特許 6163429 神経疾患免疫治療のための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6163429

(24)【登録日】2017年6月23日

(45)【発行日】2017年7月12日

(54)【発明の名称】神経疾患免疫治療のための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170703BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170703BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170703BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170703BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170703BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20170703BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20170703BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20170703BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20170703BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170703BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170703BHJP

   C12N 9/99 20060101ALN20170703BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20170703BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K16/40

   C07K16/18

   C07K16/46

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61P25/28

   A61P9/10

   A61P27/06

   A61P21/00

   A61P21/02

   A61P25/00

   A61P25/16

   A61P25/14

   A61P25/20

   A61P25/02

   A61P43/00 111

   G01N33/53 D

   !C12N9/99

   !C12P21/08

【請求項の数】42

【全頁数】86

(21)【出願番号】特願2013-538846(P2013-538846)

(86)(22)【出願日】2011年11月9日

(65)【公表番号】特表2014-502150(P2014-502150A)

(43)【公表日】2014年1月30日

(86)【国際出願番号】US2011059964

(87)【国際公開番号】WO2012064836

(87)【国際公開日】20120518

【審査請求日】2014年11月7日

(31)【優先権主張番号】61/426,425

(32)【優先日】2010年12月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/418,850

(32)【優先日】2010年12月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/418,310

(32)【優先日】2010年11月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/456,642

(32)【優先日】2010年11月10日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】アトウォル， ジャスビンダル

(72)【発明者】

【氏名】チェン， ヨンメイ

(72)【発明者】

【氏名】チウ， セシリア プイ チー

(72)【発明者】

【氏名】ラザロ， ロバート エー．

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ウエイルー

(72)【発明者】

【氏名】ワッツ， ライアン ジェー．

(72)【発明者】

【氏名】ウー， イェン

(72)【発明者】

【氏名】チャン， インナン

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１２１９４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１５５６０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５２３４６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３８６２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１４６０５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Blood, 2007, vol.110, no.2, p.616-623

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害するＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体又はその断片であって、以下から選択されるＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３、
ａ）（ｉ）配列番号：２２、２３及び７１〜７３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ１；
（ｉｉ）配列番号：２４及び７４〜７８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ２；
（ｉｉｉ）配列番号：２５及び７９から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ３；
（ｉｖ）配列番号：７及び８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ１;
（ｖ）配列番号：９、１０及び５８〜６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ２；及び
（ｖｉ）配列番号：１１〜１６及び６５〜６７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ３；又は
ｂ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：３６〜３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む、抗体又はその断片。

【請求項2】

抗体がＢＡＣＥ１の活性部位に結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

抗体がＢＡＣＥ１のエキソサイトに結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

ａ）（ｉ）配列番号：２２及び２３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ１；
（ｉｉ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ２；
（ｉｉｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ３；
（ｉｖ）配列番号：７及び８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ１;
（ｖ）配列番号：９及び１０から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ２；及び
（ｖｉ）配列番号：１１〜１６から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ３；
又は、
ｂ）（ｉ）配列番号：２３及び７１〜７３から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ１；
（ｉｉ）配列番号：２４及び７４〜７８から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ２；
（ｉｉｉ）配列番号：２５及び７９から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｈ３；
（ｉｖ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ１;
（ｖ）配列番号：９及び５８〜６４から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ２；及び
（ｖｉ）配列番号：１２及び６５〜６７から選択されるアミノ酸配列を含む、ＨＶＲ-Ｌ３
を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項5】

配列番号：２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；配列番号：２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；配列番号：３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：３６〜３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項6】

配列番号：２２及び２３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；配列番号：２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３、配列番号：７及び８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：９及び１０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：１１〜１６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む、請求項４に記載の抗体。

【請求項7】

配列番号：２３及び７１〜７３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；配列番号：２４及び７４〜７８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；配列番号：２５及び７９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；配列番号：９及び５８〜６４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び配列番号：１２及び６５〜６７から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
を含む、請求項４に記載の抗体。

【請求項8】

ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３の配列を含む抗体であって、
配列番号：２２、２４、２５、７、９及び１１の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、９及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２２、２４、２５、７、９及び１３の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２２、２４、２５、７、９及び１４の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２２、２４、２５、８、１０及び１５の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２２、２４、２５、７、９及び１６の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、７４、２５、７、９及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、７５、２５、７、９及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、５８及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：７１、２４、２５、７、５８及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、９及び６５の配列をそれぞれ含むか；配列番号：７２、２４、２５、７、９及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、５９及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、９及び６６の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、９及び６７の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、６０及び６７の配列をそれぞれ含むか；配列番号：７２、２４、２５、７、６１及び６５の配列をそれぞれ含むか；配列番号：７２、２４、２５、７、５８及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、７６、２５、７、９及び６６の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、５９及び６６の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、６２及び６７の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、７７、７９、７、９及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：７３、７８、２５、７、９及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、６３及び１２の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２３、２４、２５、７、６４及び１２の配列をそれぞれ含む、請求項４に記載の抗体。

【請求項9】

ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３の配列を含む抗体であって、
配列番号：２８、２９、３０、３５、３６及び４０の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２８、２９、３０、３５、３７及び４０の配列をそれぞれ含むか；配列番号：２８、２９、３０、３５、３８及び４０の配列をそれぞれ含むか；又は配列番号：２８、２９、３０、３５、３９及び４０の配列をそれぞれ含む、請求項５に記載の抗体。

【請求項10】

配列番号：２０、２１及び８０−９８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨ鎖を含む、請求項４に記載の抗体。

【請求項11】

ＶＨ鎖アミノ酸配列が配列番号：２７の配列である、請求項５に記載の抗体。

【請求項12】

配列番号：１−６及び９９−１１７から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む、請求項４又は１０に記載の抗体。

【請求項13】

ＶＬ鎖が配列番号：３１〜３４から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５又は１１に記載の抗体。

【請求項14】

モノクローナル抗体である、請求項１〜１３の何れか一項に記載の抗体。

【請求項15】

ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１〜１４の何れか一項に記載の抗体。

【請求項16】

抗体断片である、請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体。

【請求項17】

完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１〜１６の何れか一項に記載の抗体。

【請求項18】

請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。

【請求項19】

請求項１８の核酸を含む、宿主細胞。

【請求項20】

抗体が生産されるように請求項１９の宿主細胞を培養することを含む、抗体を生産する方法。

【請求項21】

請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害性物質を含む、イムノコンジュゲート。

【請求項22】

請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的製剤。

【請求項23】

有効量の請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体を含む、神経疾患又は障害を有する個体を治療するための医薬。

【請求項24】

神経疾患又は障害を患っているか又は罹患する危険性がある患者におけるアミロイド斑を低減するための医薬であって、有効量の請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体を含む、医薬。

【請求項25】

神経疾患又は障害を患っているか又は発症する危険性がある患者におけるアミロイド斑形成を阻害するための医薬であって、有効量の請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体を含む、医薬。

【請求項26】

神経疾患又は障害がアミロイド様タンパク質を伴い、アルツハイマー病(ＡＤ)、外傷性脳損傷、脳卒中、緑内障、認知症、多発性硬化症(ＭＳ)、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、レビー小体病、パーキンソン病、核上性麻痺、ウシ海綿状脳症、スクレピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びハンチントン病から成る群から選択される、請求項２３〜２５の何れか一項に記載の医薬。

【請求項27】

神経疾患又は障害がアルツハイマー病、脳卒中、外傷性脳損傷及び緑内障から成る群から選択される、請求項２６に記載の医薬。

【請求項28】

患者におけるアミロイド-β(Ａβ)タンパク質を低減するための医薬であって、有効量の請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体を含む、医薬。

【請求項29】

患者が神経疾患又は障害を患っているか又は罹患する危険性がある、請求項２８に記載の医薬。

【請求項30】

神経疾患又は障害がアルツハイマー病、脳卒中、外傷性脳損傷及び緑内障から成る群から選択される請求項２９に記載の医薬。

【請求項31】

患者における神経疾患又は障害を検出する方法であって、患者から単離された生体サンプルを、ＢＡＣＥ１ポリペプチドへの抗体の結合に適切な条件下で請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体と接触させる工程、及び抗体及びＢＡＣＥ１ポリペプチド間で複合体が形成されたかを検出する工程を含む、方法。

【請求項32】

患者が抗ＢＡＣＥ１抗体での治療に適格かを決定するためのキットであって、患者から単離された生体サンプルを、ＢＡＣＥ１ポリペプチドへの抗体の結合に適切な条件下で請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体と接触させ、抗体及びＢＡＣＥ１ポリペプチド間で複合体が形成されるか否かを決定し、抗体及びＢＡＣＥ１間の複合体の存在が抗ＢＡＣＥ１抗体での治療に適格な患者を示す、キット。

【請求項33】

生体サンプルが血清、血漿、唾液、胃液分泌、粘液、脳脊髄液、リンパ液、神経組織、脳組織、心臓組織又は血管組織から成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

患者における神経疾患又は障害を患者から単離された生体サンプルにおいて診断するためのキットであって、請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体を含む、キット。

【請求項35】

患者が抗ＢＡＣＥ１抗体での治療に適格かを決定するためのキットであって、請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体を含み、患者から単離された生体サンプルを該抗体と接触させた場合に、抗体及びＢＡＣＥ１間の複合体の存在が抗ＢＡＣＥ１抗体での治療に適格な患者を示す、キット。

【請求項36】

生体サンプルが血清、血漿、唾液、胃液分泌、粘液、脳脊髄液、リンパ液、神経組織、脳組織、心臓組織又は血管組織から成る群から選択される請求項３２、３４及び３５の何れか一項に記載のキット。

【請求項37】

医薬としての使用のための、請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体。

【請求項38】

アミロイド様タンパク質を伴う神経障害の治療における使用のための抗体であって、神経障害が、アルツハイマー病(ＡＤ)、外傷性脳損傷、脳卒中、緑内障、認知症、多発性硬化症(ＭＳ)、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、レビー小体病、パーキンソン病、核上性麻痺、ウシ海綿状脳症、スクレピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びハンチントン病から成る群から選択される、請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体。

【請求項39】

アミロイド-β(Ａβ)タンパク質生産の低下及び／又は阻害における使用のための、請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体。

【請求項40】

医薬の製造における、請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体の使用。

【請求項41】

医薬が、アルツハイマー病(ＡＤ)、外傷性脳損傷、脳卒中、緑内障、認知症、多発性硬化症(ＭＳ)、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、レビー小体病、パーキンソン病、核上性麻痺、ウシ海綿状脳症、スクレピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びハンチントン病から成る群から選択される、アミロイド様タンパク質を伴う神経障害の治療のためのものである、請求項４０に記載の使用。

【請求項42】

医薬がアミロイド-β(Ａβ)タンパク質生産を低減及び／又は阻害するためのものである、請求項４０に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

(関連出願)
この出願は、２０１０年１１月１０日に出願された米国仮出願第６１／４５６，６４２号、２０１０年１１月３０日に出願された米国仮出願第６１／４１８，３１０号、２０１０年１２月１日に出願された米国仮出願６１／４１８，８５０第、及び２０１０年１２月２２日に出願された米国仮出願第６１／４２６，４２５号の優先権を主張するものであり、その全てをそれらの全体において出典明記によりここに援用する。

【0002】

(発明の分野)
本発明は一般的に、ＢＡＣＥ１アンタゴニストであって例えばＢＡＣＥ１活性を阻害又は低下する抗体、及びこのような抗体を含んでなる組成物に関する。更なる実施態様は、様々な神経学的疾患又は障害の治療及び診断のための方法、並びに患者におけるＡＰＰ及び／又はＡβポリペプチドを低減する方法を含む。

【背景技術】

【0003】

アミロイドーシスは、単一の疾患ではなく、むしろ一又は複数の臓器又は身体系に蓄積するアミロイドと呼ばれる蝋様デンプン様タンパク質の細胞外組織沈着によって特徴付けられる進行性疾患プロセスの多様グループである。アミロイド沈着が蓄積すると、それらは臓器又は身体系の正常機能を干渉し始める。少なくとも１５の異なるタイプのアミロイドーシスがある。主要形態は既知の前駆体を持たない一次アミロイドーシス、幾つかの他の条件後の二次アミロイドーシス、及び遺伝性アミロイドーシスである。

【0004】

加齢の多くの疾患はアミロイド様タンパク質に基づくか又はそれを伴い、一つには、病変形成並びに疾患の進行に寄与するアミロイド又はアミロイド様物質の細胞外沈着の蓄積によって特徴づけられる。これらの疾患は、限定するものではないが、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病(ＡＤ)、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシス(オランダ型)を伴う遺伝性脳出血；グアムパーキンソン-認知症を含む。アミロイド様タンパク質に基づくか又はそれを伴う他の疾患は、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ-関連認知症、ＡＬＳ(筋萎縮性側索硬化症)、成人発症型糖尿病、老年性心アミロイドーシス、内分泌腫瘍、及び他(黄斑変性を含む)である。

【0005】

ポリペプチドβ-アミロイド(Ａβ)は、アルツハイマー病(ＡＤ)の病変形成において中心的役割を果たす。Vassar等, J. Neurosci. 29:12787-12794 (2009)。ＣＮＳにおけるＡβポリペプチドの蓄積は、シナプス機能不全、軸索変性及び神経細胞死をもたらす。ＡＤ患者の能は、主要な神経病理学的病変の特徴的病理、例えば神経原線維タングル(ＮＦＴ)、及びアミロイドリッチ老人斑を示す。アミロイド斑の主要成分はＡβである。これらの病変は中枢神経系(ＣＮＳ)の大量消失を伴い、それらの進行はＡＤに伴う臨床的認知症を伴う。

【0006】

Ａβは前駆体タンパク質、ベータアミロイド前駆体タンパク質(β-ＡＰＰ又はＡＰＰ)のタンパク質分解産物である。ＡＰＰは、２つのプロテアーゼ、β-及びγ-セクレターゼによって逐次的に切断されるタイプＩ膜貫通タンパク質である。β-部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１(ＢＡＣＥ１)として知られるβ-セクレターゼは、最初にＡＰＰを切断してＡβのＮ末端を露出し、それによってＣ９９として知られる膜結合断片を生成する。Vassar等, J. Neurosci., 29:12787-12794 (2009) and UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817 (BACE1_HUMAN)。そしてγ-セクレターゼはC99を切断可能になり、成熟Ａβポリペプチドを生産する。Ａβは不均一Ｃ末端により生産され、３８アミノ酸〜４３アミノ酸の長さの範囲のになる。Ａβの４２アミノ酸形態(Ａβ_４２)はＡβの原線維形成形態であり、ダウン症候群の患者において過剰生産され、ＡＤの早期病変形成において役割を果たすことが示唆されている。Vassar等, J. Neurosci. 29:12787-12794 (2009)。このようにＢＡＣＥ１は、その阻害がＡＰＰ及びＡβ生産をおそらく阻害することから治療標的となっている。

【0007】

実際、ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス(ＢＡＣＥ１^−／−)は脳Ａβを生産せず、ＢＡＣＥ１が主要な、そうでなくても脳におけるＡβ生産に関与する酵素であることを確認する。Roberds等, Human Mol.Genetics 10:1317-1324 (2001)。更に、ＡＤモデルにおけるＢＡＣＥ１ノックアウトマウスはアミロイド斑を形成せず；認知障害及びコリン作動性機能障害も低減される。McConlogue等, J. Biol. Chem. 282: 26326-26334 (2007); Ohno等, Neuron 41: 27-33 (2004); and Laird等, J. Neurosci. 25:11693-11709 (2005)。加えて、ＢＡＣＥ１ヘテロ接合性ノックアウトマウスは斑形成を低減させ、BACE1活性の完全な阻害が斑の低減に必要ではないことを示す。McConlogue等, J. Biol. Chem. 282: 26326-26334 (2007)。

【0008】

最近、ＡＰＰはカスパーゼ依存神経細胞体死及び軸索剪定をトリガするデスレセプター６(ＤＲ６)のリガンドであることが示された。Nikolaev等, Nature 457: 981-989 (2009)。加えて、ＢＡＣＥ１化合物阻害剤は軸索及び細胞体の変性を低下させた。Ｉｄ．これらの結果は、ＤＲ６結合によるＡＰＰがＡＤに寄与しうるモデルを示す。

【0009】

神経疾患又は障害、例えばＡＤを伴う患者におけるＡＰＰ及びＡβ生産を低減するために、ＢＡＣＥ１の効果的な治療阻害剤を有することが有益だろう。ここに提供される発明はこのような阻害剤に関し、様々な方法におけるそれらの使用を含む。

【0010】

ここに引用される全ての参考文献は、特許出願及び刊行物を含め、出典明記によりその全体を援用する。

【発明の概要】

【0011】

発明は、ＢＡＣＥ１アンタゴニスト抗体及びその使用方法を提供する。特に、抗体はＢＡＣＥ１の活性を阻害又は低減する。

【0012】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害する抗体が提供される。特に、抗体はＢＡＣＥ１の活性部位又はＢＡＣＥ１のエキソサイトに結合する。

【0013】

別の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：７−１９、２２−２６、２８−３０、３５−４７、５６−７９及び１１８−１２２から成る群から選択される少なくとも一つの超可変領域(ＨＶＲ)配列を含む抗体が提供される。

【0014】

更なる実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３から成る群から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列ＧＦＸ_３０ＦＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４ＩＨ(配列番号：４５)を含み(上式中、Ｘ_３０＝Ｎ又はＴ；Ｘ_３１＝Ｓ、Ｌ又はＹ；Ｘ_３２＝Ｇ又はＹ；Ｘ_３３＝Ｙ又はＳ；及びＸ_３４＝Ａ、Ｇ又はＳ)；ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列Ｘ_３５Ｘ_３６ＩＳＰＸ_３７Ｘ_３８ＧＸ_３９ＴＸ_４０ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：４６)を含み(上式中、Ｘ_３５＝Ａ又はＧ；Ｘ_３６＝Ｗ又はＳ；Ｘ_３７＝Ａ又はＹ；Ｘ_３８＝Ｇ又はＳ；Ｘ_３９＝Ｓ又はＹ；及びＸ_４０＝Ｄ又はＳ)；そしてＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列Ｘ_４１ＰＸ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＭＤＹ(配列番号：４７)を含む(上式中、Ｘ_４１＝Ｑ又はＧ；Ｘ_４２＝Ｔ又はＦ；Ｘ_４３＝Ｈ又はＳ；Ｘ_４４＝Ｙ又はＰ；Ｘ_４５＝Ｙ又はＷ；Ｘ_４６＝Ｙ又はＶ、及びＸ_４７が配列ＹＡＫＧＹＫＡ(配列番号：４８)を含んでいてもよい)抗体が提供される。あるいは、抗体は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＸ_１３ＧＹＸ_１４ＩＨ(配列番号：２６)(上式中、Ｘ_１３＝Ｓ又はＬ及びＸ_１４＝Ａ又はＧ)；又は配列番号：２２；配列番号：２３；及び配列番号：２８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１配列を含む。

【0015】

更なる実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３から成る群から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１がアミノ酸配列ＧＸ_７１Ｘ_７２Ｘ_７３Ｘ_７４Ｘ_７５Ｘ_７６Ｘ_７７ＩＨ(配列番号：１２０)を含み(上式中、Ｘ_７１＝Ｆ又はＹ；Ｘ_７２＝Ｆ、Ｎ又はＴ；Ｘ_７３＝Ｆ又はＹ；Ｘ_７４＝Ｌ、Ｑ、Ｉ、Ｓ又はＹ；Ｘ_７５＝Ｇ又はＹ；Ｘ_７６＝Ｙ又はＳ；及びＸ_７７＝Ａ、Ｇ又はＳ)；ＨＶＲ-Ｈ２がアミノ酸配列Ｘ_７８Ｘ_７９ＩＳＰＸ_８０Ｘ_８１ＧＸ_８２Ｘ_８３Ｘ_８４ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：１２１)を含み(上式中、Ｘ_７８＝Ａ又はＧ；Ｘ_７９＝Ｗ又はＳ；Ｘ_８０＝Ａ、Ｓ、Ｑ又はＹ；Ｘ_８１＝Ｇ又はＳ；Ｘ_８２＝Ｓ、Ｋ、Ｌ又はＹ；Ｘ_８３＝Ｔ又はＹ；及びＸ_８４＝Ｄ又はＳ)；そしてＨＶＲ-Ｈ３がアミノ酸配列Ｘ_８５ＰＸ_８６Ｘ_８７Ｘ_８８Ｘ_８９Ｘ_９０Ｘ_９１ＭＤＹ(配列番号：１２２)を含む(上式中、Ｘ_８５＝Ｑ又はＧ；Ｘ_８６＝Ｔ又はＦ；Ｘ_８７＝Ｈ、Ｙ又はＳ；Ｘ_８８＝Ｙ又はＰ；Ｘ_８９＝Ｙ又はＷ；Ｘ_９０＝Ｙ又はＶ及びＸ_９１が配列ＹＡＫＧＹＫＡ(配列番号：４８)を含んでいてもよい)抗体が提供される。あるいは、抗体は、アミノ酸配列ＧＸ_５３Ｘ_５４Ｘ_５５Ｘ_５６ＧＹＧＩＨ(配列番号：６８)(上式中、Ｘ_５３＝Ｆ又はＹ；Ｘ_５４＝Ｔ又はＦ；Ｘ_５５＝Ｆ又はＹ；Ｘ_５６＝Ｌ、Ｑ又はＩ)；又は配列番号：７１−７３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１配列を含む。あるいは、抗体は、アミノ酸配列ＧＷＩＳＰＸ_５７Ｘ_５８ＧＸ_５９Ｘ_６０ＤＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：６９)(上式中、Ｘ_５７＝Ａ、Ｓ又はＱ；Ｘ_５８＝Ｇ又はＳ；Ｘ_５９＝Ｓ、Ｋ又はＬ；Ｘ_６０＝Ｔ又はＹ)；又は配列番号：７４−７８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２配列を含む。あるいは、抗体は、アミノ酸配列ＧＰＦＸ_６１ＰＷＶＭＤＹ(配列番号：７０)(上式中、Ｘ_６１＝Ｓ又はＹ)；又は配列番号：７９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３配列を含む。

【0016】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２８及び配列番号：７１−７３から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１配列を含む抗体が提供される。

【0017】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２４、配列番号：２９及び配列番号：７４−７８から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２配列を含む抗体が提供される。

【0018】

別の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２５、配列番号：３０及び配列番号：７９から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３配列を含む抗体が提供される。

【0019】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、図１(Ｂ)におけるクローンＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９及びＹＷ４１２．８．５１に記載されるもの、又は図２(Ｂ)におけるクローンＦａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９及びＬＣ１０に記載されるもの、又は図２４Ａ−Ｃに記載されるクローンに対応するＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、及びＨＶＲ-Ｈ３配列を含む抗体が提供される。

【0020】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２２又は２３のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：２４のＨＶＲ-Ｈ２配列及び配列番号：２５のＨＶＲ-Ｈ３配列を含む抗体が提供される。別の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２３のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：２４のＨＶＲ-Ｈ２配列及び配列番号：２５のＨＶＲ-Ｈ３配列を含む抗体が提供される。更に別の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２８のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：２９のＨＶＲ-Ｈ２配列及び配列番号：３０のＨＶＲ-Ｈ３配列を含む抗体が提供される。

【0021】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：７１−７３から選択されるＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：７４−７８から選択されるＨＶＲ-Ｈ２配列及び配列番号：７９から選択されるＨＶＲ-Ｈ３配列を含む抗体が提供される。

【0022】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２０、２１、２７及び８０−９８
から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重(ＶＨ)鎖を含む抗体が提供される。一態様では、抗体は配列番号：２１のＶＨ鎖アミノ酸配列を含む。

【0023】

別の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３の群から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１がアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ａ(配列番号：４２)を含み(上式中、Ｘ_１７＝Ｓ、Ｄ又はＶ；Ｘ_１８＝Ｓ又はＡ；Ｘ_１９＝Ｓ、Ｔ又はＮ；Ｘ_２０＝Ａ又はＳ；Ｘ_２１＝Ｖ又はＬ)、ＨＶＲ-Ｌ２がアミノ酸配列Ｘ_２２ＡＳＸ_２３ＬＹＳ(配列番号：４３)を含み(上式中、Ｘ_２２＝Ｓ、Ｗ、Ｙ又はＬ；Ｘ_２３＝Ｆ、Ｓ又はＷ)、そしてＨＶＲ-Ｌ３がアミノ酸配列ＱＱＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｔ(配列番号：４４)を含む(上式中、Ｘ_２４＝Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｄ又はＹ；Ｘ_２５＝Ｙ、Ｐ、Ｓ又はＡ；Ｘ_２６＝Ｙ、Ｔ又はＮ；Ｘ_２７＝Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＳ；Ｘ_２８＝Ｐ又はＬ；及びＸ_２９＝Ｆ、Ｐ又はＴ)抗体が提供される。

【0024】

別の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３の群から選択される少なくとも１つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１がアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ａ(配列番号：４２)を含み(上式中、Ｘ_１７＝Ｓ、Ｄ又はＶ；Ｘ_１８＝Ｓ又はＡ；Ｘ_１９＝Ｓ、Ｔ又はＮ；Ｘ_２０＝Ａ又はＳ；Ｘ_２１＝Ｖ又はＬ)、ＨＶＲ-Ｌ２がアミノ酸配列Ｘ_６２ＡＳＸ_６３Ｘ_６４ＹＸ_６５(配列番号：１１８)を含み(上式中、Ｘ_６２＝Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｆ又はＬ；Ｘ_６３＝Ｆ、Ｓ、Ｙ又はＷ；Ｘ_６４＝Ｌ又はＲ；Ｘ_６５＝Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ又はＷ)、そしてＨＶＲ-Ｌ３がアミノ酸配列ＱＱＸ_６６Ｘ_６７Ｘ_６８Ｘ_６９Ｘ_７０Ｘ_７１Ｔ(配列番号：１１９)を含む(上式中、Ｘ_６６＝Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｄ又はＹ；Ｘ_６７＝Ｙ、Ｐ、Ｓ又はＡ；Ｘ_６８＝Ｙ、Ｔ又はＮ；Ｘ_６９＝Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＳ；Ｘ_７０＝Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｋ又はＬ；及びＸ_７１＝Ｆ、Ｐ又はＴ)抗体が提供される。

【0025】

ある実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、アミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１ＶＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ａ(配列番号：１７)(上式中、Ｘ_１＝Ｄ又はＶ；Ｘ_２＝Ｓ又はＡ；Ｘ_３＝Ｔ又はＮ；Ｘ_４＝Ｓ又はＡ；Ｘ_５＝Ｖ又はＬ)又は配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１配列を含む抗体が提供される。

【0026】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、アミノ酸配列Ｘ_６ＡＳＦＬＹＳ(配列番号：１８)(上式中、Ｘ_６＝Ｓ又はＬ)又はＸ_１５ＡＳＸ_１６ＬＹＳ(配列番号：４１)(上式中、Ｘ_１５＝Ｓ、Ｗ又はＹ及びＸ_１６＝Ｓ又はＷ)又は配列番号：９、配列番号：１０、及び配列番号：３６−３９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２配列を含む抗体が提供される。

【0027】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、アミノ酸配列ＱＱＸ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｔ(配列番号：１９)(上式中、Ｘ_７＝Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｄ又はＹ；Ｘ_８＝Ｙ、Ｐ、Ｓ，又はＡ；Ｘ_９＝Ｔ又はＮ；Ｘ_１０＝Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＳ；Ｘ_１１＝Ｐ又はＬ；Ｘ_１２＝Ｐ又はＴ)又は配列番号：１１−１６及び配列番号：４０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３配列を含む抗体が提供される。

【0028】

ある実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、アミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１ＶＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ａ(配列番号：１７)(上式中、Ｘ_１＝Ｄ又はＶ；Ｘ_２＝Ｓ又はＡ；Ｘ_３＝Ｔ又はＮ；Ｘ_４＝Ｓ又はＡ；Ｘ_５＝Ｖ又はＬ)又は配列番号：７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１配列を含む抗体が提供される。

【0029】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、アミノ酸配列Ｘ_４８ＡＳＸ_４９Ｘ_５０ＹＸ_５１(配列番号：５６)(上式中、Ｘ_４８＝Ｓ又はＦ；Ｘ_４９＝Ｆ又はＹ；Ｘ_５０＝Ｌ又はＲ；Ｘ_５１＝Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ又はＷ)又は配列番号：５８−６４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２配列を含む抗体が提供される。

【0030】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、アミノ酸配列ＱＱＦＰＴＹＸ_５２ＰＴ(配列番号：５７)(上式中、Ｘ_５２＝Ｌ、Ｑ、Ｓ又はＫ)又は配列番号：６５−６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３配列を含む抗体が提供される。

【0031】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、図１(Ａ)におけるクローンＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９及びＹＷ４１２．８．５１に記載されるもの、又は図２(Ａ)におけるクローンＦａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９及びＬＣ１０に記載されるもの、又は図２３Ａ−Ｃにおけるクローンに記載されるものに対応するＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３配列を含む抗体が提供される。

【0032】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：７又は配列番号：８のＨＶＲ-Ｌ１配列；配列番号：９、配列番号：１０又は配列番号：５８−６４から成る群から選択されるＨＶＲ-Ｌ２配列；及び配列番号：１１−１６及び６５−６７から成る群から選択されるＨＶＲ-Ｌ３配列を含む抗体が提供される。別の態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：７のＨＶＲ-Ｌ１配列、配列番号：９のＨＶＲ-Ｌ２配列及び配列番号：１２のＨＶＲ-Ｌ３配列を含む抗体が提供される。

【0033】

更なる実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：３５のＨＶＲ-Ｌ１配列を含む抗体が提供される。

【0034】

更なる実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：９−１０、３６−３９又は５８−６４のＨＶＲ-Ｌ２配列を含む抗体が提供される。

【0035】

更なる実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：１１−１６、４０又は６５−６７のＨＶＲ-Ｌ３配列を含む抗体が提供される。

【0036】

別の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：１−６、３１−３４及び９９−１１７から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖配列を含む抗体が提供される。一態様では、ＶＬ鎖アミノ酸配列は配列番号：２である。

【0037】

更なる実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２３のＨＶＲ-Ｈ１配列、配列番号：２４のＨＶＲ-Ｈ２配列、配列番号：２５のＨＶＲ-Ｈ３配列、配列番号：７のＨＶＲ-Ｌ１、配列番号：９のＨＶＲ-Ｌ２及び配列番号：１２のＨＶＲ-Ｌ３を含む抗体が提供される。

【0038】

一実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する単離された抗体であって、ＢＡＣＥ１ポリペプチドの活性を低減又は阻害し、配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ鎖及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ鎖を含む抗体が提供される。

【0039】

別の実施態様では、配列番号：４９の３１４ＳＥＲ；３１６ＧＬＵ；３１７ＬＹＳ；３２７ＧＬＮ；３３０ＣＹＳ；３３１ＴＲＰ；３３２ＧＬＮ；３３５ＴＨＲ；及び３７８ＡＳＰから成る群から選択されるＢＡＣＥ１の少なくとも一つのアミノ酸残基を含んでなるエピトープに結合する単離された抗体が提供される。ある実施態様では、抗体は、配列番号：４９のアミノ酸：３１４ＳＥＲ；３１６ＧＬＵ；３１７ＬＹＳ；３２７ＧＬＮ；３３０ＣＹＳ；３３１ＴＲＰ；３３２ＧＬＮ；３３５ＴＨＲ；及び３７８ＡＳＰを含んでなるＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。

【0040】

他の実施態様では、抗体は、配列番号：４９のアミノ酸３１５−３１８；配列番号：４９のアミノ酸３３１−３３５；配列番号：４９のアミノ酸３７０−３８１；及びその何れかの組合せから成る群から選択されるＢＡＣＥ１の少なくとも一つのアミノ酸領域を含んでなるＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。一実施態様では、抗体は、配列番号：４９のアミノ酸３１５−３１８、３３１−３３５及び３７０−３８１を含んでなるＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。

【0041】

別の実施態様では、抗体はＢＡＣＥ１のエピトープに結合し、結合によりＢＡＣＥ１のＰ６及びＰ７部位の構造におけるコンホメーション変化をもたらす。更なる実施態様では、抗体はＢＡＣＥ１のエピトープに結合し、配列番号：４９のアミノ酸２１８−２３１にランダムなループ構造を引き起こす。

【0042】

発明の抗体は、様々な形態でありうる。例えば、発明の抗体はヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体でありうる。他の態様では、発明の抗体は完全長抗体又はその断片(例えば抗原結合要素を含んでなる断片)である。発明の他の態様では、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様では、発明の抗体は、薬剤又は部分、例えば細胞傷害剤に連結又はコンジュゲートされ、イムノコンジュゲートを作りうる。

【0043】

一実施態様では、薬学的製剤が提供され、発明の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。更なる実施態様では、発明の抗体をコードする単離された核酸、並びに発明の抗体をコードする核酸を含むベクターが提供される。別の態様では、発明の抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞、並びに発明の抗体を生産する方法であって、抗体の生産に適した条件下で、発明の抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる方法が提供される。

【0044】

別の実施態様では、有効量の発明の抗体を個体に投与することを含んでなる、神経疾患又は傷害を有する個体を治療する方法が提供される。

【0045】

更なる実施態様では、神経疾患又は障害を患っているか又は罹患する危険性がある患者においてアミロイド斑を低減するか又はアミロイド斑形成を阻害する方法であって、有効量の発明の抗体を個体に投与することを含んでなる方法が提供される。

【0046】

一実施態様では、有効量の発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、患者におけるＡβタンパク質を低減する方法である。一態様では、患者は神経疾患又は障害を患っているか又は罹患する危険性がある。

【0047】

別の実施態様では、有効量の発明の抗体を患者に投与することを含んでなる患者における軸索変性を阻害する方法が提供される。

【0048】

更なる実施態様では、患者における神経疾患又は障害を診断する方法であって、患者から単離された生体サンプルを、ＢＡＣＥ１ポリペプチドへの抗体の結合に適切な条件下で発明の抗体と接触させる工程、及び抗体及びＢＡＣＥ１ポリペプチド間で複合体が形成されたかを検出する工程を含んでなる方法である。

【0049】

一実施態様では、患者が抗ＢＡＣＥ１抗体での治療に適格かを決定する方法であって、患者から単離された生体サンプルを、ＢＡＣＥ１ポリペプチドへの抗体の結合に適切な条件下で発明の抗体と接触させる工程、抗体及びＢＡＣＥ１ポリペプチド間で複合体が形成されたかを検出する工程を含んでなり、抗体及びＢＡＣＥ１間の複合体の存在が抗ＢＡＣＥ１抗体での治療に適格な患者を示す方法。一態様では、患者は神経疾患又は障害を患っているか又は罹患する危険性がある。

【0050】

一態様では、神経疾患又は状態の診断において；又はＢＡＣＥ１抗体での治療に対する患者の応答性の予測、又は適格性の決定のために使用されうる生物学的サンプルは、限定するものではないが体液、例えば血清、血漿、唾液、胃液分泌物、粘液、脳脊髄液、リンパ液等、又は生物から得られる組織又は細胞サンプル、例えばニューロン、脳、心臓又は血管組織を含む。

【0051】

発明の方法の一態様では、患者は哺乳類である。別の態様では、患者はヒトである。他の態様では、神経疾患又は障害はアルツハイマー病(ＡＤ)、外傷性脳損傷、脳卒中、緑内障、認知症、筋ジストロフィー(ＭＤ)、多発性硬化症(ＭＳ)、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パジェット病、外傷性脳損傷、レビー小体病、ポストポリオ症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、核上性麻痺、ウシ海綿状脳症、スクレピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、致死性家族性不眠症、球麻痺、運動ニューロン疾患、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケスキンキーヘア症候群、コケイン症候群、Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ-Ｓｐａｔｚ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びＵｎｖｅｒｒｉｃｈｔ-Ｌｕｎｄｂｏｒｇ症候群、認知症(限定するものではないが、ピック病、及び脊髄小脳失調症を含む)から成る群から選択される。一態様では、神経疾患又は障害はアルツハイマー病である。

【0052】

一実施態様では、配列番号：４９の３１４ＳＥＲ；３１６ＧＬＵ；３１７ＬＹＳ；３２７ＧＬＮ；３３０ＣＹＳ；３３１ＴＲＹ；３３２ＧＬＮ；３３５ＴＨＲ；及び３７８ＡＳＰから成る群から選択されるアミノ酸に対応するＢＡＣＥ１の少なくとも一つのアミノ酸残基を含んでなる、抗体又はその断片によって特異的に認識されるＢＡＣＥ１エピトープが提供される。一態様では、ＢＡＣＥ１エピトープは、配列番号：４９の３１４ＳＥＲ；３１６ＧＬＵ；３１７ＬＹＳ；３２７ＧＬＮ；３３０ＣＹＳ；３３１ＴＲＹ；３３２ＧＬＮ；３３５ＴＨＲ；及び３７８ＡＳＰに対応するアミノ酸を含む。

【0053】

一実施態様では、配列番号：４９のアミノ酸３１５−３１８；配列番号：４９のアミノ酸３３１−３３５；配列番号：４９のアミノ酸３７０−３８１；及びその何れかの組合せから成る群から選択されるＢＡＣＥ１の少なくとも一つのアミノ酸領域を含んでなる、抗体又はその断片によって特異的に認識されるＢＡＣＥ１エピトープである。一態様では、ＢＡＣＥ１エピトープは配列番号：４９のアミノ酸３１５−３１８、３３１−３３５及び３７０−３８１を含む。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】図１Ａ−１Ｂは実施例１(Ａ)に記載のナイーブな天然多様性ファージディスプレイライブラリーから得られるクローンＹＷ４１２．８及び親和性成熟形態のＹＷ４１２．８の軽及び重鎖アミノ酸配列を示す。図１Ａは軽鎖配列アラインメントを示す。図１Ｂは重鎖配列アラインメントを示す。図１Ａ及び１Ｂ双方において、各クローンのＨＶＲ配列はボックス領域によって示され、第一ボックスはＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：７及び８−図１Ａ)又はＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：２２及び２３−図１Ｂ)を示し、第二ボックスはＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：９及び１０−図１Ａ)又はＨＶＲ-Ｈ２(配列番号：２４−図１Ｂ)を示し、第三ボックスはＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１１−１６−図１Ａ)又はＨＶＲ-Ｈ３(配列番号：２５−図１Ｂ)を示す。

【図2】図２Ａ−２Ｂは実施例１(Ｂ)に記載のナイーブな合成多様性ファージディスプレイライブラリーから得られるクローンＦａｂ１２及び親和性成熟形態のＦａｂ１２の軽及び重鎖アミノ酸配列を示す。図２Ａは軽鎖配列アラインメントを示す。図２Ｂは重鎖配列アラインメントを示す。図２Ａ及び２Ｂ双方において、各クローンのＨＶＲ配列はボックス領域によって示され、第一ボックスはＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：３５−図２Ａ)又はＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：２８−図２Ｂ)を示し、第二ボックスはＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：３６−３９−図２Ａ)又はＨＶＲ-Ｈ２(配列番号：２９−図２Ｂ)を示し、第三ボックスはＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：４０−図２Ａ)又はＨＶＲ-Ｈ３(配列番号：３０−図２Ｂ)を示す。

【図3】図３Ａ及び３Ｂは、実施例１(Ｂ)に記載される合成多様性ファージディスプレイライブラリーから単離された軽及び重鎖ＦａｂからのＨＶＲ又はＣＤＲ配列を示す。番号付けはＫａｂａｔ等の命名法に従う。図３Ａは、「ＣＤＲＬ１」配列を配列番号：１３３として、「ＣＤＲＬ２」配列を配列番号：１３４として、「ＣＤＲＬ３」配列を配列番号１３５−１４４、１４１、及び１４５−１５２として、そして「ＣＤＲＨ１」配列を配列番号１５３−１５９、１５８、１６０−１６１、１５９、１５８、１６２、１６１、及び１６３−１６７として開示し、全てそれぞれ出現の順である。図３Ｂは「ＣＤＲＨ２」配列を配列番号１６８−１７７、１７４、１７１、１７８−１８２、１７７、及び１８３として、そして「ＣＤＲＨ３」配列を配列番号１８４−２０２として開示し、全てそれぞれ出現の順である。

【図4】図４は、天然多様性及び合成多様性ファージディスプレイライブラリーから同定された様々なクローンによるＢＡＣＥ１の阻害を示すグラフを提供する。実施例１(Ａ)に記載されるように、クローンをホモジニアス時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)アッセイにおいてＢＡＣＥ１阻害について試験した。．全ＹＷシリーズ抗体は、３２０ｎＭの濃度で試験したＹＷ４３４．６抗体以外は、５００ｎＭの濃度で使用した。抗体１２．ＩｇＧ、１４．ＩｇＧ ＬＣ６．ＩｇＧ、ＬＣ９．ＩｇＧ、ＬＣ１０．ＩｇＧ及びＬＣ１１．ＩｇＧを１μＭ濃度で試験した。

【図5】図５は実施例１(Ｂ)に記載のように、合成多様性ファージディスプレイライブラリーから同定された抗ＢＡＣＥ１ Ｆａｂの存在中におけるＨＴＲＦアッセイにおけるＢＡＣＥ１の活性を示すグラフである。ラインはＢＡＣＥ１及び基質(ＰＢＳコントロール)の存在中における１００％活性(０％阻害)及びＢＡＣＥ１の非存在中における１００％阻害に対応する。

【図6】図６は実施例１(Ｂ)に記載する親和性成熟抗ＢＡＣＥ１ ＦａｂのＣＤＲ又はＨＶＲ配列を示す。番号付けはＫａｂａｔ等の命名法に従う。競合ＥＬＩＳＡ比は実施例１(Ｂ)に示すように、１-ポイント競合ＥＬＩＳＡアッセイにおける溶液中における競合として２０ｎＭ ＢＡＣＥ１の不在又は存在中におけるＥＬＩＳＡシグナルの比である。図６は、「ＣＤＲＬ１」配列と配列番号１３３、１３３、１３３、１３３、１３３、及び２０３として、「ＣＤＲＬ２」配列を配列番号１３４、１３４、及び２０４−２０７として、「ＣＤＲＬ３」配列を配列番号２０８−２０９、１４５、１４５、及び１４５−１４６として、「ＣＤＲＨ１」配列を配列番号１５７、１５７、１５８、１５８、１５８、及び１６２として、「ＣＤＲＨ２」配列を配列番号１７２、１７２、１７１、１７１、１７１、及び１７８として、「ＣＤＲＨ３」配列を配列番号１８８、１８８、１９５、１９５、及び１９５−１９６として開示し、全て出現の順である。

【図7】図７Ａ−７Ｃは実施例１(Ｂ)に記載される親和性成熟抗ＢＡＣＥクローンによる競合ＥＬＩＳＡアッセイからのデータを示すグラフを含む。Ｆａｂ-ディスプレイファージ及びプレート上に固定されたＢＡＣＥ１間の結合は、溶液中における段階希釈のＢＡＣＥ１と競合した。図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは親及び対応する親和性成熟抗体の競合曲線を示す。

【図8】図８Ａ−８Ｃは実施例１(Ｂ)に記載されるＨＴＲＦ酵素アッセイにおける抗ＢＡＣＥ１ ＦａｂによるＢＡＣＥ１の阻害を示すグラフを描く。個々の抗ＢＡＣＥ１クローンの精製Ｆａｂの阻害活性をＨＴＲＦ酵素アッセイにおいて測定した。ＯＭ９９-２(CalBiochem(登録商標), catalog #496000)はＢＡＣＥ１の合成ペプチド阻害剤であり、ポジティブコントロールとして使用した。図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは親及び対応する親和性成熟誘導体の阻害曲線である。このアッセイにおいてＯＭ９９-２のＩＣ_５０は１１ｎＭである。

【図9】図９Ａは実施例２(Ｂ)に記載のように、ＨＴＲＦアッセイにおいてＢＡＣＥ１に対する増強感受性を有する長ペプチド基質(左パネル)、又はＦＲＥＴアッセイにおいてＢＡＣＥ１に対する増強感受性を有する短ペプチド基質を使用した、ヒト組換えＢＡＣＥ１のインビトロ酵素活性に対する親和性成熟ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体の影響を示すグラフを提供する。ＯＭ９９-２(CalBiochem(登録商標), catalog #496000)、ＢＡＣＥ１の合成ペプチド阻害剤、β-セクレターゼ阻害剤ＩＶ(CalBiochem(登録商標), catalog #565788)、ＢＡＣＥ１の小分子阻害剤(ＢＡＣＥ１ ＳＭＩ)及びＢＡＣＥ１に結合しないＩｇＧ抗体をコントロールとして使用した。図９Ｂ−１及び９Ｂ−２はまた、実施例２(Ｂ)に記載のように、ＹＷ４１２．８．３１、又はコントロールＩｇＧ抗体の存在下において、ＢＡＣＥ１に対し増強感受性を有する短ペプチドにおけるヒト組換えＢＡＣＥ１細胞外ドメイン、ヒト組換えＢＡＣＥ２細胞外ドメイン、又はカテプシンＤ細胞外ドメインのインビトロ酵素活性を示すグラフを提供する。

【図10】図１０は実施例２(Ｃ)に記載される、２９３-ＨＥＫ細胞における組換えアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)のプロセシングへの、様々な抗ＢＡＣＥ１抗体(ＬＣ６、ＬＣ９、ＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．３１及びＹＷ４１２．８．５１)により実施された実験の結果を示す。ＢＡＣＥ１に結合しないＩｇＧ抗体(Ｘｏｌａｉｒ(登録商標))をコントロールとして使用した。

【図11】図１１Ａ−１１Ｄは実施例２(Ｃ)に記載される、組換え又は内因性アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)のプロセシングへのＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体の効果を示すグラフを提供する。図１１Ａは、野生型ヒトＡＰＰを安定して発現する２９３-ＨＥＫ細胞を使用した実験からの結果を示す。ＢＡＣＥ１ ＳＭＩは、コントロールとして使用された小分子ＢＡＣＥ１阻害剤である(Compound 8e - Charrier等, J. Med. Chem. 51:3313-3317 (2008)。図１１Ｂは野生型ＣＤ１マウスから培養されたＥ１３．５後根神経節ニューロンを使用した実験からの結果を示す。更なる実験を、野生型ＣＤ１マウスからのＥ１６．５皮質ニューロンの培養物(図１１Ｃ)及びＥ１６．５培養海馬ニューロン(図１１Ｄ)を使用して実施した。

【図12】図１２Ａ−１２Ｃは実施例２(Ｄ)に記載される一次マウスニューロンへのＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体の取込みの画像を提供する。図１２Ａはニューロンにおける細胞内小胞へのＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体の内部移行を示す。胚性皮質ニューロンを記載の時間、３７^ｏＣでインキュベートした。結合ＹＷ４１２．８．３１を、α-ヒト-Ａｌｅｘａ５６８によって表面(非透過処理)又は内部(透過処理)細胞コンパートメントにおいて検出した。大部分のシグナルは内部移行していた。内部移行ＹＷ４１２．８．３１を血管コンパートメントについて記載のマーカーによって共染色することによって細胞内コンパートメントに局在化した：初期エンドソーム(ＴｆＲ)；トランスゴルジネットワーク(ＶＡＭＰ４)及びリソソーム(ＬＡＭＰ１)。スケールバー＝６５μｍ(上)及び２０μｍ(下)。図１２Ｂは図に記載の２つの異なる温度及び３つの異なる時点でのＥ１３．５後根神経節(ＤＲＧ)ニューロンへの抗ＢＡＣＥ１抗体の取込みを示す。細胞内ＢＡＣＥ１抗体の標識化を可能にするために細胞を透過処理した。外部結合ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体のみが、非透過処理細胞において標識化される。図１２(Ｃ)はＢＡＣＥ１発現又はＢＡＣＥ１ノックアウトマウスからのＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体のＥ１６．５皮質ニューロンへの取込を示す。

【図13】図１３は実施例３(Ａ)からのＥＬＩＳＡ結果のグラフ表示を提供し、ＹＷ４１２．８抗ＢＡＣＥ１抗体の、それ自身、他の抗ＢＡＣＥ１抗体(ＬＣ６)、活性部位ＢＡＣＥ１結合ペプチド(ＯＭ９９-２(CalBiochem(登録商標), catalog #496000))及びエキソサイトBACE1結合ペプチド(BMS1) (Peptide 1 in Kornacker等, Biochemistry 44:11567-11572 (2005))との競合結合を比較する。

【図14】図１４は実施例３(Ｂ)に記載のヒトＢＡＣＥ１細胞外ドメインと共結晶化されたＦａｂ ＹＷ４１２．８．３１の２．８Å構造の異なる視点を示す。Ｆａｂはセクレターゼ活性部位から遠位のＢＡＣＥ１エキソサイトに結合し、ＢＡＣＥ１阻害特性を有する特定のペプチドと相互作用することが知られている他のエキソサイトと一部重複する。

【図15】図１５はヒトＢＡＣＥ１細胞外ドメインとのＦａｂ ＹＷ４１２．８．３１の相互作用のクローズアップ図を提供する。ＢＡＣＥ１は表面表示において示され、Ｆａｂはリボンとして示されている。ドット面はＢＡＣＥ１エピトープを示す。

【図16】図１６Ａ及び１６Ｂは野生型マウスにおけるＡβ_１−４０レベルへのＢＡＣＥ１の寄与を調査する実験の結果を示す。ＢＡＣＥ１＋／＋対ＢＡＣＥ１−／−マウスにおけるＡβ_１−４０レベルを調査した。マウスは実施例４に記載のように単一投与のコントロールＩｇＧ抗体又は抗ＢＡＣＥ ＹＷ４１２．８．３１抗体を投与された。図１６ＡはマウスにおけるＡβ_１−４０生産へのＢＡＣＥ１の寄与を調査する遺伝子検査の結果を示す。ＢＡＣＥ１ノックアウトマウス(ＢＡＣＥ１−／−)において観察されたＡβ_１−４０のレベルは、ＢＡＣＥ１の特定の阻害剤が野生型マウスにおけるＡβ_1-40生産をどのように変更するかについてのコントロールを提供する。図１６Ｂは投与の２４又は４８後の結晶及びＣＮＳ(皮質)におけるＡβ_１−４０生産への用量コントロールＩｇＧ又は抗ＢＡＣＥ１ ＹＷ４１２．８．３１(５０ｍｇ／ｋｇ)の効果を示す。単一投与のコントロールＩｇＧ又は抗ＢＡＣＥ１抗体(５０ｍｇ／ｋｇ)をＣ５７Ｂｌ／６マウスにＩＶ注入によって送達した。２４又は４８時間後、Ａβ_１−４０を分析するために血漿及び脳サンプルを収集した。血漿Ａβ_１−４０は３５％(２４時間で)低減され、皮質Ａβ_１−４０は〜２０％であった。プロットされた値は平均(±ＳＥＭ)＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００１である。

【図17】図１７Ａ−１７Ｂは実施例４に記載のインビボＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体実験の結果を提供する。図１７Ａはビヒクルコントロール処置と比較した、２つの異なる濃度のＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体で処置されたマウスの血漿及び海馬において観察されるＡβ_１−４０レベルのプロットを示す。図１７Ｂは個々の薬物動態対薬力学読み出しのプロットであり、ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体についてこのマウスモデルにおいてＰＫ／ＰＤ関係が存在することを示す。

【図18】図１８Ａ及び１８Ｂは、ｈＡＰＰ-トランスジェニックマウスにＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体を全身性に(パネルＡ、図１７Ａに記載のと同じ実験を比較のための再グラフ化)又は持続ＩＣＶ注入によって(パネルＢ)投与した実験からの比較を示す。図１８Ａでは、動物はＩＰ注入(３投与＠Ｑ４Ｄ)によってビヒクル又は抗ＢＡＣＥ１抗体(３０又は１００ｍｇ／ｋｇ)を受けた。最後の投与の２時間後、Ａβ_１−４０及びＡβ_１−４２を分析するために血漿及び脳サンプルを収集した。血漿Ａβ_１−４０及びＡβ_１−４２は３０及び１００ｍｇ／ｋｇ抗ＢＡＣＥ１抗体双方で、〜３０％コントロールレベルに低減された。海馬Ａβ_１−４０及びＡβ_１−４２は高用量の抗ＢＡＣＥ１(１００ｍｇ／ｋｇ)で低減され(１３−２２％)、皮質Ａβ_１−４０及びＡβ_１−４２は減少傾向を示した(１２−１８％)。図１８Ｂでは、コントロールＩｇＧ又は抗ＢＡＣＥ１抗体を７日間、一側性ＩＣＶ注入によって送達した。皮質(１５−２３％)及び海馬(１５−２０％)双方における投与でＡβ_１−４０及びＡβ_１−４２に一貫した減少が見られた。パネルＣは全身性対ＩＣＶ送達後の脳における抗ＢＡＣＥ１抗体のレベルを示す。プロットされた値は平均(±ＳＥＭ)＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１である。

【図19】図１９Ａ及び１９Ｂは、ＢＡＬＢ／ＣマウスにＩＶ注入によって送達された単一投与のＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１(１又は１０ｍｇ／ｋｇ)のＰＫ分析を示す(図１９Ａ)。血清ＰＫを投与後２１日まで分析した。２つの別個のＰＫアッセイを使用した：血清における抗ＢＡＣＥ１を検出するアッセイ(全ｍＡｂ)、及び血清における抗ＢＡＣＥ１のみを検出するアッセイ(遊離ｍＡｂ)。ＢＡＣＥ１＋／＋、ＢＡＣＥ１＋／−、及びＢＡＣＥ１−／−マウスにおける単一投与ＰＫ分析は、初期研究において観察された非線形を確認し、増強クリアランスが確かに標的媒介であることを示す(図１９Ｂ)。

【図20】図２０Ａ及び２０ＢはＩＶ送達によってコントロールＩｇＧ又はＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体(３０ｍｇ／ｋｇ)を投与されたカニクイザルのＰＫ分析を示す。サル血清(図２０Ａ)及びＣＳＦサンプル(図２０Ｂ)における全抗ＢＡＣＥ１又はコントロール抗体濃度を、実施例５に記載のようにサル吸着ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体(Bethyl, Montgomery, TX)を使用して測定した。

【図21】図２１Ａ−２１Ｄは実施例５に記載の実験の結果であり、カニクイザルはＩＶ送達によってコントロールＩｇＧ又は抗ＢＡＣＥ１抗体ＹＷ４１２．８．３１が投与された。斜線は個々の動物のデータを示し、実線はグループ平均を示す。各個々のサルにおけるＡβ_１−４０ベースラインの平均値を設定するために、血漿及びＣＳＦを投与の７日、２日及び直前にサンプリングした。血漿Ａβ_１−４０(図２１Ａ)及びＣＳＦ Ａβ_１−４０(図２１Ｂ)を様々な時間に測定した。ベースライン血漿(図２１Ｃ)及びＣＳＦ(図２１Ｄ)Ａβ_１−４０における動物のばらつきをまた示す。

【図22】図２２Ａ及び２２Ｂは野生型マウスにおけるＹＷ４１２．８．３１の全身性投与後のＡβ生産を示す。図２２ＡはＣ５７Ｂｌ／６ＪマウスへＩＰ注入によって投与されたコントロールＩｇＧ又はＹＷ４１２．８．３１(１００ｍｇ／ｋｇ)の単一投与後のＡβ_１−４０生産を示すグラフである。４時間後、Ａβ_１−４０を分析するために血漿及び脳サンプルを収集した。血漿Ａβ_１−４０は４８％減少したが、前脳Ａβ_１−４０はこのパラダイムでは減少しなかった。図２２Ｂは各４日離した３のＩＰ注入によるコントロールＩｇＧ又はＹＷ４１２．８．３１(３０又は１００ｍｇ／ｋｇ)投与後のＡβ_１−４０生産を示すグラフである。最後の投与の４時間後、Ａβ_１−４０を分析するために血漿及び脳サンプルを収集した。血漿Ａβ_１−４０は５０−５３％は減少し、前脳Ａβ_１−４０は３０ｍｇ／ｋｇでの投与によって減少せず、１００ｍｇ／ｋｇで投与されたとき４２％減少する。プロットされた値は平均(±ＳＥＭ)＊ｐ＜０．０００１である。

【図23】図２３Ａ−２３ＣはクローンＹＷ４１２．８．３１及び親和性成熟形態のＹＷ４１２．８．３１の軽鎖アミノ酸配列を示す。図２３Ａ−２３Ｃは完全軽鎖配列アラインメントを示す。各クローンのＨＶＲ配列をボックス領域で示し、第一ボックスはＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：７−図２３Ａ)を示し、第二ボックスはＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：９及び５８−６４−図２３Ｂ)を示し、そして第三ボックスはＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１２及び「６６−６７−図２３Ｃ)を示す。

【図24】図２４Ａ−２４ＣはクローンＹＷ４１２．８．３１及び親和性形態のＹＷ４１２．８．３１の重鎖アミノ酸配列を示す。図２４Ａ−２４Ｃは完全重鎖配列アラインメントを示す。各クローンのＨＶＲ配列をボックス領域で示し、第一ボックスはＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：２４及び７１−７３−図２４Ａ)を示し、第二ボックスはＨＶＲ-Ｈ２(配列番号：２４及び７４−７８−図２４Ｂ)を示し、第三ボックスはＨＶＲ-Ｈ３(配列番号：２５及び７９−図２４Ｃ)を示す。

【図25】図２５Ａ及びＢは実施例６に記載のＨＴＲＦアッセイにおけるＹＷ４１２．８．３１及び親和性成熟クローンによるＢＡＣＥ１の阻害を示すグラフを示す。プロテアーゼ活性を阻害するクローンＹＷ４１２．８．３１．３Ｓ；ＹＷ４１２．８．３１．９Ｓ；ＹＷ４１２．８．３１．２５Ｓ；ＹＷ４１２．８．３１．５８Ｓ；ＹＷ４１２．８．３１．５３；ＹＷ４１２．８．３１．６９；ＹＷ４１２．８．３１．７７；ＹＷ４１２．８．３１．８１Ｓ及びＹＷ４１２．８．３１．８９Ｓの能力を試験した。

【発明を実施するための形態】

【0055】

(発明の実施態様の詳細な説明)
Ｉ．定義
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下に定義するヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(ＶＨ)フレームワークのアミノ酸配列を含んでなる。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列変化を有してもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列において同一である。

【0056】

「親和性」とは、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合相互作用の強さの合計を指す。明記なき限り、ここで使用される場合、「結合親和性」とは結合対(例えば抗体及び抗原)のメンバー間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般的に解離定数(Ｋｄ)によって表される。親和性は当分野で知られている一般的な方法によって測定可能であり、ここに記載されるものを含む。結合親和性を測定するための具体的な説明的、例示的実施態様を以下に記載する。

【0057】

「親和性成熟」抗体とは、そのような変更を持たない親抗体と比較して一又は複数の超可変領域(ＨＶＲ)における一又は複数の変更を有する抗体を指し、そのような変更は抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす。

【0058】

「抗β-セクレターゼ抗体」、「抗ＢＡＣＥ１抗体」、「β-セクレターゼに結合する抗体」及び「ＢＡＣＥ１に結合する抗体」なる用語は、十分な親和性でＢＡＣＥ１に結合可能であり、ＢＡＣＥ１を標的にすることにおいて診断及び／又は治療剤として有用であるような抗体を指す。一実施態様では、無関係な非ＢＡＣＥ１タンパク質への抗ＢＡＣＥ１抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定され、ＢＡＣＥ１への抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する抗体は、?１μＭ、?１００ｎＭ、?１０ｎＭ、?１ｎＭ、?０．１ｎＭ、?０．０１ｎＭ、又は?０．００１ｎＭ(例えば１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は、異なる種及びアイソフォームからのＢＡＣＥ１間で保存されたＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。

【0059】

ここにおいて「抗体」なる用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望の抗原結合活性を呈する限り抗体断片を含む。

【0060】

「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、限定するものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’-ＳＨ、Ｆ(ａｂ’)_２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子(例えばｓｃＦｖ)；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。

【0061】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上阻止する抗体を指し、逆に、競合アッセイにおいて参照抗体は抗体のその抗原への結合を５０％以上阻止する。例示的な競合アッセイがここに提供される。

【0062】

「キメラ」抗体なる用語は、重及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。

【0063】

抗体の「クラス」とは、重鎖が持つ定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかはＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２等のサブクラス(アイソタイプ)に更に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0064】

「細胞傷害剤」なる用語は、ここで使用される場合、細胞機能を阻害又は防止する及び／又は細胞死又は破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害剤は、限定するものではないが放射性同位体(例えばＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体)；化学療法物質又は薬物(例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤)；増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素(その断片及び／又は変異体を含む)；及び下に開示される様々な抗腫瘍又は抗癌剤を含む。

【0065】

「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプによって異なる抗体のＦｃ領域に起因しうるそれらの生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面受容体(例えばＢ細胞受容体)の下方制御；及びＢ細胞活性化を含む。

【0066】

「有効な量」の物質、例えば薬学的製剤とは、所望の治療又は予防結果を得るための必要な容量及び期間での有効な量を指す。

【0067】

ここでの「Ｆｃ領域」なる用語は、定常領域の少なくとも一部を有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域及び可変Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に延在する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン(Ｌｙｓ４４７)は存在する場合とそうでない場合がありうる。明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵｉｎｄｅｘとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従い、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されている。

【0068】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般的に４つのドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４から成る。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般的にＶＨ(又はＶＬ)において次の配列において出現する：ＦＲ１-Ｈ１(Ｌ１)-ＦＲ２-Ｈ２(Ｌ２)-ＦＲ３-Ｈ３(Ｌ３)-ＦＲ４。

【0069】

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」なる用語は、ここでは交換可能に使用され、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を持ち、ここで定義されるＦｃ領域を有する重鎖を持つ抗体を指す。

【0070】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」なる用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、一次形質転換細胞、及び継代の数に関わらずそれらに由来する子孫を含む。子孫は親細胞に対して核酸内容物において完全に同一でない場合があり、変異を含みうる。元の形質転換細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫はここに含まれる。

【0071】

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって生産されるか、又はヒト抗体レパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用した非ヒト供給源から得られる抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を特異的に除く。

【0072】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一実施態様では、ＶＬでは、サブグループはKabat等, supraのサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨでは、サブグループはKabat等, supraのサブグループＩＩＩである。

【0073】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含んでなるキメラ抗体を指す。ある実施態様では、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全て又は実質的に全てのＨＶＲ(例えばＣＤＲ)は非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は場合によっては、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。

【0074】

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、ここで使用される場合、配列において超可変である及び／又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、天然の４鎖抗体は６つのＨＶＲ；ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)に３つ、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)に３つを含む。ＨＶＲは一般的に超可変ループから及び／又は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)からアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性であるか及び／又は抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)、９１−９６(Ｌ３)、２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)、及び９６−１０１(Ｈ３)で生じる。(Chothia and Lesk, J. Mol.Biol.196:901-917 (1987))。例示的なＣＤＲ(ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２、ＣＤＲ-Ｌ３、ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２、及びＣＤＲ-Ｈ３)は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨにおけるＣＤＲを除き、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定領域」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、abbreviated-ＣＤＲ、又はａ-ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの残基内に含まれる。例示的なａ-ＣＤＲ(ａ-ＣＤＲ-Ｌ１、ａ-ＣＤＲ-Ｌ２、ａ-ＣＤＲ-Ｌ３、ａ-ＣＤＲ-Ｈ１、ａ-ＣＤＲ-Ｈ２、及びａ-ＣＤＲ-Ｈ３)は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Almagro and Fransson, Front.Biosci.13:1619-1633 (2008)を参照)。明記しない限り、可変ドメインにおけるＨＶＲ残基及び他の残基(例えばＦＲ残基)は、ここではKabat等, supraに従って番号付けされる。

【0075】

「イムノコンジュゲート」は、限定するものではないが細胞傷害剤を含む一又は複数の異種性分子にコンジュゲートされた抗体である。

【0076】

「個体」又は「被験体」とは、哺乳類である。哺乳類は、限定するものではないが家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、及び齧歯類(例えばマウス及びラット)を含む。ある実施態様では、個体又は被験体はヒトである。

【0077】

「単離された」抗体は、それの天然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様では、抗体は９５％又は９９％超の純度に精製され、例えば電気泳動(例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥ、等電点電気泳動(ＩＥＦ)、キャピラリー電気泳動)又はクロマトグラフィー(例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ)で決定される。抗体純度の評価の方法の総説として、例えばFlatman等, J. Chromatogr.B 848:79-87 (2007)を参照のこと。

【0078】

「単離された」核酸は、それの天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を元々有した細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外に、又はそれの天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0079】

「抗ＢＡＣＥ１抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重及び軽鎖(又はその断片)をコードする一又は複数の核酸分子を指し、単一ベクター又は異なるベクターにおけるこのような核酸分子を含み、このような核酸分子は宿主細胞における一又は複数の位置に存在する。

【0080】

「モノクローナル抗体」なる用語は、ここで使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、ありうる可変抗体を除き同一であるか及び／又は同じエピトープに結合し、例えば自然に生じる変異又はモノクローナル抗体調製物の生産中に生じるものを含み、このような変異体は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比較して、モノクローナル抗体の各モノクローナル抗体調製物は抗原における単一決定基に向けられる。従って、「モノクローナル」なる修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を意味し、何れかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術によって作られ得、限定するのもではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン座の全部又は一部を有するトランスジェニック動物を利用する方法を含み、モノクローナル抗体を作成するためのこのような方法及び他の例示的な方法がここに記載されている。

【0081】

「ネイキッド抗体」は、異種性部分(例えば細胞傷害部分)又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在しうる。

【0082】

「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合された２つの同一な軽鎖及び２つの同一な重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ-からＣ-末端へ、各重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＨ)、その後に３つの定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３)を有する。同様に、Ｎ-からＣ-末端へ、各軽鎖は可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＬ)、その後に定常軽(ＣＬ)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つのタイプの内一つに割り当てられうる。

【0083】

「パッケージ挿入物」なる用語は、治療用製品の商用パッケージに習慣的に含まれている説明書を指すために使用され、適応症、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含む。

【0084】

参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。

【0085】

アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。

【0086】

「薬学的製剤」なる用語は、そのような形態においてそこに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にし、製剤が投与されるであろう被験体に容認し難いほど毒性である更なる成分を含まない調製物を指す。

【0087】

「薬学的に許容可能な担体」とは、被験体に非毒性である活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないがバッファー、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。

【0088】

「ＢＡＣＥ１」なる用語は、ここで使用される場合、別段の定めがある場合を除き、哺乳類、例えば霊長類(例えばヒト)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)を含む何れかの脊椎動物供給源からの何れかの天然β-セクレターゼ１(β-部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、膜結合アスパラギン酸プロテアーゼ２、メマプシン２、アスパルチルプロテアーゼ２又はＡｓｐ２とも呼ばれる)を指す。用語は「完全長」の非プロセシングＢＡＣＥ１並びに細胞におけるプロセシングから得られる何れかの形態のＢＡＣＥ１を包含する。用語はまた、ＢＡＣＥ１の天然に生じる変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子多型を包含する。例示的ＢＡＣＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列は下の配列番号：４９に示され、Vassar等, Science 286:735-741 (1999)に報告されるヒトＢＡＣＥ１、アイソフォームＡの配列であり、出典明記によってその全体をここに援用する。
ＭＡＱＡＬＰＷＬＬＬＷＭＧＡＧＶＬＰＡＨＧＴＱＨＧＩＲＬＰＬＲＳＧＬＧＧＡＰＬＧＬＲＬＰＲＥＴＤＥＥＰＥＥＰＧＲＲＧＳＦＶＥＭＶＤＮＬＲＧＫＳＧＱＧＹＹＶＥＭＴＶＧＳＰＰＱＴＬＮＩＬＶＤＴＧＳＳＮＦＡＶＧＡＡＰＨＰＦＬＨＲＹＹＱＲＱＬＳＳＴＹＲＤＬＲＫＧＶＹＶＰＹＴＱＧＫＷＥＧＥＬＧＴＤＬＶＳＩＰＨＧＰＮＶＴＶＲＡＮＩＡＡＩＴＥＳＤＫＦＦＩＮＧＳＮＷＥＧＩＬＧＬＡＹＡＥＩＡＲＰＤＤＳＬＥＰＦＦＤＳＬＶＫＱＴＨＶＰＮＬＦＳＬＱＬＣＧＡＧＦＰＬＮＱＳＥＶＬＡＳＶＧＧＳＭＩＩＧＧＩＤＨＳＬＹＴＧＳＬＷＹＴＰＩＲＲＥＷＹＹＥＶＩＩＶＲＶＥＩＮＧＱＤＬＫＭＤＣＫＥＹＮＹＤＫＳＩＶＤＳＧＴＴＮＬＲＬＰＫＫＶＦＥＡＡＶＫＳＩＫＡＡＳＳＴＥＫＦＰＤＧＦＷＬＧＥＱＬＶＣＷＱＡＧＴＴＰＷＮＩＦＰＶＩＳＬＹＬＭＧＥＶＴＮＱＳＦＲＩＴＩＬＰＱＱＹＬＲＰＶＥＤＶＡＴＳＱＤＤＣＹＫＦＡＩＳＱＳＳＴＧＴＶＭＧＡＶＩＭＥＧＦＹＶＶＦＤＲＡＲＫＲＩＧＦＡＶＳＡＣＨＶＨＤＥＦＲＴＡＡＶＥＧＰＦＶＴＬＤＭＥＤＣＧＹＮＩＰＱＴＤＥＳＴＬＭＴＩＡＹＶＭＡＡＩＣＡＬＦＭＬＰＬＣＬＭＶＣＱＷＣＣＬＲＣＬＲＱＱＨＤＤＦＡＤＤＩＳＬＬＫ(配列番号：４９)

【0089】

ヒトＢＡＣＥ１の幾つかの他のアイソフォームが存在し、アイソフォームＢ、Ｃ及びＤを含む。UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817を参照のこと(出典明記によってその全体をここに援用する)。アイソフォームＢは配列番号：５０に示され、アミノ酸１９０−２１４を欠く点においてアイソフォームＡ(配列番号：４９)と異なる(すなわち、配列番号：４９のアミノ酸１９０−２１４の欠失)。アイソフォームＣは配列番号：５１に示され、アミノ酸１４６−１８９を欠く点においてアイソフォームＡ(配列番号：４９)と異なる(すなわち、配列番号：４９のアミノ酸１４６−１８９の欠失)。アイソフォームＤは配列番号：５２に示され、アミノ酸１４６−１８９及び１９０−２１４を欠く点においてアイソフォームＡ(配列番号：４９)と異なる(すなわち、配列番号：４９のアミノ酸１４６−１８９及び１９０−２１４の欠失)。

【0090】

ここで使用される場合、「治療(treatment)」(及び「治療(treat)」又は「治療(treating)」などのその文法的変異)とは、治療されている個体の自然の経過を変更する目的での臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理学の経過中に実施されうる。治療の所望される効果は、限定するものではないが、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の何れかの直接的又は間接的病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行の割合の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解予後改善を含む。幾つかの実施態様では、発明の抗体は、疾患の展開を遅延するため又は疾患の進行を遅くするために使用される。

【0091】

「可変領域」又は「可変ドメイン」なる用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれＶＨ及びＶＬ)は一般的に類似した構造を有し、各ドメインは４つの保存フレームワーク領域(ＦＲ)及び３つの超可変領域(ＨＶＲ)を含んでなる。(例えばKindt等Kuby Immunology, 6^th ed., W.H.Freeman and Co., page 91 (2007)を参照)。単一ＶＨ又はＶＬドメインが抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。更に、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ相補ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に結合する抗体からＶＬ又はＶＨドメインを使用して単離されうる。例えばPortolano等, J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson等, Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと。

【0092】

「ベクター」なる用語は、ここで使用される場合、それが連結される別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。用語は、自己複製核酸構造のベクター並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。あるベクターは、作動的に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、ここでは「発現ベクター」と呼ばれる。

【0093】

「神経障害」又は「神経疾患」なる用語は、哺乳類における中枢及び／又は末梢神経系の疾患又は障害を指すか又は説明する。神経障害の例は、限定するものではないが以下の疾患及び障害を含む。ニューロパチー障害は不適切な又は非制御的な神経シグナル伝達又はその欠如に特徴付けられる神経系の疾患又は異常であり、限定するものではないが慢性疼痛(例えば侵害受容性疼痛(外傷による体組織への疼痛、癌性疼痛を含む)、神経障害性疼痛(神経、脊髄、又は脳における異常による疼痛)、及び心因性疼痛(完全に又はほぼ心理学的疾患に関する)、頭痛、片頭痛、ニューロパチー、及びめまい又は吐き気等のニューロパチー障害をしばしば伴う症状及び症候群を含む。アミロイドーシスはＣＮＳにおける細胞外タンパク質沈着を伴う疾患及び障害のグループであり、限定するものではないが二次性アミロイドーシス、加齢性アミロイドーシス、アルツハイマー病(ＡＤ)、軽度認知障害(ＭＣＩ)、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血(オランダ型)；グアム‐パーキンソン認知症、脳アミロイド血管症、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症；クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症、ＨＩＶ-関連認知症、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、封入体筋炎(ＩＢＭ)、及びβアミロイド沈着に関連する眼疾患(すなわち、黄斑変性、ドルーゼン関連視神経症、及び白内障)を含む。ＣＮＳの癌は一又は複数のＣＮＳ細胞(すなわち神経細胞)の異常増殖を特徴とし、限定するものではないが神経膠腫、多形神経膠芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、聴神経腫瘍、軟骨腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、シュワン腫、神経線維腫、神経芽腫、及び硬膜外、髄内又は硬膜内腫瘍を含む。眼疾患又は障害は眼の疾患又は障害であり、ここでの目的ではＢＢＢに影響されるＣＮＳ臓器が考えられる。眼疾患又は障害は、限定するものではないが、強膜、角膜、虹彩及び毛様体の障害(すなわち、強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦過傷、雪眼炎、アークアイ、タイゲソン点状表層角膜症、角膜血管新生、フックスジストロフィー、円錐角膜、乾性角結膜炎、虹彩炎及びぶどう膜炎)、水晶体の障害(すなわち、白内障)、脈絡膜及び網膜の障害(すなわち、網膜剥離、網膜分離症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、網膜症、未熟児の網膜症、加齢黄斑変性症、黄斑変性症(ウェット又はドライ)、網膜上膜、網膜色素変性症及び黄斑浮腫)、緑内障、飛蚊症、視神経及び視覚路の障害(すなわち、レーベル遺伝性視神経症及び視神経乳頭ドルーゼン)、眼筋／両眼運動調節／屈折の障害(すなわち、斜視、眼麻痺、進行性外眼筋麻痺、内斜視、外斜視、遠視、近視、乱視、不同視、老視及び眼筋麻痺)、視覚障害及び盲目症(すなわち、弱視、レーバー先天性黒内障、暗点、色覚異常(color blindness)、色覚異常(achromatopsia)、夜盲症、盲目症、河川盲目症及び小眼球症／コロボーマ)、充血、アーガイル・ロバートソン瞳孔、角膜真菌症、眼球乾燥症及びandaniridiaを含む。ＣＮＳのウィルス又は微生物感染は、限定するものではないが、ウィルス(すなわち、インフルエンザ、ＨＩＶ、ポリオウイルス、風疹、)、細菌(すなわち、ナイセリア菌種、ストレプトコッカス菌種、シュードモナス菌種、プロテウス菌種、大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌種、髄膜炎菌種、ヘモフィルス菌種、及びマイコバクテリウム・ツベルクローシス)及び他の微生物、例えば真菌(すなわち、酵母、クリプトコッカス・ネオフォルマンス)、寄生虫(すなわち、トキソプラズマ・ゴンディ)又はアメーバによる感染を含み、限定するものではないが、急性又は慢性でありうる髄膜炎、脳炎、脊髄炎、血管炎及び膿瘍を含むＣＮＳ病態生理をもたらす。ＣＮＳの炎症は、物理的損傷(すなわち、事故、手術、頭部外傷、脊髄損傷、脳振盪に起因する)又はＣＮＳの一又は複数の他の疾患又は障害に起因又は関連する損傷(すなわち、膿瘍、癌、ウィルス又は微生物感染)でありうるＣＮＳへの損傷により引き起こされる炎症である。ＣＮＳの虚血は、ここで使用される場合、脳における異常な血流又は血管挙動又はその要因に関する障害の群を指し、限定するものではないが局所脳虚血、全脳虚血、脳卒中(すなわち、くも膜下出血及び脳出血)、及び動脈瘤を含む。神経変性疾患は、ＣＮＳにおける神経細胞の機能欠如又は死に伴う疾患又は障害の群であり、限定するものではないが副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、アルパース病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、アミロイドーシスにより引き起こされるか又はそれに伴う変性、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭葉変性症、ケネディー病、多系統萎縮症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、横断性脊髄炎、レフサム病、及び脊髄小脳失調症を含む。ＣＮＳの発作疾患又は障害はＣＮＳにおける不適切及び／又は異常な電気伝導を含み、限定するものではないがてんかん(すなわち、欠神発作、脱力発作、良性ローランドてんかん、小児欠神てんかん、間代発作、複雑部分発作、前頭葉てんかん、熱性発作、点頭てんかん、若年性ミオクローヌスてんかん、若年性欠神てんかん、レノックス・ガストー症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ドラベ症候群、大田原症候群、ウエスト症候群、ミオクローヌス発作、ミトコンドリア障害、進行性ミオクローヌスてんかん、心因性発作、反射てんかん、ラスムッセン症候群、単純部分発作、二次性全身性発作、側頭葉てんかん、強直間代発作、強直性発作、精神運動発作、辺縁系てんかん、部分発症発作、一般発症発作、てんかん重積症、腹部てんかん、無動発作、自律神経発作、巨大両側性ミオクローヌス(massive bilateral myoclonus)、月経随伴性てんかん、くず折れ発作、情動性発作、焦点発作、笑い発作、ジャクソン発作、ラフォラ疾患、運動発作、多巣性発作、夜間発作、光過敏性発作、偽発作、感覚発作、微発作、シルヴァン発作、離脱発作、及び視覚反射発作)を含む。行動障害は被験体の異常行動を特徴とするＣＮＳの障害であり、限定するものではないが睡眠障害(すなわち、不眠、睡眠時随伴症、夜驚症、概日リズム睡眠障害、及びナルコレプシー)、気分障害(すなわち、うつ病、自殺性鬱病、不安、慢性情動障害、恐怖症、パニック発作、強迫性障害、注意欠陥多動障害(ＡＤＨＤ)、注意欠陥障害(ＡＤＤ)、慢性疲労症候群、広場恐怖症、心的外傷後ストレス障害、双極性障害)、摂食障害(すなわち、食欲不振又は過食症)、精神病、発達性行動障害(すなわち、自閉症、レット症候群、アスペルガー症候群)、人格障害及び精神障害(すなわち、統合失調症、妄想性障害等)を含む。リソソーム蓄積症は、場合によってはＣＮＳに関連するか又はＣＮＳ特異的症状を有する代謝障害であり、限定するものではないがテイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症(タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩ)、糖原病、ＧＭ１-ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ファーバー病、カナバン白質ジストロフィー、及び神経セロイドリポフスチン症タイプ１及び２、ニーマン・ピック病、ポンペ病、及びクラッベ病を含む。

【0094】

ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、発明は、一つには、ＢＡＣＥ１に結合し、ＢＡＣＥ１活性を低減及び／又は阻害する抗体に基づく。ある実施態様では、ＢＡＣＥ１の活性部位又はエキソサイトに結合する抗体が提供される。

【0095】

Ａ．例示的な抗ＢＡＣＥ１抗体
一態様では、発明は、(ａ)配列番号：２２、２３、２６、２８、４５、６８、７１、７２、７３又は１２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２４、２９、４６、６９、７４、７５、７６、７７、７８又は１２１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：２５、３０、４７、７０、７９又は１２２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：７、８、１７、３５又は４２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：９、１０、１８、３６−３９、４１、４３、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４又は１１８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：１１−１６、１９、４０、４４、５７、６５、６６、６７又は１１９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６のＨＶＲを含んでなる抗ＢＡＣＥ１抗体を提供する。

【0096】

一態様では、発明は、(ａ)配列番号：２２、２３、２６、２８、４５、６８、７１−７３又は１２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２４、２９、４６、６９、７４−７８又は１２１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５、３０、４７、７０、７９又は１２２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＨＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。

【0097】

一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：２２又は配列番号：２３又は配列番号：２８又は配列番号：７１又は配列番号：７２又は配列番号：７３を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１を含む。別の実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：２４又は配列番号：２９又は配列番号：７４又は配列番号：７５又は配列番号：７６又は配列番号：７７又は配列番号：７８を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：２５又は配列番号：３０又は配列番号：７９を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含む。一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：２８を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１を含む。別の実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：２９を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：３０を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含む。

【0098】

別の実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：２２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：２３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含む。更なる実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：２８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：３０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含む。更なる実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：２３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：２３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：２３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：２３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：７９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：７８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：２５アミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３を含む。

【0099】

別の態様では、発明は(ａ)配列番号：７、８、１７、３５及び４２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９、１０、１８、３６−３９、４１、４３、５６、５８−６４又は１１８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１１−１６、１９、４０、４４、５７、６５−６７又は１１９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＬＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。

【0100】

一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：７又は列番号：８を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１を含む。別の実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：９又は配列番号：１０又は配列番号：５８又は配列番号：５９又は配列番号：６０又は配列番号：６１又は配列番号：６２又は配列番号：６３又は配列番号：６４を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、配列番号：１１又は配列番号：１２又は配列番号：１３又は配列番号：１４又は配列番号：１５又は配列番号：１６又は配列番号：６５又は配列番号：６６又は配列番号：６７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含む。別の実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：３５を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：３６−３９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、アミノ酸配列配列番号：４０を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含む。

【0101】

別の実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：１０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含む。更なる実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：３５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：３６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：４０アミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：３５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：３７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：４０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：３５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：３８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：４０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：３５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：３９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：４０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含む。

【0102】

別の実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：５８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１２アミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：５９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９アミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：６０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：６１アミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：５９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：６２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：６３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含むか、又は抗体は(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：６４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含む。

【0103】

別の態様では、発明の抗体は、(ａ)(ｉ)配列番号：２２、２３、２６、２８、４５、６８、７１−７３又は１２０から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１(ｉｉ)配列番号：２４、２９、４６、６９、７４−７８又は１２１から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２及び(ｉｉｉ)配列番号：２５、３０、４７、７０、７９又は１２２から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＨＨＶＲ配列を含んでなるＶＨドメイン；及び(ｂ)(ｉ)配列番号：７、８、１７、３５又は４２から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１、(ｉｉ)配列番号：９、１０、１８、３６−３９、４１、４３、５６、５８−６４又は１１８から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：１１−１６、１９、４０、４４、５７、６５−６７又は１１９から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＬＨＶＲ配列を含んでなるＶＬドメインを含む。

【0104】

別の態様では、発明は、(ａ)配列番号：２３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)配列番号：７のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)配列番号：９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)配列番号：１２から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる抗体を提供する。

【0105】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１はアミノ酸配列ＧＦＸ_３０ＦＸ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４ＩＨ(配列番号：４５)を含み(上式中、Ｘ_３０＝Ｎ又はＴ；Ｘ_３１＝Ｓ、Ｌ又はＹ；Ｘ_３２＝Ｇ又はＹ；Ｘ_３３＝Ｙ又はＳ；及びＸ_３４＝Ａ、Ｇ又はＳ)；ＨＶＲ-Ｈ２はアミノ酸配列Ｘ_３５Ｘ_３６ＩＳＰＸ_３７Ｘ_３８ＧＸ_３９ＴＸ_４０ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：４６)を含み(上式中、Ｘ_３５＝Ａ又はＧ；Ｘ_３６＝Ｗ又はＳ；Ｘ_３７＝Ａ又はＹ；Ｘ_３８＝Ｇ又はＳ；Ｘ_３９＝Ｓ又はＹ；及びＸ_４０＝Ｄ又はＳ)；そしてＨＶＲ-Ｈ３は配列Ｘ_４１ＰＸ_４２Ｘ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７ＭＤＹ(配列番号：４７)を含む(上式中、Ｘ_４１＝Ｑ又はＧ；Ｘ_４２＝Ｔ又はＦ；Ｘ_４３＝Ｈ又はＳ；Ｘ_４４＝Ｙ又はＰ；Ｘ_４５＝Ｙ又はＷ；Ｘ_４６＝Ｙ又はＶ及びＸ_４７は配列ＹＡＫＧＹＫＡ(配列番号：４８)を含んでいてもよい)。

【0106】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１はアミノ酸配列ＧＸ_７１Ｘ_７２Ｘ_７３Ｘ_７４Ｘ_７５Ｘ_７６Ｘ_７７ＩＨ(配列番号：１２０)を含み(上式中、Ｘ_７１＝Ｆ又はＹ；Ｘ_７２＝Ｆ、Ｎ又はＴ；Ｘ_７３＝Ｆ又はＹ；Ｘ_７４＝Ｌ、Ｑ、Ｉ、Ｓ又はＹ；Ｘ_７５＝Ｇ又はＹ；Ｘ_７６＝Ｙ又はＳ；及びＸ_７７＝Ａ、Ｇ又はＳ)；ＨＶＲ-Ｈ２はアミノ酸配列Ｘ_７８Ｘ_７９ＩＳＰＸ_８０Ｘ_８１ＧＸ_８２Ｘ_８３Ｘ_８４ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：１２１)を含み(上式中、Ｘ_７８＝Ａ又はＧ；Ｘ_７９＝Ｗ又はＳ；Ｘ_８０＝Ａ、Ｓ、Ｑ又はＹ；Ｘ_８１＝Ｇ又はＳ；Ｘ_８２＝Ｓ、Ｋ、Ｌ又はＹ；Ｘ_８３＝Ｔ又はＹ；及びＸ_８４＝Ｄ又はＳ)；そしてＨＶＲ-Ｈ３はアミノ酸配列Ｘ_８５ＰＸ_８６Ｘ_８７Ｘ_８８Ｘ_８９Ｘ_９０Ｘ_９１ＭＤＹ(配列番号：１２２)を含む(上式中、Ｘ_８５＝Ｑ又はＧ；Ｘ_８６＝Ｔ又はＦ；Ｘ_８７＝Ｈ、Ｙ又はＳ；Ｘ_８８＝Ｙ又はＰ；Ｘ_８９＝Ｙ又はＷ；Ｘ_９０＝Ｙ又はＶ及びＸ_９１は配列ＹＡＫＧＹＫＡ(配列番号：４８)を含んでいてもよい)。

【0107】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１はアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ａ、(配列番号：４２)を含み(上式中、Ｘ_１７＝Ｓ、Ｄ又はＶ；Ｘ_１８＝Ｓ又はＡ；Ｘ_１９＝Ｓ、Ｔ又はＮ；Ｘ_２０＝Ａ又はＳ；Ｘ_２１＝Ｖ又はＬ)、ＨＶＲ-Ｌ２はアミノ酸配列Ｘ_２２ＡＳＸ_２３ＬＹＳ(配列番号：４３)を含み(上式中、Ｘ_２２＝Ｓ、Ｗ、Ｙ又はＬ；Ｘ_２３＝Ｆ、Ｓ又はＷ)、そしてＨＶＲ-Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｔ(配列番号：４４)を含む(上式中、Ｘ_２４＝Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｄ又はＹ；Ｘ_２５＝Ｙ、Ｐ、Ｓ又はＡ；Ｘ_２６＝Ｙ、Ｔ又はＮ；Ｘ_２７＝Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＳ；Ｘ_２８＝Ｐ又はＬ；及びＸ_２９＝Ｆ、Ｐ又はＴ)。

【0108】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２及びＨＶＲ-Ｌ３の群から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１はアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ａ(配列番号：４２)を含み(上式中、Ｘ_１７＝Ｓ、Ｄ又はＶ；Ｘ_１８＝Ｓ又はＡ；Ｘ_１９＝Ｓ、Ｔ又はＮ；Ｘ_２０＝Ａ又はＳ；Ｘ_２１＝Ｖ又はＬ)、ＨＶＲ-Ｌ２はアミノ酸配列Ｘ_６２ＡＳＸ_６３Ｘ_６４ＹＸ_６５(配列番号：１１８)を含み(上式中、Ｘ_６２＝Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｆ又はＬ；Ｘ_６３＝Ｆ、Ｓ、Ｙ又はＷ；Ｘ_６４＝Ｌ又はＲ；Ｘ_６５＝Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ又はＷ)、そしてＨＶＲ-Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＸ_６６Ｘ_６７Ｘ_６８Ｘ_６９Ｘ_７０Ｘ_７１Ｔ(配列番号：１１９)を含む(上式中、Ｘ_６６＝Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｄ又はＹ；Ｘ_６７＝Ｙ、Ｐ、Ｓ又はＡ；Ｘ_６８＝Ｙ、Ｔ又はＮ；Ｘ_６９＝Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＳ；Ｘ_７０＝Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｋ又はＬ；及びＸ_７１＝Ｆ、Ｐ又はＴ)。

【0109】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１はアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１ＶＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ａ(配列番号：１７)を含み(上式中、Ｘ_１＝Ｄ又はＶ；Ｘ_２＝Ｓ又はＡ；Ｘ_３＝Ｔ又はＮ；Ｘ_４＝Ｓ又はＡ；Ｘ_５＝Ｖ又はＬ)、ＨＶＲ-Ｌ２はアミノ酸配列Ｘ_６ＡＳＦＬＹＳ(配列番号：１８)を含み(上式中、Ｘ_６＝Ｓ又はＬ)、そしてＨＶＲ-Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＸ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｔ(配列番号：１９)を含む(上式中、Ｘ_７＝Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｄ又はＹ；Ｘ_８＝Ｙ、Ｐ、Ｓ，又はＡ；Ｘ_９＝Ｔ又はＮ；Ｘ_１０＝Ｔ、Ｙ、Ｄ又はＳ；Ｘ_１１＝Ｐ又はＬ；Ｘ_１２＝Ｐ又はＴ)。

【0110】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１はアミノ酸配列ＲＡＳＱＸ_１ＶＸ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ａ(配列番号：１７)を含み(上式中、Ｘ_１＝Ｄ又はＶ；Ｘ_２＝Ｓ又はＡ；Ｘ_３＝Ｔ又はＮ；Ｘ_４＝Ｓ又はＡ；Ｘ_５＝Ｖ又はＬ)、ＨＶＲ-Ｌ２はアミノ酸配列Ｘ_４８ＡＳＸ_４９Ｘ_５０ＹＸ_５１(配列番号：５６)を含み(上式中、Ｘ_４８＝Ｓ又はＦ；Ｘ_４９＝Ｆ又はＹ；Ｘ_５０＝Ｌ又はＲ；Ｘ_５１＝Ｓ、Ｐ、Ｒ、Ｋ又はＷ)、ＨＶＲ-Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＦＰＴＹＸ_５２ＰＴ(配列番号：５７)を含む(上式中、Ｘ_５２＝Ｌ、Ｑ、Ｓ又はＫ)。

【0111】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１はアミノ酸配列ＧＦＴＦＸ_１３ＧＹＸ_１４ＩＨ(配列番号：２６)を含み(上式中、Ｘ_１３＝Ｓ又はＬ及びＸ_１４＝Ａ又はＧ)、ＨＶＲ-Ｈ２はアミノ酸配列ＧＷＩＳＰＡＧＧＳＴＤＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：２４)を含み、そしてＨＶＲ-Ｈ３はアミノ酸配列ＧＰＦＳＰＷＶＭＤＹ(配列番号：２５)を含む。

【0112】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２、ＨＶＲ-Ｈ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１はアミノ酸配列ＧＸ_５３Ｘ_５４Ｘ_５５Ｘ_５６ＧＹＧＩＨ(配列番号：６８)を含み(上式中、Ｘ_５３＝Ｆ又はＹ；Ｘ_５４＝Ｔ又はＦ；Ｘ_５５＝Ｆ又はＹ；Ｘ_５６＝Ｌ、Ｑ又はＩ)、ＨＶＲ-Ｈ２はアミノ酸配列ＧＷＩＳＰＸ_５７Ｘ_５８ＧＸ_５９Ｘ_６０ＤＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：６９)を含み(上式中、Ｘ_５７＝Ａ、Ｓ又はＱ；Ｘ_５８＝Ｇ又はＳ；Ｘ_５９＝Ｓ、Ｋ又はＬ；Ｘ_６０＝Ｔ又はＹ)、そしてＨＶＲ-Ｈ３配列はアミノ酸配列ＧＰＦＸ_６１ＰＷＶＭＤＹ(配列番号：７０)を含む(上式中、Ｘ_６１＝Ｓ又はＹ)。

【0113】

ある実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも一つの配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１はアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＡＶＡ(配列番号：３５)を含み、ＨＶＲ-Ｌ２はアミノ酸配列Ｘ_１５ＡＳＸ_１６ＬＹＳ(配列番号：４１)を含み(上式中、Ｘ_１５＝Ｓ、Ｗ又はＹ及びＸ_１６＝Ｓ又はＷ)、そしてＨＶＲ-Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＹＳＹＳＰＦＴ(配列番号：４０)を含む。

【0114】

ある実施態様では、上記の抗ＢＡＣＥ１抗体の何れか一又は複数のアミノ酸は、次のＨＶＲ位置で置換される：
ＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：２６)：位置５及び８；
ＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１７)：位置５、７、８、９及び１０；
ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：１８)：位置１又はＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：４１)位置１及び４；及び
ＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１９)：位置３、４、５、６、７及び８。

【0115】

ある実施態様では、ここに提供されるように置換は保存的置換である。ある実施態様では、何れか一又は複数の次の置換が任意の組合せにおいてなされうる：
ＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：２６)：位置５にセリン又はロイシン及び位置８にアラニン又はグリシン；
ＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１７)：位置５にアスパラギン酸又はバリン；位置７にセリン又はアラニン；位置８にスレオニン又はアスパラギン；位置９にセリン又はアラニン及び位置１０にバリン又はロイシン；
ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：１８)：位置１にセリン又はロイシン又はＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：４１)位置１にセリン、チロシン又はトリプトファン又は位置４にチロシン、セリン又はトリプトファン；及び
ＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１９)：位置３にセリン、フェニルアラニン、グリシン、アスパラギン酸又はチロシン；位置４にチロシン又はプロリン、位置５にセリン、アラニン、スレオニン又はアスパラギン；位置６にチロシン、スレオニン、アスパラギン酸又はセリン、位置７にアスパラギン酸、セリン、プロリン又はロイシン及び位置８にプロリン又はスレオニン。

【0116】

ある実施態様では、ここに提供されるように置換は保存的置換である。ある実施態様では、何れか一又は複数の次の置換が任意の組合せにおいてなされうる：
ＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：２６)：Ｓ５Ｌ及びＡ８Ｇ；
ＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１７)：Ｄ５Ｖ；Ｓ７Ａ；Ｔ８Ｎ；Ｓ９Ａ及びＶ１０Ｌ；
ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：１８)：Ｓ１Ｌ又はＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：４１)位置Ｓ１Ｗ又はＹ及びＳ４Ｗ；及び
ＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１９)：位置Ｓ３Ｆ、Ｇ、Ｄ又はＹｌ；Ｙ４Ｐ、Ｓ又はＡ；Ｔ５Ｎ；Ｔ６Ｙ、Ｄ又はＳ；Ｐ７Ｌ及びＰ８Ｔ。

【0117】

ある実施態様では、上記の抗ＢＡＣＥ１抗体の何れか一又は複数のアミノ酸は、次のＨＶＲ位置で置換される：
ＨＶＲ-Ｈ１(配列番号：１２０)：位置２、３、５、６、７及び８；
ＨＶＲ-Ｈ２(配列番号：１２１)：位置１、２、６、７、９、１０、及び１１；
ＨＶＲ-Ｈ３(配列番号：１２２)位置１、３、４、５、６、７、及び８
ＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：４２)：位置５、７、８、９及び１０；
ＨＶＲ-Ｌ２(配列番号：１１８)：位置１、４、５及び７；及び
ＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１１９)：位置３、４、５、６、７及び８。
ある実施態様では、ここに提供されるように置換は保存的置換である。

【0118】

上記置換のありうる組合せは、上記の配列番号：４２−４７及び１１８−１２２のコンセンサス配列に包含される。

【0119】

上記実施態様の何れかでは、抗ＢＡＣＥ１抗体はヒト化である。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更にアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。別の実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、配列番号：１−６、２０、２１、２７、３１−３４、８０−９８及び９９−１１７のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４配列を含んでなるＶＨ又はＶＬを更に含む。

【0120】

別の態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は、配列番号：２０、２１、２７及び８０−９８から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ＢＡＣＥ１抗体はＢＡＣＥ１に結合する及び／又はＢＡＣＥ１活性を阻害又は低減する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：２０、２１、２７及び８０−９８において合計で１〜１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲ外の領域(すなわち、ＦＲ)において生じる。場合によっては、抗ＢＡＣＥ１抗体は配列番号：２０、２１、２７又は８０−９８においてＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＨは(ａ)配列番号：２２、２３、２６、２８、４５、６８、７１、７２、７３又は１２０のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１、(ｂ)配列番号：２４、２９、４６、６９、７４、７５、７６、７７、７８又は１２１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：２５、３０、４７、７０、７９又は１２２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。

【0121】

一態様では、発明は、(ａ)図１(Ｂ)、２(Ｂ)及び２４(Ａ)におけるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ１；(ｂ)図１(Ｂ)、２(Ｂ)及び２４(Ｂ)におけるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ２；(ｃ)図１(Ｂ)、２(Ｂ)及び２４(Ｃ)におけるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｈ３；(ｄ)図１(Ａ)、２(Ａ)及び２３(Ａ)におけるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｅ)図１(Ａ)、２(Ａ)及び２３(Ｂ)におけるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｆ)図１(Ａ)及び２(Ａ)及び２３(Ｃ)におけるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６のＨＶＲを含んでなる抗ＢＡＣＥ１抗体を提供する。

【0122】

別の態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体であって、配列番号：１−６、３１−３４及び９９−１１７から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％，又は１００％配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む抗体が提供される。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は参照配列に対して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ＢＡＣＥ１抗体はＢＡＣＥ１に結合する及び／又はＢＡＣＥ１活性を阻害又は低減する能力を保持する。ある実施態様では、配列番号：１−６、３１−３４及び９９−１１７において合計で１〜１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失はＨＶＲ外の領域(すなわち、ＦＲ)において生じる。場合によっては、抗ＢＡＣＥ１抗体は配列番号：１−６、３１−３４又は９９−１１７においてＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは(ａ)配列番号：７、８、１７、３５又は４２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ１；(ｂ)配列番号：９、１０、１８、３６−３９、４１、４３及び５６、５８−６４又は１１８のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：１１−１６、１９、４０、４４、５７、６５、６６、６７又は１１９のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ-Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。

【0123】

別の態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体であって、上記の実施態様の何れかにおけるＶＨ、及び上記の実施態様の何れかにおけるＶＬを含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体は配列番号：２１及び配列番号：２においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾を含む。

【0124】

更なる態様では、発明はここに提供される抗ＢＡＣＥ１抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ある実施態様では、配列番号：２０、２１、２７及び８０−９８から選択されるＶＨ配列及び配列番号：１−６、３１−３４及び９９−１１７から選択されるＶＬ配列を含んでなる抗ＢＡＣＥ１抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様では、配列番号：２１及び配列番号：２においてそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を含んでなる抗ＢＡＣＥ１抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。

【0125】

ある実施態様では、配列番号：４９のアミノ酸３１４ＳＥＲ、３１６ＧＬＵ、３１７ＬＹＳ、３１８ＰＨＥ、３１９ＰＲＯ、３２７ＧＬＮ、３２８ＬＥＵ、３２９ＶＡＬ、３３０ＣＹＳ、３３１ＴＲＰ、３３２ＧＬＮ、３３３ＡＬＡ、３３５ＴＨＲ、３３７ＰＲＯ、３４０ＩＬＥ、３７５ＴＨＲ、３７８ＡＳＰ、３８０ＣＹＳ、４２６ＰＨＥに対応する少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９のアミノ酸を含んでなるＢＡＣＥ１内のエピトープに結合する抗体が提供される。

【0126】

ある実施態様では、配列番号：４９のアミノ酸３１４ＳＥＲ；３１６ＧＬＵ；３１７ＬＹＳ；３２７ＧＬＮ；３３０ＣＹＳ；３３１ＴＲＰ；３３２ＧＬＮ；３３５ＴＨＲ；及び３７８ＡＳＰに対応する少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９のアミノ酸を含んでなるＢＡＣＥ１内のエピトープに結合する抗体が提供される。他の実施態様では、コンホメーションエピトープは、配列番号：４９の３１４ＳＥＲ；３１６ＧＬＵ；３１７ＬＹＳ；３２７ＧＬＮ；３３０ＣＹＳ；３３１ＴＲＰ；３３２ＧＬＮ；３３５ＴＨＲ；及び３７８ＡＳＰに対応するアミノ酸を含む。ＢＡＣＥ１エピトープにおいて同定されるアミノ酸はヒトＢＡＣＥ１アイソフォームＡに対応することが理解されるだろう。しかしながら、記載したＢＡＣＥ１コンホメーションエピトープはまた、ＢＡＣＥ１の他の変異体及びアイソフォームにおける対応するアミノ酸を包含し、エピトープは記載した残基以外のアミノ酸を含みうる。

【0127】

ある実施態様では、配列番号：４９のアミノ酸３１５−３１８；配列番号：４９のアミノ酸３３１−３３５；配列番号：４９のアミノ酸３７０−３８１；又はその何れかの組合せに対応するＢＡＣＥ１の少なくとも１、少なくとも２又は少なくとも３のアミノ酸領域を含んでなるＢＡＣＥ１内のエピトープに結合する抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号：４９のアミノ酸３１５−３１８、３３１−３３５及び３７０−３８１を含んでなるＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。

【0128】

別の実施態様では、抗体結合がないＢＡＣＥ１と比較して、結合によりＢＡＣＥ１のＰ６及び／又はＰ７部位(Turner等, Biochemistry 44:105-112 (2005))におけるコンホメーション変化をもたらすＢＡＣＥ１内のエピトープに結合する抗体が提供される。更なる実施態様では、ＢＡＣＥ１のエピトープに結合し、ＢＡＣＥ１の配列番号：４９のアミノ酸２１８−２３１にランダムなループ構造を引き起こす抗体が提供される。ＢＡＣＥ１の配列番号：４９のアミノ酸２１８−２３１は、基質結合複合体ではα-ヘリックス構造において存在する。

【0129】

別の実施態様では、図１４及び１５に示され、ＢＡＣＥ１及び抗ＢＡＣＥ１抗体、ＹＷ４１２．８．３１の結晶構造に記載されるＢＡＣＥ１内の部位に結合する抗体が提供される(実施例３(Ｂ))。

【0130】

他の実施態様では、ＢＡＣＥ１内のエキソサイトに結合する抗体が提供される。一実施態様では、BACE1内のエキソサイトはKornacker等, Biochem. 44:11567-11573 (2005)によって同定されているのと同じエキソサイトである。一実施態様では、ＢＡＣＥ１への結合についてKornacker等, Biochem.44:11567-11573 (2005)(出典明記によってその全体をここに援用する)に記載のペプチド(すなわち、ペプチド１、２、３、１−１１、１−１０、１−９、１−８、１−７、１−６、２−１２、３−１２、４−１２、５−１２、６−１２、７−１２、８−１２、９−１２、１０−１２、４、５、６、５−１０、５−９、Ｙ５Ａ、Ｐ６Ａ、Ｙ７Ａ、Ｆ８Ａ、Ｉ９Ａ、Ｐ１０Ａ及びＬ１１Ａ)と競合する抗体が提供される。

【0131】

別の実施態様では、ここに記載の何れかの抗ＢＡＣＥ１抗体と結合について競合する(例えば、同じエピトープに結合する)抗体が提供される。

【0132】

発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗ＢＡＣＥ１抗体はキメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ(ａｂ’)_２断片である。別の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又はここに定義されるほかの抗体クラス又はアイソタイプである。

【0133】

更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗BACE1抗体は、下のセクション１−７に記載されるような何れかの特徴を単独又は組合せにおいて組み入れうる。

【0134】

１．抗体親和性
ある実施態様では、ここに提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有する。

【0135】

一実施態様では、Ｋｄは、次のアッセイによって記載されるように、対象の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(^１２５Ｉ)標識抗原でＦａｂを均衡にし、ついで抗Ｆａｂ抗体被覆プレートで結合抗原を捕獲することによって測定する(例えばChen等, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイ条件を確率するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)中の捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)で一晩被覆し、その後ＰＢＳ中の２％(ｗ／ｖ)のウシ血清アルブミンで室温(およそ２３℃)で２から５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［^１２５Ｉ］抗原を段階希釈した対象のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, Cancer Res. 57: 4593-4599(1997)における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでより長い時間(例えば約６５時間)継続する場合がある。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。ついで、溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０(登録商標))で８回洗浄した。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20^ＴＭ；Packard)を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭγカウンター(Packard)で１０分間計数する。最大結合の２０％か又はそれ以下を与える各Ｆａｂの濃度を選択して競合結合測定に用いる。

【0136】

他の実施態様によれば、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップで２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈した後、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定では、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０^ＴＭ)界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen等, J. Mol Biol 293:865-881(1999)を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイにより結合速度が１０^６Ｍ^−１Ｓ^−１を上回る場合、分光計、例えば、ストップフロー具備分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、バンドパス＝１６ｎｍ)の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。

【0137】

２．抗体断片
ある実施態様では、ここに提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載の他の断片を含む。所定の抗体断片の概説については、Hudson等 Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えばPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号を参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含みインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')_２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

【0138】

ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまたHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。

【0139】

単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。

【0140】

抗体断片は、限定しないが、ここに記載されるようにインタクトな抗体のタンパク質消化並びに組換え宿主細胞(例えば大腸菌又はファージ)による生産を含む様々な技術によって作製されうる。

【0141】

３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はキメラ抗体である。あるキメラ抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, PNAS USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。一例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサル由来の可変領域)とヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体はクラス又はサブクラスが親抗体のものとは変化せられた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体はその抗原結合断片を含む。

【0142】

ある種の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ(又はその一部)が非ヒト抗体由来であり、ＦＲ(又はその一部)がヒト抗体配列由来である一又は複数の可変ドメインを含む。場合によっては、ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、非ヒト抗体(例えば、ＨＶＲ残基が誘導される抗体)からの対応する残基で置換され、例えば抗体特異性又は親和性が回復又は改善される。

【0143】

ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えばAlmagro 及び Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に概説されており、更に例えば、Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；Queen等, PNAS USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同７５２７７９１号、同６９８２３２１号、及び同７０８７４０９号；Kashmiri等, Methods 36:25-34 (2005)(ＳＤＲ(ａ-ＣＤＲ)グラフトを記載)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(「リサーフェシング(resurfacing)」を記載)；Dall'Acqua等, Methods 36:43-60 (2005) (「ＦＲシャッフリング」を記載)；及びOsbourn等, Methods 36:61-68 (2005) 及び Klimka等, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(ＦＲシャッフリングに対する「案内選別(guided selection)」アプローチ法を記載)に記載されている。

【0144】

ヒト化に使用されうるヒトフレームワーク領域には、限定されるものではないが、「ベストフィット法」を使用して選択されるフレームワーク領域(例えば、Sims等 J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照)；軽鎖又は重鎖可変ドメインの特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域(例えば、Carter等 PNAS USA, 89:4285 (1992)；及び Presta等 J. Immunol., 151:2623 (1993))；ヒト成熟(体細胞的に変異された)フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照)；及びＦＲライブラリーのスクリーニング由来のフレームワーク領域(例えば、Baca等, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 及び Rosok等, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)が含まれる。

【0145】

４．ヒト抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して産生せしめることができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk及びvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。

【0146】

ヒト抗体は、抗原投与に反応してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫源を投与することによって調製することができる。このような動物は、ヒト免疫グロブリン座位の全て又は一部を典型的には含み、内在性免疫グロブリン座位を置き換えるか、又は染色体外、又は動物の染色体内にランダムに組み込まれて存在する。このようなトランスジェニックマウスにおいて、内在性免疫グロブリン座位は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説は、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照のこと。また、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載する米国特許第６０７５１８１号及び同６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ(登録商標)技術を記載した米国特許第５７７０４２９号；Ｋ-Ｍ ＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許第７０４１８７０号；ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号を参照。このような動物により産生されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組合せることにより、更に修飾することができる。

【0147】

また、ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner等, J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体は、Li等, PNAS. USA, 103:3557-3562 (2006)にまた記載されている。付加的な方法には、例えば米国特許第７１８９８２６号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を記載)、及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマを記載)に記載されている。また、ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers 及びBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及び Vollmers及びBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)にも記載されている。

【0148】

ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより産生せしめることもできる。ついで、このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組合せられうる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。

【0149】

５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体について、そのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。このような方法は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)において概説され、更に例えばMcCafferty等, Nature 348:552-554；Clackson等, Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及びBradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。

【0150】

ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組換えられ、これがついで、Winter等, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているように、抗原-結合ファージについてスクリーニングされうる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片又はＦａｂ断片として、抗体断片をディスプレイする。免疫化されたソースからのライブラリーにより、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高親和性の抗体が提供される。あるいは、天然レパートリーを、Griffiths等, EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されているように、免疫化をすることなく、広範囲の非自己、更には自己抗原に対するヒト抗体の単一供給源を提供するために(例えばヒトから)クローニングすることができる。最後に、ナイーブライブラリーは、幹細胞から再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することで合成的に作製することができ、高頻度可変ＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom 及び Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)により記載されているような、再配置をインビトロで達成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許文献には、例えば米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願第２００５／００７９５７４号、同２００５／０１１９４５５号、同２００５／０２６６０００号、同２００７／０１１７１２６号、同２００７／０１６０５９８号、同２００７／０２３７７６４号、同２００７／０２９２９３６号、及び同２００９／０００２３６０号が含まれる。

【0151】

ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体又は抗体断片は、ここでのヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。

【0152】

６．多重特異性抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施態様では、結合特異性の一つはＢＡＣＥ１に対してであり、他方は任意の他の抗原に対してである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ＢＡＣＥ１の二つの異なるエピトープに結合しうる。また二重特異性抗体はＢＡＣＥ１を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

【0153】

多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されるものではないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え同時発現(Milstein及びCuello, Nature 305: 537 (1983)を参照)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J. 10: 3655 (1991))、及び「ノブ-イン-ホール」技術(例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照)が含まれる。また、多重特異性抗体は、抗体ヘテロ二量体分子を作製するための静電気操縦効果の設計(国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号)；２又はそれ以上の抗体又は断片の架橋(例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan等, Science, 229: 81 (1985)を参照)；二重特性抗体の産生のためのロイシンジッパーの使用(例えば、Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用(例えば、Hollinger等, PNAS USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；及び単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用(例えば、Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)；及びTutt等 J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているような三重特異性抗体の調製により、作製することができる。

【0154】

「オクトパス抗体」を含む３又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もここに含まれる(例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照)。

【0155】

また、ここでの抗体又は断片は、ＢＡＣＥ１並びに他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む(例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照)。

【0156】

７．抗体変異体
ある実施態様では、ここに提供される抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合性を有している限り、欠失、挿入、及び置換をどのように組合せて、最終コンストラクトに到達してもよい。

【0157】

ａ)置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のために関心ある部位はＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、「保存的置換」と題して表１に示す。より実質的な変化は「例示的置換」との項目で表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを基準にして以下に更に記載される。アミノ酸置換は関心ある抗体に導入され得、生成物が所望の活性、例えば保持された／改善された抗原結合性、低減した免疫原性、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣについて、スクリーニングされる。

【0158】

アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
(２)中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(３)酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
(４)塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
(６)芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0159】

非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。

【0160】

一タイプの置換変異体は、親抗体(例えばヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般的に、更なる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体に対して所定の生物学的性質(例えば親和性の増加、免疫原性の減少)に修飾(例えば改善)を有するか、及び／又は親抗体の実質的に保持された所定の生物学的性質を有しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えばここに記載されたもののようなファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便に産生せしめることができる。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージにディスプレイさせ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。

【0161】

改変(例えば置換)は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいてなされうる。このような改変はＨＶＲ「ホットスポット」、つまり体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び／又はＳＤＲｓ(ａ-ＣＤＲｓ)においてなされる場合があり、得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそれから再選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、様々な方法(例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発)の何れかによって成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。ついで、二次抗体が作製される。ついで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異体が同定される。多様性を導入する他の方法は、幾つかのＨＶＲ残基(例えば一度に４−６残基)が無作為化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基が、例えばアラニンスキャン突然変異誘発又はモデリングを使用して、特に同定されうる。特にＣＤＲ-Ｈ３及びＣＤＲ-Ｌ３がしばしば標的とされる。

【0162】

ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的改変(例えばここで提供される保存的置換)をＨＶＲにおいてなすことができる。そのような改変はＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側でありうる。上に提供された変異ＶＨ及びＶＬ配列の所定の実施態様では、何れかの各ＨＶＲが改変されず、又は一、二又は三のアミノ酸置換を含む。

【0163】

突然変異誘発の標的とされうる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science 244:1081-1085 (1989)によって記載されている「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」と呼ばれる。この方法において、残基又は標的残基の群(例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基)が同定され、中性の又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、抗体の抗原との相互作用に影響があるかどうかが決定される。最初の置換に対して機能的感受性を示しているアミノ酸位置に更なる置換を導入することができる。あるいは、又は付加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造が抗体と抗原間の接触点を同定する。そのような接触残基及び近傍の残基は置換のための候補として標的にされるか又は削除されうる。変異体は、それらが所望の性質を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。

【0164】

アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から百以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合体、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの抗体のＮ又はＣ末端の融合を含む。

【0165】

ｂ)グリコシル化変異体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、一又は複数のグリコシル化部位が作られ又は除去されるように改変させることによって、簡便に達成されうる。

【0166】

抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合される炭水化物が改変されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対してＮ結合により一般的に結合する分枝状で二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright等 TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、ガラクトース、及びシアル酸を含み得、並びにフコースが二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合される。幾つかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が、ある改善された特性を有する抗体変異体を生じせしめるために、なされうる。

【0167】

一実施態様では、Ｆｃ領域に(直接又は間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％でありうる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法によって測定して、Ａｓｎ２９７(例えば複合のハイブリッド及び高マンノース構造)に結合した全ての糖構造の合計に対してＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７はＦｃ領域内の約２９７位(Ｆｃ領域のＥｕ番号付け)に位置したアスパラギン残基を意味する；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体中のマイナーな配列変異のために、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流に、つまり２９４位と３００位の間に位置している場合がありうる。そのようなフコシル化変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)を参照。「脱フコシル化された」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を生産可能な細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠けているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞(Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号, Adams等，特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(例えば、Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)が含まれる。

【0168】

例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。そのような抗体変異体は、フコシル化が低減され、及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている場合がある。そのような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号(Jean-Mairet等)；米国特許第６６０２６８４号(Umana等)；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umana等)に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有している場合がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号(Patel等)；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju, S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。

【0169】

ｃ)Ｆｃ領域変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾が、ここに提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体を産生せしめてもよい。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含んでなるヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域)を含みうる。

【0170】

ある実施態様では、本発明は、幾つかであるが全てではないエフェクター機能を持つ抗体変異体を考察し、これは、抗体を、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、あるエフェクター機能(例えば、補体及びＡＤＣＣ)は不要か又は有害である用途のために望ましい候補とする。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／喪失を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイが実施されうる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く(よってＡＤＣＣ活性を欠くと思われる)が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確かめるために実施されうる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ及びＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するための非限定的なインビトロアッセイが米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) and Hellstrom, I等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (see Bruggemann, M.等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。別法では、非放射性アッセイ法が用いられ得る(例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏ Ｔｏｘ９６(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照)。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に記載されているような動物モデルにおいてインビボで評価されうる。Ｃｌｑ結合アッセイが、抗体がＣｌｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するためにまた実施されうる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる(例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期定量も当該技術分野で知られている方法を使用して実施することがまたできる(例えば、Petkova, S.B.等, Intl. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。

【0171】

減少したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものを含む(米国特許第６７３７０５６号)。このようなＦｃ変異体は、二又はそれ以上のアミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７に置換を有するＦｃ変異体を含み、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む(米国特許第７３３２５８１号)。

【0172】

ＦｃＲへの改良又は減少された結合を有するある種の抗体変異体が記載されている(例えば米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照)。

【0173】

ある実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換(残基のＥＵ番号付け)を有するＦｃ領域を含む。

【0174】

幾つかの実施態様では、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載されているように、改変された(つまり、改善され又は減少した)Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を生じる改変がＦｃ領域に改変がなされる。

【0175】

増加した半減期及び胎児への母性ＩｇＧｓの移動に関与する新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))への改善された結合性を有する抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１(Hinton等)に記載されている。その抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換をそこに有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数での置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む(米国特許第７３７１８２６号)。

【0176】

Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Duncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0177】

ｄ)システイン操作抗体変異体
ある実施態様では、システイン操作抗体、例えば抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換される「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作ることが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基が抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に位置させられ、抗体を他の部分、例えば薬剤部分又はリンカー薬剤部分に結合させ、ここで更に記載されるように免疫コンジュゲートを作るために使用されうる。ある実施態様では、以下の残基の任意の一又は複数がシステインと置換されうる：軽鎖のＶ２０５(カバット番号付け)；重鎖のＡ１１８(ＥＵ番号付け)；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００(ＥＵ番号付け)。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるようにして、産生されうる。

【0178】

ｅ)抗体誘導体
ある実施態様では、ここに提供される抗体は、当該技術分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか等を含む、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。

【0179】

他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。

【0180】

Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え法及び構成物を使用して製造することができる。一実施態様では、ここに記載の抗ＢＡＣＥ１抗体をコードする単離核酸が提供される。このような核酸は、ＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列(例えば、抗体の軽及び／重鎖)をコードしてもよい。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(１)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクター、又は(２)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第一ベクター、及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第２ベクターを含む(例えば、これらによって形質転換される)。一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はリンパ球系細胞(例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞)である。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体の作製方法が提供され、該方法は、上に提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で、培養し、場合によっては宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。

【0181】

抗ＢＡＣＥ１抗体の組換え生産では、例えば上述のような抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、直ちに単離され、一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定されうる。

【0182】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のために適した宿主細胞は、ここに記載される原核細胞又は真核細胞である。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌で生産されうる。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号、及び米国特許第５８４０５２３号を参照のこと。(また大腸菌中での抗体断片の発現を記述しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254を参照)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製されうる。

【0183】

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」された菌及び酵母株を含み、部分的に又は完全にヒト化したグリコシル化パターンを持つ抗体の生産を生じる。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004),及びLi等, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。

【0184】

グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からもまた誘導される。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫の細胞を含む。特にヨウトガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用されうる多くのバキュロウィルス株が同定されている。

【0185】

植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号(遺伝子導入植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記述)を参照。

【0186】

脊椎動物細胞をまた宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態で増殖するよう適合化された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物細胞株の他の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７)によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株(Graham等, J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３細胞)；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ)；マウスセルトリ細胞(例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞)；サル腎細胞(ＣＶ１)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６)；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ３Ａ)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８)；ヒト肝細胞(ＨｅｐＧ２)；マウス乳腺腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２)；Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等のミエローマ細胞株である。抗体生産のために適した哺乳類動物宿主細胞株の概説として、例えばYazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp255-268 (2003)を参照のこと。

【0187】

Ｃ．アッセイ
ここに提供される抗ＢＡＣＥ１抗体は、当分野で知られている様々なアッセイによってそれらの物理的／化学的特性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。

【0188】

１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、発明の抗体は、知られている方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等によってその抗原結合活性について試験される。

【0189】

他の態様では、競合アッセイはＢＡＣＥ１に対する結合について、ここに記載の抗体又はＦａｂの何れか、例えばＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９、ＹＷ４１２．８．５１、Ｆａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９、ＬＣ１０と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合抗体は、ここに記載の抗体又はＦａｂの何れか、例えばＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９、ＹＷ４１２．８．５１、Ｆａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９、ＬＣ１０によって結合される同じエピトープ(例えば線状又はコンホメーションエピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。

【0190】

例示的な競合アッセイでは、固定されたＢＡＣＥ１が、ＢＡＣＥ１(例えば、ＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９、ＹＷ４１２．８．５１、Ｆａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９、ＬＣ１０)に結合する第一標識抗体、及びＢＡＣＥ１への結合について第一抗体と競合するその能力について試験されている第二非標識抗体を含んでなる溶液中においてインキュベートされる。第二抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在しうる。コントロールとして、固定されたＢＡＣＥ１が、第一標識抗体を含むが第二非標識抗体を含まない溶液中においてインキュベートされる。ＢＡＣＥ１への第一抗体の結合が可能な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体が除去され、固定されたＢＡＣＥ１に付随するラベルの量が測定される。固定されたＢＡＣＥ１に付随するラベルの量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプルにおいて有意に低減された場合、これは、ＢＡＣＥ１への結合について第二抗体が第一抗体と競合していることを意味する。Harlow and Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。

【0191】

２．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するその抗ＢＡＣＥ１抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えばＢＡＣＥ１アスパルチルプロテアーゼ活性の阻害又は低減；又はＢＡＣＥ１によるＡＰＰ切断の阻害又は低減；又はＡβ生産の阻害又は低減を含む。インビボ及び／又はインビトロにおいてこのような生物学的活性を有する抗体も提供される。

【0192】

ある実施態様では、発明の抗体は、このような生物学的活性について試験される。例えば、ＢＡＣＥ１プロテアーゼ活性は、合成基質ペプチドを使用して、実施例１及び２(Ｂ)に詳細に記載するようにホモジニアス時間分解蛍光ＨＴＲＦアッセイ又はマイクロ流体キャピラリー電気泳動(ＭＣＥ)アッセイにおいて試験できる。

【0193】

簡潔には、ホモジニアス時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)アッセイは、アミロイド前駆タンパク質ＢＡＣＥ１切断部位ペプチドの使用によりＢＡＣＥ１アスパルチルプロテアーゼ活性を測定するために使用できる。例えば、Ｂｉ２７ペプチド(ビオチン−ＫＴＥＥＩＳＥＶＮＬＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬ(配列番号：５３), American Peptide Company))を、３８４-ウェルプレート(Proxiplate^ＴＭ, Perkin-Elmer)においてＢＡＣＥ反応バッファー(５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．４及び０．１％ＣＨＡＰＳ)中において抗ＢＡＣＥ抗体でプレインキュベートされたＢＡＣＥ１と組み合わせる。タンパク分解性反応混合物を周囲温度で７５分間インキュベートし、検出バッファー(200mM Tris pH 8.0、20mM EDTA, 0.1% BSA、及び0.8M KF)中において、２ｎＭのストレプトアビジン-Ｄ２及び１５０ｎＭのユーロピウムクリプテートで標識された抗アミロイドβ抗体を有する５μＬのＨＴＲＦ検出混合物の添加によってクエンチした。最終反応混合物を周囲温度で６０分間インキュベートし、ＴＲ-ＦＲＥＴシグナルを３２０ｎｍの励起波長及び６１５及び６６５ｎｍの放出波長でEnVision Multilabel Plate Reader^ＴＭ (Perkin-Elmer)を使用して測定する。

【0194】

ＭＣＥアッセイ反応は標準的な酵素反応において実施可能であり、ヒトＢＡＣＥ１(細胞外ドメイン)、アミロイド前駆タンパク質βセクレターゼ活性部位ペプチド(ＦＡＭ-ＫＴＥＥＩＳＥＶＮＬＤＡＥＦＲＷＫＫ-ＣＯＮＨ_２(配列番号：５５))、５０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．４及び０．１％ＣＨＡＰＳを有する、４ｘ化合物及び酵素に基質を添加することによって開始した。周囲温度で６０分間のインキュベーションの後、各反応における産物及び基質をＬＣ３０００(登録商標)(both, Caliper Life Sciences)において分析される12-sipper microfluidic chipを使用して分離した。産物及び基質の分離は、製造者の最適化ソフトウェアを使用して電圧及び圧力を選択することによって最適化される。基質変換はHTS Well Analyzer software (Caliper Life Sciences)を使用して電気泳動図から算出される。

【0195】

更に、ＢＡＣＥ１プロテアーゼ活性は、ＡＰＰ等のＢＡＣＥ１基質を発現する細胞株においてインビボで、又はヒトＡＰＰ等のＢＡＣＥ１基質を発現するトランスジェニックマウスにおいて、実施例２(Ｃ)及び４に記載のように試験できる。

【0196】

更に、ＢＡＣＥ１プロテアーゼ活性は動物モデルにおいて抗ＢＡＣＥ１抗体で検査できる。例えば、様々な神経疾患及び障害の動物モデル、及びこれらのモデルに伴う病理学的過程を検査するための関連技術が当分野において容易に利用可能である。様々な神経障害の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物双方を含む。非組換え動物モデルは、例えば齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、及び腎被膜下移植を使用して同系マウスに細胞を導入することによって生成可能である。インビボモデルは、脳卒中／脳虚血のモデル、神経変性疾患のインビボモデル、例えばパーキンソン病のマウスモデル；アルツハイマー病のマウスモデル；筋萎縮性側索硬化症のマウスモデル；脊髄性筋萎縮症のマウスモデル；局所及び全脳虚血のマウス／ラットモデル、例えば一般的な頸動脈閉塞又は中大脳動脈閉塞モデル；又はエクスビボ全胚培養を含む。一非限定的な例として、アルツハイマー病のための多くの当分野で知られたマウスモデルがある((例えばRakover等, Neurodegener. Dis. (2007); 4(5): 392-402; Mouri等, FASEB J. (2007) Jul;21 (9): 2135-48; Minkeviciene et al ., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2004) Nov; 311 (2) :677-82 and Yuede等, Behav Pharmacol. (2007) Sep; 18 (5-6): 347-63を参照)。様々なアッセイが、知られたインビトロ又はインビボアッセイ形態において実施され得、当分野で知られており、文献に記載されている。様々なこのような動物モデルはまた、Jackson Laboratory等の民間ベンダーから入手から入手可能である。更なる動物モデルアッセイを実施例４及び５に記載する。

【0197】

Ｄ．イムノコンジュゲート
発明はまた、一又は複数の細胞傷害性物質、例えば化学療法物質又は薬物、増殖阻害物質、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的活性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体にコンジュゲートされたここの抗ＢＡＣＥ１抗体を含んでなるイムノコンジュゲートを提供する。

【0198】

一実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定しないが、メイタンシノイド(米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照)；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ(ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ)(米国特許第５６３５４８３号及び同第５７８０５８８号及び同第７４９８２９８号を参照)；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体(米国特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第５７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号、及び同第５８７７２９６号；Hinman等, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode等, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照)；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン(Kratz等, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照)；メトトレキセート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテシン及びＣＣ１０６５を含む一又は複数の薬物に抗体がコンジュゲートされる抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)である。

【0199】

他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、限定しないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされたここに記載された抗体を含む。

【0200】

他の実施態様では、イムノコンジュゲートは放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされるここに記載の抗体を含む。様々な放射性同位元素が放射性コンジュゲートの生産のために利用可能である。例は、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位元素を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)イメージング(磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている)用のスピン標識、例えばまたヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。

【0201】

抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。

【0202】

ここでのイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定するものではないが、(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)安息香酸塩)を含む架橋剤を用いて調製されるコンジュゲートが明示的に考えられる。

【0203】

Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様では、ここに提供される何れかの抗ＢＡＣＥ１抗体は生物学的サンプルにおけるＢＡＣＥ１の存在の検出に有用である。「検出」なる用語は、ここで使用される場合、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様では、生物学的サンプルは細胞又は組織、例えば血清、血漿、唾液、胃液分泌物、粘液、脳脊髄液、リンパ液、神経組織、脳組織、心臓組織又は血管組織を含む。

【0204】

一実施態様では、診断又は検出の方法における使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体が提供される。更なる態様では、生物学的サンプルにおけるＢＡＣＥ１の存在を検出する方法が提供される。ある実施態様では、方法は、生物学的サンプルを、ＢＡＣＥ１への抗ＢＡＣＥ１抗体の結合が可能な条件下でここに記載の抗ＢＡＣＥ１抗体と接触させる工程、及び抗ＢＡＣＥ１抗体及びＢＡＣＥ１間で複合体が形成されているかを検出する抗体を含む。このような方法はインビトロ又はインビボ方法でありうる。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は抗ＢＡＣＥ１抗体での治療に適格な被験体を選択するために使用され、例えばＢＡＣＥ１が患者の選択のためのバイオマーカーである場合などである。

【0205】

発明の抗体を使用して診断されうる例示的な障害は、神経変性疾患、例えば非限定的に、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパチー、(アルツハイマー病、及び核上性麻痺を含むがこれらに限定されない)、プリオン病(ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含むがこれらに限定されない)、脳卒中、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パジェット症候群、外傷性脳損傷、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性疾患(カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮毛症候群、コケイン症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群を含むがこれらに限定されない)、認知症(ピック病、及び脊髄小脳失調症を含むがこれらに限定されない)が含まれる。

【0206】

ある実施態様では、標識抗ＢＡＣＥ１抗体が提供される。標識には、限定するものではないが、直接検出される標識又は分子(例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用によって間接的に検出される酵素ないしはリガンドなどの分子が含まれる。例示的な標識には、限定するものではないが、放射性同位体である^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希有土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環のオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために水素ペルオキシダーゼを用いる酵素とカップリングさせたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離基などが含まれる。

【0207】

Ｆ．薬学的製剤
ここに記載された抗ＢＡＣＥ１抗体の薬学的製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、一又は複数の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol,A.編(1980))と所望の度合いの純度を有する抗体を混合することにより調製される。薬学的に許容される担体は用いられる用量及び濃度でレシピエントに一般に非毒性であり、限定しないが、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体(例えばＺｎ-タンパク質錯体)；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ここでの例示的な薬学的に許容可能な担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(ｓＨＡＳＥＧＰ)、例えばヒト可溶性ＰＨ-２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)のような間質薬剤分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含むある種の例示的ｓＨＡＳＥＧＰｓ及び使用方法は米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは一又は複数のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせられる。

【0208】

例示的な凍結乾燥抗体製剤は米国特許第６２６７９５８号に記載される。水性抗体製剤は米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されたものを含み、後者の製剤はヒスチジン-アセテートバッファーを含む。

【0209】

また、ここでの製剤は治療される特定の適応症に必要な一又は複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含みうる。このような活性成分は意図される目的のために有効である量で組合わせて適切に存在する。

【0210】

活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。

【0211】

徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。

【0212】

インビボ投与に使用される製剤は一般に無菌である。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過により、直ぐに達成されうる。

【0213】

Ｇ．治療方法及び組成物
ここに提供される抗ＢＡＣＥ１抗体の何れかは、治療方法において使用されうる。

【0214】

一態様では、医薬としての使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体が提供される。更なる態様では、神経疾患又は障害の治療における使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体が提供される(例えばＡＤ)。ある実施態様では、治療の方法における使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体が提供される。ある実施態様では、発明は、有効量の抗ＢＡＣＥ１抗体を個体に投与することを含んでなる、神経疾患又は障害を有する個体を治療する方法における使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体を提供する。一このような実施態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの更なる治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、発明は、神経疾患又は障害(例えばＡＤ)の危険があるか又は患っている患者におけるアミロイド斑形成の低減又は阻害における使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体を提供する。ある実施態様では、発明は、有効量の抗ＢＡＣＥ１抗体を個体に投与することを含んでなる、個体におけるＡβ生産の低減又は阻害の方法における使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」とは、好ましくはヒトである。ある態様では、発明の方法における使用のための抗ＢＡＣＥ１抗体は、ＢＡＣＥ１活性を低減又は阻害する。例えば抗ＢＡＣＥ１抗体は、ＡＰＰを切断するＢＡＣＥ１の能力を低減又は阻害する。

【0215】

更なる態様では、発明は、医薬の製造又は調製における抗ＢＡＣＥ１抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は神経疾患又は障害の治療のためである。更なる実施態様では、医薬は、有効量の医薬を神経疾患又は障害を有する個体に投与することを含んでなる、神経疾患又は障害を治療する方法における使用のためである。一このような実施態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、医薬はＢＡＣＥ１活性を阻害するためである。更なる実施態様では、医薬は、Ａβ生産又は斑形成を阻害するために、有効量の医薬を個体に投与することを含んでなる、個体におけるＡβ生産又は斑形成を阻害する方法における使用のためである。上記実施態様の何れかによる「個体」は、ヒトでありうる。

【0216】

更なる態様では、発明はアルツハイマー病を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、有効量の抗ＢＡＣＥ１抗体をＡＤを有する個体に投与することを含む。一このような実施態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの更なる治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」は、ヒトでありうる。

【0217】

更なる態様では、発明は、例えば上記治療方法の何れかにおける使用のための、ここに提供される抗ＢＡＣＥ１抗体の何れかを含んでなる薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、ここに提供される何れかの抗ＢＡＣＥ１抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。他の実施態様では、薬学的製剤は、ここに提供される何れかの抗ＢＡＣＥ１抗体及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。

【0218】

発明の抗体は、治療において単独で、又は他の薬剤との組合せにおいて使用されうる。例えば、発明の抗体は少なくとも一つの更なる治療剤と共投与されうる。

【0219】

上記のこのような併用療法は、組合せ投与(２以上の治療在が同じ又は別の製剤中に含まれる)、及び別々の投与(この場合、発明の抗体の投与は更なる治療剤及び／又はアジュバントの投与より前に、同時に、及び／又は後に行われる)を含包含する。発明の抗体は放射線治療と併用して使用されることもできる。

【0220】

本発明の抗体(及び任意の更なる治療剤)は、非経口、腹腔内、及び鼻腔内、及び局所治療が望まれるならば、病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与されうる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、任意の適切な経路、例えば投与が短期か慢性であるかどうかに部分的に依存して、静脈内又は皮下注射のような注射によるものとできる。限定しないが、単一又は様々な時点にわたる複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投薬スケジュールがここで考えられる。

【0221】

発明のある実施態様は、血液脳関門を通過するための抗体又はその断片を提供する。ある神経変性疾患は、血液脳関門の透過性の増加を伴い、抗体又はその活性断片は容易に脳に導入可能である。血液脳関門がインタクトなままの場合、それを通過して分子を運ぶための幾つかの当分野で知られた方法が存在し、限定するものではないが、物理的方法、脂質ベース法、及び受容体及びチャンネルベース法を含む。

【0222】

血液脳関門を通過して抗体又はその断片を運ぶ物理的方法は、限定するものではないが、血液脳関門全体を回避するか又は血液脳関門に開口を作ることを含む。回避方法は、限定するものではないが、脳への直接注射(例えばPapanastassiou等, Gene Therapy 9: 398-406 (2002)を参照)及び脳における送達装置移植(例えばGill等, Nature Med. 9: 589-595 (2003); and Gliadel Wafers^TM, Guildford Pharmaceuticalを参照)を含む。関門に開口を作る方法は、限定するものではないが、超音波(例えばU.S. Patent Publication No. 2002/0038086号を参照)、浸透圧(例えば、高張性マンニトールの投与(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)))、例えばブラジキニン又は又はpermeabilizer A-7による透過処理(例えば米国特許第５，１１２，５９６号、同第５，２６８，１６４号、同第５，５０６，２０６号、及び同第５，６８６，４１６号を参照)、及び抗体又はその断片をコードする遺伝子を有するベクターによる血液脳関門をまたがるニューロンの遺伝子導入(例えばU.S. Patent Publication No. 2003/0083299を参照)を含む。

【0223】

血液脳関門を通過して抗体又はその断片を運ぶ脂質ベース方法は、限定するものではないが、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体結合断片にカップリングされるリポソームへの抗体又はその断片の封入(例えばU.S. Patent Application Publication No. 20020025313を参照)、及び低密度リポタンパク質粒子(例えばU.S. Patent Application Publication No. 20040204354を参照)又はアポリポタンパク質Ｅ(例えばU.S. Patent Application Publication No. 20040131692を参照)における抗体又はその断片のコーティングを含む。

【0224】

本発明の抗体は、良好な医療実務に合致した形で製剤化され、用量決定され、投与される。この点で考慮される要因には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実務家に既知の他の要因が含まれる。抗体は、必要ではないが、場合によっては、問題の疾患を予防又は治療するために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の要因に依存する。これらは一般にここに記載のものと同じ用量及び投与経路で、あるいはここに記載の用量のおよそ１から９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると判定される任意の用量及び任意の経路で使用される。

【0225】

疾患の防止又は治療について、発明の抗体の適切な投与量は(単独又は一又は複数の他の更なる治療剤との組合せにおいて使用される場合)、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的のために投与されるか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、及び主治医の判断に依存するだろう。抗体は、一度に又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に依存し、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ)の各抗体が、例えば一又は複数の別々の投与又は連続的な注入によって、患者に投与される初回の候補投与量でありうる。一つの典型的な投与量は約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得、上記の要因に依存する。数日又はそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存し、治療は一般的に疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されうる。抗体の一つの例示的投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の投与が患者に投与されうる。このような投与は、間欠的に、例えば毎週又は毎三週に投与されうる(例えば、患者は約２〜約２０、又は例えば約６投与の抗体をうける)。最初の高負荷投与量、次いで一又は複数の低投与量が投与されうる。しかしながら、他の投与レジメンが有用でありうる。この治療の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニタされる。

【0226】

任意の上記製剤又は治療方法は、抗ＢＡＣＥ１抗体の代わりに又は加えて、発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されうることが理解される。

【0227】

Ｈ．製品
当該発明のもう１つの局面において、前記した障害の治療、予防および／または診断で有用な材料を含有する製品が提供される。該製品は、容器および該容器上の、または該容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等を含む。該容器はガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成することができる。該容器は、単独の、または該疾患を治療し、予防し、および／または診断するのに有効なもう１つの組成物と組み合わされた組成物を保有し、および滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、該容器は皮下注射針を刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい)。該組成物中の少なくとも１つの活性な剤は当該発明の抗体である。該ラベルまたは添付文書は、該組成物が選択された疾患を治療するのに用いられることを示す。さらに、該製品は、(ａ)組成物がその中に含有された第一の容器、ここに、該組成物は当該発明の抗体を含み；および(ｂ)組成物がその中に含有された第二の容器、ここに、該組成物はさらなる細胞傷害性またはそうでなければ治療剤を含む、を含むことができる。当該発明のこの実施態様における製品は、さらに、該組成物を用いて、特定の疾患を治療することができることを示す添付文書を含んでもよい。別法として、または加えて、該製品は、さらに、注射用の静菌性水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液のような医薬上許容される緩衝液を含む第二の(または第三の)容器を含んでもよい。それは、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含めた、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。

【0228】

前記した製品のいずれも、抗ＢＡＣＥ１抗体の代わりに、またはそれらに加えて、発明のイミュノコンジュゲートを含んでもよいと理解される。

【0229】

ＩＩＩ．実施例
以下は発明の方法及び組成物の実施例である。上記の一般的な説明のもと、様々な他の実施態様が実施されうることが理解される。

【0230】

実施例１：抗ＢＡＣＥ１抗体の生成及び特徴付け
ＢＡＣＥ１に特異的に結合する抗体を、ヒトＢＡＣＥ１細胞外ドメイン、配列番号：４９のアミノ酸１−４５７に対し２つの異なるタイプのファージディスプレイ抗体ライブラリー(一方は天然多様性(ＶＨ及びＶＨ／ＶＬ)を有するものであり、他方は特定のアミノ酸セット(ＹＳＧＸ)に人工的に制限された特定のＣＤＲ領域に多様性を有するもの)をパニングすることによって生成した。

【0231】

Ａ．抗ＢＡＣＥ-１抗体を同定するための自然多様性ライブラリーソーティング及びスクリーニング
ファージディスプレイされた抗BACE1クローンの選択
ビオチン化ヒトBACE-1(配列番号:49の1-457)をライブラリーソーティングの抗原として使用した。天然多様性ファージライブラリーを、交互ニュートラアビジン/ストレプトアビジンプレートに事前捕獲されたビオチン化ＢＡＣＥ-１に対して４ラウンドソーティングした。ソーティングの第一ラウンドでは、NUNC 96ウェル Maxisorpイムノプレートをまず10μg/mLニュートラアビジン(Fisher Scientific, #21125)でコートし、ファージブロッキングバッファーPBST(リン酸緩衝食塩水(PBS)及び1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.05%(v/v)Tween 20)で一晩ブロッキングした。最初に、10μg/mLビオチン化BACE-1をイムノプレート上に30分間捕獲した。交代ファージライブラリーVH (see e.g., Lee等, J. Immunol. Meth. 284:119-132 (2004))及びVH/VL (see Liang等, J. Mol. Biol. 366: 815-829 (2007))を、ファージブロッキングバッファーPBSTで事前にブロッキングし、その後プレートに加え、室温で一晩インキュベートした。プレートをPBT(0.05% Tween 20のPBS)で次の日10x洗浄し、結合ファージを1mLの50mM HCl及び500mMのNaClで30分間溶出し、600μLの1M Tris塩基(pH 8.0)で中和した。回収したファージを大腸菌XL-1 Blue細胞において増幅させた。その後の選択ラウンド中、増殖したファージライブラリーをまずPBST/BSA中において50μlのDynabeads(登録商標) MyOne^ＴＭ ストレプトアビジン T1 (Invitrogen, # 65601)でプレ吸収し、室温で30分間インキュベートした。ニュートラアビジンに結合したファージ粒子を、Dynabeads(登録商標)の除去によりファージストックから取り除いた。次いで非結合ファージをストレプトアビジンプレート上にディスプレイされたBACE-1抗原に加え、インキュベーション時間を2-3時間に低減した。プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に増加させた。

【0232】

５ラウンドのパニング後、有意な濃縮が観察された。９６クローンをＶＨ及びＶＨ／ＶＬライブラリーソーティングからとり、それらがヒトＢＡＣＥ-１に特異的に結合するか決定した。ユニーク配列クローンを同定するために、これらのクローンの可変領域をＰＣＲ配列決定した。バックグラウンドの少なくとも５ｘ超でヒトＢＡＣＥ-１に結合する４２のユニークファージ抗体を選択し、インビトロ細胞アッセイにおける評価のために完全長ＩｇＧに再編成した。

【0233】

個々のクローンのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域をそれぞれＬＰＧ３及びＬＰＧ４ベクターにクローン化することによって興味のクローンをＩｇＧに再編成し、哺乳類ＣＨＯ細胞において一過性に発現させ、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。

【0234】

抗ＢＡＣＥ１阻害クローンの選択
ＢＡＣＥ１はアミロイド前駆タンパク質を、その膜貫通ドメインに近い、細胞の表面に近接したポイントで通常切断するアスパルチルプロテアーゼである。したがって、特定のＢＡＣＥ１基質に対するＢＡＣＥ１タンパク質分解活性を調節する上記抗体の能力を、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用してインビトロで評価した。

【0235】

HTRFアッセイを次のように実施した。2マイクロリットルの375nM Bi27(ビオチン-KTEEISEVNLDAEFRHDSGYEVHHQKL (配列番号:53), American Peptide Company))、BACE1切断に対する感受性を増加するために置換を有するアミロイド前駆体タンパク質BACE1切断部位ペプチドを、384ウェルプレート (Proxiplate^ＴＭ, Perkin-Elmer)においてBACE反応バッファー(50mM酢酸ナトリウムpH 4.4及び0.1% CHAPS)において抗BACE抗体でプレインキュベートされた3μLの125nM BACE1と組み合わせた。タンパク分解性反応混合物を周囲温度で75分間インキュベートし、検出バッファー(200 mM Tris pH 8.0, 20 mM EDTA, 0.1% BSA,及び0.8M KF)中において、2 nM のストレプトアビジン-D2 及び150 nMのユーロピウムクリプテートで標識された6E10抗アミロイドβ抗体(Covance, Emoryville, CA)を有する5 μL のHTRF 検出混合物の添加によってクエンチした。最終反応混合物を周囲温度で60分間インキュベートし、TR-FRETシグナルを320nmの励起波長及び615及び665nmの放出波長でEnVision Multilabel Plate Reader^ＴＭ(Perkin-Elmer)を使用して測定した。BACE1酵素(0 BACE)を欠く反応及び抗BACE1抗体 (PBS (100% BACE1活性)の欠如を有する反応をコントロールとして使用した。

【0236】

自然多様性ライブラリーから同定された試験された４２抗体から、ＢＡＣＥ１の最良のインヒビター、ＹＷ４１２．８を親和性成熟について選択した。図４を参照。

【0237】

抗ＢＡＣＥ１阻害クローンの親和性成熟
ライブラリーを次のようにYW412.8抗体を親和性成熟するために構築した。全CDR-L3位置に終止コドン(TAA)を有し、M13バクテリオファージ)の表面上に一価のFabを提示するファージミドpW0703(ファージミドpV0350-2b由来(Lee等, J. Mol. Biol. 340, 1073-1093 (2004))を、親和性成熟のための天然多様性ライブラリーから興味のクローンの重鎖可変ドメイン(VH)を移植するためのライブラリー鋳型として使用した。ハード及びソフトランダム化方策の双方を親和性成熟に使用した。ハードランダム化では、選択された位置の３つの軽鎖ＣＤＲを有する一軽鎖ライブラリーを、天然ヒト抗体を模倣するために設計されたアミノ酸を使用してランダム化し、設計ＤＮＡ縮重はLee等(J. Mol.Biol.340, 1073-1093 (2004))に記載される通りであった。ソフトランダム化では、CDR-L3の位置91-94及び96、CDR-H1の28-31及び34-35、CDR-H2の50、52、及び53-58、CDR-H3の95-99及び100Aの残基を標的にした；CDRループの２つの異なる組合せ、L3/H1/H2及びL3/H3をランダム化のために選択した。選択した位置におよそ５０％の変異率を導入するソフトランダム化条件を得るために、変異誘発DNAを、野生型ヌクレオチドを好む70-10-10-10混合物で合成した(Gallop等, J. Med.Chem.37:1233-1251 (1994))。

【0238】

親和性改善Fabsの選択を次のように実施した。親和性改善ファージライブラリーを第一ラウンドでプレートソーティングに、その後４又は５ラウンドの溶液ソーティング課した。第一ラウンドのプレートソーティングでは、ライブラリーを、室温で2時間、1%BSA及び0.05%Tween 20中に約2OD/mlのファージ投入により、ニュートラアビジンコートプレート(NUNC Maxisorp plate)に捕獲された10μg/ml ビオチン化標的(BACE1)に対してソーティングした。プレートソーティングの第一ラウンド後、選択のストリンジェンシーを増加するために溶液ソーティングを実施した。溶液ソーティングでは、第一ラウンドのプレートソーティングから増殖された1OD/mlのファージを、1% Superblock(Pierce Biotechnology)及び0.05% Tween 20を有する100μlのバッファー中において室温で30分間100nMのビオチン化標的タンパク質(濃度は親クローンファージIC₅₀値に基づく)でインキュベートした。混合物を1% Superblockで10x更に希釈し、100μl/ウェルをニュートラアビジン-コード化ウェル(5μg/ml)に、ビオチン化標的がファージに結合するように穏やかに振とうさせながら室温で15分間適用した。ウェルを、PBS及び0.05% Tween20で１０回洗浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ビオチン化されていない標的を伴うファージを有するコントロールウェルをニュートラアビジン-コート化プレート上に捕獲した。結合ファージを0.1NのHClで20分間溶出し、1/10体積の1M Tris pH 11で中和し、滴定し、次ラウンドのために増殖させた。次に、選択ストリンジェンシーを増加させながら更に２ラウンドの溶液ソーティングを実施した。第一ラウンドは、100nMから5nMにビオチン化標的タンパク質濃度を低下することによるオン-レート選択についてであった。第二ラウンドは、室温で弱い結合を競合オフするために過剰量の非ビオチン化標的タンパク質(100倍以上)を加えることによるオフ-レート選択についてであった。また、バックグラウンドファージ結合を低下させるためにファージ投入を低下させた(0.1~0.5 OD/ml)。

【0239】

コロニーを第４ラウンドスクリーニングから選択し、９６-ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）において５０μｇ／ｍｌカルベニシリン及び１Ｅ１０／ｍｌ ＫＯ７ファージを有する１５０μｌ／ウェルの２ＹＴ培地において３７℃で一晩増殖させた。同じプレートから、ＸＬ-１感染親ファージのコロニーをコントロールとして選択した。９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、４℃で一晩又は室温で２時間、ＰＢＳ中において１００μｌ／ウェルのニュートラアビジン（２μｇ／ｍｌ）でコートした。ビオチン化標的タンパク質（２μｇ／ｍｌ）を加える前にプレートを６５μｌの１％ＢＳＡで３０分間、そして４０μｌの１％Ｔｗｅｅｎ２０で更に３０分間ブロッキングし、室温で１５分間インキュベートした。

【0240】

ファージ上澄みを100μlの全体積において10nMの標的タンパク質の有無によりELISA(酵素結合免疫吸着測定法)バッファー(0.5% BSA, 0.05% Tween20のPBS)において1:10に希釈し、単一スポット競合アッセイにおける使用のためにFプレート(NUNC)において室温で少なくとも1時間インキュベートした。標的タンパク質の有無による75μlの混合物を、ニュートラアビジンコート化プレートに捕獲された標的タンパク質に並列して移した。プレートを15分間穏やかに振とうさせ、ニュートラアビジン捕獲標的タンパク質に非結合ファージを捕獲させた。プレートをPBS-0.05% Tween 20で少なくとも５回洗浄した。結合をELISAバッファー(1:5000)中における西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化抗M13抗体の添加によりクエンチし、室温で30分間インキュベートした。プレートを少なくとも５回PBS-0.05% Tween 20で洗浄した。次に、100μl/ウェルの1:1比の3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)ペルオキシダーゼ基質及びPeroxidase Solution B(H₂O₂)(Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))をウェルに加え、室温で5分間インキュベートした。反応を100μlの1Mリン酸(H₃PO₄)を各ウェルに加えることによって停止させ、室温で5分間インキュベートさせた。各ウェルにおける黄色のOD(光学密度)を450nmで標準のELISAプレートを使用して決定した。ODの低下(%)を次の式によって算出した:

【0241】

ＯＤ_{４５０ｎｍ}の低下（％）＝［（競合を有するウェルのＯＤ_{４５０ｎｍ}）／（競合無しのウェルのＯＤ_{４５０ｎｍ}）］＊１００。

【0242】

親ファージ（１００％）のウェルのＯＤ_{４５０ｎｍ}の低下（％）と比較して、ヒト及びマウス双方について５０％未満のＯＤ_{４５０ｎｍ}の低下（％）を有したクローンを配列分析のために選択した。ユニーククローンを、親クローンとの比較により標的に対する結合親和性（ファージＩＣ_５０）を決定するためにファージ調製のために選択した。最も親和性改善されたクローンを、抗体生産及びＢＩＡｃｏｒｅを使用した表面プラズモン共鳴による更なる結合キネティック分析及び他のインビトロ又はインビボアッセイのためにヒトＩｇＧ１に再フォーマットした。

【0243】

自然多様性ファージライブラリーから選択されたＹＷ４１２．８の軽鎖及び重鎖ＨＶＲ領域の配列を図１（Ａ）及び１（Ｂ）に示す。加えて、ＹＷ４１２．８抗体の親和性成熟から得られた５つの抗体をまた配列決定し、軽鎖及び重鎖ＨＶＲ配列をまた図１（Ａ）及び１（Ｂ）に示す。これらの抗体において可変性を提示した軽鎖ＨＶＲ領域のコンセンサスアミノ酸配列は次の通りであった：ＨＶＲ-Ｌ１：Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｘ_１ Ｖａｌ Ｘ_２ Ｘ_３ Ｘ_４ Ｘ_５ Ａｌａ（配列番号：１７）（上式中、はＸ_１アスパラギン酸及びバリンから選択され、Ｘ_２はセリン及びアラニンから選択され、Ｘ_３はスレオニン及びアスパラギンから選択され、Ｘ_４はアラニン及びセリンから選択され、そしてＸ_５はバリン及びロイシンから選択さる）；ＨＶＲ-Ｌ２：Ｘ_６ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ（配列番号：１８）（上式中、Ｘ_６はセリン及びロイシンから選択さる）；及びＨＶＲ-Ｌ３：Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｘ_７ Ｘ_８ Ｘ_９ Ｘ_１０ Ｘ_１１ Ｘ_１２ Ｔｈｒ（配列番号：１９）（上式中、Ｘ_７はセリン、フェニルアラニン、グリシン、アスパラギン酸及びチロシンから選択され、Ｘ_８はチロシン、プロリン、セリン及びアラニンから選択され、Ｘ_９はスレオニン及びアスパラギンから選択され、Ｘ_１０はスレオニン、チロシン、アスパラギン酸及びセリンから選択され、Ｘ_１１はプロリン及びロイシンから選択され、そしてＸ_１２はプロリン及びスレオニンから選択さる）。重鎖超可変領域Ｈ１のみがこれらの抗体間で可変性を提示し、その領域のコンセンサス配列は次の通りであった：ＨＶＲ-Ｈ１：Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｘ_１３ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｘ_１４ Ｉｌｅ Ｈｉｓ（配列番号：２６）（上式中、Ｘ_１３はセリン及びロイシンから選択され、Ｘ_１４はアラニン及びグリシンから選択される）。

【0244】

Ｂ．抗ＢＡＣＥ-１抗体を同定するための合成多様性ライブラリーソーティング及びスクリーニング
相補性決定領域（ＣＤＲ）に制限化学多様性を有するミニマル合成抗体ライブラリーを構築が構築され、Fellouse, F.A.et al.J. Mol.Biol.373:924-940 (2007)に過去に記載されるように、様々なタンパク質に対する高親和性抗体バインダーの獲得に効果的であることが示されている。ＹＳＧＸライブラリーと命名される合成多様性ライブラリーを、溶液ソーティングによりＢＡＣＥ１に対する阻害抗体を探索するために使用した。結合のパニングを下記のように５回実施した。

【0245】

ＹＳＧＸライブラリーと命名される一次ソーティングのライブラリーを、Ｆａｂ-ファージディスプレイのファージミド(pF1359)を使用して前述のように構築した(Library D in Fellouse, F.A.et al., J. Mol.Biol.373:924-940 (2007))。ライブラリーの多様性は約２ｘ１０^１０だった。

【0246】

親和性成熟では、一次ソーティングに由来する選択クローンについて全３つのＣＤＲＬを固定ＣＤＲＨでランダム化した。これらのタイプのオリゴヌクレオチドをランダム化のために使用した。タイプＩはＴｙｒ及びＳｅｒのみをコードする縮重コドンＴＭＣを使用する。タイプＩＩは等モル比でＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ及びＴｒｐのコドンを有するカスタム三量体ホスホラミダイトミックスを使用する。タイプＩＩＩは次のモル比：Ｔｙｒ（３０％）、Ｓｅｒ（１５％）、Ｇｌｙ（１５％）、Ｔｒｐ（１０％）及びＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、各々５％において１０アミノ酸残基をコードする三量体ホスホラミダイトミックスを使用する。元の鋳型のＫｐｎＩ部位が変異誘発によってサイレンシングされるようにオリゴヌクレオチドに変異を導入した。長さのバリエーションはＣＤＲ-Ｌ１では３〜１０アミノ酸、ＣＤＲ-Ｌ２では７アミノ酸、ＣＤＲ-Ｌ３では２−１０アミノ酸だった。最終セットのオリゴヌクレオチドを作成するためにオリゴヌクレオチドを適切に一つにプールし、すなわち、一タイプ内に異なる長さを有する全てのＬ１、Ｌ２及びＬ３オリゴヌクレオチドを混合し、次いでそれぞれＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３のオリゴヌクレオチドセットとして全３つのタイプを一つに混合する。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を使用し、全ＣＤＲ-ＬＣ位置を置換した。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発(Kunkel, T.A.et al., Methods Enzymol.154:367-382 (1987))後、ＤＮＡを精製し、鋳型ＤＮＡを消化するために３７℃で３時間ＫｐｎＩで処理した。次いで精製ＤＮＡを、ライブラリー構築のためにエレクトロポレーションに課した。

【0247】

ファージディスプレイされた抗ＢＡＣＥ１クローンの選択
ビオチン化ヒトＢＡＣＥ-１（配列番号：４９の１−４５７）をライブラリーソーティングの抗原として使用した。パニングの第一ラウンドでは、２０μｇのビオチン化ＢＡＣＥ１を４℃で１．５時間１ｘ１０^１３ｐｆｕ／ｍｌの濃度で１ｍＬのライブラリーでインキュベートした。標的に結合したファージを、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ，０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン）で事前にブロックした２００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅストレプトアビジンで１５分間捕獲した。結合したファージを０．１ＭのＨＣｌで溶出し、すぐに１ＭのＴｒｉｓ塩基で中和した。溶出ファージを前述のように標準プロトコルに従って増幅した(Sidhu, S.S.等 Methods Enzymol. 328: 333-363 (2000))。第二ラウンドを第一ラウンドと同じように実施し、１０μｇのビオチン化ＢＡＣＥ１を使用し４００μｌの増幅ファージでインキュベートした。その後の全てのラウンドでは、２μｇのビオチン化ＢＡＣＥ１を４００μｌの増幅ファージでインキュベートした。ビオチン化ＢＡＣＥ１に結合したファージを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジン（ラウンド間で交互）で事前にコートされブロッキングバッファーでブロックされたＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（ＮＵＮＣ）を使用して１５分間捕獲した。

【0248】

５ラウンドの選択後、ファージを９６-ウェルフォーマットにおいて増殖された個々のクローンから生産し、ファージスポットＥＬＩＳＡにおける使用のために培養上澄みをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 0.1% (v/v) Tween 20 (Sigma-Aldrich) (PBT buffer)に３倍に希釈した。希釈ファージ上澄みを、ニュートラアビジンコート化３８４-ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（ＮＵＮＣ）上に固定化されたビオチン化ＢＡＣＥ１で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＴバッファー）で６回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体コンジュゲート（ＰＢＴバッファー中に１：５０００希釈）(GE Healthcare)で３０分間インキュベートした。プレートをＰＴバッファーで６回及びＰＢＳで２回洗浄し、３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン／Ｈ_２Ｏ_２ペルオキシダーゼ基質(Kirkegaard-Perry Laboratories)で１５分間処理し、１．０ＭのＨ_３ＰＯ_４でクエンチし、吸光度を分光光度法で４５０ｎｍで読んだ。

【0249】

抗ＢＡＣＥ１阻害クローンの選択
ＹＳＧＸライブラリーのパニングは、ＢＡＣＥ１に結合する１８のユニーククローンの同定をもたらした。図３を参照。これらのクローンに対応するＦａｂタンパク質を次のように精製した。終止コドンを、Ｆａｂをコードするファージミドの重鎖及び遺伝子３間に導入した。得られたファージミドを大腸菌株３４Ｂ８に形質転換した。単一コロニーを、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充された３０ｍＬのＬＢ培地において３７℃で一晩増殖させた。一晩した培養物（５ｍＬ）をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）で補充された５００ｍＬの完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地に播種し、２４時間３０℃で増殖させた。Ｆａｂタンパク質を、標準的な方法によりプロテインＡアガロースビーズを使用して精製した。

【0250】

精製Ｆａｂを上記のようにＨＴＲＦ酵素活性アッセイを使用してＢＡＣＥ１に対する阻害活性ついてスクリーニングした。Ｆａｂ２、５、８、１２、１４及び１９をＢＡＣＥ１のインヒビターとして同定し、Ｆａｂ２３をアクチベーターとして同定した。図５を参照。

【0251】

Ｆａｂ２、５、８、１２、１４及び１９を、それらの結合エピトープを決定するために更に特徴付けた。全６抗体の精製Ｆａｂのパネルを使用して、下記のようにファージ競合ＥＬＩＳＡにおいてプレート捕獲ＢＡＣＥ１に結合された個々のＦａｂ-ディスプレイファージと競合させた。

【0252】

選択クローンの単一コロニー(XL1 blue cellにおける)を選択し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及びＭ１３ＫＯ７で補充された１ｍｌ ２ＹＴブロスにおいて３７℃で２時間増殖させた。カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を培養物に加え、６時間増殖を続けた。培養物を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンで補充された３０ｍｌの２ＹＴブロスに移し、３７℃で一晩増殖させた。ファージを収集し、前述のように精製した(Sidhu, S.S.等 Methods Enzymol. 328: 333-363 (2000))。精製されたＦａｂディスプレイファージをＰＢＴバッファーにおいて段階希釈し、プレート上に固定されたＢＡＣＥ１に対する結合について試験した。８０％の飽和シグナルをもたらす一定ファージ濃度を、その後の競合ＥＬＩＳＡのために選択した。競合を、一定亜飽和Ｆａｂディスプレイファージを段階希釈のＢＡＣＥ１と１時間インキュベートすることによって実施し、次いで非結合ファージを捕獲するために１５分間ＢＡＣＥ１固定化プレートに移した。次いでプレートを８回洗浄し、結合ファージを抗Ｍ１３-ＨＲＰで検出した。

【0253】

精製Ｆａｂ５は、ファージディスプレイＦａｂ８及び１２に対してＢＡＣＥ１の結合で競合したが、Ｆａｂ２、１４及び１９とは競合しなかった。このデータと一致して、精製Ｆａｂ８はファージディスプレイＦａｂ５及び１２と競合した。まとめると、これらのデータはＦａｂ５、８及び１２がＢＡＣＥ１上の同じ又は重複エピトープに結合することを示す。Ｆａｂ１４及び１９も、これらの精製ＦａｂのどちらかがＦａｂ１４-及び１９ディスプレイファージのどちらかと競合するという事実に基づき、互いに競合であった。これは、これらの２つの抗体が、Ｆａｂ５、８及び１２のものとは異なる同じ又は重複エピトープに結合することを示唆した。ファージＥＬＩＳＡアッセイでは、Ｆａｂ２-ディスプレイファージはＦａｂ２自身を含む精製Ｆａｂタンパク質の何れかと競合せず、Ｆａｂ２及びＢＡＣＥ１間の結合が非特異的であることを示す。従って、Ｆａｂ２を親和性成熟について候補として除外した。

【0254】

抗ＢＡＣＥ１阻害クローンの親和性成熟
最初のパニングプロセスによって得られた親阻害抗体の結合親和性を改善するために、Ｆａｂ５、８、１２、１４及び１９の全３つのＣＤＲ-ＬＣをランダム化して新しいファージライブラリーを設計した。これらの５つの抗体をそれらの異なるエピトープに基づいて２つのサブグループに分けた−Ｆａｂ５、８及び１２をグループ１、Ｆａｂ１４及び１９をグループ２とした。個々のクローンの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をライブラリー構築の鋳型として精製した。グループ１のｓｓＤＮＡ鋳型を親和性成熟ライブラリー１（ＬＣ-ｌｉｂ１として設計）のために一つにプールし、グループ２をライブラリー２（ＬＣ-ｌｉｂ２）のためにプールした。化学多様性を、分子認識について天然アミノ酸の機能的能力に基づいてランダム化ＣＤＲ内に制限した。Birtalan, S.等Mol Biosyst.6:1186-1194 (2010)を参照。ミニマル多様性(Tyr及びSer二元コドン)、セミミニマル多様性（Ｔｙｒ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ及びＴｒｐ三元コドン）及び１０アミノ酸を含む更なる多様性を、高親和性を得るために混合した。２つの親和性成熟ライブラリー、ＬＣ-ｌｉｂ１及びＬＣ-ｌｉｂ２を同セットのオリゴヌクレオチドを使用して構築し、上記のように全３つのＣＤＲ-ＬＣを同時にランダム化した。親和性成熟では、全３つのＣＤＲ-ＬＣ（相補性決定領域-軽鎖）を、一次ソーティング由来の選択クローンについて固定ＣＤＲ-ＨＣ（相補性決定領域-重鎖）とランダム化した。

【0255】

最初に得られた抗体の親和性成熟のためのライブラリーのスクリーニングを上記と同様に実施した。ライブラリーを３ラウンド溶液中においてビオチン化ＢＡＣＥ１でソーティングし、これは結合において１００倍超の濃縮をもたらした。ラウンド１では、２μｇのビオチン-ＢＡＣＥ１をファージディスプレイＦａｂライブラリーでインキュベートした。ラウンド２及び３では、２０ｎＭ及び５ｎＭのビオチン化ＢＡＣＥ１を増幅ファージでそれぞれインキュベートした。２つのライブラリーの各々からのクローン（９６）をワンポイント競合ＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングし、下記のように、プレート固定ＢＡＣＥ１への結合からファージ粒子と競合するように２０ｎＭのＢＡＣＥ１を溶液中において使用した。

【0256】

ＢＡＣＥ１で固定化されたプレートを、事前に２μｇ／ｍｌのニュートラアビジンを４℃で一晩コーティングし、ブロッキングバッファーでブロックした３８４-ウェルaxisorp Immunoplateを使用して１５分間２μｇ／ｍｌのビオチン化ＢＡＣＥ１を捕獲することによって調製した。９６-ウェルフォーマットにおいて増殖された個々のクローンからの培養上澄みをＰＢＴバッファーにおいて２０倍に希釈し、室温で１時間２０ｎＭのＢＡＣＥ１の有無によりインキュベートした。Ｔｈ混合物を固定化ＢＡＣＥ１を有するプレートに移し、１５分間インキュベートした。プレートをＰＴバッファーで６回洗浄し、結合ファージを上記のように抗Ｍ１３-ＨＲＰで検出した。溶液中におけるＢＡＣＥ１の不在及び存在におけるウェルからのＥＬＩＳＡシグナル間の比率はクローンの親和性を示し、高比率は高親和性を示す。

【0257】

ＬＣ_ｌｉｂ１からの５クローンは、ＢＡＣＥ１存在におけるウェルからのＥＬＩＳＡシグナルに対するＢＡＣＥ１不在におけるウェルからのＥＬＩＳＡシグナル間に＞４の比率を有し、ＬＣ_ｌｉｂ２からの１クローンは＞３の比率であった。ＬＣ４及び１１と命名する２クローンをＦａｂ５から得て；Ｆａｂ１２から３クローンＬＣ６、ＬＣ９及びＬＣ１０、及びＦａｂ１４からＬＣ４０を得た（図６）。

【0258】

これらの６クローンの親和性を推定するために、上記のようにファージ競合ＥＬＩＳＡを実施し、ＩＣ_５０値を決定した（図７）。ＩＣ_５０値を、Kaleidagraph (Synergy Software)を使用してMarquardt (Marquardt, D. W. SIAM J. Appl.Math.11:431-441 (1963))によるfour-parameter logistic equationにデータをフィッティングすることによって決定し、下の表２に示す。

【0259】

全ＬＣクローンは確かに、それらのそれぞれの親と比較して改善した親和性を示した。注目すべきは、ＣＤＲ-Ｌ２への２つのＴｒｐ残基の導入は、親の１００倍超、Ｆａｂ１２誘導体の親和性を改善した。

【0260】

６クローンのＦａｂタンパク質を精製し、上記のようにＨＴＲＦ酵素活性アッセイに課した。ＢＡＣＥ１のペプチド阻害剤であるＯＭ９９-２(CalBiochem(登録商標), catalog #496000)をコントロールとして使用した。親としてＦａｂ５を有する抗体では、ＦａｂＬＣ４が有意な改善された阻害を示し、ＬＣ１１は阻害活性を失った。Ｆａｂ１４由来のＬＣ４０もその阻害活性を失った。Ｆａｂ１２の親和性改善誘導体、ＦａｂＬＣ６、ＬＣ９及びＬＣ１０は一般に、それらの阻害活性においておよそ２０倍の改善を示した(図８)。このアッセイに基づくと、ＦａｂＬＣ６が最良の阻害剤であり、酵素活性のほぼ１００％の阻害を示し、他のＦａｂは部分阻害剤であり、およそ６０−７０％の阻害範囲を有した(図８)。試験された様々なＦａｂのＩＣ_５０値を下の表３に示す。ＩＣ_５０ＯＭ９９-２はこのアッセイにおいて１１ｎＭだった。

【0261】

Ｆａｂ１２の軽及び重鎖ＨＶＲ領域の配列を図２(Ａ)及び２(Ｂ)に示す。Ｆａｂ１２の親和性成熟によって生産される３つの抗体の軽及び重鎖ＨＶＲ配列をまた、図２(Ａ)及び２(Ｂ)に示す。軽鎖ＨＶＲ-Ｌ２のみがこれらの抗体において可変性を示した：ＨＶＲ-Ｌ２：Ｘ_１５ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｘ_１６ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ(配列番号：４１)(上式中、Ｘ_１５はセリン、トリプトファン及びチロシンから選択され、Ｘ_１６はセリン及びトリプトファンから選択される)。３つの重鎖ＨＶＲ領域の各々は４つの抗体において同一であった。

【0262】

Ｆａｂを次のように他の適用における使用のためにＩｇＧ抗体としてクローン化した。２９３Ｔ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞における一過性ＩｇＧ発現のために、選択されたＦａｂの軽鎖及び重鎖の可変ドメインをヒト軽鎖又は重鎖(ヒトＩｇＧ１)定常ドメインと共にＲＫ５-ベースプラスミドにクローン化した。ＩｇＧタンパク質を、標準的な方法によりプロテインＡアガロースビーズを使用して精製した。

【0263】

実施例２：抗ＢＡＣＥ１抗体の更なる特徴付け
上記のように、抗体をＢＡＣＥ１への機能及びエピトープ結合について同定した。親及び親和性成熟抗体を、下記のアッセイを使用して更に特徴付けた。

【0264】

A.結合キネティクス
YW412.8.31の結合キネティクスを評価した。簡潔には、抗BACE1 IgGの結合親和性を、BIAcore^ＴＭ-3000 instrumentを使用して表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。YW412.8.31 抗BACE1ヒトIgGをCM5バイオセンサーチップ上にコートされたマウス抗ヒトFc抗体(GE Healthcare, cat# BR-1008-39)によって捕獲し、およそ100反応単位(RU)を得た。キネティクス測定のために、２倍の段階希釈(0.98nM〜125nM)のヒトBACE1 ECD又はマウスBACE1 ECD(アミノ酸1-457)を25℃、30μl/分の流量でPBTバッファー(0.05% Tween 20のPBS)に注入した。会合速度(k_on)及び解離速度(k_off)を、単純一対一ラングミュア結合モデル(BIAcore^ＴＭ Evaluation Software version 3.2)を使用して算出した。平衡解離定数(K_D)を比k_off/k_onとして算出した。pH7.0でのYW412.8.31結合の結果を表4に示す。

【0265】

ＢＡＣＥ１へのＹＷ４１２．８．３１の結合をｐＨ７．０及び５．０双方で確認した。これは重要であり、ＢＡＣＥ１は酸性ｐＨで、おそらく細胞内小胞及び／又はトランスゴルジネットワークにおいて最適に活性である。

【0266】

Ｂ．インビトロ阻害アッセイ
加えて、特定のＢＡＣＥ基質に対するＢＡＣＥ１タンパク質分解活性を調節する抗体の能力を、ＢＡＣＥ１のヒト組換え細胞外ドメインを用い２つの活性アッセイ：ＨＴＲＦアッセイ及びマイクロ流体キャピラリー電気泳動(ＭＣＥ)アッセイを使用してインビトロで評価した。

【0267】

親和性成熟YW412.8.31 抗BACE1抗体を実施例1に記載のようにHTRFアッセイにおいて試験した。BACE1の合成ペプチド阻害剤、OM99-2 (CalBiochem(登録商標), Catalog # 496000),BACE1の小分子阻害剤 (β-セクレターゼ阻害剤IV, CalBiochem(登録商), Catalog #5657688)及びBACE1に結合しないIgG抗体をコントロールとして使用した。図9 (パネルA) (長ペプチド)を参照。加えて、短FRETペプチド(Rh-EVNLDAEFK-quencher (配列番号:54), Invitrogen)を使用した反応をまた、HTRF反応と同様に実施した。コントロール反応からの得られた蛍光性産物を、545nmの励起波長及び585nmの放出波長以外は上記の通りに測定した。得られたデータをGraphPad Prism 5^ＴＭ(LaJolla, CA)を使用して分析した。図9(パネルA)(短ペプチド)を参照。

【0268】

MCEアッセイ反応を、384-ウェルマイクロプレートにおいて20μL／ウェルの最終体積において実施した。標準的な酵素反応を、12nMのヒトBACE1細胞外ドメイン、1mMのアミロイド前駆体タンパク質βセクレターゼ活性部位ペプチド(FAM-KTEEISEVNLDAEFRWKK-CONH₂ (配列番号:55))、50mMのNaOAc pH 4.4及び0.1% CHAPSを含む5mLの4x化合物及び5 μLの4x酵素に、10 μLの2X基質を加えることによって開始した。同じ反応条件をヒトBACE2酵素の細胞外ドメイン(5nM)及びカテプシンDの細胞外ドメイン(6nM, Calbiochem(登録商標))に使用した。周囲温度で60分間のインキュベーションの後、各反応における産物及び基質をLC3000(登録商標)において分析される12-sipper microfluidic chipを使用して分離した(双方ともCaliper Life Sciences)。産物及び基質の分離を、製造者の最適化ソフトウェアを使用して電圧及び圧力を選択することによって最適化した。分離バッファーは、100mM HEPES pH 7.2、0.015% Brij-35、0.1%コーティング試薬#3、10mM EDTA及び5% DMSOを含んだ。分離条件は、-500Vの下流電位、-2250Vの上流電位及び-1.2 psi.のスクリーニング圧力を使用した。産物及び基質蛍光を、488nmの波長で励起させ、530nmの波長で検出した。基質変換をHTS Well Analyzerソフトウェア(Caliper Life Sciences)を使用して電気泳動図から算出した。

【0269】

ＹＷ４１２．８．３１抗体を使用したＨＴＲＦ及びＭＣＥアッセイからの結果を図９に示す。長ペプチドアッセイにおける抗体の観察されたＩＣ_５０は１．７ｎＭであり、最大阻害は７７％に達した。加えて、ＹＷ４１２．８．３１抗体は短ペプチドアッセイにおいて１７ｎＭのをＩＣ_５０を有した。更に、ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体は、マイクロ流体キャピラリー電気泳動アッセイにおいて８０ｐＭのＩＣ_５０でＢＡＣＥ１活性を阻害し、ヒトＢＡＣＥ２又はカテプシンＤ、リソソームアスパルチルプロテアーゼを阻害しなかった。ＹＷ４１２．８．３１抗体のＳＰＲ分析はまた、ＢＡＣＥ１に最も高く関連するプロテアーゼであるＢＡＣＥ２に抗体が結合しないことを確認した。合わせてこれらのデータは、ＹＷ４１２．８．３１抗体が強力で選択的なＢＡＣＥ１アンタゴニストであることを示す。この抗体の更なる特徴付けを、その機能をより理解するために実施した。

【0270】

Ｃ．細胞ベース阻害アッセイ
ＡＰＰプロセシングへの抗ＢＡＣＥ１抗体の観察されたインビトロ阻害作用がまた細胞状況において存在するか決定するために、インビボ研究を実施した。野生型ヒトアミロイド前駆体タンパク質を安定して発現する２９３-ＨＥＫ細胞におけるＡβ_１−４０生産を阻害する抗体の能力を以下のように評価した。２９３-ＡＰＰ^ＷＴ細胞を９６-ウェルプレートにおいて３ｘ１０^４細胞／ウェルの密度で一晩播種した。抗ＢＡＣＥ１抗体又はコントロールＩｇＧ１抗体を有する５０μｌの新鮮な培地(ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ)を、３７^ｏＣで２４時間細胞と共にインキュベートした。三環系小分子ＢＡＣＥ１インヒビター(BACE1 SMI)をまたコントロールとして使用した((Compound 8e - Charrier, N.等 J. Med. Chem. 51:3313-3317 (2008))。細胞培地を回収し、製造者の指示に従ってＡβ_1-40 HTRF(登録商標)アッセイ(CisBio)を使用してＡβ_1-40の存在についてアッセイした。Ａβ_1-40値を細胞生存率について正規化し、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使用して決定した。実験を少なくとも３回実施し、各実験における各ポイントを二つ組において反復した。データをfour-parameter non-linear regression curve-fitting program(Kaleidagraph, Synergy Software)を使用してプロットした。

【0271】

同様な研究をまた、マウスから単離された後根神経節、皮質ニューロン及び海馬ニューロンにおいて実施した。簡潔には、解離ニューロン培養物をＥ１３．５後根神経節(ＤＲＧ)、Ｅ１６．５皮質ニューロン及びＥ１６．５海馬ニューロンから調製した。ニューロンをインビトロにおいて５日間増殖させた。ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ抗体又はコントロールＩｇＧ１を有する新鮮な培地を２４時間ニューロンと共にインキュベートした。培地を回収し、製造者の指示に従ってＭＳＤ(登録商標)齧歯類／ヒト(４Ｇ８)Ａβ４０ Ultrasensitiveキットを使用してＡβ₄₀の存在についてアッセイした。Ａβ₄₀値を細胞生存率について正規化し、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使用して決定した。実験を少なくとも３回実施し、各実験における各ポイントを二つ組において反復した。データをfour-parameter non-linear regression curve-fitting program(Kaleidagraph, Synergy Software)を使用してプロットした。

【0272】

試験した全抗ＢＡＣＥ１抗体(ＬＣ６、ＬＣ９、ＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．３１及びＹＷ４１２．８．５１)は、非ＢＡＣＥ１ ＩｇＧ抗体阻害剤(Ｘｏｌａｉｒ(登録商標))と比較してＡＰＰを発現する２９３の細胞においてＡβ_１−４０生産を阻害した。図１０を参照。

【0273】

図１１に示すように、ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体はＡＰＰを発現する２９３の細胞においてＢＡＣＥ１ ＳＭＩコントロールと類似な程度までＡβ_１−４０生産を阻害し、１７ｎＭのＩＣ_５０及び〜９０％の最大低減だった。類似な結果がＤＲＧニューロンにおいて得られ、最も高い濃度のＹＷ４１２．８．３１でＡβ_４０生産において約５０％の低減となり、８．４ｎＭのＩＣ_５０だった。ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体はまた、２．３−２．６ｎＭのＩＣ_５０で皮質及び海馬ニューロンにおけるＡβ_４０生産を阻害した。これらの発見は抗ＢＡＣＥ１抗体がインビトロにおいて前に観察されたように細胞に同様に機能したことを示す。更に、ＹＷ４１２．８．３１抗体はＣＮＳのニューロンにおいて最良の効力を示すと思われる。

【0274】

Ｄ．抗ＢＡＣＥ１抗体の細胞内内部移行
ＢＡＣＥ１は細胞内、特にゴルジにおいて発現されることが知られている。ＹＷ４１２．８．３１が細胞内環境においてＢＡＣＥ１と相互作用するか否か確かめるために、内部移行研究を実施した。ＢＡＣＥ１＋／＋又はＢＡＣＥ１−／−マウスから、一セットのニューロン培養物をＥ１３．５後根神経節(ＤＲＧ)外植片から調製し、第二セットのニューロン培養物をＥ１６．５解離皮質ニューロンから調製し、３７℃で２４又は７２時間それぞれ培養した。０．５μＭのＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体を有する培地を３０分〜２時間の様々な期間で培養物に加え、４℃又は３７℃の何れかでインキュベートした。処理後、非結合抗体をＰＢＳで十分に洗浄した。培養物を４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定し、選択したサンプルをまた０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００で透過処理した。結合した抗体を、製造者の指示に従って二次Ａｌｅｘａ ５６８-コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ１抗体(Molecular Probes)を使用して検出した。

【0275】

大部分の抗体シグナルが、高温サンプルにおいて内部移行されたことが分かった。図１２(Ｂ)に見られるように、二次抗体によるＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体の検出を可能にするために細胞が透過処理されたとき、ＢＡＣＥ１は３７^ｏＣでＤＲＧ軸索において細胞内に検出できた。逆に、ＤＲＧが内部移行を防ぐために４^ｏＣで冷却インキュベーションされる場合、又は細胞がＹＷ４１２．８．３１の細胞内検出を可能にするために透過処理されない場合、細胞表面では微少のＢＡＣＥ１が検出される。ニューロンへの抗体の内部移行はＢＡＣＥ１結合に依存し、なぜならそれがＢＡＣＥ１＋／＋動物からの皮質ニューロンにおいてのみ検出可能であり、ＢＡＣＥ１−／−動物からのニューロンでは検出されたなかったからである(図１２(Ｃ)の中央及び右パネルを比較)。

【0276】

加えて、マウス皮質ニューロンを１０分間又は３時間ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体又はコントロールＩｇＧの存在下において培養し、その後抗体を免疫染色によって検出した。ニューロン培養物をＥ１５．５解離皮質ニューロンから調製し、１４ＤＩＶ培養した。１μＭのＹＷ４１２．８．３１を有する培地を１０分間〜３時間培養物に加え、３７℃でインキュベートした。処理後、非結合抗体をＨＢＳＳで十分に洗浄した。培養物を室温で１０分間２％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００で透過処理をするか又はしなかった。結合抗体をＡｌｅｘａ ５６８コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ１二次抗体(Molecular Probes)を使用して検出した。ＹＷ４１２．８．３１局在を、どのくらい細胞の表面に結合したか見るために非透過処理細胞において、並びにどのくらい抗体が内部移行したか見るために透過処理細胞において分析した。検出された抗体シグナルの大部分が細胞内に局在し、少量の抗体染色が細胞表面に観察された(図１２(Ａ))。内部移行はＹＷ４１２．８．３１処理のわずか１０分後に明らかであり、抗体が初期エンドソームによって活発に取り込まれることを示唆する。ほとんどのＹＷ４１２．８．３１シグナルが点状であり、それが小胞内に含まれたであろうことを示す。

【0277】

ＹＷ４１２．８．３１が局在化された細胞内区画をより良く同定するために、我々は異なる小胞区画のマーカーで共染色した：初期エンドソーム(トランスフェリン受容体、ＴｆＲ)、トランスゴルジネットワーク(ＴＧＮ)(ＶＡＭＰ４)、及びリソソーム(ＬＡＭＰ１)。細胞を抗ＴｆＲ(Novus, Cat#NB100-64979)、抗ＶＡＭＰ４(Novus, Cat#NB300-533)又は抗ＬＡＭＰ１(BD Pharmingen, Cat#553792)で共染色した。ＹＷ４１２．８．３１免疫反応性は初期エンドソーム及びＴＧＮのマーカーと共局在したが、リソソームとは異なった(図１２(Ａ))。このパターンはＢＡＣＥ１が活性である区画に局在する抗体と一致する。

【0278】

実施例３：抗ＢＡＣＥ１抗体結合部位の特徴づけ
ヒトＢＡＣＥ１に対する特定の抗ＢＡＣＥ１抗体の結合部位を同定するために更なる研究を実施した。一セットの実験では、どの抗体が競合結合を示すか決定するために、ＢＡＣＥ１(ｈＢＡＣＥ１)への抗体の結合を既知の活性部位又はエキソサイトＢＡＣＥ１結合ペプチドの有無において評価した。第二セットの実験では、三次元結合部位を決定するために、抗ＢＡＣＥ１ ＦａｂをヒトＢＡＣＥ１細胞外ドメインと共結晶化させた。

【0279】

Ａ．競合結合
発明の抗ＢＡＣＥ１抗体のＢＡＣＥ１上の結合部位を決定する間接的方法として、競合ＥＬＩＳＡを実施した。簡潔には、抗体ＹＷ４１２．８ＩｇＧ(１μｇ／ｍｌ)を４℃で一晩ＮＵＮＣ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートにコートし、ブロッキングバッファーＰＢＳＴ(ＰＢＳ及び１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０)で１時間室温でブロックした。抗ＢＡＣＥ１抗体ＹＷ４１２．８又はｈＢＡＣＥ１結合ペプチドの段階希釈を所定量のビオチン化ｈＢＡＣＥ１でインキュベートし、室温で６０分間インキュベートした。次いで段階希釈をＹＷ４１２．８コート化プレートに加え、室温で３０分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄バッファー(０．０５％Ｔ-２０のＰＢＳ)で洗浄し、室温で３０分間、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)で標識されたストレプトアビジンを加えて処理した。次いでプレートを洗浄し、テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質で処理した。捕獲ビオチン化ｈＢＡＣＥ１に結合したＨＲＰ-コンジュゲートストレプトアビジンを、標準的な技術を使用して６３０ｎｍの波長で測定した。

【0280】

上記競合ＥＬＩＳＡアッセイに使用されるビオチン化標的タンパク質の最適濃度を決定するために、ＮＵＮＣ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートをコートし、上記のようにブロックした。ビオチン化標的の段階希釈を、抗体コートプレートで３０分間室温でインキュベートした。次いでプレートをＰＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンで３０分間室温でインキュベートした。結合シグナルの検出は上記の通りであった。データをfour-parameter non-linear regression curve-fitting program(Kaleidagraph, Synergy Software)を使用してプロットした。ビオチン化hBACE1の亜飽和濃度をカーブフィッティングから決定し、上記の競合ELISAに適用した。

【0281】

予測した通り、ＹＷ４１２．８は、ｈＢＡＣＥ１への結合について自身と競合した(図１３)。ＹＷ４１２．８及び活性部位阻害ペプチドＯＭ９９-２(CalBiochem(登録商標), catalog #496000)間で競合は観察されたなかった。ＬＣ６及びＹＷ４１２．８抗ＢＡＣＥ１抗体及び既知のエキソサイト結合ペプチドＢＭＳ１(Peptide 1 from Kornacker等, Biochemistry 44:11567-11572 (2005))間で競合が観察された。まとめると、これらの結果はＹＷ４１２．８がＡＰＰ切断のためのＢＡＣＥ１活性部位と異なるＢＡＣＥ１エキソサイトに結合することを示唆する。図１３における曲線の形は、ＹＷ４１２．８、ＬＣ６及びＢＭＳ１がＢＡＣＥ１において重複する結合部位を有しうることを示唆する。

【0282】

Ｂ．血漿構造
ＢＡＣＥ１とのＹＷ４１２．８抗体の相互作用をより良く理解するために、ＹＷ４１２．８．３１Ｆａｂをヒト組換えＢＡＣＥ１細胞外ドメインの細胞外ドメインと共結晶化した。

【0283】

タンパク質発現及び精製
Ｃ末端His6タグ(配列番号:210)を伴うBACE1(配列番号:49のアミノ酸57-453)DNAのタンパク質発現及び精製をBlue Heronで合成し、pET29a(+)ベクター(Novagen)にクローン化し、BL21(DE3)細胞(Invitrogen)に形質転換した。発現を、1mMのイソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)導入により37^oCで4時間実施した。細胞をマイクロフルダイザーで溶解し、封入体(BACE1を含む)を単離し、TE(10mM Tris pH8.0及び1mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA))バッファーで2回洗浄した。12,000rpmで30分間の遠心分離の前に、タンパク質可溶化を7.5M尿素、100mM AMPSO pH10.8及び100mM β-メルカプトエタノール(BME)を使用して室温で2時間実施した。次いで上澄みを7.5M尿素、100mM AMPSO pH10.8で希釈し、約1.5-2.0のOD₂₈₀を得た。タンパク質リフォールディングを、まず冷却水において可溶化BACE1を1:20に希釈し、次いでリフォールディングを生じさせるために4^oCで3週間サンプルを穏やかに撹拌することによって実施した。リフォールディングしたBACE1の精製は3つのカラムクロマトグラフィー工程を含んだ。まず、BACE1を20mM Tris pH 8.0及び0.4M尿素でプレ平衡化された50ml Q sepharose Fast Flow(GE Healthcare)カラムにロードし、0-0.5M NaClの塩勾配で溶出した。ピーク画分をプールし、20mM Tris pH 8.0バッファーで5倍に希釈し、SourceTM15Qカラム(GE Healthcare)にロードした。BACE1を溶出するために0-0.3M NaClの勾配を使用した。BACE1タンパク質を有する画分をプールし、濃縮し、そして25mM Hepes pH 7.5、150mM NaClにおいてSuperdex^ＴＭ S75カラム(GE Healthcare)において更に精製した。

【0284】

YW412.8.31 Fabを大腸菌において発現させ、細胞ペーストをPBS、25mM EDTA及び1mM PMSFにおいて解凍した。混合物をホモジナイズし、マイクロフルダイザーを2回通過させ、12,000rpmで60分間遠心分離した。次いで上澄みをプロテインGカラムに5ml/分でロードした。カラムをベースラインまでPBSで洗浄し、タンパク質を0.58%酢酸で溶出した。YW412.8.31 Fabを有する画分をプールし、20mM MES, pH 5.5で平衡化したSP-セファロースカラムにロードし、Fabを0〜0.25M NaClの塩勾配で溶出した。Fabを25mM Hepes pH 7.5及び150mM NaClにおいてSuperdex^ＴＭS75カラムにおいて更に精製した。

【0285】

結晶化
精製BACE1タンパク質(配列番号:49のアミノ酸57〜453)を1:1.5モル比(Fabの過剰)で精製YW412.8.31 Fabと混合した。複合体を氷上で1時間インキュベートし、S200 26/60 gel filtration column(GE Healthcare)において精製し、過剰Fabからそれを分離した。次いで複合体を15mg/mlに濃縮した。結晶化を、20% PEG 4000、0.1MのTris pH 8.5及び0.2Mの酢酸ナトリウムを有する1μlのウェル溶液と混合した1μlのBACE1/Fab複合体を用いてsitting drop vapor diffusion 法によって実施した。次いで結晶化ドロップを19℃でインキュベートした。結晶は４日後出現し、更に2日間成長した。次いで結晶を収集し、母液及び20%グリセロールを有する凍結保護溶液において急速冷凍させた。

【0286】

データ収集及び構造決定
回折データをStanford Synchrotron Radiation Facility(SSRL) beam line 7-1で単色X線ビーム(12658.4eV)を使用して収集した。X線検出装置は、結晶から430mm離して置かれたADSC quantum-315 CCD検出器だった。完全なデータセットの収集のために回転法を単一結晶に適用し、0.5°オシレーション/フレーム及び180°のトータルウェッジサイズを用いた。次いでデータをインデックス化し、統合し、プログラムHKL2000(登録商標) (HLK Research, Inc.)を使用してスケーリングした。

【0287】

構造をプログラムPhaser (Read, R.J., Acta Cryst.D57:1373-1382 (2000))を用い分子置換(MR)法を使用して解析した。Matthews’ coefficientの算出結果は、各非対称ユニットが１つのBACE1/Fab及び48%溶媒から成ることを示した。従って、MR算出は、FabのN- 及びC-ドメイン、及びBACE1細胞外ドメインを含む３サブユニットの一セットを検索することに向けられた。N-及びC-末端Fabドメインは、柔軟なエルボー角度を可能にするために別個に検索した Fabサブユニットの検索モデルは、HGFA/Fab複合体の結晶構造から得た(PDB code:2R0L, Wu, Y.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:19784-19789 (2007))。BACE1の検索モデルは、公開BACE1構造PDBコード:1FKN からである(Hong, L.等Science 290:150-153 (2000))。有意なコンホメーション変化は、BACE1/Fab界面で生じる。手動再構築をプログラムCOOT(Crystallographic Object-Orientation Toolkit) (Emsley & Cowtan, Acta.Cryst.D60:2126-2132 (2004))を用いて実施した。構造精密化を、最尤標的機能を使用して、プログラムREFMAC5 (Murshudov, G.N.,等, Acta Cryst.D53:240-255 (1997))及びPHENIX (Python-based Hierarchical Environment for Integrated Xtallography) (Adams, P.D.et al.Acta.Cryst.D66:213-221 (2010)を用いて反復的に実施し、0.221の最終R因子及び0.274のR_freeを得た。構造精密化統計を表5に示す。

^１Ｒｓｙｍ＝Ｓ｜Ｉ_ｈｉ−Ｉ_ｈ｜／ＳＩ_ｈｉ、ここでＩ_ｈｉは反射ｈのｉ番目の対象関連観察のスケール強度であり、Ｉ_ｈは平均値である。
²括弧内の値は(１．９７−１．９０Å)である最外郭分解能のものである。
^３Ｒｃｒｙｓｔ＝Ｓ_ｈ｜Ｆ_ｏｈ−Ｆ_ｃｈ｜／Ｓ_ｈＦ_ｏｈ、ここでＦ_ｏｈ及びＦ_ｃｈは反射ｈの観察及び算出構造因子振幅である。
^４Ｒｆｒｅｅの値は精密化に含まれていない５％のランダムに選択した反射についての算出である。

【0288】

結晶回折及び構造を２．８Å分解能で精密化した。複合体におけるＢＡＣＥ１の全体構造は、その遊離形態に非常に類似し(Hong等, Science 290:150-153 (2000))、残基の96% (373/385)のＣα原子位置で０．６３Å ＲＭＳＤでアラインできる。ＹＷ４１２．８．３１ ＦａｂはＢＡＣＥ１分子表面の〜８４０Å^２の表面積をカバーし、活性部位の近傍において結合しない。エピトープはループＣ(完全長ＢＡＣＥ１のアミノ酸３１５−３１８)、Ｄ(完全長ＢＡＣＥ１のアミノ酸３３１−３３５)、及びＦ(完全長ＢＡＣＥ１のアミノ酸３７０−３８１)としてHong等(Science 290:150-153 (2000))に示される構造要素を含み、これらは三次元空間において近位に位置する。更に、ＹＷ４１２．８．３１結合部位の及び近傍におけるＢＡＣＥ１の部分はコンホメーション変化を採用し、強結合と一致する０．７１の形態相補スコアを生じる。コンホメーション変化を誘発された抗体は、セクレターゼ活性のアロステリック阻害に寄与すると考えられる。

【0289】

Ｆａｂはアミロイド前駆体タンパク質のＢＡＣＥ１の活性部位に遠位なエキソサイトに結合し、ＢＡＣＥ１結合ペプチドのパパネルの結合部位として過去に同定されたエキソサイトと部分的に重複する(Kornacker等, Biochemistry 44:11567-11572 (2005) (図14)。重及び軽鎖双方が相互作用に関与した(図15)。ＢＡＣＥ１エピトープ領域が高温度因子に示されるようにより動的である遊離形態と異なり、抗体結合構造はユニークコンホメーションにおいて安定し、セクレターゼのＰ６及びＰ７部位(Turner等, Biochemistry 44:105-112 (2005))を変形させる。これらの部位に隣接して、基質結合複合体においてαヘリックス構造を採用する配列番号：４９のアミノ酸２１８−２３１(AGFPLNQSEVLASV (配列番号:126)(Lin等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:1456-1460 (2000)の残基157-170 (アミノ酸番号付けはBACE1の成熟プロテアーゼドメインで開始する))は、抗体複合体においてランダムループとなり、これはおそらく触媒能においてＡＰＰがＢＡＣＥ１触媒クレフトと反応するのを防ぐことによりＡＰＰタンパク分解性切断に悪影響を及ぼす。構造エピトープは、結晶構造においてＹＷ４１２．８．３１ Ｆａｂの何れかの部分から４Åの距離内に位置する一又は複数の原子を有するＢＡＣＥ１のアミノ酸残基を含む。下の表６において、Ｆａｂ軽鎖残基は鎖Ｌに属し、Ｆａｂ重鎖残基は鎖Ｈに属する。BACE1アミノ酸の残基番号付けは、BACE1の完全長配列(配列番号:49)に基づく。Fabアミノ酸の残基番号付けはKabat番号付けスキームに基づく(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。

【0290】

詳細な原子相互作用は、極性相互作用のファンデルワールス接触の形態である。極性相互作用は水素結合及び塩橋を含む。下の表７はＢＡＣＥ１及びＹＷ４１２．８．３１Ｆａｂ間の対極性相互作用のリストを含む。Ｆａｂ軽鎖残基は鎖Ｌに属し、Ｆａｂ重鎖残基は鎖Ｈに属する。ＢＡＣＥ１アミノ酸の残基番号付けは、ＢＡＣＥ１の完全長配列(配列番号：４９)に基づく。Ｆａｂアミノ酸の残基番号付けはＫａｂａｔ番号付けスキームに基づく。

【0291】

下に示すように、ＹＷ４１２．８．３１抗体ＢＡＣＥ１エピトープにおけるアミノ酸組成は、ＢＡＣＥ２及びカテプシンＤにおける対応する領域間であまり保存されていない。ＹＷ４１２．８．３１抗体のエピトープにおけるこのアミノ酸差異は、抗体がＢＡＣＥ１に対して高く選択的であるという観察と一致する。番号付けはＢＡＣＥ１の完全長配列(配列番号：４９)に基づく。ＢＡＣＥ２及びカテプシンＤの配列は、それらのそれぞれの結晶構造に基づいてＢＡＣＥ１にアラインされる。ＹＷ４１２．８．３１ ＢＡＣＥ１エピトープにおける残基をボックスで囲む。

【0292】

実施例４：インビボ特徴づけ-マウス
インビボでのＹＷ４１２．８．３１の効果を評価した。ＢＡＣＥ１特異性阻害剤が達成できる最大Ａｂ_１−４０低減を得るために、ＢＡＣＥ１＋／＋コントロールと比較したＢＡＣＥ１−／−マウスの血漿及び前脳におけるＡｂ_１−４０生産に対するＢＡＣＥ１の寄与を調査した。ＢＡＣＥ１−／−マウスにおいて血漿Ａｂ_１−４０シグナルは４５％低減し、脳Ａｂ_１−４０シグナルは８０％低減した(図１６、パネルＡ)。これらの結果は、ＢＡＣＥ１が確かに前脳において主要なｂ-セクレターゼであるが、周辺においてはＢＡＣＥ１は部分的なＡｂ_１−４０生産のみを占め、残りは他のｂ-セクレターゼから生じるこをを示す。

【0293】

Ａβ生産へのＢＡＣＥ１の寄与の理解により、ｈＡＰＰトランスジェニックマウス及び野生型マウスにおけるアミロイド形成プロセシングを調節する抗ＢＡＣＥ１抗体ＹＷ４１２．８．３１の能力を評価した。

【0294】

ｈＡＰＰトランスジェニックマウス
簡潔には、５ヶ月のヒトＡＰＰ-発現マウスを、毎４日、計３投与（すなわち１、５、及び９日目）の腹腔内注入によって３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇＹＷ４１２．８．３１抗体又はビヒクルで処理した。動物を最終投与後２時間で安楽死させた。血清、血漿、及び脳を収集し加工した。血漿、皮質及び海馬を、製造者の指示に従ってアミロイドベータ（Ａβ）ＥＬＩＳＡ試験キット(The Genetics Company)を使用して可溶性Ａβ_１−４０及びＡβ_１−４２のレベルについて分析した。薬物動態分析を血清及び脳ホモジネートにおいて実施した。

【0295】

結果は血漿Ａβ_１−４０及びＡβ_１−４２レベルが、３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのＹＷ４１２．８．３１抗体投与レベル双方でコントロールレベルのおよそ３０％に低減されたことを示した(図１７(Ａ)、上パネル及び図１８、パネルＡ)。しかしながら、下で検討される野生型マウスにおいて観察されたものと対照的に、脳におけるＡβ_１−４０及びＡβ_１−４２のレベルは１００ｍｇ／ｋｇ投与量レベルのＹＷ４１２．８．３１抗体では１５−２２％のみ低減された(図１７(Ａ)、下パネル及び図１８、パネルＡ)。試験された動物の脳におけるＹＷ４１２．８．３１抗体の濃度は用量依存的に増加し、３０ｍｇ／ｋｇで処置された動物の脳における抗体の観察された濃度は４．８±３．６ｎＭであり、１００ｍｇ／ｋｇで処置された動物の脳における抗体の観察された濃度は１４．０±９．３ｎＭであり、抗体のより高い腹腔内投与用量は確かに、脳におけるより高用量の観察抗体に変換されたことを確認する。個々の薬物動態学対薬力学の結果のプロットは、このモデルにおけるこの抗体についてＰＫ／ＰＤ関係が存在することを示唆する(図１７(Ｂ))。

【0296】

類似な実験をまた実施し、YW412.8.31 抗BACE1抗体を持続ICV注入によってhAPPトランスジェニックマウス脳に全身性又は直接的に送達させた。ICV送達では、一側性移植されたAlzet osmotic minipump(model 2001)によって7日間持続的に抗体を送達させた。送達されたYW412.8.31抗体の量は0.041mg/日(低容量)又は0.41mg/日(高容量)だった；0.33 mg/日のコントロールIgGをコントロールグループに送達させた。安楽死では、血漿、皮質、及び海馬を収集し、製造者の指示に従いELISA(The Genetics Company)によって可溶性Ａβ_1-40及びＡβ_1-42のレベルについて分析した。

【0297】

下の表８は全身性送達によって３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇ、又はＩＣＶ送達によって０．０４１ｍｇ／日及び０．４１ｍｇ／日投与されたマウスの脳におけるＹＷ４１２．８．３１抗体の濃度を示す。

【0298】

しかしながら、注入後の脳における高レベルの抗体にも関わらず、Ａβの低下は１５−２３％と中程度であり、全身性送達で観察された低下と類似であった(図１８，パネルＢ)。この観察は、高用量の全身性注入はｈＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてＡβレベルを低下可能でありうるが、しかしながら減少は中程度であることを示唆する。ｈＡＰＰトランスジェニックマウスにおける低減された効果は動物モデルの結果であると信じられ、なぜなら、全身性送達後の血清における濃度と等しい脳における高濃度は、Ａｂ生産を更に低下させなかったからである。更に、ｈＡＰＰトランスジェニックマウスの脳における低減は、野生型マウスに観察され下に記載されるものと比較して小さい。このようにトランスジェニックｈＡＰＰマウスは、インビボで抗ＢＡＣＥ１効果を研究するには理想的ではないかもしれない。野生型マウスは疾患の観点からも抗体についてより適切なモデルであり、なぜなら圧倒的多数のアルツハイマーの患者人口は野生型ＡＰＰ対立遺伝子を保有するからである。

【0299】

野生型マウス
アミロイド形成プロセシングを調節する抗ＢＡＣＥ１抗体ＹＷ４１２．８．３１の能力をまた、野生型マウスにおいて評価した。簡潔には、実験を上記のように実施した。単一用量のコントロールＩｇＧ抗体又はＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体(５０ｍｇ／ｋｇ)を野生型マウスに静脈内(ＩＶ)注入によって全身性に送達させた。２４又は４８時間後、血漿及び脳サンプルを収集し、Ａβ_１−４０レベルを分析した。血漿及び脳における全マウスＡβ_１−４０の濃度を、全抗ＢＡＣＥ１抗体濃度を測定する下記の類似な手順に従って、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定した。簡潔には、Ａβ_１−４０のＣ末端に特異的なウサギモノクローナル抗体(Millipore, Bedford, MA)をプレート上にコートし、ビオチン化抗マウスＡβモノクローナル抗体M3.2 (Covance, Dedham, MA)を検出に使用した。アッセイは血漿において１．９６ｐｇ／ｍｌ、脳において３９．１ｐｇ／ｇの定量下限を有した。図１６、パネルＢに示すように、血漿Ａβ_１−４０は３５％低減され、皮質Ａβ_１−４０は２０％低減された。

【0300】

野生型C57Bl/6Jマウスによる更なる実験を実施し、100mg/kgのYW412.8.31又はコントロールIgGを全身性に投与した。単一腹腔内(IP)注入の４時間後の処置動物の血漿及び前脳双方におけるAb_1-40のレベルを決定した。血漿を単離するために、血液を心穿刺によって動物から集めた。PBS灌流後、脳を収集し、一方の半脳からの前脳をPKバッファー(PBS中に1% NP-40, Rocheコンプリートプロテアーゼインヒビターを伴う)において調製し、他方の半脳からの前脳を5MのGuHCL, 50mMのTris pH 8.0においてホモジナイズし、Ab_1-40分析のために、カゼインブロッキングバッファー(PBS中に0.25%カゼイン/0.05% アジ化ナトリウム, 20μg/mlアプロチニン/5mM EDTA, pH 8.0/10mg/mlロイペプチン)中に更に希釈した。

【0301】

図２２、パネルＡに示すように、１００ｍｇ／ｋｇ用量はコントロールレベルの〜５０％、及び前述のＢＡＣＥ１ノックアウトレベルに類似して血漿Ａｂ_１−４０を低減できた。しかしながら、投与後４時間では前脳Ａｂ_１−４０において変化は検出されなかった。この早期の時点は、脳における効果を見るにはＹＷ４１２．８．３１の投与後で早すぎうる。投与後の長い時間が脳における低下Ａβを観察するのに必要であり得、なぜなら特に、上記のようにＡβの低下が低用量(５０ｍｇ／ｋｇ)の野生型マウスにおいて２４時間で観察されるからである。血清におけるＹＷ４１２．８．３１濃度は非常に高く、投与後４時間で１０４０±１４０μｇ／ｍＬ(６．９±０．９μＭ)であった。脳におけるＹＷ４１２．８．３１濃度はずっと低く０．７±０．４μｇ／ｇ(４．７±２．７ｎＭ)であり、これは血清における濃度の〜０．０７％を表し、ＣＮＳへの抗体の予測された０．１％定常状態浸透に近似する(Reiber and Felgenhauer, Clin.Chim.Acta.163:319-328 (1987)。重要なことには、脳において得られた抗体濃度、４．７±２．７ｎＭは、前に観察された細胞ＩＣ_５０に近い(図１１)。このように、ＢＡＣＥ１ノックアウトマウスにおいて見られるレベルまでの血漿Ａｂ_１−４０の低減に示されるように、抗ＢＡＣＥ１抗体はインビボにおいて非常に効果的である。しかしながら、単一全身性投与はマウスへの投与後４時間では脳低減をもたらさず、おそらく何れかの効果を観察するには時点が早すぎたためだと思われる。

【0302】

反復投与による上昇脳抗体レベルの効果を決定するために、更なる実験を実施した。ＹＷ４１２．８．３１抗体、又はコントロールＩｇＧを毎４日、計３投与、３０又は１００ｍｇ／ｋｇ ＩＰ投与した。この試験では、最終投与後４時間の処置動物の血漿及び前脳双方におけるＡｂ_１−４０のレベルを測定した。再び、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ双方でのマルチ投与後、血漿Ａｂ_１−４０レベルにおける〜５０％の低減が観察された(図２２、パネルＢ)。注目すべきは、高用量の抗ＢＡＣＥ１では前脳Ａｂ_１−４０において４２％の低減が観察されたが、低用量では低減が観察されなかった。それぞれ毎４日に与えられる３０及び１００ｍｇ／ｋｇでの投与後、血清におけるＹＷ４１２．８．３１抗体濃度は４８０±２１０及び１５００±４４０μｇ／ｍＬであり、脳における濃度は０．９±０．６μｇ／ｇ(５．９±４．３ｎＭ)及び３．０±１．６μｇ／ｇ(２０±１０ｎＭ)だった。このように、予測された通り、脳における高抗体レベルはＡｂレベルにおいて頑強な低減をもたらした。注目すべきは、末梢Ａｂレベルにおいて１００ｍｇ／ｋｇ用量と比較して３０ｍｇ／ｋｇ用量での差はなく、３０ｍｇ／ｋｇでの最大末梢阻害が得られ、従って単純に末梢Ａｂレベルを低減することは脳レベルを低減するには十分でないことを示唆する。

【0303】

加えて、野生型及びＢＡＣＥ１ノックダウンマウスにＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体を投与した後、ＰＫデータを得た。図１９を参照のこと。抗ＢＡＣＥ１の単一投与(１又は１０ｍｇ／ｋｇ)をＢＡＬＢ／ＣマウスにＩＶ注入によって送達した。血清ＰＫを、投与後２１日まで分析した。

【0304】

マウス血清及び脳サンプルにおける全抗BACE1抗体濃度を次のように測定した。マウス血清及び脳サンプルにおける抗体濃度を酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して測定した。NUNC 384ウェル Maxisorpイムノプレート(Neptune, NJ)をロバ抗ヒトIgGのF(ab’)₂断片、Fc断片特異性ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)で4^oCで一晩コートした。次の日、プレートを0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を有するリン酸緩衝食塩水(PBS)で室温で1時間ブロックした。各抗体(コントロールIgG及び抗BACE1)を、それぞれの抗体濃度を定量化するためにスタンダードとして使用した。マイクロプレートウォッシャー(Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)を使用して0.05% Tween 20を有するPBSでプレートを洗浄後、0.5% BSA、0.35M NaCl、0.25% CHAPS、5mM EDTA、0.05% Tween 20及び15ppm Proclinを有するPBSにおいて希釈したスタンダード及びサンプルを穏やかな攪拌と共に室温で2時間プレートにおいてインキュベートした。結合抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートF(ab’)₂ヤギ抗ヒトIgG、Fc特異性ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch)で検出した。最後に、プレートを基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB) (KPL, Inc., Gaithersburg, MD)を使用して処理した。吸光度をMultiskan Ascent reader (Thermo Scientific, Hudson, NH)において630nmの基準を用いて450nmの波長で測定した。濃度をfour-parameter non-linear regression programを使用して標準曲線から決定した。アッセイは血清において3.12ng/ml及び脳において15.6ng/gの定量下限(LLOQ)を有した。

【0305】

マウスにおける遊離ＹＷ４１２．８．３１抗体濃度を、コートとしてＢＡＣＥ１ ＥＣＤ及び検出のために抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異性抗体(Jackson ImmunoResearch)を使用して上記に類似した手順に従って検出した。遊離抗ＢＡＣＥ１マウスＥＬＩＳＡは、血清において０．６２６ｎｇ／ｍｌ及び脳において３．１３ｎｇ／ｇのＬＬＯＱ値を有する。

【0306】

２つの別個のＰＫアッセイを使用した：血清における全ＹＷ４１２．８．３１を検出するアッセイ(全ｍＡｂ)、及び血清における非結合ＹＷ４１２．８．３１のみを検出するアッセイ(遊離ｍＡｂ)。観察されたＰＫは非線形であり、ＹＷ４１２．８．３１濃度が＜１０μｇ／ｍＬであるサンプルの全体対遊離ｍＡｂ値における差は、標的媒介クリアランスを示唆する。図１９、パネルＡを参照。更に、全ｍＡｂ及び非結合ｍＡｂ間の差異は、血清における幾つかのＹＷ４１２．８．３１が可溶性ＢＡＣＥ１に結合し得たことを示す。ＢＡＣＥ１＋／＋、ＢＡＣＥ１＋／−、及びＢＡＣＥ１−／−マウスにおける単一投与ＰＫ分析は、初期研究において観察された非線形を確認し、増強クリアランスが確かに標的媒介であることを示す。ＢＡＣＥ１−／−マウスは線形ＰＫを示す。図１９(パネルＢ)を参照。

【0307】

実施例５：インビボ特徴付け-サル
カニクイザルにＩＶ送達によってコントロールＩｇＧ又はＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体(３０ｍｇ／ｋｇ)を投与した。個々動物の各々における平均ベースラインＡβ_１−４０レベルを設定するために投与の７日前まで、次いで投与後様々な時点で血漿及びＣＳＦをサンプリングた。サル血清及びＣＳＦサンプルにおける全抗ＢＡＣＥ１又はコントロール抗体濃度を、コート及び検出双方としてサル吸着ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体(Bethyl, Montgomery, TX)を使用して測定した。サルにおける遊離抗ＢＡＣＥ１抗体濃度を、コートとしてＢＡＣＥ１ ＥＣＤ及び検出のためにサル吸着ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Bethyl)を使用して決定した。全及び遊離抗ＢＡＣＥ１サルアッセイ双方は、血清又はＣＳＦにおいて６．２５ｎｇ／ｍｌのＬＬＯＱ値を有した。ＰＫはサルに投与されたＩｇＧ１について予測された通りであり、予測した曝露を示す。

【0308】

試験したカニクイザルからの血漿及びCSFにおけるＡβ_1-40レベルも決定した。簡潔には、血漿における全cyno Ａβ_1-40の濃度を、製造者に説明に従いMSD MA6000 Human (6E10) Abeta Kit (Cat#K111BVE-2, Meso Scale Diagnostics)を使用して決定した。Ａβ_1-40のC末端に特異的な捕獲抗体をプレート上に事前にコートし、Sulfo-Tag 抗Ａβモノクローナル抗体6E10を検出に使用した。アッセイは血漿において49.4pg/mlの定量下限を有した。CSFにおける全cyno Ａβ_1-40のの濃度を、サンドイッチELISAを使用して決定した。Ａβ_1-40 のC末端に特異的なウサギポリクローナル抗体(cat#AB5737, Millipore, Bedford, MA)をプレート上にコートし、ビオチン化抗Ａβモノクローナル抗体6E10 (Cat#SIG-39340, Covance, Dedham, MA)を検出に使用した。アッセイはCSFにおいて15.6pg/mlの定量下限を有した。

【0309】

図２１(パネルＡ)に示すように、血漿Ａβ_１−４０レベルは全個体にわたりベースラインの〜５０％に低減された。Ａβにおける５０％最大血漿低減が、７日の観察期間中持続した。ＹＷ４１２．８．３１抗ＢＡＣＥ１抗体の血清濃度-時間プロファイルは、コントロールＩｇＧ抗体について観察されたものと類似し、線形範囲において投与された典型的なＩｇＧ１のものに類似する動力学が示唆される(図２０，パネルＡ)。〜８００μｇ／ｍＬのピーク血清抗体濃度を投与後１５分の最初のサンプル採取の時間に観察し、投与後７日までに２３２μｇ／ｍＬに落ちた。注目菅器は、投与後測定した全ての時点で、ＹＷ４１２．８．３１の血清濃度は細胞ＩＣ_５０を超えた。(〜２．５ｎＭ，図１１を参照)。

【0310】

ＣＳＦ Ａβ_１−４０レベルは、図２１(パネルＢ)に示すように、変動はあるが、投与後１及び３日で最大で５０％までの低下、その後は投与後７日ではベースラインＡβへの回帰傾向を示した。ベースライン血漿及びＣＳＦレベルにおける変動を図２１(パネルＣ及びＤ)に示す。ベースライン血漿レベルは動物を通してかなり均一であったが、ＣＳＦ Ａβ_１−４０レベルはかなり変動した。従って、全Ａβ_１−４０測定を各個々のサルについてベースラインに正規化した。

【0311】

これらのデータは、サルにおける単一投与のＹＷ４１２．８．３１が、血漿及びＣＳＦ Ａβレベルを有意に低減することを示す。ＣＳＦでは、この期間にわたり０．２−０．３μｇ／ｍｌのＹＷ４１２．８．３１濃度が観察され、これは〜２ｎＭ(図２０，パネルＢ)に変換される。このデータから、ＹＷ４１２．８．３１の脳濃度が類似範囲内であることが推測される。ＰＫ及びＰＤデータを比較すると、これらの結果は、血漿における薬物曝露が７日ウィンドウにわたりＡβ生産を最大限に阻害するのに十分であり、細胞ＩＣ_５０に近いＣＳＦにおける薬物濃度がそして試験された投与レベル(３０ｍｇ／ｋｇ)で、脳におけるＡβレベルを一過性に低減することを示す。概要すると、これらのデータは、ＣＳＦ Ａβ測定によって決定されるように、非ヒト霊長類において、全身性に投与された抗ＢＡＣＥ１が脳におけるＢＡＣＥ１活性を低減できることの強力な証拠を提供する。

【0312】

実施例６：ＹＷ４１２．８．３１抗体の親和性成熟
ＹＷ４１２．８．３１抗体を、前に記載した結晶構造に提供される構造データに従って親和性成熟した。ＢＡＣＥ１と接触する抗体残基を、ＹＷ４１２．８．３１抗体の親和性を増強するために変異させた。この方策によって生成される親和性成熟クローンは、命名法ＹＷ４１２．８．３１ｘＳを有する。ＹＷ４１２．８．３１親和性成熟クローンはまた、前述したように全ＣＤＲのソフトランダム化ターゲティングにより生成され、命名法ＹＷ４１２．８．３１ｘを有する。ＢＡＣＥ１に結合したクローンの重鎖可変配列及び軽鎖可変配列を図２３(Ａ)β(Ｃ)及び２４(Ａ)β(Ｃ)に記載する。

【0313】

ＢＡＣＥ１に結合したクローンを、実施例２Ｃにおいて前述したように細胞ベースＨＴＲＦアッセイにおいてＢＡＣＥ１プロテアーゼ阻害について試験した。アッセイの結果を図２５Ａ及び２５Ｂに示す。図２５Ｂは、記載の濃度で様々な親和性成熟抗ＢＡＣＥ１抗体により２４時間処理された一次皮質ニューロンからのＡβ_１−４０生産(ｐｇ／ｍｌ)の結果を示す。試験された幾つかの抗体が、ＹＷ４１２．８．３１で観察されたものと類似なレベルでＢＡＣＥ１を阻害した。

【0314】

前述の発明を、理解を明瞭にするために説明及び実施例によって幾らか詳細に記載したが、説明及び実施例は、発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。ここに引用される全特許及び化学文献の開示は、出典明記によってその全体を明瞭にここに援用する。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B-1】

【図9B-2】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A-B】

【図19】

【図20】

【図21A-B】

【図21C-D】

【図22A-B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25A】

【図25B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]