軽鎖単量体または二量体；および最大全４個までの可変領域アナログが置換されているヘテロ四量体を含む、ＨＡＢＰポリペプチドが１個以上の軽または重鎖に融合している重および軽鎖ヘテロ四量体に存在するものを含む。ある例において、１個または１個を超える核酸融合分子を宿主細胞に形質転換して、多量体のＨＡＢＰ部分が同一または異なる多量体を形成できる。ある例において、非ＨＡＢＰポリペプチド軽−重鎖可変様ドメインが存在し、それによりヘテロ二官能性抗体を産生する。ある例において、キメラポリペプチドは、ヒンジジスルフィドを欠く免疫グロブリン分子の一部に融合させることができ、ここで、２個のＨＡＢＰポリペプチド部分の非共有結合または共有結合相互作用は、分子をホモまたはヘテロ二量体に会合させる。

【0304】

(ａ) Ｆｃドメイン
典型的に、ＨＡＢＰキメラタンパク質の免疫グロブリン部分は免疫グロブリンポリペプチドの重鎖、もっとも一般的には重鎖の定常ドメインを含む。ヒトＩｇＧサブタイプの重鎖定常領域の配列の例は配列番号３５５(ＩｇＧ１)、配列番号３５６(ＩｇＧ２)、配列番号３５７(ＩｇＧ３)および配列番号３５８(ＩｇＧ４)に示す。例えば、配列番号３５５に示す重鎖定常領域について、Ｃ_Ｈ１ドメインはアミノ酸１〜９８に対応し、ヒンジ領域はアミノ酸９９〜１１０に対応し、Ｃ_Ｈ２ドメインはアミノ酸１１１〜２２３に対応し、Ｃ_Ｈ３ドメインはアミノ酸２２４〜３３０に対応する。

【0305】

一例として、免疫グロブリンポリペプチドキメラタンパク質は免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含み得る。典型的に、このような融合は、少なくとも官能的に活性なヒンジ、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含む。例えば、ＩｇＧ１の完全長Ｆｃ配列は、配列番号３５５に示す配列のアミノ酸９９〜３３０を含む。ｈＩｇＧ１のＦｃ配列の例は配列番号３５９およびに示し、配列番号３５５のアミノ酸１００〜１１０に対応するヒンジ配列のほとんど全ておよび配列番号３５５に示すＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインの完全配列を含む。Ｆｃポリペプチドの他の例は、配列番号２１２に示すＦｃポリペプチドである。Ｆｃポリペプチドの他の例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１に示され、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からＦｃ領域の天然Ｃ末端に延びる単一鎖ポリペプチドである(配列番号３５９)。結合が成される正確な部は重要ではない：特定の部位は周知であり、ＨＡＢＰポリペプチドの生物活性、分泌または結合特性を最適化するように選択できる。例えば、Ｆｃポリペプチド配列の他の例は、配列番号３５５に示す配列のアミノ酸Ｃ１０９またはＰ１１３から開始する(例えば、米国公開番号２００６／００２４２９８参照)。

【0306】

ｈＩｇＧ１ Ｆｃに加えて、他のＦｃ領域はまたここに提供するＨＡＢＰキメラポリペプチドに包含され得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用が仲介するエフェクター機能を最小化するとき、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃのような、補体またはエフェクター細胞をほとんど集合させないＩｇＧアイソタイプとの融合が意図される。さらに、Ｆｃ融合体は、ＩｇＧ(ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む)、ＩｇＡ(ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む)、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭクラスの抗体を含むが、これらに限定されない抗体クラスのいずれかに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる免疫グロブリン配列である。さらに、リンカーを使用して、Ｆｃキメラを産生するためにＦｃを他のポリペプチドに共有結合的に結合できる。

【0307】

修飾Ｆｃドメインはまたここでは、ＨＡＢＰポリペプチドとのキメラにおける使用のために意図される。いくつかの例において、Ｆｃ領域を、ＦｃＲへの結合が変えられるように修飾し、それゆえに、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能から変えられた(すなわち多いまたは少ない)エフェクター機能がもたらされる。それゆえに、修飾Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する高または低親和性または親和性なしを含むが、これらに限定されない改変された親和性を有し得る。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲｓに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が典型的にＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好に受容体に結合する。さらに、異なるＦｃγＲｓは異なるエフェクター機能を仲介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲIIａ／ｃおよびＦｃγＲIIIａは、免疫受容活性化チロシンモチーフ(ＩＴＡＭ)を有する細胞内ドメインを有することにより特徴付けられる、免疫複合体誘発活性化の正のレギュレーターである。ＦｃγＲIIｂは、しかしながら、免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ＩＴＩＭ)を有し、それゆえに阻害性である。ある例においては、ここで提供されるＨＡＢＰポリペプチドＦｃキメラタンパク質は、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を増強するように修飾され得る。さらに、Ｆｃは、ＦｃＲｎへのその結合を変えるように、それによりＨＡＢＰ−Ｆｃキメラポリペプチドの薬物動態が改善されるように、修飾できる。それゆえに、受容体に対するＦｃ領域の親和性改変は、Ｆｃドメインと関連するエフェクター機能および／または薬物動態特性を調節できる。修飾Ｆｃドメインは、当業者に知られており、文献に記載されており、修飾の例について例えば米国特許番号５,４５７,０３５；米国特許公開番号ＵＳ２００６／００２４２９８；および国際特許公開番号ＷＯ２００５／０６３８１６を参照のこと。

【0308】

典型的に、ポリペプチド多量体は、２個の同一または異なるＨＡＢＰポリペプチドのＦｃポリペプチドへの、直接的または間接的結合により創製した、２個のキメラタンパク質の二量体である。ある例において、ＨＡＢＰ−Ｆｃキメラタンパク質をコードする遺伝子融合体を適当な発現ベクターに挿入する。得られたＨＡＢＰ−Ｆｃキメラタンパク質は該組み換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞で発現でき、抗体分子そっくりの集合を可能にし、ここで、Ｆｃ部分の間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、２価ＨＡＢＰポリペプチドが得られる。

【0309】

得られたＦｃ部分を含むキメラポリペプチドおよびそこから形成された多量体プロテインＡまたはプロテインＧカラム上の親和性クロマトグラフィーにより容易に精製できる。ヘテロ二量体の産生のために、さらなる精製工程が必要であるかもしれない。例えば、異なるＨＡＢＰキメラポリペプチドをコードする２個の核酸を細胞に形質転換したとき、ヘテロ二量体の形成は、Ｆｃドメインを担持するＨＡＢＰキメラ分子が同様にジスルフィド結合ホモ二量体として発現されるため、生化学的に達成されなければならない。それゆえに、ホモ二量体は、鎖間ジスルフィドの破壊に好ましいが、鎖内ジスルフィドに作用しない条件下で減少され得る。典型的に、異なるＨＡ結合ドメイン部分を有するキメラ単量体を等モル量で混合し、酸化してホモおよびヘテロ二量体の混合物を形成させる。この混合物の成分をクロマトグラフ法により分離する。あるいは、このタイプのヘテロ二量体の形成を、遺伝子操作により偏向させ、ＨＡＢＰポリペプチド、続いてｈＩｇＧのＦｃドメイン、続いてｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓロイシンジッパーのいずれかを含むＨＡＢＰ融合分子を発現できる(下記参照)。ロイシンジッパーは優勢にヘテロ二量体を形成するため、望むとき、それらを使用してヘテロ二量体形成を誘導できる。

【0310】

Ｆｃ領域を含むＨＡＢＰキメラポリペプチドはまた金属キレートまたは他のエピトープを有するタグを含むように操作できる。タグ付けされたドメインは、金属キレートクロマトグラフィーおよび／または抗体による急速な精製に使用でき、バイオアッセイにおけるウェスタンブロット、免疫沈殿または活性枯渇／ブロッキングの検出を可能にできる。

【0311】

ＨＡＢＰ−Ｆｃキメラポリペプチドの例は、ＴＳＧ−６結合モジュール(ＴＳＧ−６−ＬＭ)およびＦｃの融合タンパク質を含む。ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃの例は配列番号２１２に示し、配列番号２１１に示すヌクレオチドの配列によりコードされる。さらに、例えばＴＳＧ−６−Ｆｃ分子の例を含むＨＡＢＰ−Ｆｃ分子は、所望によりエピトープタグまたは発現および分泌のためのシグナルを含んでよい。例えば、配列番号２１２に示すＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃキメラポリペプチドの例は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ(κ)リーダーシグナルペプチド配列(配列番号２１０)、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃフラグメント(配列番号２０４)およびヒトＴＳＧ−６結合モジュール(配列番号２０７)を含む。ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃキメラポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は配列番号２１１に示す。ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトＴＳＧ−６結合モジュール領域をコードするＤＮＡは、６bp ＡｇｅＩ制限酵素開裂部位および４個のさらなるアミノ酸(ＤＫＴＨ；配列番号２０９)をコードする１２bp配列であるGACAAAACTCAC(配列番号２０８)で結合する。

【0312】

(２) ロイシンジッパー
ここに提供する方法において使用するためのＨＡＢＰポリペプチド多量体の他の製造方法は、ロイシンジッパードメインの使用を含む。ロイシンジッパーは、それらが存在するタンパク質の多量体化を促進するペプチドである。典型的に、ロイシンジッパーは、いくつかのタンパク質における保存ドメインとして存在する４〜５個のロイシン残基を含む反復する七組のモチーフを意味する用語である。ロイシンジッパーは、短、平行コイルドコイルとして折りたたまれ、それらがドメインを形成するタンパク質のオリゴマー化を担うと考えられている。ロイシンジッパードメインにより形成される二量体は、(ａｂｃｄｅｆｇ)ｎと命名された七組反復により安定化され(例えば、McLachlanおよびStewart(1978) J. Mol. Biol. 98:293参照)、ここで残基ａおよびｄは一般的に疎水性残基であり、ｄはロイシンであり、これは螺旋の同じ面に並ぶ。逆に荷電された残基が一般に位置ｇおよびｅに存在する。それゆえに、２個の螺旋ロイシンジッパードメインから形成された平行コイルドコイルにおいて、第一螺旋の疎水性側鎖により形成される“ノブ”が、第二螺旋の側鎖間に形成される“穴”に充填されている。

【0313】

ここで多量体化ドメインとして使用するロイシンジッパーの例は、ロイシンジッパードメインを発現する２個の核トランスフォーミングタンパク質であるｆｏｓおよびｊｕｎのいずれかまたはマウス癌原遺伝子の産物ｃ−ｍｙｃに由来する。ロイシンジッパードメインはこれらのタンパク質で生物活性(ＤＮＡ結合)に必須である。核癌遺伝子ｆｏｓおよびｊｕｎの産物は、ヘテロ二量体を優勢に形成するロイシンジッパードメインを含む(O’Shea et al. (1989) Science, 245:646; Turner and Tijian (1989) Science, 243:1689)。例えば、ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは、１：１化学量論で安定なヘテロ二量体を形成することが示されている(例えば、Busch and Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6:36-40; Gentz et al., (1989) Science, 243:1695-1699参照)。ｊｕｎ−ｊｕｎホモ二量体も形成されることが示されているが、それらはｊｕｎ−ｆｏｓヘテロ二量体より約１０００倍安定性が低い。

【0314】

それゆえに、典型的にここで提供されるＨＡＢＰポリペプチド多量体は、ｊｕｎ−ｆｏｓ組み合わせを使用して産生する。一般的に、ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓのいずれかのロイシンジッパードメインを、遺伝子操作融合遺伝子により、インフレームでポリペプチドのＨＡＢＰのＣ末端と融合する。ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパーのアミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号３６２および３６３に示す。ある例においては、ロイシンジッパーの配列は、ジスルフィド結合の形成を可能にするようなシステイン残基付加またはペプチド濃度測定を容易にするためのＣ末端へのチロシン残基付加によるように、修飾できる。このような修飾ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパーによりコードされるアミノ酸の配列の例を、それぞれ配列番号３６２および３６３に示す。さらに、ＨＡＢＰポリペプチドとロイシンジッパーの結合は直接であってよくまたは例えばＩｇＧのヒンジ領域または種々の長さおよび組み合わせのグリシン、セリン、スレオニンまたはアラニンのような小アミノ酸の他のポリペプチドリンカーのような可動性リンカードメインを用い得る。ある例においては、コードされるポリペプチドのＣ末端からのロイシンジッパーの分離を、例えば、トロンビン開裂部位のようなプロテアーゼ開裂部位をコードする配列との融合により行うことができる。さらに、キメラタンパク質を、金属キレートクロマトグラフィーでの急速な精製を可能にする例えば、６ＸＨｉｓタグおよび／またはウェスタンブロット、免疫沈殿または活性枯渇／ブロッキングバイオアッセイでの検出を可能にするための例えばｍｙｃタグのような抗体が接近可能なエピトープによりタグ付けされ得る。

【0315】

多量体化ドメインとして使用するロイシンジッパードメインの他の例は、出芽酵母の窒素の一般的制御(ＧＣＮ４)代謝に関与する遺伝子のファミリーの転写アクティベーターとして機能する核タンパク質に由来する。タンパク質は二量体化でき、ＧＣＮ４の認識配列を含むプロモータ配列を結合し、それにより窒素欠乏の際に転写を活性化する。二量体複合体を形成できるＧＣＮ４ロイシンジッパーの配列の例を配列番号３６４に示す。ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインを表す合成ペプチドのａおよびｄ残基におけるアミノ酸置換(すなわち配列番号３６４に示す配列におけるアミノ酸置換)は、ロイシンジッパードメインのオリゴマー化特性を変えることが判明している。例えば、位置ａの全残基をイソロイシンに変えても、ロイシンジッパーはまだ平行二量体を形成する。この変更に加えて、位置ｄの全ロイシン残基をイソロイシンに変えたとき、得られたペプチドは、溶液中で三量体平行コイルドコイルを本質的に形成する。三量体を形成できるこのようなＧＮＣ４ロイシンジッパードメインの配列の例を配列番号３６５に示す。位置ｄの全アミノ酸のイソロイシンでの置換および位置ａのロイシンでの置換は、四量体化するペプチドを生じる。このような四量体を形成できるＧＣＮ４のロイシンジッパードメインの配列の例を配列番号３６６に示す。これらの置換を含むペプチドは、オリゴマー形成機構が上に記載し、配列番号３６４に示すＧＣＮ４のような伝統的ロイシンジッパードメインのものと同様であると考えら得るため、なおロイシンジッパードメインと呼ぶ。

【0316】

(３) サブユニット間のタンパク質−タンパク質相互作用
ここでの方法において使用するために提供されるＨＡＢＰを修飾するために使用する他のタイプの多量体化ドメインの例は、多量体化が、異なるサブユニットポリペプチド間のタンパク質−タンパク質相互作用により促進されるものである。このような多量体化ドメインの例は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ(ＰＫＡ)とＡキナーゼアンカータンパク質(ＡＫＡＰ)のそのアンカリングドメイン(ＡＤ)の機構に由来する。それゆえに、ヘテロ多量体ＨＡＢＰポリペプチドは、ＨＡＢＰポリペプチドのＨＡ結合ドメインのようなＨＡＢＰポリペプチドをコードする核酸と、ＰＫＡのＲサブユニット配列をコードする核酸(すなわち配列番号３６７)の結合(直接的または間接的)により産生できる。これは、Ｒサブユニットにより行われる二量体の自発的形成により、ホモ二量体分子をもたらす。相前後して、他のＨＡＢＰポリペプチド融合を、他のＨＡＢＰポリペプチドをコードする核酸とＡＫＡＰのＡＤ配列をコードする核酸配列に結合することにより産生できる(すなわち配列番号３６８)。宿主細胞へのＨＡＢＰキメラ成分の同時形質移入に続くような２成分の同時発現により、二量体Ｒサブユニットは、ＡＤ配列に結合するためのドッキング部位を形成し、ヘテロ多量体分子をもたらす。この結合事象は、さらに例えば、ジスルフィド結合のような共有結合的結合により安定化できる。ある例において、可動性リンカー残基を、ＨＡＢＰポリペプチドをコードする核酸と多量体化ドメインの間に融合できる。他の例において、ＨＡＢＰポリペプチドをコードする核酸の融合は、共有結合的結合を促進するためにＲサブユニットのアミノ末端に隣接して取り込まれたシステイン残基を含むＲサブユニットをコードする核酸へである(例えば、配列番号３６９参照)。同様に、パートナーＨＡＢＰポリペプチドをコードする核酸の融合は、ＡＤのアミノ末端およびカルボキシル末端両者へのシステイン残基の取り込みを含むＡＤサブユニットをコードする核酸にである(例えば、配列番号３７０参照)。

【0317】

iv. 他の多量体化ドメイン
ここでの方法において使用するために提供されるＨＡＢＰの多量体化に使用できる他の多量体化ドメインは当業者に知られており、別々に産生され、ＨＡＢＰ融合体として発現される２個以上のポリペプチドのタンパク質−タンパク質相互作用を促進するあらゆるものである。２個のキメラポリペプチドのタンパク質−タンパク質相互作用を提供するために使用できる他の多量体化ドメインの例は、バルナーゼ−バルスターモジュール(例えば、Deyev et al., (2003) Nat. Biotechnol. 21:1486-1492参照)；特定のタンパク質ドメインの使用(例えば、Terskikh et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1663-1668 and Muller et al., (1998) FEBS Lett. 422:259-264参照)；特定のペプチドモチーフの使用(例えば、de Kruif et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:7630-7634 and Muller et al., (1998) FEBS Lett. 432: 45-49)；および安定性を高めるためのジスルフィド架橋の使用(de Kruif et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:7630-7634 and Schmiedl et al., (2000) Protein Eng. 13:725-734)を含むが、これらに限定されない。

【0318】

ｂ. ＨＡ結合を改善するための変異
さらなる例において、ここでの方法において使用するためにここで提供されるのは、他のＧＡＧｓと比較してヒアルロナンへの高い特異性を示すためにアミノ酸置換によってのように修飾されたＨＡＢＰ類である。例えば、ここで提供されるのは、アミノ酸残基２０、３４、４１、５４、５６、７２および／または８４および特にアミノ酸残基２０、３４、４１および／または５４(配列番号３６０に示すアミノ酸残基に対応)にアミノ酸置換を含む変異体ＴＳＧ−６−ＬＭである。置換アミノ酸はあらゆる他のアミノ酸残基でよく、一般的に非塩基性アミノ酸残基へである。例えば、アミノ酸置換はＡｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ａｌａ(Ａ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｍｅｔ(Ｍ)、Ｐｈｅ(Ｆ)、Ｔｙｒ(Ｙ)またはＴｒｐ(Ｗ)へであり得る。１箇所または複数個所アミノ酸置換はヘパリンへの結合を減少させる。アミノ酸置換を含まないＴＳＧ−６−ＬＭのヘパリンへの結合と比較して、結合は少なくとも１.２倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍以上減少できる。ここで提供される方法において試薬として使用するためのＴＳＧ−６−ＬＭ変異体の例は、Ｋ２０Ａ／Ｋ３４Ａ／Ｋ４１Ａ。それゆえに、例えば、ヘパリンへの結合は、ヒアルロナンへの特異性が高まるように減少される。変異体ＴＳＧ−６−ＬＭは多量体化ドメインに直接的または間接的に結合して、多量体を産生する。例えば、ここでの方法に使用するための試薬の例はＴＳＧ−６−ＬＭ(Ｋ２０Ａ／Ｋ３４Ａ／Ｋ４１Ａ)−Ｆｃである。

【0319】

ｃ. 検出のためのＨＡ結合タンパク質修飾
ここに提供する診断方法において使用するために、ＨＡ結合タンパク質は、検出可能タンパク質または検出を容易にする部分を含むために修飾できる。

【0320】

ｉ. 検出可能タンパク質または部分との結合
ここに提供する診断方法において使用するためのＨＡ結合タンパク質は、ペプチドタグ、放射性標識、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、Ｆｃドメイン、ビオチン、検出可能な反応を触媒するか検出可能な生成物の形成を触媒する酵素群および検出可能な化合物と結合するタンパク質を含むが、これらに限定されない検出可能な部分と結合するように修飾できる。タンパク質および検出を容易にする化合物または部分を含む検出可能な部分は当業者に知られる。検出可能な部分はＨＡＢＰの検出および／または精製を容易にするために使用できる。

【0321】

一例として、ＨＡ結合タンパク質は、検出可能タンパク質または検出可能シグナルを誘発するタンパク質への結合により修飾する。検出可能タンパク質または検出可能シグナルを誘発するタンパク質は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、受容体または検出できる造影剤、発色団、化合物またはリガンドと結合するおよび／または輸送するトランスポータータンパク質から選択できる。例えば、検出可能タンパク質または検出可能シグナルを誘発するタンパク質は緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)または赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)である。

【0322】

検出可能な標識をここに提供する診断方法のいずれでも使用できる。検出可能な標識の例は、例えば、化学発光部分、生物発光部分、蛍光部分、放射性核種および金属を含む。標識を検出する方法は当分野で周知である。このような標識は、例えば、目視により、蛍光スペクトロスコピーにより、反射率測定により、フローサイトメトリーにより、Ｘ線により、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)および磁気共鳴スペクトロスコピー(ＭＲＳ)のような種々の磁気共鳴方法により検出できる。検出方法はまたコンピュータ断層撮影法(ＣＴ)、コンピュータ体軸断層撮影法(ＣＡＴ)、電子ビームコンピュータ断層撮影法(ＥＢＣＴ)、高解像度コンピュータ断層撮影法(ＨＲＣＴ)、下環状断層撮影法、陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、スパイラルコンピュータ断層撮影法および超音波断層法を含む種々の断層撮影方法のいずれも含む。

【0323】

このようなタンパク質の例は、例えば、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼまたはベータ−グルクロニダーゼ(ＧｕｓＡ)のようなルシフェラーゼ群のような、検出可能な反応を触媒できるまたは検出可能な生成物の形成を触媒する酵素群である。またこのようなタンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)または赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)のような蛍光タンパク質を含む、検出可能シグナルを放出するタンパク質である。冷光または蛍光タンパク質のような検出可能シグナルを放出できるまたは検出可能な反応を触媒できるタンパク質をコードする種々のＤＮＡ配列は知られており、ここに提供する方法において使用できる。発光タンパク質をコードする遺伝子の例は、例えば、ビブリオ・ハーベイの細菌ルシフェラーゼ(Belas et al., (1982) Science 218:791-793)、ビブリオ・フィシェリの細菌ルシフェラーゼ(Foran and Brown, (1988) Nucleic acids Res. 16:777)、ホタルルシフェラーゼ(e Wet et al., (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737))、オワンクラゲのエクオリン(Prasher et al., (1987) Biochem. 26:1326-1332)、ウミシイタケのウミシイタケルシフェラーゼ(Lorenz et al, (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4438-4442)およびオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質(Prasher et al., (1987) Gene 111:229-233)からの遺伝子を含む。細菌ルシフェラーゼのｌｕｘＡおよびｌｕｘＢ遺伝子を融合して融合遺伝子(Ｆａｂ_２)を産生でき、これは発現して完全な機能的ルシフェラーゼタンパク質を産生できる(Escher et al., (1989) PNAS 86:6528-6532)。

【0324】

ここに提供する診断方法において使用するためにＨＡ結合タンパク質と結合できる検出可能タンパク質の例はまた、トランスフェリン受容体またはフェリチンのような検出できる造影剤、発色団または化合物またはリガンドと結合できるタンパク質；および大腸菌β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ｇｐｔ)およびアルカリホスファターゼのようなレポータータンパク質を含む。検出可能タンパク質の例は受容体、金属結合タンパク質(例えば、シデロホア類、フェリチン類、トランスフェリン受容体)、リガンド結合タンパク質および抗体を含むが、これらに限定されない、検出可能な化合物と特異的に結合できるタンパク質である。

【0325】

ＨＡＢＰはまたタンパク質またはペプチドタグと結合できる。一例として、ＨＡ結合タンパク質はＦｃドメインと結合する。タンパク質およびペプチドタグは、ヘキサＨｉｓタグ(配列番号５４)、赤血球凝集素タグ(配列番号４２０)、ＦＬＡＧタグ(配列番号５５)、ｃ−ｍｙｃタグ(配列番号４１９)、ＶＳＶ−Ｇタグ(配列番号４２１)、ＨＳＶタグ(配列番号４２２)およびＶ５タグ(配列番号４１５)、キチン結合タンパク質(ＣＢＰ)、マルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)およびグルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ)を含むが、これらに限定されない。

【0326】

検出可能な標識を、組み換え方法または化学的方法によりＨＡＢＰにカップリングまたは結合できる。例えば、結合は、タンパク質を、直接的または間接的にペプチドリンカーまたは化学的リンカーのようなリンカーに結合することにより行うことができる。リンカーは、約５〜２００アミノ酸のポリ−グリシン配列のようなポリペプチド配列であり得る。プロリン残基は、リンカーにより顕著な二次的構造要素、すなわち、α−螺旋／β−シートが形成されることを阻止するためにポリペプチドリンカーに取り込むことができる。可動性リンカーの例は、中間部プロリンを伴うグリシン鎖を含むポリペプチドである。他の例において、化学的リンカーを使用して、合成的または組み換えにより産生した結合および標識ドメインサブシーケンスを接続する。このような可動性リンカーは当業者に知られている。例えば、ポリ(エチレングリコール)リンカーはShearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alaから入手可能である。これらのリンカーは、所望によりアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を含んでよい。

【0327】

４. 診断使用のためのＨＡ結合タンパク質の選択
診断剤として使用するのに適切なＨＡ結合タンパク質は、ＨＡに対する特異性または親和性、溶解度、ペプチド安定性、均一性、発現および精製の容易さ、発現ペプチドのバッチ間最小偏差およびＨＡ結合および検出における低サンプル変動を含むが、これらに限定されない１個以上の所望の特性または活性に基づき選択できる。ある例において、単一ポリペプチド診断剤が、複数ポリペプチド成分を有する診断剤よりも意図される。例えば、完全結合タンパク質の非存在下でＨＡに結合する結合モジュール。ここに提供するＨＡＢＰがヒアルロナンに結合する能力は、ＨＡ、ヘパリンおよびコンドロイチン硫酸類ＡまたはＣ、ヘパラン硫酸類またはデルマタン硫酸類のような他のグリコサミノグリカン類とのＥＬＩＳＡベースのアッセイ、競合的結合アッセイを含むが、これらに限定されない当分野で周知の方法により評価できる。ＨＡ結合活性を評価するアッセイの例は、ここにセクションＤおよび実施例において提供する。

【0328】

Ｄ. アッセイおよび分類
ここで提供される方法は、組織サンプルまたは体液サンプルのような１個または複数のサンプル中のヒアルロナン(ＨＡ)の発現またはレベルのアッセイに基づく。ここでの方法は、サンプル中のヒアルロナン発現またはレベルを評価する、調べる、決定する、定量化するおよび／または他の方法で特異的に検出するためのヒアルロナン結合タンパク質コンパニオン診断(ＴＳＧ−６−ＬＭ、多量体またはその変異体のようなＨＡＢＰ)を使用する結合方法に基づく。アッセイはインビトロまたはインビボで実施できる。対照または参照サンプルと比較することによりまたは予め決定したレベルに基づき分類することにより、このような値をヒアルロナン関連疾患または状態の診断または予後診断のために、ヒアルロナン分解酵素治療に対するヒアルロナン関連疾患または状態を有する対象の応答性を予測するためにおよび／またはヒアルロナン分解酵素治療で処置しているヒアルロナン関連疾患または状態を有する対象の処置効果をモニターするまたは予測するために使用できる。例えば、ここに記載するとおり、ＨＡレベルおよび程度は、ヒアルロニダーゼまたは修飾ヒアルロニダーゼ(例えばＰＥＧＰＨ２０のようなペグ化ヒアルロニダーゼ)のようなヒアルロナン分解酵素での処置への応答性と特異的に関連することが判明した。

【0329】

上記例のいずれにおいても、ヒアルロナン関連疾患または状態は、ヒアルロナンレベル上昇が疾患または状態の原因として、結果としてまたは他で観察される疾患および状態を言う。ヒアルロナン関連疾患または状態の例は、高間質性流体圧、癌および特に高ヒアルロナン腫瘍、浮腫、ディスク圧、炎症性疾患と関連するものおよびヒアルロナンと関連する他の疾患を含むが、これらに限定されない。ある例において、ヒアルロナン関連疾患および状態は、腫瘍のような上昇した間質性流体圧、低下した血管体積および／または組織における上昇した水含量と関連する。特に、ヒアルロナン関連疾患および状態は、高ヒアルロナン腫瘍、例えば、末期癌、転移癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、前立腺癌、膵癌、非小細胞性肺癌、乳癌、結腸癌および他の癌のような固形腫瘍を含む腫瘍を含むが、これらに限定されない。

【0330】

一例として、ヒアルロナンのレベルまたは発現に基づき、患者または対象を抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置のために選択できる。例えば、対象からのサンプルを、ＴＳＧ−６−ＬＭ、多量体またはその変異体のようなヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)コンパニオン診断と接触させ、ＨＡＢＰのサンプルへの結合を、サンプル中のヒアルロナンの量を決定するために検出できる。ここに記載するとおり予め決定した選択または分類基準に基づき、患者をヒアルロナン関連疾患または状態として診断し、それゆえに疾患または状態の処置のために選択できる。また、ここに記載するとおり予め決定した選択または分類基準に基づき、ここでの方法は対象の予後診断に使用できる。疾患または状態の経過によって、治療剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の投与量、処置スケジュールおよび／または投与レジメをそれに応じて最適化し、調節できる。ここでの具体例において、ここに記載するとおり予め決定した選択または分類基準に基づき、患者または対象を、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼまたは修飾ヒアルロニダーゼ(例えばＰＥＧＰＨ２０のようなペグ化ヒアルロニダーゼ)のようなヒアルロナン分解酵素での処置に応答性でると予測される処置に対して選択できる。それゆえに、本方法は、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素による処置の効果の予測に使用できる。

【0331】

ここでの方法の例において、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での処置の効果は、処置の経過中のヒアルロナンの発現またはレベルのモニタリングにより決定できる。それゆえに、本方法は、疾患状態および／または回復をモニタリングする処置後方法であり、この情報を使用して、個々の状態情報により対象の処置の経過を変えることができる。例えば、対象からのサンプルを、ヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)コンパニオン診断、例えばＴＳＧ−６−ＬＭ、多量体またはその変異体と接触させて、ＨＡＢＰのサンプルへの結合を、サンプル中のヒアルロナンの量を決定するために検出できる。サンプル中のヒアルロナンの発現またはレベルを、ヒアルロナンレベルまたは発現の差を評価するために参照または対照サンプルと比較できる。例えば、健常または正常対象と比較した疾患対象における上昇したまたは蓄積したヒアルロナンレベルはヒアルロナン関連疾患または状態(例えば腫瘍または癌)の指標であり、ヒアルロナン発現またはレベルの程度は疾患高攻撃性と相関する。このような方法において、対照または参照サンプルは健常対象からのサンプルであり、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置前の対象由来のベースラインサンプル(処置前参照)または対象からの抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の直前の投与の前のサンプルである。例えば、患者応答モニタリングのために、アッセイを治療開始時に行い、サンプル(例えば組織または体液)におけるヒアルロナンベースライン(または予定された)レベルを確立できる。同じサンプル(例えば組織または体液)を次いで同じアッセイでサンプリングして、ヒアルロナンのレベルをベースラインまたは予定されたレベルと比較する。

【0332】

１. ヒアルロナン測定のためのアッセイ
ここに記載するとおりＴＳＧ−６−ＬＭ、多量体(例えばＴＳＧ−６ＬＭ−Ｆｃ)またはその変異体のようなＨＡＢＰコンパニオン診断をしようして、サンプル中のヒアルロナンレベルを評価、定量、決定および／または検出するのは当業者のレベルの範囲内である。アッセイはインビトロまたはインビボアッセイを含む。サンプル中のヒアルロナンの発現またはレベルを評価する、調べる、決定する、定量するおよび／または他の点で特異的に検出するために使用できる結合アッセイの例は、固相結合アッセイ(例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ))、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、免疫放射定量アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学(ＩＨＣ)または非抗体結合剤を使用する擬似免疫組織化学のような組織化学的方法を含むが、これらに限定されない。ＥＬＩＳＡ方法のような固相結合アッセイ方法において、例えば、アッセイはサンドイッチ形式でも競合的阻害形式でもよい。他の例において、インビボ造影法を使用できる。

【0333】

ａ. 組織化学的および免疫組織化学的方法
ヒアルロナン蓄積を評価する方法は、結合するＨＡＢＰコンパニオン診断の量がサンプル中のＨＡの量と相関するように、ＨＡＢＰコンパニオン診断がサンプル、例えば組織または細胞サンプル中のＨＡと結合する能力に基づく。ここに提供するあらゆるＨＡＢＰコンパニオン診断を使用して、免疫組織化学(ＩＨＣ)のような細胞化学的または組織化学的方法または非抗体結合剤(例えば擬似免疫組織化学)を使用する組織化学を含むが、これらに限定されない、当業者に知られる組織染色方法を使用して、ＨＡを検出できる。このような組織化学的方法は、腫瘍組織サンプルのようなサンプル中のＨＡと結合するＨＡＢＰの量の定量的または半定量的検出を可能にする。このような方法において、組織サンプルを、ここで提供されるＨＡＢＰ試薬および特に組織または細胞関連ＨＡとの結合を可能にする条件下で、検出可能に標識されているまたは検出できるものと接触できる。

【0334】

組織化学により決定したここに提供する方法において使用するためのサンプルは、組織または細胞サンプルのような、そのＨＡレベルを分析できるあらゆる生物学的サンプルであり得る。例えば、組織サンプルは、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織サンプルまたは生検試料または吸引物または細胞を含む、固形組織であり得る。いくつかの例において、組織サンプルは、乳房、結腸、直腸、肺、胃、卵巣、頸、子宮、精巣、膀胱、前立腺、甲状腺および肺の癌腫瘍を含むが、これらに限定されない原発および転移腫瘍のような固形腫瘍から得られる組織または細胞である。具体例において、サンプルは、末期癌、転移癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、前立腺癌、膵癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌である癌の組織サンプルである。他の例において、組織サンプルは、原発または培養細胞または細胞株由来の細胞である。細胞は種々の分化段階でよく、正常、前癌性または癌性であってよく、新鮮組織、分散細胞、幹細胞を含む未成熟細胞、中程度の成熟度の細胞および完全に成熟した細胞であり得る。典型的に、ここで提供される方法において使用するために選択される細胞は、癌細胞である。

【0335】

腫瘍が固形腫瘍であるとき、腫瘍細胞の単離は、典型的に外科生検である。対象から腫瘍細胞を回収するために使用できる生検技術は、針生検、ＣＴ下針生検、吸引生検、内視鏡生検、気管支鏡生検、気管支洗浄、切開生検、切除生検、パンチ生検、薄片生検、皮膚生検、骨髄生検および電気外科的ループ切除法(ＬＥＥＰ)を含むが、これらに限定されない。典型的に、１００mgより多いが、多くても１００mg、５０mg以下、１０mg以下または５mg以下であるように小さくてもよい；または１００mg、２００mg以上または５００mg以上、１gm以上、２gm以上、３gm以上、４gm以上または５gm以上のように大きくてもよい非壊死性、無菌生検または検体を得る。アッセイのために抽出すべきサンプルサイズは、実施するアッセイ数、組織サンプルの健康、癌のタイプおよび対象の状態を含むが、これらに限定されない、多くの因子により得る。腫瘍組織を無菌チューブまたは培養プレートのような無菌容器に入れ、所望により適当な媒体に浸漬できる。

【0336】

生検後に患者から得た組織は、しばしば、通常ホルマリン(ホルムアルデヒド)またはグルタルアルデヒド、例えばまたはアルコール浸漬により固定化する。組織化学的方法のために、腫瘍サンプルを、腫瘍組織の脱水およびパラフィン蝋または当業者に知られた他の固体支持体への包埋(Plenat et al., (2001) Ann Pathol January 21(1):29-47)、染色に適切な切片への組織のスライスおよび、例えば有機溶媒により包埋用固体支持体の除去および保存組織の再水和を含む、選択した組織化学的染色方法による切片の染色のための処理のような、既知技術を使用して処理できる。それゆえに、ここでの方法に使用するためのサンプルは、例えば、防腐剤、抗凝血剤、緩衝液、固定液、栄養剤および抗生物質を含む、組織または細胞サンプルに天然に存在しない化合物を含み得る。

【0337】

ヒアルロナン分解酵素で処置するために対象を選択する方法の例において、腫瘍組織の採取を、一般的に対象をヒアルロナン分解酵素で処置する前に行う。ヒアルロナン分解酵素での腫瘍の治療をモニタリングする方法の例において、対象からの腫瘍組織の採取を、対象がヒアルロナン分解酵素での処置を１回以上受ける前、間または後に行い得る。

【0338】

ここで提供される方法において使用するためのアッセイは、サンプルに存在するＨＡを組織化学または免疫組織化学を使用して検出するものを含む。組織化学(ＨＣ)は、組織抗原またはバイオマーカー、例えば、ＨＡのような細胞または特異的タンパク質を検出するために、抗体(例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体)または他の結合パートナーのような結合パートナーを使用する酵素反応に基づく染色方法である。例えば、ここでの方法で使用するための組織化学アッセイは、ＨＡＢＰを細胞または組織と関連するＨＡの検出のための結合パートナーとして使用するものを含む。典型的に、組織化学プロトコルは、定性的または定量的分析のために、ヒト眼または自動化走査系のいずれかのためにマーカーの存在を可視化する検出系を含む。直接ＨＣアッセイにおいて、結合を、標識された試薬の使用による、組織またはバイオマーカーへの結合パートナー(例えば一次抗体)の結合により直接測定する。間接的ＨＣアッセイにおいて、二次抗体または第二の結合パートナーが、第一結合パートナーの結合の検出のために、それが標識されていないため必要である。

【0339】

このような方法において、一般的にスライドに乗せた組織サンプルを、一般的組織化学技術を使用して標識結合試薬(例えば標識ＨＡＢＰ)で染色する。それゆえに、ここで提供するＨＣ方法の例において、ＨＡＢＰコンパニオン診断を、検出され得る部分を含むように修飾する(上のセクション３Ｃに記載のとおり)。いくつかの例において、ＨＡＢＰコンパニオン診断を、標識結合パートナーまたは抗体を介して検出できる小分子、例えば、ビオチンに結合する。いくつかの例において、ＩＨＣ方法は、ホースラディッシュペルオキシダーゼでの酵素染色により検出されるＨＡＢＰタンパク質で染色する。例えば、ＨＡＢＰをビオチニル化し、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼのような検出可能タンパク質と結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出できる(下記実施例６参照)。他の例において、ＨＡＢＰコンパニオン診断を、例えば、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質または酵素と結合したＨＡＢＰコンパニオン診断のような直接検出を可能にする検出可能タンパク質と結合する。目的のタンパク質を検出するための、種々の酵素染色方法が当分野で知られる。例えば、酵素相互作用を、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのような種々の酵素群またはＤＡＢ、ＡＥＣまたはFast Redのような異なる色素原を使用して可視化できる。他の例において、ＨＡＢＰコンパニオン診断を、標識結合パートナーまたは抗体を介して検出できるペプチドまたはタンパク質と結合できる。

【0340】

他の例において、ＨＡを、ＨＡＢＰ類の１個以上のエピトープ、ＨＡＢＰ結合ドメインまたはそのＨＡ結合フラグメントを認識する標識抗体のような標識二次試薬によりＨＡＢＰコンパニオン診断を検出する、ここに提供するＨＡＢＰコンパニオン診断を使用するＨＣ方法により検出する。他の例において、ＨＡＢＰコンパニオン診断を抗ＨＡＢＰ抗体を使用して検出する。ＨＡＢＰを検出するために、あらゆる抗ＨＡＢＰ抗体を、それがＨＡ検出に使用するＨＡＢＰ、ＨＡＢＰ結合ドメインまたはそのＨＡ結合フラグメントに使用する限り、使用できる。例えば、ＴＳＧ−６またはＴＳＧ−６−ＬＭの検出のために、Ａ３８およびＱ７５と命名された抗体のような抗ＴＳＧ−６結合モジュールモノクローナル抗体を使用できる(Lesley et al. (2002) J Biol Chem 277:26600-26608参照)。抗ＨＡＢＰ抗体を検出するために標識してよくまたは一次抗体と結合する二次的抗体を用いて検出してよい。適当な抗ＨＡＢＰ抗体の選択は当業者のレベルの範囲内である。

【0341】

得られた染色された抗体を、各々、染色のデジタル画像のような、検出可能シグナルを可視化し、画像を獲得するシステムを使用して可視化する。画像を獲得する方法は当業者に周知である。例えば、サンプルが染色されたら、例えば、正立または倒立光学顕微鏡、走査共焦点顕微鏡、カメラ、走査またはトンネル電子顕微鏡、走査プローブ顕微鏡および赤外線撮像ディテクタのような、あらゆる光学または非光学造影装置を使用して、染色またはバイオマーカー標識を検出できる。いくつかの例において、画像デジタル化により捕獲できる。得られた画像を、次いで、サンプル中のＨＡの量の定量的または半定量的決定に使用できる。免疫組織化学で使用するのに適切な種々の自動化サンプル処理、走査および分析システムは当分野で利用可能である。このようなシステムは、自動化染色および顕微鏡的走査、コンピュータ化画像分析、連続切片比較(サンプルの配向およびサイズの多様性を制御するために)、デジタル報告作成およびサンプルの記録および追跡(例えば組織切片が置かれるスライド)を含み得る。免疫染色サンプルを含む、細胞および組織上で定量的分析を行うためのデジタル画像処理システムを備えた慣用の光学顕微鏡と組み合わせた細胞造影システムは市販されている。例えば、ＣＡＳ−２００システム(Becton, Dickinson & Co.)参照。特に、検出は手動でも、コンピュータ・プロセッサおよびソフトウェアを含む画像処理技術によってもよい。このようなソフトウェアを使用して、例えば、当業者に知られた方法を使用して、例えば、染色品質または染色強度を含む因子に基づき、画像を設定し、校正し、標準化し、／または確認することができる(例えば公開米国特許出願番号ＵＳ２０１００１３６５４９参照)。

【0342】

画像を定量的または半定量的に分析し、サンプルの染色強度に基づきスコア化できる。定量的または半定量的組織化学は、抗原または他のタンパク質(例えばＨＡ)のような特定のバイオマーカーの存在を同定および定量するために組織化学に付されているサンプルを、走査およびスコア化する方法を言う。定量的または半定量的方法は、染色密度または染色の量を検出するための造影ソフトウェアまたは熟練技師が数字として結果をランク付けするヒト眼による染色を検出する方法を用い得る。例えば、画像を、画素数アルゴリズム(例えばAperio Spectrumソフトウェア、Automated QUantitatative Analysisプラットフォーム(ＡＱＵＡ(登録商標)プラットフォーム)および染色の程度を測定もしくは定量化または半定量化する他の標準的方法を使用して定量的に分析できる(例えば米国特許番号８,０２３,７１４；米国特許番号７,２５７,２６８；米国特許番号７,２１９,０１６；米国特許番号７,６４６,９０５；公開米国特許出願番号ＵＳ２０１００１３６５４９および２０１１０１１１４３５；Camp et al. (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327; Bacus, et al.(1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328参照)。強い正の染色(例えば褐色染色)対総染色面積の合計の比を計算し、スコア化できる。

【0343】

免疫組織化学的方法または擬似免疫組織化学的方法のような組織化学的方法を使用して、検出したＨＡの量を定量し、ＨＡ正画素のパーセンテージおよび／またはスコアとして示す。例えば、サンプル中の検出したＨＡの量を、ＨＡ正画素のパーセンテージとして定量できる。いくつかの例において、サンプルに存在するＨＡの量を、染色面積のパーセンテージ、例えば、ＨＡ正画素のパーセンテージとして定量する。例えば、サンプルは、総染色面積と比較して、少なくともまたは凡そ少なくともまたは約０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のＨＡ正画素であり得る。

【0344】

ある例において、サンプルにサンプルの組織化学的染色の強度または量の数値表現であり、サンプルに存在する標的バイオマーカー(例えば、ＨＡ)の量を表すスコアを付ける。光学密度または面積パーセンテージ値は、例えば整数スケール、例えば、０〜１０、０〜５または０〜３で、等級付けしたスコアをもたらし得る。具体例において、サンプル中のヒアルロナンの量を０〜３のスケール、例えば０、ＨＡ^＋１、ＨＡ^＋２およびＨＡ^＋３で分類する。存在するＨＡの量はＨＡ画素のパーセンテージと関連し、すなわち、低パーセンテージのＨＡ画素は低レベルのＨＡを示し、一方高パーセンテージのＨＡ画素は高レベルのＨＡを示す。スコアを、染色された面積パーセンテージがそれぞれ染色なし、１０％未満の染色、１０〜２５％染色および２５％を超える染色を表す０、ＨＡ^＋１、ＨＡ^＋２およびＨＡ^＋３としてスコア化されるように、パーセンテージのＨＡ正画素と相関させ得る。例えば、比率(例えば強画素染色対総染色面積)が２５％を超えるならば、腫瘍組織をＨＡ^＋３とスコア化し、比率が１０〜２５％の強い正の染色対総染色であるならば腫瘍組織をＨＡ^＋２とスコア化し、比率が１０％未満の強い正の染色対総染色であるならば、腫瘍組織をＨＡ^＋１とスコア化し、強い正の染色対総染色が０であるならば、腫瘍組織を０とスコア化する。０またはＨＡ^＋１のスコアは、試験サンプル中の低レベルのＨＡを示し、一方ＨＡ^＋２またはＨＡ^＋３のスコアは、試験サンプル中の高いレベルのＨＡを示す。

【0345】

ｂ. 固相結合アッセイ
ヒアルロナン蓄積を評価する方法は、結合するＨＡＢＰコンパニオン診断の量がサンプル中のＨＡの量と相関するように、ＨＡＢＰコンパニオン診断がサンプル中のＨＡと結合する能力に基づく。特に固相結合アッセイを使用できる。サンプル中のヒアルロナンの発現またはレベルを評価する、調べる、決定する、定量するおよび／または他の点で特異的に検出するために使用できる結合アッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、免疫放射定量アッセイ、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイを含むが、これらに限定されない。例えば、ここで提供されるＨＡＢＰコンパニオン診断は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)またはサンドイッチＥＬＩＳＡまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを含む他の類似の免疫アッセイを含むが、これらに限定されない、当業者に知られるあらゆる結合アッセイを使用して、ＨＡ検出に使用できる。ここに提供される方法の例は、腫瘍を有するまたは腫瘍を有することが疑われる対象からの腫瘍組織サンプルまたは体液サンプルのようなサンプル中のＨＡと結合する、ＨＡＢＰの量の定量的または半定量的検出のためのＥＬＩＳＡベースの方法を含む。固相結合アッセイは、ＨＡを体液中で検出するとき、使用できる。

【0346】

ここに記載するとおり、腫瘍組織において高レベルのヒアルロナン産生を示す患者はまた血液で高レベルのヒアルロナンを示す。従って、ここに提供される方法は、腫瘍を有する患者または腫瘍を有することが疑われる患者からの体液サンプル中のヒアルロナン蓄積評価を含む、ヒアルロナン分解酵素での処置に対する対象の応答性を予測する、ヒアルロナン分解酵素での処置について対象を選択するまたはヒアルロナン分解酵素での処置をモニターする方法を包含する。

【0347】

癌のようなＨＡ関連疾患におけるＨＡ産生分析のための体液サンプルは、血清、尿、血漿、脳脊髄液およびリンパ液を含むが、これらに限定されない。対象は、乳房、結腸、直腸、肺、胃、卵巣、頸、子宮、精巣、膀胱、前立腺、甲状腺、肺における原発および転移腫瘍のような癌を有してもまたは有することが疑われてもよい。具体例において、癌は末期癌、転移癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、前立腺癌、膵癌、非小細胞性肺癌、乳癌または結腸癌である。

【0348】

ヒアルロナン分解酵素での処置について対象の応答性を予測するまたはヒアルロナン分解酵素での処置について対象を選択する方法の例において、対象からの体液サンプル採取は、一般的に対象をヒアルロナン分解酵素で処置する前に行う。腫瘍のヒアルロナン分解酵素での治療をモニタリングする方法の例において、対象からの体液サンプル採取は、対象がヒアルロナン分解酵素での１回以上の処置を受けている前、途中または後に行い得る。体液サンプル採取はまた対象が１ラウンド以上の放射線および／または化学療法処置のような抗癌治療を受けている前、途中または後にも行い得る。

【0349】

体液サンプルを、次いで、固相結合アッセイを使用して、ＨＡの存在または量について評価する。固相結合アッセイは、体液サンプルの基質(例えばＨＡ)を、固体表面に固定化または不動化された結合剤への基質の結合により検出できる。検出可能な標識(例えば酵素)に結合した基質特異的抗体または結合タンパク質(例えばここに提供するＨＡＢＰ)を適用し、基質と結合させる。抗体または結合タンパク質の量を、次いで検出し、定量する。検出および定量化方法は、比色、蛍光、冷光または放射性方法を含むが、これらに限定されない。検出方法の選択は、使用する検出可能な標識による。ある例において、抗体に結合した酵素を用いる比色反応。例えば、本方法で一般的に用いる酵素群は、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。サンプルに存在する基質の量は生じる色の量に比例する。基質標準を一般的に用いて、定量的精度を改善する。サンプル中のＨＡの濃度は、標準曲線にデータを内挿することにより計算できる。ＨＡの量を体液サンプルの濃度として表し得る。

【0350】

方法の例において、一般的に標識されていないＨＡＢＰ試薬を、最初に固体支持体に固定化し(例えばマイクロタイタープレートのウェルへのコート)、続いてＨＡを含む体液サンプル(例えば血清または血漿)とインキュベートしてＨＡを捕捉する。体液サンプを適当な緩衝液で洗浄後、結合したＨＡを検出できる。結合したＨＡを検出するためのある例において、ビオチニル化ＨＡＢＰのような固定化ＨＡＢＰと同一または異なり、標識されている第二のＨＡＢＰ(標識ＨＡＢＰ)を使用して、プレート上のＨＡを結合する。結合していない標識ＨＡＢＰの除去後、結合した標識ＨＡＢＰを検出試薬を使用して検出する。例えば、ビオチンはアビジン検出試薬を使用して検出できる。いくつかの例において、プレートに結合したＨＡＢＰは、検出に使用するＨＡＢＰと異なる。他の例において、プレートに結合したＨＡＢＰおよび検出用ＨＡＢＰは同一である。結合したＨＡを検出するための他の例において、結合したＨＡをＨＡＢＰの添加および続く抗ＨＡＢＰ抗体の添加により検出する。例えば、ＴＳＧ−６またはＴＳＧ−６−ＬＭの検出のために、Ａ３８およびＱ７５と命名された抗体のような抗ＴＳＧ−６結合モジュールモノクローナル抗体を使用できる(Lesley et al. (2002) J Biol Chem 277:26600-26608参照)。抗ＨＡＢＰ抗体を検出するために標識してよくまたは一次抗体と結合する二次的抗体を用いて検出してよい。結合したＨＡを検出するためのさらに別の例において、結合したＨＡを抗ＨＡ抗体で直接検出する。抗ＨＡ抗体は当業者に周知であり、例えば、ヒツジ抗ヒアルロン酸ポリクローナル抗体(例えば、Abcam #53842または#93321)を含む。

【0351】

ｃ. インビボ造影アッセイ
ここでのいくつかの例において、ＨＡの量をインビボ造影法を使用して検出する。このような方法において、ＴＳＧ−６−ＬＭ、その多量体(例えばＴＳＧ−６ＬＬＭ−Ｆｃ)または変異体のようなＨＡＢＰを、検出可能部分または造影法により検出され得る部分と結合する。造影法の例は、蛍光造影、Ｘ線、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)および磁気共鳴スペクトロスコピー(ＭＲＳ)のような磁気共鳴方法およびコンピュータ断層撮影法(ＣＴ)、コンピュータ体軸断層撮影法(ＣＡＴ)、電子ビームコンピュータ断層撮影法(ＥＢＣＴ)、高解像度コンピュータ断層撮影法(ＨＲＣＴ)、下環状断層撮影法、陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、スパイラルコンピュータ断層撮影法および超音波断層法を含む断層撮影方法を含むが、これらに限定されない。例えば、蛍光造影のために、蛍光シグナルを蛍光顕微鏡または蛍光立体顕微鏡で分析できる。また、高感度造影カメラも使用できる。

【0352】

特に、ＴＳＧ−６−ＬＭ、その多量体(例えばＴＳＧ−６ＬＬＭ−Ｆｃ)または変異体のようなＨＡＢＰを、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)、シンチ撮影法、ガンマカメラ、β＋ディテクタ、γディテクタ、蛍光造影および生物発光造影を含むが、これらに検出されない方法で撮像するとき、シグナルを提供するかインビボで検出可能なシグナルを誘発する部分で標識するかまたはそれと結合させる。造影／モニタリング方法の例は、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)および磁気共鳴スペクトロスコピー(ＭＲＳ)のような種々の磁気共鳴方法のいずれかを含み、またコンピュータ断層撮影法(ＣＴ)、コンピュータ体軸断層撮影法(ＣＡＴ)、電子ビームコンピュータ断層撮影法(ＥＢＣＴ)、高解像度コンピュータ断層撮影法(ＨＲＣＴ)、下環状断層撮影法、陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)、ガンマ線(ＰＥＴ走査でポジトロンおよび電子消滅後)、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ)、スパイラルコンピュータ断層撮影法および超音波断層法を含む種々の断層撮影方法のいずれかも含む。造影法の他の例は、弱光造影、Ｘ線、超音波シグナル、蛍光吸収および生物発光を含む。さらに、タンパク質を、蛍光化合物または分子のような発光または他の電磁スペクトル放出化合物で標識できる。検出は発光または他の電磁放射線放出の検出により行い得る。

【0353】

検出可能な標識は、直接検出可能な元素(例えば放射性標識)を含む試薬および間接的に検出可能な元素(例えば反応生成物)を含む試薬を含む。セクションＣ.３.ｃはまた検出可能な標識を含む。検出可能な標識の例は放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素群を含む。検出可能な標識を、化学的または組み換え方法によりＨＡＢＰに取り込み得る。

【0354】

Ｘ線造影に適当な標識は当分野で知られ、例えば、ビスマス(III)、金(III)、ランタン(III)または鉛(II)；６７銅、６７ガリウム、６８ガリウム、１１１インジウム、１１３インジウム、１２３ヨウ素、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１９７水銀、２０３水銀、１８６レニウム、１８８レニウム、９７ルビジウム、１０３ルビジウム、９９テクネチウムまたは９０イットリウムのような放射性イオン；コバルト(II)、銅(II)、クロム(III)、ジスプロシウム(III)、エルビウム(III)、ガドリニウム(III)、ホルミウム(III)、鉄(II)、鉄(III)、マンガン(II)、ネオジム(III)、ニッケル(II)、サマリウム(III)、テルビウム(III)、バナジウム(II)またはイッテルビウム(III)のような核磁気スピン共鳴同位体；またはローダミンまたはフルオレセインを含む。

【0355】

造影剤は磁気共鳴画像法のために使用される。造影剤の例は、鉄、金、ガドリニウムおよびガリウムを含む。磁気共鳴画像法に適当な標識は当分野で知られ、例えば、鉄、ガリウム、金、ガドリニウム、マグネシウム、^１Ｈ、^１９Ｆ、^１３Ｃおよび^１５Ｎ標識化合物のような、例えば、フッ素、ガドリニウムキレート、金属および金属酸化物を含む。造影剤におけるキレートの使用は当分野で知られる。断層撮影造影法に適当な標識は当分野で知られ、例えば、^１ｌＣ、^１３Ｎ、^１５Ｏまたは^６４Ｃｕのようなβ−エミッターまたは(ｂ)^１２３Ｉのようなγ−エミッターを含む。例えば、ＰＥＴのトレーサーとして、使用できる放射性核種の他の例は、^５５Ｃｏ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^６０Ｃｕ(II)、^６７Ｃｕ(II)、^９９Ｔｃ、^５７Ｎｉ、^５２Ｆｅおよび^１８Ｆを含む。ＴＳＧ−６またはそのＦＣ部分のような試薬を適切な標識に結合できおよび／またはタンパク質はその構成物分子内に放射性標識を含み得る。

【0356】

ここで提供する造影法で有用な放射性核種は、例えば、^１１炭素、^１１フッ素、^１３炭素、^１３窒素、^１５窒素、^１５酸素、^１８フッ素、^１９フッ素、^２４ナトリウム、^３２ホスフェート、^４２カリウム、^５１クロム、^５５鉄、^５９鉄、^５７コバルト、^６０コバルト、^６４銅、^６７ガリウム、^６８ガリウム、^７５セレン、^８１クリプトン、^８２ルビジウム、^８９ストロンチウム、^９２ストロンチウム、^９０イットリウム、^９９テクネチウム、^１０３パラジウム、^１０６ルテニウム、^１１１インジウム、^１１７ルテチウム、^１２３ヨウ素、^１２５ヨウ素、^１３１ヨウ素、^１３３Ｘｅｎｏｎ、^１３７セシウム、^１５３サマリウム、^１５３ガドリニウム、^１６５ジスプロシウム、^１６６ホルミウム、^１６９イッテルビウム、^１７７Leutium ^１８６レニウム、^１８８レニウム、^１９２イリジウム、^１９８金、^２０１タリウム、^２１１アスタチン、^２１２ビスマスおよび^２１３ビスマス。当業者は、異なる放射性核種／金属を可視化するために異なる造影法(ＭＲＩ、例えば)で使用するパラメータを改変できる。

【0357】

蛍光標識も使用できる。これらは、蛍光タンパク質、蛍光プローブまたは蛍光基質を含む。例えば、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)またはそのホモログまたはＲＦＰのような蛍光タンパク質；蛍光色素(例えば、フルオレセインおよびフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)およびOregon Green(登録商標)のような誘導体、ローダミンおよび誘導体(例えば、Texas redおよびテトラメチルローダミンイソチオシアネート(ＴＲＩＴＣ))、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、Alexa Fluor(登録商標)、Li-COR(登録商標)、CyDyes(登録商標)またはDyLight(登録商標)Fluors)；tdTomato、mCherry、mPlum、Neptune、TagRFP、mKate2、TurboRFPおよびTurboFP635(Katushka)を含むが、これらに限定されない。蛍光試薬を、使用者の所望の励起および発光スペクトルに基づき選択できる。蛍光開裂生成物を生じる蛍光基質も使用できる。

【0358】

インビボ造影法はＨＡ関連腫瘍または癌の診断に使用できる。このような技術は、生検を使用しない診断を可能にする。ＨＡＢＰの腫瘍への結合の程度またはレベルに基づくインビボ造影法は、癌患者の予後診断にも使用できる。インビボ造影法はまた、体の他の部分への転移癌または循環腫瘍細胞(ＣＴＣｓ)の検出にも使用できる。腫瘍ではない組織の背景ヒアルロナンレベルを確認するのは当業者のレベルの範囲内である。ヒアルロナン発現腫瘍は背景組織より高いレベルのシグナルを有する。ある例において、閾値基準を、正常または健常対象で検出したシグナルとの比較により決定できる。

【0359】

２. 対象の分類
サンプル中のヒアルロナンの量が決定されたら、量を対照または閾値レベルと比較し得る。対照または閾値レベルは、一般的にヒアルロナン関連疾患または状態(例えば腫瘍または癌)の指標である予定した閾値または量である。このようなレベルまたは量は当業者により経験的に決定できる。ここでの方法のための特定の予め決定した選択または分類基準は、ヒアルロナン検出に使用する特定のアッセイおよび試験する特定のサンプルによることは当然である。アッセイが特定のサンプルの試験と適合性があるか否かを決定するのは当業者のレベルの範囲内である。一般的に、インビトロ固相アッセイは体液サンプルの試験に使用する。組織化学または免疫組織化学のような固相アッセイは、一般的に組織サンプルの試験に使用する。予め決定したレベルもしくは量または対照もしくは参照サンプルとの比較を含む方法において、参照は同じタイプのサンプルから同じアッセイおよびＨＡＢＰ試薬(同じ検出可能な部分および検出方法を含む)を使用して製造することも理解される。

【0360】

例えば、予定した閾値は、レベルまたは発現の差異を評価するために、対象集団におけるマーカーの中央または平均レベルまたは量のような参照または対照サンプルにおけるマーカーのレベルまたは量に基づき決定できる。一例として、予定した閾値は、健常対象またはヒアルロナン関連疾患または状態(例えば腫瘍または癌)を有することが知られた対象のサンプル中のヒアルロナンの平均または中央レベルまたは量である。一つの態様において、正常組織または体液サンプルからのヒアルロナンの予定されたレベルまたは量は正常サンプルで観察される平均レベルまたは量である(例えば、分析した全正常サンプル)。他の態様において、正常組織または体液サンプルのヒアルロナンのレベルまたは量は、正常サンプルで観察されるレベルまたは量の中位値である。予定した閾値はまた細胞株または他の対照サンプル(例えば腫瘍細胞株)におけるヒアルロナンのレベルまたは量に基づき得る。下記のとおり、これらの予め決定した値は、同じ検出アッセイで同じＨＡＢＰ試薬を使用して決定した対応する正常サンプルにおけるＨＡレベルの比較または知識により決定できる。

【0361】

参照または対照サンプルは、正常組織、細胞または体液、例えば、試験するサンプルに順ずるが、異なる対象から単離した組織、細胞または体液のような他の組織、細胞または体液であり得る。対照または参照対象は、正常(すなわち疾患または状態を有しない)である対象または対象の集団、疾患を有するが、検査を受ける対象が有するまたは有することが疑われる疾患または状態のタイプは有しない対象、例えば、ヒアルロナン関連疾患または状態(例えば腫瘍または癌)を有しない対象または類似疾患または状態を有するが、その疾患は重度ではないおよび／または相対的に低いヒアルロナンを発現する他の対象からの類似組織であり得る。例えば、試験する細胞、組織または体液が、癌を有する対象または対象の集団であるとき、マーカーのレベルまたは量を、初期段階のような重篤ではない癌、区別されるまたは他のタイプの癌を有する対象の組織、細胞または体液のマーカーのレベルまたは量と比較できる。他の例において、対照または参照サンプルは、サンプル、低レベルのＨＡを発現する腫瘍細胞株の例、例えば、ＨＣＴ １１６細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＮＣＩ Ｈ４６０細胞株、DU145細胞株、Ｃａｐａｎ−１細胞株およびこのような細胞株を使用して産生した腫瘍モデルからの腫瘍のような相対的に低レベルのＨＡを発現することが知られる例えば腫瘍細胞株のような、知られた量または相対的量のヒアルロナンを含む体液、組織、抽出物(例えば細胞または核抽出物)、核酸またはペプチド調節物、細胞株、生検、標準または他のサンプルである。

【0362】

ここでの全ての方法において、ヒアルロナン関連疾患または状態(例えば、癌)を有することが疑われるまたは知られた対象からのサンプル中のヒアルロナンのレベルは、参照または正常組織のヒアルロナンレベルの決定と同時に決定してよい。あるいは、ヒアルロナン関連疾患または状態(例えば癌)を有することが疑われるまたは知られた対象からのサンプル中のヒアルロナンのレベルを、正常組織または体液で予め決定したヒアルロナンのレベルと比較してよい。それゆえに、あらゆる検出、比較、決定または評価に用いる正常または健常サンプルまたは他の参照サンプル中のヒアルロナンのレベルは、ヒト患者からのサンプル中のヒアルロナンのレベルまたは量の検出、決定または評価の前に決定されたレベルまたは量であり得る。

【0363】

ヒアルロナンのレベルまたは量を、決定および／またはスコア化し、疾患と関連するヒアルロナンの予め決定した表現型と比較する。特定の疾患、ヒアルロナンの検出に使用するアッセイおよび／または使用するＨＡＢＰ検出試薬により疾患診断の閾値レベルを決定することは当業者のレベルの範囲内である。抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置の応答性を分類するためにヒアルロナンの閾値レベルを決定することは当業者のレベルの範囲内である。処置のために対象を診断、予後診断または選択するための腫瘍サンプルまたは体液サンプルの層別化のための方法の例をここに提供する。

【0364】

ヒアルロナンの特定の変化、例えば増加または減少は使用するアッセイによることは理解される。ＥＬＩＳＡにおいて、特定の波長の吸光度またはタンパク質の量(例えば標準曲線を使用して決定)の増加または減少の倍率を対照に対して表し得る。ＲＴ−ＰＣＲのようなＰＣＲアッセイにおいて、発現レベを、標準化のような当分野で知られた方法をしようして、対照発現レベルと比較できる(例えば変化倍率として表す)。

【0365】

ここでの方法の具体例において、対象を、ヒアルロナンの量がサンプル中で上昇していると決定されたならば、抗ヒアルロナン剤での治療の候補として選択する。例えば、健常または正常対象と比較した疾患対象における上昇したまたは蓄積したヒアルロナンレベルはヒアルロナン関連疾患または状態(例えば腫瘍または癌)の指標である。ヒアルロナンは０.５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍以上上昇し得る。それゆえに、ここでの方法の例において、対象からのサンプル中のヒアルロナンの量を試験するとき、マーカーの検出は、対象からのサンプル中のＨＡの量(例えば癌性細胞、組織または体液)が、予め決定したレベルまたは量または対照サンプルと比較した決定であり得る。一例として、対象は、予定されたレベルまたは量または対照サンプルと比較して、組織、細胞または体液におけるＨＡの量が正確にまたは約０.５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍以上上昇しているならば、ヒアルロナン関連疾患または状態を有すると決定する。

【0366】

対象は、対象からのサンプル中(例えば体液または他の体液)のヒアルロナンのレベルまたは量に基づき抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での治療の候補として選択できる。０.０１０μg／mL、０.０１５μg／mLおよび一般的に０.０２μg／mL、０.０３μg／mL、０.０４μg／mL、０.０５μg／mL、０.０６μg／mLを超えるまたはそれ以上のＨＡは腫瘍または癌の存在と相関する。このような方法を使用して、ここに提供する方法の例において、対象は、血清サンプルのような体液サンプル中のＨＡの濃度が、０.０１０μg／mL、０.０１５μg／mLおよび一般的に０.０２μg／mL、０.０３μg／mL、０.０４μg／mL、０.０５μg／mL、０.０６μg／mLを超えるまたはそれ以上のＨＡレベルを含むならば、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置に選択できる。

【0367】

対象は、細胞または組織サンプル中のヒアルロナンのレベルまたは量に基づき、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での治療の候補として選択できる。このような例において、レベルが疾患を示すならば、患者をヒアルロナン関連疾患または状態を有すると診断する。例えば、腫瘍組織の免疫組織化学的方法を使用して、ＨＡ^＋２またはＨＡ^＋３のスコアは疾患の決定因であり得る。例えば、１０％を超える、例えば１０〜２５％または２５％を超えるＨＡの染色対総腫瘍面積のパーセンテージは疾患の指標である。ここでの方法において、サンプルの等級化スコアがＨＡ^＋２またはＨＡ^＋３サンプルであるならば、対象を抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置に選択する。例えば、高スコア、例えば、ＨＡ^＋３は、対象がＨＡ富腫瘍を有することを示し、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置から利益を受ける腫瘍の存在の指標であり、それゆえに抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での治療の候補である。他の例において、対象は、染色のパーセンテージに基づき、例えば、ＨＡ染色の程度が総染色面積の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上および一般的に少なくとも２５％以上であるならば、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置に選択できる。

【0368】

抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置の効果または処置に対する応答性も、経時的に対象のヒアルロナンのレベルまたは量を比較することによりモニターできる。ヒアルロナンのレベルまたは量の変化は、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置の用量またはスケジューリングの最適化に使用できる。本方法において、処置対象からのサンプルにおける、特に腫瘍組織(例えば免疫組織化学または他の類似方法で)評価したＨＡの発現レベルを予め決定したＨＡの発現レベルと比較する。ヒアルロナン分解酵素、特に長い半減期(例えばＰＥＧＰＨ２０)を有するものの投与後の処置をモニタリングする目的で、モニターするサンプルは、全身レベルの酵素が存在し得る体液ではない。

【0369】

処置モニタリングの目的で、予定されたレベルのＨＡは正常または健常対象、処置前のベースラインＨＡ値、処置後の同じ対象から前に測定した以前のＨＡレベルまたは疾患進行または緩解と関連することが知られるＨＡレベルの分類または層別化であり得る。例えば、参照または対照サンプルと比較してヒアルロナンレベルがほぼ同じまたは低い(または減少している)ならば、処置は有効である可能性があり、処置を継続もしくは中断または変更してよい。例えば、予定されたレベルのＨＡは正常または健常組織サンプルからのＨＡレベルであってよく、処置後の対象で測定したＨＡレベルが正常ＨＡレベルより高いならば、処置を再開または継続する。例えば、予定されたレベルのＨＡは処置前にベースラインＨＡ値から決定したＨＡレベルであり、処置の経過をそれに応じて決定できる。例えば、ＨＡのレベルがベースラインＨＡと同じならば、処置を継続または再開する；ＨＡのレベルがベースラインＨＡより高いならば、処置を継続または再開するまたは処置を加速または増加する(例えばヒアルロナン分解酵素投与量増加または投与量レジメンサイクルの投与スケジュールを増やすことにより)；ＨＡのレベルがベースラインＨＡより低いならば、処置を継続または再開する、終了するまたは減少または低下させる(例えばヒアルロナン分解酵素の投与量減少または投与量レジメンサイクルの投与スケジュールを減らすことにより)。さらなる例において、予定されたレベルのＨＡは、同じ対象で前の処置経過中の以前に測定において決定したＨＡレベルであり得る。例えば、ＨＡのレベルが先に測定したＨＡと同じならば、処置を継続または再開する；ＨＡのレベルが先に測定したＨＡより高いならば、処置を継続または再開するまたは処置を加速または増加する(例えばヒアルロナン分解酵素投与量増加または投与量レジメンサイクルの投与スケジュールを増やすことにより)；ＨＡのレベルが先に測定したＨＡより低いならば、処置を継続または再開する、終了するまたは減少または低下させる(例えばヒアルロナン分解酵素の投与量減少または投与量レジメンサイクルの投与スケジュールを減らすことにより)。

【0370】

モニタリング方法または処置の効果を決定する方法において、特定の治療を、個々の応答を最大化するために処置経過中に変えてよい。処置の投与およびスケジューリングを、レベル変動に応じて修飾できる。他の抗癌剤を使用する組み合わせ治療もこのような処置方法で用い得る。詳細な処置計画を決定することは処置をする医師の技術領域の範囲である。例えば、処置を、中止、減少または頻度を減らすまたは疾患または状態のための他の処置と組み合わせるように、適宜投与量、スケジュール(例えば投与頻度)またはレジメを調節するように変更できる。他方で、ヒアルロナンレベルが比較参照または対照サンプルより高いならば、患者は処置に応答していない可能性がある。このような場合、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)または組み合わせ治療の特定の性質およびタイプを修飾または改変できる。他の例において、投与、量、スケジュールおよび／またはレジメを、適宜、増加または頻度を増やすように調節できる。正確な処置経過を決定することは処置医のレベルの範囲内である。

【0371】

処置の効果をモニタリングする目的で、ヒアルロナンの予定されたレベルまたは量を経験的に決定でき、それによって該レベルまたは量は処置が有効であることを示す。これらの予め決定した値は、同じ検出アッセイで同じＨＡＢＰ試薬を使用して決定した対応する対応する正常サンプルまたは疾患対象サンプルにおけるＨＡレベルの比較または知識により決定できる。例えば、定量的スコアスキームを使用した免疫組織化学的方法で評価して、高ＨＡレベル(例えばＨＡ^＋３)または２５％を超えるヒアルロナンに対する腫瘍染色パーセンテージは、広範な癌タイプの悪性疾患の存在と相関し、患者が処置に応答していないことを示す。他の例において、血漿のような体液における０.０１５μg／mLを超えるおよび一般的に０.０２μg／mLを超える、例えば０.０３μg／mL、０.０４μg／mL、０.０５μg／mLまたは０.０６μg／mL ＨＡのＨＡレベルは進行した疾患段階と関連する。他方で、サンプルの等級化スコアが多くてもＨＡ^＋２またはＨＡ^＋３またはＨＡ染色パーセンテージが多くても２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％以下であるならば、対象は処置に応答性の可能性がある。血漿のような体液におけるＨＡレベルが多くても０.０３μg／mL、０.０２μg／mL、０.０１μg／mL以下であるならば、対象は処置に応答性の可能性がある。

【0372】

ここでの方法において、予め決定したレベルまたは対照または参照サンプルのレベルとの比較は、当業者に知られるあらゆる方法により決定できる。例えば、ヒアルロナンのレベルの参照、対照または予定されたレベルとの比較は、アッセイを実施する機器(例えばコンピュータプラットフォーム)の一部であるまたはそれと互換性があるソフトウェアプログラムまたはインテリジェンスシステムのような自動化システムにより実施できる。あるいは、この比較は、医師または他の訓練されたもしくは経験のある専門家もしくは技術者が実施できる。

【0373】

Ｅ. 選択対象の抗ヒアルロナン剤での処置
ここに提供される方法は、腫瘍担持対象の抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での処置方法を含み、ここで、対象は、腫瘍で検出されたＨＡのレベルに基づき処置について選択されている。処置方法はまた、例えば、腫瘍阻害または緩解のような処置の効果または例えば、筋骨格副作用のような処置の副作用のような、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での処置の効果を評価する方法も含む。１種以上の別の抗癌剤または抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での治療の副作用の１つ以上を処置するための１種以上の薬物との組み合わせ治療も提供される。

【0374】

１. 抗ヒアルロナン剤
抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン合成を阻害するまたはヒアルロナンを分解する薬剤を含む。ヒアルロナン分解酵素群のような抗ヒアルロナン剤は、腫瘍および癌または炎症性疾患または状態を含むヒアルロナン関連疾患または状態の処置に使用できる。例えば、ヒアルロナン代謝、分配および機能の変更によるようなＨＡ蓄積は、関節炎、免疫および炎症性障害、肺および血管疾患および癌と関連する(Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459)。このような疾患はＨＡ合成阻害またはＨＡ分解により処置できる(例えばMorohashi 2006；米国公開出願番号２０１００００３２３８および国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９／１２８９１７参照)。ある例において、細胞および組織のヒアルロナンレベルを減少させるこのような処置は、筋骨格副作用のような有害副作用と関連し得る。それゆえに、抗ヒアルロナン剤での処置は、さらにこのような副作用を寛解または減少のコルチコステロイドでの処置を含み得る。

【0375】

ａ. ヒアルロナン合成を阻害する薬剤
ＨＡは、ｈａｓ−１、ｈａｓ−２およびｈａｓ−３と命名されるＨＡシンターゼ群として同定された３種の関連する哺乳動物遺伝子の生成物である３酵素群により合成される。異なる細胞型は異なるＨＡＳ酵素群を発現し、ＨＡＳ ｍＲＮＡ発現はＨＡ生合成と相関する。腫瘍細胞におけるＨＡＳ遺伝子サイレンシングが腫瘍増殖および転移を阻害することが知られている。抗ヒアルロナン剤は、ＨＡシンターゼの発現またはレベルを阻害、減少または下方制御するあらゆる薬物を含む。このような薬物は当業者に知られているまたは同定できる。

【0376】

例えば、ＨＡＳの下方制御は、ＨＡＳをコードする１個以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズするまたは他に相互作用するオリゴヌクレオチドの提供により達成できる。例えば、ヒアルロナン合成を阻害する抗ヒアルロナン剤は、ｈａｓ遺伝子に対するアンチセンスまたはセンス分子を含む。このようなアンチセンスまたはセンス阻害は、典型的に少なくとも１個の鎖またはセグメントが開裂、分解または他に操作不能となるように、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合ベースのハイブリダイゼーションに基づく。他の例において、転写後遺伝子サイレンシング(ＰＴＧＳ)、ＲＮＡｉ、リボザイムおよびＤＮＡザイムを用いることができる。ＨＡＳ１(配列番号２１９に示す)、ＨＡＳ２(配列番号２２０に示す)またはＨＡＳ３(配列番号２２１に示す)の配列に基づきこのような構築物を産生するのは、当業者のレベルの範囲内である。アンチセンスまたはセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的核酸と１００％相補的でなくてもよいことは当分野で理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１個以上のセグメントを超えてハイブリダイズできる(例えばループ構造またはヘアピン構造)。一般的に、アンチセンスまたはセンス化合物は、標的核酸内の標的領域と少なくとも７０％配列相補性、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のように７５％〜１００％相補性である。センスまたはアンチセンス分子の例は当分野で知られる(例えばChao et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:27513-27522; Simpson et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am. J Path., 161:849; Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem., 274:21893-21899; Edward et al. (2010) British J Dermatology, 162:1224-1232; Udabage et al. (2005) Cancer Res., 65:6139；および公開米国特許出願番号ＵＳ２００７０２８６８５６参照)。

【0377】

ＨＡ合成阻害剤である抗ヒアルロナン剤の他の例は４−メチルウンベリフェロン(４−ＭＵ；７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン)またはその誘導体である。４−ＭＵは、ＨＡ合成に必要なＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ前駆体プールを減少させることにより働く。例えば、哺乳動物細胞において、ＨＡはＵＤＰ−グルクロン酸(ＵＧＡ)およびＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン前駆体を使用してＨＡＳにより合成される。４−ＭＵは、ＵＧＡが産生される工程を妨害し、それによりＵＧＡの細胞内プールを枯渇させ、ＨＡ合成阻害に至る。４−ＭＵは抗腫瘍活性を有することが知られる(例えばLokeshwar et al. (2010) Cancer Res., 70:2613-23; Nakazawa et al. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol., 57:165-170; Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459参照)。６００mg／kg／ｄでの４−ＭＵの経口投与は、Ｂ１６黒色腫モデルで転移を６４％減少させた(Yoshihara et al. (2005) FEBS Lett., 579:2722-6)。４−ＭＵの構造は下に示す。また、４−ＭＵの誘導体、特に６,７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンおよび５,７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンは抗癌活性を示す(例えばMorohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459参照)。
４−メチルウンベリフェロン(４−ＭＵ；Ｃ_１０Ｈ_８Ｏ_３)

【化1】

【0378】

さらに抗ヒアルロナン剤の例は、レフルノミド(Arava)、ゲニステインまたはエルブスタチンのようなチロシンキナーゼ阻害剤である。レフルノミドはまたピリミジン合成阻害剤でもある。レフルノミドはリウマチ性関節炎(ＲＡ)処置剤として知られ、同種移植ならびに異種移植の拒絶反応の処置にも有効である。ＨＡはＲＡに直接的または間接的に関与することが知られている(例えばStuhlmeier (2005) J Immunol., 174:7376-7382参照)。チロシンキナーゼ阻害剤はＨＡＳ１遺伝子発現を阻害する(Stuhlmeier 2005)。

【0379】

一例として、レフルノミドまたはその誘導体、一般的に１〜１００mgの活性薬物、例えば、１mg、５mg、１０mg、２０mg、３０mg、４０mg、５０mg、６０mg、７０mg、８０mg、９０mgまたは１００mgの薬物を含む錠剤として入手可能である。ヒアルロナン関連疾患および状態、例えばリウマチ性関節炎または腫瘍または癌の処置のために、それを１０〜５００mg／日、典型的に１００mg／日で投与する。疾患または状態の処置の必要に応じて投与を続けてよくまたは連続的に低投与量までテーパリングまたは減少してよい。例えば、関節リウマチの処置のために、レフルノミドを、３日間１００mg／日の処置負荷投与量で投与し、その後２０mg／日の継続投与量で投与し得る。

【0380】

ｂ. ヒアルロナン分解酵素群
ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質性バリアの主な構成物である。ヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロナン分解酵素群はヒアルロナンの粘性を下げ、それにより組織透過性を上げ、非経腸的に投与された流体の吸収速度を増加させる。このようなものとして、ヒアルロニダーゼ群のようなヒアルロナン分解酵素群は、例えば、他の薬剤、薬物およびタンパク質と共にその分散および送達を促進する展着剤または分散剤として使用される。

【0381】

ヒアルロナン分解酵素群は、交互のβ−１→４およびβ−１→３グリコシド結合を介して互いに結合している二糖類単位であるＤ−グルクロン酸(ＧｌｃＡ)およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)の反復からなるヒアルロナンポリマー類を開裂することにより、ヒアルロナンを分解するように働く。ヒヒアルロナン鎖は約２５,０００二糖反復以上の長さに達し、ヒアルロナンのポリマー類のサイズはインビボで約５,０００〜２０,０００,０００Daの範囲であり得る。従って、ここで提供する使用および方法のためのヒアルロナン分解酵素群は、ヒアルロナン二糖鎖またはポリマーの開裂を触媒する能力を有するあらゆる酵素を含む。ある例において、ヒアルロナン分解酵素はヒアルロナン鎖またはポリマーにおけるβ−１→４グリコシド結合の開裂をする。他の例において、ヒアルロナン分解酵素はヒアルロナン鎖またはポリマーにおけるβ−１→３グリコシド結合の開裂を触媒する。

【0382】

それゆえに、ヒアルロニダーゼ群のようなヒアルロナン分解酵素群は、細胞外マトリックスの必須成分であり、間質性バリアの主な構成物であるヒアルロン酸を分解する酵素群のファミリーである。間質性バリアの主構成物であるヒアルロン酸の加水分解を触媒することにより、ヒアルロナン分解酵素群はヒアルロン酸の粘性を下げ、それにより組織透過性を高める。このようなものとして、ヒアルロニダーゼ群のようなヒアルロナン分解酵素群は、例えば、他の薬剤、薬物およびタンパク質と共にその分散および送達を促進する展着剤または分散剤として使用される。ヒアルロナン分解酵素群はまた他の注射剤の吸収および分散を高めるアジュバントとして、皮下点滴療法(皮下流体投与)のためにおよび放射線不透過性剤の吸収を改善するために皮下尿路造影における補助剤としても使用される。ヒアルロナン分解酵素群、例えば、ヒアルロニダーゼは眼への適用法、例えば、眼の手術前の局所麻酔における眼球周囲およびテノン嚢下ブロックにおいて使用できる。ヒアルロニダーゼはまた、例えば、眼瞼形成術およびフェースリフトのような美容整形において無動を促進することにより、他の治療および美容的使用も有する。

【0383】

種々の形態のヒアルロニダーゼ群を含むヒアルロナン分解酵素群が製造されており、ヒトを含む対象における治療使用が承認されている。提供する組成物および方法は、これらのおよび他の治療使用を介して、ヒアルロナン関連疾患および状態を処置するために使用できる。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物は、Vitrase(ISTA Pharmaceuticals)、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ、Amphadase(Amphastar Pharmaceuticals)、ウシ精巣ヒアルロニダーゼおよびHydase(Prima Pharm Inc.)、ウシ精巣ヒアルロニダーゼを含む。あらゆる動物由来ヒアルロニダーゼ調製物をここで提供する方法および使用において使用できると理解される(例えば、米国特許番号２,４８８,５６４、２,４８８,５６５、２,６７６,１３９、２,７９５,５２９、２,８０６,８１５、２,８０８,３６２、５,７４７,０２７および５,８２７,７２１および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００５／１１８７９９参照)。Hylenex(Halozyme Therapeutics)は、ｒＨｕＰＨ２０と命名される、可溶性形態のＰＨ２０をコードする核酸を含む遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞から産生されたヒト組み換えヒアルロニダーゼでる。

【0384】

ここで提供される組成物および方法におけるヒアルロナン分解酵素群の例は、可溶性ヒアルロニダーゼ群である。ヒアルロナン分解酵素群の他の例は、ヒアルロナンを開裂する能力を有する特定のコンドロイチナーゼ群およびリアーゼ群を含むが、これらに限定されない。

【0385】

下記のとおり、ヒアルロナン分解酵素群は、膜結合型または細胞から分泌される可溶性形態で存在する。本発明の目的のために、可溶性ヒアルロナン分解酵素群は、ここでの方法、使用、組成物または組み合わせで使用するために提供される。それゆえに、ヒアルロナン分解酵素群がグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを含むおよび／または他の点で膜固定または不溶性であるならば、このようなヒアルロナン分解酵素群は、酵素を分泌型および可溶性とするためにＧＰＩアンカーの切断または欠失により、ここでは可溶性形態で提供される。それゆえに、ヒアルロナン分解酵素群は、切断型変異体、例えばＧＰＩアンカーの全てまたは一部を除去するための切断を含む。ここで提供されるヒアルロナン分解酵素群はまた、可溶性ヒアルロナン分解酵素の対立形質または種変異体または他の変異体を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素群は、アミノ酸置換、付加および／または欠失のような１個以上の変異を一次配列に含み得る。ヒアルロナン分解酵素の変異体は、一般的に変異を含まないヒアルロナン分解酵素と比較して、少なくともまたは約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す。酵素がヒアルロニダーゼ活性を変異を含まないヒアルロナン分解酵素の活性と比較して、例えば少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の活性を維持する限り、あらゆる変異が本発明の目的でヒアルロナン分解酵素に導入され得る(当分野で知られたおよびここに記載するインビトロおよび／またはインビボアッセイで測定)。

【0386】

ここに提供する方法および使用が可溶性ヒアルロニダーゼ、したがって、あらゆるヒアルロナン分解酵素の使用を記載するとき、一般的に可溶性ヒアルロナン分解酵素を使用できる。あらゆるヒアルロニダーゼをここに提供する方法および使用で使用できることは理解される(例えば、米国特許番号７,７６７,４２９および米国公開番号ＵＳ２００４０２６８４２５およびＵＳ２０１００１４３４５７参照)。

【0387】

ｉ. ヒアルロニダーゼ群
ヒアルロニダーゼ群はヒアルロナン分解酵素群の大ファミリーのメンバーである。ヒアルロニダーゼ群には哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群、細菌ヒアルロニダーゼ群およびヒル類、他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群の３種がある。このような酵素群をここに提供される組成物、組み合わせおよび方法に使用できる。

【0388】

(１) 哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群
哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.35)は、ヒアルロナンのβ−１→４グリコシド結合を四糖類および六糖類のような種々のオリゴ糖長に加水分解するｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ類である。これらの酵素群は加水分解性およびトランスグリコシダーゼ活性の両者を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸(ＣＳ)、一般的にＣ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解できる。このタイプのヒアルロニダーゼ群は、ウシ(ウシ属)(配列番号１０、１１および６４およびＢＨ５５(米国特許番号５,７４７,０２７および５,８２７,７２１)、配列番号１９０〜１９２に示す核酸分子)、ヒツジ(Ovis aries)(配列番号２６、２７、６３および６５、配列番号６６および１９３〜１９４に示す核酸分子)、スズメバチ(配列番号１２および１３)、ミツバチ(配列番号１４)、北米産スズメバチ(配列番号１５)、アシナガバチ(配列番号１６)、マウス(配列番号１７〜１９、３２)、ブタ(配列番号２０〜２１)、ラット(配列番号２２〜２４、３１)、ウサギ(配列番号２５)、オランウータン(配列番号２８)、カニクイザル(配列番号２９)、モルモット(配列番号３０)、チンパンジー(配列番号１０１)、アカゲザル(配列番号１０２)およびヒトヒアルロニダーゼ群(配列番号１〜２、３６〜３９)からのヒアルロニダーゼ群を含むが、これらに限定されない。ここで提供される組成物、組み合わせおよび方法におけるヒアルロニダーゼ群の例は、可溶性ヒアルロニダーゼ群である。

【0389】

哺乳動物ヒアルロニダーゼ群は、さらに、主に精巣抽出物で見られる中性活性のもの、および主に肝臓のような臓器で見られる酸活性のものにさらに細分できる。中性活性ヒアルロニダーゼ群は、例えば、ヒツジ(配列番号２７、６３および６５)、ウシ(配列番号１１および６４)およびヒト(配列番号１)のような種由来のＰＨ２０を含むが、これらに限定されないＰＨ２０を含む。ヒトＰＨ２０(ＳＰＡＭ１または精子表面タンパク質ＰＨ２０としても既知)は、一般的にグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを介して原形質膜に結合している。これは精子−卵付着に天然で関与し、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層への精子浸透を助ける。

【0390】

ヒトＰＨ２０(ＳＰＡＭ１とも呼ぶ)以外に、５種のヒアルロニダーゼ様遺伝子、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４およびＨＹＡＬＰ１がヒトゲノムで同定されている。ＨＹＡＬＰ１は偽遺伝子であり、ＨＹＡＬ３(配列番号３８)はあらゆる既知の基質に対して酵素活性を示さない。ＨＹＡＬ４(配列番号３９に示す前駆体ポリペプチド)はコンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対してわずかに活性を示す。ＨＹＡＬ１(配列番号３６に示す前駆体ポリペプチド)はプロトタイプ酸活性酵素であり、ＰＨ２０(配列番号１に示す前駆体ポリペプチド)はプロトタイプ中性活性酵素である。酸活性ヒアルロニダーゼ群、例えばＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２(配列番号３７に示す前駆体ポリペプチド)は、一般的に中性ｐＨ(すなわちｐＨ７)で触媒活性を欠く。例えば、ＨＹＡＬ１は、インビトロでｐＨ４.５を超えるとほとんど触媒活性を有しない(Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269)。ＨＹＡＬ２は、インビトロで極めて低比活性の酸活性酵素である。ヒアルロニダーゼ様酵素群はまた一般的にヒトＨＹＡＬ２およびヒトＰＨ２０のようなグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを介して原形質膜に結合するもの(Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5)、およびヒトＨＹＡＬ１のように一般的に溶解性であるもの(Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5)により特徴付けもできる。

【0391】

(ａ) ＰＨ２０
ＰＨ２０は、他の哺乳動物ヒアルロニダーゼ群と同様、ヒアルロン酸のβ１→４グリコシド結合を四糖類および六糖類のような種々のオリゴ糖長に加水分解するｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。これは加水分解性およびトランスグリコシダーゼ活性の両者を有し、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸、例えばＣ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解できる。ＰＨ２０は精子−卵付着に天然で関与し、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層への精子浸透を助ける。ＰＨ２０は精子表面およびリソソーム由来アクロソームに見られ、アクロソームでそれは内アクロソーム膜に結合する。原形質膜ＰＨ２０は、中性ｐＨでのみヒアルロニダーゼ活性を有するのに対し、内アクロソーム膜ＰＨ２０は、中性および酸ｐＨのいずれでも活性を有する。ヒアルロニダーゼである以外に、ＰＨ２０はまたＨＡ誘発細胞シグナリングの受容体、および卵母細胞を囲む透明帯の受容体であると報告されている。

【0392】

ＰＨ２０タンパク質類の例は、ヒト(配列番号１に示す前駆体ポリペプチド、配列番号２に示す成熟ポリペプチド)、チンパンジー(配列番号１０１)、アカゲザル(配列番号１０２) ウシ(配列番号１１および６４)、ウサギ(配列番号２５)、ヒツジＰＨ２０(配列番号２７、６３および６５)、カニクイザル(配列番号２９)、モルモット(配列番号３０)、ラット(配列番号３１)およびマウス(配列番号３２)ＰＨ２０ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

【0393】

ウシＰＨ２０は５５３アミノ酸前駆体ポリペプチド(配列番号１１)である。ウシＰＨ２０とヒトＰＨ２０のアラインメントはわずかな相同性しか示さず、ウシポリペプチドにおけるＧＰＩアンカーの不存在により、アミノ酸４７０から各カルボキシ末端まで複数ギャップが存在する(例えば、Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440参照)。実際、明らかなＧＰＩアンカーはヒト以外の多くの他のＰＨ２０種で予測されない。それそれゆえに、ヒツジおよびウシから産生されたＰＨ２０ポリペプチド類は、本来可溶性形態として存在する。ウシＰＨ２０は原形質膜への極めて緩い結合で存在するが、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して固定されていない(Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36)。ウシヒアルロニダーゼのこの独特な特徴は臨床使用のための抽出物としての可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素の使用を可能にする(Wydase(登録商標)、Hyalase(登録商標))。

【0394】

ヒトＰＨ２０ｍＲＮＡ転写物は通常翻訳されて、Ｎ末端に３５アミノ酸シグナル配列(アミノ酸残基１〜３５位)およびＣ末端に１９アミノ酸グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカー付着シグナル配列(アミノ酸残基４９１〜５０９位)を含む５０９アミノ酸前駆体ポリペプチド(配列番号１)を生じる。成熟ＰＨ２０は、それそれゆえに、配列番号２に示す４７４アミノ酸ポリペプチドである。ＥＲの前駆体ポリペプチドへの輸送およびシグナルペプチドの除去に続き、Ｃ末端ＧＰＩ付着シグナルペプチドは開裂され、ＧＰＩアンカーの配列番号１に示す前駆体ポリペプチドの４９０位に対応するアミノ酸位置に新たに形成されたＣ末端アミノ酸との共有結合が促進される。それそれゆえに、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する４７４アミノ酸ＧＰＩアンカー型成熟ポリペプチドが産生される。

【0395】

ヒトＰＨ２０は中性および酸ｐＨでヒアルロニダーゼ活性を示す。一つの面において、ヒトＰＨ２０は、一般的にＧＰＩアンカーを介して原形質膜に固定されているプロトタイプ中性活性ヒアルロニダーゼである。他の面において、ＰＨ２０は、内アクロソーム膜上に発現され、そこで、中性および酸ｐＨでヒアルロニダーゼ活性を有する。ＰＨ２０は、ポリペプチドのペプチド１およびペプチド３領域の２カ所の領域に二つの触媒部位を含む(Cherr et al., (2001)Matrix Biology 20:515-525)。配列番号２に示す成熟ポリペプチドのアミノ酸１０７〜１３７位に対応するＰＨ２０のペプチド１領域および配列番号１に示す前駆体ポリペプチドの１４２〜１７２位が、中性ｐＨでの酵素活性に必要である証拠がある。この領域内の１１１位および１１３位のアミノ酸(配列番号２に示す成熟ＰＨ２０ポリペプチドに対応)が、アミノ酸置換による変異原性が、それぞれ野生型ＰＨ２０と比較してＰＨ２０ポリペプチド類の３％ヒアルロニダーゼ活性および検出不能なヒアルロニダーゼ活性を生じるために、活性に必須であると報告されている(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。

【0396】

配列番号２に示す成熟ポリペプチドのアミノ酸２４２〜２６２位に対応するペプチド３領域、および配列番号１に示す前駆体ポリペプチドの２７７〜２９７位は、酸性ｐＨでの酵素活性に重要であると報告されている。この領域内で、成熟ＰＨ２０ポリペプチドの２４９位および２５２位のアミノ酸は活性に必須であり、このいずれかの変異原性は、本質的に活性を欠くポリペプチドとなると報告されている(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。

【0397】

触媒部位に加えて、ＰＨ２０またはヒアルロナン結合部位を含む。実験的証拠は、この部位が配列番号１に示す前駆体ポリペプチドのアミノ酸２０５〜２３５位および配列番号２に示す成熟ポリペプチドの１７０〜２００位に対応するペプチド２領域に位置することを示す。この領域はヒアルロニダーゼ群で高度に保存され、ヘパリン結合モチーフと類似する。アルギニン残基１７６位(配列番号２に示す成熟ＰＨ２０ポリペプチドに対応)のグリシンへの変異は、野生型ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の約１％しか活性がないポリペプチドとなる(Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814)。

【0398】

ヒトＰＨ２０において配列番号１に例示するポリペプチドのＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３、Ｎ４９０に、７カ所の潜在的Ｎ架橋グリコシル化部位を含むグリコシル化部位がある。配列番号１のアミノ酸３６〜４６４が活性が最小のヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼドメインを含むように見えるため、グリコシル化部位Ｓ−４９０は適切なヒアルロニダーゼ活性に必須ではない。ヒトＰＨ２０において６個のジスルフィド結合があると報告されている。配列番号１に例示するポリペプチドのシステイン残基Ｃ６０とＣ３５１およびＣ２２４とＣ２３８の間の２個のジスルフィド結合(それぞれ配列番号２に示す成熟ポリペプチドの残基Ｃ２５とＣ３１６、およびＣ１８９とＣ２０３に対応)がある。さらに４カ所のジスルフィド結合が配列番号１に例示するポリペプチドのシステイン残基Ｃ３７６とＣ３８７；Ｃ３８１とＣ４３５；Ｃ４３７とＣ４４３；Ｃ４５８とＣ４６４(それぞれ配列番号２に示す成熟ポリペプチドの残基Ｃ３４１とＣ３５２；Ｃ３４６とＣ４００；Ｃ４０２とＣ４０８；およびＣ４２３とＣ４２９に対応)に形成される。

【0399】

(２) その他のヒアルロニダーゼ群
細菌ヒアルロニダーゼ群(EC 4.2.2.1またはEC 4.2.99.1)はヒアルロナン、および種々の程度で、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸を分解する。細菌から単離されたヒアルロナンリアーゼ群は、作用機序がヒアルロニダーゼ群と異なる(他の起源由来、例えば、ヒアルロノグルコサミニダーゼ群、EC 3.2.1.35)。ヒアルロナンのＮ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸残基の間のβ１→４−グリコシド結合の加水分解ではなく、脱離反応を触媒するｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ類であり、３−(４−デオキシ−β−Ｄ−グルコ−４−エヌロノシル)−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンテトラ−および六糖類、および二糖最終産物を生じる。反応は、非還元末端に不飽和ヘキスロン酸残基を伴うオリゴ糖類の形成を生じる。

【0400】

ここで提供される組成物、組み合わせおよび方法で使用するための細菌由来のヒアルロニダーゼ群の例は、アルスロバクター属、デロビブリオ属、クロストリジウム属、ミクロコッカス属、レンサ球菌属、ペプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属、バクテロイデス属、およびストレプトマイセス属の株を含む微生物におけるヒアルロナン分解酵素群を含むが、これらに限定されない。このような酵素群の具体例は、アルスロバクター属(株FB24)(配列番号６７)、ブデロビブリオ・バクテリオヴォルス(配列番号６８)、プロピオニバクテリウム・アクネス(配列番号６９)、ストレプトコッカス・アガラクチア((配列番号７０)；18RS21(配列番号７１)；血清型Ｉａ(配列番号７２)；血清型III(配列番号７３))、黄色ブドウ球菌(株ＣＯＬ)(配列番号７４)；株MRSA252(配列番号７５および７６)；株MSSA476(配列番号７７)；株NCTC 8325(配列番号７８)；株ウシRF122(配列番号７９および８０)；株USA300(配列番号８１)、肺炎レンサ球菌((配列番号８２)；株ATCC BAA-255/R6(配列番号８３)；血清型２、株D39/NCTC 7466(配列番号８４)、Ａ群溶血レンサ球菌(血清型Ｍ１)(配列番号８５)；血清型Ｍ２、株MGAS10270(配列番号８６)；血清型Ｍ４、株MGAS10750(配列番号８７)；血清型Ｍ６(配列番号８８)；血清型Ｍ１２、株MGAS2096(配列番号８９および９０)；血清型Ｍ１２、株MGAS9429(配列番号９１)；血清型Ｍ２８(配列番号９２)；豚レンサ球菌(配列番号９３〜９５)；ビブリオ・フィッシェリ(株ATCC 700601/ES114(配列番号９６))、およびヒアルロン酸に特異的であり、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を開裂しないストレプトマイセス・ヒアルロノリチクスヒアルロニダーゼ酵素を含むが、これらに限定されない(Ohya, T. and Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607)。ヒル類、他の寄生虫、および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ群(EC 3.2.1.36)は、四糖類および六糖類最終産物を生じるｅｎｄｏ−β−グルクロニダーゼ群である。これらの酵素群は、ヒアルロナートのβ−Ｄ−グルクロネートとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の間の１→３−架橋の加水分解を触媒する。ヒル類由来のヒアルロニダーゼ群は、例えば、Hirudinidae(例えば、ドイツ蛭)、イシビル科(例えば、Nephelopsis obscuraおよびErpobdella punctata)、Glossiphoniidae(例えば、Desserobdella picta、Helobdella stagnalis、Glossiphonia complanata、Placobdella ornateおよびテロミゾン属)およびヘモピ科(Haemopis marmorata)を含むが、これらに限定されない(Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B BiochemMol Biol. 124(3):319-26)ヒアルロニダーゼである。ヒルヒアルロニダーゼと同じ作用機序を有する細菌由来のヒアルロニダーゼの例は、シアノバクテリア、シネココックス属(株RCC307、配列番号９７)由来のものである。

【0401】

(３) その他のヒアルロナン分解酵素群
ヒアルロニダーゼファミリーに加えて、他のヒアルロナン分解酵素群をここで提供する組成物、組み合わせおよび方法において使用できる。例えば、ヒアルロナンを開裂する能力を有する特定のコンドロイチナーゼ群およびリアーゼ群を含む酵素群を用いることができる。ヒアルロナンを分解できるコンドロイチナーゼ群は、例えば、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ(コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られる)、コンドロイチンＡＣリアーゼ(コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られる)およびコンドロイチンＣリアーゼを含むが、これらに限定されない。このような酵素群のここに提供する組成物、組み合わせおよび方法において使用するための産生および精製方法は知られている(例えば、米国特許６,０５４,５６９；Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535;Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160(30):1849-1857)。

【0402】

コンドロイチンＡＢＣリアーゼは、２種の酵素群、コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ(EC 4.2.2.20)およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ(EC 4.2.2.21)(Hamai et al. (1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30)を含み、コンドロイチン−硫酸−およびデルマタン−硫酸タイプの種々のグリコサミノグリカン類を分解する。コンドロイチン硫酸、コンドロイチン−硫酸プロテオグリカンおよびデルマタン硫酸はコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼの好ましい基質であるが、本酵素はまたヒアルロナン上で低速で作用する。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼはコンドロイチン−硫酸−およびデルマタン−硫酸型の種々のグリコサミノグリカン類を分解し、種々のサイズのΔ４−不飽和オリゴ糖類の混合物を生じ、それは最終的にΔ４−不飽和四糖類および二糖類に分解される。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼは、類似の基質特異性を有するが、重合体コンドロイチン硫酸およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼにより産生されるそのオリゴ糖フラグメントの両方の非還元末端から二糖残基を事除去する(Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130)。コンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼ群およびコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエキソリアーゼ群は、例えばプロテウス・ブルガリスおよびペドバクター・ヘパリナス(プロテウス・ブルガリスコンドロイチン−硫酸−ＡＢＣエンドリアーゼは配列番号９８に示す)を含むが、これらに限定されない(Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)。

【0403】

コンドロイチンＡＣリアーゼ(EC 4.2.2.5)は、コンドロイチン硫酸ＡおよびＣ、コンドロイチンおよびヒアルロン酸に活性であるが、デルマタン硫酸(コンドロイチン硫酸Ｂ)に活性ではない。細菌由来のコンドロイチナーゼＡＣ酵素群は、例えば、それぞれ配列番号９９および１００に示すペドバクター・ヘパリナスおよびビクチバリス・バデンシスおよびアルスロバクタ・オウレセンス由来のものを含むが、これらに限定されない(Tkalec et al. (2000) Applied and EnvironmentalMicrobiology 66(1):29-35;Ernst et al. (1995) Critical Reviews in BiochemistryおよびMolecular Biology 30(5):387-444)。

【0404】

コンドロイチナーゼＣはコンドロイチン硫酸Ｃを分解し、四糖と不飽和６−硫酸化二糖(デルタジ−６Ｓ)を産生する。それはまたヒアルロン酸を開裂し、不飽和非硫酸化二糖(デルタジ−ＯＳ)を産生する。細菌由来のコンドロイチナーゼＣ酵素群は、例えば、レンサ球菌およびフラボバクテリウム由来のものを含むが、これらに限定されない(Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4;Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8;Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133)。

【0405】

ii. 可溶性ヒアルロナン分解酵素群
ここでの組成物、組み合わせおよび方法で提供されるのは、可溶性ヒアルロニダーゼ群を含む可溶性ヒアルロナン分解酵素群である。可溶性ヒアルロナン分解酵素群は、発現により細胞(例えばＣＨＯ細胞)から分泌され、可溶性形態で存在するあらゆるヒアルロナン分解酵素群を含む。このような酵素群は、非ヒト動物可溶性ヒアルロニダーゼ群、細菌可溶性ヒアルロニダーゼ群およびヒトヒアルロニダーゼ群、Ｈｙａｌ１、ウシＰＨ２０およびヒツジＰＨ２０、対立形質その変異体および他のその変異体を含む、非ヒト可溶性ヒアルロニダーゼ群を含む、可溶性ヒアルロニダーゼ群を含む。例えば、可溶性ヒアルロナン分解酵素群に包含されるのは、可溶性であるように修飾されているあらゆるヒアルロナン分解酵素群である。例えば、ＧＰＩアンカーを含むヒアルロナン分解酵素群は、ＧＰＩアンカーの全てまたは一部の切断および除去により可溶性にできる。一例として、通常ＧＰＩアンカーを介する膜アンカー型であるヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０を、Ｃ末端のＧＰＩアンカーの全てまたは一部の短縮化および除去により溶解性にできる。

【0406】

可溶性ヒアルロナン分解酵素群はまた中性活性および酸活性ヒアルロニダーゼ群を含む。投与後の所望の酵素の活性レベルおよび／または投与部位を含むが、これらに限定されない因子によって、中性活性および酸活性ヒアルロニダーゼ群を選択できる。特定の例において、ここでの組成物、組み合わせおよび方法で使用するヒアルロナン分解酵素は可溶性中性活性ヒアルロニダーゼである。

【0407】

可溶性ヒアルロニダーゼの例は、ヒアルロニダーゼが可溶性(発現により分泌)であり、ヒアルロニダーゼ活性を維持する限り、あらゆる種由来のＰＨ２０、例えば配列番号１、２、１１、２５、２７、２９〜３２、６３〜６５および１０１〜１０２に示すいずれか、またはＣ末端ＧＰＩアンカーの全てまたは一部を欠くその切断型形態である。また可溶性ヒアルロニダーゼ群に包含されるのは、配列番号１、２、１１、２５、２７、２９〜３２、６３〜６５および１０１〜１０２のいずれかの対立形質変異体または他の変異体またはその切断型である。対立形質変異体および他の変異体は当業者に知られており、配列番号１、２、１１、２５、２７、２９〜３２、６３〜６５および１０１〜１０２のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドまたはその切断型を含む。アミノ酸変異体ｉｎｃｌｕｄｅ 保存的および非保存的変異。アミノ酸変異体は保存的および非保存的変異を含む。重要であるか、他の点でヒアルロニダーゼの活性に必要である残基、例えば上記のまたは当業者に知られたいずれかは、一般的に不変であり、変化できないことは理解されよう。これらは、例えば、活性部位残基を含む。それそれゆえに、例えば、ヒトＰＨ２０ポリペプチド、またはその可溶性形態のアミノ酸残基１１１、１１３および１７６(配列番号２に示す成熟ＰＨ２０ポリペプチドの残基に対応)は一般的に不変であり、変えられない。グリコシル化および適切な折りたたみに必要なジスルフィド結合形成に関与する他の残基も不変であり得る。

【0408】

ある例においては、可溶性ヒアルロナン分解酵素は通常ＧＰＩ固定(例えば、ヒトＰＨ２０のような)であり、Ｃ末端での切断により可溶性となる。このような切断はＧＰＩアンカー付着シグナル配列の全ての除去またはＧＰＩアンカー付着シグナル配列の一部のみの除去であり得る。得られたポリペプチドは、しかしながら、可溶性である。可溶性ヒアルロナン分解酵素がＧＰＩアンカー付着シグナル配列の一部を保持する例において、ポリペプチドが可溶性である限り、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個以上のアミノ酸残基を残し得る。ＧＰＩアンカーの１個以上のアミノ酸を残すポリペプチドは、拡大可溶性ヒアルロナン分解酵素群と呼ぶ。当業者は、当分野で周知の方法を使用して、ポリペプチドがＧＰＩ固定であるか否かを決定できる。このような方法は、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列およびω−部位の存在および位置を予測するためのアルゴリズムの使用およびホスファチジルイノシトール−特異的ホスホリパーゼＣ(ＰＩ−ＰＬＣ)またはＤ(ＰＩ−ＰＬＤ)での消化前および後の溶解度分析の実施を含むが、これらに限定されない。

【0409】

拡大可溶性ヒアルロナン分解酵素群は、得られたポリペプチドが可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の１個以上のアミノ酸残基を含むように、あらゆる天然のＧＰＩ固定ヒアルロナン分解酵素をＣ末端切断することにより製造できる(例えば、米国公開特許出願番号ＵＳ２０１００１４３４５７参照)。Ｃ末端切断されているが、ＧＰＩアンカー付着シグナル配列の一部を含む拡大可溶性ヒアルロナン分解酵素群の例は、例えば、ヒトおよびチンパンジーｅｓＰＨ２０ポリペプチドのような霊長類起源の拡大可溶性ＰＨ２０(ｅｓＰＨ２０)ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。例えば、ｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１、２または１０１に示す成熟または前駆体ポリペプチドのいずれかまたはその活性フラグメントを含むその対立形質または他の変異のＣ末端切断により製造でき、ここで、得られたポリペプチドは可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の１個以上のアミノ酸残基を保持する。対立形質変異体および他の変異体は当業者に知られており、配列番号１または２のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ここで提供するｅｓＰＨ２０ポリペプチドは、得られたｅｓＰＨ２０ポリペプチドは可溶性であり、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列からの１個以上のアミノ酸残基を保持する限り、配列番号１、２または１０１に示す配列を有するポリペプチドのような野生型ポリペプチドと比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のアミノ酸のＣ末端切断型であり得る。

【0410】

典型的に、ここでの組成物、組み合わせおよび方法において使用するために、可溶性ヒトＰＨ２０のような可溶性ヒトヒアルロナン分解酵素を使用する。他の動物からのＰＨ２０のようなヒアルロナン分解酵素群を使用できるが、このような調製物は、動物タンパク質であるために潜在的に免疫原性である。例えば、相当な割合の患者が摂取食物に二次的な事前感作を示し、これらが動物タンパク質であるために、全患者に事後感作の危険性がある。それゆえに、非ヒト調製物は慢性使用に適切ではない可能性がある。非ヒト調製物が望まれるならば、このようなポリペプチドを低免疫原性となるように製造できることがここでは意図される。このような修飾は当業者のレベルの範囲内であり、例えば、分子上の１個以上の抗原性エピトープの除去および／または置換を含み得る。

【0411】

ここでの方法において使用するヒアルロニダーゼ群を含むヒアルロナン分解酵素群(例えば、ＰＨ２０)は組み換えにより産生できまたは例えば、精巣抽出物のような天然起源からの精製または一部精製であり得る。組み換えヒアルロナン分解酵素群を含む組み換えタンパク質の産生方法は本明細書のいずれかの場所に提供し、当分野で周知である。

【0412】

(１) 可溶性ヒトＰＨ２０
可溶性ヒアルロニダーゼの例は可溶性ヒトＰＨ２０である。可溶性形態の組み換えヒトＰＨ２０は産生されており、ここに記載する組成物、組み合わせおよび方法において使用できる。このような可溶性形態のＰＨ２０の産生は、米国公開特許出願番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６、ＵＳ２００６０１０４９６８、ＵＳ２０１００１４３４５７および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９１１１０６６に記載されている。例えば、配列番号１におけるアミノ酸の配列を有するまたは配列番号１におけるアミノ酸の配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％、９８％配列同一性を有するＣ末端切断型変異体ポリペプチドを含む可溶性ＰＨ２０ポリペプチドはヒアルロニダーゼ活性を維持し、可溶性である。これらのポリペプチドに包含されるのは、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の全てまたは一部を完全に欠く可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。

【0413】

また包含されるのは、ＧＰＩアンカーの少なくとも１個のアミノ酸を保持する拡大可溶性ＰＨ２０(ｅｓＰＨ２０)ポリペプチドである。それゆえに、ＥＲにおいてタンパク質のＣ末端と共有結合的に結合したＧＰＩアンカーを有し、原形質膜の細胞外小葉に固定されている代わりに、これらのポリペプチドは分泌型および可溶性である。Ｃ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号１または２に示す配列を有する完全長野生型ポリペプチドまたはその対立形質または種変異体または他の変異体のような完全長野生型ポリペプチドと比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個以上のアミノ酸がＣ末端切断されていてよい。

【0414】

例えば、可溶性形態は、配列番号１に示すアミノ酸の配列のＣ末端アミノ酸残基４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を有する配列番号１に示すヒトＰＨ２０のＣ末端切断型ポリペプチドまたはそれと少なくとも８５％同一性を示すポリペプチドである。可溶性形態のヒトＰＨ２０は、一般的に配列番号１に示すアミノ酸３６〜４６４を含むものを含む。例えば、哺乳動物細胞において発現されたとき、３５アミノ酸Ｎ末端シグナル配列は、処理中に開裂され、成熟形態のタンパク質は分泌される。それゆえに、成熟可溶性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３６〜４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２および４８３を含む。表３は、Ｃ末端切断型可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを含むＣ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチドの例の非限定的例を提供する。下記表３において、Ｃ末端切断型ＰＨ２０タンパク質の前駆体および成熟ポリペプチドのアミノ酸配列の例を示す、前駆体および成熟ポリペプチドの長さ(アミノ酸の)および配列識別子(配列番号)を提供する。野生型ＰＨ２０ポリペプチドもまた比較のために表３に包含させる。特に、可溶性ヒアルロニダーゼ群の例は、配列番号４〜９に示すいずれかのような４４２、４４３、４４４、４４５、４４６または４４７アミノ酸長の可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドまたはその対立形質または種変異体または他の変異体である。

【0415】

【表3】

【0416】

例えば、細胞から分泌され、可溶性であるヒアルロニダーゼ活性を示すＣ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチドの例は、表３に示す成熟形態の切断型ヒトＰＨ２０のいずれかまたはヒアルロニダーゼ活性を示すその変異体を含む。例えば、ＰＨ２０またはその切断型は、配列番号４〜９、４７、４８、１５０〜１７０および１８３〜１８９のいずれかに示すアミノ酸の配列または配列番号４〜９、４７、４８、１５０〜１７０および１８３〜１８９のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。例えば、ＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号４〜９、４７、４８、１５０〜１７０および１８３〜１８９のいずれかと少なくとも８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示し得る。

【0417】

一般的に可溶性形態のＰＨ２０は、グリコシル化がヒアルロニダーゼ群の触媒的活性および安定性に重要であるため、ポリペプチドが活性を保持することを確実にするために正確なＮ−グリコシル化を促進するタンパク質発現系を使用して産生する。このような細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(例えばＤＧ４４ ＣＨＯ細胞)を含む。

【0418】

(２) ｒＨｕＰＨ２０
組み換え可溶性形態のヒトＰＨ２０が産生されており、ここに提供される組成物、組み合わせおよび方法において使用できる。このような可溶性形態の組み換えヒトＰＨ２０の産生は、例えば、米国公開特許出願番号ＵＳ２００４０２６８４２５；ＵＳ２００５０２６０１８６；ＵＳ２００６０１０４９６８；ＵＳ２０１００１４３４５７；および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９１１１０６６に記載されている。このようなポリペプチドの例は、アミノ酸１〜４８２(配列番号３に示す)をコードする核酸分子の発現により産生する。このような核酸分子の例を配列番号４９に示す。翻訳後処理は３５アミノ酸シグナル配列を除き、４４７アミノ酸可溶性組み換えヒトＰＨ２０(配列番号４)をもたらす。培養培地で産生されるため、ｒＨｕＰＨ２０と命名された生成物が種々の量で配列番号４〜９のいずれか１種以上を含み得る種の混合物を含むように、Ｃ末端に不均一性がある。典型的に、ｒＨｕＰＨ２０は、活性を維持するための正確なＮ−グリコシル化を促進する細胞、例えばＣＨＯ細胞(例えばＤＧ４４ ＣＨＯ細胞)で産生される。

【0419】

iii. ヒアルロナン分解酵素群のグリコシル化
ヒアルロニダーゼ群を含むいくつかのヒアルロナン分解酵素群の、Ｎ−およびＯ架橋グリコシル化を含むグリコシル化は、その触媒活性および安定性に重要である。糖タンパク質を修飾するグリカンのタイプの変更はタンパク質の抗原性、構造的折りたたみ、溶解性、および安定性に大きな影響を与え得るが、ほとんどの酵素群は、最適酵素活性のためにグリコシル化は不要であると考えられている。あるヒアルロニダーゼ群について、Ｎ架橋グリコシル化の除去は、ヒアルロニダーゼ活性をほぼ完全に不活化する。それそれゆえに、このようなヒアルロニダーゼ群にとって、Ｎ架橋グリカン類の存在は活性酵素産生に重要である。

【0420】

Ｎ架橋オリゴ糖類は大きく数種(オリゴマンノース、複合体、ハイブリッド、硫酸化)に分けられ、その全てが、−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−配列(ここで、ＸａａはＰｒｏではない)に入るＡｓｎ残基のアミド窒素を介して結合した(Ｍａｎ)_３−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−コアを有する。−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−部位でのグリコシル化は、凝固タンパク質Ｃについて報告されている。ある例において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼはＮ−グリコシド架橋およびＯ−グリコシド架橋の両者を含み得る。例えば、ＰＨ２０はＯ架橋オリゴ糖類ならびにＮ架橋オリゴ糖類を含む。配列番号１に例示するヒトＰＨ２０のＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３、Ｎ４９０に７カ所の潜在的Ｎ架橋グリコシル化部位がある。アミノ酸残基Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４は、複合体型グリカンで占拠され、アミノ酸残基Ｎ３６８およびＮ３９３は高マンノース型グリカンで占拠されている。アミノ酸残基Ｎ２３５は約８０％高マンノース型グリカンおよび２０％複合体型グリカンで占拠されている。上記のとおり、Ｎ４９０でのＮ架橋グリコシル化はヒアルロニダーゼ活性に必須ではない。

【0421】

いくつかの例において、ここで提供される組成物、組み合わせおよび／または方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素群グリコシル化は、グリコシル化部位の１カ所または全てでグリコシル化されている。例えば、ヒトＰＨ２０、またはその可溶性形態について、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、およびＮ３９３に対応する２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、または６箇所のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。数例において、ヒアルロナン分解酵素群は、１箇所以上の天然グリコシル化部位でグリコシル化される。他の例において、ヒアルロナン分解酵素群は、１箇所以上の付加的部位でポリペプチドのグリコシル化を付与するために１箇所以上の非天然グリコシル化部位で修飾される。このような例において、付加的糖分子の付着は、分子の薬物動態学的特性を亢進でき、例えば半減期を改善し、／または活性を改善する。

【0422】

他の例において、ここで提供される組成物、組み合わせおよび／または方法において使用するためのヒアルロナン分解酵素群は、部分的脱グリコシル化(または一部Ｎ−グリコシル化されたポリペプチド)されている。例えば、完全にグリコシル化されたヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性の全てまたは一部を保持する部分的脱グリコシル化可溶性ＰＨ２０ポリペプチドを、ここに提供される組成物、組み合わせおよび／または方法において使用できる。部分的脱グリコシル化ヒアルロニダーゼ類の例は、配列番号１、２、１１、２５、２７、２９〜３２、６３、６５および１０１〜１０２に示すいずれかまたはその対立形質変異体、切断型変異体または他の変異体のような、あらゆる種由来の可溶性形態の部分的脱グリコシル化ＰＨ２０ポリペプチドを含む。このような変異体は当業者に知られており、配列番号１、２、１１、２５、２７、２９〜３２、６３、６５および１０１〜１０２のいずれいかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドまたはその切断型を含む。ここで提供する部分的脱グリコシル化ヒアルロニダーゼ群はまたハイブリッド、融合およびキメラ部分的脱グリコシル化ヒアルロニダーゼ群および部分的脱グリコシル化ヒアルロニダーゼコンジュゲートを含む。

【0423】

グリコシダーゼ群、またはグリコシドヒドロラーゼ群は、２個の小さな糖類を産生するためにグリコシド結合の加水分解を触媒する酵素群である。Ｎ−グリカン類の主なタイプは高マンノースグリカン、ハイブリッドグリカンおよび複合体グリカンを含む。部分的タンパク質脱グリコシル化しか生じない数種のグリコシダーゼ群は以下のものを含む。高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ１；二分岐複合体型グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ２；二分岐およびさらに分岐した複合体グリカンを開裂するＥｎｄｏＦ３；および高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを開裂するＥｎｄｏＨ。これらのグリコシダーゼ群の１個または全てでの可溶性ＰＨ２０のような可溶性ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素での処理は、一部しか脱グリコシル化されていない、それゆえに、ヒアルロニダーゼ活性の保持をもたらし得る。

【0424】

部分的脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素群、例えば部分的脱グリコシル化可溶性ヒアルロニダーゼ群を、１種以上のグリコシダーゼ群、一般的に全てのＮ−グリカンを除去せず、タンパク質を部分的脱グリコシル化するグリコシダーゼで消化させることにより製造できる。例えば、ＰＨ２０(例えばｒＨｕＰＨ２０と命名した組み換えＰＨ２０)の上記グリコシダーゼ群の１個または全て(例えばＥｎｄｏＦ１、ＥｎｄｏＦ２および／またはＥｎｄｏＦ３)での処理は部分的脱グリコシル化をもたらす。これらの部分的脱グリコシル化ＰＨ２０ポリペプチドは、完全グリコシル化ポリペプチドと同等なヒアルロニダーゼ酵素活性を示すことができる。対照的に、ＰＨ２０を、全Ｎ−グリカン類を開裂するグリコシダーゼであるＰＮＧａｓｅＦで処置すると、全Ｎ−グリカン類の完全な除去がもたらされ、それによりＰＨ２０酵素が不活性となる。それゆえに、全Ｎ−結合グリコシル化部位(例えば、配列番号１に例示するヒトＰＨ２０のアミノ酸Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８およびＮ３９３のような)はグリコシル化できるが、１種以上のグリコシダーゼ群処理はグリコシル化程度を、１種以上のグリコシダーゼ群で消化していないヒアルロニダーゼと比較して、減少させ得る。

【0425】

部分的脱グリコシル化可溶性ＰＨ２０ポリペプチド類を含む部分的脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素群は、完全グリコシル化ポリペプチドのグリコシル化レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を有し得る。一例において、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、およびＮ３９３に対応する１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所または６箇所のＮ−グリコシル化部位は、高マンノースまたは複合体型グリカンをもはや含まないが、少なくとも１個のＮ−アセチルグルコサミン部分を含むように、部分的脱グリコシル化される。数例において、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６およびＮ２５４に対応するＮ−グリコシル化部位の１箇所、２箇所または３箇所が脱グリコシル化され、すなわち、それは糖部分を含まない。他の例において、配列番号１のアミノ酸類Ｎ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、およびＮ３９３に対応する３箇所、４箇所、５箇所、または６箇所のＮ−グリコシル化部位がグリコシル化される。グリコシル化アミノ酸残基はＮ−アセチルグルコサミン部分を最小限含む。典型的に、部分的脱グリコシル化可溶性ＰＨ２０ポリペプチド類を含む部分的脱グリコシル化ヒアルロナン分解酵素群は、完全グリコシル化ポリペプチドのヒアルロニダーゼ活性の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ以上であるヒアルロニダーゼ活性を示す。

【0426】

iv. 修飾(ポリマー結合型)ヒアルロナン分解酵素群
一例として、提供される組成物および組み合わせは、典型的に、ヒアルロナン分解酵素の半減期を延長するために、例えば、対象における長期の／十分な処置効果を促進するために、１個以上の重合体分子(ポリマー)への結合により修飾されているヒアルロナン分解酵素群、特に可溶性ヒアルロニダーゼ群を含む。

【0427】

ポリエチレングリコール(ペグ化部分(ＰＥＧ))のような重合体分子のヒアルロニダーゼ群のようなヒアルロナン分解酵素群への共有結合または他の安定な付着(結合)は、得られたヒアルロナン分解酵素−ポリマー組成物に有益な特性を付与する。このような特性は、改善された生体適合性、対象内の血液、細胞および／または他の組織におけるタンパク質(および酵素活性)半減期延長、プロテアーゼ群および加水分解からのタンパク質の有効な遮蔽、改善された体内分布、薬物動態および／または薬力学亢進および水溶解度増加を含む。

【0428】

それゆえに、ここでの具体例において、ヒアルロナン分解酵素をポリマーと結合する。ポリマーの例は、ポリオール類(すなわちポリ−ＯＨ)、ポリアミン類(すなわちポリ−ＮＨ_２)およびポリカルボキシル酸類(すなわちポリ−ＣＯＯＨ)のような重合分子およびさらにヘテロポリマー、すなわち１個以上の異なるカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマー類である。適切な重合体分子の例は、ポリプロピレングリコール類(ＰＥＧ)、メトキシポリエチレングリコール類(ｍＰＥＧ)およびポリプロピレングリコール類を含むポリアルキレングリコール類(ＰＡＧ)のようなポリアルキレンオキシド類(ＰＡＯ)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル類(Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ)、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(Ｃジ−ＰＥＧ)分枝ポリエチレングリコール類(ＰＥＧｓ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート類、ポリビニルピロリドン、ポリ−Ｄ,Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチル−デキストラン類を含むデキストラン類、ヘパリン、相同アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースカルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース類、キトサンの加水分解産物、ヒドロキシエチル−デンプン類およびヒドロキシプロピル−デンプン類のようなデンプン類、グリコーゲン、アガロース類およびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物および生体高分子から選択される重合体分子を含む。

【0429】

特に、ポリマーはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)である。ヒアルロニダーゼ群を含むヒアルロナン分解酵素群への付着に適切な重合体分子は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびメトキシ−ポリエチレングリコール類(ｍＰＥＧ)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル類(Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ)、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(Ｃジ−ＰＥＧ)、分枝ＰＥＧｓのようなＰＥＧ誘導体およびポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)を含むが、これらに限定されない(例えばRoberts et al., Advanced Drug Delivery Review (2002) 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, (2003) Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221; and Tsubery, (2004) J Biol. Chem 279(37):38118-24参照)。重合体分子は、典型的に約３kDa〜約６０kDaの範囲の分子量であり得る。ある態様において、ｒＨｕＰＨ２０のようなタンパク質に結合している重合体分子は、５kDa、１０kDa、１５kDa、２０kDa、２５kDa、３０kDa、３５kDa、４０kDa、４５kDa、５０kDa、５５kDa、６０kDaまたは６０kDaを超える分子量を有する。

【0430】

ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体(すなわち“ペグ化”)を共有結合的に結合(コンジュゲート)することによりポリペプチドを修飾する種々の方法は当分野で知られる(例えば、Ｕ.Ｓ.２００６／０１０４９６８；Ｕ.Ｓ.５,６７２,６６２；Ｕ.Ｓ.６,７３７,５０５；およびＵ.Ｓ.２００４／０２３５７３４参照)。このような技術は本明細書のいずれかの場所に記載されている。

【0431】

２. 医薬組成物および製剤
ここに提供されるのは、ここに提供する処置方法において使用するための抗ヒアルロナン剤、例えば、ヒアルロナン分解酵素またはその修飾形態(例えばペグ化ヒアルロニダーゼ群のようなペグ化ヒアルロナン分解酵素群)の医薬組成物である。またここで提供されるのは、癌のようなヒアルロナン関連疾患または状態と関連する疾患または障害を処置するために使用する第二剤を含む医薬組成物である。このようなの例は、薬物、ポリペプチド、核酸、抗体、ペプチド、小分子、遺伝子治療ベクター、ウイルスおよび他の治療剤を含む抗癌剤である。抗ヒアルロナン剤、例えば、ヒアルロナン分解酵素またはその修飾形態(例えばペグ化ヒアルロニダーゼ群のようなペグ化ヒアルロナン分解酵素群またはＰＥＧＰＨ２０)は、このような第二剤の医薬製剤と共製剤または共投与して、所望のヒアルロナン過剰または蓄積と関連する体内の部位または組織への送達を亢進できる。

【0432】

薬学的に許容される組成物は、一般的に動物およびヒトでの使用のための認められた薬局方に従い、準備される規制当局または他の当局の承認の観点で製造される。化合物は、溶液、懸濁液、粉末または徐放性製剤のような経口および静脈内投与のいずれかのための任意の適切な医薬に製剤できる。典型的に、化合物は、当分野で周知の技術および方法を使用して医薬組成物に製剤する(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126参照)。製剤は投与方法に適合させるべきである。

【0433】

一例として、医薬製剤は液体形態、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であり得る。液体形態で提供されるならば、医薬製剤は、使用前に治療的有効濃度に希釈すべき濃縮製剤として提供できる。このような液体製剤は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル類または分画植物油)；および防腐剤(例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート類またはソルビン酸)のような薬学的に許容される添加剤と慣用法で製造できる。他の例において、医薬製剤は、使用前に水または他の適当な媒体で再構成するための凍結乾燥形態で提供できる。

【0434】

医薬組成物は、それらを用いて組成物(例えばコルチコステロイドまたはペグ化ヒアルロナン分解酵素群のような抗ヒアルロナン剤)を投与する希釈剤、アジュバント、添加物または媒体のような担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。このような組成物は、治療有効量の化合物または薬物を、一般的に精製形態または一部精製形態で、適切な量の担体とともに含み、患者への投与に適切な形態を提供する。このような医薬担体は滅菌液体、例えば水および石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油を含む。水は、医薬組成物を静脈内投与するときの典型的担体である。食塩水溶液および水性のデキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射液のための液体担体として使用できる。組成物はまた活性成分とともに：ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロースのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルクのような滑沢剤；およびデンプン、アカシアガムのような天然ゴム類、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロース類およびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン類および当業者に知られる他のこのような結合剤のような結合剤を含む。適切な医薬添加物は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールを含む。例えば、適切な添加物は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。組成物は、所望により、また湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤および例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリン類のような他のこのような薬物のような他の少量の非毒性補助物質を含み得る。

【0435】

非経腸製剤で使用される薬学的に許容される担体は、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質を含む。水性媒体の例は、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張デキストロース注射、滅菌水注射、デキストロースおよび乳酸リンゲル注射を含む。非水性非経腸媒体は、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびピーナツ油を含む。静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤を、多数回投与容器に包装された非経腸製剤に添加でき、それはフェノール類またはクレゾール類、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む。等張化剤は塩化ナトリウムおよびデキストロースを含む。緩衝剤はリン酸およびクエン酸を含む。抗酸化剤は硫酸水素ナトリウムを含む。局所麻酔剤は塩酸プロカインを含む。懸濁および分散剤はナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを含む。乳化剤はポリソルベート８０(TWEEN 80)を含む。金属イオンの封鎖またはキレート剤はＥＤＴＡを含む。医薬担体はまた水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールおよびｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を含む。

【0436】

注射剤は、慣用の形態で、液体溶液または懸濁液、注射前に液体で溶液または懸濁液とするのに適切な固体形態またはエマルジョンとして製造できる。前立腺内投与用製剤は、皮下組織錠剤、調整済み注射用無菌懸濁液、使用前に媒体と併せるための無菌乾燥不溶性生成物、無菌エマルジョンを含む、調整済み注射用無菌溶液、使用直前に溶媒と合わせるための凍結乾燥粉末のような無菌乾燥可溶性生成物を含む。溶液は水性でも非水性でもよい。

【0437】

３. 投与量および投与
典型的に、抗ヒアルロナン剤、例えば、ヒアルロナン分解酵素の投与量は、癌のようなヒアルロナン関連疾患または状態の処置に有効な治療も達成するものである。それゆえに、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵の組成物素は、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で包含される。活性剤を含む組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。抗ヒアルロナン剤の組成物はまた第二治療剤を含み得る。

【0438】

抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素の治療的有効濃度は、経験的に化合物を、ここに提供するアッセイのようなインビトロおよびインビボシステムで試験することにより決定できる。例えば、ヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤またはその修飾形態(例えばペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素)の濃度は、吸収、不活性化および排出率、物理化学的特性、投与スケジュールおよび投与される量ならびに当業者に知られた他の因子による。例えば、正確な投与量および処置の持続時間は、処置する組織、処置する疾患または状態、投与経路、患者または対象および特定の抗ヒアルロナン剤の関数であり、経験的に既知試験プロトコルを使用してまたはインビボまたはインビトロ試験データの外挿により決定できおよび／または特定の薬物の既知投与レジメから決定できることは理解される。疾患または状態、例えばＨＡ富腫瘍のようなヒアルロナン関連疾患または状態の処置のために投与すべき抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素またはその修飾形態(例えばペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素)の量は標準的臨床的技術により決定できる。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを最適投与量範囲の決定を補助するために用い得る。経験的に決定できる正確な投与量は、特定の酵素、投与経路、処置する疾患のタイプおよび疾患の重症度に依存し得る。

【0439】

例えば、ヒアルロナン関連疾患および状態の処置のためにヒアルロナン分解酵素群のような抗ヒアルロナン剤またはその修飾形態(例えばペグ化形態)を使用する方法は当分野で周知である(例えば米国公開出願番号２０１００００３２３８および国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９／１２８９１７参照)。それゆえに、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼのような抗ヒアルロナン剤の投与量は、ある投与経路についてのその薬物の標準的投与レジメに基づき選択できる。

【0440】

ヒアルロナン関連疾患または状態の処置のための抗ヒアルロナン剤の有効量の例は、０.０１μg〜１００ｇ／体重kgの範囲の投与量である。例えば、有効量の抗ヒアルロナン剤は０.０１μg〜１００mg／体重kg、例えば０.０１μg〜１mg／体重kg、１μg〜１００μg／体重kg、１μg〜１０μg／体重kgまたは０.０１mg〜１００mg／体重kgの範囲の投与量である。例えば、有効量は、少なくともまたは凡そ少なくともまたは約または０.０１μg、０.０５、０.１、０.５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μg／kg体重を含む。他の有効量の例は、０.０１、０.０２、０.０３、０.０４、０.０５、０.０６、０.０７、０.０８、０.０９、０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｇ／kg体重を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼのような抗ヒアルロナン剤(例えばＰＥＧＰＨ２０のようなペグ化ヒアルロニダーゼ)を正確にまたは約０.１μg／kg〜１mg／kg、例えば０.５μg／kg〜１００μg／kg、０.７５μg／kg〜１５μg／kg、０.７５μg／kg〜７.５μg／kgまたは１.０μg／kg〜３.０μg／kgで投与してよい。他の例において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼのような抗ヒアルロナン剤(例えばＰＥＧＰＨ２０のようなペグ化ヒアルロニダーゼ)を正確にまたは１mg／kg〜５００mg／kg、例えば、１００mg／kg〜４００mg／kg、例えば２００mg／kgで投与してよい。例えば、組成物は、０.５mg〜１００ｇの抗ヒアルロナン剤、例えば、２０μg〜１mg、例えば１００μg〜０.５mgを含みまたは１mg〜１ｇ、例えば５mg〜５００mgを含み得る。

【0441】

例えば、抗癌剤のようなヒアルロナン関連疾患および状態の処置のための薬物および処置は当分野で周知である(例えば米国公開出願番号２０１００００３２３８および国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９／１２８９１７参照)。それゆえに、組成物中のヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼまたは他の第二剤の投与量、ある投与経路についてのその薬物の標準的投与レジメに基づき選択できる。

【0442】

ヒアルロナン分解酵素の有効量の例は、０.０１μg〜１００ｇ／体重kgの範囲の投与量である。例えば、有効量のヒアルロナン分解酵素は、０.０１μg〜１００mg／体重kg、例えば０.０１μg〜１mg／体重kg、１μg〜１００μg／体重kg、１μg〜１０μg／体重kgまたは０.０１mg〜１００mg／体重kgの範囲の投与量である。例えば、有効量は、少なくともまたは凡そ少なくともまたは約または０.０１μg、０.０５、０.１、０.５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μg／kg体重を含む。他の有効量の例は、０.０１、０.０２、０.０３、０.０４、０.０５、０.０６、０.０７、０.０８、０.０９、０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｇ／kg体重を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ(例えばＰＥＧＰＨ２０のようなペグ化ヒアルロニダーゼ)は、正確にまたは約０.１μg／kg〜１mg／kg、例えば０.５μg／kg〜１００μg／kg、０.７５μg／kg〜１５μg／kg、０.７５μg／kg〜７.５μg／kgまたは１.０μg／kg〜３.０μg／kgで投与できる。他の例において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ(例えばＰＥＧＰＨ２０のようなペグ化ヒアルロニダーゼ)は正確にまたは１mg／kg〜５００mg／kg、例えば、１００mg／kg〜４００mg／kg、例えば２００mg／kgで投与できる。一般的に、組成物は０.５mg〜１００ｇのヒアルロナン分解酵素、例えば、２０μg〜１mg、例えば１００μg〜０.５mgを含みまたは１mg〜１ｇ、例えば５mg〜５００mgを含み得る。

【0443】

投与量または組成物は一回投与量投与または複数投与量投与のためであり得る。投与量または組成物を単一投与で１回、週に数回、１週間に２回、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間または３０日間毎に１回、月に１回、年に数回または毎年投与できる。他の例において、投与量または組成物を分割し、１回、週に数回、１週間に２回、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間または３０日間毎に１回、月に１回、年に数回または毎年投与できる。ヒアルロナン分解酵素組成物を液体組成物として製剤できまたは凍結乾燥してよい。組成物はまた錠剤またはカプセル剤としても製剤できる。

【0444】

下に提供するのは、ここでの方法に使用するためのポリマーに結合した(例えばペグ化)ヒアルロナン分解酵素群の例の投与量および投与量レジメンの説明である。ヒアルロナン分解酵素群は単独で単剤治療としてまたは癌のようなＨＡ関連疾患または状態の処置に使用する他の薬物と組み合わせて使用できる。本明細書のいずれかの場所、特にここでの方法および使用の実施例に記載するとおり、本薬物を、抗ヒアルロナン剤の処置と関連する副作用を寛解するためにコルチコステロイドと組み合わせて投与してよい。

【0445】

ａ. ペグ化ヒアルロナン分解酵素の投与
ペグ化ヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロニダーゼ)のようなヒアルロナン分解酵素を全身的に、例えば、静脈内(IV)、筋肉内またはあらゆる他の全身性経路により投与できる。具体例において、低投与量を局所的に投与できる。例えば、ペグ化ヒアルロナン分解酵素、例えばペグ化ヒアルロニダーゼ(例えばＰＨ２０)のようなヒアルロナン分解酵素の局所投与は、低絶対投与量で局所作用を高めることができる、腫瘍内投与、動脈内注射(例えば肝動脈)、腹腔内投与、膀胱内投与および他の癌治療のための局所経路を含む。

【0446】

投与量範囲の例は正確にまたは約０.３単位／kg〜３２０,０００単位／kg、例えば１０単位／kg〜３２０,０００単位／kgのペグ化ヒアルロニダーゼまたは機能的等価量の他のペグ化ヒアルロナン分解酵素である。ここでは、活性の単位は、標準的活性、例えば、ヒアルロニダーゼ活性をアッセイする微小濁度(マイクロturbidity)アッセイで測定した活性に対して基準化されていることは理解される。ペグ化可溶性ヒアルロニダーゼは、そのように結合していない天然可溶性ヒアルロニダーゼと比較して、総タンパク質mgあたり低い活性を示し、すなわち低い比活性を示し得ることは理解される。例えば、ｒＨｕＰＨ２０製剤の例は、１２０,０００単位／mgの比活性を示すのに対し、ｒＨｕＰＨ２０のペグ化形態は、正確にまたは約３２,０００単位／mgの比活性を示す。典型的に、ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素のペグ化形態、例えばｒＨｕＰＨ２０は、正確にまたは約１８,０００から正確にまたは約４５,０００Ｕ／mgの範囲の比活性を示す。一例として、ＰＥＧ−ヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ対タンパク質モル比５：１〜９：１、例えば、７：１で１１２,０００Ｕ／mL(〜３２,０００Ｕ／mg)で、例えば、３.５mg／mLの原液として提供できまたはそれより低濃度の形態で提供できる。本発明の目的のために、投与量は単位を基準とする。

【0447】

例えば、ペグ化されたヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素、例えばＰＥＧＰＨ２０は、静脈内に１週間に２回、１週間に１回または２１日間毎に１回投与できる。典型的に、ペグ化ヒアルロナン分解酵素は１週間に２回投与する。投与サイクルは一定期間であり、一般的に３週間または４週間である。投与サイクルは、投与量レジメで少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間以上繰り返し得る。一般的に、投与サイクルは処置医の裁量で繰り返してよく、疾患または状態の寛解、疾患または状態の重症度、有害事象および他の因子のような因子に依存し得る。他の例において、その後の投与サイクルにおいて、ヒアルロナン分解酵素を低頻度で投与してよい。例えば、第一サイクルにおいてヒアルロナン分解酵素は１週間に２回、４週間投与し、その後の投与サイクルにおいてヒアルロナン分解酵素を１週間に１回または２週間に１回、３週間に１回(例えば２１日間毎に１回)または４週間に１回投与する。ここに記載するとおり、コルチコステロイドの投与量または投与レジメはヒアルロナン分解酵素の投与レジメによる。

【0448】

投与量は疾患および患者により変わり得るが、ペグ化ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素は、一般的に正確にまたは約０.０１μg／kg、例えば０.０００５mg／kg(０.５μg／kg)〜１０mg／kg(３２０,０００Ｕ／kg)、例えば、０.０２mg／kg〜１.５mg／kg、例えば、０.０５mg／kgの範囲の量で投与する。ペグ化ヒアルロニダーゼは、例えば、正確にまたは約０.０００５mg／kg(対象の)、０.０００６mg／kg、０.０００７mg／kg、０.０００８mg／kg、０.０００９mg／kg、０.００１mg／kg、０.００１６mg／kg、０.００２mg／kg、０.００３mg／kg、０.００４mg／kg、０.００５mg／kg、０.００６mg／kg、０.００７mg／kg、０.００８mg／kg、０.００９mg／kg、０.０１mg／kg、０.０１６mg／kg、０.０２mg／kg、０.０３mg／kg、０.０４mg／kg、０.０５mg／kg、０.０６mg／kg、０.０７mg／kg、０.０８mg／kg、０.０９mg／kg、０.１mg／kg、０.１５mg／kg、０.２mg／kg、０.２５mg／kg、０.３０mg／kg、０.３５mg／kg、０.４０mg／kg、０.４５mg／kg、０.５mg／kg、０.５５mg.kg、０.６mg／kg、０.７mg／kg、０.８mg／kg、０.９mg／kg、１.０mg／kg、１.１mg／kg、１.２mg／kg、１.３mg／kg、１.４mg／kg、１.５mg／kg、１.６mg／kg、１.７mg／kg、１.８mg／kg、１.９mg／kg、２mg／kg、２.５mg／kg、３mg／kg、３.５mg／kg、４mg／kg、４.５mg／kg、５mg／kg、５.５mg／kg、６mg／kg、６.５mg／kg、７mg／kg、７.５mg／kg、８mg／kg、８.５mg／kg、９mg／kg、９.５mg／kg、１０mg／kg、１１mg／kg、１２mg／kg、１３mg／kg、１４mg／kg、１５mg／kg、１６mg／kg、１７mg／kg、１８mg／kg、１９mg／kg、２０mg／kg、２１mg／kg、２２mg／kg、２３mg／kg、２４mg／kg、２５mg／kg以上の投与量を、典型的に体重約７０kg〜７５kgの、平均的成人対象に投与する。具体例において、ヒアルロナン分解酵素を、多くても２０μg／kg、例えば０.０１μg／kg〜１５μg／kg、０.０５μg／kg〜１０μg／kg、０.７５μg／kg〜７.５μg／kgまたは１.０μg／kg〜３.０μg／kgのような低量で投与する。

【0449】

ここで提供されるペグ化されたヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素(例えばＰＨ２０)、例えば、ＰＥＧＰＨ２０は、投与する対象の重量あたり、正確にまたは約１単位／kg〜８００,０００単位／kg、例えば１０〜８００,０００単位／kg、１０〜７５０,０００単位／kg、１０〜７００,０００単位／kg、１０〜６５０,０００単位／kg、１０〜６００,０００単位／kg、１０〜５５０,０００単位／kg、１０〜５００,０００単位／kg、１０〜４５０,０００単位／kg、１０〜４００,０００単位／kg、１０〜３５０,０００単位／kg、１０〜３２０,０００単位／kg、１０〜３００,０００単位／kg、１０〜２８０,０００単位／kg、１０〜２６０,０００単位／kg、１０〜２４０,０００単位／kg、１０〜２２０,０００単位／kg、１０〜２００,０００単位／kg、１０〜１８０,０００単位／kg、１０〜１６０,０００単位／kg、１０〜１４０,０００単位／kg、１０〜１２０,０００単位／kg、１０〜１００,０００単位／kg、１０〜８０,０００単位／kg、１０〜７０,０００単位／kg、１０〜６０,０００単位／kg、１０〜５０,０００単位／kg、１０〜４０,０００単位／kg、１０〜３０,０００単位／kg、１０〜２０,０００単位／kg、１０〜１５,０００単位／kg、１０〜１２,８００単位／kg、１０〜１０,０００単位／kg、１０〜９,０００単位／kg、１０〜８,０００単位／kg、１０〜７,０００単位／kg、１０〜６,０００単位／kg、１０〜５,０００単位／kg、１０〜４,０００単位／kg、１０〜３,０００単位／kg、１０〜２,０００単位／kg、１０〜１,０００単位／kg、１０〜９００単位／kg、１０〜８００単位／kg、１０〜７００単位／kg、１０〜５００単位／kg、１０〜４００単位／kg、１０〜３００単位／kg、１０〜２００単位／kg、１０〜１００単位／kg、１６〜６００,０００単位／kg、１６〜５００,０００単位／kg、１６〜４００,０００単位／kg、１６〜３５０,０００単位／kg、１６〜３２０,０００単位／kg、１６〜１６０,０００単位／kg、１６〜８０,０００単位／kg、１６〜４０,０００単位／kg、１６〜２０,０００単位／kg、１６〜１６,０００単位／kg、１６〜１２,８００単位／kg、１６〜１０,０００単位／kg、１６〜５,０００単位／kg、１６〜４,０００単位／kg、１６〜３,０００単位／kg、１６〜２,０００単位／kg、１６〜１,０００単位／kg、１６〜９００単位／kg、１６〜８００単位／kg、１６〜７００単位／kg、１６〜５００単位／kg、１６〜４００単位／kg、１６〜３００単位／kg、１６〜２００単位／kg、１６〜１００単位／kg、１６０〜１２,８００単位／kg、１６０〜８,０００単位／kg、１６０〜６,０００単位／kg、１６０〜４,０００単位／kg、１６０〜２,０００単位／kg、１６０〜１,０００単位／kg、１６０〜５００単位／kg、５００〜５０００単位／kg、１０００〜１００,０００単位／kgまたは１０００〜１０,０００単位／kgで投与できる。ある例において、ここで提供されるペグ化ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素(例えばＰＨ２０)、例えば、ＰＥＧＰＨ２０は、正確にまたは約１単位／kg〜１０００単位／kg、１単位／kg〜５００単位／kgまたは１０単位／kg〜５０単位／kgで投与し得る。

【0450】

一般的に、ペグ化ヒアルロニダーゼの比活性が、対象の体重あたり正確にまたは約１８,０００Ｕ／mg〜４５,０００Ｕ／mg、一般的に正確にまたは約１単位／kg(Ｕ／kg)、２Ｕ／kg、３Ｕ／kg、４Ｕ／kg、５Ｕ／kg、６Ｕ／kg、７Ｕ／kg、８Ｕ／kg、８Ｕ／kg、１０Ｕ／kg、１６Ｕ／kg、３２Ｕ／kg、６４Ｕ／kg、１００Ｕ／kg、２００Ｕ／kg、３００Ｕ／kg、４００Ｕ／kg、５００Ｕ／kg、６００Ｕ／kg、７００Ｕ／kg、８００Ｕ／kg、９００Ｕ／kg、１,０００Ｕ／kg、２,０００Ｕ／kg、３,０００Ｕ／kg、４,０００Ｕ／kg、５,０００Ｕ／kg、６,０００Ｕ／kg、７,０００Ｕ／kg、８,０００Ｕ／kg、９,０００Ｕ／kg、１０,０００Ｕ／kg、１２,８００Ｕ／kg、２０,０００Ｕ／kg、３２,０００Ｕ／kg、４０,０００Ｕ／kg、５０,０００Ｕ／kg、６０,０００Ｕ／kg、７０,０００Ｕ／kg、８０,０００Ｕ／kg、９０,０００Ｕ／kg、１００,０００Ｕ／kg、１２０,０００Ｕ／kg、１４０,０００Ｕ／kg、１６０,０００Ｕ／kg、１８０,０００Ｕ／kg、２００,０００Ｕ／kg、２２０,０００Ｕ／kg、２４０,０００Ｕ／kg、２６０,０００Ｕ／kg、２８０,０００Ｕ／kg、３００,０００Ｕ／kg、３２０,０００Ｕ／kg、３５０,０００Ｕ／kg、４００,０００Ｕ／kg、４５０,０００Ｕ／kg、５００,０００Ｕ／kg、５５０,０００Ｕ／kg、６００,０００Ｕ／kg、６５０,０００Ｕ／kg、７００,０００Ｕ／kg、７５０,０００Ｕ／kg、８００,０００Ｕ／kg以上であるものを投与する。

【0451】

ある面において、少なくとも３Ｕ／mLのペグ化ヒアルロニダーゼを血漿中に維持するように、ペグ化ヒアルロナン分解酵素を製剤し、投与する(例えば公開米国特許出願番号ＵＳ２０１００００３２３８および公開国際特許出願番号ＷＯ２００９１２８９１７参照)。例えば、血漿に少なくともまたは約３Ｕ／mL、一般的に３Ｕ／mL〜１２Ｕ／mL以上、例えば、少なくともまたは約または正確に４Ｕ／mL、５Ｕ／mL、６Ｕ／mL、７Ｕ／mL、８Ｕ／mL、９Ｕ／mL、１０Ｕ／mL、１１Ｕ／mL、１２Ｕ／mL、１３Ｕ／mL、１４Ｕ／mL、１５Ｕ／mL、１６Ｕ／mL、１７Ｕ／mL、１８Ｕ／mL、１９Ｕ／mL、２０Ｕ／mL、２５Ｕ／mL、３０Ｕ／mL、３５Ｕ／mL、４０Ｕ／mL、４５Ｕ／mL、５０Ｕ／mL以上のレベルを維持する十分な量でペグ化可溶性ヒアルロニダーゼを全身投与のために製剤する。一般的に、少なくとも３Ｕ／mLのヒアルロニダーゼを血漿で維持するためのここでの目的のために、正確にまたは約０.０２mg／kg(対象の)、０.０３mg／kg、０.０４mg／kg、０.０５mg／kg、０.０６mg／kg、０.０７mg／kg、０.０８mg／kg、０.０９mg／kg、０.１mg／kg、０.１５mg／kg、０.２mg／kg、０.２５mg／kg、０.３０mg／kg、０.３５mg／kg、０.４０mg／kg、０.４５mg／kg、０.５mg／kg、０.５５mg.kg、０.６mg／kg、０.７mg／kg、０.８mg／kg、０.９mg／kg、１.０mg／kg、１.１mg／kg、１.２mg／kg、１.３mg／kg、１.４mg／kg、１.５mg／kg以上を投与する。一般的に、修飾ヒアルロニダーゼの比活性が正確にまたは約２０,０００Ｕ／mg〜６０,０００Ｕ／mg、一般的に正確にまたは約３５,０００Ｕ／mg、６０,０００Ｕ；７０,０００Ｕ；８０,０００Ｕ；９０,０００Ｕ；１００,０００Ｕ；２００,０００Ｕ；３００,０００Ｕ；４００,０００Ｕ；５００,０００Ｕ；６００,０００Ｕ；７００,０００Ｕ；８００,０００Ｕ；９００,０００Ｕ；１,０００,０００Ｕ；１,５００,０００Ｕ；２,０００,０００Ｕ；２,５００,０００Ｕ；３,０００,０００Ｕ；３,５００,０００Ｕ；４,０００,０００Ｕ以上を投与する。このようなレベルを維持するために、投与は毎日、週に数回、１週間に２回、毎週または毎月でよい。

【0452】

血液に少なくとも３Ｕ／mLのヒアルロニダーゼを維持するためのペグ化ヒアルロン分解酵素、例えば、ペグ化ＰＨ２０の量の決定は、当業者のレベルの範囲内である。血液中のヒアルロニダーゼのレベルは、十分な量のヒアルロニダーゼが血液に存在することを確実にするために経時的にモニターできる。血漿中のヒアルロニダーゼを測定するための当業者に知られるあらゆるアッセイを実施できる。例えば、ここでの実施例に記載する微小濁度アッセイまたは酵素アッセイを、血漿中のタンパク質で実施できる。血漿は、通常ヒアルロニダーゼ酵素群を含むことは理解される。このような血漿ヒアルロニダーゼ酵素群は、典型的に酸性ｐＨで活性を有する(米国特許番号７,１０５,３３０)。それゆえに、修飾酵素での処置前に、血漿レベルのヒアルロニダーゼを決定し、ベースラインとして使用すべきである。処置後のその後の血漿ヒアルロニダーゼ測定レベルを処置前のレベルと比較できる。あるいは、アッセイを、通常酸性ｐＨで活性を示す内在性リソソームヒアルロニダーゼ活性を抑制するｐＨ条件で行ってよい。それゆえに、修飾可溶性ヒアルロニダーゼは中性ｐＨで活性(例えばヒトＰＨ２０)とき、修飾中性活性可溶性ヒアルロニダーゼのみのレベルが測定される。

【0453】

他の例において、血液において維持される検出可能レベルのヒアルロニダーゼがなくても、ヒアルロナン関連疾患または状態に対する治療効果を有することが本発明により判明した、ペグ化ヒアルロナン分解酵素を製剤し、低投与量で投与する。例えば、ペグ化可溶性ヒアルロニダーゼを、多くても２０μg／kg、例えば０.０１μg／kg〜１５μg／kg、０.０５μg／kg〜１０μg／kg、０.７５μg／kg〜７.５μg／kgまたは１.０μg／kg〜３.０μg／kg、例えば正確にまたは約０.０１μg／kg(対象の)、０.０２μg／kg、０.０３μg／kg、０.０４μg／kg、０.０５μg／kg、１.０μg／kg、１.５μg／kg、２.０μg／kg、２.５μg／kg、３.０μg／kg、３.５μg／kg、４.０μg／kg、４.５μg／kg、５.０μg／kg、５.５μg／kg、６.０μg／kg、７.０μg／kg、７.５μg／kg、８.０μg／kg、９.０μg／kg、１０.０μg／kg、１２.５μg／kgまたは１５μg／kgである量で投与する。一般的に、修飾ヒアルロニダーゼの比活性が正確にまたは約２０,０００Ｕ／mg〜６０,０００Ｕ／mg、一般的に正確にまたは約３５,０００Ｕ／mg、２００単位〜５０,０００(Ｕ)、例えば２００Ｕ、３００Ｕ；４００Ｕ；５００Ｕ；６００Ｕ；７００Ｕ；８００Ｕ；９００Ｕ；１,０００Ｕ；１２５０Ｕ；１５００Ｕ；２０００Ｕ；３０００Ｕ；４０００Ｕ；５,０００Ｕ；６,０００Ｕ；７,０００Ｕ；８,０００Ｕ；９,０００Ｕ；１０,０００Ｕ；２０,０００Ｕ；３０,０００Ｕ；４０,０００Ｕ；または５０,０００Ｕを投与する。このようなレベルを維持するために、投与は毎日、週に数回、１週間に２回、毎週または毎月でよい。

【0454】

典型的に、ここで意図されるペグ化ヒアルロニダーゼの注射または点滴体積は、正確にまたは約０.５mL、１mL、２mL、３mL、４mL、５mL、６mL、７mL、８mL、９mL、１０mL、１５mL、２０mL、３０mL、４０mL、５０mL以上である。ペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素は、原液として、正確にまたは約５０Ｕ／mL、１００Ｕ／mL、１５０Ｕ／mL、２００Ｕ／mL、４００Ｕ／mLまたは５００Ｕ／mL(または機能的等価量)で提供してよくまたは直接使用または使用前に有効濃度まで希釈するためにより濃縮された形態、例えば正確にまたは約１０００Ｕ／mL、２０００単位／mL、３０００Ｕ／mL、４０００Ｕ／mL、５０００Ｕ／mL、６０００Ｕ／mL、７０００Ｕ／mL、８０００Ｕ／mL、９０００Ｕ／mL、１０,０００Ｕ／mL、１１,０００Ｕ／mL、１２,０００Ｕ／mLまたは１２,８００Ｕ／mLで提供してよい。投与するペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素の体積は必要投与量の関数であるが、利用可能な可溶性ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素原液製剤の濃度により変わり得る。例えば、ここでは、ペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素を約５０mLより多い体積で投与することは意図せず、典型的に５〜３０mLの体積、一般的に約１０mLを超えない体積で投与する。ペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素は、液体または凍結乾燥製剤として提供できる。凍結乾燥製剤は大きな単位投与量のペグ化ヒアルロナン分解酵素群の保存に理想的である。

【0455】

４. 組み合わせ処置
ヒアルロナン分解酵素群またはその修飾形態(例えばＰＥＧＰＨ２０のようなペグ化ヒアルロナン分解酵素またはペグ化ヒアルロニダーゼ)のような抗ヒアルロナン剤を、例えば、癌のようなヒアルロナン関連疾患または状態の処置のための、組み合わせ処置において投与できる。抗ヒアルロナン剤の組成物は、ヒアルロナン関連疾患または状態、例えばヒアルロナン関連癌を処置するための薬物または処置のような過程のような他の治療剤または薬物または処置と共製剤または、前に、間欠的にまたは続けて共投与できる。このような薬物は、他の生物製剤、抗癌剤、小分子化合物、分散剤、麻酔剤、血管収縮剤および手術およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ここに例示する全てを含む疾患または状態の処置に利用可能なこのような他の薬物および処置は当業者に知られているまたは経験的に決定できる。

【0456】

１種以上の第二剤の製剤または１種以上の処置剤を一度に投与してよくまたは一定間隔で数回投与するために複数の小投与量に分けてよい。選択した薬物／処置製剤を、処置過程において、例えば数時間、数日間、数週間または数ヶ月にわたり１回以上の投与量で投与してよい。ある例において、連続的投与が有用である。確な投与量および投与の経過は適応および患者の耐容性によることは理解される。一般的に、ここでの第二剤／処置の投与レジメは当業者に知られる。

【0457】

一例として、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素またはそのポリマー結合修飾形態(例えばペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素)を、疾患または状態の処置のために第二剤または処置と投与する。一例として、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素またはそのポリマー結合修飾形態(例えばペグ化ヒアルロナン分解酵素)および第二剤または処置を共製剤し、一緒に投与してよい。他の例において、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素またはそのポリマー結合修飾形態(例えばペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素)を第二剤または処置製剤の後に、間欠的にまたは同時に投与する。一般的に、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素(例えばペグ化ヒアルロナン分解酵素)を、第二剤または処置製剤の前に、該薬物が組織または細胞関連ヒアルロナンのレベルまたは量の減少を可能にするように投与する。例えば、ヒアルロナン分解酵素、例えばペグ化ヒアルロナン分解酵素を、該酵素が例えば、間質腔、細胞外マトリックス、腫瘍組織、血液または他の組織のような対象の細胞、組織または体液におけるヒアルロン酸の減少または分解をするように第二剤または処置の前に投与する。例えば、ヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤またはそのポリマー結合修飾形態(例えばペグ化可溶性ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素)を、第二剤製剤投与の０.５分間、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間以上前に投与してよい。ある例において、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素またはそのポリマー結合修飾形態(例えばペグ化ヒアルロナン分解酵素)を第二剤製剤と一緒に投与する。当業者には当然であるが、共投与の所望の近接は、特定の組織設定および処置する特定の疾患におけるこれらの薬物の有効半減期に相当部分依存し、適切な動物モデルのような適切なモデルにおけるさまざまな時間のこれらの薬物の投与の効果の試験により容易に最適化できる。いくつかの状況で、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素またはそのポリマー結合修飾形態(例えばペグ化ヒアルロニダーゼのようなペグ化ヒアルロナン分解酵素)の最適な投与タイミングは６０分間を越える。

【0458】

例えば、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素を抗癌剤と組み合わせて投与してよい(例えば米国公開番号ＵＳ２０１０−０００３２３８参照)。ヒアルロナン分解酵素と組み合わせで使用する抗癌剤または処置は、手術、放射線、薬物、化学療法剤、ポリペプチド、抗体、ペプチド、小分子または遺伝子治療ベクター、ウイルスまたはＤＮＡを含むが、これらに限定されない。

【0459】

他の例において、ここに提供される処置方法は、ヒアルロナン分解酵素に加えて、１種以上のさらなる抗ヒアルロナン剤を治療のために投与する方法を含む。抗ヒアルロナン剤は、腫瘍におけるＨＡの蓄積を減少させるまたは除去するあらゆる薬物を含む。このような薬物は、ここに記載するヒアルロナン分解酵素群およびまたＨＡの合成を阻害する薬物を含むが、これらに限定されない。例えば、ヒアルロナン合成を阻害する抗ヒアルロナン剤は、ｈａｓ遺伝子に対するアンチセンスまたはセンス分子を含む。このようなアンチセンスまたはセンス阻害は、典型的に少なくとも１個の鎖またはセグメントが開裂、分解または他に操作不能となるように、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合ベースのハイブリダイゼーションに基づく。他の例において、転写後遺伝子サイレンシング(ＰＴＧＳ)、ＲＮＡｉ、リボザイムおよびＤＮＡザイムを用いることができる。ＨＡＳ１(配列番号１９５に示す)、ＨＡＳ２(配列番号１９６に示す)またはＨＡＳ３(配列番号１９７または１９８に示す)の配列に基づきこのような構築物を産生するのは、当業者のレベルの範囲内である。アンチセンスまたはセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能となるためにその標的核酸と１００％相補的でなくてもよいことは当分野で理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１個以上のセグメントを超えてハイブリダイズできる(例えばループ構造またはヘアピン構造)。一般的に、アンチセンスまたはセンス化合物は、標的核酸内の標的領域と少なくとも７０％配列相補性、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のように７５％〜１００％相補性である。センスまたはアンチセンス分子の例は当分野で知られる(例えばChao et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:27513-27522; Simpson et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am. J Path. 161:849; Nishida et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:21893-21899; Edward et al. (2010) British J Dermatology 162:1224-1232; Udabage et al. (2005) Cancer Res. 65:6139；および公開米国特許出願番号ＵＳ２００７０２８６８５６参照)。ＨＡ合成阻害剤の他の例は抗ヒアルロナン剤は４−メチルウンベリフェロン(４−ＭＵ；７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン)またはその誘導体である。４−ＭＵは、ＨＡ合成に必要なＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ前駆体プールを減少させることにより働く。抗ヒアルロナン剤のさらなる例はレフルノミド(Arava)、ゲニステインまたはエルブスタチンのようなチロシンキナーゼ阻害剤である。

【0460】

ある例において、組み合わせ治療において、コルチコステロイドを、ヒアルロナン分解酵素の副作用または有害事象を寛解するために投与できる(例えば米国特許出願番号１３／１３５,８１７参照)。いくつかの例において、グルココルチコイドはコルチゾン類、デキサメサゾン類、ヒドロコルチゾン類、メチルプレドニゾロン類、プレドニゾロン類およびプレドニゾン類から選択される。特定の例において、グルココルチコイドはデキサメサゾンである。典型的に、コルチコステロイドは経口投与されるが、コルチコステロイドのあらゆる投与方法が意図される。典型的に、グルココルチコイドは、正確にまたは約０.４および２０mg、例えば、投与量あたり正確にまたは約０.４mg、０.５mg、０.６mg、０.７mg、０.７５mg、０.８mg、０.９mg、１mg、２mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg、１６mg、１７mg、１８mg、１９mgまたは２０mgの量で投与する。

【0461】

Ｆ.ヒアルロナン分解酵素群の核酸およびコード化ポリペプチドおよびヒアルロナン結合タンパク質の製造方法
ここに示す処置のための提供する組成物および方法において使用するためのヒアルロナン結合タンパク質のポリペプチドまたは可溶性ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素は、タンパク質精製および組み換えタンパク質発現について当分野で周知の方法により得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための、当業者に知られるあらゆる方法を使用できる。当分野で利用可能なあらゆる方法を使用して、例えば、細胞または組織起源から、ヒアルロナン結合タンパク質またはヒアルロニダーゼをコードする完全長(すなわち、完全コーディング領域を包含)ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。修飾または変異体ヒアルロナン結合タンパク質またはヒアルロニダーゼ群は、部位特異的変異誘発によるように野生型ポリペプチドから操作できる。

【0462】

ポリペプチドは、核酸分子クローニングおよび単離のための当分野で知られるあらゆる利用可能な方法を使用してクローン化または単離できる。このような方法は、核酸のＰＣＲ増幅および核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含むライブラリーのスクリーニングを含む。

【0463】

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)方法を含む、核酸を増幅する方法を使用して、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離できる。核酸含有物質を、所望のポリペプチドコード化核酸分子を単離できる出発物質として使用できる。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ製剤、細胞抽出物、組織抽出物、体液サンプル(例えば血液、血清、唾液)、健常および／または疾患対象からのサンプルを増幅方法に使用できる。核酸ライブラリーも出発物質の起源として使用できる。プライマーは、所望のポリペプチドを増幅するために設計できる。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが産生される発現配列に基づき設計できる。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づき設計できる。増幅により産生した核酸分子を配列決定し、所望のポリペプチドのコードを確認できる。

【0464】

ベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コーディングＤＮＡ配列の増幅のために設計したベクター内への合成遺伝子のクローニングを目的として、制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含むさらなるヌクレオチド配列をポリペプチドコード化核酸分子と連結できる。さらに、機能的ＤＮＡ要素を特定する付加的ヌクレオチド配列を、ポリペプチドコード化核酸分子に作動可能に結合できる。このような配列の例は、細胞内タンパク質発現および分泌配列を促進するために設計したプロモータ配列、例えばタンパク質分泌を促進するために設計した異種シグナル配列を含むが、これらに限定されない。このような配列は当業者に知られている。タンパク質結合領域と特定する塩基対の配列のような付加的ヌクレオチド残基配列を、酵素コード化核酸分子に結合できる。このような領域は、特異的標的細胞への酵素取り込みを促進するまたは促進するタンパク質をコードするまたは他の点で合成遺伝子の生成物の薬物動態を変える残基の配列を含むが、これらに限定されない。例えば、酵素群はＰＥＧ部分と結合できる。

【0465】

さらに、例えばポリペプチドの検出またはアフィニティ精製を助けるためなどの目的で、タグまたは他の部分を付加することもできる。例えば、エピトープタグまたは他の検出可能マーカーを指定する塩基配列などの追加ヌクレオチド残基配列も、酵素コード核酸分子に連結することができる。そのような配列の典型例には、Ｈｉｓタグ(例えば６×Ｈｉｓ、ＨＨＨＨＨＨ；配列番号５４)またはＦｌａｇタグ(ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号５５)などがある。

【0466】

次に、同定され単離された核酸を適当なクローニングベクターに挿入することができる。当技術分野で知られる多数のベクター−宿主系を使用することができる。考えられるベクターには、プラスミドまたは改変ウイルスなどがあり、これらに限定されないが、ベクター系は使用する宿主細胞と適合しなければならない。そのようなベクターには、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＣＭＶ４、ｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、またはBluescriptベクター(Stratagene, La Jolla, CA)などがあるが、これらに限定されない。他の発現ベクターには、本明細書に例示するＨＺ２４発現ベクターがある。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を持つクローニングベクター中に、ＤＮＡフラグメントをライゲートすることによって達成することができる。挿入はＴＯＰＯクローニングベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使って達成することができる。ＤＮＡをフラグメント化するために使用される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいは、ヌクレオチド配列(リンカー)をＤＮＡ末端にライゲートすることによって所望する任意の部位を作り出すこともでき、これらのライゲートされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。これに代わる方法として、切断されたベクターおよびタンパク質遺伝子を、ホモポリマーテーリング(homopolymer tailing)によって修飾することもできる。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションなどによって、その遺伝子配列のコピーが数多く生成するように、宿主細胞中に導入することができる。

【0467】

特別な態様では、宿主細胞を、単離されたタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を組み込んだ組換えＤＮＡ分子で形質転換することにより、その遺伝子のコピーを多数生成させることができる。こうして、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要であれば、単離した組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、遺伝子を大量に得ることができる。

【0468】

１. ベクターおよび細胞
本明細書に記載するあらゆるヒアルロナン結合タンパク質またはヒアルロナン分解酵素のような所望のタンパク質の１つ以上を組換え発現させるために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター中に、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に、挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、酵素遺伝子の天然プロモーターおよび／またはそれらの隣接領域によって供給され得る。

【0469】

酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供する。ベクターを含有する細胞も提供する。細胞には真核細胞および原核細胞が含まれ、ベクターはそこでの使用に適した任意のベクターである。

【0470】

ベクターを含有する原核細胞および真核細胞(内皮細胞を含む)を提供する。そのような細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などがある。細胞は、コードされているタンパク質が細胞によって発現されるような条件下で上述の細胞を成長させ、発現されたタンパク質を回収することにより、そのタンパク質を生産するために使用される。本発明では、例えば酵素を、培地中に分泌させることができる。

【0471】

天然のまたは異種のシグナル配列に結合されたヒアルロナン分解酵素ポリペプチド、ある例では可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ならびにその複数コピーを含有するベクターを提供する。ベクターは酵素タンパク質が細胞中で発現されるように選択するか、酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。

【0472】

種々の宿主−ベクター系を使って、タンパク質コード配列を発現させることができる。これらには、ウイルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス)に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌などがあるが、これらに限定されない。ベクターの発現要素はその強さおよび特異性がさまざまである。使用する宿主−ベクター系に依存して、数ある適切な転写および翻訳要素のどれでも１つを使用することができる。

【0473】

ベクター中にＤＮＡフラグメントを挿入するための当業者に知られる任意の方法を使用して、適当な転写／翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列とを含むキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技法、ならびにインビボ組換え体(遺伝子組換え)を含めることができる。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、フラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはそのフラグメントが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第２の核酸配列によって調節することができる。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野で知られる任意のプロモーター／エンハンサーで制御することができる。具体的一態様では、プロモーターが、所望するタンパク質の遺伝子にとって天然のプロモーターではない。使用することができるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)))、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列(long terminal repeat)に含まれるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))；原核発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543)またはｔａｃプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))；Gilbert and Villa-Komaroff “Useful Proteins from Recombinant Bacteria” Scientific American 242:74-94 (1980))も参照；ノパリンシンテターゼプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984))またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター(Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981))、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984))を含有する植物発現ベクター；酵母および他の真菌由来のプロモーター要素、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物で使用されてきた、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987))；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ球様細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳房、リンパ球様細胞およびマスト細胞中で活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986))、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓中で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓中で活性なα−１アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄性細胞中で活性なβグロビン遺伝子制御領域(Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳の希突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域(Shani, Nature 314:283-286 (1985))、および視床下部の性腺刺激細胞中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))を含むが、これらに限定されない。

【0474】

特異的態様において、所望のタンパク質またはそのドメイン、フラグメント、誘導体またはホモログをコードする核酸に作動可能に結合したプロモータ、１箇所以上の複製起点および所望により、１個以上の選択可能マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターを使用する。大腸菌細胞の形質転換のためのプラスミドベクターの例は、例えば、ｐＱＥ発現ベクター(Qiagen, Valencia, CAから入手可能；また本システムを記載するQiagenにより公開された文献も参照)を含む。ｐＱＥベクターは、ファージＴ５プロモータ(大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識)および大腸菌内での厳しく制御された、組み換えタンパク質の高レベル発現を禎子湯するための二重ｌａｃオペレーター抑制モジュール、効率的翻訳のための合成リボソーム結合部位(RBS II)、６ＸＨｉｓタグコーディング配列、ｔ_０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製起点およびアンピシリン耐性を付与するためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。ｐＱＥベクターは、組み換えタンパク質のＮ末端またはＣ末端への６ｘＨｉｓタグ設置を可能とする。このようなプラスミドは、全３個の読み取り枠のための複数クローニング部位を提供し、Ｎ末端６ｘＨｉｓ−タグ付けされたタンパク質の発現を提供するpQE 32、pQE 30およびpQE 31を含む。大腸菌細胞形質転換のためのプラスミドベクターの他の例は、例えば、ｐＥＴ発現ベクター(米国特許４,９５２,４９６；Novagen, Madison, WIから入手可能参照；また本システムを記載するNovagenにより公開された文献も参照)。このようなプラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモータ、Ｔ７ターミネーター、誘導可能大腸菌ｌａｃオペレーターおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含むpET 11a；Ｔ７プロモータ、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含むpET 12a-c；およびＨｉｓカラムでの精製に使用するためのＨｉｓ−タグ^ＴＭリーダー配列およびカラム上で精製後、開裂を可能にするトロンビン開裂部位、Ｔ７−ｌａｃプロモータ領域およびＴ７ターミネーターを含むpET 15bおよびpET19b(Novagen, Madison, WI)を含む。

【0475】

哺乳動物細胞発現のためのベクターの例は、ＨＺ２４発現ベクターである。ＨＺ２４発現ベクターはｐＣＩベクター骨格から由来した(Promega)。それは、ベータ−ラクタマーゼ耐性遺伝子(ＡｍｐＲ)、Ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモータ領域(ＣＭＶ)およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル(ＳＶ４０)をコードするＤＮＡを含む。発現ベクターはまたＥＣＭＶウイルス(Clontech)由来の配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子を含む。

【0476】

２. 発現
ヒアルロナン結合タンパク質および可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含むヒアルロナン分解酵素ポリペプチドは、インビボ法およびインビトロ法を含む、当業者に知られる任意の方法によって製造することができる。所望のタンパク質は、要求される量および形態(例えば投与および処置に必要とされる量および形態)でそのタンパク質を生産するのに適した任意の生物中で発現させることができる。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞(ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む)が含まれる。発現宿主は、そのタンパク質産生レベルが異なり得ると共に、発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプも異なり得る。発現宿主の選択は、これらの因子および他の因子、例えば調節および安全性の問題、生産コスト、ならびに精製の必要性および精製の方法などに基づいて行うことができる。

【0477】

多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に知られており、それらをタンパク質の発現に使用することができる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって左右されるだろう。一般に発現ベクターは、転写プロモーターを含み、場合によってはエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。安定形質転換に使用される発現ベクターは、典型的に、形質転換細胞の選択と維持を可能にする選択可能マーカーを持つ。複製起点を使用してベクターのコピー数を増幅することができる場合もある。

【0478】

ヒアルロナン結合タンパク質および可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドのようなヒアルロナン分解酵素ポリペプチドは、タンパク質融合物として利用し、または発現させることもできる。例えば、酵素に付加的機能を加えるために、酵素融合物を作製することができる。酵素融合タンパク質の例には、シグナル配列、タグ、例えば位置確認(localization)用のタグ、例えばｈｉｓ_６タグもしくはｍｙｃタグ、または精製用タグ、例えばＧＳＴ融合物、ならびにタンパク質分泌および／または膜会合を指示するための配列の融合物などがあるが、これらに限定されない。

【0479】

ａ. 原核細胞
原核生物、特に大腸菌は、大量のタンパク質を生産するための系になる。大腸菌の形質転換は当業者に周知の簡便で迅速な技法である。大腸菌用の発現ベクターは誘導性プロモーターを含有することができ、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに有用であり、宿主細胞に対して何らかの毒性を示すタンパク質を発現させるのにも有用である。誘導性プロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、ならびに温度感受性λＰＬプロモーターなどがある。

【0480】

タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)は、大腸菌の細胞質環境中で発現させることができる。細胞質は還元的環境であり、一部の分子にとって、これは不溶性封入体の形成をもたらし得る。タンパク質を再可溶化するにはジチオスレイトールやβ−メルカプトエタノールなどの還元剤およびグアニジン−ＨＣｌや尿素などの変性剤を使用することができる。代替的アプローチは、酸化的環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生をもたらすことができる周辺腔におけるタンパク質の発現である。典型的に、タンパク質をペリプラズムに向かわせるリーダー配列が、発現されるべきタンパク質に融合される。その場合、リーダーは、ペリプラズム内で、シグナルペプチダーゼによって除去される。ペリプラズムを標的とする(periplasmic-targeting)リーダー配列には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダー、およびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーなどがある。ペリプラズム発現により、発現されたタンパク質の培養培地への漏出が可能になる場合もある。タンパク質の分泌は培養上清からの迅速かつ簡便な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は浸透圧溶解によってペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、時には、タンパク質が不溶性になることもあり、可溶化および再フォールディングが容易になるように、変性剤および還元剤を使用することができる。誘導温度および成長温度も、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼすことがあり、典型的に、２５℃〜３７℃の温度が使用される。典型的に、細菌は非グリコシル化タンパク質を産生する。タンパク質が機能するためにグリコシル化を要求する場合は、宿主細胞から精製した後に、インビトロでグリコシル化を追加することができる。

【0481】

ｂ. 酵母細胞
サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母は、タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)の生産に使用することができる周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターで形質転換させるか、相同組換えによる安定染色体組込みで形質転換させることができる。典型的に、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターが使用される。そのようなプロモーターの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１、ＡＯＸ１、または他のピキア(Ｐｉｃｈｉａ)プロモーターもしくは他の酵母プロモーターがある。発現ベクターは、多くの場合、形質転換されたＤＮＡを選択し維持するために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択可能マーカーを含む。酵母中で発現されたタンパク質は溶解性であることが多い。Ｂｉｐなどのシャペロニン類およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベルおよび溶解性が改善され得る。また、酵母中で発現されるタンパク質は、例えばサッカロミセス・セレビシェに由来する酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物、およびＡｇａ２ｐ接合付着受容体(mating adhesion receptor)またはアークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を使って、分泌するように指示することもできる。発現されたポリペプチドが分泌経路を出た時に、融合された配列を発現されたポリペプチドから除去するために、プロテアーゼ切断部位、例えばＫｅｘ−２プロテアーゼの切断部位を、工学的に作ることができる。酵母はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化を行う能力も持つ。

【0482】

ｃ. 昆虫細胞
昆虫細胞、特にバキュロウイルス発現を用いるものは、ヒアルロナン結合タンパク質および可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドのようなヒアルロナン分解酵素ポリペプチドを含むポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物が使用する翻訳後修飾の大半を行う能力を持つ。バキュロウイルスは宿主域が制限されており、それが安全性を向上させ、真核細胞発現に関する規制上の懸念を減少させる。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用のプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系は、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)およびカイコ(Bombyx mori)核多核体病ウイルス(ＢｍＮＰＶ)などのバキュロウイルスと、例えばツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)に由来するＳｆ９、シューダレチア・ユニパンクタ(Pseudaletia unipuncta)(Ａ７Ｓ)およびオオカバマダラ(Danaus plexippus)(ＤｐＮ１)などの昆虫細胞株を含む。高レベル発現には、発現されるべき分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは昆虫細胞では正確にプロセシングされ、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌させるには、これらのシグナルを使用することができる。加えて、細胞株シューダレチア・ユニパンクタ(Ａ７Ｓ)およびオオカバマダラ(ＤｐＮ１)は、哺乳動物細胞系と類似するグリコシル化パターンを持つタンパク質を産生する。

【0483】

昆虫細胞におけるもう一つの発現系は安定形質転換細胞の使用である。発現には、シュナイダー(Schneider)２(Ｓ２)細胞およびＫｃ細胞(キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster))およびＣ７細胞(ヒトスジシマカ(Aedes albopictus))などの細胞株を使用することができる。カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベル発現を誘導するために、ショウジョウバエ(Drosophila)メタロチオネインプロモーターを使用することができる。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシンやハイグロマイシンなどの選択可能マーカーの使用によって維持される。

【0484】

ｄ. 哺乳動物細胞
ヒアルロナン結合タンパク質および可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドのようなヒアルロナン分解酵素ポリペプチドを含むタンパク質を発現させるために、哺乳類発現系を使用することができる。発現構築物は、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接的ＤＮＡ導入によって、また、エレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、哺乳動物細胞に導入することができる。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、典型的に、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列(コザック(Ｋｏｚａｋ)コンセンサス配列)およびポリアデニル化要素を含む。選択可能マーカーなどのもう一つの遺伝子との２シストロン性発現が可能になるように、ＩＲＥＳ要素も加えることができる。そのようなベクターは、多くの場合、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)の末端反復配列などを含む。これらのプロモーター−エンハンサーは多くの細胞タイプにおいて活性である。発現には、組織型および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域も使用することができる。典型的なプロモーター／エンハンサー領域には、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(gonadotropic releasing hormone gene control)などの遺伝子に由来するものがあるが、これらに限定されない。発現構築物を持つ細胞を選択し、維持するために、選択可能マーカーを使用することができる。選択可能マーカー遺伝子の例には、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)およびチミジンキナーゼなどがあるが、これらに限定されない。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を発現させる細胞だけを選択するために、メトトレキサートの存在下で発現を行うことができる。ＴＣＲ−ζやＦｃ_εＲＩ−γなどの細胞表面シグナリング分子との融合により、細胞表面上で活性な状態にあるタンパク質の発現を指示することができる。

【0485】

哺乳類発現には、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞およびハムスター細胞など、多くの細胞株を利用することができる。典型的細胞株には、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０(非分泌性)および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８、およびＨＫＢ細胞などがあるが、これらに限定されない。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする無血清培地に適応した細胞株も利用できる。例として、ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012)および無血清ＥＢＮＡ−１細胞株(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-342)が挙げられる。発現量が最大になるように最適化された特別な培地での成長に適応した細胞株も利用できる。例えばＤＧ４４ ＣＨＯ細胞は、動物性産物を含まない合成培地における懸濁培養での成長に適応している。

【0486】

ｅ. 植物
タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)を発現させるために、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を使用することができる。発現構築物は、典型的に、微粒子銃(マイクロprojectile bombardment)やプロトプラストへのＰＥＧによる導入などといった直接的ＤＮＡ導入を使って、またアグロバクテリウムによる形質転換を使って、植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結要素および翻訳制御要素を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技法は、通常は、アラビドプシス(Arabidopsis)やタバコなどの双子葉植物宿主用と、トウモロコシやイネなどの単子葉植物宿主用とに分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターなどがある。形質転換細胞の選択と維持が容易になるように、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能マーカーが、多くの場合、使用される。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)として培養維持するか、全植物体に再生させることができる。トランスジェニック植物細胞には、ヒアルロニダーゼポリペプチドを産生するように工学的に操作された藻類も含めることができる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを持つので、これは、これらの宿主中で生産されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。

【0487】

３. 精製方法
ヒアルロナン結合タンパク質およびヒアルロナン分解酵素ポリペプチド(例えば可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチド)または他のタンパク質を含むポリペプチドを宿主細胞から精製するための方法は、選択した宿主細胞と発現系に依存するだろう。分泌される分子の場合、タンパク質は一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現の場合は、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物やトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に使用する場合は、組織または臓器を、溶解細胞抽出物を作るための出発物質として使用することができる。また、トランスジェニック動物生産には、乳または卵におけるポリペプチドの生産を含めることができ、それらは、収集し、必要であれば、当技術分野における標準的方法を使って、タンパク質を抽出し、さらに精製することができる。

【0488】

タンパク質は、当技術分野において知られる標準的なタンパク質精製技法、例えば限定するわけではないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、およびアニオン交換などのイオン交換クロマトグラフィーなどを使って精製することができる。効率および調製物の純度を改善するためにアフィニティ精製技法を利用することもできる。アフィニティ精製では、例えばヒアルロナン結合タンパク質またはヒアルロニダーゼ酵素を結合する抗体、受容体および他の分子を使用することができる。発現構築物を工学的に操作して、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ_６などのアフィニティタグをタンパク質に付加し、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂を使ってアフィニティ精製することもできる。純度は、当技術分野で知られる任意の方法、例えばゲル電気泳動および染色および分光測光技法などによって評価することができる。ここで提供する精製ｒＨｕＰＨ２０組成物は、典型的に少なくとも７０,０００〜１００,０００単位／mg、例えば、約１２０,０００単位／mgの比活性を有する。比活性は、ポリマーでのような修飾により変わり得る。

【0489】

４. ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドのペグ化
ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)は、主に典型的に非免疫原性である生体適合性、非毒性、水可溶性ポリマーであることを理由として、生体材料、バイオテクノロジーおよび医薬で広く使用されている(Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997)。薬物送達の分野において、ＰＥＧ誘導体は、免疫原性、タンパク質分解および腎クリアランスを下げ、溶解度を上げるためにタンパク質への共有結合付着(すなわち“ペグ化”)で使用されている(Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995)。同様に、ＰＥＧは、低分子量の相対的に疎水性薬物に、溶解度を上げ、毒性を下げ、体内分布を変えるために結合されている。典型的に、ペグ化薬物は溶液として注射される。

【0490】

密接に関連する適用は、分解可能、可溶性薬物担体の設計に使用するのと同じ化学のほとんどが、分解性ゲルの設計にも使用できるため、薬物送達に使用するための架橋分解性ＰＥＧネットワークまたは製剤の合成である(Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993)。高分子内複合体が、２個の相補的ポリマーの溶液の混合により形成できることも知られている。このような複合体は、一般的に関与する複数ポリマー間の静電気的相互作用(ポリアニオン−ポリカチオン)および／または水素結合(ポリ酸−ポリ塩基)および／または水性環境の複数ポリマー間の疎水相互作用により安定である(Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996)。例えば、ポリアクリル酸(ＰＡＡｃ)およびポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)の溶液の適切な条件下での混合は、ほとんど水素結合により複合体形成をもたらす。解生理的条件下でのこれらの複合体の離が遊離薬物(すなわち、非ペグ化)送達に使用されている。さらに、相補的ポリマーの複合体はホモポリマーおよびコポリマーの両者から形成されている。

【0491】

ペグ化のための多数の試薬が当分野で記載されている。このような試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル(ＮＨＳ)活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ_２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファ−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタン酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能性ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−カーボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド、分枝ｍＰＥＧ_２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ“リンカーレス”マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳおよびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳを含むが、これらに限定されない(例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997；Ｕ.Ｓ.５,６７２,６６２；Ｕ.Ｓ.５,９３２,４６２；Ｕ.Ｓ.６,４９５,６５９；Ｕ.Ｓ.６,７３７,５０５；Ｕ.Ｓ。４,００２,５３１；Ｕ.Ｓ。４,１７９,３３７；Ｕ.Ｓ.５,１２２,６１４；Ｕ.Ｓ.５,３２４、８４４；Ｕ.Ｓ.５,４４６,０９０；Ｕ.Ｓ.５,６１２,４６０；Ｕ.Ｓ.５,６４３,５７５；Ｕ.Ｓ.５,７６６,５８１；Ｕ.Ｓ.５,７９５、５６９；Ｕ.Ｓ.５,８０８,０９６；Ｕ.Ｓ.５,９００,４６１；Ｕ.Ｓ.５,９１９,４５５；Ｕ.Ｓ.５,９８５,２６３；Ｕ.Ｓ.５,９９０、２３７；Ｕ.Ｓ.６,１１３,９０６；Ｕ.Ｓ.６,２１４,９６６；Ｕ.Ｓ.６,２５８,３５１；Ｕ.Ｓ.６,３４０,７４２；Ｕ.Ｓ.６,４１３,５０７；Ｕ.Ｓ.６,４２０,３３９；Ｕ.Ｓ.６,４３７,０２５；Ｕ.Ｓ.６,４４８,３６９；Ｕ.Ｓ.６,４６１,８０２；Ｕ.Ｓ.６,８２８,４０１；Ｕ.Ｓ.６,８５８,７３６；Ｕ.Ｓ.２００１／００２１７６３；Ｕ.Ｓ.２００１／００４４５２６；Ｕ.Ｓ.２００１／００４６４８１；Ｕ.Ｓ.２００２／００５２４３０；Ｕ.Ｓ.２００２／００７２５７３；Ｕ.Ｓ.２００２／０１５６０４７；Ｕ.Ｓ.２００３／０１１４６４７；Ｕ.Ｓ.２００３／０１４３５９６；Ｕ.Ｓ.２００３／０１５８３３３；Ｕ.Ｓ.２００３／０２２０４４７；Ｕ.Ｓ.２００４／００１３６３７；ＵＳ２００４／０２３５７３４；ＷＯ０５０００３６０；Ｕ.Ｓ.２００５／０１１４０３７；Ｕ.Ｓ.２００５／０１７１３２８；Ｕ.Ｓ.２００５／０２０９４１６；ＥＰ１０６４９５１；ＥＰ０８２２１９９；ＷＯ０１０７６６４０；ＷＯ０００２０１７；ＷＯ０２４９６７３；ＷＯ９４２８０２４；およびＷＯ０１８７９２５参照)。

【0492】

一例として、ポリエチレングリコールは約３kD〜約５０kD、典型的に約５kD〜約３０kDの範囲の分子量を有する。ＰＥＧの薬物への共有結合付着(“ペグ化”として知られる)は既知化学的合成技術により達成できる。例えば、タンパク質のペグ化は、ＮＨＳ−活性化ＰＥＧとタンパク質の適切な反応条件下での反応により達成できる。

【0493】

多数の反応がペグ化について記載されているが、ほとんど一般的に適応可能であるものは、方向性として、穏やかな反応条件の利用を示し、毒除去のために性触媒または副生成物大規模下流処理を必要としない。例えば、モノメトキシＰＥＧ(ｍＰＥＧ)は１個の反応性末端ヒドロキシルしか有さず、それゆえにその使用は、得られたＰＥＧ−タンパク質生成物混合物の不均一性を幾分制限する。ポリマーの末端メトキシ基と逆の末端のｅヒドロキシル基の活性化が、一般的に効率的タンパク質ペグ化に必要であり、目的は誘導体化ＰＥＧを求核性攻撃に対してより感受性とすることである。攻撃求核試薬は、通常リジル残基のイプシロン−アミノ基であるが、局所条件が望ましいならば、他のアミン類も反応できる(例えばヒスチジンのＮ末端アルファ−アミンまたは環アミン類)。より直接的付着は、単一リシンまたはシステインを含むタンパク質で可能である。後者の残基を、チオール−特異的修飾のためにＰＥＧ−マレイミドにより標的化できる。あるいは、ＰＥＧヒドラジドを過ヨウ素酸酸化ヒアルロナン分解酵素と反応させて、ＮａＣＮＢＨ_３の存在下減少できる。さらに具体的に、ペグ化ＣＭＰ糖類を、適当なグリコシル−トランスフェラーゼ類の存在下でヒアルロナン分解酵素と反応させ得る。一つの方法は、多くの重合体分子を問題のポリペプチドと結合する“ペグ化”である。この方法を使用するとき、免疫系は、抗体形成を担うポリペプチド表面上のエピトープ認識が困難となり、それにより免疫応答が低減する。特定の生理学的効果を与えるためにヒト体内の循環器に直接導入されたポリペプチドについて(すなわち医薬)、典型的潜在的免疫応答はＩｇＧおよび／またはＩｇＭ応答であるが、呼吸器から吸入されたポリペプチド(すなわち産業的ポリペプチド)は潜在的にＩｇＥ応答(すなわちアレルギー性応答)を起し得る。免疫応答減少を説明する一つの理論は、重合体分子が抗体形成に至る免疫応答を担うポリペプチド表面上のエピトープを遮蔽することである。他の理論または少なくとも一部の因子は、コンジュゲートが重いほど、免疫応答が減少することである。

【0494】

典型的に、ペグ化ヒアルロニダーゼ群を含むここで提供されるペグ化ヒアルロナン分解酵素群を製造するために、ＰＥＧ部分を、共有結合付着を介して、ポリペプチドに結合させる。ペグ化の方法は、特定化リンカーおよびカップリング化学(例えば、Roberts, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002参照)、単一結合部位への複数ＰＥＧ分子の付着(例えば、分枝ＰＥＧの使用を介する；例えば、Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002参照)、部位特異的ペグ化および／またはモノ−ペグ化(例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999参照)、および部位特異的酵素ペグ化(例えば、Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002参照)を含むが、これらに限定されない。文献に記載された方法および技術により、一タンパク質分子に結合した１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１０個を超えるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質類が産生される(例えば、Ｕ.Ｓ.２００６／０１０４９６８参照)。

【0495】

ペグ化ヒアルロニダーゼ群のようなペグ化ヒアルロナン分解酵素群の製造方法の説明の例として、ＰＥＧアルデヒド類、スクシンイミド類およびカーボネート類が、各々ＰＥＧ部分、典型的にスクシンイミジルＰＥＧｓをｒＨｕＰＨ２０に結合するために適用されている。例えば、ｒＨｕＰＨ２０は、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート類(ｍＰＥＧ−ＳＰＡ)、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート類(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ)および(“分枝”ＰＥＧｓ結合のために)ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドを含む例示的スクシンイミジルモノＰＥＧ(ｍＰＥＧ)試薬と結合されている。これらのペグ化スクシンイミジルエステル類は、ＰＥＧ基と活性化クロスリンカーの間に種々の長さの炭素骨格を有し、単一または分枝ＰＥＧ基である。これらの差異を使用して、例えば、結合工程中のｒＨｕＰＨ２０へのＰＥＧ付着に利用可能な異なる反応動力学および潜在的制限部位を提供できる。

【0496】

直鎖または分枝鎖ＰＥＧｓを含むスクシンイミジルＰＥＧｓ(上記)をｒＨｕＰＨ２０と結合できる。ＰＥＧｓを使用して、平均してヒアルロニダーゼあたり約３〜６または３〜６ＰＥＧ分子を有する分子を含むｒＨｕＰＨ２０ｓを再現性よく産生できる。このようなペグ化ｒＨｕＰＨ２０組成物は、容易に精製して約２５,０００または３０,０００単位／mgタンパク質ヒアルロニダーゼ活性の比活性を有する組成物を得られ、実質的に非ペグ化ｒＨｕＰＨ２０が存在しない(多くても５％非ペグ化)。

【0497】

種々のＰＥＧ試薬を使用して、例示したヒアルロナン分解酵素群、特に可溶性ヒト組み換えヒアルロニダーゼ群(例えばｒＨｕＰＨ２０)を、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ(３０kD)、ｍＰＥＧ−ＳＭＢ(３０kD)およびｍＰＥＧ２−ＮＨＳ(４０kD)およびｍＰＥＧ２−ＮＨＳ(６０kD)に基づく分枝変異体を使用して製造できる。ｒＨｕＰＨ２０のペグ化型は、ＮＨＳ化学を使用して、ならびにカーボネート類およびアルデヒド類は各々試薬を使用して製造できる：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ−４０Ｋ分枝、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−１０Ｋ分枝、ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−２０Ｋ分枝、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ−６０Ｋ分枝；ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−５Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−２０Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ；ｍＰＥＧ−ＳＭＢ−２０Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＭＢ−３０Ｋ；ｍＰＥＧ−ｂｕｔｙｒアルデヒド；ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−２０Ｋ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−３０Ｋ；およびＰＥＧ−ＮＨＳ−５Ｋ−ビオチン。ペグ化ヒアルロニダーゼ群はまた、Dowpharmaのｐ−ニトロフェニル−カーボネートＰＥＧ(３０kDa)およびプロピオンアルデヒドＰＥＧ(３０kDa)でのヒアルロニダーゼ群ペグ化を含む、Dow Chemical Corporationの一部であるDowpharmaから入手可能なＰＥＧ試薬を使用しても製造されている。

【0498】

一例として、ペグ化は、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ(約３０kDaの分子量を有する)またはＰＥＧブタン酸誘導体の他のスクシンイミジルエステル類の可溶性ヒアルロニダーゼへの結合を含む。ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫのようなＰＥＧブタン酸誘導体のスクシンイミジルエステル類は、タンパク質のアミノ基に容易に結合する。例えば、ｍ−ＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫおよびｒＨｕＰＨ２０(約６０KDaサイズ)の共有結合的結合は、下記スキーム１に示すとおりｒＨｕＰＨ２０とｍＰＥＧの安定なアミド結合を提供する。

【化2】

【0499】

典型的に、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋまたは他のＰＥＧを、ヒアルロナン分解酵素、ある場合にはヒアルロニダーゼに、ＰＥＧ：ポリペプチドモル比１０：１で、適切な緩衝液、例えばｐＨ６.８の１３０mM ＮａＣｌ／１０mM ＨＥＰＥＳまたは７０mMリン酸緩衝液、ｐＨ７中で添加し、続いて滅菌、例えば無菌濾過し、例えば、一夜、４℃の冷室で、撹拌しながら、結合を続ける。一例として、結合ＰＥＧ−ヒアルロナン分解酵素を濃縮し、緩衝液交換する。

【0500】

ＭＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫのようなＰＥＧブタン酸誘導体のスクシンイミジルエステル類をカップリングする他の方法は当分野で知られる(例えば、Ｕ.Ｓ.５,６７２,６６２；Ｕ.Ｓ.６,７３７,５０５；およびＵ.Ｓ.２００４／０２３５７３４参照)。例えば、ヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロニダーゼ)のようなポリペプチドを、ＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体と、ホウ酸緩衝液(０.１Ｍ、ｐＨ８.０)中、１時間、４℃で反応させることによりカップリングできる。得られたペグ化タンパク質を限外濾過により精製できる。あるいは、ウシアルカリホスファターゼのペグ化を、ホスファターゼとｍＰＥＧ−ＳＢＡを、０.２Ｍリン酸ナトリウムおよび０.５Ｍ ＮａＣｌ(ｐＨ７.５)含有緩衝液中、４℃で３０分間混合することにより達成できる。未反応ＰＥＧを限外濾過により除去できる。他の方法は、ポリペプチドとｍＰＥＧ−ＳＢＡを、脱イオン水中で反応させ、そこにトリエチルアミンをｐＨを７.２〜９に上げるために添加する。得られた混合物を室温で数時間撹拌して、ペグ化を完了させる。

【0501】

例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ群および細菌ヒアルロナン分解酵素群を含むヒアルロナン分解ポリペプチドのペグ化方法は当業者に知られる。例えば、ウシ精巣ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチンＡＢＣリアーゼのペグ化を記載する欧州特許番号ＥＰ０４００４７２参照。また、米国公開番号２００６０１４９６８は、ヒトＰＨ２０由来ヒトヒアルロニダーゼのペグ化を記載する。例えば、ペグ化ヒアルロナン分解酵素は、一般的に分子あたり少なくとも３個のＰＥＧ部分を含む。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、５：１〜９：１、例えば、７：１のＰＥＧ対タンパク質モル比であり得る。

【0502】

Ｇ. 抗ヒアルロナン剤の活性評価および効果モニタリングの方法
抗ヒアルロナン剤、例えばヒのようなアルロニダーゼまたは修飾ヒアルロニダーゼ(例えばＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０)ヒアルロナン分解酵素群は、単独でまたはヒアルロナン関連疾患および状態、特に癌の処置のための化学療法剤のような第二剤と組み合わせて治療剤である(例えば、ＵＳ２０１０／０００３２３８およびＷＯ０９／１２８９１７参照)。さらに、本明細書のいずれかに記載するとおり、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素での治療は、ペグ化ヒアルロニダーゼの全身性、例えば筋骨格副作用を最小化するためにコルチコステロイドでの処置を伴い得る。ここで提供するＴＳＧ−６−ＬＭまたはＴＳＧ−６−ＬＭ：Ｆｃまたはその変異体のようなＨＡＢＰコンパニオン診断を、癌のようなヒアルロナン関連疾患または障害の処置に使用する抗ヒアルロナン剤治療、例えばヒアルロナン分解酵素治療と組み合わせて、該薬物(例えばヒアルロナン分解酵素)に対する応答性および処置効果をモニタリングできる。さらに、補助剤または補足方法もまた、単独またがコルチコステロイドとの組み合わせ処置における抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素群)の効果の評価に利用できる。コルチコステロイドによる副作用改善の評価、ならびにヒアルロナン分解酵素治療を含む抗ヒアルロナン剤治療の効果、耐容性および薬物動態試験は当業者のレベルの範囲内である。このセクションは、ヒアルロナン分解酵素治療の効果、応答性、耐容性および／または薬物動態の評価に使用できる補助剤または補足方法を説明する。

【0503】

１. 副作用評価方法
インビボアッセイは、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素または全身性半減期延長を示すように修飾したヒアルロニダーゼ(例えばＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０)が原因であり得る筋骨格副作用の改善または除去に対するコルチコステロイドの効果の評価に使用できる。評価し得る副作用は、例えば、筋肉および関節痛、上肢および下肢硬直、筋痙攣、筋炎、筋肉ひりひり感および全身の圧痛、脱力、疲労および／または膝または肘関節可動域減少を含み得る。副作用を評価するためのアッセイは、動物が運動減少、行動または姿勢変化、Ｘ線検査知見、組織病理学的変化および他の顕著な臨床的観察について観察できるものである、動物モデルを含み得る。他のアッセイは、患者に症状に関して質問し、理学的検査、造影(例えばＭＲＩまたはＰＥＴによる)または放射線学的評価により評価できる、ヒト対象における臨床試験であり得る。抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素剤)の投与が原因の副作用の改善は、コルチコステロイド存在下で、それが不在のときと比較して副作用が寛解し、除かれ、軽減しまたは減少したとき観察される。

【0504】

このような例において、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)および／またはコルチコステロイドの投与量は、活性を達成するのに必要であるが、副作用を改善する最適または最小投与量を同定するために変わり得る。このような試験は当業者のレベルの範囲内である。さらに、投与量レジメは変わり得る。例えば、試験は、ヒアルロナン分解酵素の月に１回、隔週、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回以上の投与スケジュールを使用して実施できる。さらに、コルチコステロイドを、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の投与前、同時および／または後に投与してよい。

【0505】

例えば、インビボ動物モデルを利用して、デキサメサゾンのようなコルチコステロイドが、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)投与と関連する副作用を寛解するまたはなくす能力を評価できる。動物モデルは、カニクイザルまたはアカゲザルのような非ヒト霊長類、イヌ、例えばビーグル犬または抗ヒアルロナン剤(例えばペグ化ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素、例えばＰＥＧＰＨ２０)処置での処置に応答して有害副作用を他の動物を含み得る。動物モデルに、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)をコルチコステロイド存在下または非存在下に投与し、筋骨格効果を観察または測定し得る。

【0506】

観察可能または測定可能な筋骨格事象が可能な例えば、カニクイザル、ビーグルまたは他の類似の動物モデルのような動物を、コルチコステロイド存在下または非存在下ヒアルロナン分解酵素で処置する。一例として、一群の動物、例えばカニクイザルまたはビーグルにヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤単独、例えばペグ化ヒアルロニダーゼを、静脈内投与によるように投与する。例えば、投与は１週間に２回であり得る。膝および肘関節で肢関節可動域に変化が見られるまでまたは硬直または運動減少が見られるまで処置を津図ける。次いで、他の群の動物を、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)およびコルチコステロイド投与により、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)投与と同日のデキサメサゾンまたは他のコルチコステロイドの経口投与によるように処置する。これらの群の動物を、次いで、例えば、当業者に知られた関節可動域または他の運動減少、関節の病理組織学、硬直についての触診または造影の理学的検査を介して比較して、デキサメサゾンのようなコルチコステロイドが、ヒアルロナン分解酵素仲介のような抗ヒアルロナン剤仲介筋骨格副作用を寛解する能力を評価し得る。デキサメサゾンのようなコルチコステロイドの投与量、投与頻度、投与経路および投与のタイミングは、コルチコステロイドの有効性を最適化するために変化し得る。

【0507】

他の例において、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)投与と関連する有害副作用の改善または除去に対するデキサメサゾンのようなコルチコステロイドの効果を、固形腫瘍を有するヒト患者で評価し得る。例えばヒト患者に、筋肉および関節痛／上肢および下肢硬直、筋痙攣、筋肉、筋炎筋肉ひりひり感および全身の圧痛、脱力および疲労の一つ以上を含むが、これらに限定されない抗ヒアルロナン剤仲介(例えばヒアルロナン分解酵素仲介)有害事象の寛解および／または除去する能力を試験するためにコルチコステロイドを投与し得る。患者は、デキサメサゾンのようなコルチコステロイドの共処置有りまたは無しで抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)で処置し得る。抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)投与中および後、両処置群の副作を評価できる。医師は、例えば、患者愁訴、バイタルサイン、体重変化、１２−リードＥＣＧ、心エコー図、臨床化学または造影(ＭＲＩ、ＰＥＴまたは放射線学的評価)を含む対象の理学的検査により症状の重症度を決定できる。症状の重症度を、次に、ＮＣＩ有害事象共通用語規準(ＣＴＣＡＥ)等級付けシステムを使用して定量できる。ＣＴＣＡＥは、有害事象(ＡＥ)報告にしようする記述用語である。等級付け(重症度)スケールは各ＡＥ用語について提供される。ＣＴＣＡＥは、次の一般的ガイドラインに基づく各有害事象の重症度についての臨床的説明により、グレード１〜５を示す：グレード１(軽度ＡＥ)；グレード２(中程度ＡＥ)；グレード３(重度ＡＥ)；グレード４(生命を脅かすまたは無力にするＡＥ)；およびグレード５(ＡＥと関連する死)。コルチコステロイドが抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)投与と関連する有害副作用を寛解する能力は、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)およびコルチコステロイドで処置されている対象におけるＣＴＣＡＥスケールの１個以上の有害副作用の等級付けまたは重症度の、同じ抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)単独で処置されている対象と比較した減少により毒低でき、すなわち、副作用の重症度は、グレード３からグレード１またはグレード２に減少する。

【0508】

他の例において、ヒト患者に抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の投与量を増加させながら投与して耐容性を評価し、副作用の重症度による指標として用量規制毒性を評価し得る。このような例において、コルチコステロイドのような寛解剤存在下で耐容できる抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の最大耐量を決定できる。処置レジメンは、患者は同じ投与量レベルのコルチコステロイドでヒアルロナン分解酵素の投与量を上げていく、投与量漸増を含み得る。患者は、副作用がもはや耐容性ではなくなる前にコルチコステロイドと併用できるヒアルロナン分解酵素の最高投与量について決定するために有害事象をモニターできる。耐容性は、処置中および後に現れる症状の重症度に基づき測定できる。抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の投与量を、有害効果が予め決定したレベル、例えば、グレード３に到達するまで増加してよい。投与レジメンはまたコルチコステロイドの継続的必要性および生じる副作用に関する抗ヒアルロナン剤の蓄積の可能性を試験するために、コルチコステロイドの量のテーパリングも含み得る。

【0509】

２. 抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素活性)の活性と関連するバイオマーカーの評価
ここに記載するとおり、ＨＡ表現型の程度およびレベルは、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の効果および活性と関連および相関するバイオマーカーである。例えば、進行固形腫瘍のような腫瘍を有する癌患者において、腫瘍および間質関連のＨＡレベルの低下は、投与したヒアルロナン分解酵素活性のバイオマーカーである。本明細書のいずれかに記載するとおり、組織(例えば腫瘍生検)または体液(例えば血漿)に存在するＨＡを検出するためのＨＡＢＰ結合アッセイは、抗ヒアルロナン(例えばヒアルロナン分解酵素)の治療効果を評価およびモニターするために実施できる。

【0510】

さらに、アッセイは、ヒアルロナン阻害または分解活性に対する抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)の効果をさらに評価するために、組織(例えば腫瘍生検)または体液(例えば血漿)中のＨＡの検出に使用するＨＡＢＰアッセイと独立してまたは組み合わせて実施できる。特に、癌のようなヒアルロナン関連疾患または状態の処置について、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロナン分解酵素活性の活性と関連する臨床的指標またはバイオマーカー関連は、腫瘍代謝活性減少、見かけの拡散増加および腫瘍灌流亢進および／またはＨＡ異化産物増加を含むが、これらに限定されない。このようなバイオマーカーを測定するさらなるアッセイは、血液または尿中のヒアルロナン異化産物の測定、血漿中のヒアルロニダーゼ活性測定または腫瘍中の間質性流体圧、血管体積または水含量の測定を含むが、これらに限定されない。このようなアッセイを実施するのは当業者のレベルの範囲内である。

【0511】

これらのアッセイは、ヒアルロナン分解酵素で処置された動物モデルまたはヒト患者で実施できる。例えば、ヒアルロナン関連疾患、障害または状態の動物モデルを使用して、抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素または半減期延長のために修飾したヒアルロニダーゼ(例えばＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０)の投与のインビボでの影響を評価し得る。化学療法剤のような他の薬物も本活性評価に包含してよい。適当な動物モデルを使用できるヒアルロナン関連疾患の例は、固形腫瘍、例えば、末期癌、転移癌、未分化癌、卵巣癌、上皮内癌(ＩＳＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)、前立腺癌、膵癌、非小細胞性肺癌、乳癌、結腸癌および他の癌を含む。またヒアルロナン関連疾患および障害の例は、炎症性疾患、ディスク圧、癌および浮腫、例えば、臓器移植、卒中、脳外傷または他の傷害が原因の浮腫である。

【0512】

動物モデルは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルのような非ヒト霊長類モデルを含むが、これらに限定されないものであり得る。ある例において、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスのような免疫欠損マウスに、ヒアルロナン関連癌からの腫瘍細胞株を移植し、該癌の動物モデルを確立する。ヒアルロナン関連癌由来の細胞株の例は、ＰＣ３前立腺癌細胞、BxPC-3膵腺癌細胞、MDA-MB-231乳癌細胞、MCF-7乳房腫瘍細胞、BT474乳房腫瘍細胞、Tramp C2前立腺腫瘍細胞およびMat-LyLu前立腺癌細胞およびここにヒアルロナン関連である、例えば増加したレベルのヒアルロナンを含むと記載されている他の細胞株を含むが、これらに限定されない。次いで、ヒアルロナン分解酵素のような抗ヒアルロナン剤を、例えば、ヒアルロナンレベルまたは含量の測定により、抗ヒアルロナン活性に対するコルチコステロイドの影響を評価するために、デキサメサゾンのようなコルチコステロイドと共にまたは無しで動物に投与してよい。ヒアルロナン含量は、ヒアルロナンについて腫瘍組織サンプルを染色することによりまたは血漿中の可溶性ヒアルロナンレベルを測定することにより測定できる。抗ヒアルロナン活性の他の測定は、腫瘍体積、ハローの形成またはサイズ、間質性流体圧、水含量および／または血管体積の評価を含む。

【0513】

他の例において、ビーグル犬のようなイヌを、デキサメサゾンのようなコルチコステロイド存在下または非存在下で抗ヒアルロナン剤で処置し得る。皮膚または骨格筋組織のような組織を組織診し、ヒアルロナンについて染色し、目視により評価する。次いで、抗ヒアルロナン剤単独で処置した動物の組織を、抗ヒアルロナン活性に対するコルチコステロイドの影響を測定するために抗ヒアルロナン剤およびコルチコステロイドで処置した動物由来の組織と比較する。

【0514】

ヒアルロナン分解酵素活性のような抗ヒアルロナン剤の活性のアッセイはヒト対象でも実施し得る。例えば、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)活性と関連するバイオマーカーを測定するためのアッセイを、ヒアルロナン関連疾患または状態(例えば癌)を有することが知られているまたは有することが疑われ、ヒアルロナン分解酵素(例えばＰＥＧＰＨ２０)で処置されているヒト対象で実施し得る。

【0515】

ａ. ヒアルロナン分解酵素の活性を評価するためのアッセイ
ヒアルロナン分解酵素の活性は当技術分野で周知の方法を使って評価することができる。例えば、ヒアルロニダーゼに関するUSP XXIIアッセイでは、酵素をＨＡと３７℃で３０分間反応させた後に残存する未分解ヒアルロン酸またはヒアルロナン(ＨＡ)基質の量を測定することにより、活性が間接的に決定される(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD)。アッセイでは、ヒアルロニダーゼ参照標準(ＵＳＰ)または国民医薬品集(National Formulary)(ＮＦ)標準ヒアルロニダーゼ溶液を使って、任意のヒアルロニダーゼの活性を単位数として確認することができる。ある例では微小濁度アッセイを使って活性を測定する。これはヒアルロン酸が血清アルブミンと結合した時に起こる不溶性沈殿物の形成に基づく。活性は、ヒアルロニダーゼまたはヒアルロニダーゼを含むサンプルをヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)と共に設定された時間(例えば１０分間)インキュベートした後、酸性化血清アルブミンを添加して未消化のヒアルロン酸ナトリウムを沈殿させることによって測定される。得られたサンプルの濁度をさらなる発現期間後に６４０ｎｍで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性に起因する濁度の低下が、ヒアルロニダーゼ酵素活性の尺度である。

【0516】

もう一つの例では、ヒアルロニダーゼまたはヒアルロニダーゼを含むサンプル、例えば、血液または血漿と共にインキュベートした後に残存ビオチン化ヒアルロン酸を測定するマイクロタイターアッセイを使って、ヒアルロニダーゼ活性が測定される(例えばFrost and Stern (1997) Anal.Biochem. 251:263-269、米国特許出願公開第２００５０２６０１８６号参照)。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基をビオチン化し、そのビオチン化ヒアルロン酸基質をマイクロタイタープレートに共有結合させる。ヒアルロニダーゼと共にインキュベートした後、アビジン−ペルオキシダーゼ反応を使って残存ビオチン化ヒアルロン酸基質を検出し、既知の活性を持つヒアルロニダーゼ標品による反応後に得られるものと比較する。ヒアルロニダーゼ活性を測定するための他のアッセイも当技術分野では知られており、本発明の方法において使用することができる(例えばDelpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263参照)。

【0517】

例えば化学療法剤のための、展着剤または拡散剤として作用する修飾可溶性ヒアルロニダーゼ(例えばペグ化ＰＨ２０)のようなヒアルロナン分解酵素の活性も評価できる。例えば、トリパンブルー色素を、ヌードマウスの左右の外側皮膚に、ヒアルロナン分解酵素と共にまたは伴わず、皮下または皮内のように注射し得る。次いで、染色面積を、マイクロキャリパーでのより測定して、展着剤として作用するヒアルロナン分解酵素の能力を決定する(例えば米国公開特許番号２００６０１０４９６８参照)。

【0518】

ｂ. ＨＡ異化産物の測定
他の例において、血液および尿を、患者の処置中の種々の時点で採取し、ヒアルロナンの異化産物についてアッセイし得る。異化産物の存在はヒアルロナン分解の指標であり、それゆえにヒアルロニダーゼ活性を測定する。血漿酵素もまた投与後経時的に評価し、測定し得る。例えば、ＨＡ−二糖分解生成物であるＨＡ異化産物を、サッカライドピーク面積の分離および測定のために高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を使用して評価できる。実施例１５はこのアッセイの例である。

【0519】

ｃ. 腫瘍代謝活性
腫瘍代謝活性の減少は、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)活性と関連する。腫瘍代謝活性を、当分野で知られた標準的方法を使用して評価し得る。例えば、[１８Ｆ]−フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影法(ＦＤＧ−ＰＥＴ)を使用できる。ＰＥＴは、画像および灌流、細胞生存能、増殖および／または組織の代謝活性の定量的パラメータを提供する非侵襲性診断である。画像は、陽電子放出放射性同位体で標識した種々の生物学的物質(例えば糖類、アミノ酸、代謝前駆体、ホルモン)に由来する。例えば、ＦＤＧはグルコースの類似体であり、正常グルコース経路の第一段階として生存細胞に取り込まれる。癌において、解糖活性が増加しており、癌細胞におけるＦＤＧの捕捉がもたらされる。ＦＤＧ捕捉の減少は、腫瘍代謝活性の減少および抗腫瘍原性活性と相関する。ＰＥＴ造影のガイドラインは当業者に知られており、全ての処置医または技術者は従わなければならない。

【0520】

ｄ. 見かけの拡散増加および腫瘍灌流亢進
抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)活性を評価するさらなる方法は、組織中の水拡散を評価するアッセイを含む。本明細書のいずれかの場所に記載するとおり、ヒアルロナンを蓄積する組織は、付随する水蓄積により、正常組織よりも一般的に間質性流体圧が高い。それゆえに、腫瘍のようなＨＡを蓄積する組織は高間質性流体圧を有し、これは、当分野で知られる種々の方法により測定できる。例えば、ＡＤＣＭＲＩまたはＤＣＥＭＲＩのような拡散ＭＲＩを使用できる。水の拡散をこれらの方法で評価し、固形腫瘍のようなヒアルロナン富組織の存在と直接的に評価させ得る(例えばChenevert et al. (1997) Clinical Cancer Research, 3:1457-1466参照)。例えば、ヒアルロナンを蓄積する腫瘍は、灌流の増加のために、ＡＤＣＭＲＩまたはＤＣＥＭＲＩで識別可能に増加する。このようなアッセイをヒアルロナン分解酵素の存在下および非存在下で実施し、結果を比較し得る。拡散を測定する方法は、このような治療後の細胞変化の評価に有用な測定である。

【0521】

３. 腫瘍サイズおよび体積
抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素群)活性は、腫瘍サイズおよび／または体積の減少と関連する。腫瘍サイズおよび体積を、当業者に知られた技術に基づきモニターできる。例えば、腫瘍サイズおよび体積をＸ線検査、超音波造影、検死、ノギスの使用、マイクロＣＴまたは^１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴによりモニターできる。腫瘍サイズはまた目視により評価できる。具体例において、腫瘍サイズ(直径)をノギスを使用して直接測定する。

【0522】

他の例において、腫瘍体積を、ノギスまたは超音波評価により得られた腫瘍直径(Ｄ)の測定値の平均を使用して測定できる。例えば、腫瘍体積は、VisualSonics Vevo 770高解像度超音波または他の類似の超音波を使用して決定できる。体積を、式Ｖ＝Ｄ^３×π／６(ノギスを使用して測定する直径について)またはＶ＝Ｄ^２×ｄ×π／６(超音波を使用して測定する直径について、ｄは深さまたは厚さである)から決定できる。例えば、ノギス測定は腫瘍長(ｌ)および幅(ｗ)から成り、腫瘍体積を長さ×幅^２×０.５２として計算し得る。他の例において、マイクロＣＴ走査を使用して腫瘍体積を測定できる(例えばHuang et al. (2009) PNAS, 106:3426-3430参照)。一例として、マウスにOptiray Pharmacyイオベルソール注射７４％造影剤(例えば７４１mgのイオベルソール／mL)を注射し、マウスを麻酔し、ＣＴ走査を、MicroCat 1Aスキャナーまたは他の類似のスキャナー(例えばIMTek)(４０kV、６００μA、１９６回転ステップ、全回転角度＝１９６)を使用して実施し得る。画像を、ソフトウェア(例えばRVA3ソフトウェアプログラム；IMTek)を使用して再構築する。腫瘍体積を、利用可能なソフトウェア(例えばAmira 3.1ソフトウェア；Mercury Computer Systems)を使用して決定できる。腫瘍体積またはサイズはまた腫瘍の重量に基づいて決定することもできる。

【0523】

腫瘍増殖阻害パーセントを、次の式を使用して体積に基づき計算できる：％ＴＧＩ＝[１−(Ｔ_ｎ−Ｔ_０)÷(Ｃ_ｎ−Ｃ_０)]×１００％(式中、“Ｔ_ｎ”は、ヒアルロナン分解酵素最終投与から“ｎ”日後の処置群の平均腫瘍体積であり；“Ｔ_０”はその処置群の処置前０日の平均腫瘍体積であり；“Ｃ_ｎ”は“ｎ”日の対応する対照群の平均腫瘍体積であり；“Ｃ_０”は対照群の処置前０日の平均腫瘍体積である)。腫瘍体積の統計学的分析により決定できる。

【0524】

４. 薬物動態および薬力学的アッセイ
薬物動態または薬力学的試験を、動物モデルを使用して実施してよくまたは抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素または修飾ヒアルロニダーゼ(例えばＰＥＧＰＨ２０)の薬物動態特性を評価するための患者の試験中に実施してよい。動物モデルは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルのような非ヒト霊長類モデルを含むが、これらに限定されない。ある例においては、薬物動態または薬力学的試験は健常動物を使用して実施する。他の例において、試験は、あらゆるヒアルロナン関連疾患または障害の動物モデル、例えば腫瘍モデルのようなヒアルロナンでの治療が考慮される疾患の動物モデルを使用して実施する。

【0525】

抗ヒアルロナン剤(例えば修飾ヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素)の薬物動態特性を、投与後の最大(ピーク)濃度(Ｃ_ｍａｘ)、ピーク時間(すなわち最高濃度になるとき；Ｔ_ｍａｘ)、最小濃度(すなわち投与間の最小濃度；Ｃ_ｍｉｎ)、排出半減期(Ｔ_１／２)および曲線下面積(すなわち時間対濃度のプロットにより作成した曲線下面積；ＡＵＣ)のようなパラメータの測定により評価できる。薬物または酵素(例えばヒアルロニダーゼ)の絶対的バイオアベイラビリティは、皮下送達後の曲線下面積(ＡＵＣ_ｓｃ)と静脈内送達後のＡＵＣ(ＡＵＣ_iv)の比較により決定できる。絶対的バイオアベイラビリティ(Ｆ)は、式：Ｆ＝([ＡＵＣ]_ｓｃ×投与量_ｃ)／([ＡＵＣ]_iv×投与量_iv)を使用して計算できる。一定範囲の投与量および異なる投与頻度を薬物動態試験で用い、投与における抗ヒアルロナン剤、例えばヒアルロニダーゼのようなヒアルロナン分解酵素または修飾ヒアルロニダーゼ(例えばペグ化ＰＨ２０)の濃度増加または減少の影響を評価し得る。

【0526】

Ｈ. キットおよび製品
ここに提供されるのは、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置について患者を選択するために、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置の効果を予測するために、ＨＡ関連疾患を有する患者の予後を決定するためにまたはＨＡ関連疾患、特に癌の処置について抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置の効果をモニタリングするために使用するキットである。ここで提供するキットは、サンプル中のヒアルロナンの検出および定量のためのここで提供されるＨＡＢＰ試薬および所望により該方法を実施するための試薬を含む。例えば、キットは、さらに、抗体、緩衝液、酵素染色のための基質、色素原のような検出試薬またはスライド、容器、マイクロタイタープレートのような他の材料および所望により、方法を実施するための指示を含むが、これらに限定されない、組織の採取、組織の調製および処理のための試薬ならびにサンプル中のＨＡの量を定量するための試薬を含み得る。当業者は、種々の物質の接触に使用できる他の可能な容器およびプレートおよび試薬を認識する。キットはまた試験サンプルの比較および分類のための種々のＨＡのレベルまたはＨＡ含量染色についての参照サンプルの組織を表す対照サンプルも含み得る。提供されるＨＡＢＰ診断は凍結乾燥または診断剤の他の安定な製剤で提供され得る。いくつかの例において、キットは、アッセイ検出のための自動化細胞造影システム(ＡＣＩＳ)蛍光光度計、ルミノメーターまたは分光光度計のような装置を含む。

【0527】

また提供されるのは、提供される改善されたＨＡＢＰ試薬を含むここで提供されるＨＡＢＰ試薬およびヒアルロナン分解酵素の組み合わせである。ここに記載するとおり、ＨＡＢＰ類は、ヒアルロナン分解酵素での処置のコンパニオン診断剤として用いることができる。このような組み合わせは、所望により抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置について患者の選択に使用するためおよびこのような患者の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置のため、患者の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置の効果を予測するためおよびこのような患者の抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置のため、ＨＡ関連疾患を有する患者の予後診断を決定するためおよびこのような患者を抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)で処置するためまたはＨＡ関連疾患、特に癌の処置について抗ヒアルロナン分解酵素(例えばヒアルロナン分解酵素)での患者の処置効果をモニタリングするためおよび処置効果に基づきこのような患者を抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)で処置するためのキットとして包装され得る。キットとして包装され得る組み合わせは、抗癌剤のような治療のための１種以上の付加的薬物または抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)での処置と関連する筋骨格副作用の処置のためのコルチコステロイドを含む治療の副作用の処置のための１種以上の付加的薬物を含み得る。キットは、抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)または１種以上の付加的治療剤のための包装材を含み得る。例えば、キットは、単腔および二腔容器を含む容器を含み得る。容器は、チューブ、ビンおよびシリンジを含むが、これらに限定されない。容器は、さらに皮下投与用針のような投与のための物質を含み得る。抗ヒアルロナン剤(例えばヒアルロナン分解酵素)または１種以上の付加的治療剤を一緒にまたは別々に提供し得る。キットは、所望により、投与量、投与レジメンを含む投与の指示および投与方法の指示を含み得る。

【0528】

ここで提供するキットはまた、例えば、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、アルファ−フェトプロテイン(ＡＦＰ)、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ＨＣＧ)、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、ＣＡ２７.２９、ＣＹＦＲＡ ２１−２、ＬＡＳＡ−Ｐ、ＣＡ１５−３、ＴＰＡ、Ｓ−１００およびＣＡ−１２５を含むが、これらに限定されない、例えば１個以上の付加的癌マーカーのようなサンプルの１個以上の付加的タンパク質の発現またはコード化ＲＮＡを検出するための試薬を含み得る。

【0529】

Ｉ. 実施例
以下に掲載する実施例は例示を目的とし、本発明の範囲を限定しようとするものではない。

【0530】

実施例１
ｒＨｕＰＨ２０発現細胞株
Ａ. 最初の可溶性ｒＨｕＰＨ２０発現細胞株の産生
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞をＨＺ２４プラスミド(配列番号５２に示す)でトランスフェクトした。可溶性ｒＨｕＰＨ２０を発現させるためのＨＺ２４プラスミドベクターは、ｐＣＩベクターバックボーン(Promega)、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸１〜４８２をコードするＤＮＡ(配列番号４９)、ＥＣＭＶウイルス由来の配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)(Clontech)、およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子を含有する。ｐＣＩベクターバックボーンは、ベータ−ラクタマーゼ耐性遺伝子(ＡｍｐＲ)をコードするＤＮＡ、ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー／プロモーター領域(ＣＭＶ)、キメライントロン、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル(ＳＶ４０)も含んでいる。可溶性ｒＨｕＰＨ２０構築物をコードするＤＮＡは、ヒトＰＨ２０のネイティブ３５アミノ酸シグナル配列のアミノ酸位置１のメチオニンをコードするＤＮＡの前にＮｈｅＩ部位とコザックコンセンサス配列とを含有し、配列番号１に記載のヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸位置４８２に対応するチロシンをコードするＤＮＡの後に停止コドンを含有し、その後ろに、ＢａｍＨＩ制限部位が続いている。したがって、構築物ｐＣＩ−ＰＨ２０−ＩＲＥＳ−ＤＨＦＲ−ＳＶ４０ｐａ(ＨＺ２４)は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される単一のｍＲＮＡ種であって、配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)によって分離された、ヒトＰＨ２０のアミノ酸１〜４８２(配列番号３に記載)とマウスジヒドロ葉酸レダクターゼのアミノ酸１〜１８６(配列番号５３に記載)とをコードするものをもたらす。

【0531】

トランスフェクションの準備として、４mMのグルタミンおよび１８ml／Ｌ Plurionic Ｆ６８／Ｌ(Gibco)を補足したＤＨＦＲ(−)細胞用のGIBCO変法ＣＤ−ＣＨＯ培地で成長させた非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、０.５×１０^６細胞／mlの密度でシェーカーフラスコに播種した。細胞を湿潤インキュベータ中、５％ＣＯ_２下、３７℃において、１２０rpmで振とうしながら成長させた。トランスフェクションに先立ち、対数増殖期の非トランスフェクトＣＨＯ細胞を、生存能について調べた。

【0532】

非トランスフェクトＣＨＯ細胞培養の生細胞６千万個をペレット化し、２×トランスフェクションバッファー(２×ＨｅＢＳ：４０mMのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.０、２７４mMのＮａＣｌ、１０mMのＫＣｌ、１.４mMのＮａ_２ＨＰＯ_４、１２mMのデキストロース)０.７mLに、２×１０^７細胞の密度で再懸濁した。再懸濁した細胞の各アリコートに、０.０９mL(２５０μg)の線状ＨＺ２４プラスミド(ＣｌａＩ(New England Biolabs)で終夜消化することによって線状化したもの)を加え、その細胞／ＤＮＡ溶液を、室温で、間隙０.４cmのＢＴＸ(Gentronics)エレクトロポレーションキュベットに移した。陰性対照エレクトロポレーションは、プラスミドＤＮＡを細胞と混合せずに行った。細胞／プラスミド混合物を、３３０Ｖおよび９６０μFまたは３５０Ｖおよび９６０μFのコンデンサ放電でエレクトポレートした。

【0533】

細胞をエレクトロポレーション後のキュベットから取り出して、４mMのグルタミンおよび１８ml／Ｌ Pluronic Ｆ６８／Ｌ(Gibco)を補足した５mLのＤＨＦＲ(−)細胞用変法ＣＤ−ＣＨＯ培地に移し、湿潤インキュベータ中、５％ＣＯ_２下、３７℃において、選択圧を加えずに、６穴組織培養プレートのウェルで２日間成長させた。

【0534】

エレクトロポレーションの２日後に、０.５mLの組織培養培地を各ウェルから取り出し、実施例３に記載の微小濁度アッセイを使って、ヒアルロニダーゼ活性の存在について試験した。最高レベルのヒアルロニダーゼ活性を発現する細胞を組織培養ウェルから集め、計数し、１mLあたり１×１０^４〜２×１０^４個の生細胞になるように希釈した。５枚の９６穴丸底組織培養プレートの各ウェルに、細胞懸濁液を０.１mLずつ移した。４mM GlutaMAX(商標)−１補助剤(GIBCO(商標)、Invitrogen Corporation)を含有しヒポキサンチンおよびチミジン補助剤を含有しないＣＤ−ＣＨＯ培地(GIBCO)１００マイクロリットルを、細胞を含むウェルに加えた(最終体積０.２mL)。

【0535】

メトトレキサート無しで増殖させた５個のプレートから１０クローンを同定した。これらのＨＺ２４クローンの６個を拡大培養し、単一細胞懸濁液としてシェーカーフラスコに移した。クローン３Ｄ３、３Ｅ５、２Ｇ８、２Ｄ９、１Ｅ１１、および４Ｄ１０を、左上のウェルの５０００細胞から開始して、細胞をプレートの縦方向に１：２希釈し、プレートの横方向に１：３希釈する二次元無限希釈法を使って、９６穴丸底組織培養プレートにプレーティングした。培養の初期に必要な成長因子を供給するために１ウェルあたり５００個の非トランスフェクトＤＧ４４ ＣＨＯ細胞のバックグラウンドで、希釈クローンを成長させた。５０nMメトトレキサートを含有する５枚とメトトレキサートを含有しない５枚で、１サブクローンあたり１０枚のプレートを作製した。

【0536】

クローン３Ｄ３は、２４個の目に見えるサブクローンを産生した(メトトレキサート処理なしから１３個、および５０nMメトトレキサート処理から１１個)。それら２４個のサブクローンのうち８個から得られる上清に、有意なヒアルロニダーゼ活性(＞５０単位／mL)が測定され、それら８個のサブクローンをＴ−２５組織培養フラスコに拡大培養した。メトトレキサート処理プロトコルから単離されたクローンは、５０nMメトトレキサートの存在下で拡大培養した。クローン３Ｄ３５Ｍをさらに、５００nM メトトレキサート中、シェーカーフラスコで拡大培養して、１,０００単位／mlを超えるヒアルロニダーゼ活性を産生するクローン(クローン３Ｄ３５Ｍ；またはＧｅｎ１ ３Ｄ３５Ｍ)を得た。次に、３Ｄ３５Ｍ細胞のマスター細胞バンク(master cell bank)(ＭＣＢ)を調製した。

【0537】

Ｂ. 可溶性ｒＨｕＰＨ２０を発現する第二世代細胞株の産生
実施例１Ａに記載の第１世代３Ｄ３５Ｍ細胞株を、さらに高いメトトレキサートレベルに適応させて、第２世代(Ｇｅｎ２)クローンを作出した。樹立メトトレキサート含有培養物から、４mM GlutaMAX−１(商標)および１.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地に、３Ｄ３５Ｍ細胞を播種した。３７℃、７％ＣＯ_２湿潤インキュベータ中で、４６日間にわたって、細胞を成長させ、それらを９回継代することにより、細胞を、より高いメトトレキサートレベルに適応させた。２.０μMメトトレキサートを含む培地が入っている９６穴組織培養プレートでの限界希釈法により、増幅された細胞集団をクローンアウト(clone out)した。約４週間後に、クローンを同定し、クローン３Ｅ１０Ｂを拡大培養のために選択した。４mM GlutaMAX−１(商標)および２.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地中で、継代２０代にわたって、３Ｅ１０Ｂ細胞を成長させた。３Ｅ１０Ｂ細胞株のマスター細胞バンク(ＭＣＢ)を作製し、凍結し、以後の研究に使用した。

【0538】

４mM GlutaMAX−１(商標)および４.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地中で３Ｅ１０Ｂ細胞を培養することによって、この細胞株の増幅を続けた。１２回目の継代後に、細胞を研究用細胞バンク(research cell bank)(ＲＣＢ)としてバイアル中で凍結した。ＲＣＢのバイアルを１本融解し、８.０μMメトトレキサートを含有する培地で培養した。５日後に、培地中のメトトレキサート濃度を１６.０μMに増加させ、次いで１８日後に２０.０μMに増加させた。２０.０μMメトトレキサートを含有する培地における８回目の継代培養から得た細胞を、４mM GlutaMAX−１(商標)および２０.０μMメトトレキサートを含有するＣＤ ＣＨＯ培地が入っている９６穴組織培養プレートでの限界希釈法によってクローンアウトした。５〜６週間後にクローンを同定し、クローン２Ｂ２を２０.０μMメトトレキサートを含有する培地での拡大培養のために選択した。１１回目の継代後に、２Ｂ２細胞を研究用細胞バンク(ＲＣＢ)としてバイアル中で凍結した。

【0539】

得られた２Ｂ２細胞は、可溶性組換えヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)を発現させるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損性(ｄｈｆｒ−)ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞である。可溶性ＰＨ２０は２Ｂ２細胞中に、約２０６コピー／細胞のコピー数で存在する。ＳｐｅＩ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで消化したゲノム２Ｂ２細胞ＤＮＡを、ｒＨｕＰＨ２０特異的プローブを使ってサザンブロット解析したところ、以下の制限消化プロファイルが明らかになった：ＳｐｅＩで消化したＤＮＡでは１本の主要ハイブリダイズバンド約７.７kbと４本の副ハイブリダイズバンド(約１３.９、約６.６、約５.７および約４.６kb)；ＸｂａＩで消化したＤＮＡでは、１本の主要ハイブリダイズバンド約５.０kbと２本の副ハイブリダイズバンド(約１３.９および約６.５kb)；ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで消化した２Ｂ２ ＤＮＡを使うと、約１.４kbの単一ハイブリダイズバンドが観察された。ｍＲＮＡ転写物の配列解析により、得られたｃＤＮＡ(配列番号５６)は、位置１１３１における１塩基対の相違(これは予想されるシトシン(Ｃ)の代わりにチミジン(Ｔ)であることがわかった)を除いて、基準配列(配列番号４９)と同一であることが示された。これはサイレント突然変異であり、アミノ酸配列には影響しない。

【0540】

実施例２
ｒＨｕＰＨ２０の産生および精製
Ａ. ３００Ｌバイオリアクター細胞培養中のＧｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の産生
ＨＺ２４−２Ｂ２細胞(実施例１Ｂ)融解し、シェーカーフラスコから３６Ｌスピナーフラスコを通して２０μMのメトトレキサートおよびGlutaMAX−１(商標)(Invitrogen)添加ＣＤ−ＣＨＯ培地(Invitrogen、Carlsbad, CA)に拡大した。簡単に述べると、細胞のバイアルを３７℃の水浴で融解し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を、２０mLの新鮮培地が入っている１２５mL浸透フラスコに再懸濁し、３７℃、７％ＣＯ_２のインキュベータに入れた。細胞を１２５mL振とうフラスコ中で４０mLまで拡大培養した。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を１２５mLスピナーフラスコに１００mLの培養体積で拡大した。フラスコを３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を２５０mLスピナーフラスコに２００mLの培養体積で拡大し、フラスコを３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を１Ｌスピナーフラスコに８００mLの培養体積で拡大し、３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０^６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を６Ｌスピナーフラスコに５０００mLの培養体積で拡大し、３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞密度が１.５×１０６細胞／mLを上回る密度に達したら、培養物を３６Ｌスピナーフラスコに３２Ｌの培養体積で拡大し、３７℃、７％ＣＯ_２でインキュベートした。

【0541】

４００Ｌリアクターを滅菌し、２３０mLのＣＤ ＣＨＯ培地を加えた。使用前に、リアクターを汚染についてチェックした。約３０Ｌの細胞を３６Ｌスピナーフラスコから４００Ｌバイオリアクター(Ｂｒａｕｎ)に、１mlあたり４.０×１０^５個の生細胞という接種密度および２６０Ｌの総体積で移した。パラメータは温度設定値：３７℃；インペラー速度４０〜５５ＲＰＭ；容器圧：３ｐｓｉ；空気散布量０.５〜１.５Ｌ／分；空気オーバーレイ：３Ｌ／分とした。細胞数、ｐＨ確認、培地分析、タンパク質の生産および貯留を調べるために、リアクターから毎日サンプルを採取した。また、運転中に栄養フィードを加えた。１２０時間(５日目)の時点で、１０.４Ｌの第１フィード培地(４×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋１６０mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋８３mL／Ｌイーストレート(Yeastolate)＋３３mg／Ｌ ｒＨｕインスリン)を加えた。１６８時間(７日目)の時点で、１０.８Ｌの第２フィード(２×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋８０mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋１６７mL／Ｌイーストレート＋０.９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を３６.５℃に変えた。２１６時間(９日目)の時点で、１０.８Ｌの第３フィード(１×ＣＤ−ＣＨＯ＋５０ｇ／Ｌグルコース＋５０mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋２５０mL／Ｌイーストレート＋１.８０ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を３６℃に変えた。２６４時間(１１日目)の時点で、１０.８Ｌの第４フィード(１×ＣＤ−ＣＨＯ＋３３ｇ／Ｌグルコース＋３３mL／Ｌ GlutaMAX−１(商標)＋２５０mL／Ｌイーストレート＋０.９２ｇ／Ｌ酪酸ナトリウム)を加え、培養温度を３５.５℃に変えた。フィード培地の添加は生産の最終段階における可溶性ｒＨｕＰＨ２０の生産を劇的に強化することが観察された。１４日時点もしくは１５日時点で、または細胞の生存能が４０％未満に低下した時に、リアクターを収集した。このプロセスにより、１２００万細胞／mLの最大細胞密度で１７,０００単位／mlの最終生産能力が得られた。マイコプラズマ、生物汚染度、エンドトキシンならびにインビトロおよびインビボでのウイルス、ウイルス粒子に関するＴＥＭ、ならびに酵素活性を調べるために、収集時に、培養物をサンプル採取した。

【0542】

それぞれが４〜８μmに分級された珪藻土の層と１.４〜１.１μmに分級された珪藻土の層とを含有し、その後にセルロースメンブレンが設けられている、並列した４つのMillistak濾過系モジュール(Millipore)に、培養物を蠕動ポンプで通し、次に、０.４〜０.１１μmに分級された珪藻土の層と、＜０.１μmに分級された珪藻土の層とを含有し、その後にセルロースメンブレンが設けられている、第２の単一Millistak濾過系(Millipore)に通し、次に０.２２μm最終フィルターを通して、３５０Ｌの容量を持つ滅菌使い捨てフレキシブルバッグ中に入れた。その収集細胞培養液に１０mMのＥＤＴＡおよび１０mMのＴｒｉｓをｐＨが７.５になるように補足した。培養物を、４つのSartoslice TFF ３０kDa分子量分画(ＭＷＣＯ)ポリエーテルスルホン(ＰＥＳ)フィルタ(Sartorius)を使用するタンジェンシャルフロー濾過(ＴＦＦ)装置で１０倍濃縮した後、１０mMのＴｒｉｓ、２０mMのＮａ_２ＳＯ_４、ｐＨ７.５で１０回のバッファー交換を行い、０.２２μm最終フィルターを通して、５０Ｌ滅菌保存バッグに濾過した。

【0543】

濃縮しダイアフィルトレーションに付した収集物を、ウイルスに関して不活化した。ウイルス不活化に先だって、１０％Triton X-１00、３％リン酸トリ(ｎ−ブチル)(ＴＮＢＰ)の溶液を調製した。濃縮しダイアフィルトレーションに付した収集物を、Ｑカラムで精製する直前に、３６Ｌガラス反応容器中で、１％Triton X-１00、０.３％ＴＮＢＰに１時間曝露した。

【0544】

Ｂ. Ｇｅｎ２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の精製
Q Sepharose(Pharmacia)イオン交換カラム(樹脂９Ｌ、Ｈ＝２９cm、Ｄ＝２０cm)を調製した。ｐＨおよび伝導度の決定ならびにエンドトキシン(ＬＡＬ)アッセイのために洗浄液サンプルを集めた。カラムを５カラム体積の１０mMのＴｒｉｓ、２０mMのＮａ_２ＳＯ_４、ｐＨ７.５で平衡化した。濃縮しダイアフィルトレーションに付した(実施例２Ａ)を、ウイルス不活化後に、１００cm／時間の流速でＱカラムに負荷した。カラムを、５カラム体積の１０mMのＴｒｉｓ、２０mMのＮａ_２ＳＯ_４、ｐＨ７.５および１０mMのＨＥＰＥＳ、５０mMのＮａＣｌ、ｐＨ７.０で洗浄した。タンパク質を１０mMのＨＥＰＥＳ、４００mMのＮａＣｌ、ｐＨ７.０で溶出させ、０.２２μm最終フィルターを通して滅菌バッグに濾過した。溶出液サンプルを生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。この交換の最初と最後にＡ_２８０吸光度を読み取った。

【0545】

次にPhenyl-Sepharose(Pharmacia)疎水相互作用クロマトグラフィーを行った。Phenyl-Sepharose(ＰＳ)カラム(樹脂１９〜２１Ｌ、Ｈ＝２９cm、Ｄ＝３０cm)を調製した。洗浄液を集め、ｐＨ、伝導度およびエンドトキシン(ＬＡＬアッセイ)用のサンプルを採取した。カラムを５カラム体積の５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１mMのＣａＣｌ_２、ｐＨ７.０で平衡化した。Q Sepharoseカラムから得たタンパク質溶出液に２Ｍ硫酸アンモニウム、１Ｍのリン酸カリウムおよび１ＭのＣａＣｌ_２保存液を補足して、最終濃度をそれぞれ５mM、０.５Ｍおよび０.１mMにした。タンパク質を１００cm／時間の流速でＰＳカラムに負荷し、素通り画分を集めた。１００cm／時間の５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０.１mMのＣａＣｌ_２ ｐＨ７.０でカラムを洗浄し、その洗浄液を、集めた素通り画分に加えた。カラム洗浄液と合わせた素通り画分を０.２２μm最終フィルターを通して滅菌バッグに入れた。生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性を調べるために素通り画分のサンプルを採取した。

【0546】

アミノフェニルボロネートカラム(ProMedics)を調製した。洗浄液を集め、ｐＨ、伝導度およびエンドトキシン(ＬＡＬアッセイ)用のサンプルを採取した。カラムを５カラム体積の５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した。精製タンパク質を含有するＰＳ素通り画分を１００cm／時間の流速でアミノフェニルボロネートカラムに負荷した。カラムを５mMのリン酸カリウム、０.５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７.０で洗浄した。カラムを２０mMビシン、０.５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９.０で洗浄した。カラムを２０mMビシン、１００mM塩化ナトリウム、ｐＨ９.０で洗浄した。タンパク質を５０mMのＨＥＰＥＳ、１００mMのＮａＣｌ、ｐＨ６.９で溶出させ、滅菌フィルターを通して滅菌バッグに入れた。溶出したサンプルを生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。

【0547】

ヒドロキシアパタイト(ＨＡＰ)カラム(BioRad)を調製した。洗浄液を集めて、ｐＨ、伝導度およびエンドトキシン(ＬＡＬアッセイ)について調べた。カラムを５mMのリン酸カリウム、１００mMのＮａＣｌ、０.１mMのＣａＣｌ_２、ｐＨ７.０で平衡化した。アミノフェニルボロネートで精製したタンパク質を、最終濃度が５mMのリン酸カリウムおよび０.１mMのＣａＣｌ_２になるように補足し、１００cm／時間の流速でＨＡＰカラムに負荷した。カラムを５mMのリン酸カリウム、ｐＨ７、１００mMのＮａＣｌ、０.１mMのＣａＣｌ_２で洗浄した。次に、カラムを１０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７、１００mMのＮａＣｌ、０.１mMのＣａＣｌ_２で洗浄した。タンパク質を７０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７.０で溶出させ、０.２２μm滅菌フィルターを通して滅菌バッグに入れた。溶出したサンプルを生物汚染度、タンパク質濃度および酵素活性について調べた。

【0548】

次に、ＨＡＰで精製したタンパク質をウイルス除去フィルターに通した。滅菌したVirosartフィルタ(Sartorius)を、まず、２Ｌの７０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７.０で洗浄することによって調製した。使用前に、ｐＨおよび伝導度を調べるために、濾過されたバッファーをサンプル採取した。ＨＡＰで精製したタンパク質を蠕動ポンプで２０nMウイルス除去フィルターに通した。７０mMのリン酸カリウム、ｐＨ７.０中の濾過されたタンパク質を０.２２μm最終フィルターを通して滅菌バッグに入れた。ウイルス濾過されたサンプルをタンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖およびシアル酸プロファイリングについて調べた。サンプルをプロセス関連不純物についても試験した。

【0549】

実施例３
可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の決定
細胞培養、血漿、精製フラクションおよび精製溶液のようなサンプル中の可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合したとき不溶性沈殿を形成することに基づく比濁法アッセイまたは可塑性多ウェルマイクロタイタープレートに非共有結合的に結合したビオチニル化ヒアルロン酸(ｂ−ＨＡ)基質の消化により酵素的に活性なｒＨｕＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０の量を測定するビオチニル化−ヒアルロン酸基質アッセイのいずれかを使用して決定した。

【0550】

Ａ. 微小濁度アッセイ
本アッセイにおいて、ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性を、可溶性ｒＨｕＰＨ２０とヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)を一定時間(１０分間)インキュベートし、次いで未消化ヒアルロン酸ナトリウムを酸性化血清アルブミン添加により沈殿させることにより測定した。得られたサンプルの濁度を、６４０nmで３０分間展開時間後に測定した。ヒアルロン酸ナトリウム基質上の酵素活性由来の濁度の減少は可溶性ｒＨｕＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性の指標であった。本方法を、可溶性ｒＨｕＰＨ２０アッセイ作業標品の希釈により作成した検量線を使用して行い、サンプル活性測定をこの検量線に対して行った。サンプル希釈を酵素希釈剤溶液で調製した。

【0551】

酵素希釈剤溶液を、３３.０±０.０５mgの加水分解ゼラチンを２５.０mLの５０mMのＰＩＰＥＳ反応緩衝剤(１４０mMのＮａＣｌ、５０mMのＰＩＰＥＳ、ｐＨ５.５)および２５.０mLの注射用滅菌水(ＳＷＦＩ；Braun, product number R5000-1)に溶解し、０.２mLの２５％ヒト血清アルブミン(US Biologicals)溶液で混合物を希釈し、３０秒間ボルテックス処理することにより調製した。これを使用前２時間以内に行い、必要となるまで氷上で保存した。サンプルを概算１〜２Ｕ／mLまで希釈した。一般的に、工程あたりの最大希釈は１：１００を超えず、最初の希釈用の初期サンプルサイズは少なくとも２０μLであった。アッセイを実施するのに必要な最少サンプル容積は、工程内サンプル、ＦＰＬＣフラクション：８０μL；組織培養上清：１mL；濃縮物質８０μL；精製または最終工程物質：８０μLであった。希釈を低タンパク質結合９６ウェルプレートで３連で行い、各希釈物の３０μLをOptilux黒色／透明底プレート(BD BioSciences)に移した。

【0552】

濃度２.５Ｕ／mLの既知可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、標準曲線作成のために酵素希釈剤溶液で作製し、Optiluxプレートに３連で添加した。希釈は０Ｕ／mL、０.２５Ｕ／mL、０.５Ｕ／mL、１.０Ｕ／mL、１.５Ｕ／mL、２.０Ｕ／mL、および２.５Ｕ／mLを含んだ。６０μLの酵素希釈剤溶液を含む“無試薬”ウェルを、プレートにネガティブコントロールとして包含させた。次いで、プレートを覆い、ヒートブロックで５分間、３７℃で加温した。覆いを取り、プレートを１０秒間振盪させた。振盪後、プレートをヒートブロックに戻し、MULTIDROP 384 Liquid Handlingデバイスを温かい０.２５mg／mLのヒアルロン酸ナトリウム溶液(１００mgのヒアルロン酸ナトリウム(LifeCore Biomedical)を２０.０mLのＳＷＦＩに溶解することにより作製した。これを２〜８℃で２〜４時間または完全に溶解するまで穏やかな回転および／または振盪により混合した)で開始させた。反応プレートをMULTIDROP 384に移し、３０μLのヒアルロン酸ナトリウムを各ウェルに分配させるためにスタートキーを押して、反応を開始させた。次いでプレートをMULTIDROP 384から除き、１０秒間振盪させ、プレートカバーを置き換えたヒートブロックに移した。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。

【0553】

MULTIDROP 384を、血清作業溶液で機械をプライミングし、容積設定を２４０μLに変えることにより反応を停止させる準備をした。(２５mLの血清ストック溶液[１容積のウマ血清(Sigma)を９容積の５００mM酢酸緩衝液で希釈し、塩酸でｐＨを３.１に調節した]の７５mLの５００mM酢酸緩衝液)。プレートをヒートブロックから除き、MULTIDROP 384に置き、２４０μLの血清作業溶液をウェルに分配した。プレートを除き、プレートリーダー上で１０秒間振盪させた。さらに１５分間後、サンプルの濁度を６４０nmで測定し、各サンプルのヒアルロニダーゼ活性(Ｕ／mL)を標準曲線に適合させることにより決定した。

【0554】

比活性(単位／mg)を、ヒアルロニダーゼ活性(Ｕ／ml)をタンパク質濃度(mg／mL)で割ることにより計算した。

【0555】

Ｂ. ビオチニル化ヒアルロナンアッセイ
ビオチニル化−ヒアルロン酸アッセイは、可塑性多ウェルマイクロタイタープレートに非共有結合的に結合した大分子量(〜１.２メガダルトン)ビオチニル化ヒアルロン酸(ｂ−ＨＡ)基質の消化による、生物学的サンプル中の酵素的に活性なｒＨｕＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０の量を測定する。標準およびサンプル中のｒＨｕＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０を、ｂ−ＨＡでコートしたプレート中、３７℃でインキュベートする。一連の洗浄後、残った未開裂／結合ｂ−ＨＡをストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(ＳＡ−ＨＲＰ)で処理する。固定化ＳＡ−ＨＲＰと発色性基質である３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)の反応は青色溶液をもたらす。酸で反応停止後、可溶性黄色反応生成物の形成を、マイクロタイタープレート分光光度計を使用して４５０nmの吸光度を読むことにより決定する。ビオチニル化ヒアルロン酸(ｂ−ＨＡ)基質の酵素活性由来の４５０nmでの吸光度減少は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０ヒアルロニダーゼ活性の指標である。本方法を、可溶性ｒＨｕＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０参照標準の希釈により作成した較正曲線を使用して行い、サンプル活性測定をこの較正曲線と比較する。

【0556】

サンプルおよびキャリブレーターの希釈物をアッセイ希釈剤中で調製した。アッセイ希釈剤を、１％ｖ／ｖ貯蔵血漿(適当な種から)を０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡのＨＥＰＥＳ溶液に、ｐＨ７.４に添加することにより調製した。これを毎日調製し、２〜８℃で保存した。種タイプならびに予測ヒアルロニダーゼレベルによって、１回または複数希釈を調製し、少なくとも１個のサンプル希釈が較正曲線の範囲内に入るようにする。試験サンプル希釈選択の指針として、投与されたヒアルロニダーゼ投与量、投与経路、該種の凡その血漿体積および時点に関して知られた情報をヒアルロニダーゼ活性レベルの概算に使用した。各サンプル希釈を、短いパルス−ボルテックスで調製されるように混合し、ピペットチップを各希釈毎に変えた。一般に、希釈は最初の５０または１００倍希釈から初め、その後さらに連続希釈した。ｒＨｕＰＨ２０またはＰＥＧＰＨ２０の７点較正曲線(投与処置量による)を、ｒＨｕＰＨ２０について０.００４〜３.０Ｕ／mLおよびＰＥＧＰＨ２０について０.０３７〜２７Ｕ／mLの範囲の濃度で調製した。１００マイクロリットル(１００μL)の各試験サンプル希釈および較正曲線点を、予め１００μL／ウェルのｂ−ＨＡで０.１mg／mLでコーティングし、２５０μLの１.０％(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミンのＰＢＳでブロックした９６ウェルマイクロタイタープレート(Immulon 4HBX, Thermo)にトリプリケートで適用した。プレートを接着性プレートシールで覆い、３７℃で約９０分間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、接着性シールをプレートから外し、サンプルを吸引し、ウェルあたり３００μLの洗浄緩衝液(１０mMリン酸緩衝液、２.７mM塩化カリウム、１３７mM塩化ナトリウム、ｐＨ７.４、０.０５％(ｖ／ｖ)Tween 20含有、ＰＢＳＴ)で自動化プレートウォッシャー(BioTek ELx405 Select CW、プログラム‘4HBX1’)を使用して５回洗浄した。１００マイクロリットルのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート作業溶液[２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７mM塩化ナトリウム、０.０２５％(ｖ／ｖ)Tween 20、０.１％(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミン中ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート(１：５,０００ｖ／ｖ)]をウェルあたりに添加した。プレートを密閉し、環境温度で約６０分間、振盪せず、遮光してインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、接着性シールをプレートから外し、サンプルを吸引し、プレートを上記のとおり、ウェルあたり３００μLの洗浄緩衝液で５回洗浄した。ＴＭＢ溶液(環境温度で)を各ウェルに添加し、５分間、室温で遮光しながらインキュベートした。ＴＭＢ停止溶液(ＫＰＬ、Catalog # 50-85-06)を１００μL／ウェルで添加した。各ウェルの４５０nmでの吸光度をマイクロタイタープレート分光光度計を使用して決定した。各プレート上の較正曲線の応答を、４−パラメータロジスティック曲線適合を使用してモデル化した。各未知のヒアルロニダーゼ活性を、較正曲線の内挿により計算し、サンプル希釈計数で補正し、Ｕ／mLで示した。

【0557】

実施例４
ペグ化ｒＨｕＰＨ２０の製剤
本実施例において、ｒＨｕＰＨ２０をメトキシポリ(エチレングリコール)ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ)との酵素反応によりペグ化した。

【0558】

Ａ. ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋの製造
ＰＥＧＰＨ２０を産生するために、ｒＨｕＰＨ２０(約６０KDaサイズ)を、分子量約３０kDaを有するメトキシポリ(エチレングリコール)ブタン酸の直鎖Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ)と共有結合的に結合させた。ｍＰＥＧ−ＳＢＡの構造を下に示す(ここで、ｎ≒６８１である)。

【化3】

【0559】

ｒＨｕＰＨ２０のペグ化に使用したｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋの製造方法は、例えば、米国特許番号５,６７２,６６２に記載されている。簡単に言うと、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋを次の方法に従い製造する。
ジオキサンに溶解したマロン酸エチル(２当量)溶液を水素化ナトリウム(２当量)およびトルエンに窒素雰囲気下滴下する。ｍＰＥＧメタンスルホネート(１当量、ＭＷ ３０kDa、Shearwater)をトルエンに溶解し、上記混合物に添加する。得られた混合物を約１８時間還流する。反応混合物を元の体積の半分まで濃縮し、１０％ＮａＣｌ水溶液で抽出し、１％塩酸水溶液で抽出し、水性抽出物を併せる。回収した水層をジクロロメタン(３×)で抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾固する。得られた残渣を塩化ナトリウム含有１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、混合物を１時間撹拌する。混合物のｐＨを６Ｎ塩酸の添加により約３に調節する。混合物をジクロロメタン(２×)で抽出する。

【0560】

有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、冷ジエチルエーテルに注加する。沈殿を濾過により回収し、減圧下乾燥する。得られた化合物をジオキサンに溶解し、８時間還流し、濃縮乾固する。得られた残渣を水に溶解し、ジクロロメタン(２×)で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶液を回転蒸発により濃縮し、冷ジエチルエーテルに注加する。沈殿を濾過により回収し、減圧下乾燥する。得られた化合物(１当量)をジクロロメタンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(２.１当量)を添加する。溶液を０℃に冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド(２.１当量)のジクロロメタン溶液を滴下する。液を室温で約１８時間撹拌する。反応混合物を濾過し、濃縮し、ジエチルエーテルで沈殿させる。沈殿を濾過により回収し、減圧下乾燥して、粉末ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋを得て、これを≦−１５℃で凍結する。

【0561】

Ｂ. ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫのｒＨｕＰＨ２０への結合
ＰＥＧＰＨ２０を製造するために、下記のとおり(ここで、ｎ≒６８１である)、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０ＫをｒＨｕＰＨ２０のアミノ基と共有結合的結合によりカップリングさせ、ｒＨｕＰＨ２０とｍＰＥＧの安定なアミド結合を得た。

【化4】

【0562】

結合の前に、実施例２Ｂで製造したｒＨｕＰＨ２０精製バルクタンパク質を、０.２ｍ^２濾過面積の１０kDaポリエーテルスルホン(ＰＥＳ)接線流濾過(ＴＦＦ)カセット(Sartorius)を使用して〜１０mg／mLに濃縮し、緩衝液をｐＨ７.２で７０mMリン酸カリウムに対して交換した。濃縮したタンパク質を使用するまで２〜８℃で保存した。

【0563】

ｒＨｕＰＨ２０を結合させるために、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ(Nektar)を、室温で、暗所で２時間を越えない時間融解した。バッチサイズによって、無菌３”撹拌子を１または３リットルエレンマイヤーフラスコに入れ、緩衝液交換したｒＨｕＰＨ２０タンパク質を添加した。１グラムあたりのｒＨｕＰＨ２０に対し５グラムの乾燥ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ粉末(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋ：ｒＨｕＰＨ２０の１０：１モル比)をバキュームフード下にフラスコに添加し、混合物を１０分間またはｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋが完全に溶解するまで混合した。撹拌速度は、泡立たずに渦が起こるように設定した

【0564】

次いで、溶液をクラス１００フード下に、溶液を、蠕動ポンプを介して、０.２２μmポリスチレン、セルロースアセテートフィルターカプセル(Corning ５０mLチューブトップフィルター)を介して、無菌３”撹拌子を含む新しい１または３リットルエレンマイヤーフラスコに濾過して入れた。ＰＥＧＰＨ２０反応混合物の体積を質量(１ｇ／mL密度)により決定し、濾過に使用した０.２２μmフィルターを使用後完全性試験で試験した。

【0565】

次いで混合物を撹拌プレートに２〜８℃で、２０±１時間、暗所で入れた。撹拌速度は、再び、泡立たずに渦が起こるように設定した。全部のエレンマイヤー容器をホイルで包み、溶液を遮光した。混合後、１Ｍグリシンを最終濃度２５mMまで添加して、反応停止させた。サンプルを容器から取って、ｐＨおよび伝導率を試験した。ｐＨおよび伝導率を、５mM Tris Base(５.６５Ｌ／Ｌ)および５mM Ｔｒｉｓ、１０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８.０(１３.３５Ｌ／Ｌ)の添加により調節して、Q Sepharose精製を行った。

【0566】

QFF Sepharose(GE Healthcare)イオン交換カラム(高さ＝２１.５〜２４.０cm、直径＝２０cm)を、５カラム体積(３６Ｌ)の５mM Ｔｒｉｓ、１０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８.０での平衡化により調節した。結合した生成物を、ＱＦＦカラムに９５cm／時間の流速で充填した。カラムを１１Ｌの平衡緩衝液(５mM Ｔｒｉｓ、１０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８.０)で９５cm／時間の流速で洗浄し、続いて２５Ｌの平衡緩衝液で２６８cm／時間の流速で洗浄した。次いでタンパク質生成物を５mM Ｔｒｉｓ、１３０mM ＮａＣｌ、ｐＨ８.０で２６８cm／時間の流速で溶出した。得られた精製ＰＥＧＰＨ２０を、０.２ｍ^２濾過面積の３０kDaポリエーテルスルホン(ＰＥＳ)接線流濾過(ＴＦＦ)カセット(Sartorius)を使用して３.５mg／mLに濃縮し、１０mMヒスチジン、１３０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６.５に対して緩衝液交換した得られた物質を実施例３に記載のとおり酵素活性について試験した。３.５mg／mLの濃度のペグ化ｒＨｕＰＨ２０物質(最終酵素活性１４０,０００Ｕ／mL)を、３mL体積で、シリコン処理ブロモブチルゴム栓およびアルミニウムフリップオフシールを備えた５mLガラスバイアルに充填し、凍結(−２０℃冷凍庫で一夜凍結、次いで−８０℃冷凍庫に長期貯蔵のために入れる)させた。ペグ化ｒＨｕＨＰ２０は、ｒＨｕＰＨ２０１モルあたり約４.５モルのＰＥＧを含んだ。

【0567】

Ｂ. ペグ化ｒＨｕＰＨ２０の分析
ペグ化ｒＨｕＰＨ２０(ＰＥＧＰＨ２０)物質を、ゲル電気泳動でアッセイした。上の実施例４Ａのとおりに製造したＰＥＧＰＨ２０の３バッチは、同一パターンの複数バンドを明らかにし、種々の距離で移動する未反応ＰＥＧおよび複数種のＰＥＧＰＨ２０コンジュゲートを示す。分子量マーカーの移動との比較により、バンドは、約９０KDa〜３００KDaの範囲の種と、２４０KDaマーカーの上に移動する３個の暗バンドを示した。これらのデータは、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋの共有結合的結合により製造したＰＥＧＰＨ２０が、おそらくモノ−、ジ−およびトリ−ペグ化タンパク質を含む、ＰＥＧＰＨ２０種の不均一混合物を含むことを示す。６０KDaの可視バンドの欠失は、全タンパク質がＰＥＧと反応し、検出可能な天然ｒＨｕＰＨ２０が混合物中になかったことを示した。

【0568】

実施例５
細胞周囲マトリックスを形成する腫瘍細胞の適格性および腫瘍細胞ヒアルロナン(ＨＡ)含量、ヒアルロナンシンターゼ(ＨＡＳ)のレベルおよびヒアルロニダーゼ(Ｈｙａｌ)発現との相関
Ａ. 腫瘍細胞ＨＡ含量、ＨＡＳ１、２、３ならびにＨｙａｌ１および２発現および細胞周囲マトリックス形成の比較
本実施例において、腫瘍細胞における内在性ＨＡ合成酵素群、ヒアルロナンシンターゼ(ＨＡＳ)１、２および３、ヒアルロニダーゼ(Ｈｙａｌ)１および(Ｈｙａｌ)２の量およびヒアルロナン(ＨＡ)蓄積量を比較して、腫瘍細胞による細胞周囲マトリックス形成との各相関を示した。

【0569】

１. 研究に使用した細胞株
種々の組織起源(例えば、前立腺、乳房、卵巣、膵臓および肺)および種起源(例えば、ヒト、マウスおよびラット)の腫瘍の１０種の細胞株本研究で試験した。次の細胞株を得られたアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ＡＴＣＣ)から得た：４Ｔ１マウス乳房腫瘍(ATCC CRL-2539)、PC-3ヒト前立腺腺癌(ATCC CRL-1435)、BxPC-3ヒト膵腺癌(ATCC CRL-1687)、MDAMB 231ヒト乳腺癌(ATCC HTB-26)、Mat-LyLuラット悪性前立腺癌(ATCC JHU-92)、AsPc-1ヒト膵腺癌(ATCC CRL-1682)、DU-145ヒト前立腺癌(ATCC HTB-81)およびMIA PaCa 2ヒト膵癌(ATCC CRL-1420)。ＡＴＣＣ細胞株を、１０％ＦＢＳを含む推奨培養培地で、５％ＣＯ_２／９５％空気を供給する３７℃の加湿インキュベーターで培養した。北アメリカホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するMDA-MB-231-Luc(Cat. No. D3H2LN)細胞をCaliper Life Sciences Inc.から購入し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩで増殖した。

【0570】

DU-145/HAS2およびMDA-MB-231-Luc/HAS2細胞株を、DU-145およびMDA-MB-231-Luc細胞株の、ヒアルロナンシンターゼ２(ＨＡＳ２)(配列番号１９５)をコードするレトロウイルスへの形質導入により賛成した。ＨＡＳ２レトロウイルスを産生するために、Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグｈＨＡＳ２ ｃＤＮＡ(配列番号１９６)を、ネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターpLXRN(配列番号１９７；Clontech、Cat. No. 631512)のＡｖｒIIおよびＮｏｔＩ部位に挿入し、pLXRN-hHAS2(配列番号２０１)を創製した。pLXRN-hHAS2 Hisプラスミドを、次いでリポフェクタミン２０００試薬(Life Technologies)を使用して、pVSV-Gエンベロープベクター(配列番号１９８；Clontech、Cat. No. 631530の一部)とGP-293細胞に同時形質移入した。DU-145偽細胞株も、空ＬＸＲＮプラスミドおよびpVSV-Gエンベロープベクターの同時形質移入により産生した。

【0571】

ウイルス力価を、定量的ＰＣＲ方法(Retro-XTM qRT-PCR Titration Kit；Clontech、Catalog No. 631453)により、次のプライマー(Clontech Catalog No. #K1060-E)を使用して決定した：
pLXSN 5’プライマー(１３９８−１４２０)：5’-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3’(配列番号１９９)；
pLXSN 3’プライマー(１５３７−１５１５)：5’-GAGCCTGGGGACTTTCCACACCC-3’(配列番号２００)。

【0572】

ＨＡＳ２発現細胞株を確立するために、７０％コンフルエント癌細胞、DU-145またはMDAMB 231 Lucを、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ(Mediatech)中、レトロウイルス６０：１〜６：１比で７２時間インキュベートした。培養を、２００μg／mLのＧ４１８を含む選択培地で維持した。安定なＨＡＳ２発現癌細胞は、２週間のＧ４１８条件培地選択後に産生した。

【0573】

２. ヒアルロン酸の定量化
ヒアルロナン結合タンパク質(ＨＡＢＰ)ベースのアッセイを用いて、腫瘍細胞により産生されるヒアルロナンの量を決定した。ＨＡＢＰベースのアッセイは、ＨＡＢＰが、ヒアルアドヘリン類(ＨＡ結合タンパク質)と結合する能力がある少なくとも１５(ｎ−アセチルグルコース−グルクロン酸)二糖類から成るＨＡを優勢に検出するために、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)バイオマーカーとしてＨＡを測定するための化学的方法に好ましい(例えば、Haserodt S, et al. (2011) Glycobiology 21:175-183参照)。

【0574】

腫瘍細胞を、１×１０^６細胞で７５cm^２フラスコに播種し、２４時間インキュベートした。組織培養上清を、ＨＡ捕捉として組み換えヒトアグリカンおよび検出試薬(組み換えヒトアグリカンG1-IGD-G2ドメイン、Accession No. NP_037359のVal20-Gly676(配列番号２０２)とＣ末端１０−ＨＩＳタグ、R&D Systems、Catalog No. 1220-PG)を使用する、酵素結合ＨＡＢＰサンドイッチアッセイ(R&D Systems、Catalog No. DY3614)を使用するＨＡの定量化のために回収した。ＨＡ検出のためのアッセイを製造者の指示に従い行った。簡単に言うと、アッセイプレートを組み換えヒトアグリカンでコートし、ＨＡを含むサンプル(すなわち組織培養上清)をプレートに添加した(各細胞株を個々に３反復で試験した)。プレートを洗浄し、結合したＨＡをビオチニル化組み換えヒトアグリカンを使用して検出した。未結合プローブ除去後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)に結合したストレプトアビジンを二次的検出試薬として添加した。プレート洗浄後、結合したＨＲＰを、１：１ Ｈ_２Ｏ_２／テトラメチルベンジジン基質溶液(R&D Systems)とのインキュベーションにより検出し、スペクトルMaxM3マルチモードマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, CA)を使用して４５０nmで光学密度検出して定量化した。培養培地中の各腫瘍細胞型のＨＡ濃度を、培養培地中のＨＡ濃度(ng／mL)として表した(表５)。

【0575】

３. ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２ ｍＲＮＡ発現の定量化
ＲＮＡを、RNeasy(登録商標)Mini Kit(Qiagen GmbH)を製造者の指示に従い使用して、細胞ペレットから抽出した。次いで、抽出したＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE)を使用して定量した。遺伝子特異的プライマーを使用する定量的実時間ＰＣＲ(qRT-PCR)を使用して、各ヒアルロナンシンターゼおよびヒアルロニダーゼの相対的ｍＲＮＡレベルを定量した。ｑＲＴ−ＰＣＲプライマーをBio Applied Technologies Joint, Inc.(San Diego, CA)から購入した。個々のＰＣＲ反応に使用するプライマーについてのＤＮＡ配列は次のとおりであった。

【表4】

【0576】

ＰＣＲ反応について、サンプルをiQ SYBR Green master mix(Bio-Rad)および各遺伝子について指定したプライマー対と混合した。ＰＣＲ反応をBio-Rad Chromo 4 qPCR装置で行った。第一鎖合成を次の条件下で行った：ＤＮＡ脱離反応について４２℃で２分間、逆方向−転写のために４２℃で１５分間および逆転写酵素の３分間、９５℃での不活性化。増幅のために、９５℃での３分間初期変性、４５サイクルの１５秒間の変性および１分間、５８℃でのアニーリング伸長を使用した。各サンプルの遺伝子発現ＣＴ値を、内部ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨで標準化することにより計算し、相対値をプロットした。表５は、アッセイした各遺伝子について各腫瘍細胞型のＣＴ値を示す。

【0577】

４. 細胞周囲マトリックス形成のアッセイ
１０種の細胞株の単層培養物を増殖し、アグリカン促進細胞周囲マトリックス形成について試験した。アグリカン仲介ＨＡ細胞周囲マトリックスをインビトロで可視化するために、Thompson CB, et al. (2010) Mol Cancer Ther 9: 3052-3064に以前に記載された粒子排除アッセイを幾分改変して使用した。簡単に言うと、細胞を、６ウェルプレートのウェルあたり１×１０^５細胞で２４時間播種し、培養細胞培地単独または１０００Ｕ／mLｒＨｕＰＨ２０含有で３７℃で１時間処置した。ｒＨｕＰＨ２０での前処置は細胞周囲マトリックスの形成を阻止し、それゆえに、これを各細胞型の細胞周囲マトリックス形成の負対照として使用した。次いで、細胞を０.５mg／mLのウシアグリカン(Sigma-Aldrich)と、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、培地を除去し、Ｂａｌｂ／ｃマウス(Taconic, Hudson, NY)から単離した２％グルタルアルデヒド固定マウス赤血球(ＲＢＣｓ)のＰＢＳ、ｐＨ７.４中１０^８／mL懸濁液と置き換えた。粒子を１５分間沈降させた。次いで、カメラスキャナーおよび造影プログラム(Diagnostic Instruments)と連結した位相差顕微鏡を用いて培養物を撮像した。粒子排除面積および細胞面積をSPOT Advanceプログラム(Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI)を使用して測定した。細胞周囲マトリックス面積を、マトリックス面積から細胞面積を減算することにより計算し、μm^２として示した(表５)。

【0578】

５. 結果：細胞周囲マトリックス形成に対する腫瘍細胞ＨＡ含量およびＨＡＳおよびＨＹＡＬ発現の比較
ＨＡＢＰベースの検出アッセイで決定した条件培地中のＨＡ濃度は、単層培養中の腫瘍細胞により形成されるアグリカン仲介細胞周囲マトリックスの面積と相関することが判明した(表５、Ｐ＜０.００２９)。さらに、ヒアルロナンシンターゼ２(ＨＡＳ２)を発現するように操作した細胞株であるDU-145/HAS2およびMDA-MB-231/HAS2は、各親細胞株と比較した増加したＨＡ産生および亢進した細胞周囲マトリックス形成をインビトロで示した。対照的に、細胞周囲マトリックス形成とＨＡＳ １、２もしくは３またはＨｙａｌ １もしくは２のｍＲＮＡ発現の相対レベルの間に相関は見られなかった。これらの知見は、腫瘍細胞関連ＨＡの直接測定は、特異的に細胞周囲マトリックス形成の予測因子を提供することを示す。

【0579】

【表5】

ＮＥ：評価せず
^１ 粒子排除アッセイにより評価した細胞周囲マトリックス面積(μm^３)。
^２ 培養培地(ｎ＝３、別個の培養)中の平均ＨＡ濃度(ng／mL)。
^３、４ 実時間ＲＴ−ＰＣＲにより決定したヒアルロナンシンターゼ(ＨＡＳ)およびヒアルロニダーゼ(Ｈｙａｌ)発現。Ｃｔ値をＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡにより基準化し、差の倍率はBxPC3発現に相対的である。

【0580】

実施例６
腫瘍細胞ヒアルロナン濃度の測定およびＰＥＧＰＨ２０の抗腫瘍活性との関係
本実施例において、種々の腫瘍細胞株中のヒアルロナン濃度を免疫組織化学的分析により評価し、ＰＥＧＰＨ２０が腫瘍細胞株から産生した異種移植腫瘍の腫瘍増殖およびＨＡ富腫瘍細胞株の腫瘍コロニー増殖を阻害する能力を比較した。

【0581】

Ａ. 種々の異種移植腫瘍モデルにおけるＨＡ含量とＰＥＧＰＨ２０効果の比較
１. 異種移植腫瘍モデル
１４種の腫瘍細胞株由来異種移植腫瘍を次の腫瘍細胞株から産生した：DU-145ヒト前立腺癌(空pLXRNプラスミドで偽遺伝子導入したATCC HTB-81、実施例５.Ａ.１参照)、DU-145 HAS2(実施例５.Ａ.１参照)、MDAMB 231ヒト乳腺癌(ATCC HTB-26)、MDA-MB-231/Luc(D3H2LN、Caliper Life Sciences)、MDAMB 231 Luc/HAS2(実施例５.Ａ.１参照)、SKOV3ヒト卵巣癌(ATCC HTB-77)、AsPc-1ヒト膵腺癌(ATCC CRL-1682)、MIA PaCa 2ヒト膵癌(ATCC CRL-1420)、４Ｔ１マウス乳房腫瘍(ATCC CRL-2539)、BxPC-3ヒト膵腺癌(ATCC CRL-1687)、Mat-LyLuラット悪性前立腺癌(ATCC JHU-92)およびPC-3ヒト前立腺腺癌(ATCC CRL-1435)。腫瘍細胞株を実施例５に記載のとおり維持した。LUM 697およびLUM 330ヒト腫瘍外植片をCrown Bioscience, Beijing Chinaから得た。

【0582】

６〜８週齢ｎｕ／ｎｕ(Ｎｃｒ)無胸腺ヌードマウス(Taconic)またはＢａｌｂ／ｃ(Harlan)またはＢａｌｂ／ｃヌードマウス(Shanghai Laboratory Animal Center, CAS(SLACCAS)；実施例７参照)を、Micro-isolatorケージで、１２時間明／１２時間暗サイクルの環境制御された部屋で飼育し、無菌餌および水を自由に摂取させた。全動物試験を、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルに準拠して行った。

【0583】

腫瘍産生について、マウスに腫瘍細胞を、下記表６に従い、脛骨周囲(peritibially)(右脛骨骨膜に隣接した筋肉内注射)、皮下(ｓ.ｃ.、右後肢)または乳房脂肪体に接種した。

【表6】

Ｈ：ヒト；Ｍ：マウス；Ｒ：ラット

【0584】

脛骨周囲腫瘍について、腫瘍体積をVisualSonics Vevo 770高解像度超音波を使用して決定した。皮下および乳房脂肪体腫瘍について、腫瘍体積を、固形腫瘍塊の長(Ｌ)および幅(Ｗ)のノギス測定により計算した。腫瘍体積(ＴＶ)を(Ｌ×Ｗ^２)／２として計算した。腫瘍体積が〜４００〜５００mm^３に達したとき、動物をＰＥＧＰＨ２０処置に選択した。次いで、動物を処置群と対照群に無作為化した(ｎ≧６マウス／群)。

【0585】

ＰＥＧＰＨ２０での処置および腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)の分析を記載されているとおりに行った(Thompson et al.)。マウスを、表７に示すスケジュールに従い、媒体(１０mMヒスチジン、ｐＨ６.５、１３０mM ＮａＣｌ)またはＰＥＧＰＨ２０で２〜３週間処置した。腫瘍体積を１週間に２回測定した。腫瘍サイズが２,０００mm^３に達したとき、動物を実験から外し、人道的に屠殺した。

【0586】

【表7】

【0587】

各腫瘍モデルのＴＧＩを、表７に示す実験終了日の体積に基づき計算した。各腫瘍モデルの腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)パーセンテージを次の式を使用して計算した：
％ＴＧＩ＝[１−(Ｔ_ｎ−Ｔ_０)÷(Ｃ_ｎ−Ｃ_０)]×１００％
式中、“Ｔ_ｎ”はペグ化ｒＨｕＰＨ２０最終投与“ｎ”日後の処置群(ペグ化ｒＨｕＰＨ２０を受けている動物)の平均腫瘍体積であり；“Ｔ_０”は処置前、０日の該処置群の平均腫瘍体積であり；“Ｃ_ｎ”は“ｎ”日目の対応する対照群の平均腫瘍体積であり；“Ｃ_０”は処置前、０日の対照群の平均腫瘍体積である。対照群と処置群の腫瘍体積の統計学的分析を、一方向ＡＮＯＶ試験を使用して行い、Ｐ≦０.０５のＰ値を統計学的有意と定義した。

【0588】

２. 腫瘍組織中のＨＡの組織化学染色およびＨＡ含量の半定量化
腫瘍増殖阻害実験終了時、１４種の産生した異種移植腫瘍の各々を、ＨＡ検出用プローブとしてビオチニル化ヒアルロナン結合タンパク質(Ｂ−ＨＡＢＰ)を使用する組織化学によりＨＡ含量を分析し、デジタル定量化した。

【0589】

腫瘍組織を採取し、１０％中性緩衝化ホルマリン溶液(ＮＢＦ)に固定し、パラフィンに包埋し、５μm切片に切断した。組織化学的分析について、切片を脱パラフィン化し、再水和した。内在性ペルオキシダーゼ類をperoxo-block溶液(Invitrogen, CA, USA)で２分間遮断した。非特異的染色を、１時間、室温(ＲＴ)で２％正常ヤギ血清ＰＢＳ中２％ＢＳＡで遮断し、２.５μg／ml ビオチニル化ＨＡ結合タンパク質(B-HABP, Catalog No. 400763, Seikagaku, Tokyo, Japan)と１時間、３７℃でインキュベートした。染色特異性を確認するために、切片のサブセットを、ｒＨｕＰＨ２０(１０００Ｕ／mL)で、ＰＩＰＥＳ緩衝液(２５mM ＰＩＰＥＳ、７０mM ＮａＣｌ、０.１％ＢＳＡ、ｐＨ５.５)中、３７℃で１時間前処理し、Ｂ−ＨＡＢＰを添加した。一次試薬を除去するための洗浄後、サンプルをストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ溶液(BD Pharmingen, Catalog No. 550946)と３０分間、ＲＴでインキュベートし、３,３’−ジアミノベンジジン(DAB;Dako, Catalog No. K3467)で検出した。次いで、切片をギルのヘマトキシリン(Vector Labs, Catalog No. H-3401)で対比染色し、脱水和し、Cytoseal 60媒体(American MasterTech)にマウントした。

【0590】

Aperio T2 Scanscope(Aperio)を使用して、組織切片の高解像度画像を作成した。画像を、褐色(ＨＡ)数についての画素数アルゴリズムを使用するAperio Spectrumソフトウェアを使用して定量的に分析した。切片中の１０％未満の腫瘍細胞または５０％を超える壊死性組織の組織コアを本評価から除外した。ＰＣ３(ＨＡ^＋３)異種移植腫瘍組織を正対象として使用した。強い正(褐色)染色面積対総染色面積の合計の比を計算し、それぞれ該比率が２５％、１０〜２５％、１０％未満または０であるとき、＋３、＋２、＋１または０とスコア化した。

【0591】

スピアマンの順位相関係数を使用して、ＨＡ発現とＰＥＧＰＨ２０処置に対する応答の相関を評価した。

【0592】

３. 結果：ＰＥＧＰＨ２０処置後の腫瘍ＨＡ含量および腫瘍増殖阻害の比較
表８に示す結果は、異種移植腫瘍から採った組織切片で測定したＨＡのレベルおよびＰＥＧＰＨ２０による腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)パーセンテージの比較である。結果は、少なくとも１mg／kg ＰＥＧＰＨ２０で処置した腫瘍由来である。１mg／kgより高い投与量は腫瘍増殖阻害を増やさなかった。PC-3(ＨＡ^＋３)およびBxPC3(ＨＡ^＋２)動物モデルにおいて、それぞれ１０μg／kgおよび１００μg／kgより高い投与量で効果の顕著な増加は見られなかった。

【0593】

腫瘍細胞型の多様性にも係らず(ヒト、マウスおよびラット起源)、Ｂ−ＨＡＢＰ仲介ＨＡ染色強度とＰＥＧＰＨ２０のインビボ抗腫瘍活性には顕著な相関(Ｐ＜０.００１、スピアマンのｒ＝８、ｎ＝１４)があった(表８)。

【表8】

Ｈ：ヒト；Ｍ：マウス；Ｒ：ラット

【0594】

Ｂ. ＨＡＳ２過発現の異種移植腫瘍モデルにおけるＨＡ含量とＰＥＧＰＨ２０効果の比較
腫瘍細胞中のＨＡ産生増加の、ＰＥＧＰＨ２０処置に対する腫瘍感受性増加に対する効果を、さらに、外来性ヒアルロナンシンターゼ２(ＨＡＳ２)を発現する腫瘍異種移植で試験した。実施例５に示すとおり、DU-145腫瘍細胞株によるＨＡ産生は、インビトロで細胞周囲マトリックス形成にいたる、ＨＡＳ２をコードする遺伝子を細胞に形質導入することにより増加できた。さらに、DU142-HAS2は上記のとおりＨＡ染色増加および異種移植モデルにおけるＰＥＧＰＨ２０による腫瘍阻害増加を示した。本実施例において、経時的なＰＥＧＰＧ２０処置の効果を、DU-145対DU-145-HAS2異種移植で比較した。

【0595】

マウス異種移植モデルを、実施例６Ａに上記のとおり製造した。簡単に言うと、マウスにDU-145／ベクター対照またはDU-145/HAS2細胞を表６に示すとおり接種した。腫瘍が約５００mm^３サイズに到達したとき、マウスを処置群(ｎ＝８)に分け、媒体単独またはＰＥＧＰＨ２０で処置した。ＰＥＧＰＨ２０処置について、マウスに、１週間に２回、３週間、４.５mg／kgの投与量を尾静脈から注射した。腫瘍体積を上記のとおりノギス測定によりモニターした。異種移植腫瘍を、ＰＥＧＰＨ２０での最後の処置２４時間後、上記のとおりＨＡ含量についてビオチニル化ヒアルロナン結合タンパク質(Ｂ−ＨＡＢＰ)を使用する組織化学により分析した。

【0596】

ＨＡＳ２過発現DU-145前立腺腫瘍異種移植は、先の報告(表７)(Thompson et al.(2010))と同様、ヌードマウスで空ベクター(DU-145偽)を遺伝子導入した親細胞株より激しく増殖した。ＰＥＧＰＨ２０はDU-145-HAS2腫瘍で腫瘍増殖を阻害したが(ＴＧＩ＝５０％、Ｐ＜０.００１、ｎ＝８)、DU-145ベクター対照腫瘍ではしなかった(ＴＧＩ＝０.７％、Ｐ＞０.０５、ｎ＝８)。さらに、ＰＥＧＰＨ２０処置腫瘍のＢ−ＨＡＢＰでの組織化学染色は、対照腫瘍と比較した腫瘍サンプル中のＨＡ除去を示した。これらのデータは、ＥＣＭへのＨＡ蓄積が腫瘍発達を促進し、促進された腫瘍関連ＨＡ蓄積は、ＰＥＧＰＨ２０の抗腫瘍活性と相関することを示す。

【0597】

Ｃ. ヒアルロナン富腫瘍におけるＰＥＧＰＨ２０処置の投与関連効果
本実験において、ＨＡ富腫瘍の腫瘍増殖阻害におけるＰＥＧＰＨ２０の投与量依存的効果を試験した。マウス異種移植モデルを、実施例６Ａに上記のとおり製造した。簡単に言うと、マウスにBxPC-3ヒト膵腺癌(ATCC CRL-1687)またはPC-3ヒト前立腺腺癌(ATCC CRL-1435)細胞を表６に従い接種した。腫瘍が約５００mm^３サイズに達したとき、マウスを処置群(ｎ＝１０)に分け、媒体単独またはＰＥＧＰＨ２０で処置した。ＰＥＧＰＨ２０処置について、マウスに１週間に２回、２週間、０.０１mg／kg、０.１mg／kg、１mg／kg、４.５mg／kgおよび１５mg／kg(それぞれ３５０Ｕ／kg、３,５００Ｕ／kg、３５,０００Ｕ／kg、１５７,５００Ｕ／kgおよび５００,０００Ｕ／kg)の投与量を尾静脈に全身的に注射した。腫瘍体積を上記のとおりノギス測定によりモニターした。

【0598】

ＰＥＧＰＨ２０の最大有効投与量は１mg／kg以下であることが観察された。PC-3異種移植モデルにおいて全投与量のＰＥＧＰＨ２０(媒体に対して０.１mg／kg、１mg／kg、４.５mg／kg、１５mg／kg投与量でＰ＜０.００１；０.０１mg／kg投与量でＰ＜０.０１)およびBxPC-3異種移植モデルで０.０１ mg／kgより多い全投与量のＰＥＧＰＨ２０(媒体に対して０.１mg／kg、１mg／kg、４.５mg／kg、１５mg／kg投与量でＰ＜０.００１)で有意な腫瘍阻害が観察された。０.０１μg／kg(ＰＣ３、ＨＡ^＋３)または０.１mg／kg(BxPC3、ＨＡ^＋２)を超える投与量で効果の有意な増加は観察されなかった。

【0599】

Ｄ. ヒアルロナン富腫瘍細胞のインビトロでのコロニー増殖に対するペグ化ｒＨｕＰＨ２０の効果
ＰＥＧＰＨ２０が、インビトロでヒアルロナン富前立腺腫瘍細胞(ＰＣ３)の足場非依存性増殖および拡散を阻止できるか否かを決定するために、三次元クローン原性アッセイを細胞で行った。ＰＣ３細胞を、約８０％集密度で、トリプシン処理し、回収し、１回完全培地で洗浄した。細胞密度を８×１０^４／mL細胞に調節し、氷上でMatrigel(登録商標)(BD Biosciences, San Jose, CA)に懸濁した。０.０２５mLのこの細胞／Matrigel(登録商標)混合物を、Matrigel(登録商標)で０.１mL／ウェルで予めコートしている４８ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃で１時間固化させた。対照ＡＰＩ緩衝液および０.６mL／ウェルのＡＰＩ緩衝液含有完全培地の種々の濃度のＰＥＧＰＨ２０で、１７日間連続的曝露のために、１Ｕ／mL、３Ｕ／mL、１０Ｕ／mLおよび１００Ｕ／mLのＰＥＧＰＨ２０を適当なウェルの頂上に添加した。ウェルを、３７℃で、加湿雰囲気下、空気中５％ＣＯ_２で１７日間インキュベートし、適当なとき、適当な濃度の酵素を含む処置媒体を、１７日間の期間中３〜４日間毎に置き換えた。

【0600】

１７日目、コロニーの増殖を、Insight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と組み合わせたNikon Eclipse TE2000U倒立顕微鏡で画像を捕捉することにより評価した。コロニー数および各コロニーの直径(μm)をImageJソフトウェア(オープンソースソフトウェア、画像表示および分析、面積および画素値計算に利用可能な公開プログラム)および組み合わされた較正関数を使用して測定した(コロニー体積をコロニー直径および式：４／３πｒ^３を使用して計算)。

【0601】

各条件のウェルの平均コロニー体積を決定し、対照サンプル(酵素無しのＡＰＩ(活性医薬成分)緩衝液(１０mM Ｈｅｐｅｓおよび１３０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７.０))における平均コロニー体積を、ペグ化ｒＨｕＰＨ２０存在下でインキュベートしたサンプルと比較して、コロニー体積に対するＰＥＧＰＨ２０の効果を決定した。阻害比を式：
(対照の平均体積−処置の平均体積)／(対照の平均体積)＊１００
を使用して計算した。

【0602】

ペグ化ｒＨｕＰＨ２０は、対照と比較して少ないコロニー体積により証明される、増殖の投与量依存性阻害を誘発した。上記式を使用して計算した阻害比に基づき、１Ｕ／mL、３Ｕ／mL、１０Ｕ／mLおよび１００Ｕ／mLのＰＥＧＰＨ２０存在下でインキュベートした培養物は、対照緩衝液とインキュベートした培養物と比較して、それぞれ平均でコロニー体積を３９％、６７％、７３％および７５％減少させた(３Ｕおよび１０Ｕサンプルについてはｐ＜０.０１；１００Ｕサンプルについてはｐ＜０.００１；ｎ＝６)。統計学的差異をマン・ホイットニー検定を使用して分析した。

【0603】

Graphpad Prism(登録商標)４プログラム(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)を使用して決定したコロニー体積減少におけるＰＥＧＰＨ２０のＩＣ_５０は約１.６７Ｕ／mLであった。コロニーの平均数は、媒体処置(対照)培養で１０.１７±１.５６／ウェルおよびＰＥＧＰＨ２０１００Ｕ／mL処置培養で１１.５０±０.８９／ウェルであった。コロニー数の差異は対照と１００Ｕ／mL培養で有意ではなかった(ｎ＝６、ｐ＞０.０５)。これらの結果は、ＰＥＧＰＨ２０が高ヒアルロナン腫瘍細胞の増殖および／または生存を阻害できることを示す。

【0604】

別の実験において、ＰＣ３細胞を上記のとおり再構成基底膜(Matrigel)に藩主し、媒体または０.１Ｕ／mL、１Ｕ／mL、１０Ｕ／mL、１００Ｕ／mLおよび１０００Ｕ／mLのＰＥＧＰＨ２０に１９日間暴露した。次いで画像をデジタル処理で捕捉し、コロニー体積をImageJプログラムを使用して捕捉した。対照と比較したコロニー体積の阻害は、それぞれ２２％、４５％、６３％、７３％および７４％であった(媒体と比較して１Ｕ／mlについてＰ＜０.０１、１０Ｕ／mLについてＰ＜０.００１およびそれ以上；ｎ＝３)。

【0605】

実施例７
ＰＥＧＰＨ２０に対するヒトＮＳＣＬＣ腫瘍の応答を予測するバイオマーカーとしてのＨＡの評価
Ａ. ＮＳＣＬＣ患者生検におけるＨＡの発現
先の研究は、上昇したＨＡの蓄積が非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)で起こることを示している(Hernandez JR, et al. (1995) Int J Biol Markers 10: 149-155 and Pirinen R, et al. (2001) Int J Cancer 95: 12-17)。それに反してＮＳＣＬＣ由来細胞株は低レベルであり、ＮＳＣＬＣ株化細胞がインビトロで継代中にＨＡ発現を失うことを示唆する。それゆえに、初代腫瘍生検におけるＨＡ発現を試験した。

【0606】

１９０種のＮＳＣＬＣ生検の組織マイクロアレイ(ＴＭＡ)パネル(USBiomax, Inc.)を、組織型およびＨＡ蓄積について試験した。ＨＡ含量は、実施例６に記載のとおりＢ−ＨＡＢＰ組織化学染色により決定した。強い正(褐色)染色面積対総染色面積の合計の比がそれぞれ２５％を超える、１０〜２５％、１０％未満または０であるとき、サンプルを＋３、＋２、＋１または０とスコア化した。このパネルにおいて、USBiomaxにより提供される病理診断に基づき、腺癌(ＡＤＣ)、扁平上皮細胞癌(ＳＣＣ)および大細胞癌(ＬＣＣ)細胞型がそれぞれ３２％、５１％および３％の頻度で観察された(表９)。他の未同定サブタイプは、試験した１９０サンプルの約１１％を構成した。

【0607】

腫瘍関連ＨＡ蓄積の分析は、全組織型が、ＨＡ^＋３高ＨＡ表現型を発現する細胞のサブセットを有し、約２７％の全体的割合であることを示した(表９)。特に、ＳＣＣ症例の４０％がＨＡ^＋３表現型を示し、一方ＡＤＣ症例の１１％およびＬＣＣ症例の３３％がＨＡ^＋３とスコア化された。ＳＣＣ症例の３４％はＨＡ^＋２表現型を示し、一方ＡＤＣ症例の４８％およびＬＣＣ症例の５０％がＨＡ^＋２とスコア化された。ＳＣＣ症例の２５％はＨＡ^＋１表現型を示し、一方ＡＤＣ症例の３６％およびＬＣＣ症例の１７％はＨＡ^＋２とスコア化された。このデータセットにおいて、正常肺組織サンプル発現のいずれもＨＡ^＋３表現型とはならなかったが、検出可能なＨＡはほとんどの正常肺組織サンプルで見られた。

【0608】

【表9】

^１ ＨＡスコアは、正ＨＡ染色強度の％に基づき規定した
^２ ＡＤＣ：腺癌
^３ ＳＣＣ：扁平上皮細胞癌
^４ ＬＣＣ：大細胞癌

【0609】

Ｂ. ＮＳＣＬＣ患者外植片におけるＨＡの発現およびＰＥＧＰＨ２０効果の予測
ＮＳＣＬＣのＨＡ過発現とＰＥＧＰＨ２０仲介ＨＡ枯渇に対する抗腫瘍応答の関係を前向き試験するために、ＨＡ蓄積程度が種々のヒトＮＳＣＬＣ患者腫瘍外植片を選択し、異種移植腫瘍モデルにおけるＰＥＧＰＨ２０処置に対する応答性を評価した。ＨＡ蓄積により特徴付けられる初代外植片を、外植片モデルが無処置腫瘍の遺伝的多様性のより代表的なサンプルを含み、天然腫瘍様間質の側面を保持するはずであるために、本研究で使用した。

【0610】

腫瘍生検を１６名のＮＳＣＬＣ患者から得て、ヌードマウス(Crown Bioscience, Beijing, China)において低継代数で皮下的に維持した。ＮＳＣＬＣ腫瘍外植片を、１〜４継代で外植片組織におけるＨＡ蓄積をスクリーニングし、上記のとおりＢ−ＨＡＢＰ組織化学染色によりＨＡ表現型(すなわち、＋１、＋２または＋３)を割り当てた。ＨＡ^＋３(ＬＵＭ６９７)表現型、ＨＡ^＋２(ＬＵＭ３３０)表現型およびＨＡ^＋１(ＬＵＭ８５８)表現型を表す３種の扁平上皮細胞型(ＳＣＣ)外植片を、異種移植について前向きに選択した。

【0611】

選択した腫瘍外植片について播種腫瘍が５００〜７００mm^３サイズに達したら、マウスを屠殺し、腫瘍を抽出し、３×３×３mm^３フラグメントに刻んだ。表６に示すとおり、各腫瘍につき１フラグメントを、メスＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右ひ腹に皮下的にインプラントした(各群ｎ＝１０)。腫瘍体積を、最大長手直径(長(Ｌ))および最大横断直径(幅(Ｗ))のノギス測定により決定し、(Ｌ×Ｗ^２)／２の計算を使用して概算した。平均腫瘍サイズが５００mm^３(３００〜６００mm^３範囲)に達したとき、動物を２群に無作為化した。治療のために、動物を、上の表７に示すとおり、媒体またはＰＥＧＰＨ２０で４.５mg／kgを１週間に２回、５投与で処置した。パーセンテージ腫瘍増殖阻害(％ＴＧＩ)および統計学的分析を実施例６に記載のとおりに行った。

【0612】

組織化学により決定したＨＡ表現型の順番(すなわち、＋１、＋２または＋３)は、ＰＥＧＰＨ２０による腫瘍増殖阻害の予測となることが判明した(表９)。例えば、増殖阻害パーセンテージはＬＵＭ６９７(ＨＡ^＋３)で９７％、ＬＵＭ３３０(ＨＡ^＋２)で４４％およびＬＵＭ８５８(ＨＡ^＋１)で１６％であった。さらに、腫瘍緩解がＬＵＭ６９７(ＨＡ^＋３)腫瘍外植片軍で観察されたが、ＬＵＭ３３０(ＨＡ^＋２)群およびＬＵＭ８５８(ＨＡ^＋１)群では観察されなかった：ＬＵＭ６９７(ＨＡ^＋３)腫瘍を有する１０匹中４匹の動物が、治療前と比較して腫瘍負荷が減少した。

【0613】

実施例８
異種移植腫瘍細胞ＤＮＡ合成および腫瘍微小環境(ＴＭＥ)に対するＰＥＧＰＨ２０処置の効果
Ａ. 腫瘍細胞ＤＮＡ合成に対するＨＡ枯渇の効果
ＨＡ枯渇がインビボで腫瘍細胞に対する抗増殖性効果を有するか否かを試験するために、ＰＥＧＰＨ２０処置PC-3(ＨＡ^＋３)腫瘍異種移植をＤＮＡ合成のレベルについて試験した。

【0614】

６〜８週齢ｎｕ／ｎｕ(Ｎｃｒ)無胸腺ヌードマウスに、実施例６に記載のとおり、PC-3腫瘍細胞を脛骨周囲内(intraperitibially)にインプラントした(０.０５mL中１×１０^６細胞／マウス)。腫瘍体積をノギス測定でモニターした。腫瘍が〜４００mm^３に達したら、マウスを、１００μLの媒体またはＰＥＧＰＨ２０(１mg／kg(３５,０００Ｕ／kg)または４.５mg／kg(１５７,５００Ｕ／kg)；２０ｇマウス体重に基づき約７００Ｕ／投与量または３１５０Ｕ／投与量)で、１週間に２回、２週間尾静脈への注射により処置した。実験終了２４時間前、マウスに１０mg／kg ＢｒｄＵ(０.２mL)(Invitrogen, Cat#00-0103)を腹腔内投与した。腫瘍をマウスから切除し、１０％緩衝化ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。組織を５μm切片に切断し、細胞増殖を抗ＢｒｄＵ抗体(ＢｒｄＵ染色キット；Invitrogen, Cat#93-3943)で染色後、製造者の指示に従い評価した。

【0615】

ＰＥＧＰＨ２０で処置した動物を媒体処置動物と比較した。媒体処置腫瘍と比較して、ＰＥＧＰＨ２０処置腫瘍において合成活性核の５８.３％減少が観察された(ＢｒｄＵ陽性核は４.８％から２％に減少した)。この結果は、ＰＥＧＰＨ２０処置の結果として前立腺ＰＣ３(ＨＡ^＋３)または膵臓BxPC3(ＨＡ^＋２)異種移植での観察される増殖阻害と一致した(１mg／kg以上の投与量で〜５０％ＴＧＩ)(実施例６参照)。

【0616】

Ｂ. 腫瘍微小環境関連タンパク質の発現に対するＨＡ枯渇の効果
先の試験は、ＨＡ^＋３腫瘍のＰＥＧＰＨ２０での処置が腫瘍間質性流体圧(ＩＦＰ)に、それそれゆえに腫瘍とその外部環境の流体圧差に劇的な効果を有することを示している(Thompson et al.(2010)参照)。ＴＭＥにおける物理的変化は遺伝子発現に影響を有する(Shieh AC (2011) Ann Biomed Eng 39:1379-1389)。ＨＡ除去がＴＭＥタンパク質のターンオーバーまたは発現に影響を有するか否かを試験するために、活性にリモデリングするマトリックスで見られるマウスコラーゲンＩ(Ｃｏｌ１α１)、マウスコラーゲンＶ(Ｃｏｌ５α１)およびテネイシンＣ(ＴＮＣ)のようなＴＭＥタンパク質の発現を試験した。

【0617】

１. 腫瘍組織におけるコラーゲンの局在化および半定量化
実施例８Ａにおいて産生したPC-3腫瘍由来の隣接皮膚を伴う腫瘍組織を１０％中性緩衝化ホルマリンに４８時間固定化し、組織処理装置(TISSUE-TEKVIP, Sakura Finetek, CA)を使用して処理し、パラフィンブロックに包埋した。パラフィン包埋組織サンプルを５μm切片に切断し、脱脂し、脱イオン水で再水和した。抗原回復を、スライドをＥＤＴＡ緩衝液中、ｐＨ８.０、１００℃で２５分間過熱することにより処理した。スライドをＰＢＳ−Ｔで濯ぎ、２％ＰＢＳ／ＢＳＡ中２％正常ヤギ血清で３０分間遮断し、続いてウサギポリクローナル抗コラーゲンタイプ１抗体(１：２００、Abcam, Cat#ab34710)と２時間、室温でインキュベートした。次いで、切片をTexas redタグ付ヤギ抗ウサギＩｇＧ(１：２００、Vector Laboratories, Cat# F1-1000)と１時間、室温でインキュベートし、対比染色し、ＤＡＰＩ(Invitrogen, CA)と共にProLong(登録商標)Gold antifade試薬を用いてマウントした。顕微鏡写真をＲＴ３カメラ(Diagnostic Instruments, MI)と組み合わせたZeiss Axioskop顕微鏡下に捕捉した。各セクションからの無作為５視野をコラーゲン陽性強度について、Image-Pro plusプログラムを使用して分析した。

【0618】

２. ＰＣ３異種移植腫瘍組織における遺伝子発現のｃＤＮＡアレイ分析
実施例６Ａに記載のとおりＰＣ３腫瘍担持Ncr nu/nuマウスを産生し、媒体またはＰＥＧＰＨ２０で処置した。動物を、媒体またはＰＥＧＰＨ２０で処置８時間および４８時間後に屠殺した。腫瘍組織を無菌条件下で切除し、液体窒素で急速冷凍した。総ＲＮＡを、Asuragenの標準的操作法に従い凍結組織から単離した。総ＲＮＡサンプルの純度および量を、NanoDrop ND-1000UV分光光度計を使用する２６０nmおよび２８０nmの吸光度解読により決定した。総ＲＮＡの完全性を、Agilent Bioanalyzer 2100マイクロフルイディック電気泳動により定量した。ｍＲＮＡプロファイリング試験のためのサンプルを、Asuragen, Inc.により、Affymetrix Mouse 430 2.0およびHuman U133 plus 2.0アレイを使用して処理した。

【0619】

３. 結果
PC-3腫瘍におけるＣｏｌ１α１の腫瘍特異的減少が、ＰＥＧＰＨ２０での処置によるＨＡ枯渇後に観察された。媒体処置腫瘍と比較したＣｏｌ１α１染色の８０％減少が観察された(Ｐ＜０.０５ ｔ検定)。ＰＥＧＰＨ２０処置マウスからの皮膚におけるＣｏｌ１α１染色は、しかしながら、安定なままであった。さらに、Ｃｏｌ１α１、Ｃｏｌ５α１およびＴＮＣについてマウス(間質)ｍＲＮＡのレベル減少が、ｍＲＮＡ発現アレイ分析で祖ｋ低して観察された。ＴＮＣ ｍＲＮＡは最も顕著に影響を受け(６６％減少)、続いてＣｏｌ１α１(５３％減少)およびＣｏｌ５α１(４５％減少)であった。これらの結果は、ＴＭＥ内のＨＡ枯渇がタンパク質発現の顕著な変化をもたらすことを示唆する。

【0620】

実施例９
ＴＳＧ−６結合モジュールＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質の産生
ＴＳＧ−６の結合モジュールおよびＩｇＧのＦｃドメインを含む融合タンパク質ＤｅａｒｕＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃを産生した。ＴＳＧ−６結合モジュールのヘパリン結合領域が変異した変異体融合タンパク質ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐも産生した。

【0621】

Ａ. 組み換えヒトＴＳＧ−６結合モジュール融合タンパク質のベクター構築
ＤＮＡ新規合成(GenScript, NJ)を用いて、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を産生した。核酸は、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパ(κ)リーダーシグナルペプチド配列(配列番号２１０)をコードするＤＮＡ、ヒトＩｇＧ１重鎖の６６９bp長ｃＤＮＡフラグメント(GI No. 5031409；配列番号２０３、配列番号２０４に示すペプチド配列をコードする)およびヒトＴＳＧ−６結合モジュール領域の２８５bp長ｃＤＮＡフラグメント(配列番号２１６、配列番号２０７に示すペプチド配列をコードし、これは配列番号２０５(ｍＲＮＡ)および配列番号２０６(タンパク質)に示すＴＳＧ−６プレタンパク質、GI No. 315139000のアミノ酸位置３５〜１２９に対応)を含む。ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトＴＳＧ−６結合モジュール領域を、６bp ＡｇｅＩ制限酵素開裂部位および元々ＩｇＧ１ Ｆｃ配列の一部として公開された４個のさらなるアミノ酸(ＤＫＴＨ；配列番号２０９)をコードする１２bp配列、ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ(配列番号２０８)を含む(Nucleic Acids Research, 1982, Vol. 10, p4041)。融合タンパク質配列にフランキングな、５’末端のＮｈｅＩおよび３’末端のＢａｍＨＩの２個の特有の制限酵素開裂部位を合成した。合成したフラグメントは、配列番号２１７に示す配列を有する。フラグメントは、タンパク質発現改善および新規ＤＮＡ合成による合成について最適化されたコドンであった。コドン最適化フラグメントは、配列番号２１１に示す配列を有する。コードされるＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質配列は配列番号２１２に示す。

【0622】

合成したコドン最適化フラグメントを、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ開裂部位を介して、周知の組み換えＤＮＡ法(New England Biolabs, Ipswich, MAから得られた制限酵素およびライゲーション試薬)を使用してpHZ24 IRESバイシストロニック哺乳動物発現ベクター(配列番号５２)に挿入し、pHZ24-ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ構築物(配列番号２１３)を産生した。このベクターでの組み換えタンパク質発現はＣＭＶプロモータにより駆動される。

【0623】

ヒアルロナン(ＨＡ)結合特異性を亢進し、他のＧＡＧ鎖の結合を減少するために、ＴＳＧ−６結合モジュールのアミノ酸位置５５、６９、７６に３箇所のリシンからアラニン変異を含む変異体融合タンパク質であるＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐをコードする構築物を構築した。変異はＴＳＧ−６結合モジュールのヘパリン結合活性を減少させるが、ＨＡ結合活性に影響しない(ヘパリン結合部位における三重変異体；Ｋ２０Ａ／Ｋ３４Ａ／Ｋ４１Ａの１０倍低いヘパリン結合活性を報告するMahoney DJ et al. (2005) J Biol Chem. 280:27044-27055参照)。ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐを、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸フラグメントの変異誘発およびpHZ24-ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ(配列番号２１８)を産生するためのpHZ24 IRESベクターへの挿入により産生した。ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐフラグメントの配列を配列番号２１４に示し、これは、配列番号２１５に示すSG-6-LM−Ｆｃ／ΔＨｅｐ融合タンパク質をコードする。

【0624】

Ｂ. 組み換えタンパク質発現および精製
FreeStyle CHO-S懸濁細胞(Invitrogen)をＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ融合タンパク質の発現に使用した。遺伝子導入前、FreeStyle CHO-S懸濁細胞株をCHO-S CD培養培地(Invitrogen)に維持した。遺伝子導入および組み換えタンパク質発現のための細胞を調製するために、FreeStyle CHO-S細胞を、８mM Ｌ−グルタミン添加FreeStyle CHO発現培地(Invitrogen)で、振盪フラスコ中、３７℃で空気中８％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、１２５rpmで回転するオービタルシェーカープラットフォームで、通気を可能にするためフラスコのキャップを緩めて培養した。

【0625】

懸濁細胞の一過性遺伝子導入を製造者の指示に従い行った。簡単に言うと、細胞を遺伝子導入２４時間前に密度６×１０^５／mlに分け、ＤＮＡ／脂質比１：１でFreeStyleMax脂質を使用して遺伝子導入した。遺伝子導入９６時間後、細胞を４,０００ｇで２０分間で回収し、上清を回収した。一過性遺伝子導入後のタンパク質発現レベルの時間経過分析は、タンパク質発現レベルが遺伝子導入９６時間後プラトーに達することを確認した。それゆえに、組み換えタンパク質を遺伝子導入９６時間後に回収した。

【0626】

回収した上清中の発現したＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ融合タンパク質を、製造者の指示に従いプロテインＡ樹脂(Bio-Rad, Hercules, CA)による親和性精製により回収した。簡単に言うと、回収した上清を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４(Teknova Catalog No. T1074)および５Ｍ ＮａＣｌ(Sigma)を用いてｐＨ７.４、０.１５Ｍ ＮａＣｌに調節し、プロテインＡカラムへの充填前に結合緩衝液で３倍希釈した。溶出した生成物を直ぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.５で中和し、リン酸平衡化溶液(ＰＢＳ、１３７mM ＮａＣｌ、２.７mM ＫＣｌ、８mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１.４６mM ＫＨ_２ＰＯ_４およびｐＨ７.４)に対して４℃で透析し、−２０℃で保存した。一工程プロテインＡ親和性カラムを介した上清からの精製タンパク質の収量は３〜５mg／リットルであった。

【0627】

Ｃ. 発現組み換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
精製融合タンパク質の純度、サイズおよび同一性を、還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ４〜２０％勾配ゲルおよびウェスタンブロット分析により決定した。６０ngの精製タンパク質を本分析に使用した。精製融合タンパク質のサイズは還元条件下で約４０kDaおよび非還元条件下で約８０kDaであり、発現タンパク質がＩｇＧ Ｆｃのヒンジ領域におけるジスルフィド結合を介するホモ二量体を形成することを示唆する。タンパク質サンプルの純度は９５％を超えた。精製タンパク質はＰＢＳ中、少なくとも１ヶ月間、４℃で、何らかの目に見える分解または結合活性喪失なく安定であった。

【0628】

ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐにおけるＴＳＧ−６結合モジュールの同一性をヤギ抗ヒトＴＳＧ−６ＩｇＧ(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)、続いてウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ(EMD, San Diego, CA)とのウェスタンブロットにより評価した。組み換え完全長ヒトＴＳＧ−６タンパク質(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を陽性対象として用いた。還元および非還元条件下のウェスタンブロット分析により検出されたタンパク質のパターンは、非還元条件下で少量の上部バンド(分子量サイズから、組み換えタンパク質の四量体を表す可能性が最も高い)が観察された以外ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のものと同じであった。

【0629】

精製組み換えタンパク質のＦｃ部分の同一性を、ＨＲＰ−ウサギ抗ヒトＩｇＧＦｃを用いるウェスタンブロット分析で確認した(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)。検出されたタンパク質のパターンはＳＤＳ−Ｐａｇｅおよび抗ＴＳＧ−６分析と同じであり、精製タンパク質がＴＳＧ−６結合モジュール(ＬＭ)ならびにｈＩｇＧＦｃの両者を含むことを示した。

【0630】

タンパク質がグリコシル化されているか否かを分析するために、精製タンパク質を、タンパク質からＮ結合オリゴ糖類を除去するグリコシダーゼPNGase F(０.５単位／ngタンパク質)で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。PNGase F処置前後でタンパク質分子量で５kDaの差異が見られ、該発現タンパク質がグリコシル化されていることを示した。

【0631】

実施例１０
ＴＳＧ−６のヒアルロナンおよびヘパリンへの結合
ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃおよびその変異体の両者のＨＡおよびヘパリンへの結合を試験するために２形態を使用した。第一形態において、ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐの、マイクロプレート上の固定化ＨＡまたはヘパリンへの結合を用いた。第二形態において、ビオチニル化ＨＡおよびヘパリンの、マイクロプレート上の固定化組み換えＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐタンパク質への結合を用いた。

【0632】

Ａ. 組み換えＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐの固定化ＨＡおよびヘパリンへの結合
野生型および変異体ＴＳＧ−６−ＬＭ Ｆｃ融合ホモ二量体を、ＨＡまたはヘパリン被覆マイクロプレートを使用して、そのＨＡ結合およびヘパリン結合活性を試験した。簡単に言うと、平均ＭＷ約１０００kDaのヒアルロナン(Lifecore, Chaska, MN)または平均ＭＷ１５kDaのヘパリン(Calbiochem, San Diego, CA)を、.５Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９.６中１００μg／mlの濃度で９６ウェルプレートに２個ずつ１００μl／ウェルで分配し、４℃で一夜インキュベートした。プレートを１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で遮断して、非特異的結合を減少させた。

【0633】

ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ精製タンパク質サンプルを希釈して、ＨＡ被覆プレートへの結合について０.３１〜４０ng／ml、ヘパリン被覆プレートへの結合について０.７８〜１００ng／mlの濃度範囲とした。各サンプルについて、１００μl／ウェルを２個ずつマイクロプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを０.０５％Tween 20含有ＰＢＳで５回洗浄して、未結合タンパク質を除去した。ヒアルロナンまたはヘパリン結合したＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐをウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、続いてＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)基質(KPL, Gaithersburg, MD)で検出した。サンプルを、ウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ抗体と６０分間インキュベートした。洗浄後、結合したＨＲＰを、１０〜１５分間の発色時間の間ＴＭＢ溶液で検出し、続いて発色停止のためにリン酸試薬を添加した。吸光度を、Molecular Devices, Spectra M3分光光度計を使用してＯＤ４５０で測定した。

【0634】

ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのいずれでも、同じＨＡ結合活性をＨＡ被覆プレートで示し、ＨＡ結合活性のこれらの滴定曲線はほとんど重複し、これら２種の発現タンパク質が、ＨＡ結合の滴定曲線からのＥＣ_５０値に基づきＨＡに高親和性で結合することを示した。ヘパリン結合部位における３重変異はＨＡ結合に影響しなかった。対照的に、ヘパリン被覆プレートへの２種のタンパク質の結合は、有意な差を示した。野生型ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃはヘパリンに結合するがそのＨＡへの結合と比較して相対に低い結合活性であり、これは、プレート上を被覆する２個のＧＡＧ鎖のサイズ差によるものであり得る。変異体ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃタンパク質は、野生型と比較して約１０％のヘパリン結合活性を示し、これは、三重変異ＴＳＧ−６−ＬＭ単量体の報告されている結果と一致した(Mahoney DJ et al. (2005))。

【0635】

Ｂ. ビオチニル化ＨＡおよびヘパリンの固定化組み換えＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐへの結合
野生型ＴＧＳ６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのＧＡＧ結合特性を、さらにマイクロプレートを組み換えタンパク質でコーティングし、ビオチニル化ＨＡおよびビオチニル化ヘパリンへのその結合を評価することにより試験した。

【0636】

マイクロプレートの調製のために、１×ＰＢＳ緩衝液中２μg／ml濃度のＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐを９６ウェルプレートに２個ずつ１００μl／ウェルで分配し、４℃で一夜インキュベートした。プレートを１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で遮断して、非特異的結合を減少させた。

【0637】

ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ精製タンパク質サンプルを希釈して、ＨＡ被覆プレートへの結合について０.３１〜４０ng／ml、ヘパリン被覆プレートへの結合について０.７８〜１００ng／mlの濃度範囲とした。各サンプルの１００μl／ウェルを２個ずつマイクロプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ヒアルロナンまたはヘパリン結合したＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐを抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、続いてＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)基質(KPL, Gaithersburg, MD)で検出した。

【0638】

ＨＡのビオチニル化について、ＨＡのカルボキシル基をヒドラジド化学を介する結合に使用した。簡単に言うと、ビオチン−ヒドラジドをＤＭＳＯに２５mM濃度で溶解し、体積比６：１００で、１０００kDaまたは１５０kDa分子量ＨＡ(Lifecore Biomedical, LLC Chaska, MN)を、０.１ＭＭＥＳ、ｐＨ５.０中１mg／mlで含むＨＡ溶液に添加した。１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロライド(ＥＣＤ)およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(スルホ−ＮＨＳ)を結合反応にそれぞれ４０μＭおよび８５０μＭの濃度まで添加し、ビオチン−ヒドラジドおよびＨＡの結合を仲介させた。反応物を、撹拌しながら４℃に一夜維持した。過剰量の化学物を透析によりビオチニル化ＨＡから除去した。ビオチニル化ヘパリンをEMD, San Diego(Catalog No. 375054)から購入した。

【0639】

ビオチニル化ヒアルロナンまたはヘパリンを、ＰＢＳ中、０.７８ng／ml〜１００ng／mlの濃度範囲に希釈し、１００μl／ウェルで分配し、室温で１時間インキュベートした。プレートプレートを０.０５％Tween 20含有ＰＢＳで５回洗浄して、未結合タンパク質を除去した。結合したビオチニル化ヒアルロナンおよびヘパリンを、上記のとおり抗ストレプトアビジン−ＨＲＰ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、続いてＴＭＢ基質(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)基質(KPL, Gaithersburg, MD)で検出した。吸光度をＯＤ４５０で測定した。

【0640】

観察された結合の結果は、固定化ＨＡおよびヘパリンおよび遊離ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐを使用する実施例１０Ａで実施した結合アッセイと類似した。ビオチニル化ＨＡに対する固定化ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐの結合活性またはＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐの結合滴定曲線に顕著な差はなく、野生型タンパク質と比較して変異体ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのビオチニル化ヘパリンへの結合の顕著な減少も観察された。それ故、野生型ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃおよびその変異体のＨＡおよびヘパリン結合特性をＧＡＧ被覆または組み換えタンパク質被覆形態で評価でき、両形態とも類似結合パターンを確認した。

【0641】

Ｃ. ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃの結合親和性の計算
ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃのＨＡ結合親和性を、Bio-Layer Interferometry(BLI)技術を使用して、Octet QKe装置(ForteBio, Menlo Park, CA)により計算した。完全長ＴＳＧ−６組み換えタンパク質(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を対照として使用した。簡単に言うと、平均分子量の１５０kDaのビオチニル化ＨＡをストレプトアビジン被覆バイオセンサー上に２４０秒間固定化した。次いで、ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐを固定化ＨＡと１８０秒間、ＰＢＳ中、種々の濃度でｐＨ６.０またはｐＨ７.４で結合させ、続いて結合タンパク質を、ＰＢＳ中、ｐＨ６.０またはｐＨ７.４で２４０秒間解離させた。結合動力学の結果を製造者により提供されるソフトウェアにより分析した。計算した結合親和性の結果を表１０に示す。

【表10】

【0642】

実施例１１
他のグリコサミノグリカン類によるヒアルロナンおよびヘパリンへのＴＳＧ−６の結合の競合的阻害評価
ＴＳＧ−６結合モジュールのＨＡおよびヘパリンＧＡＧ結合部位は、結合モジュールの異なる領域に位置する。２個の結合部位が、ＴＳＧ−６結合モジュールとの相互作用中または他のＧＡＧ鎖の存在下で互いに妨害されるか否かを決定するために、競合的阻害アッセイを実施して、他のＧＡＧ鎖の存在下ＨＡまたはヘパリンの結合を評価した。

【0643】

ＨＡおよびヘパリン被覆９６ウェルマイクロプレートを実施例１０Ａに記載のとおり調製した。ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐを、ＨＡ被覆プレートについて４０ng／mlおよびヘパリン被覆プレートについて１００ng／mlの濃度で、ＨＡ(Lifecore Biomedical, LLC Chaska, MN)、コンドロイチン硫酸Ａ(EMD, San Diego, CA、Catalog No. 230687)コンドロイチン硫酸Ｃ(EMD, San Diego, CA、Catalog No. 2307)およびヘパリン硫酸(EMD, San Diego, CA、Catalog No. 375095)の４種のＧＡＧ鎖と３濃度(０.１１μg／ml、０.３３μg／ml、１.０μg／ml)でまたは対照としてＧＡＧ鎖無しで、室温で１０分間インキュベートした。次いで、サンプルをＨＡおよびヘパリン被覆９６ウェルマイクロプレートに２個ずつ分配し(１００μl)、室温で１時間インキュベートした。プレートプレートを０.０５％Tween 20含有ＰＢＳで５回洗浄して、未結合タンパク質を除去した。結合したＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐを、上記のとおり抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、続いてＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)基質(KPL, Gaithersburg, MD)で検出した。吸光度をＯＤ４５０で測定した。

【0644】

ＨＡ被覆プレートについて、ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐの両者とも類似の競合的阻害パターンを証明した。ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃの固定化ＨＡへの結合は、同量のタンパク質と種々の量の遊離ＨＡのプレインキュベーションで効率的に阻害されたが(０.１１μg／ml、０.３３μg／ml、１.０μg／ml量でそれぞれ約６８％、８５％および９３％阻害)、種々の量の遊離ヘパリンまたはコンドロイチン硫酸Ｃとのプレインキュベーションでは影響を受けなかった。ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐの幾分かの阻害がコンドロイチン硫酸Ａとのプレインキュベーションで観察されたが、ＨＡより少なかった(０.１１μg／ml、０.３３μg／ml、１.０μg／ml量で約２３％、４３％および６３％阻害)。それゆえに、約１０倍高量のコンドロイチン硫酸Ａが阻害に必要であった(別の実験では、３０倍高量のコンドロイチン硫酸ＡがＨＡと同等の阻害に必要であった)。ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐがコンドロイチン硫酸Ａとのプレインキュベーションで類似の阻害を示すため、ＴＳＧ−６結合モジュールにおけるＨＡ結合部位はコンドロイチン硫酸Ａ結合を担う可能性がある。

【0645】

ヘパリン被覆プレートについて、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃのヘパリンへの結合はヘパリンとのプレインキュベーションだけでなく、ＨＡまたはコンドロイチン硫酸Ａとのプレインキュベーションでも効率的に阻害された。このデータは、TSG-6-Fc-LMのＨＡへの結合がそのヘパリン結合活性を遮断することを示す。予測とおり、変異体ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐはヘパリンと結合せず、それゆえに対照およびプレインキュベーションサンプルの背景に近い読み取りとなった。

【0646】

この研究は、ＴＳＧ−６の結合モジュールのＨＡへの結合が遊離ヘパリンまたは予め形成されたＴＳＧ−６ヘパリン複合体により影響を受けないが、そのヘパリンへの結合は、遊離ＨＡまたは予め形成されたＴＳＧ−６ＨＡ存在下で有意に阻害されることを証明する。これらの観察に基づき、ＴＳＧ−６−ＬＭはＨＡおよびヘパリンに同時に結合するまたはＴＳＧ−６−ＬＭのＨＡへの結合はそのヘパリンへの結合より強いと結論付けることができる。ＨＡおよびＴＳＧ−６−ＬＭ複合体形成は、ヘパリンへの結合に好ましくないタンパク質配座変化または他のタンパク質の配置を生じ得る。

【0647】

実施例１２
ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐおよびＨＡＢＰのグリコサミノグリカン結合特性の比較
本実施例において、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐおよびＨＡ結合タンパク質(ＨＡＢＰ)のＨＡ、ヘパリンおよび他のＧＡＧへの特異性および結合活性を比較した。この実験のために、ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃおよびビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ ＨＡ結合タンパク質を産生し、市販のビオチニル化−ＨＡ結合タンパク質(ＨＡＢＰ)(Seikagaku, Tokyo, Japan)と、ＧＡＧ鎖被覆プレート上の結合活性について比較した。

【0648】

Ａ. ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのビオチニル化
無作為標識アプローチを使用して、ＨＡ結合部位を保護するために遊離ＨＡとのプレインキュベーションなしで、ビオチンをタンパク質中の１級アミン含有残基(Ｌｙｓ)に結合した。ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのビオチニル化のために、１級アミン活性試薬ＮＨＳ−ＰＥＧ_４−ビオチン(Thermo Fisher Scientific, Chicago, IL)の直接結合を製造者の指示に従い行った。ＰＢＳ中１mg／ml濃度の０.５mgタンパク質および１０μlの２０mM ビオチニル化試薬をビオチニル化反応に使用した。ＮＨＳ−ＰＥＧ_４−ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＮＨＳ)基は特異的におよび効率的にリシンおよびＮ末端アミノ基とｐＨ７〜９で反応して、安定なアミド結合を形成する。親水性ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)スペーサーアームは水溶解度を与え、これはビオチニル化分子に移され、それゆえに溶液で貯蔵する標識タンパク質の凝集を減少させる。ＰＥＧスペーサーアームはまた試薬に長くかつ可動性の結合を与え、アビジン分子への結合に関与する立体的障害を最小化する。未反応ＮＨＳ−ＰＥＧ_４−ビオチンを１×ＰＢＳでの透析により除去し、−２０℃で保存した。

【0649】

比較のために、ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐタンパク質もまた、ＮａＩＯ_４、続いてビオチン−ヒドラジドを使用してタンパク質上の多糖鎖を酸化することにより、タンパク質上の糖鎖にビオチン単位を結合させる志向性標識アプローチを使用してビオチニル化した。簡単に言うと、０.１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７.２中１mg／ml濃度の１mlタンパク質を、最初に最終濃度５mg／mlの過ヨウ素酸ナトリウム(ＮａＩＯ_４)で、４℃で３０分間酸化した。本反応は糖類上の２個の隣接する１級ヒドロキシル基を、対応するアルデヒド反応性基に変換すする。酸化タンパク質を０.１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７.２に対して透析した。次いで、透析したタンパク質を、体積比９：１でＤＭＳＯ中に調製した５０mMヒドラジド−ビオチンと混合し、反応中５mMヒドラジド−ビオチンとし、室温で２時間インキュベートして、アルデヒド基とヒドラジド基の間にヒドラゾン結合を形成させた。標識タンパク質を１×ＰＢＳに対して透析し、−２０℃で保存した。

【0650】

結合および遊離ビオチン除去後、ビオチン−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃおよびビオチン−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐの両者のＨＡ結合活性を非標識の対応するタンパク質と共に試験して、ＨＡ被覆プレートを使用する実施例１０Ａに記載の結合アッセイを使用して標識がＨＡ結合活性を減少させるか否かを試験した。標識対非標識タンパク質でＨＡ結合活性の差は見られなかった。

【0651】

Ｂ. ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ、ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐおよびビオチニル化−ＨＡＢＰのＧＡＧへの結合
ＧＡＧ被覆マイクロプレートの調製のために、ＨＡ、ヘパリン、コンドロイチン硫酸Ａまたはコンドロイチン硫酸Ｃを、０.５Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液中１００μg／mlの濃度で、１００μl／ウェルで９６ウェルプレートに２個ずつ分配し、４℃で一夜インキュベートした。プレートを１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で遮断して、非特異的結合を減少させた。ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ、ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐおよびビオチニル化−ＨＡＢＰの３種のビオチニル化タンパク質をＨＡ、コンドロイチン硫酸Ａおよびコンドロイチン硫酸Ｃ被覆プレートへのために結合０.０５〜１００ng／mlおよびヘパリン被覆プレートへの結合のために０.２３〜５００ng／mlの濃度範囲まで希釈した。希釈したタンパク質サンプルを、プレートに、１００μl／ウェルで２個ずつ分配し、室温で１時間インキュベートした。ＧＡＧ被覆プレートに結合したタンパク質を、上記のとおりストレプトアビジン−ＨＲＰ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)、続いてＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)基質(KPL, Gaithersburg, MD)で検出した。吸光度をＯＤ４５０で測定した。

【0652】

全３種のビオチニル化ＧＡＧ結合タンパク質は、ＨＡ被覆プレートで強ＨＡ結合活性を示した。ＨＡの最大結合濃度(すなわち３３.３ng／mlおよび１００ng／ml)より低い一つの希釈を表す１１.１ng／mlタンパク質濃度で、ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃおよびビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのＨＡへの結合は背景の約１４倍であり、Ｂ−ＨＡＢＰＨＡへの結合は背景の約９倍であった。

【0653】

ビオチニル化−ＨＡＢＰおよびビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのいずれもヘパリン被覆プレートに対してほとんど結合活性を示さなかった。ビオチニル化−野生型ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃもまたヘパリン結合活性は陰性であり、ＮＨＳ−ＰＥＧ_４−ビオチンを用いる無作為標識アプローチはヘパリン結合活性を喪失させることを示唆した。ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃを上記のとおり志向性標識アプローチによりビオチニル化したとき、ヘパリンへの結合は回復し、タンパク質は、非標識ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃと類似のヘパリン結合活性を示した。それゆえに、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃのヘパリン部位におけるリシンのビオチン修飾は、そのヘパリン結合活性をなくす。

【0654】

全３種のタンパク質ともコンドロイチン硫酸Ｃ被覆プレートへの結合活性を示さなかったが、コンドロイチン硫酸Ａ被覆プレートに対する強い結合を示した。ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃおよびビオチン−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐはビオチン−ＨＡＢＰより数倍高い結合活性を示すことが観察された。１１.１ng／mlタンパク質濃度で、ビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃおよびビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのＨＡへの結合は、それぞれ背景の約２０倍および１２倍であり、Ｂ−ＨＡＢＰＨＡへの結合は背景の約６倍であった。それにもかかわらず、ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃおよびＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐのいずれもＧＡＧ競合的アッセイにおいて示されるとおり、ＨＡへの結合についてはるかに強い優先性を有した。実施例１１に示すとおり、少なくとも１０倍のコンドロイチン硫酸ＡがＨＡと同等の競合的阻害のために必要であった。さらに、別の実験において、ＧＡＧ競合的アッセイにおいてビオチニル化−ＨＡＢＰをビオチニル化−ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃと比較し、ビオチン−ＨＡＢＰのＨＡへの結合対ＴＳＧ−６−ＬＭ−ＦｃのＨＡへの結合で、４種のＧＡＧ鎖(ＨＡ、ヘパリンコンドロイチン硫酸類ＡおよびＣ)の類似の阻害パターンが観察された。

【0655】

実施例１３
アグリカン結合アッセイによるＫ_３−ＥＤＴＡヒト血漿におけるヒアルロナンの定量化
ヒアルロナンの濃度を、サンドイッチ結合アッセイを使用して臨床的ヒト血漿サンプルで決定した。血漿サンプルを、進行段階の種々の腫瘍タイプの固形腫瘍を有し、デキサメサゾン存在下または非存在下での患者におけるＰＥＧＰＨ２０の漸増投与量を評価する臨床試験(相１−１０１および相１−１０２；表１１参照)に参加している１９名の対象から得た。さらに、血漿サンプルをまた２０名の正常患者から得た(BioReclamation, Hicksville, NYから得た)。ＰＥＧＰＨ２０での処置前に、ＨＡのベースラインレベルを次のとおり決定した。

【0656】

Immulon 4HBX９６ウェル平底マイクロタイタープレート(Immulon/Thermo;Catalog No. 3855)を、捕獲試薬としての組み換えヒトアグリカン(ｒＨｕ−アグリカン)(R&D Systems, Catalog No. 842162)で被覆した。使用前に、ｒＨｕ−アグリカンを１バイアルに２５０μlの試薬希釈剤を添加することにより再構成し、２〜８℃で最大１ヶ月保存した。次いで、ｒＨｕ−アグリカンの０.５μg／mL溶液を産生するために、原液の２４０倍希釈を調整した(例えば４１.７μL原液に対し約１０mLＰＢＳ)。希釈直後、１００μLを４ＨＢＸプレートの各ウェルに分配し、プレートをプレートシーラーで覆い、一夜または最大３日間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、プレートの各ウェルを１×ＰＢＳＴ洗浄緩衝液(１×ＰＢＳ、０.０５％Tween 20)で、ELx405Select CWプレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。次いでアッセイプレートを遮断緩衝液(ＰＢＳ中５％Tween 20)で、各ウェルに３００μLの遮断緩衝液を添加することにより遮断した。プレートを付着性プレートカバーで覆い、環境温度で少なくとも１時間、振盪せずにインキュベートした。

【0657】

プレートをサンプルと共にインキュベートする前に、血漿サンプルおよび標準曲線を作製した。簡単に言うと、血漿試験サンプルを得て、分析するまで≦６０℃で貯蔵した。分析直前に、試験サンプルを氷水上で融解し、希釈直前にボルテックス処理により短く混合した。次いで、少なくとも１個のサンプル希釈が、試薬希釈剤(５％Tween-20 PBS溶液、６.５mL Tween-20(Sigma;Catalog No. P7949)を１２３.５mLリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳに添加することにより作製；CellGro；Catalog No. 21-031-CV))で希釈した較正曲線の範囲内に入ることを確実にするために、血漿試験サンプル希釈の数回連続希釈を作製した。アッセイの正当性を評価するために、２個の品質対照サンプルもアッセイのために希釈した。対照は、Ｋ_３−ＥＤＴＡ(貯留ヒトＫ_３−ＥＤＴＡ血漿；“低品質対照”)中に回収した貯留ヒト血漿および外来性ヒアルロナン(ＨＡ)添加貯留ヒトＫ_３−ＥＤＴＡ血漿(“高品質対照”)であった。ヒトＫ_３−ＥＤＴＡ血漿(対照として使用)のための最小必要希釈(ＭＲＤ)は１：４であった。希釈はポリプロピレンチューブ(例えば、BioRad Titerチューブ；BioRad, Catalog No. 223-9391)中であり、５００μlの総体積(サンプルおよび希釈剤)とした。各希釈物を、パルス−ボルテックスにより製造したとおり混合した。ピペットを各希釈毎に変えた。

【0658】

標準曲線のために、ヒアルロナン原液(１３２kD、１８００ng／mL；R& D Systems, Catalog No. 842164)を５００ng／mL、１６７ng／mL、５５.６ng／mL、１８.５ng／mL、６.２ng／mL、２.１ng／mLおよび０.６８ng／mLの最終濃度まで試薬希釈剤(ＰＢＳ中５％Tween 20)で連続希釈することにより希釈した。試薬希釈剤を含むブランクウェルも標準に包含させた。

【0659】

次いで、遮断段階の最後に、各ウェルを１×ＰＢＳＴ洗浄緩衝液(１×ＰＢＳ、０.０５％Tween 20)でELx405Select CWプレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。試験サンプル、対照および標準曲線を、１００μLの各々をプレートの各ぅ得るに添加することにより被覆し、遮断したプレートに添加した。プレートを接着性プレートシーラーで覆い、環境温度で約２時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを１×ＰＢＳＴ洗浄緩衝液(１×ＰＢＳ、０.０５％Tween 20)でELx405Select CWプレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。

【0660】

ＨＡの被覆ｒＨｕ−アグリカンへの結合を検出するために、ビオチニル化ｒＨｕアグリカン検出試薬(７２μg／mL；R& D Systems, Catalog No. 842163)をプレートに添加した。最初に、１０mLの０.３μg／mLビオチニル化−アグリカン溶液を、原液を試薬希釈剤(５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ)で２４０倍希釈することにより調製した。次いで、１００μLの検出試薬を各ウェルに添加した。プレートを接着性シールで覆い、環境温度で約２時間インキュベートした。各ウェルを１×ＰＢＳＴ洗浄緩衝液(１×ＰＢＳ、０.０５％Tween 20)でELx405Select CWプレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ(ＳＡ−ＨＲＰ；R&D Systems、Catalog No. 890803)作業溶液を、原液を２００倍に希釈することにより試薬希釈剤中で調製した。次いで、１００μLの希釈したＳＡ−ＨＲＰ作業溶液を各ウェルに添加した。プレートを接着性シールで覆い、環境温度で約２０分間、５００rpmで振盪しながらインキュベートした。ＳＡ−ＨＲＰインキュベーション時間の最後に、各ウェルを１×ＰＢＳＴ洗浄緩衝液(１×ＰＢＳ、０.０５％Tween 20)でELx405Select CWプレートウォッシャーを使用して５回洗浄した。次いで、遮光しながら環境温度で平衡化した１００μLのＴＭＢ基質(ＫＰＬ；Catalog No. 52-00-03)を各ウェルに添加し、環境温度で２０分間、５００rpmで振盪しながらインキュベートした。次いで、１００μLのＴＭＢ停止溶液(ＫＰＬ；Catalog No. 50-85-06)を少なくとも５分間、しかし最大３０分間各ウェルに添加し、４５０nmでの光学密度(ＯＤ ４５０nm)をマイクロタイタープレート分光光度計およびSoftMax Proソフトウェアを使用して決定した。

【0661】

ＯＤ４５０nm値に基づき、各サンプルの無処置ヒアルロナン濃度を、標準曲線からの内挿により決定した。結果をサンプル希釈係数で乗算した。データを、較正曲線の定量限界の範囲内の全数値の平均として報告した(ng／mL)。結果を表１１および１２に示す。結果は、健常ヒトの中央血漿ＨＡは０.０１５μg／mLであり、第１相対象では０.０６μg／mLであることを示す。これは、ｐ＜０.０００１で統計学的有意差を表す。

【0662】

【表11】

【0663】

【表12】

【0664】

実施例１４
ＨＡの組織化学的検出
ＨＡの組織化学的検出を、１.６μg／kg ＰＥＧＰＨ２０＋デキサメサゾンを４週間投与した患者からの生検前腫瘍検体および処置後転移肝臓生検サンプルを得た。投与前生検(前生検)は、２００７年に得られた記録されたサンプルであった(ＰＥＧＰＨ２０での処置３.５年前)。処置後生検サンプルを、肝転移を有する女性結腸癌患者からＰＥＧＰＨ２０＋デキサメサゾン処置レジメンにおける最後の投与(８回目投与)３日後に得た間。具体的に、患者処置後生検を、デキサメサゾン共処置の投与サイクルについて１週間に２回スケジュールで１.６μg／kgのＰＥＧＰＨ２０処置の１サイクル後に得た。処置サイクルは２８日間と規定され、ＰＥＧＰＨ２０を静脈内投与し(IV)、デキサメサゾンを経口投与した。各投与日に、４mgのデキサメサゾンの前投薬レジメンをＰＥＧＰＨ２０の投与１時間前に経口投与し、続いて４mgデキサメサゾンの２回目の投与を、ＰＥＧＰＨ２０投与８〜１２時間後に行った。

【0665】

簡単に言うと、腫瘍生検を中性緩衝ホルマリン(ＮＢＦ)に固定し、５μm切片に切断し、ビオチン標識ヒアルロナン結合タンパク質(HABP-bio)(Seikagaku, Japan)を使用して染色した。一次試薬を除去するための洗浄後、標識二次試薬を使用した。核をＤＡＰＩ(４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール)試薬を使用して対比染色した。顕微鏡写真を、Insight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)または同じ造影システムを有するZEISSオーバーヘッドスコープ(Carl Zeiss, Inc.)と組み合わせたNikon Eclipse TE2000U倒立蛍光顕微鏡により捕捉した。

【0666】

ビオチニル化−ＨＡ結合タンパク質でのサンプルの組織化学的染色は、１サイクルのＰＥＧＰＨ２０処置後の細胞周囲および間質ＨＡレベルの減少を示した。結果を表１３に溶訳する。Ｈスコアは、細胞周囲および間質ＨＡの相対的強度を示す。本データは、処置後の腫瘍生検におけるＨＡ染色の減少により証明されるとおり、ＰＥＧＰＨ２０が腫瘍関連ＨＡを分解する能力を証明する。

【表13】

＊＊腫瘍関連間質

【0667】

実施例１５
血漿中のヒアルロナン(ＨＡ)レベルの概算のためのＨＰＬＣ方法
本実施例は、ＰＥＧＰＨ２０の酵素活性後の分解生成物であるＨＡ異化産物の指標として、血漿中のＨＡ−二糖含量を決定する方法を記載する。本方法は、ＨＡ−二糖類を遊離するためのＨＡのコンドロイチナーゼＡＢＣでの加水分解、２−アミノアクリドン(ＡＭＡＣ)でのそれらの誘導体化および蛍光検出と組み合わせた逆相ＨＰＬＣでの分析を用いる。ＨＡ−二糖類の定量化は、ＨＡ−二糖標準との比較により達成する。本アッセイは、ＰＥＧＰＨ２０の処置後の患者から予定回数、患者の血漿におけるヒアルロナン異化産物の濃度をモニタリングすることによりＰＥＧＰＨ２０の酵素活性の測定に使用した。

【0668】

１. 作業標準
本方法において、作業標準溶液を作製した。最初に、希釈原液(ＤＳＳ)をＨＡ−二糖原液(ＳＳ)から作製した。ＨＡ二糖ＳＳを、１mLの水を２mgの凍結乾燥粉末を含むHA-Disac(V-labs, Cat. No. C3209)のバイアルに添加し、均一懸濁液を作製することにより産生した。希釈原液を作製するために、５μlのＳＳ溶液を１２５μlの水で希釈して、ＤＳＳ１溶液(２００pmoles／μl HA-Disac含有；２００nmoles／ml HA-Disac)を作製した。水での５倍連続希釈を行い、ＤＳＳ２(４０pmoles／μl HA-Disac含有；４０nmoles／ml HA-Disac)、ＤＳＳ３(８pmoles／μl HA-Disac含有；８nmoles／ml HA-Disac)を作製した。次に、表１４および１５に示すとおり、２５％ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)(ABO Pharmaceuticals, Cat. No. 1500233)または正常マウス血漿(Bioreclamation, Cat. No. MSEPLEDTA2-BALB-M)に示す作業標準溶液を作製した。

【0669】

【表14】

【0670】

【表15】

【0671】

２. サンプルの加水分解および誘導体化
次に、サンプルを加水分解した。サンプル(例えば血漿)を、約１００μgのタンパク質をポリプロピレンチューブに入れ、体積を水で３４０μlに調節した。マトリックスブランクもサンプルと当体積の希釈緩衝液(１.５９ｇ ＨＥＰＥＳ、５.０７ｇ ＮａＣｌ、１８００mL水、ｐＨ７.０)をとり、体積を３４０μlに調節することにより製造した。サンプルおよびマトリックスブランクの加水分解を、６０μlのＴＦＡをサンプルチューブおよびマトリックスブランクチューブに添加し、中身を混合し、１００℃で４時間インキュベートすることにより行った。バイアルを室温に冷却した。バイアルを、speed vacを使用して蒸発乾固した。次いで、３００μlの水を各チューブに添加し、サンプルを再懸濁するためにボルテックス処理した。

【0672】

加水分解サンプル、ブランクおよび作業サンプルの誘導体化のために、４５μlの各サンプル(サンプル、ブランクまたは作業サンプル)をspeed vacで蒸発乾固した。次いで、１０μlのＳＡＳを乾燥したサンプル、ブランクおよび作業標準に添加した。次いで、５０μl ＡＢＡ／ＮａＣＮＢＨ３標識溶液を添加した。チューブｓをボルテックス処理し、短く遠心分離した。次いで、４４０μlの移動相Ａを添加し、チューブをよく混合した。移動相Ａを次のとおり調製した：１３２mLの１Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液(Sigma、Ｃａｔ。Ｎｏ。Ａ７３３０)を、１Ｌ容積測定フラスコに添加し、水を添加してフラスコを満たした。誘導体化後、作業標準の２０μlの注入あたり、名目上オンカラム充填は、表１６に示すとおりである。

【表16】

【0673】

３. ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣカラムを表１７に略記する初期移動相設定で１.０mL／分の流速で平衡化した。システムをベースラインが一定になるまで平衡化させた。ＨＰＬＣ分析を、表１７に示す装置パラメータ内で行った。

【表17】

【0674】

サンプル分析の順番は次のとおりであった：カラム条件付け／平衡化／検出器獲得のためのＷＳＳ５(１注入)；水注入(１注入)；ＷＳＳ３(３注入)；ＷＳＳ１(１注入)；ＷＳＳ２(１注入)；ＷＳＳ４(１注入)；ＷＳＳ５(１注入)；水(１注入)；マトリックスブランク(１注入)；サンプル１(１注入)；サンプル２(１注入)；ＷＳＳ３(３注入)；水(１注入)。システムは、許容される分離品質がある、ＷＳＳ１サンプルにおける短い単糖ピークに対するシグナル対ノイズ比が１０以上、ＷＳＳ３の６注入の各単糖標準についてのピーク面積相対標準偏差(ＲＳＤ)が４％以下、相関係数(ｒ)が０.９９(ｒはＷＳＳ３標準の最初の３回の注入を使用したオンカラム負荷(pmolとして表す)に対する各作業標準のピーク面積をプロットし、直線状最小二乗回帰モデルを使用する作業標準の傾斜、切片および相関係数を計算するためのソフトウェアを使用して、測定)、単糖類に対応するピークのピーク面積が、ＷＳＳ５について測定したピーク面積の２％を超えず、水注入における単糖類に対応するピークのピーク面積がＷＳＳ５で測定したピーク面積の０.５％を超えないとき、適切であると見なした。

【0675】

４. サンプル分析
各サンプル製剤中の各単糖の平均補正ピーク面積を決定した。谷−谷組込みをＧａｌＮピークに使用した。これを決定するために、作業標準から作成した線状曲線(linear curve)を使用して、各サンプル製剤に充填された各単糖の量を計算した。各タイプの単糖について、各サンプルの単糖類／タンパク質分子の平均モル比を計算した。次いで、各サンプルについて、全５種の単糖類の平均モル比の全体的合計を決定した。計算は次の式のものに基づいた：非グリコシル化ヒアルロニダーゼタンパク質の分子量(ＭＷ)は５１１０６ｇ／mol；各サンプルの総体積は５００μl；サンプル希釈係数は０.１５；各注入体積は２０μl；およびmgからpgへの変換係数は１０^９。計算を、各単糖について次のとおり行った：

【0676】

各製剤の単糖の量を次の式を使用して計算した：

【数1】

タンパク質分子あたりの単糖類の数を次の式を使用して計算した：

【数2】

各サンプルについて、各サンプルの結果を、５種の単糖の比とともに各単糖について単糖類／タンパク質比として報告する。

【0677】

５. 結果
上記二糖アッセイを使用して、デキサメサゾンと共にまたは伴わず、投与量レジメサイクルで０.５μg／kg〜５０μg／kgの範囲の投与量でＰＥＧＰＨ２０のIV投与を受けている第Ｉ相臨床的試験に参加している患者からのＨＡおよびその異化産物を測定した。ＰＥＧＰＨ２０投与前の血漿ＨＡ濃度は典型的に、治験の全患者で多くても１μg／mLまたは定量限界以下(０.５μg／mL)であった。

【0678】

ＰＥＧＰＨ２０の１回５０μg／kg投与を受けた患者から採取した血漿を処置後経時的に評価した。結果は、ヒアルロナンの血漿濃度が顕著に増加することを示す。この患者で、ＰＥＧＰＨ２０濃度は２日間の最終半減期で減少するが、ＨＡ異化産物の上昇した濃度はゆっくり蓄積され、ＰＥＧＰＨ２０処置後２週間まで維持し、最高ＨＡ血漿濃度はＰＥＧＰＨ２０投与約２００時間後に観察された。

【0679】

血漿をまた０.５μg／kg ＰＥＧＰＨ２０を１週間に２回(１患者)、０.５μg／kgを２１日毎(３患者)、０.７５μg／kgを２１日間毎(４患者)、１.０μg／kを２１日毎(３患者)または１.５μg／kを２１日毎(１患者)の処置である最初のＰＥＧＰＨ２０投与後２４時間から開始して、さらに１２名の患者から採取した。結果は、０.５μg／kg〜１.５μg／kg範囲のＰＥＧＰＨ２０の１回または複数投与後、ＨＡ異化産物レベルは投与量依存的方法で、１週間の経過で増加することを示す。最大ＨＡ濃度(Ｃ_ｍａ×)および１週間曲線下面積概算(ＡＵＣ_{０−１６８ｈ})も、薬力学的応答を定量するために各患者で決定した。結果は、最高血漿濃度または曲線下面積で測定して、ＨＡ異化産物への全身性曝露がＰＥＧＰＨ２０の投与量が多い患者で増加することを示した。さらに、デキサメサゾンをＰＥＧＰＨ２０投与が原因の筋骨格効果を排除または寛解するための前投薬として投与レジメに付加したＰＥＧＰＨ２０を投与された患者からの血液サンプルを得た。処置サイクルは２８日間と規定され、ＰＥＧＰＨ２０は静脈内(IV)投与され、デキサメサゾンは経口投与された。ＰＥＧＰＨ２０およびデキサメサゾンの投与は、２８日サイクルの１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目、１８日目、２２日目および２５日目に行った。各投与日に、４mgのデキサメサゾンの前投薬レジメンを、ＰＥＧＰＨ２０投与１時間前に経口投与し、続いてＰＥＧＰＨ２０投与８〜１２時間後２回目の４mgデキサメサゾンを投与した。血漿を、処置の第１週のＰＥＧＰＨ２０投与後種々の時点で取った。上記のＰＨ２０のみを投与された患者から得たサンプルでの観察と一致して、血漿ＨＡ濃度対時間データはＰＥＧＰＨ２０の投与後増加した。投与の第１週目に測定した血漿ＨＡ濃度は、ＰＥＧＰＨ２０の投与量の増加により増加した。全サイクルの処置を完了し、８投与のＰＥＧＰＨ２０を受けた３患者において、結果は、投与期間をとおして測定して、全３患者でサンプルにおける血漿ＨＡ濃度の持続した増加を示した。

【0680】

これらの結果は、ＰＥＧＰＨ２０活性の予測される機構と一致し、ＰＥＧＰＨ２０薬力学のバイオマーカーとしてのＨＡの役割を支持する。

【0681】

実施例１６
磁気共鳴造影
拡散強調ＭＲＩを、見かけの拡散係数のための画素毎の値を概算するために一ショットスピンエコー配列を使用して行った。動的造影磁気共鳴画像法(ＤＣＥ−ＭＲＩ)は、造影剤の輸液中の造影を含んだ。較正は、内部チューブおよび氷／水混合物を含む２部ファントムを使用して達成した。走査を処置前および処置後に行った。

【0682】

１. 見かけの拡散係数磁気共鳴造影(ＡＤＣ−ＭＲＩ)
見かけの拡散係数磁気共鳴造影(ＡＤＣ−ＭＲＩ)は、処置前および処置後走査に由来する計算に基づき、細胞膜を超えて移動する水の体積を測定する。ＡＤＣ−ＭＲＩ走査を、デキサメサゾン前投薬なしのＰＥＧＰＨ２０処置を評価する第Ｉ相臨床試験の１４名の患者中計１０名およびデキサメサゾン前投薬有りのＰＥＧＰＨ２０処置を評価する第Ｉ相臨床試験の５名の患者中４名で完了した。各患者から獲得した画像の分析を、放射線科医が Imaging Endpoints(Scottsdale, AZ)で行い、ＡＤＣの定量的概算を、各患者における組織について算出した。腫瘍領域と関連するＡＤＣ−ＭＲＩ知見の要約を表１８に示す。該表に示すとおり、ＡＤＣ−ＭＲＩの増加が、ＰＥＧＰＨ２０投与後１４名の患者のうち７名(５０％)で観察された。ＡＤＣ値増加はＰＥＧＰＨ２０の作用機序と一致する。ＡＤＣ値は、しかしながら、１４名の患者のうち５名で変化せず、１４名の患者のうち２名で値が減少した。

【0683】

【表18】

【0684】

２. 動的造影磁気共鳴造影(ＤＣＥ−ＭＲＩ)
動的造影磁気共鳴画像法(ＤＣＥ−ＭＲＩ)は、腫瘍の血管増生の変化を示す血流を測定する。走査は、デキサメサゾン前投薬有りのＰＥＧＰＨ２０処置を評価する第Ｉ相臨床試験の４患者で完了した。各患者から獲得した画像の分析を、放射線科医がImaging Endpoints(Scottsdale, AZ)で行い、体積移動係数(Ｋ_{ｔｒａｎｓ})、血液体積(Ｖｐ)および細胞外体積分画(Ｖｅ)の定量的概算を各患者の組織について算出した。腫瘍領域と関連するＤＣＥ−ＭＲＩ知見を表１９に示す。Ｋ_{ｔｒａｎｓ}パラメータの顕著な増加がＰＥＧＰＨ２０投与日に走査した２名の患者で観察された。投与１時間以内のＫ_{ｔｒａｎｓ}増加は、ＰＥＧＰＨ２０が血管除圧および血流増加を示す前臨床データと一致する(Thompson et al. (2010) Mol. Cancer Ther., 9:3052-64)。

【0685】

【表19】

【0686】

ＣＥ−ＭＲＩ造影もまた、２８日間投与サイクルで３.０μg／kg＋デキサメサゾン／ｗｋを受けている第Ｉ相臨床試験に参加した膵腫瘍のさらなる患者で行った。造影を投与前および投与後に次のとおり行った：
８時間(１日目)、２４時間(２日目)およびサイクル１におけるＰＥＧＰＨ２０投与の４週目の毎週投与３日後(サイクル１の最後)。結果を表２０に示す。結果は、連続ＤＣＥ−ＭＲＩで測定して、ＰＥＧＰＨ２０が腫瘍Ｋ_{ｔｒａｎｓ}を増加させることを示す。

【表20】

【0687】

３. ＦＤＧ−ＰＥＴ造影
グルコースと類似のＦＤＧを使用する陽電子放出断層撮影法(ＰＥＴ)を使用して、局所グルコース取り込みの観点で組織代謝活性を得た。ＦＤＧ−ＰＥＴ造影を、２８日間の投与サイクルで３.０μg／kg＋デキサメサゾン；２ｘ／ｗｋを受けている第Ｉ相臨床試験に参加した肺転移を有する転移直腸癌の患者で行った。造影は投与前、投与８時間後、投与２４時間後およびサイクルの最後(８回目の投与の１日後)に行った。ＦＤＧ標準化取り込み値(ＳＵＶ)を、標準的方法を使用して行った。結果を表２１に示す。結果は、患者が肺転移目印のＰＥＧＰＨ２０処置後腫瘍代謝活性減少を示すことを示した。

【0688】

【表21】

【0689】

４. 要約
結果は、種々の腫瘍造影モダリティを、腫瘍組織におけるＰＥＧＰＨ２０の活性の証明およびモニターに使用できることを示す。

【0690】

実施例１７
ＨＡ富癌診断および処置のためのＴＳＧ−６−Ｆｃ腫瘍標的造影
ヒアルロナン富腫瘍担持マウスまたは対照マウスにDyLight 755 Fluor Labeling試薬で標識したＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ(ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５})を投与し、マウスを撮像して、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}の腫瘍結合および分配を評価した。ＩｇＧ^{ＤＬ７５５}対照と染色および分配を比較することにより特異性も評価した。BxPC3脛骨周囲腫瘍担持マウスを作製するために、マウスにBxPC-3ヒト膵腺癌(ATCC CRL-1687)腫瘍細胞を皮下(ｓ.ｃ.、右後肢)に１×１０^７細胞／０.１mLで接種した。ＨＡ^＋３Du145-Has2およびHA-DU145腫瘍担持マウスを作製するために、マウスにDu145-Has2細胞(上記のとおり作製)およびDu145細胞を脛骨周囲(いずれかの側の右脛骨骨膜に隣接した筋肉内注射)に５×１０^６／０.０５mLで接種した。
ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}を、製造者のプロトコルに従い、Thermo Scientific DyLight 755 Amine-Reactive Dye(Catalog No. 84538;Thermo Scientific, Rockford, IL)を使用してＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ(実施例９に記載のとおり作製)をDyLight 755で蛍光標識して作製した。

【0691】

Ａ. ＰＥＧＰＨ２０での前処置有りまたは無しでのＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}の分配
直径約１８〜２０mmのＨＡ^＋２BxPC3脛骨周囲腫瘍を担持するマウスに、１μg、５μgまたは１０μg ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}を静脈内注射した。一群のマウスにおいて、マウスをＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}投与３時間前に４.５mg／kgのＰＥＧＰＨ２０の静脈内投与により前処置した。

【0692】

蛍光全身画像システム(IVIS Lumina XR, Caliper Life Sciences, Mountain View, CA)を使用して、動物の蛍光を追跡した。DyLight 755の選択的励起を、Ｄ７４５nm帯域通過フィルターを使用して行い、発光された蛍光を長通過Ｄ８００nmフィルターを介して集めた。３群のマウス(非注射、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}およびＰＥＧＰＨ２０＋ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５})を、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}後種々の時点で撮像した(１時間、４時間、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目および６日目)。造影のために、非注射対照マウスも評価した。蛍光画像を、超冷却、高感受性、デジタルカメラで捕捉した。蛍光画像を後にLiving Image(Caliper Life Sciences, Mountain View, CA)で分析した。

【0693】

結果は、注射後１時間および４時間まで、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}は血流中の循環物として検出され、また腫瘍に結合し始めていることも検出された。腫瘍への結合は投与量依存性であり、染色強度の増加が１０μg投与量で見られた。腫瘍結合は、全投与量および全時点でＰＥＧＰＨ２０で処置されたマウスにおける造影で少なかった。注射後遅い時点で(例えば１日目または２日目)、肝臓結合も検出されたが、これは、低投与量の１μg ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^ＤＬ７５を注射されたマウスで少なかった。ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}は、画像分析で評価して１〜２日目にピークレベルに達した。低投与量処置マウスにおいて、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}は注射後３日目に除去された。高投与量処置マウスにおいて、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}は注射５日後もまた循環しており、腫瘍への全結合は注射６日後減少した。

【0694】

要約すると、インビボ造影結果は、ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}結合が投与量依存性であり、ピークレベルに注射１〜２日後に到達することを示した。さらに、ＰＥＧＰＨ２０によるＨＡ除去は、少ないG-6-LM−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}結合をもたらした。ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}結合は、腫瘍から注射６日後に除去された。

【0695】

Ｂ. Du145腫瘍＋／−Ｈａｓ２のＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}結合の比較
ＨＡ^＋３Du145-Has2およびHA-DU145腫瘍担持マウスに、５μg ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}を静脈内注射した。マウスをＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}注射後毎日撮像した。HA-DU145腫瘍の低レベル背景染色は観察されたが、画像結果から評価して、ＨＡ富Du145-Has2へのＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}結合ははるかに多かった。結合は、染色強度で決定して、１〜２日後ピークであった。それゆえに、結果は、腫瘍に存在するＨＡが多いほど、多くのＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}が腫瘍に結合することを示す。

【0696】

Ｃ. ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}の標的特異性
ＨＡ富腫瘍へのＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５の}特異性を、さらにＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}またはＩｇＧ^{ＤＬ７５５}のＨＡ^＋２BxPC3脛骨周囲腫瘍担持マウスへの結合を比較することにより評価した。ＨＡ＋＋BxPC3脛骨周囲腫瘍担持マウスに、５μg ＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}または５μg ＩｇＧ^{ＤＬ７５５}を静脈内注射した。マウスを注射後毎日撮像した。造影結果は、ＩｇＧ^{ＤＬ７５５}の腫瘍への検出可能染色はほとんどまたはまったくないことを示し、それゆえにＩｇＧ^{ＤＬ７５５}よりも大きなＴＳＧ−６−ＬＭ−Ｆｃ／ΔＨｅｐ^{ＤＬ７５５}のＰＣ３腫瘍への結合を示した。

【0697】

修飾は当業者には明白であるため、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]