特許 6164637 生体試料標識用蛍光プローブ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6164637

(24)【登録日】2017年6月30日

(45)【発行日】2017年7月19日

(54)【発明の名称】生体試料標識用蛍光プローブ

(51)【国際特許分類】

   C09K 11/56 20060101AFI20170710BHJP

   C09K 11/08 20060101ALI20170710BHJP

   G01N 33/551 20060101ALI20170710BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20170710BHJP

【ＦＩ】

   C09K11/56CPC

   C09K11/08 D

   C09K11/08 G

   G01N33/551

   G01N21/78 C

【請求項の数】2

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2013-60365(P2013-60365)

(22)【出願日】2013年3月22日

(65)【公開番号】特開2014-185224(P2014-185224A)

(43)【公開日】2014年10月2日

【審査請求日】2016年3月18日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１）第３９回日本臓器保存生物医学会学術集会 プログラム・抄録集 第１９巻第２号第（２３９）１０９頁 日本臓器保存生物医学会 発行年月日 平成２４年１０月２０日 （２）日本化学会第９３春季年会（２０１３）プログラム２Ｇ１−３６ 公益社団法人日本化学会 発行年月日 平成２５年３月８日

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人名古屋大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000017

【氏名又は名称】特許業務法人アイテック国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】湯川 博

(72)【発明者】

【氏名】西 弘泰

(72)【発明者】

【氏名】鳥本 司

(72)【発明者】

【氏名】馬場 嘉信

【審査官】 仁科 努

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−１４６００８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０３１１１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２１５４６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１４６１５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／００９６１２８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−１０１４９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０８２６２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−２１６６０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０７１１３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０２６７４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 笹村哲也等，低毒性元素からなる新規半導体ナノ粒子の作製と光機能材料への応用，日本写真学会誌，日本，２０１０年，７３巻６号，290-296

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０９Ｋ １１／５６

Ｃ０９Ｋ １１／０８

Ｇ０１Ｎ ２１／７８

Ｇ０１Ｎ ３３／５５１

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

半導体ナノ粒子を含む生体試料標識用蛍光プローブであって、
前記半導体ナノ粒子は、
コアと該コアを取り囲むシェルとを備えたコアシェル構造の半導体ナノ粒子であって、
前記コアが（ＡｇＩｎ）_xＺｎ_2(1-x)Ｓ₂（ｘは０．４≦ｘ≦０．９５を満たす）であり、
前記シェルがＺｎＳ又はＺｎＯであり、
前記シェルの表面に親水性の官能基を有し、
前記親水性の官能基は、カルボキシル基若しくはその塩、又は、スルホ基若しくはその塩である、
生体試料標識用蛍光プローブ。

【請求項2】

ｘは０．８≦ｘ≦０．９を満たす、
請求項１に記載の生体試料標識用蛍光プローブ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、半導体ナノ粒子及び生体試料標識用蛍光プローブに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞のイメージング技術は、細胞動態を解明する上で重要な技術である。これまでに様々な色素を用いた細胞イメージングが開発されてきたが、近年では高い発光量子収率や高い吸光係数、広い吸収領域、高い耐久性を合わせ持つ量子ドットを用いた細胞イメージングが注目されている。しかしながら、量子ドットを用いたイメージングでは、毒性が懸念されるカドミウム（Ｃｄ）を含んだ粒子を用いていることが多く、毒性の低い代替元素を用いた高輝度量子ドットの開発が望まれている。こうした状況下、例えば、特許文献１や非特許文献１，２には、ＺｎＳ−ＡｇＩｎＳ₂固溶体（ＺＡＩＳ）の半導体ナノ粒子にスルホ基（−ＳＯ₃Ｈ）を導入した水溶性の半導体ナノ粒子が報告されている。スルホ基を導入するとナノ粒子は水溶性になり細胞へ取り込まれやすくなることから、細胞イメージングに用いられる量子ドットとしての利用が期待される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００９−２１５４６５公報（実施例１，２）

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Chemistry Lett. 2008, vol.37, p700-701

【非特許文献2】Electrochemistry 2011, vol.79, p790-792

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、非特許文献２に記載されているように、ＺＡＩＳにスルホ基を導入した後の半導体ナノ粒子の発光量子収率は８％に過ぎず、ＺＡＩＳにスルホ基を導入する前の発光量子収率（約２０％）に比べて大きく落ち込んでしまうという問題があった。一方、ＺＡＩＳをコアとし、ＺｎＳをシェルとするコアシェル構造の半導体ナノ粒子も知られている（例えば特開２０１０−３１１１５号公報）が、これらを細胞イメージングに利用する具体的な技術についてはこれまでのところ報告されていない。

【0006】

本発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、毒性が低く発光量子収率が高い半導体ナノ粒子を提供することを主目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上述した目的を達成するために、本発明者らは、ＺＡＩＳをコアとしＺｎＳをシェルとするコアシェル構造の半導体ナノ粒子のシェルの表面を種々の分子で修飾してその性質を調べた。そうしたところ、親水性の官能基を有する分子で修飾したものが細胞イメージングに用いられる量子ドットとして有用であることを見いだし、本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本発明の半導体ナノ粒子は、コアと該コアを取り囲むシェルとを備えたコアシェル構造の半導体ナノ粒子であって、前記コアが（ＡｇＩｎ）_xＺｎ_2(1-x)Ｓ₂（ｘは０．４≦ｘ≦０．９５を満たす）であり、前記シェルがＺｎＳ又はＺｎＯであり、前記シェルの表面に親水性の官能基を有しているものである。

【0009】

また、本発明の生体試料標識用蛍光プローブは、上述した半導体ナノ粒子を含むものである。

【発明の効果】

【0010】

本発明の半導体ナノ粒子は、毒性が低く発光量子収率が高い。そのため、細胞イメージングに用いられる量子ドットとして適しており、生体試料標識用蛍光プローブとしての利用価値が高い。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の半導体ナノ粒子の合成手順の一例を示す説明図。

【図2】毒性試験の結果を示すグラフ。

【図3】毒性試験の結果を示すグラフ。

【図4】増殖試験の結果を示すグラフ。

【図5】分化誘導試験の結果を示す写真。

【図6】細胞標識に関する写真。

【図7】細胞標識に関する写真。

【図8】吸収スペクトル及び発光スペクトルのグラフ。

【図9】ＺｎＳ−ＺＡＩＳ（ｘ＝０．４〜１．０）の発光量子収率と発光ピーク波長（λ_PL）との関係を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の半導体ナノ粒子は、コアと該コアを取り囲むシェルとを備えたコアシェル構造の半導体ナノ粒子であって、前記コアが（ＡｇＩｎ）_xＺｎ_2(1-x)Ｓ₂（ｘは０．４≦ｘ≦０．９５を満たす）であり、前記シェルが、ＺｎＳ又はＺｎＯであり、前記シェルの表面に親水性の官能基を有しているものである。

【0013】

本発明の半導体ナノ粒子は、コアが（ＡｇＩｎ）_xＺｎ_2(1-x)Ｓ₂である。ｘは０．４≦ｘ≦０．９５である。この範囲であれば、発光量子収率が比較的高いからである。ｘは０．８≦ｘ≦０．９であることが好ましい。この場合、発光量子収率が非常に高い値になると共に、発光波長が７００〜９００ｎｍであり、生体の分光学的窓に入るためin vivo動態の解明に役立つからである。

【0014】

本発明の半導体ナノ粒子は、シェルがＺｎＳ又はＺｎＯである。このうち、ＺｎＳが好ましい。シェルの膜厚は、発光量子収率をより向上させることを考慮すると、０ｎｍより厚く５０ｎｍ以下であることが好ましく、０ｎｍより厚く１．０ｎｍ以下であることがより好ましく、０ｎｍより厚く０．５ｎｍ以下であることが特に好ましい。

【0015】

本発明の半導体ナノ粒子は、シェルの表面に親水性の官能基を有している。親水性の官能基としては、例えば、カルボキシル基（−ＣＯ₂Ｈ）やその塩、スルホ基（−ＳＯ₃Ｈ）やその塩、四級アンモニウム塩などが挙げられるが、このうちカルボキシル基、スルホ基及びそれらの塩が好ましく、生体への取り込みを考慮するとカルボキシル基及びその塩がより好ましい。なお、塩としては、アルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩が挙げられる。また、シェルの表面には、前出の親水性の官能基（第１の官能基）とシェルの表面に結合可能な官能基（第２の官能基）とを有する二官能性分子が第２の官能基にてシェルの表面に結合していることが好ましい。なお、シェルの表面への結合の様式は、特に限定されるものではないが、例えば共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、ファンデルワールス結合等の化学結合が挙げられる。第１の官能基については、親水性の官能基として既に説明したとおりである。第２の官能基としては、例えば、硫黄原子を含む官能基や窒素原子を含む官能基などが挙げられる。硫黄原子を含む官能基としては、メルカプト基、アルキルジチオ基等のジスルフィド結合を有する基、アルキルチオ基等のスルフィド結合を有する基、ピリジルチオ基、ジチオカルボキシル基などが挙げられる。窒素原子を含む官能基としては、例えば、イミノ基、アミド基、イミド基、ピリジル基などの窒素原子を含む官能基などが挙げられる。二官能性分子としては、例えば、第１の官能基と第２の官能基とを炭化水素基やエーテル基で連結した構造の分子であることが好ましい。二官能性分子の具体例としては、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプトブタン酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプトプロパンスルホン酸などが挙げられる。

【0016】

本発明の半導体ナノ粒子は、量子サイズ効果が現われる粒径であることが好ましく、具体的には、１００ｎｍ以下が好ましく、５０ｎｍ以下がより好ましく、２０ｎｍ以下が更に好ましい。

【0017】

本発明の半導体ナノ粒子は、例えば以下の手順（１）〜（３）にしたがって合成する（図１参照）。ここでは、シェルがＺｎＳの場合について説明する。
（１）アルキルアミンで修飾された（ＡｇＩｎ）_xＺｎ_2(1-x)Ｓ₂（ｘは０．４≦ｘ≦０．９５を満たす）のナノ粒子、すなわちＺＡＩＳナノ粒子を合成する。
（２）ＺＡＩＳナノ粒子を原料として、アルキルアミンで修飾されたコアシェル構造のＺｎＳ−ＺＡＩＳを合成する。なお、ＺｎＳ−ＺＡＩＳとは、ＺｎＳで被覆されたＺＡＩＳナノ粒子のことをいう。
（３）配位子置換法により、アルキルアミンで修飾されたＺｎＳ−ＺＡＩＳのアルキルアミンを、親水性の官能基を有する分子に置換する。

【0018】

手順（１）では、Ａｇ塩とＩｎ塩とＺｎ塩と硫黄を配位元素とする配位子とを混合して錯体を合成し、その錯体を１００〜３００℃、好ましくは１５０〜２００℃で加熱し、加熱後の物質の表面をアルキルアミンにより修飾する。各塩としては、硝酸塩、酢酸塩、硫酸塩などが挙げられるが、このうち硝酸塩が好ましい。硫黄を配位元素とする配位子としては、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムなどのジアルキルジチオカルバミン酸塩類、１，２−ビス（トリフルオロメチル）エチレン−１，２−ジチオールなどのチオール類、チオアセトアミドなどのチオカルボン酸アミド類などが挙げられるが、このうちジアルキルジチオカルバミン酸塩類が好ましい。各塩の混合比はｘの値に応じて決定すればよい。アルキルアミンとしては、炭素数４〜２０の炭化水素基を有するアミンが好ましい。なお、Ａｇ、Ｉｎ及びＺｎの各ジアルキルジチオカルバミン酸塩を原料として用いる場合には、硫黄を配位元素とする配位子は不要なため、これら３者を混合して加熱し、加熱後の物質の表面をアルキルアミンにより修飾してもよい。

【0019】

手順（２）では、アルキルアミンで修飾されたＺＡＩＳナノ粒子を、酢酸亜鉛とチオアセタミドとアルキルアミンと共に１００〜３５０℃、好ましくは１５０〜２５０℃で加熱する。これにより、ＺＡＩＳナノ粒子の表面がＺｎＳで被覆されてコアシェル構造のＺｎＳ−ＺＡＩＳになると共に、そのシェルの表面がアルキルアミンによって修飾される。なお、手順（１），（２）については、特開２０１０−３１１１５号公報に詳しく説明されている。

【0020】

手順（３）では、アルキルアミンで修飾されたＺｎＳ−ＺＡＩＳを、上述した第１及び第２の官能基を備えた二官能性分子と共に混合撹拌することにより、アルキルアミンを二官能性分子に置換する。二官能性分子は、第２の官能基がシェルの表面に結合し、第１の官能基すなわち親水性の官能基が外側を向く。混合撹拌は、室温で行ってもよいし、加熱して行ってもよい。溶媒は有機相と水相の二相系としてもよく、二相系の場合には相関移動触媒を添加してもよい。この反応によって得られる本発明の半導体ナノ粒子は、水溶性である。

【0021】

本発明の生体試料標識用蛍光プローブは、上述した半導体ナノ粒子を含むものである。この蛍光プローブは、細胞毒性が低い。また、波長７００〜９００ｎｍで発光するようにｘの値を調節することにより、in vivo動態の解明が可能になる。

【実施例】

【0022】

Ａ．親水性の官能基を持つ分子で修飾したＺｎＳ−ＺＡＩＳの合成
１．オレイルアミンで修飾したＺＡＩＳナノ粒子の合成
（１）合成例１
J. Am. Chem. Soc. 2007, vol.129, p12388-12389に記載された手法でＺＡＩＳナノ粒子を合成した。前駆体である（ＡｇＩｎ）_xＺｎ_2(1-x)（Ｓ₂ＣＮ（Ｃ₂Ｈ₅）₂）₄はｘ＝０．８５のものを用いた。
（２）合成例２
以下のようにＺＡＩＳナノ粒子を合成した。Ａｇ（Ｓ₂ＣＮＥｔ₂）（１３．６ｍｇ）、Ｉｎ（Ｓ₂ＣＮＥｔ₂）₃（２９．７ｍｇ）、およびＺｎ（Ｓ₂ＣＮＥｔ₂）₂（６．８ｍｇ）をオレイルアミン（３．０ｍＬ）に分散し、窒素雰囲気下、１８０℃で３０分間加熱した。得られた溶液を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することで大きな粒子を沈殿物として取り除き、上澄みにメタノールを加えて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することでＺＡＩＳナノ粒子（ｘ＝０．８５）を沈殿物として得た。

【0023】

２．ＺｎＳ−ＺＡＩＳの合成
Chem. Commun. 2010, vol.46, p2082-2084を参考にして、以下のようにＺｎＳ−ＺＡＩＳを合成した。上記１．（１）又は（２）に記載した方法、分量で合成したＺＡＩＳナノ粒子全てと、酢酸亜鉛２水和物（１１．８ｍｇ）と、チオアセトアミド（４．０ｍｇ）をオレイルアミン（２．０ｍＬ）に分散させ、窒素雰囲気下、１８０℃で３０分間加熱した。得られた溶液をシリンジフィルタでろ過した後にメタノールを加え、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことによりＺｎＳ−ＺＡＩＳを沈殿物として分離した。

【0024】

３．カルボキシル基を持つ分子で修飾したＺｎＳ−ＺＡＩＳ（ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨ）の合成
Nanoscale 2011, vol.3, p201-211を参考にして、以下のようにＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨを合成した。上記２．に記載した方法、分量で合成したＺｎＳ−ＺＡＩＳ全てをクロロホルム（１．０ｍＬ）に溶解し、３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）（１００ｍＬ）およびテトラメチルアンモニウムヒドロキシド２５％メタノール溶液（７３０μＬ）を含むエタノール（１．０ｍＬ）溶液と混合した。この反応液を窒素雰囲気下、７０℃で５時間加熱した。減圧下で溶媒を取り除き、得られた粗成生物をエタノールに溶解し、クロロホルムを加えて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことにより粒子を沈殿物として分離した。このエタノールに溶解およびクロロホルムを加えて遠心分離するサイクルを数回繰り返し、残留試薬を取り除いた。得られた粒子は減圧下で乾燥し、超純水に溶解してＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨの水溶液とした。

【0025】

４．スルホ基を持つ分子で修飾したＺｎＳ−ＺＡＩＳ（ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ）の合成
（１）合成例１
Chem. Lett. 2008, vol.37, p700-701に記載された手法で、上記２．で合成したＺｎＳ−ＺＡＩＳからＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈを合成した。
（２）合成例２
Nanoscale 2011, vol.3, p201-211を参考にして、以下のようにＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈを合成した。上記２．に記載した方法、分量で合成したＺｎＳ−ＺＡＩＳ全てをクロロホルム（１．０ｍＬ）に溶解し、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳ）（１６４ｍｇ）およびテトラメチルアンモニウムヒドロキシド２５％メタノール溶液（７３０μＬ）を含むメタノール（１．０ｍＬ）溶液と混合した。この反応液を窒素雰囲気下、７０℃で１．５時間加熱した。減圧下で溶媒を取り除き、得られた粗成生物をメタノールに溶解し、クロロホルムを加えて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことにより粒子を沈殿物として分離した。この溶解および遠心分離を数回繰り返し、余分な残留試薬を取り除いた。得られた粒子は減圧下で乾燥し、超純水に溶解してＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈの水溶液とした。

【0026】

以下の毒性試験等で用いたＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈは、合成例２によって得られたものを使用した。

【0027】

Ｂ．毒性試験
毒性試験を以下のように実施した。培養培地（ＦＤ培地：Ｆ１２とＤＭＥＭがそれぞれ５０％ずつ混合されている培地＋２０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を用いて、マウス脂肪組織由来幹細胞（Adipose tissue-derived stem cells：ＡＳＣｓ）を９６ウェルのプレートに１×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で２４時間培養した。その後、維持培地（ＦＤ培地：Ｆ１２とＤＭＥＭがそれぞれ５０％ずつ混合されている培地＋２％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を用いて、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ及びＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨを膜浸透性ペプチドであるオクタアルギニンＲ８とそれぞれ目的の濃度となるように調整して混合し、２０分間静置させた。その後、ＡＳＣｓの培養液を、調整したＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ溶液あるいはＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨ溶液に交換して２４時間培養した。なお、Ｒ８を用いたのは、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃ＨやＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨを細胞に取り込ませやすくするためである。細胞数はＭＴＴアッセイを用いて測定し、無添加の細胞群の細胞数を１００％とした時の細胞数の割合を算出した。その結果を図２及び図３に示す。図２及び図３から明らかなように、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈは５００ｎＭでも細胞毒性は見られず、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨは１０００ｎＭでも細胞毒性は見られなかった。

【0028】

Ｃ．増殖試験
増殖試験を以下のように実施した。上述した培養培地を用いてＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ及びＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨをそれぞれ目的の濃度となるように調整し、その調整した溶液を用いてＡＳＣｓを４時間培養した。これにより、ＡＳＣｓはＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃ＨあるいはＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨによって標識された。その後、通常の培養培地に交換し、標識されたＡＳＣｓを４日間培養した。その後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞数を測定した。ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨで標識されたＡＳＣｓの結果を図４に示す。図４から明らかなように、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨで標識されたＡＳＣｓは、未標識のＡＳＣｓと同程度に増殖した。このことから、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨは細胞増殖に悪影響を与えることがないことがわかった。

【0029】

Ｄ．分化誘導試験
ＤＭＥＭ培地に、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（シグマ社製のＬ−６７６８）、１μＭデキサメタゾン（シグマ社製のＤ−１７５６）、１０μＭインシュリン（シグマ社製のＩ−５５００）、及び１０％ＦＢＳを添加して脂肪細胞分化誘導用培地を調整した。また、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳを添加して脂肪細胞培養用培地を調整した。ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨで標識したＡＳＣｓに、先ず脂肪細胞分化誘導用培地を添加して、３日間培養した。誘導をかけてから３日後に新鮮な分化誘導用培地に取り換え、７日後には脂肪細胞培養用培地に取り換えた。１０日後に新鮮な脂肪細胞培養用培地に取り換え、更に４日間培養した。その後、脂肪組織分化の確認のために、オイルレッドＯ染色を行ったところ、図５に示すように赤色の脂肪滴が確認された。これにより、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨで標識したＡＳＣｓが分化誘導を行うことで脂肪細胞に分化することが確認された。

【0030】

また、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨで標識したＡＳＣｓを分化誘導せずに培養した後、オイルレッドＯ染色を行ったところ、染色はみられなかった。これにより、標識しただけでは脂肪細胞に分化することはないことも確認された。

【0031】

Ｅ．細胞標識
ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨ及びＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ（濃度２５０ｎＭ）でＡＳＣｓを標識した。図６は、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨで標識されたＡＳＣｓの写真であり、（ａ）が光学顕微鏡像、（ｂ）が蛍光顕微鏡像である。また、図７は、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈで標識されたＡＳＣｓの写真であり、（ａ）が光学顕微鏡像、（ｂ）が蛍光顕微鏡像である。図６及び図７の蛍光顕微鏡像では細胞が赤色に発色していることから、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨ及びＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈの両方とも、細胞イメージングに有用であることがわかる。

【0032】

Ｆ．発光量子収率
発光量子収率は、常温での光吸収された光子数に対する発光により放出された光子数の比で表される。発光量子収率の測定は、十分に希釈したＺｎＳ−ＺＡＩＳのクロロホルム溶液、又は水溶性ＺｎＳ−ＺＡＩＳナノ粒子（ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨ）の水溶液を用い、絶対量子収率測定装置により測定した。３６５ｎｍの励起光下での発光量子収率は、ＺｎＳ−ＺＡＩＳを３−メルカプトプロピオン酸で修飾する前後で４７％から３０％（修飾前の約６４％）に変化し、２−メルカプトメタンスルホン酸で修飾する前後で５８％から３５％（修飾前の約６０％）に変化した。なお、修飾する前の発光量子収率に差があるのは、ロット間でバラツキがあるためである。非特許文献２には、ＺＡＩＳを２−メルカプトメタンスルホン酸で修飾する前後で発光量子収率が２０％から８％（修飾前の約４０％）に低下していることと比較すると、ＺｎＳ−ＺＡＩＳでは修飾の前後で発光量子収率の低下が抑えられていることがわかる。

【0033】

ＺｎＳ−ＺＡＩＳを３−メルカプトプロピオン酸で修飾する前後の発光スペクトルを図８に示す。図８には、修飾前のＺｎＳ−ＺＡＩＳの吸収スペクトルも合わせて示した。図８から、発光スペクトルのピーク波長は修飾前後でほとんど変わらないことがわかる。また、図示しないが、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈの発光スペクトルも、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨとほぼ同じ形状であり、発光波長領域は約５００〜９００ｎｍ、発光ピーク波長は約６５０ｎｍであった。

【0034】

シェル表面に親水性の官能基を有していないＺｎＳ−ＺＡＩＳ（ｘ＝０．４〜１．０）の発光量子収率と発光ピーク波長（λ_PL）との関係を図９に示す。ここで、図８を見ると、シェル表面に親水性の官能基を有する場合と有さない場合とで発光ピーク波長がほとんど同じである。この点を考慮すると、シェル表面に親水性の官能基を有する場合も、ｘ＝０．４〜０．９５における発光量子収率と発光ピーク波長（λ_PL）との関係は図９と同じ傾向を示すことが示唆される。つまり、本発明の半導体ナノ粒子において、ｘ＝０．４〜０．９５であれば、比較的量子収率が高いことが示唆される。

【0035】

Ｇ．粒径
ＴＥＭ像から計算した上記２．のＺｎＳ−ＺＡＩＳ自体の粒径は３−４ｎｍであったことから、ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ及びＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨにおけるシェルコア構造のＺｎＳ−ＺＡＩＳ粒子の粒径もこれと同じ大きさと考えられる。

【0036】

Ｈ．水溶液中の挙動
ＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＳＯ₃Ｈ水溶液及びＺｎＳ−ＺＡＩＳ−ＣＯＯＨ水溶液の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。そうしたところ、１０ｎｍ前後に極大値を持つピークが得られた。このことから、いずれの水溶液においても、ナノ粒子が水中で凝集することなく良好に分散していることが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0037】

本発明は、細胞イメージングに用いられる量子ドットに利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】