特許 6163560 マイクロ流体細胞の捕捉チップ及びその製作方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6163560

(24)【登録日】2017年6月23日

(45)【発行日】2017年7月12日

(54)【発明の名称】マイクロ流体細胞の捕捉チップ及びその製作方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20170703BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20170703BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20170703BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20170703BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/48 M

   G01N33/48 S

   C12M3/00 Z

   C12M1/00 A

   C12M1/26

【請求項の数】13

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2015-540988(P2015-540988)

(86)(22)【出願日】2012年11月14日

(65)【公表番号】特表2016-503496(P2016-503496A)

(43)【公表日】2016年2月4日

(86)【国際出願番号】CN2012084603

(87)【国際公開番号】WO2014071642

(87)【国際公開日】20140515

【審査請求日】2015年6月17日

(31)【優先権主張番号】201210442637.7

(32)【優先日】2012年11月8日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】515332469

【氏名又は名称】武漢友芝友医療科技股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100109449

【弁理士】

【氏名又は名称】毛受 隆典

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】劉 侃

(72)【発明者】

【氏名】汪 勝祥

(72)【発明者】

【氏名】張 南剛

(72)【発明者】

【氏名】周 鵬飛

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０４７９０６４０（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２２７０１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１４３５９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５２０６８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１１６２１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１６９８２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

上部硬質材料及び下部硬質材料を含み、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に、入口及び出口を有する溝が形成され、前記上部硬質材料及び下部硬質材料の少なくとも１つが透明材であるマイクロ流体細胞の捕捉チップにおいて、前記溝が入口から出口までの高さが高い点から低い点へと次第に過渡し楔状となり又は溝の一部の領域が楔状となり、前記溝の最低点が少なくとも１つの標的細胞のサイズに近似し又は未満であり、
前記溝の上下の底面に、ナノ粒子層や、ナノファイバ層、細胞と接触面との摩擦抵抗の増大のためのマイクロナノ構造が１層堆積され、
前記溝の入口において、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に厚さ５０〜２００μｍの鋼板が塞がれ、前記溝の出口において、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に厚さ１〜５０μｍの鋼板が塞がれ、前記溝が前記２つの鋼板の間に形成されることを特徴とするマイクロ流体細胞の捕捉チップ。

【請求項2】

前記溝は、幅が０．０５〜２００ｍｍであり、長さが１〜５００ｍｍである請求項１に記載のマイクロ流体細胞の捕捉チップ。

【請求項3】

前記ナノ粒子層又はナノファイバ層は、ナノＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２又はＦｅ_２Ｏ_３である請求項１に記載のマイクロ流体細胞の捕捉チップ。

【請求項4】

前記上部硬質材料又は下部硬質材料の少なくとも１つの表面に免疫仕上げを行い、少なくとも１つの標的細胞の分子特異性を認識できる請求項１又は３に記載のマイクロ流体細胞の捕捉チップ。

【請求項5】

前記上部硬質材料及び下部硬質材料の何れも、ガラス又はアクリル材料である請求項１に記載のマイクロ流体細胞の捕捉チップ。

【請求項6】

上部硬質材料と下部硬質材料とを重ねる工程１と、
前記上部硬質材料と下部硬質材料が重なった一端に厚鋼板を塞いで締め具で括り付け、前記上部硬質材料と下部硬質材料が重なった他端に薄鋼板を塞いで締め具で括り付け、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に楔状溝を形成する工程２と、
前記上部硬質材料及び下部硬質材料の側辺をポリジメチルシロキサンで封止しベーキングして、ヒト液体のサンプルが前記上部硬質材料及び下部硬質材料の側辺から流れ出さないようにする工程３と、
更に、前記楔状溝の両端をポリジメチルシロキサンで封止してベーキングし、前記厚鋼板に貫通孔を設けて前記楔状溝の入口を形成し、前記薄鋼板に貫通孔を設けて前記楔状溝の出口を形成し、ヒト液体のサンプルが前記楔状溝の入口から流れ込んで、前記楔状溝の出口から流れ出すようにする工程４と、
を備え、
工程１において、前記上部硬質材料及び下部硬質材料の表面に、ナノ粒子層や、ナノファイバ層、細胞と接触面との摩擦力の増大に寄与するマイクロナノ構造が１層堆積され、
前記厚鋼板の厚さは５０〜２００μｍであり、前記薄鋼板の厚さは１〜５０μｍであることを特徴とするマイクロ流体細胞の捕捉チップの製作方法。

【請求項7】

前記楔状構造の入口及び出口に、それぞれヒト液体のサンプルを通過させる孔針を挿す工程５を更に備える請求項６に記載の製作方法。

【請求項8】

前記溝は、幅が０．０５〜２００ｍｍであり、長さが１〜５００ｍｍである請求項６に記載の製作方法。

【請求項9】

前記ナノ粒子層又はナノファイバ層は、ナノＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２又はＦｅ_２Ｏ_３である請求項６に記載の製作方法。

【請求項10】

前記上部硬質材料又は下部硬質材料の少なくとも１つの表面に免疫仕上げを行い、少なくとも１つの標的細胞の分子特異性を認識できる請求項６に記載の製作方法。

【請求項11】

前記少なくとも１つの表面に仕上げを行う工程としては、無水エタノールで４％の３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン溶液を調合してチップの溝に満たし、常温で１時間反応させた後、無水エタノールで５分間洗浄する工程１と、ジメチルスルホキシドで蛋白質架橋剤の４−マレイミド酪酸−Ｎ−スクシンイミジルを１μｍｏｌ／ｍＬの溶液に調合してチップの溝に注入し、常温で４５ｍｉｎ反応させた後、無水エタノールで５分間洗浄する工程２と、リン酸塩緩衝液で５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン溶液を調合してチップの溝に注入して、４℃の冷蔵庫において一晩反応させた後でｐＨ＝７．２〜７．４のリン酸塩緩衝液で５分間洗浄する工程３と、上皮細胞接着分子溶液をチップの溝に注入し、常温で１〜２時間静置反応させた後、ＰＢＳで溝を５分間洗浄する工程４と、を含む請求項１０に記載の製作方法。

【請求項12】

前記上部硬質材料及び下部硬質材料の何れも、ガラス又はアクリル材料である請求項６に記載の製作方法。

【請求項13】

請求項６乃至１２のいずれか１項に記載の製作方法で製作されたマイクロ流体細胞の捕捉チップ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞捕捉ツール及びその調製方法に関し、特に、腫瘍診断、補助治療、及び生化学分析検討の有利なツールとして用いられる、循環腫瘍細胞を分離・濃縮・認識するマイクロ流体細胞の捕捉チップ及びその調製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、腫瘍診断は、一般的に、大量の病的状態に基づいて行われる。例えば、生検や直腸癌の指診のような方法としては、一般的に、侵入性分析をとるが、ある程度の外傷性を有するので、患者には好ましくない。

【0003】

また、例えば、血清学的パラメータ（ＰＳＡ量）検出のような、末梢血中の分子バイオマーカーをとって検査することもあるが、その感度及び特異性の何れも好ましくないので、癌の診断・治療でよい効果を得ることは困難である。

【0004】

数多くの癌患者にとって、死亡の原因は、主に転移性腫瘍である。手術で患者の主要な腫瘍を切除した後、従来の検出手段では、適時な治療状況の反映、転移性腫瘍の同定、及び後の放射線治療・化学治療過程の指針作成が難しいため、患者が治療の最適時機を失い、無効な治療及び投薬計画を適時且つ効果的に調整できない。そのため、全ての転移性腫瘍をうまく治療できず、患者が最終的に死亡してしまう。臨床の角度から見れば、転移性腫瘍を癌が自然に進行したことによる最終的な結果と見なしてもよい。

【0005】

非外傷性過程で患者から腫瘍細胞サンプルを抽出するツールの開発が望まれている。

【0006】

循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ；ＣＴＣｓ）とは、極めて低いレベルで血液中に存在する生体固形癌腫瘍細胞である。循環腫瘍細胞の研究の発展につれて、これらの細胞の濃縮・同定が既に癌診断の１つの補助方法となっている。監督管理機構（例えば、アメリカ食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ；ＦＤＡ））は、既に循環腫瘍細胞捕捉、同定システムに基づいたある臨床応用を許可した。

【0007】

体液中の循環腫瘍細胞を分離・濃縮し、腫瘍細胞を拡散させるために、このような細胞サイズ、表面分子発現等の特徴に基づく、いくつかの捕捉、濃縮方法（例えば、多孔質濾過膜、免疫磁気ビーズ濃縮法）が開発されている。

【0008】

従来の多孔質濾過膜は、（１）孔径が単一で、実際の臨床病者の細胞サイズの多様性に合わず、漏れる現象があり、（２）試薬の消費量が高く、後期の同定作業を行いにくく、（３）詰まり現象になりやすく、実験の結果に影響を与えてしまい、（４）専用濾過膜の調製プロセスが複雑で、コストが高いという欠点を有する。

【0009】

免疫的認識濃縮法としては、主に、磁気ビーズ濃縮及びチップ濃縮の２つがある。生物の複雑性と多様性により、体液中の腫瘍細胞では細胞特徴認識基が退化し、免疫的認識の効率が低下して、偽陰性又は偽陽性になる可能性がある。磁気ビーズ濃縮とチップ濃縮の何れも、細胞と免疫的認識基との接触確率が大きくなく、結合が弱いので、最後の検出及び診断状況に影響を及ぼす。それと同時に、このようなチップは、コストが高く、加工しにくい。そこで、既存の循環腫瘍細胞の分離・濃縮方法を改善する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の解决しようとする技術問題は、既存技術の侵入によるサンプリング等の問題を解决した、ヒト液体のサンプルから希少な細胞を分離・濃縮可能なマイクロ流体細胞の捕捉チップを提出することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の技術問題を解决するための技術案は、上部硬質材料及び下部硬質材料を含み、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に、入口及び出口を有する溝が形成され、前記上部硬質材料及び下部硬質材料の少なくとも１つが透明材であるマイクロ流体細胞の捕捉チップにおいて、前記溝の入口から出口までの高さが高い点から低い点へと次第に過渡し楔状となり、又は溝の一部の領域が楔状となり、前記溝の最低点が少なくとも１つの標的細胞のサイズに近似し又は未満であるマイクロ流体細胞の捕捉チップを提供するものである。

【0012】

本発明のさらなる改善としては、前記溝は、幅が０．０５〜２００ｍｍであり、長さが１〜５００ｍｍである。

【0013】

本発明のさらなる改善としては、前記溝の上下の底面に、ナノＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２又はＦｅ_２Ｏ_３の等のナノ粒子層や、ナノファイバ層、細胞と接触面との摩擦抵抗の増大のためのマイクロナノ構造が１層堆積される。

【0014】

本発明のさらなる改善としては、前記上部硬質材料又は下部硬質材料の少なくとも１つの表面に免疫仕上げを行い、少なくとも１つの標的細胞の分子特異性を認識できる。

【0015】

本発明のさらなる改善としては、前記溝の入口において、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に厚さ５０〜２００μｍの鋼板が塞がれ、前記溝の出口において、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に厚さ１〜５０μｍの鋼板が塞がれ、前記溝が前記２つの鋼板の間に形成される。

【0016】

本発明のさらなる改善としては、前記上部硬質材料及び下部硬質材料の何れも、ガラス又はアクリル材料である。

【0017】

本発明の技術問題を解决するための別の技術案は、
上部硬質材料と下部硬質材料とを重ねる工程１と、
前記上部硬質材料と下部硬質材料が重なった一端に厚鋼板を塞いで締め具で括り付け、前記上部硬質材料と下部硬質材料が重なった他端に薄鋼板を塞いで締め具で括り付け、前記上部硬質材料と下部硬質材料との間に楔状溝を形成する工程２と、
前記上部硬質材料及び下部硬質材料の側辺をポリジメチルシロキサンで封止しベーキングして、ヒト液体のサンプルが前記上部硬質材料及び下部硬質材料の側辺から流れ出さないようにする工程３と、
更に、前記楔状溝の両端をポリジメチルシロキサンで封止してベーキングし、厚鋼板に貫通孔を設けて前記楔状溝の入口を形成し、薄鋼板に貫通孔を設けて前記楔状溝の出口を形成し、ヒト液体のサンプルが前記楔状溝の入口から流れ込んで、前記楔状溝の出口から流れ出すようにする工程４と、を備えるマイクロ流体細胞の捕捉チップの製作方法を提供するものである。

【0018】

本発明の製作方法のさらなる改善としては、前記楔状構造の入口及び出口に、それぞれヒト液体のサンプルを通過させる孔針を挿す工程５を更に備える。

【0019】

本発明の製作方法のさらなる改善としては、厚鋼板の厚さは５０〜２００μｍであり、薄鋼板の厚さは１〜５０μｍである。

【0020】

本発明の製作方法のさらなる改善としては、前記溝は、幅が０．００５〜２００ｍｍであり、長さが１〜５００ｍｍである。

【0021】

本発明の製作方法のさらなる改善としては、工程１において、前記上部硬質材料及び下部硬質材料の表面に、ナノＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２又はＦｅ_２Ｏ_３等のナノ粒子層や、ナノファイバ層、細胞と接触面との摩擦力の増大に寄与するマイクロナノ構造が１層堆積される。

【0022】

本発明の製作方法のさらなる改善としては、前記上部硬質材料又は下部硬質材料の少なくとも１つの表面に免疫仕上げを行い、少なくとも１つの標的細胞の分子特異性を認識できる。

【0023】

本発明の製作方法のさらなる改善としては、前記少なくとも１つの表面に仕上げを行う工程としては、無水エタノールで４％の３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン溶液を調合してチップの溝に満たし、常温で１時間反応させた後、無水エタノールで５分間洗浄する工程１と、ジメチルスルホキシドで蛋白質架橋剤の４−マレイミド酪酸−Ｎ−スクシンイミジルを１μｍｏｌ／ｍＬの溶液に調合してチップの溝に注入し、常温で４５ｍｉｎ反応させた後、無水エタノールで５分間洗浄する工程２と、リン酸塩緩衝液で５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン溶液を調合してチップの溝に注入して、４℃の冷蔵庫において一晩反応させた後でｐＨ＝７．２〜７．４のリン酸塩緩衝液で５分間洗浄する工程３と、上皮細胞接着分子溶液をチップの溝に注入し、常温で１〜２時間静置反応させた後、ＰＢＳで溝を５分間洗浄する工程４と、を含む。

【0024】

本発明の製作方法のさらなる改善としては、前記上部硬質材料及び下部硬質材料の何れも、ガラス又はアクリル材料である。

【発明の効果】

【0025】

本発明は、非侵入式で患者からヒト液体のサンプルを得て、ヒト液体のサンプルを微小溝のチップの入口から注入し、微小溝の高さが楔状となるように分布しているので、標的細胞が溝を通過する場合に自動的な分離・濃縮が達成される。本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップは、構造が簡単で、製作しやすく、コストが低く、異なったサイズや特異性分子発現を有する細胞を迅速で効率よく分離・濃縮することができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップの実施例の構造模式図である。

【図2】本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップの縦断面を拡大した模式図である。

【図3】本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップの細胞分離の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明の目的、技術案及びメリットをより明らかにするために、以下、添付図面及び実施例に沿って、本発明を更に詳しく説明する。ここで述べた具体的な実施例は、本発明を解釈するためのものだけであり、本発明を制限するためのものではないことは理解されるべきである。

【0028】

図１〜図３に示すように、本発明の実施例では、マイクロ流体細胞２００を捕捉するためのマイクロ流体細胞の捕捉チップ１００を提供する。当該マイクロ流体細胞の捕捉チップ１００は、上部透明ガラス１０及び下部透明ガラス２０を含み、当該上部透明ガラス１０と下部透明ガラス２０との間に、入口３２及び出口３４を有し、入口３２から出口３４までの高さが高い点から低い点へと次第に過渡し楔状となり又は溝の一部の領域が楔状となり、最低点が少なくとも１つの標的細胞のサイズに近似し又は未満である溝３０が形成される。本実施例において、マイクロ流体細胞２００は、循環腫瘍細胞である。本実施例において、本発明のこれらの透明ガラスに限定されず、例えば、アクリル材料のような透明の硬質材料によって取って代わられてもよく、また、上部透明ガラス及び下部透明ガラスも１つの透明の硬質材料及び１つの非透明の硬質材料によって取って代わられてもよく、つまり、両者の一方が透明の硬質材料であればよい。

【0029】

当該溝３０は、幅が０．０５〜２００ｍｍであり、長さが１〜５００ｍｍである。当該上部透明ガラス１０又は下部透明ガラス２０の少なくとも１つの表面に表面仕上げを行ってもよい。当該少なくとも１つの表面に表面仕上げを行う工程としては、無水エタノールで４％の３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ Ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＭＰＴＭＳ）溶液を調合してチップの溝に満たし、常温で１時間反応させた後、無水エタノールで５分間洗浄する工程１と、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）で蛋白質架橋剤の４−マレイミド酪酸−Ｎ−スクシンイミジル（４‐ｇａｍｍａ-ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ Ｎ-ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ；ＧＭＢＳ）を１μｍｏｌ／ｍＬの溶液に調合してチップの溝に注入し、常温で４５ｍｉｎ反応させた後、無水エタノールで５分間洗浄する工程２と、リン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；ＳＡ）溶液を調合してチップの溝に注入し、そして４℃の冷蔵庫に置いて一晩反応させた後でＰＢＳ（リン酸塩緩衝液、ｐＨ＝７．２〜７．４）溶液で５分間洗浄する工程３と、上皮細胞接着分子（Ａｎｔｉ‐ＥｐＣＡＭ）溶液をチップの溝に注入し、常温で１〜２時間静置反応させた後、ＰＢＳで溝を５分間洗浄する工程４と、を含む。表面仕上げされた後、少なくとも１つの標的細胞の分子特異性抗体を認識できる。当該溝３０の入口３２において、当該上部透明ガラス１０と下部透明ガラス２０との間に厚さ５０〜２００μｍの鋼板４０が塞がれ、当該溝３０の出口３４において、当該上部透明ガラス１０と下部透明ガラス２０との間に厚さ１〜５０μｍの鋼板４０が塞がれ、当該溝が当該２つの鋼板４０の間に形成される。

【0030】

本発明の実施例は、ヒトの有機液体サンプルから細胞を分離・濃縮可能なマイクロ流体細胞の捕捉チップを提供し、当該マイクロ流体細胞の捕捉チップ１００内の溝３０の高さが一定の規律で変化し、且つ溝３０の上下の底面が特別に処理（つまり、当該溝の上下の底面のガラス表面に、厚さ５〜２００ｎｍの、ＴｉＯ_２、ＳｉＯ_２又はＦｅ_２Ｏ_３等のナノフィルムや、ナノファイバ、細胞と接触面との摩擦力の増大に寄与するマイクロナノ構造が１層堆積）されることで、標的細胞の捕捉効率が向上する。本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップは、構造が簡単で、製作しやすく、コストが低く、異なったサイズや特異性分子発現を有する細胞を迅速で効率よく分離・濃縮することができる。

【0031】

本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップ１００は、当該細胞を非手動的に分離・濃縮する。当該細胞は、液体の流れに基づいてマイクロ流体細胞の捕捉チップにおいて自動に分離・濃縮する。本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップは、少なくとも１種の追跡子で当該細胞をマーク・認識する。本発明は、非侵入式で患者からヒト液体のサンプルを得て、ヒト液体のサンプルをマイクロ流体細胞の捕捉チップ１００の入口３２から注入し、溝３０の高さが楔状となるように分布するので、標的細胞が溝３０を通過する際に自動的な分離・濃縮が達成される。

【0032】

本発明は、更に、
上下の２つの透明ガラス１０、２０を重ねる工程１と、
２つのガラスが重なった一端に厚さ５０〜２００μｍの精密鋼板４０を塞いで締め具で括り付け、２つのガラスが重なった他端に厚さ１〜５０μｍの精密鋼板を塞いで締め具で括り付け、２つのガラスの間に楔状溝３０を形成する工程２と、
２つのガラスの側辺をポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ；ＰＤＭＳ）で封止して、加熱ステージにおいてベーキングし、ヒト液体のサンプルがガラスの側辺から流れ出さないようにする工程３と、
更に、当該楔状溝の両端をポリジメチルシロキサンで封止しベーキングし、両端に孔を抜けて、ヒト液体のサンプルが図１に示す楔状溝３０の入口３２から流れ込んで出口３４から流れ出すようにする工程４と、
図１に示す楔状溝３０の入口３２及び出口３４のそれぞれにヒト液体のサンプルを通過させる孔針を挿す工程５と、
を備えるマイクロ流体細胞の捕捉チップの製作方法を提供する。これにより、当該マイクロ流体細胞の捕捉チップは、製作終了である。

【0033】

実験原理：
（１）図１に示すように、本発明では、楔状溝の構造に設計し、２つのガラスの間に溝幅０．０５〜２００ｍｍ、溝長さＷ〜５００ｍｍの楔状溝を形成し、
（２）本発明の楔状溝の入口高さが５０〜２００μｍで、出口高さが１〜５０μｍであり、ヒト液体のサンプルが入口を介して楔状溝に流れ込むと、流体空間の制限で、ヒト液体のサンプルに伴って流れ込んだ標的捕捉細胞が特定の位置で挟まれ、
（３）この実験の基本的な考え方は、検出される患者のヒト液体のサンプルが本発明の楔状マイクロ流体細胞の捕捉チップを通過し、最終に異なったサイズの標的細胞が溝を通過する際に自動的な分離・濃縮を達成するものである。

【0034】

実験工程：
（１）発明の製作方法によって、図１に示す微小流動つきの楔状循環腫瘍細胞の捕捉チップを製作する。
（２）検出されるヒト液体のサンプルを上記チップの入口から注入し、チップの出口で標的細胞が分離したヒト液体のサンプルを収集する。
（３）続いて、入口でリン酸塩緩衝溶液（つまり、ＰＢＳ溶液、ｐＨ＝７．２〜７．４、ＮａＣｌ １３７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣ１ ２．７ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ４．３ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １．４ｍｍｏｌ／Ｌ）を加えて洗浄する。
（４）続いて、入口で追跡標識物（例えば、ＤＡＰＩ又はＨｏｅｃｈｓｔ染料のような細胞核染色用の蛍光色素）や免疫試薬を選択して加え、標的細胞を認識する。
（５）入口でＰＢＳを更に加えて洗浄する。
（６）チップを顕微鏡に置いて捕捉した標的細胞を観察する。

【0035】

実験効果分析
（１）、図２に示すように、それぞれ領域１、領域２、領域３、領域４の４つの観測点を選択し、標的細胞の上記チップでの分離・濃縮が見られる。
（２）、上記４つの領域の４つの観測点で観測した標的細胞の分布により、標的細胞の分離・濃縮は、標的細胞のサイズと楔状溝のサイズとの相互作用の結果であり、大サイズの細胞が出口から離れた箇所に濃縮され、小サイズの細胞が出口に近い箇所に濃縮されることが見られる。
（３）、本実験は、異なったサイズの標的細胞の分離、捕捉を達成でき、操作が簡単で、再現性が高い。
（４）、本実験装置に使用する楔状マイクロ流体細胞の捕捉チップは、構造が簡単で、製作しやすく、コストが低く、異なったサイズや特異性分子発現を有する細胞を迅速で効率よく分離・濃縮することができる。

【0036】

本発明によれば、非侵入式で患者からヒト液体のサンプルを得て、ヒト液体のサンプルを微小溝のチップの入口から注入する。微小溝の高さが楔状となるように分布しているので、標的細胞が溝を通過する際に、標的細胞の自動的な分離・濃縮が達成される。本発明のマイクロ流体細胞の捕捉チップは、構造が簡単で、製作しやすく、コストが低く、異なったサイズや特異性分子発現を有する細胞を迅速で効率よく分離・濃縮することができる。

【0037】

以上は、本発明の好ましい実施例だけであり、本発明を制限するためのものではなく、本発明の精神や原則で加えた如何なる修正や、同等な取替え及び改善等の何れも、本発明の保護範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】