特許 6166263 ロイシンｔＲＮＡ合成酵素の新規用途（ＮｏｖｅｌｕｓｅｏｆｌｅｕｃｙｌｔＲＮＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6166263

(24)【登録日】2017年6月30日

(45)【発行日】2017年7月19日

(54)【発明の名称】ロイシンｔＲＮＡ合成酵素の新規用途（ＮｏｖｅｌｕｓｅｏｆｌｅｕｃｙｌｔＲＮＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/25 20060101AFI20170710BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170710BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170710BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20170710BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20170710BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20170710BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20170710BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170710BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/25ZNA

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P37/06

   A61P3/10

   A61P3/04

   A61P9/00

   A61P43/00 111

【請求項の数】1

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2014-531729(P2014-531729)

(86)(22)【出願日】2012年9月24日

(65)【公表番号】特表2014-527827(P2014-527827A)

(43)【公表日】2014年10月23日

(86)【国際出願番号】KR2012007656

(87)【国際公開番号】WO2013043012

(87)【国際公開日】20130328

【審査請求日】2015年9月3日

(31)【優先権主張番号】10-2011-0095893

(32)【優先日】2011年9月22日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】514070937

【氏名又は名称】メディシナル バイオコンバージェンス リサーチ センター

(74)【代理人】

【識別番号】100086759

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 喜平

(74)【代理人】

【識別番号】100109128

【弁理士】

【氏名又は名称】岡野 功

(74)【代理人】

【識別番号】100112977

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 有子

(74)【代理人】

【識別番号】100100608

【弁理士】

【氏名又は名称】森島 なるみ

(74)【代理人】

【識別番号】100142099

【弁理士】

【氏名又は名称】中山 真一

(74)【代理人】

【識別番号】100152803

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 哲也

(74)【代理人】

【識別番号】100154184

【弁理士】

【氏名又は名称】生富 成一

(74)【代理人】

【識別番号】100123548

【弁理士】

【氏名又は名称】平山 晃二

(74)【代理人】

【識別番号】100169535

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 信一郎

(72)【発明者】

【氏名】キム、サンフン

(72)【発明者】

【氏名】ハン、ジュン ミン

【審査官】 中村 勇介

(56)【参考文献】

【文献】 J. Biol. Chem., 2008, 283(45), pp.30482-30492

【文献】 Exp. Mol. Med., 2008, 40(2), pp.229-236

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ１／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

mTORC1媒介疾病の予防及び治療剤のスクリーニング方法であって、
ロイシンtRNA合成酵素(leucyl tRNA synthetase，LRS)及びRagD(RagD GTPase)の混合物に試験製剤を添加して試験混合物を製造する段階；
LRS及びRagDの混合物に試験製剤を添加せずにコントロール混合物を製造する段階；
試験混合物及びコントロール混合物におけるLRS及びRagD間の結合親和度を測定する段階；
試験混合物において測定されたLRS及びRagD間の結合親和度を、コントロール混合物におけるLRS及びRagD間の結合親和度と比較する段階であって、試験混合物におけるLRS及びRagD間の結合親和度が、コントロール混合物におけるLRS及びRagD間の結合親和度よりも少ないことを、試験製剤が、LRS及びRagD間の結合を阻害することを示す指標とする段階；
前記比較にもとづいて、LRS及びRagD間の結合を阻害する試験製剤を検出する段階を含み、
前記mTORC1媒介疾患は、癌、自己免疫疾患、糖尿、肥満及び心血管系疾患からなる群より選ばれた疾患である
mTORC1媒介疾病の予防及び治療剤のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、2011年09月22日付で出願された大韓民国特許出願第10-2011-0095893号に基づく優先権を主張しているものであり、その明細書全体は本出願の参考文献である。

【0002】

本発明は、ロイシンtRNA合成酵素の新規用途に関するもので、より詳細にはLRSをRagD又はRagD GTPaseの結合水準を阻害する試験製剤をスクリーニングするmTORC1媒介疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法、及び細胞内でLRSの発現を抑制する段階を含む対照群細胞に比べて細胞の大きさを減少させる方法に関するものである。

【背景技術】

【0003】

ロイシンは３個の分枝鎖アミノ酸(branched chain amino acid)の内の一つである。他のアミノ酸とは異なり、ロイシンと他の分枝鎖アミノ酸であるイソロイシンとバリンは分枝鎖アミノ酸アミノ基転移酵素(amino transferase)の欠陥により、肝代謝には関与せず、筋肉蛋白質合成に直接的な影響を及ぼす。ロイシンは蛋白質合成の基質として提供されるばかりでなく、蛋白質代謝を調節する強力なシグナルを送る栄養素としても認識される。ロイシンの経口投与がネズミの骨格筋蛋白質合成の比率を増加させ(Crozier SJ、Kimball SR、Emmert SW、Anthony JC、Jefferson LS. Oral leucine administration stimulates protein synthesis in rat skeletal muscle. J Nutr. 135(2005)、pp. 376-382.)、完全食餌からロイシンを取除くと蛋白質合成刺激が阻害された(Stipanuk MH. Leucine and protein synthesis: mTOR and beyond. Nutr Rev. 65(2007)、pp. 122-129.)。ロイシンから誘導された蛋白質合成は、mTOR、Raptor、GβL、Rhebで構成されたmTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)の影響を受ける(Bgaskar PT、Hay N. The two TORCs and Akt. Dev Cell、12(2007)、pp．487-502)。mTORC1は、翻訳過程の速度決定段階であるS6Kと4E-BPをリン酸化して、mRNAsの 5'キャップ構造にて現れる翻訳開始を引起こす(Ma XM、Blenis J. Molecular mechanisms of mTOR-mediated translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 10(2009)、pp 307-318.; Holz MK、Ballif BA、Gygi SP、Blenis J. mTOR and S6K1 mediate assembly of the translation preinitiation complex through dynamic protein interchange and ordered phosphorylation events. Cell 123(2005)、pp 569-580)。

【0004】

mTORC1は、翻訳を調整し、成長因子、細胞内のエネルギー状況、アミノ酸の有効性のようないくつかの上位段階の入力を調節することによる細胞の成長を調節する。TSC（The Tuberous Sclerosis Complex）1とTSC2は、Rasに類似するGTPase，RhebのGTP/GDP交換を制御し、成長因子と細胞内エネルギー信号のmTORC1への伝達を調節する。GTPに結合した時、RhebはmTORC1と相互作用して活性化し(Tee AR、Manning BD、Roux PP、Cantley LC、Blenis J. Tuberous sclerosis complex gene products、Tuberin and Hamartin、control mTOR signaling by acting as a GTPase-activating protein complextoward Rheb. Curr Biol. 13(2003)、pp. 1259-1268.)、アミノ酸の有効性を含む全ての信号伝達により、mTORC1の活性に対する必要性が発生する。これとは対照的にTSC1-TSC2は、アミノ酸によるmTORC1の調節に不要であり、TSC2が欠乏した細胞では、mTORC1の経路はアミノ酸欠乏に敏感ではあるが、成長因子の除去(withdrawal)には抵抗性がある(Roccio M、Bos JL、Zwartkruis FJT.Regulation of the small GTPase Rheb by amino acids.Oncogene.25(2006)、pp.657-664)。

【0005】

最近、GTP結合蛋白質のRasファミリーの構成源であるRag GTPaseが、mTORC1経路のアミノ酸に特定の調節者として知られている(Sancak Y、Bar-Peled L、Zoncu R、Markhard AL、Nada S、Sabatini DM. Ragulator-Rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell 141(2010)、pp. 290-303.)。哺乳類から発現する４個のRag蛋白質、RagA、RagB、RagC及びRagDは、RagA又はRagBとRagC又はRagDで構成されたヘテロダイマーである。RagAとRagBは、RagCとRagDのように互いに極めて類似していて、機能的に重複している(Schurmann A、Brauers A、Massmann S、Becker W、Joost HG. Cloning of a Novel Family of Mammalian GTP-binding Proteins(RagA、RagBs、RagB1)with Remote Similarity to the Ras-related GTPases. J Biol Chem. 270(1995)、pp. 28982-28988.)。Ragヘテロダイマーは、GTP結合RagBを含み、mTORC1と相互作用して、アミノ酸はRagBとGTPの投入を増進させることにより、mTORC1-Ragの相互作用を誘導し、これはmTORC1の構成要素であるRaptorsと直接の相互作用を可能にする(Sancak Y、Bar-Peled L、Zoncu R、Markhard AL、Nada S、Sabatini DM. Ragulator-Rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell 141(2010)、pp. 290-303.; Kim E、Goraksha-Hicks P、Li L、Neufeld TP、Guan KL. Regulation of TORC1 by Rag GTPases in nutrient response. Nat Cell Biol. 10(2008)、pp. 935-945.)。アミノ酸によるmTORC1経路の活性化は、知られていない位置から、後期エンドソームとリソソーム全てのマーカー(marker)である（Bucci C、Thomsen P、Nicoziani P、MeCarthy J、van Deur b.Reb7:A Key to Lysosome Biogenesis. Mol Biol Cell、11(2000)、pp．467-480)、Rab7を含む区域へのmTORC1の移動と関連がある(Sancak Y、Peterson TR、Shaul YD、Lindquist RA、Thoreen CC、Bar-Peled L、Sabatini DM. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science 320(2008)、pp. 1496-1501.)。最近の調査によれば、アミノ酸は、RagGTPaseがあるリソソームへのmTORC1の移動を誘導する。MAPKSP1、ROBLD3、さらに、cllorf59遺伝子産物で構成された調節複合体は、RagGTPaseと相互作用して、これらをリソソームに集め、それは、mTORC1活性化に必須的である(Sancak Y、Bar-Peled L、Zoncu R、Markhard AL、Nada S、Sabatini DM. Ragulator-Rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell 141(2010)、pp. 290-303.)。しかしながら、細胞内ロイシンがmTORC1の活性化を如何に認識して、Rag GTPaseのGTP/GDP循環がmTORC1活性化のためアミノ酸によりどれ程調節されるかは知られていない。

【0006】

アミノアシル-tRNA合成酵素(ARSs)は、細胞性蛋白質合成及び生存に必須的な酵素であり、特定アミノ酸でそれらの同族tRNAsへの結合を触媒する。酵素反応は、アミノ酸の活性化とtRNAのアミノアシル化に対するATP-PPi交換反応の２段階に分離される(Park S、Ewalt K、Kim S、Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: New perspectives on housekeepers. Trends Biochem Sci. 30(2005)、pp. 569-574.)。アミノ酸配列の整列と構造的特性に基づいて、ARSsは、二つのクラスに分かれている(Eriani G、Delarue M、Poch O、Gangloff J、Moras D. Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motif. Nature 347(1990)、pp. 203-206.; Burbaum JJ、Schimmel P. Structural relationships and the classification of aminoacyl-tRNA synthetases. J Biol Chem. 266(1991)、pp. 16965-16968.)。クラスＩ合成酵素は、２個の共通配列、つまり、HIGH(His-Ile-Gly-His)とKMSKS(Lys-Met-Ser-Lys-Ser)モチーフを共有し、ヌクレオチド結合ロスマンホルド(Rossman fold)を形成する(Arnez JG、Moras D. Structural and functional considerations of the aminoacylation reaction. Trends Biochem sci. 22(1997)、pp. 211-216.)。これと対照的に、クラスＩＩ合成酵素は、ロスマンホールドを含まずに、極めて異なる触媒ドメインを共有する(Cusack S、Hartlein M、Leberman R. Sequence、structure and evolutionary relationships between class 2 aminoacyl-tRNA synthetases. Nucl Acids Res. 19(1991)、pp. 3489-3498.)。ロイシン-tRNA合成酵素(LRS)は、HIGHとKMSKSモチーフに特徴のあるクラスＩ酵素である(Cusack S、Yaremchuk A、Tukalo M. The 2Å crystal structure of leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-adenylate analogue. EMBO J. 19(2000)、pp. 2351-2361.)。構造的に、LRSは、両者間のロスマンホールドとCP1、tRNA結合アンチコドンドメイン、さらに、Ｃ-末端エクステンションドメインと称される膨大な挿入ドメインの触媒作用ドメインで構成されている(Cusack S、Yaremchuk A、Tukalo M. The 2Å crystal structure of leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-adenylate analogue. EMBO J. 19(2000)、pp. 2351-2361.)。高等の真核細胞において、LRSは、９個の相異するtRNA合成酵素と３個の非酵素的構成要素であるp18/AIMP3、p38/AIMP2、さらに、p43/AIMP1で構成されたARS複合体の構成要素として存在する(Lee SW、Cho BH、Park SG、Kim S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation. J Cell Sci. 117(2004)、pp. 3725-3734.; Park S、Ewalt K、Kim S、Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: New perspectives on housekeepers. Trends Biochem Sci. 30(2005)、pp. 569-574.; Park SG、Schimmel P、Kim S. Aminoacyl tRNA synthetases and their connections to disease. Proc Natl Acad Sci USA 105(2008)、pp. 11043-11049.)。これは、LRSのＣ-末端ドメインが、ARS複合体の他の構成要素との相互作用に重要であることを示す(Ling C、Yao YN、Zheng YG、Wei H、Wang L、Wu XF、Wang ED. The C-terminal appended domain of human cytosolic leucyl-tRNA synthetase is indispensable in its interaction with arginyl-tRNA synthetase in the multi-tRNA synthetase complex. J Biol Chem. 280(2005)、pp. 34755-3463.)。複合体の構成要素の内、それぞれの異なる構成要素は多様な細胞信号伝達過程に関与する(Lee YN、Nechushtan H、Figov N、Razin E. The function of lysyl-tRNA synthetase and Ap4A as signaling regulators of MITF activity in Fc3RIactivated mast cells. Immunity 20(2004)、pp. 145-151.; Park S、Ewalt K、Kim S、Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: New perspectives on housekeepers. Trends Biochem Sci. 30(2005)、pp. 569-574.; Park SG、Schimmel P、Kim S. Aminoacyl tRNA synthetases and their connections to disease. Proc Natl Acad Sci USA 105(2008)、pp. 11043-11049.)。例えば、glutamy-prolyl-tRNA合成酵素（EPRS）は、interferon gamma-activated inhibitor of tranlation（GAIT）複合体の形成により、炎症標的(target inflammatory)mRNAsの翻訳を抑制する(Sampath P、Mazumder B、Seshadri V、Gerber C、Chavatte L、Kinder MT、Dignam JD、Kim S、Driscoll DM、Fox PL. Non-canonical Translational Silencing Activity of Glutamyl-prolyl-tRNA Synthetase. Cell. 119(2004)、pp. 195-208.)。Lysyl-tRNA合成酵素（LRS）とその産物Ap4Aは、遺伝子発現調節による免疫反応で、信号伝達調節者としての機能をする(Lee YN、Nechushtan H、Figov N、Razin E. The function of lysyl-tRNA synthetase and Ap4A as signaling regulators of MITF activity in Fc3RIactivated mast cells. Immunity 20(2004)、pp. 145-151.; Yannay-Cohen N、Carmi-Levy I、Kay G、Yang CM、Han JM、Kemeny DM、Kim S、Nechushtan H、Razin E. LysRS Serves as a Key Signaling Molecule in the Immune Response by Regulating Gene Expression. Mol Cell 34(2009)、pp. 603-611.)。Methionyl-tRNA合成酵素（MRS)とglutaminyl-tRNA合成酵素(QRS)は、tRNA biogenesis(Ko YG、Kang YS、Kim EK、Park SG、Kim S. Nucleolar localization of human methionyl-tRNA synthetase and its role in ribosomal RNA synthesis. J Cell Biol 149(2000)、pp. 567-574.)と、それぞれのanti apoptotic signal調節に関与する(Ko YG、Kim EY、Kim T、Park H、Park HS、Choi EJ、Kim S. Glutamine-dependent antiapoptotic interaction of human glutaminyl-tRNA synthetase with apoptosis signal-regulating kinase 1. J Biol Chem 276(2001)、pp. 6030-6036.)。細胞質（cytosolic）のLRSは、肝癌成長において、潜在的に関連があり(Shin SH、Kim HS、Jung SH、Xu HD、Jeong YB、Chung YJ. Implication of leucyl-tRNA synthetase 1(LARS1)over-expression in growth and migration of lung cancer cells detected by siRNA targeted knock-down analysis. Exp Mol Med. 40(2008)、pp. 229-236.)、ミトコンドリアのLRSは糖尿病に関与する('t Hart LM、Hansen T、Rietveld I、Dekker JM、Nijpels G、Janssen GM、Arp PA、Uitterlinden AG、Jφgensen T、Borch-Johnsen K、Pols HA、Pedersen O、van Duijn CM、Heine RJ、Maassen JA. Evidence that the mitochondrial leucyl tRNA synthetase(LARS2)gene represents a novel type 2 diabetes susceptibility gene. Diabetes. 54(2005)、pp. 1892-1895.; Li R.、Guan MX. Human Mitochondrial Leucyl-tRNA Synthetase Corrects Mitochondrial Dysfunctions Due to the tRNALeu(UUR)A3243G Mutation、Associated with Mitochondrial Encephalomyopathy、Lactic Acidosis、and Stroke-Like Symptoms and Diabetes. Mol Cell Biol. 30(2010)、pp. 2147-2154.)。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは、蛋白質合成に対する触媒作用の機能でないLRSの別の機能について研究した結果、LRSが、mTORC1関連蛋白質であって、アミノ酸から誘導されるmTORC1活性化のための必須の役割をすることを発見した。LRSからロイシン結合能力を除去すれば、アミノ酸へのmTORC1経路が鈍化されるが、LRSは、Rag GTPaseとアミノ酸依存的に直接相互作用して、Rag GTPaseに対してGTPase活性化蛋白質(GAT)として機能し、mTORC1を活性化することを確認して本発明を完成した。

【0008】

従って、本発明の目的は
(ａ）LRS及びRagDを試験製剤と共に又は試験製剤なしに接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｃ）LRSとRagD間の結合親和度の変化を測定する段階を含むmTORC1媒介疾病の予防及び治療剤スクリーニング方法を提供することである。

【0009】

本発明の他の目的は細胞内でLRSの発現を抑制する段階を含む対照群細胞に対する細胞の大きさを減少させる方法を提供することである。

【0010】

本発明の他の目的は
(ａ）LRS及びRagDを試験製剤と共に又は試験製剤なしに接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｃ）LRSとRagD間の結合親和度を阻害する試験製剤を検出する段階を含むmTORC1媒介疾病の予防及び治療剤スクリーニング方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記のような目的を達成するために、本発明は
(ａ）LRS及びRagDを試験製剤と共に又は試験製剤なしに接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｃ）LRSとRagD間の結合親和度の変化を測定する段階を含むmTORC1媒介疾病の予防及び治療剤スクリーニング方法を提供する。

【0012】

本発明の他の目的を達成するために、本発明は細胞内でLRSの発現を抑制する段階を含む対照群細胞に比べて細胞の大きさを減少させる方法を提供する。

【0013】

本発明の他の目的を達成するために、本発明は
(ａ）LRS及びRagDを試験製剤と共に又は試験製剤なしに接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｃ）LRSとRagD間の結合親和度を阻害する試験製剤を検出する段階を含むmTORC1媒介疾病の予防及び治療剤スクリーニング方法を提供する。

【0014】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0015】

本発明は、LRS(leucyl tRNA synthetase)が、mTORC1へのアミノ酸信号伝達の核心媒介体として機能する点を初めて究明した。つまり、本発明は、LRSが、アミノ酸依存的にmTORC1への信号伝達媒介体であるRag GTPaseに直接結合して、Rag GTPaseに対するGTPase-activating protein(GAP)の役割をしてRag GTPaseがmTORC1を活性化させることを見いだした。

【0016】

本発明者らは、ロイシンtRNA合成酵素(leucyl tRNA synthetase、LRS)がアミノ酸から誘導されるmTORC1の活性化において、重要な役割をし、LRSが細胞内のロイシン濃度を感知して、ロイシンから誘導されるmTORC1の活性化に影響を及ぼすことを確認した。より詳しくは、LRSは、アミノ酸依存的にmTORC1への信号伝達媒介体であるRag GTPaseに直接結合し、Rag GTPaseに対するGTPase-activating protein(GAP)の役割をしてmTORC1を活性化することを確認した。

【0017】

定義
他の定義がない限り、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は当業者らにより一般的に理解される同一な意味を有する。次の参考文献は、本発明の明細書に使用された多様な用語の一般的な定義を有する技術の一つを提供する。

【0018】

Singleton et al.、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed.、1988)；及びHale＆Marham、THE HARPER COLINS DICTIONARY OF BIOLOGY
又は下記の定義が、本発明の実施のために、読者の足しになるように提供される。

【0019】

本発明で“発現”とは、細胞からの蛋白質又は核酸の生成を意味する。

【0020】

本発明で“宿主細胞”とは、任意の手段（例えば、電気衝撃法、カルシウムホスファターゼ沈殿法、微細注入法、形質転換法、ウイルス感染法）により、細胞内に導入された異種性DNAを含む原核又は真核細胞を意味する。

【0021】

本発明で“ポリペプチド”は、二以上の“ポリペプチド”又は一又は二以上の“蛋白質”と互換性があるように使用され、例えば、自然状態の蛋白質から一般的に発現するアミノ酸残基の重合体を意味する。

【0022】

本発明で“LRSポリペプチド”は、ロイシンtRNA合成酵素として知られているポリペプチドを意味する。前記LRSポリペプチドは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドでもある（Genbank Accession No.NP_064502.9）。又は本発明のLRSは、これの機能的同等物を含む。

【0023】

前記機能的同等物とは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上の配列相同性（つまり、同一性）を有するポリペプチドを意味する。例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列相同性を有するポリペプチドを含み、配列番号１で表示されるポリペプチドと実質的に同質の生理活性を示すポリペプチドを意味する。ここで、“実質的に同質の生理活性”とは、RagDと結合して、Rag GTPaseに対するGTPase-activating protein(GAP)機能をし、mTORC1を活性化することを意味する。前記機能的同等物は、配列番号１のアミノ酸配列の内、一部が付加、置換又は欠失の結果、生成できるものでもある。前記においてアミノ酸の置換は、好ましくは保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は、下記の通りである；脂肪族アミノ酸(Gly、Ala、Pro)、疎水性アミノ酸(Ile、Leu、Val)、芳香族アミノ酸(Pyr、Tyr、Trp)、酸性アミノ酸(Asp、Glu)、塩基性アミノ酸(His、Lys、Arg、Gln、Asn)、及び硫黄含有アミノ酸（Cys、Met)
前記機能的同等物には、本発明のLRSポリペプチドのアミノ酸配列下で、アミノ酸の一部が欠失された変形体も含まれる。前記アミノ酸の欠失又は置換は、好ましくは、本発明のポリペプチドの生理活性に直接関連しない領域に位置する。さらに、アミノ酸の欠失は、好ましくはLRSポリペプチドの生理活性に直接関与していない部分に位置している。また、前記LRSポリペプチドのアミノ酸配列の両端末又は配列内に、幾つかのアミノ酸が付加された変形体も含まれる。本発明の機能的同等物の範囲には、本発明によるポリペプチドの基本骨格及びこれの生理活性を維持しながら、ポリペプチドの一部化学構造が変形されたポリペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のポリペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度などを変更させるための構造変更がこれに含まれる。

【0024】

本発明において、配列相同性及び同質性は、LRSのアミノ酸配列（配列番号１）と候補配列を整列してギャップ(gaps)を導入した後、LRSのアミノ酸配列に対する候補配列のアミノ酸残基の百分率として定義される。必要な場合、最大百分率の配列の同質性を収得するために、配列の同質性の部分として保存的置換は考慮しない。さらに、LRSのアミノ酸配列のＮ−末端、Ｃ−末端、又は内部における伸長、欠損又は挿入は、配列の同質性又は相同性に影響を及ぼす配列として解析されない。さらに、前記配列の同質性は、二つのポリペプチドのアミノ酸配列の類似した部分を比較するために使用される一般的な標準方法により決定することができる。BLAST又はこのようなコンピュータープログラムは、二つのポリペプチドをそれぞれのアミノ酸が最適にマッチングするように整列させる（一つ又は二つの配列の電場配列に沿って、又は一つ又は二つの配列の予測された部分に沿って）。前記プログラムは、デフォルトオープニングペナルティー(default opening penalty)及びデフォルトギャップペナルティー(default gap penalty)を提供し、コンピュータープログラムと共に、連係して使用し得るPAM250（標準スコーリングマトリックス；Dayhoff et al.、in Atlas of Protein Sequence and Structure、vol 5、supp 3、1978)のようなスコーリングマトリックスを提供する。例えば、同質性の百分率は、次の通りに計算することができる。すなわち、一致する配列の総数に100を掛けた後、二つの配列を整列するために、一致するスパン(matched span)内のより長い配列の長さの和と、その長い配列内に導入されているギャップ数で割る。

【0025】

本発明によるポリペプチドは、天然で抽出するか、又は遺伝工学的方法により作製することができる。例えば、一般的な方法により、前記ポリペプチド又はこれの機能的同等物を符号化する核酸（例えば、LRSの場合配列番号２(Genbank Accession No.NM_020117.9)、RagDの場合配列番号３(Genbank Accession No.NM_021244.4))を作成する。前記核酸は、適切なプライマーを使用して、PCR増幅することにより、作成することができる。他の方法で当業界に公知の標準方法により、例えば、自動DNA合成器(Biosearch又はApplied Biosystems社で販売するもの）を使用して、DNA配列を合成することもできる。作製された核酸は、これに作動可能に連結され、核酸の発現を調節する一つ以上の発現調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含むベクターに挿入され、これより形成された組替え発現ベクターで宿主細胞を形質転換させる。生成された形質転換体を前記核酸が発現されるに適切な培地及び条件下で培養し、培養物から前記核酸により発現した、実質的に純粋なポリペプチドを回収する。前記回収は、当業界に公知の方法（例えば、クロマトグラフィー）を利用して行うことができる。前記で“実質的に純粋なポリペプチド”とは、本発明によるポリペプチドが、宿主細胞から由来した他の如何なる蛋白質も実質的に含まないことを意味する。本発明のポリペプチド合成のための遺伝工学的方法は、下記の文献を参考にすることができる：Maniatis et al.、Molecular Cloning; A laboratory Manual、Cold Spring Harbor laboratory、1982; Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、N.Y.、Second(1998)and Third(2000)Editions; Gene Expression Technology、Method in Enzymology、Genetics and Molecular Biology、Method in Enzymology、Guthrie ＆ Fink(eds.)、Academic Press、San Diego、Calif、1991; 及び Hitzeman et al.、J. Biol. Chem.、255:12073-12080、1990。

【0026】

本発明のポリペプチドは、当業界に公知の化学的合成（creighton Proteins;Structures and Molecular Principles、W．H．Freemanand Co.、NY、1983)により、容易に製造することができる。代表的な方法として、これらに限定されるものではないが、液体又は固体状合成、断片凝縮、F-MOC又はT-BOC化学法が含まれる(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins、Williams et al.、Eds.、CRC Press、Boca Raton Florida、1997; A Practical Approach、Athert on ＆ Sheppard、Eds.、IRL Press、Oxford、England、1989)。

【0027】

本発明で“核酸”、“DNA配列”又は“ポリヌクレオチド”は、単一又は二重の形態からなるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを意味する。他の制限がない限り、自然に生成するヌクレオチドと類似の方法で、核酸に混成される自然のヌクレオチドの公知のアナログも含まれる。

【0028】

本発明で“LRS又は機能的同等物を符号化するポリヌクレオチド”は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を符号化する塩基配列を有するものとすることができる。前記核酸は、DNA、cDNA及びRNA配列を全て含む。つまり、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を符号化する塩基配列を有するか、又は前記塩基配列に相補的な塩基配列を有することができる。好ましくは、配列番号２で表示される塩基配列を有する。前記核酸は、天然で分離されるか又は上述した通り、遺伝工学的方法により製造することができる。

【0029】

本発明で“アナログ”とは、標準物質と構造的に類似するものの、標準物質の特異的な置換基が置換により、代替されることにより標的や調節方法が変形された物質を意味する。標準物質と比較する時、アナログは当業者により予想できる通り、同一又は類似するか又は向上された有用性を有する。向上した性質（例えば、標的物質に対するより高い結合親和力）を有する公知の化合物変異体を究明するためのアナログの構成及びスクリーニングは、化学分野に公知である。

【0030】

本発明で“相同する”とは、蛋白質及び／又は蛋白質配列に言及する場合、共同の祖先蛋白質又は蛋白質配列から自然に又は人為的に由来したことを示す。同様に、核酸及び／又は核酸配列は、それらが共通の祖先核酸、又は核酸配列から自然に又は人為的に由来した時に相同する。

【0031】

本発明で“接触”とは、これの一般的な意味であって、２個以上の製剤（例えば、２個のポリペプチド）を結合させるか、又は製剤と細胞（例えば、蛋白質と細胞）を結合させることを意味する。接触は、試験管内(in vitro)で起こり得る。例えば、試験管又は他のコンテナーで、２個以上の製剤を結合させるか、又は試験製剤と細胞又は、細胞分解物と試験製剤を結合させることである。さらに、接触は、細胞又はインシチュー(in situ)でも起こり得る。例えば、２個のポリペプチドを符号化する組替えポリヌクレオチドを細胞内で共同発現させることにより、細胞又は細胞分解物において２個のポリペプチドを接触させることである。

【0032】

本発明で“製剤(agent)”又は“試験製剤(test agent)”とは、任意の物質、分子、元素、化合物、実在物又はこれらの組合せを含む。例えば、これに制限はされないが、蛋白質、ポリヌクレオチド、小有機物質(small organic molecule)、多糖類、ポリヌクレオチドなどを含む。さらに、自然産物、合成化合物又は化学化合物又は２個以上の物質の組合せでもある。特別の定めのない限り、製剤、物質及び化合物は互換可能に使用することができる。

【0033】

具体的に、本発明のスクリーニング方法でスクリーニングできる試験製剤は、ポリペプチド、ベーターターンミメティック(beta-turn mimetics)、多糖類、燐脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロサイクリック化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマリックＮ-置換グリシン(oligomeric N-substituted glycines)、オリゴカーバメート(oligocarbamates)、糖類、脂肪酸、ピューリン、ピリミジン又はこれらの誘導体、構造的アナログ又は組合せを含む。ある試験製剤は合成物質であり、他の試験製剤は天然物質である。前記試験製剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む広範囲で多様な出所から得ることができる。組合せライブラリーは、ステップ-バイ-ステップ方式で合成できる多様な種類の化合物に生産することができる。多数の組合せライブラリーの化合物は、ESL(encoded synthetic libraries)方法(WO95/12608、WO95/12608、WO93/06121、WO94/08051、WO95/395503及びWO95/30642)により製造することができる。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレー方法(WO91/18980)により製造することができる。バクテリア、カビ、植物及び動物抽出物形態の自然化合物のライブラリーは、商業的な出所から得るか、又はフィールドで収集することができる。公知の薬理学的製剤は、構造的アナログを製造するため、例えばアシル化、アルキル化、エステル化反応、アミド化反応を直接適用したり、あるいは無作為な化学的修飾を適用したりすることができる。

【0034】

前記試験製剤は、自然に生成される蛋白質又はその断片でもある。このような試験製剤は、自然の出所、例えば、細胞又は組織分解物から収得することができる。ポリペプチド製剤のライブラリーは、例えば、一般的な方法により生成されるか、又は商業的に入手できるcDNAライブラリーから収得することができる。前記試験製剤は、ペプチド、例えば、約5-30個、好ましくは約5-20個、さらに、好ましくは約7-15個のアミノ酸を有するペプチドでもある。前記ペプチドは、自然に生成される蛋白質、ランダムペプチド又は“バイアス(biased)”ランダムペプチドの切断物でもある。

【0035】

前記試験製剤は、“核酸”でもある。核酸試験製剤は、自然に生成される核酸、ランダム核酸、又は“バイアス(biased)”ランダムペプチドでもある。例えば、原核又は真核ゲノムの伝達物のために、前述したのと同様に使用することができる。

【0036】

前記試験製剤は、小分子（例えば、約1,000以下の分子量を有する分子）でもある。小分子の調節製剤をスクリーニングするための方法には、高速分析アッセイを適用することができる。多くのアッセイが前記スクリーニングに有用である(Shultz、Bioorg. Med. Chem. Lett.、8:2409-2414、1998; Weller、Mol. Drivers.、3:61-70、1997; Fernandes、Curr. Opin. Chem. Biol.、2:597-603、1998; and Sittampalam、Curr. Opin. Chem. Biol.、1:384-91、1997)。

【0037】

本発明の方法におけるスクリーニング試験製剤のライブラリーは、LRS又はこれの断片であるか、又はアナログに対する構造研究を基に製造することができる。このような構造研究は、LRSに結合する可能性がある試験製剤の究明を可能にする。

【0038】

LRSの３次元的構造は、多様な方法、例えば、結晶学構造及び分子的モデリングに研究することができる。Ｘ-線結晶学を利用する蛋白質構造研究方法が文献においてよく知られている。Physical Bio-Chemistry、Van Holde、K. E.(Prentice-Hall、New Jersey 1971)、pp.221-239、and Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences、D. Eisengerg ＆ D. C. Crothers(Benjamin Cummings、Menlo Park 1979)。

【0039】

LRSの構造に対するコンピユーターモデリングは、スクリーニングするために、試験製剤のデザインのための他の手段を提供する。
分子的モデリング方法は、文献に開示されている：U.S.Pat.No.5,612,894、U.S.No.5,583,973。
蛋白質構造は中性子回折（neutron differaction）及びNMR(nuclear magnetic resonance)により決定できる：Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J.(Prentice-Hall, New Jersey 1972)、NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich(Wiley-Interscience, New York 1986)。

【0040】

以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、
(ａ）LRS及びRagDを試験製剤と共に又は試験製剤なしに接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｃ）LRSとRagD間の結合親和度の変化を測定する段階を含むmTORC1媒介疾病の予防及び治療物質スクリーニング方法を提供する。

【0041】

本発明でRag蛋白質は、Ras small GTPaseの内、Rag下位ファミリーに属し、RagA、RagB、RagB、RagDの４種が存在する。この内、AとBはイーストのGtr1p GTPaseのオーソログ(ortholog)であり、CとDはイーストのGtr2p GTPaseのオーソログである。RagDはA 又はBと共に結合して二量体(dimer)をなし、アミノ酸によるmTORC1活性を媒介する（Trends in Biochemical Sciences,33:565-568,2008）。好ましくは、RagはRagDである。

【0042】

mTORC1は、癌、腸器移植拒否、自己免疫疾患、糖尿、肥満、心血管疾患、神経系異常、老化などの疾患(Drug Discoverry Today,12:112-124,2007)と関連があることが知られている。従って、本発明のmTORC1媒介疾患は、癌、自己免疫疾患、糖尿、肥満、心血管疾患でもあり得る。

【0043】

具体的に、癌はこれらに制限はされないが、黒色腫、白血病、大腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、乳房癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、リンパ腫、再生不良性貧血などを含む。前記でリンパ腫は、ホジキン氏リンパ腫及び非ホジキン氏リンパ腫を全て含み、前躯Ｂ細胞腫瘍(Precursor B-cell neoplasm)のようなＢ型細胞新生物、前躯Ｔ細胞腫瘍のようなＴ細胞とＮＫ細胞新生物及び典型的ホジキン病のようなホジキンリンパ腫(Hodgkin lymphoma,Hodgkin disease)を含む。

【0044】

本発明のスクリーニング方法は、当業界に公知の多様な生化学的及び分子生物学的技術が前記方法を実施するにおいて利用することができる。前記技術は下記の文献に開示されているSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998)and Third(2000)Editions; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York(1987-1999)。

【0045】

好ましくは、前記試験製剤が、まずLRSの生化学的活性を調節する能力があるか、否かを選択的にアッセイする（１次アッセイ段階）。具体的に、１次段階では試験製剤の存在下で分離されたLRSの生物学的活性をアッセイして、前記ポリペプチドの生物学的活性を調節する調節製剤を究明する。より好ましくは下記の段階を含むことができる：
（ａ）試験製剤の存在下でLRSと試験製剤を接触させる段階；
（ｂ）LRSの活性を測定してLRSの活性を変化させる試験製剤を選別する段階。

【0046】

好ましくは、本発明は
(ａ）LRS及びRagDを試験製剤と共に又は試験製剤なしに接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を測定する段階；
(ｃ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｄ）試験製剤がある時のLRS及びRagD間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度の変化を測定する段階で構成することができる。

【0047】

１次アッセイ段階ではLRSの多様な生物学的活性に対する調節がアッセイされる。例えば、試験製剤は、LRSの発現水準、例えば、転写又は翻訳を調節する活性があるかについてアッセイすることができる。前記試験製剤は、LRSの細胞内水準又は安定性、例えば、翻訳後の修飾又は加水分解を調節する活性があるかについてアッセイすることができる。

【0048】

以降、前記１次アッセイ段階を通じてLRSの生物学的活性を増加させる調節製剤を究明した後、前記試験製剤が、Rag、RagD又は(RagD GTPase)と結合する能力があるかをLRSの存在下でテストする（２次試験段階）。

【0049】

前記１次及び２次段階の全てにおいて、損傷のない(intact)LRS及びこれの断片、アナログ、又は機能的同等物を使用することができる。これらアッセイに使用できる断片は、一般的にLRSの生物学的活性を一つ以上保有する。前記断片又はアナログを含む融合蛋白質が、試験製剤のためのスクリーニングに使用される。LRSの機能的同等物は、アミノ酸欠失及び／又は挿入及び／又は置換を有するものの、LRSと同一の生体活性を保有するものであるので、本発明のスクリーニング方法の実施に使用することができる。

【0050】

当業界に一般的に実施されている多様なアッセイらが、LRSを調節する製剤を究明することに使用することができる。好ましくは、前記製剤は、細胞基盤アッセイシステムであって、スクリーニングすることができる。例えば、スクリーニングするための典型的な細胞基盤アッセイにおいて（つまり、２次試験段階で）、試験製剤の存在下でリポーター遺伝子活性（例えば、酵素活性）を測定し、これを試験製剤の不在下でのリポーター遺伝子の活性と比較する。前記リポーター遺伝子は、当業界に公知の任意の検出可能なポリペプチド（反応又はリポーターポリペプチド）、例えば、蛍光又はリン光により検出可能なポリペプチドや、それが保有している酵素活性により検出可能なポリペプチドを符号化することができる。検出可能な反応ポリペプチドは、例えば、ルシフェラーゼ、アルファーグルクロニダーゼ、アルファーガラクトシダーゼ、クロラムペニコールアセチル転移酵素、緑色蛍光蛋白質、強化された緑色蛍光蛋白質及びヒトから分泌されたアルカリ性リン酸化酵素である。

【0051】

細胞基盤アッセイにおいて、試験製剤（例えば、ペプチド又はポリペプチド）は、宿主細胞内に存在する他のベクターにより発現することができる。ある方法では試験製剤のライブラリーが、前記ベクターのライブラリー（例えば、cDNAライブラリー）により符号化される。前記ライブラリーは、当業界に公知の方法を利用して製造することができ(Sambrook et al.and Ausubel et al.,supra)、又は多様な商業的出所から得ることができる。

【0052】

前述した細胞基盤アッセイの他に、非細胞基盤方法によってもスクリーニングすることができる。前記方法は、例えば、モビリティシフトDNA結合アッセイ、メチル化及びウラシル干渉アッセイ、DNase及びヒドロキシラジカルフットプリンティング分析（DNase and hydroxyl radical footprinting analysis)、蛍光偏光(fluorescence polarization)及びＵＶ交叉結合又は化学的架橋剤を含む。一般的な概要はAusubelなどの文献に開示されている(Ausubel et al.,supra,chapter 12,DNA-Protein Interaction)。核酸及びDNA/RNA結合蛋白質を含む共同結合された蛋白質を分離する技術は、切断可能な架橋剤ジチオビス(dithiobis)(succinimidylpropionate)及び3,3'-ジチオビス(succinimidyl-propionate)を含むＵＶ交叉結合又は化学的架橋剤を含む(McLaughlin, Am. J. Hum. Genet., 59:561-569, 1996; Tang, Biochemistry, 35:8216-8225, 1996; Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:10712, 1996; and Chodosh, Mol. Cell. Biol., 6:4723-4733, 1986)。

【0053】

１次アッセイ段階：LRSを調節する製剤のスクリーニング（選択的）
多くのアッセイシステムが、LRSの調節因子のための試験製剤のスクリーニングに適用することができる。前記の通り、前記スクリーニングは、試験管内アッセイシステム又は細胞基盤アッセイシステムを利用することができる。このスクリーニング段階で、試験製剤は、LRSとの結合、LRSの細胞内水準変更、又はLRSの別の生物学的活性の調節についてスクリーニングすることができる。

【0054】

１）LRSに結合する製剤のスクリーニング
１次スクリーニング段階で、LRSと試験製剤の結合を測定することができる。LRSに対する試験製剤の結合は、例えば、標識された試験管内蛋白質−蛋白質結合アッセイ、蛋白質結合を検出するための免疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などのような多様な方法でアッセイすることができる(U.S. Pat. Nos. 4,366,241:4,376,110; 4,517,288 and 4,837,168; and Bevan et al., Trends in Biotechnology, 13:115-122, 1995; Ecker et al., Bio/Technology, 13:351-360, 1995; and Hodgson, Bio/Technology, 10:973-980, 1992)。試験製剤は、LRSとの直接的な結合、例えば、LRSに対する抗体によるLRSポリペプチドとの共同沈殿を検出することにより、確認することができる。さらに、試験製剤は、LRSと試験製剤の結合を表すシグナル、例えば、蛍光ケンチング(quenching)を検出することにより、確認することができる。

【0055】

競争アッセイは、LRSに特異的に結合する試験製剤の究明に適当なフォーマットを提供する。前記フォーマットにおいて、試験製剤は、LRSと結合するものと既に公知の化合物との競争を通じてスクリーニングされる。公知の結合化合物は、合成化合物でもある。さらに、それはLRSを特異的に認識する抗体、例えば、LRSに対する単一クローン抗体でもある。もし、試験製剤が公知のLRSと公知の化合物の結合を阻害すれば、前記試験製剤はLRSにも結合する。

【0056】

多様な種類の競争アッセイが当業界に公知である。例えば、固体状直接又は間接的酵素放射免疫測定法、固体状直接又は間接的酵素免疫測定法、サンドイッチ競争アッセイ（Stahli et al.,Methods in Enzymology,9:242-2453,1983)；固体状直接ビオチン−アビジンEIA(Kirkland et al.,J.Immunol.,137:3619,1986)；固体状直接標識アッセイ、固体状直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane,Antibodies,A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,1988);1251を利用した固体状直接標識RIA(Morel et al.,Mol..Immuno.,25(1);7-15,1988;固体状直接ビオチン−アビジンEIA(Cheung et al.,Virology,176:546-552,1990)；及び直接標識RIA(Moldenhauer et al.,Sacnd.J.ImmunoL.,32;77-82,1990)。一般的に前記アッセイは、非標識化された試験製剤及び標識化された対照化合物を含む細胞，又は固体表面に結合されている精製されたポリペプチドの利用を含む。競争的阻害は、試験製剤の存在下で固体表面又は細胞に結合された標識の量を決定することにより測定される。競争アッセイにより究明された調節製剤は、対照化合物と同一のエピトープに結合する製剤及び立体阻害（steric hindrance）を起らせるために、対照化合物により結合されたエピトープに十分に近接した隣接エピトープと結合する製剤を含む。一般的に競争阻害が過度に存在する時、一般的な標的ポリペプチドに対する対照化合物の特異的な結合が少なくとも50又は75%阻害される。

【0057】

前記スクリーニングアッセイは、不溶性又は溶解性フォーマットでもある。不溶性アッセイの一例は、LRS又はこれの断片を固体状マトリックスで固体化することである。以降、試験製剤が結合するに十分な時間で固体状マトリックスを試験製剤と接触させておく。その後、固体状マトリックスから結合されていない物質を洗浄して除去した後、固体状に結合された製剤の存在を確認する。前記方法は固体状マトリックスから結合された製剤を溶離して製剤を分離する段階を含み得る。両者択一的にLRSを固定化させる他の方法は、試験製剤を固体状マトリックスに結合させてLRSを添加することである。

【0058】

溶解性アッセイは、前記の通り、いくつかの結合ライブラリースクリーニング方法を含む。溶解性アッセイフォーマット下で、試験製剤やLRSは、全て固体支持台に結合しない。試験製剤に対するLRS又はこれの断片の結合は、例えば、LRS及び／又は試験製剤の蛍光により測定することができる。蛍光は内在的であるか、又は蛍光物質を有する成分の標識により付与することができる。

【0059】

いくつかの結合アッセイにおいて、LRS、試験製剤又は第３の物質（例えば、LRSに結合する抗体）は、与えられた条件で前記ポリペプチドの確認、検出及び定量を容易にするために、標識された状態で提供することができる。つまり、共有的に結合又は検出可能な標識やグループ、又は架橋可能なグループにリンクされて提供することができる。これらの検出可能なグループは、検出可能なポリペプチドグループ、例えば、アッセイ可能な酵素又は抗体エピトープを含む。両者択一的に前記検出可能なグループは、放射性同位元素（例えば、¹²⁵I、³²P、³⁵S)又は化学発光性又は蛍光性グループのような検出可能なグループ又はラーベルから選択することができる。同様に、前記検出可能なグループは、基質、補助因子、阻害剤又は親和リガンドでもある。

【0060】

２）LRSの他の生体活性を調節する製剤のスクリーニング
LRSの試験製剤の結合は、試験製剤がLRSの調節者であることを示す。さらに、これは、前記製剤がRag、好ましくはRagD又はRagD GTPaseの生体活性を調節可能であることを示す。従って、LRSと結合する試験製剤が、ラミニン受容体活性を調節する能力を有するかをテストすべきである。

【0061】

両者択一的にLRSと結合する試験製剤は、LRSに対するその活性を測定するために調査される。そのような活性の存在、性質又は範囲は、活性アッセイによりテストすることができる。前記活性アッセイでは、LRSに対する試験製剤の結合が、実際にLRSに対する調節活性を有することを確認することができる。前記調節アッセイは、LRSの活性を調節する試験製剤を究明するために、独立的に使用することができる（つまり、LRSに結合する能力をアッセイする初段階なしで）。一般的に前記方法は、LRSの生物学的活性テストに必要とされる他の物質又は試薬の存在、又は不在下で、LRSを含むサンプルに試験製剤を添加し、LRSの生物学的活性の変更を測定することを含む。LRSの酵素又は他の生物学的活性を調節する製剤をスクリーニングするアッセイに加えて、前記活性アッセイは、LRSの発現又は細胞内水準の変化のための試験管内スクリーニング及び生体内スクリーニングを含む。

【0062】

２次試験段階：Ragを通じたmTORC1活性を調節する製剤のスクリーニング
調節製剤がLRSと結合するか、及び／又はLRSの生物学的活性（細胞内水準を含む）を調節するものが特定されると、前記製剤が、RagDを通じたmTORC1の活性の調節、又は癌などのmTORC1媒介疾患の予防又は治療する能力を有しているか否かをテストすることができる。前記調節製剤による調節は、一般的にLRSの存在下でテストされる。細胞基盤スクリーニングシステムを利用する場合、LRSは、宿主細胞に導入された発現ベクターから発現することができる。両者択一的にLRSは、スクリーニングシステムにおいて、宿主細胞により内生的に供給することもある。

【0063】

一方、本発明は、細胞内でLRSの発現を抑制する段階を含む対照群細胞に対する細胞の大きさを減少させる方法を提供する。

【0064】

mTORC1は細胞の大きさを調節すると知られている(Fingar DC, Salama S, Tsou C, Harlow E, Blenis J. Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6K1 and 4EBP1/eIF4E. Genes Dev. 16(2002), pp. 1472-1487.)。本発明者らが確認したLRSとmTORC1の関連性によって、本発明者らはLRSの発現抑制が細胞の大きさを減少させることを確認した。その結果、LRSが抑制された細胞は、対照群細胞に比べて大きさが小さいことを確認した（図２Ｅ上段、図２Ｆ）。

【0065】

細胞内でLRSの発現の抑制は、当業者に公知の一般的な分子生物学的技法により行われる。これに制限はされないが、LRSの発現の抑制は、プロモーター及びこれと作動可能に連結されたLRSに対するアンチセンスRNA又は干渉RNAを符号化するポリヌクレオチドを含むベクターで前記細胞を形質転換させることにより行える。

【0066】

本発明で“プロモーター”とは、特定した宿主細胞から作動可能に連結された核配列の発現を調節するDNA配列を意味し、“作動可能に連結される”とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合されて、その機能又は発現が他の核酸断片により影響を受けることを意味する。従って、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したmRNAリボソーム結合部位をコーディングする配列、並びに転写及び解読の終結を調節する配列を追加して含むことができる。前記プロモーターでは全ての時間帯に常時的に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター、又は特定した位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーターを使用することができる。

【0067】

本発明の細胞は、mTORC1が媒介される信号伝達システムを備えた細胞で、好ましくは哺乳動物の細胞でもある。

【0068】

本発明はさらに、
(ａ）LRS(leucyl tRNA synthetase)及びRagDを試験製剤と共に、又は試験製剤なしで接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRSとRagD及び試験製剤間の結合親和度と、試験製剤が無い時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｃ）LRSとRagD間の結合親和度を阻害する試験製剤を検出する段階を含むmTORC1媒介疾病の予防及び治療物質スクリーニング方法を提供する。

【0069】

好ましくは、本発明は、
(ａ）LRS(leucyl tRNA synthetase)及びRagDを試験製剤と共に、又は試験製剤なしで接触させる段階；
(ｂ）試験製剤がある時のLRSとRagD及び試験製剤間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を測定する段階；
(ｃ）試験製剤がある時のLRSとRagD及び試験製剤間の結合親和度と、試験製剤がない時のLRS及びRagD間の結合親和度を比較する段階；及び
(ｄ）LRSとRagD間の結合親和度を阻害する試験製剤を検出する段階に構成することができる。

【0070】

前記スクリーニング方法は、labeled in vitro protein-protein binding assays(in vitro full-down assays)、EMSA(electro phoretic mobility shift assays)，immuno assays for protein binding, functional assays(phosphorylation assays, etc), yeast-2 hybrid assays, assays of non-immune immunoprecipitations, immunoprecipitations/Western blot assays, immuno-co-localization assaysなどを含む当業界に知られた多様な方法を利用して行うことができる。

【0071】

例えば、yeast two hybrid assayは、bacteria repressor LexaのDNA結合ドメイン又は酵母GAL4及びGAL4転移活性ドメインとそれぞれ融合されたLRSとRagD又はこれら蛋白質の相同性部位を発現する酵母を利用して実施することができる（Kim,M,J.ET AL.,Nat,Gent.,34:339-336,2003）。前記リポーター遺伝子は、検出可能なポリペプチドを符号化する当業界に知られた如何なる遺伝子でもある。

【0072】

例えば、chlorampenicol acetyltransferase(CAT), luciferase, β-galactosidase,β-glucusidase, alkaline phosphatase, green fluorescent protein(GFP)などを使用することができる。LRSとRagDの結合水準、又はこれらの蛋白質の一部又は相同するものの結合水準が、試験製剤により刺激又は強化されると、リポーター遺伝子の発現は、正常条件下での結合水準に比べて増加する。逆に試験製剤により結合水準が阻害又は緩和されるとすれば、リポーター遺伝子は発現しないか、又は正常条件下に比べてその発現が減少するであろう。

【0073】

さらに、酵母の成長を可能にする蛋白質を符号化するリポーター遺伝子が選ばれることもある。例えば、前記リポーター遺伝子は、アミノ酸又は窒素性塩基の生合成経路に関与する酵素を符号化する栄養要求性遺伝子でもある（例えば、酵母のADE3,HIS3遺伝子又はこれと同等の他種起源遺伝子）。前記システムから発現されたLRSとRagD、又はこれらの蛋白質の相同部位間の相互作用が試験製剤により、阻害又は緩和されるとすれば前記リポーター遺伝子は発現されないであろう。

【0074】

従って、前記条件で酵母の成長は止どまるか、遅くなる。リポーター遺伝子発現により引起こされる効果は、目視で又は装置（例えば、顕微鏡）を通じて観察することができる。

【0075】

本発明に関する図面について、下記の通り説明する。

【0076】

図１は、ロイシンtRNAs合成酵素(leucyl tRNA synthetase，LRS)は、mTOR関連蛋白質を示す。

【0077】

(A)LRSの細胞分画(subcellular fractionation)。それぞれの分画は、抗LRS、IRS、MRS、mTOR抗体で免疫ブロッティング(immunoblotting)をした。YY1とLAMP2は、それぞれ核と細胞内膜マーカーに使用された。Nuc,nucleus;PM,plzsma membrane;EM,endomembrane;Cyt,cytosol

【0078】

(B)HeLa細胞上のLRSの免疫蛍光染色（Immunofluorescence staining）。HeLa細胞は、抗(anti)-LRS、抗calnexin(ERマーカー）、抗GM130(コルジ体マーカー）、抗LAMP2(リソソームマーカー）、又は抗EEA1(エンドソームマーカー）抗体と反応し、それぞれ２次抗体の結合したalexa488とalexa504で視覚化された。

【0079】

(C)LRSのリソソーム ローカライゼーション。293T細胞を１時間アミノ酸欠乏処理し、５分間アミノ酸で再刺激をした。細胞をlysosome isolation kit(Sigma-Aldrich)で分画した。リソソーム蛋白質は、抗mTOR、抗Raptor、抗LRS、及び抗LAMP1抗体で免疫ブロットした。

【0080】

(D)293T細胞分解物は、抗mTOR抗体で免疫沈殿され、共沈殿されたLRSとRaptorは、免疫ブロッティングにより測定した。塩素IgG、抗mTOR抗体の追加により、エピトープ ペプチド（epitope peptide）を防ぎ、抗アクチン抗体は陰性対照群として使用した。

【0081】

(E)293T細胞は、control plasmid(EV)、myc-tagged LRS、又はMRSに形質感染された。細胞分解物は、抗myc抗体で免疫沈殿され、共沈殿されたmTORC1とRaptorは、免疫ブロッティングにより測定した。

【0082】

(F)HeLa細胞内のmTORC1とLRSは、同じ位置にある。細胞は、抗LRS、抗 MRS、抗IRS、及び抗mTOR抗体と反応して、それぞれ２次抗体の結合したalexa488とalexa594で視覚化された。

【0083】

(G)HeLa細胞内のRaptorとLRSは、同じ位置にある。細胞は、抗LRS、抗 MRS、抗IRS、及び抗mTOR抗体と反応して、それぞれ２次抗体の結合したalexa488とalexa594で視覚化された。

【0084】

図２は、mTORC1活性化とリソソームの位置、細胞の大きさ、オートファジー（Autophagy）下におけるLRSの効果を示す。

【0085】

(A)293T細胞は、48時間６種類のLRS siRNAに形質感染され、アミノ酸依存S6Kリン酸化は、免疫ブロッティングにより測定された。

【0086】

(B)293T細胞は、48時間対照群、mTOR、LRS、IRS、MRS、又はVRS siRNAに形質転感染され、アミノ酸依存S6Kリン酸化は、免疫ブロッティングにより測定された。

【0087】

(C)293T細胞は、対照群、LRS、IRS、MRSor VRS siRNAに形質転感染され、ロイシン依存S6Kリン酸化は、免疫ブロッティングにより測定された。

【0088】

(D)293Tは、48時間対照群又はLRSsiRNAで感染させ、１時間アミノ酸を欠乏させて、５分間アミノ酸で再刺激した。細胞は、lysosome isolation kitで分画された。リソソーム蛋白質（lysosomal proteins）は、抗mTOR、抗Raptor、抗LRS、及び抗LAMP2抗体と免疫ブロットされた。

【0089】

(E)対照群、LRS、IRS、VRS、又はMRS siRNAで感染された細胞の大きさ分布。

【0090】

(F)(E)の細胞の大きさ分布（G1細胞のFSC)を数量化した(n＝3，p<0.0001)。

【0091】

(G)LC3 分裂（cleavage）下のLRS下向調節の効果。203T細胞は、48時間表示されたsiRNAで形質転換して、２時間ロイシンの欠乏処理を行った。細胞分解物を製造して、抗LC3抗体で免疫ブロッティングにより、LC3-IとIIを測定した。オートファジー インダクション（Autophagy induction）は、LC3 II/LC3 Iの比率により表示された。

【0092】

(H)表示されたsiRNAとEGFP-LC3の共同形質感染後に、細胞は、２時間ロイシンと血清（serum）の欠乏処理が行われた。punctaでEGFP-LC3の蓄積が観察された。

【0093】

(I)(F)からのEGFP-LC3 punctaの定量分析。sample当り少なくとも８個の細胞が分析された。データはmean±S.D.を示す。LRS siRNAとmTOR siRNAに感染した細胞は、対照群 siRNAに感染した細胞と比べて、細胞当りのLC3 punctaが統計上大きく増加したことを示した。（それぞれp=0.0005，p<0.0005）

【0094】

図３は、LRSとRagD GTPaseの直接的な相互作用を示す。

【0095】

(A)精製されたGST-LRSは、HA(Hemagglutinin)-tagged RagA, RagB, RagC, RagD, heb1, GβL, Raptor, 又はmTORで感染した293T細胞らから抽出した蛋白質と培養して、抗HA抗体で免疫ブロッティングにより、HA-tagged蛋白質の共沈殿を測定した。Inputsは10%蛋白質抽出物で使用された量である。

【0096】

(B)293T細胞は、発現ベクターにより表示されたcDNAsで感染した。細胞分解物とHA-tagged免疫沈殿物は、抗myc又はHA抗体で免疫ブロッティングにより分析した。WCLは全細胞分解物（whole cell lysate）を意味する。

【0097】

(C)HA-tagged RagDとmyc-tagged LRS、IRS、MRS、又はEPRSの共同形質感染後に、抗HA抗体と共沈殿されたmyc-tagged蛋白質で免疫沈殿された細胞分解物は抗体myc抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0098】

(D)293T細胞は、発現ベクターにより表示されたcDNAsで形質感染した。細胞分解物を製造して、細胞分解物とmyc-tagged免疫沈殿物は、抗FLAG、抗myc、又は抗HA抗体で免疫ブロッティングにより分析した。

【0099】

(E)293T細胞は、対照群又はmyc-RagD/HA-RagBで感染した。抗myc抗体とmyc-tagged免疫沈殿物で免疫沈殿された細胞分解物は、抗HA、抗LRS又は抗Raptor抗体で免疫ブロッティングにより分析された。

【0100】

(F)RagD GTPaseにおけるそれぞれの機能ドメインは、GST fasion蛋白質として発現した。精製されたGST-RagD蛋白質をmyc-tagged LRSで培養し、myc-tagged共沈殿は、抗myc抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0101】

(G)FLAG-tagged LRSとHA-tagged RagB、さらに、myc-tagged WT又はmutatedRagDの共同形質感染後に、細胞分解物は抗myc抗体で免疫沈殿され、共沈殿したLRSとRagBは、抗FLAGと抗HA抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0102】

(H)それぞれのLRSのＣ-末端 断片は、GST8Q融合蛋白質として発現した。精製されたGST-LRS蛋白質は、HA-RagD形質感染細胞分解物と培養し、HA-RagDの共沈殿は、抗HA抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0103】

(I)HA-tagged Ragdとmyc-tagged WT又はmutated-LRSの共同形質感染後に、細胞分解物は抗HA抗体で免疫沈殿され、共沈殿したLRSは、抗myc抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0104】

図４は、LRSはアミノ酸依存的にRagDとRaptorからなる分子複合体を示す。

【0105】

(A)LRSのRagD及びRaptorとのアミノ酸刺激性相互作用。１時間アミノ酸を欠乏させて、５分間アミノ酸で再刺激された293T細胞、抗Raptor抗体、共沈殿されたLRSとRagD細胞で免疫沈殿された細胞分解物は、抗LRSと抗RagD抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0106】

(B)293T細胞は、発現ベクターに対して表示されたcDNAsで形質感染させた。細胞は１時間ロイシンを欠乏させて、５分間ロイシンで再刺激した。細胞分解物とmyc-tagged免疫沈殿物は、抗FLAGと抗myc抗体で免疫ブロッティングにより分析した。

【0107】

(C)293T細胞は、発現ベクターに対して表示されたcDNAsで形質感染させた。細胞は１時間アミノ酸を欠乏させて、５分間アミノ酸で再刺激した。細胞分解物とHA-tagged免疫沈殿物は、抗mycと抗FLAGと抗HA抗体で免疫ブロッティングにより分析した。

【0108】

(D)LRSは、RagDとRaptorの複合体形成に必要である。293T細胞を48時間対照群又はLRSとsiRNAで形質感染させた。細胞は、１時間アミノ酸を欠乏させて、５分間アミノ酸で再刺激した。抗Raptor抗体と沈殿物（precipitates）で免疫沈殿された細胞分解物は、抗LRSと抗RagD抗体で免疫ブロッティングにより分析した。

【0109】

図５は、mTORC1信号伝達に対するロイシン受容体としてのLRSの機能を示した。

【0110】

(A)複数種のロイシン-tRNA合成酵素のN-末端部位の主な配列の配置。ATP結合に重要なHIGHモチーフで保護されるclass 1aは灰色の箱で表示した。

【0111】

(B)LRS WTに対するleucylationsと4μM tRNA^Leuと50nMの酵素を用いて実施される突然変異(F50A/Y52A、F50A、及びY52A)。

【0112】

(C)293T細胞を24時間 LRS WT又はF50A/Y52A mutantで形質感染させ、１時間アミノ酸を欠乏させて、５分間アミノ酸で再刺激した。ロイシン依存S6Kリン酸化は免疫ブロッティングにより測定した。

【0113】

(D)HA-RagD／myc-RagBをmyc-tagged WT又は突然変異されたLRSで共同形質感染させた後、細胞分解物は抗HA抗体で免疫沈殿され、共沈殿されたLRSは抗myc抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0114】

(E)293T細胞は、発現ベクターに表示されたcDNAsで形質感染させた。細胞分解物は抗HA抗体で免疫沈殿され、共沈殿されたLRSとRaptorは抗myc抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0115】

図６は、RagDのヌクレオチド結合状態に依存する方式で、LRSとRagDの相互作用を示す。

【0116】

(A)アミノ酸又は(B)ロイシンの欠乏と刺激に対して、S6Kのリン酸化存在下で表示された蛋白質発現の効果。細胞分解物は、(A)アミノ酸又は(B)ロイシンを１時間欠乏させた後、５分間アミノ酸又はロイシンで刺激された293T細胞から製造された。

【0117】

(C)精製されたGST又はGST-LRS蛋白質は、GDPβS又はGTPγSの存在下で、HA-RagDの形質感染細胞分解物で培養された。共沈殿されたRagDは、抗HA抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0118】

(D)精製されたGST又はGST-LRS蛋白質をmyc-tagged RagD WT、S77L(GDP)、又はQ121L(GTO)形質感染細胞分解物で培養した。共沈殿されたRagDは、抗myc抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0119】

(E)FLAG-tagged LRSをmyc-tagged WT又はmutatedRagDで共同形質感染させた後、細胞分解物は、抗myc抗体で免疫沈殿され、共沈殿されたLRSとRagDは、抗FLAGと抗myc抗体で免疫ブロッティングにより測定した。

【0120】

(F)293T細胞を発現ベクターに表示されたcDNAsで形質感染させた。細胞分解物を製造し、細胞分解物とmyc-tagged免疫沈殿物を抗FLAG又は抗myc抗体で免疫ブロッティングにより分析した。

【0121】

(G)293T細胞を発現ベクターに表示されたcDNAsで形質感染させた。細胞分解物を製造し、細胞分解物とmyc-tagged免疫沈殿物を抗FLAG、抗HA又は抗myc抗体で免疫ブロッティングにより分析した。

【0122】

図７は、RagDに対するGTPase活性蛋白質として作用するLRSを示す。

【0123】

(A)His tagged LRS(759-1176 a.a)断片の表示された量を、37℃で20分間0.15 μM RagDで培養した。error barsはmean±S.D.(N=3)を示す。

【0124】

(B)His-tagged LRS断片(0.3 μM)を、表示された時間について、RagDで培養した。error barsはmean S.D.(N=3)を示す。

【0125】

(C)複数種のADF-ribosylation factor-GAPs(ARF-GAPs)とLRSの推定（putative）GAPモチーフの配列の配置。保存された残基は黒色である。h.hydrophobic;s,Gly or Ala;x.anyresiduehs, Homo sapiens rn, Rattus norvegicus; dm, Drosophila melanogaster; sc, Saccharomyces cerevisiae; ss, Sus scrofa.

【0126】

(D)LRS WTとRagDのGTP 加水分解（hydrolysis）状態で突然変異の効果。精製されたLRS WT(759-1176 a.a)断片又は突然変異(H844A,R845A)断片は、37℃で20分間RagDで培養した。error barsはmean S.D.(N=3)を示す。

【0127】

(E)293T細胞を24時間LRS WT又はGAP突然変異(H844A,R845A)で感染させ、１時間アミノ酸を欠乏させた後、５分間アミノ酸で再刺激した。ロイシン依存S6Kリン酸化を免疫ブロッティングにより測定した。

【0128】

(F)mTORC1へのアミノ酸信号伝達におけるLRSの役割を表現する図式である。

【0129】

図８は、LRSのリソソーム 局在化（localization）を示す生きている細胞の低速撮影共焦点顕微鏡イメージである。

【0130】

293T細胞をEGFP-LRS(A)又はEGFP control(B)発現ベクターで36時間形質感染させて、LysoTracker Red DND-99(Molecular Probcs)で30分間染色した。細胞は、50分間ロイシンを欠乏させた後、0.8mMロイシンで12分間再刺戟された。

【0131】

(C)定量分析は、LRSのロイシン依存的なリソソーム 局在化（localization）を示す。

【0132】

図９は、LRSノックダウンのロイシン又はロイシン類似物質刺戟S6Kリン酸化に及ぼす影響を示す。

【0133】

(A)ロイシン類似物がロイシン刺戟S6Kリン酸化に及ぼす効果を示す。293T細胞は、１時間ロイシンなしの状態で、0.8又は8mMのleucinol又はleucine amideに前培養された。5分後、0.8mMロイシンが添加された。5分間培養後に細胞を収得して、免疫ブロッティングを通じてS6Kリン酸化を確認した。

【0134】

(B)HeLa細胞を１時間ロイシンなしで培養し、0.8又は8mMのleucinol又はleucine amideで前培養した。5分後、0.8mMロイシンが添加された。5分間培養後細胞を収得して、免疫ブロッティングを通じてS6Kリン酸化を確認した。

【0135】

(C)293T細胞をcontrol又はLRS siRNAsで48時間形質感染して、ロイシン又はロイシン類似物質刺戟S6Kリン酸化を免疫ブロッティングで確認した。

【0136】

(D)HeLa細胞を48時間control又はLRS siRNAsで48時間形質感染して、ロイシン又はロイシン類似物質刺戟S6Kリン酸化を免疫ブロッティングで確認した。L-leucineとleucine amideの濃度は0.8mM、D-leucine、norleucineとnorcinolの濃度は8mMであった。

【0137】

図10は、LRSが、tRNA独立的方式で、mTORC1の活性化に関与することを示す。

【0138】

(A)tRNAのin vitro LRS-RagD結合への影響。293T細胞分解物をleucine(0.1mM)、ATP(0.1mM)とtRNA^Leu(25μg)がある条件下で、精製したGST又はGST融合LRSと培養した。沈殿したRagDは、抗RagD抗体を用いて免疫ブロッティングにより確認した。

【0139】

(B)複数の種類のロイシン-tRNA合成酵素の主たる配列配置。クラス1aには、tRNA結合に重要なKMSKSモチーフ（黒色の箱）が保存されている。

【0140】

(C)LRS K716A/K719A突然変異によるleucylationとATP-PPiの交換活性を試験した。

【0141】

(D)K716A/K719A突然変異がRagD結合に及ぼす影響。293T細胞をmyc-標識LRS野生型又は突然変異型とHA標識RagDに形質感染させた。細胞分解物を抗-HA形体と免疫沈殿させ、共沈殿されたLRSとRagDを抗myc抗体で免疫ブロッティングして確認した。

【0142】

(E)293T細胞を標識されたcDNAsで24時間形質感染させて、免疫ブロッティングによりロイシン依存的S6Kリン酸化を確認した。

【0143】

図11は、ロイシンが定量依存的にmTORC1を活性化させることを示している。

【0144】

(A)293T細胞に5分間標識された濃度でロイシンを処理した。ロイシン依存的 S6Kリン酸化は、免疫ブロッティングにより確認した。

【0145】

(B)(A)のｐ−S6Kバンドの定量化、mTORC1に対するロイシン刺戟のEC50は80mMである。

【0146】

(C)WT LRSのleucylationとATP-PPiの交換活性に対する動力学的係数。

【0147】

図12は、アミノ酸刺戟のRagDのGTP/GDP状態への影響を示す。myc-RagDの野生型突然変異型を293T細胞に形質感染させて、32Pリン酸で標識した。myc-RagDを共沈殿し、結合されたヌクレオチドを分離してTLCで分析した。EVは対照群空ベクターを意味する。

【0148】

図13は、LRSとRag間の結合親和度の測定に関するELISA assayの結果である。

【0149】

(A)ELISAの結果は、RagD蛋白質がLRS-(1-1176)に定量依存的に結合することを示す（96well plateはLRS-(1-1176)(500ng/ml in carbonate buffer)でコーティングした）。GSTは陰性対照群である。RagD蛋白質はGST-RagDの形態で使用した。１次抗体には抗-GST抗体(z-5,1:100希釈)を、２次抗体にはHRP-conjugated anti-rabbit antibody(1:5000希釈)を使用した。

【0150】

(B)LRS-(1-1176)96well plate上の対照群(GST-RagD及びRagD＋LRS-(759-1176)に対する結合親和度の比較結果である。LRS-(759-1176)は、LRS-(1-1176)でコーティングしたplateのRagDの結合親和度を減少させた。

【発明の効果】

【0151】

本発明は、LRSの新規な用途である、mTORC1媒介疾患の予防及び治療剤をスクリーニングする方法と、細胞の大きさを減少させる方法を提供する。本発明の方法は、細胞の大きさを調節できる新たな方法を提供し、スクリーニング方法は、癌などの疾患の新たな治療剤の開発に有用に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0152】

【図1】図１は、ロイシンtRNA合成酵素（Leucyl-tRNA合成酵素、LRS)がmTOR関連蛋白質であることを示す。

【図2】図２は、mTORC1活性化とリソソームの位置、細胞の大きさ、オートファジー（autophagy）上でのLRSの効果を示す。

【図3】図３は、LRSとRagD GTPaseの直接的相互作用を示す。

【図4】図４は、LRSがアミノ酸依存方式でRagDとRaptorからなる分子複合体をなすことを示す。

【図5】図５は、mTORC1信号伝達に対するロイシン受容体としてのLRSの機能を示す。

【図6】図６は、RagDのヌクレオチド結合状態に依存する方式でのLRSとRagDの相互作用を示す。

【図7】図７は、RagDに対するGTPase活性蛋白質として作用するLRSを示す。

【図8】図８は、LRSのリソソーム 局在化（localization）を示す生きている細胞の低速撮影共焦点顕微鏡イメージである。

【図9】図９は、LRSノックダウンのロイシン又は類似物質刺戟S6Kリン酸化の影響を示す。

【図10】図10は、LRSがtRNA-独立的にmTORC1活性化に関与することを示す。

【図11】図11は、ロイシンが定量依存的にmTORC1を活性化することを示す。

【図12】図12は、RagDのGTP/GDP状態におけるアミノ酸刺戟の影響を示す。

【図13】図13は、LRSのRag間の結合親和度の測定に関するELISA assayの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0153】

<実験方法>
１．細胞培養と試薬
HEK293T細胞とHeLa細胞は、10%の牛胎児血清と抗生物質を含むDMEM（Hyclone)で生育した。CHO-tSH1細胞は、マイククレメンス博士より提供された。CHO-tSH1細胞は、34℃で、9%(v/v)牛胎児血清、100mg/mlストレプトマイシン硫酸塩、さらに、100ユニット/mlペニシリンＧが補充された商用の培地(Dulbecco's modified Eagle's medium/Nutrient Mixture Ham's F12(Sigma))で生育した。tsH1ラインは、34℃で活性であるが、39.5℃では非活性の温度敏感性ロイシン-tRNA合成酵素を含む。アミノ酸不足と追加実験は、DMEM(＋AA)、25mMグルコース、1mM sodiumピルビン酸塩、1xMEMビタミン(Invitrogen)を含むDPBS(-AA)を利用して実施した。L-ロイシン、D-ロイシン、L-ロイシンアミド、ロイシノール、ノルロイシン(Sigma Aldrich)は、PBS［pH7.6］で溶解させ、0.8mMの濃度で処理した。［³²P］ピロリン酸塩(80.70mCi/mL)は、PerkinElmer生命科学から得た。［³H］ロイシンは、American Radiolabeled Chemicalsから得た。RagCとRagD siRNAsは、Invitrogenから得た。

【0154】

２．細胞のアミノ酸又はロイシン欠乏と刺激
ロイシン欠乏のために、細胞をロイシンフリーDMEMで２回洗浄し、ロイシンフリーDMEMで60分間培養して、52mg/mlロイシンで5-60分間刺激した。アミノ酸欠乏のために、細胞を25mMグルコースを含むDPBSで培養し、1mM ピルビン酸ナトリウム、1x MEMビタミンを含むDPBSで60分間培養し、DMEMに変えて5-60分間培養した。

【0155】

３．抗体とプラスミド
抗体は下記の提供所から得た：Santa Cruz Biotechbologyの抗mTOR blockingペプチド、mTOR(for IP)、HA、c-MYC、ラミンＡ抗体又はHRP-labeled 抗-mouse、抗-rabbit ２次抗体；Cell Signaling Technologyのphospho-T389 S6K1，phospho-S473，Akt/PKB、phospho-T308 Akt、S6K1、Akt、LC3、RagC, RagD抗体；Abcam(for Western)のLAMP2(H4B4)、mTOR(Y391)、Raptor抗体；Invitrogen(for Western IF,IP)のRaptor、mTOR、FLAG抗体；Millipore(for Western)のmTOR、clone 2ID8.2-mouse monoclonal抗体；Molecular ProbeのLysoTracker Red DND-99；BD Pharmigenのmonoclonal mouse anti-calnexin抗体；Dr.D-H.Kim(University of Minnesota)とDr.E-J.Kim(Catholic University of Daegu)により提供されたRagA,RagB,RagC,RagD,mTOR、Raptor、GbL、Rheb1を構成要素に含むHA-付着mTORC1。その他にLRS、IRS、MRS、及びEPRSを含む全てのその他のDNA構築物は、実験室保有分を使用した。形質感染はGeneporter system(Gene Therapysystem)を利用して実施した。

【0156】

４．細胞分解物の製造と免疫沈殿
1% Triton X-100,40mM HEPES(pH7.4)、2mM EDTA、10mM ピロリン酸、10mMグリセロールリン酸と、タンパク質分解酵素阻害剤カクテルを含む分解バッファで細胞を溶解させて、分解物を30分間13,000rpmで遠心分離した。その後、SDS-PAGEにより抽出された蛋白質の20μgを分画した。免疫沈殿のために細胞を(50mM Tris-HCL(pH7.4)、10mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA、1mM MgCl₂、0.1% CHAPS、and 0.5% Triton X-100、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride)で溶解させ、１次抗体を分解物に添加して、4℃で２時間循環して培養した。蛋白質アカロスG-セファロスの50%スラリーが添加され、追加４時間培養を持続した。冷却した分解バッファで３回洗浄後、沈殿物はSDSサンプルバッファで溶解させてSDS-PAGEで分離した。

【0157】

５．免疫蛍光背染色法(Immunofluorescence Staining)
細胞をカバースリップに載せて、-20℃で５分間、100%アセトンで固定した。2% BSAを含むPBSブロックバッファで培養後、細胞は１次抗体（1;100)で２時間、2% BSA and 10%牛胎児血清を含むブロックバッファでアルレクサ488-又はアルレクサ595-結合２次抗体（1;1,000)で１時間培養した。核はDAPIで染色した。PBSで洗浄後細胞を固定し、共焦点レーザー走査顕微鏡を通じて(Nikon AIR)で観察した。

【0158】

６．LRSとRagDの突然変異
LRSとRagDの点突然変異は、QuickChange kit(Stratagene)を用いて部位特異的突然変異法を通じて発生させ、突然変異はDNA配列分析により確認した。

【0159】

７．超遠心細胞分画法(Subcellular Fractionation)
細胞を接種して、70%コンフルーエンス(confluence)まで培養した。細胞を無アミノ酸培地で３回洗浄して、５分間正常培地を添加した。以降、製造会社の指針に従って、Iysosome isolation kit(SIGMA-ALDRICH)を用いてリソソーム分画を抽出した。簡単に抽出バッファを添加し、均質器を利用して細胞を破壊させた。10分間1000gのサンプルを遠心分離した後、上澄液20,000gを20分間遠心分離した。ペレットは抽出バッファにおいて再分散した。

【0160】

８．持続撮影のin vivo細胞イメージング
細胞イメージングは、共焦点レーザー走査顕微鏡を利用して行った。全てのイメージは、CFI Plan Apochroment VC objective lens(60x/1.40 Oil)でデジタルズームを使用して、512×512の解像度で撮影した。全てのイメージは、Nikon AIRsi confocal microscopeに対する標準フォーマットであるND又はJPG2000ファイルで保存した。

【0161】

９．イメージ分析
細胞イメージは、定量分析に利用される。この過程は、Nikon imaging software NIS-element AR 64-bit version 3.00で行った。イメージファイルフォーマットは、NIS-element softwareを用いてND又はJPG2000ファイルをJCS又はTIFFフォーマットに転換した。リソソーム共局在化（colocalization）の定量分析は、NIS-element softwareの“Region Of Intensity”(ROI)の“Time measurement”toolを用いて行った。ROIsがLysoTrackerのlocalizationに従って定義された後、他の構成要素のlocalizationは、定義されたROIsを用いて測定した。相対的蛍光ユニットは、ROIの初期強度に対して正常化され、以降、OriginPro 7.5を用いて図示した。共局在化の定量分析のため、ImageJ colocalizationfinder pluginを利用した。共局在化の指数は、各co-labeling当たり10個以上の細胞を得る重複係数(R)*100と一致する。緑色と赤色の信号間の比率は、0.8と1.2間の範囲である。

【0162】

10．in vitro Pull-down分析
組替えLRS又はRagD断片蛋白質は、GST融合蛋白質として発現し、グルタチオンセファロースにより精製された。RagD断片とmyc-LRSが過発現した細胞分解物間の、又はLRS断片とHA-RagDが過発現した細胞分解物間の相互作用は、in vitroの結合分析を用いて試験した。結合分析は、10mM NaCl、1mM MgCl₂、1mM EDTA、0.5mM EGTA、及び0.5% Triton X-100を含む25mM Tris-HClバッファ(pH7.4)で実施した。

【0163】

11．細胞の大きさ測定
forward scatter units(FSC)を用いて固定されていない細胞の大きさを測定した。293T細胞をメッキ（plate）して、PBSで１度洗浄し、0.1% serum、5mM EDTA、5ng/ml propidium iodide(PI;Sigma)を含むPBSで再分散した。試料は、細胞の大きさ(FSC)に関して、FACS分析(FACS caliber;Becton Dickinson)により分析した。G1段階の細胞のFSCの平均を測定した。

【0164】

12．ATP-PPi交換分析
ATT-PPi交換反応は、2mM［³²P］ピロリン酸(PPi)(80.70mCi/mL)、50mM HEPES-KOH(pH7.6)、2mM MgCl₂、4mM ATP、多様な濃度のロイシン、及び、LRSの25nMを含む反応混合物により行った。反応は酵素で開始され、37℃で実施した。アリコット(aliquots(10μl))を異なる時点で採取し、反応を急冷バッファ(50mM NaPPi、3.5% HCIO₄ 2% 活性化charcoal)1mlを用いて停止した。木炭懸濁液は、Whatman GF/Aフィルターを通じてろ過し、水5mlで4回洗浄して、100%アルコールの10mlですすいだ。フィルター上の木炭粉末を乾燥させ、合成［³²P］ATPをシンチレーション計数器(Beckman Coulter)を用いて算出した。

【0165】

13．Leucylation分析
Leucylation分析は、1mM spermine、50mM HEPES-KOH (pH7.6)、25mM KC1、5mM MgCl₂、4mMATP、2mg/ml bovine liver tRNA^leu、多様な濃度［³H］Leu(60Ci/mmol)、及び、LRSの10-100nMを含むバッファで行った。反応は酵素で開始されて、37℃で実施した。アリコット(10μl)を異なる時点で採取し、5% trichloroacetic acid(TCA)に漬けたWhatmanフィルターパッドで停止（quench）した。パッドを、それぞれ冷たい5%TCAで10分間3回洗浄し、冷たい100%エタノールで１回洗浄した。洗浄したパッドは乾燥させた。放射能（radioactivity）は、シンチレーション計数器(Beckman Coulter)で数量化した。

【0166】

14．in vitro GTPase 分析
GTPase分析は、製造会社の指針に従って、GTPase assay kit(Innova Biosciences)を用いて、200mlの最終体積で0.1%牛胎児血清アルブミンを含む分析バッファ(20mM piperrazine-N、N9-bis(2-ethanesulfonic acid)、20mM HEPES、5mM MgCl₂、125mM NaCl、5mM KCl、pH7.0、0.5mM GTP)で行った。

【0167】

15．in vivo GTPase 分析
293T細胞をリン酸塩なしのDMEMで洗浄して、リン酸塩なしのDMEM 1mMで60分間培養した。その後、細胞を［³²P］ピロリン酸/mlの100uCiで8時間培養した。標識（labeling）後、細胞を冷却した分解バッファ(0.5% NP-40、50mM Tris［pH7.5］、100mM NaCl、10mM MgCl₂、1mM dithiothreitol(DTT)、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride、10μg of leupeptin/ml、10μg of aprotinin/ml)で、氷上で30分間溶解した。その後、分解物を4℃で15分間12,000Xgで遠心分離した。上澄液（160μl)を新鮮なチューブに移して、NaCl(500mM)16μlをGAP活性を阻害するために添加した。myc-RagDは、4℃で１時間抗myc抗体と蛋白質-Gセファロースビーズ（sepharose bead）で免疫沈殿した。ビーズを4℃で洗浄バッファ1(50mM Tris)［pH8.0］、500mM NaCl、5mM MgCl 2、1mM MDTT、0.5%TritonX-100)で３回洗浄し、さらに、4℃で洗浄バッファ2(50mM Tris［pH8.0］、100mM NaCl、5mM MgCl₂、1mM MDTT、0.1% Triton X-100)で３回洗浄した。myc-RagD結合ヌクレオチドは、68℃で溶出バッファ(2mM EDTA、0.2% sodium dodecyl sulfate、1mM GDP、1mM GTP)20μlで10分間溶出させた。溶出されたヌクレオチドをpolyethyleneimine cellulose plate(Baker-flex)に適用し、0.75M KH₂PO₄［pH3.4］溶液で展開（develop）した。GTPとGDPはphosphoimagerにより視覚化して数量化した。

【0168】

16．ＲＴ−ＰＣＲ
RNAは、RNA抽出kit（RNeasy Mini)を用いて、培養した細胞から抽出した。全てのRNA(1mg)を、1ml dNTP(2.5mM each)、1mM random hexamer(5mM)、及び、20ml反応のMMLV逆転写酵素の200ユニットと共に、逆転写に使用した。cDNA溶液の1:4の希釈の後、1mlをPCR反応に使用した。

【0169】

RagC、Sense: 5'-TCGGCTACGGCGTGGAGGAG-3'(SEQ ID NO: 19)
RagC、Antisense: 5'-CGCCCCCCGGACCACAGCCA-3'(SEQ ID NO: 20)
RagD、Sense: 5'-TGAGCTGGTGGGGCTAGCGG-3'(SEQ ID NO: 21)
RagD、Antisense: 5'-GGGTCACTGAAGTCCAGAACTC-3'(SEQ ID NO: 22)

【0170】

17．LRSとRagD間の結合親和度測定のためのELISA assay
LRSとRagD蛋白質が相互結合するか否かを調べるために、配列番号１〜８に示されるプライマーを使用した。

【0171】

【表1】

【0172】

まず、各LRS断片はLRSのcDNAを鋳型にして、各断片に特異的なプライマー対（表１）を用いて、重合酵素連鎖反応（PCR）により合成した。重合酵素連鎖反応の増幅は、次のような条件で行われた：95℃で２分間鋳型DNA変性；95℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃３分30秒の条件で30cycles；72℃ 10分間、最終伸長（final extension）。各PCR産物は、NdeIとBamHIで切断して、同一の制限酵素で切断したpET16aベクター(Novagen)に結合（ligate）した。E.coli BL21(DE3)細胞を前記ベクターで形質感染させて、ペプチドの発現を誘導するために培養した。His-tag融合蛋白質で発現された各ペプチドは、Ni-chelating agaroseで精製された。脂質多糖類を除去するために、前記蛋白質溶液はピロゲンフリー（pyrogen-free）バッファ(10mM potassium phosphate buffer、pH6.0、100mM sodium chloride)で透析された。透析後、前記蛋白質は、同じバッファで平衡化されたポリミキシン樹脂（polymyxin resin）(Bio-Rad)にロードされ、20分間インキュベーションした後、溶出して、各LRSの断片を作製した。

【0173】

RagD断片は、LRSのcDNAを鋳型にして、各断片に特異的なプライマー対（表１）を用いて重合酵素連鎖反応により合成した。重合酵素連鎖反応の増幅は、次のような条件で行われた：95℃で２分間鋳型DNA変性；95℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃１分30秒の条件で30cycles；72℃ ５分間、最終伸長（final extension）。各PCR産物は、BamHIとXhoIで切断して、同一の制限酵素で切断したGEX4T3ベクター(GEhcalthcare)に結合した。E.coli BL21(DE3)細胞を前記ベクターで形質感染させて、ペプチドの発現を誘導するために培養した。GST-tag融合蛋白質で発現された各ペプチドは、GSH agaroseで精製された。脂質多糖類を除去するために、前記蛋白質溶液はピロゲンフリー（pyrogen-free）バッファ(10mM potassium phosphate buffer、pH6.0、100mM sodium chloride)で透析された。透析後、前記蛋白質は、同じバッファで平衡化されたポリミキシン樹脂（polymyxin resin）(Bio-Rad)にロードされ、20分間インキュベーションした後、溶出して、各LRSの断片を作製した。

【0174】

精製されたGST-RagDは、多様な濃度でプレート（plate）にコーティングされたHis-LRS(1-1176)と共にインキュベーションし、anti-GST antibody(2-5、1:100 dilution)とHRP-conjugated anti-rabbit antibody(1:5000 dilution)を用いてELISAを行った。ELISAの結果を、図13に示す。

【0175】

<実験結果>
１．mTOR連関蛋白質としてLRSの確認
LRSがARS複合体内で触媒作用の役割をするのとは別に、付加的な活動をするか否かに付いて調査するために、まず、細胞内分布を検査した。細胞分画分析は、たLRSの数多くの量が、IRSとMRSが主に発見される細胞質のみならず、mTORと共に内部膜分画に位置することを示す（図１Ａ）。免疫蛍光分析は、LRSがERマーカーカルネキシン(calnexin)、及びエンドソームマーカーのEEA1と同じ位置にあることを示す。少量のLRSが、少量のリソソームマーカーのLAMP2と同じ位置にあることを示すが、ゴルジマーカーのGM130とは殆ど同じ位置にない（図１Ｂ）。以前の報告では、アミノ酸が、リソソームの膜へのmTORC1の移動を誘導することを示す(Sancak Y、Bar-Peled L、Zoncu R、Markhard AL、Nada S、Sabatini DM. Ragulator-Rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell 141(2010)、pp. 290-303.)。

【0176】

そこで、アミノ酸刺激（図１Ｃと図８）に伴うLRSのリソソームの局在化（localization）を調査した。蔗糖勾配分画を利用してリソソームに位置するLRSを生化学的に分析した。アミノ酸欠乏により、リソソームのmTOR、Raptor、及びLRSは減少するが、アミノ酸補充により、mTORとRaptorと共に、LRSのリソソームでの転移が明らかに誘導される（図１Ｃ）。リソソームの共局在化の定量的な分析を、time lapse confocal live cell imagingを用いて行った。ロイシンの欠乏は、EGFP-LRSとリソソームマーカーLysoTrackerとの共局在化を減少させる。しかし、ロイシンの補充は、EGFP-LRSとリソソームの共局在化を10分以内に回復させる（図８Ａ）。対照群EGFPとLysoTrackerの共局在化は、ロイシンの欠乏又は添加により殆ど変わりはなかった（図８Ｂ）。共局在化の強度は、NIS-elementソフトウェアにより定量した。LRSのリソソームにおける局在化は、ロイシンの欠乏処理後、50分間は次第に減少するが、ロイシンの補充後、LRSのリソソームにおける局在化が、10分以内に速かに誘導される。（図８Ｃ）。このような結果は、ロイシンが、mTORC1ばかりでなくリソソーム分画にLRSの移動を誘導することを示唆している。

【0177】

そこで、LRSがmTORC1と共に複合体を形成するか否かについて調査した。HEK293T細胞分解物を、抗塩素IgG、抗-mTOR、抗-actin抗体と共に免疫沈殿して、免疫沈殿物を、抗-LRS、抗-IRS、抗-mTOR、及び、抗-Raptor抗体と共に分析した。LRSは、mTOR免疫沈殿でのみmTORとRaptorと共に沈殿する（図１Ｄ）。mTOR抗体に対抗する競争的な抗原決定基ペプチドを細胞溶解後に追加する時、LRSバンドの強度が大きく減少する。これは、LRSが、特にmTORC1と相互作用することを示す。興味深いことに、isoleusyl-tRNA合成酵素は、mTOR免疫沈殿物内で発見されないが、mTORC1内のLRSは、ARS複合体内のそれとは異なることを暗示する。この可能性を試験するため、HEK293T細胞をmyc-tagged LRS又はMethionyl-tRNA合成酵素で形質感染させ、細胞分解物をanti-myc抗体で免疫沈殿させた後、免疫沈殿物をanti-mTORとanti-Raptor抗体で分析した。mTORとRaptorはLRS免疫沈殿物でのみ発見された（図１Ｅ）。さらに、LRSはmTOR（図１Ｆ）とRaptor（図１Ｇ）と良く共局在化している。図１Ｄ、Ｇのように、MRSとIRSはmTORC1と共局在化していなかった（図１Ｆ、Ｇ）。このような結果は、mTORC1内のLRSが、ARS複合体に結合するそれとは異なることを示唆している。

【0178】

２．mTOR活性化、リソソーム局在化、細胞の大きさ、オートファジーにおけるLRSの効果
mTORC1活性化の調節におけるLRSの重要性を見るために、６個の異種のLRS siRNA（表２）を用いて、mTORC1活性化におけるLRSのノックダウンの効果を調べた。全てのsiRNAは、LRSの発現とアミノ酸から誘導されるS6Kリン酸化をかなり抑制した（図２Ａ）。

【0179】

次に、mTORC1活性化によるLRSの特別な関与(involvement)を調べた。IRS、MRS又はvalyl-tRNA合成酵素ではない、mTORとLRSのノックダウンは、アミノ酸誘導性S6Kリン酸化を相当抑制した（表３、図２Ｂと図２Ｃ）。さらに、LRSはロイシンから誘導されるS6Kリン酸化を特別に媒介した（図２Ｃ）。このような結果は、内因性のLRSが、アミノ酸誘導性mTORC1活性化経路に関与したことを示唆する。次に、mTORC1のアミノ酸誘導性のリソソーム共局在化におけるLRSのノックダウンの効果を調べてみた。si-対照群で形質感染された細胞において、アミノ酸の補充によって、mTORとRaptorのリソソーム共局在化が誘導される間、si-LRSで形質感染された細胞では、mTORとRaptorのリソソーム共局在化は観察されなかった（図２Ｄ）。このため、この結果は、LRSが、mTORC1のアミノ酸誘導性のリソソーム局在化を媒介することを暗示する。

【0180】

mTORC1は、細胞の大きさを調節することで知られている(Fingar DC、Salama S、Tsou C、Harlow E、Blenis J. Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6K1 and 4EBP1/eIF4E. Genes Dev. 16(2002)、pp. 1472-1487.)。もし、mTORC1経路が抑制されると、細胞の大きさの減少を誘発するであろう。mTORC1に信号を送るアミノ酸の媒介体になるLRSと一致して、LRS抑制細胞は、調節細胞よりもサイズが小さい（図２Ｅ上段）。しかしながら、IRS、VRS、MRSのノックダウンは、細胞の大きさに及ぼす効果がない（図２Ｅ下段）。細胞サイズ調節の定量分析が行われ、ラパマイシン（rapamycin）処理又はLRSのノックダウンが、特異的に細胞の大きさを減少させることを確認した（図２Ｆ）。加えて、mTORC1経路により抑制される過程であるオートファジー(autophagy)は、LC3-II/LC3-I比率の増加により確認される通り、LRS下向調節細胞で活性化された（図２Ｇ）。また、内因性LRSの下向調節は、GFP-LC3-II斑点(puncta)の大きさと数が対照群細胞と比べて増加することで確認される通り、オートファジーを特異的に活性化する（図２Ｈ、２Ｉ）。これらの結果は、mTORC1経路の調節におけるLRSの特別な役割を示唆する。

【0181】

【表2】

【0182】

【表3】

【0183】

３．LRSとRagD GTPaseとの直接相互作用
LRSがmTORC1経路の核心構成要素と相互作用するかを調べた。相互作用は、GST-LRSとHA-tagged mTORC1分子を利用したiv vivo pull-down調査により試験した。GST-LRSは特異的にHA-RagDと共沈殿するが、他のものとは異なり（図３Ａ）、これは特異的で直接的な相互作用を示す。共沈殿分析は、LRSとRagDの特別な相互作用を示すが、RagC(81.1%相同性）の配列相同性にも拘らず、RagA、RagB、RagC（図３Ｂ）とは相互作用を示さなかった(Sekiguchi T、Hirose E、Nakashima N、Ii M、Nishimoto T. Novel G proteins、Rag C and Rag D、interact with GTP-binding proteins、Rag A and Rag B. J Biol Chem. 276(2001)、pp. 7246-7257.)。LRSとRagD間の特異的な相互作用を調査した。RagDは、LRSとのみ相互作用し、IRS、MRS、EPRSとは相互作用しなかった（図３Ｃ）。Rag GTPaseがmTORC1活性化のためヘテロダイマーを形成するため、どのRagGTPaseのヘテロダイマーがLRSに特異的に結合するパートナーであるかを調査した。一貫して、LRSは、RagDヘテロダイマーと特異的な相互作用を示すが、RagCヘテロダイマーとは特異的な相互作用を示さなかった（図３Ｄ）。興味深いことに、RagB/RagDヘテロダイマーは、RagA/RagDヘテロダイマーよりもLRSに高い親和度を示した（図３Ｄ）。内因性LRSが、RagB/RagDヘテロダイマーと複合体形成することができる否かを調べて、内因性LRSが、RaptorとRagB/RagDヘテロダイマー複合体を形成できることを発見した（図３Ｅ）。次に、iv vivo pull-down分析により、LRSとの相互作用に関与するRagDのペプチド領域を決定した。myc-tagged LRSは、GSGT-RagD断片と共に沈殿した。RagDのaa 1-400と230-400間にあるペプチドは、LRSと相互作用した（図３Ｆ）。図３Ｂに示した通り、LRSは、RagDと相互作用するが、配列が相同するにも拘らず、RagCとは相互作用しない。そこで、RagDのC-末端230-400部位が、LRSとの特異的な結合をするであろうとの仮説を設けた。RagDの230-400部位、371-400部位以内のみが、RagCのそれと比べて配列の多様性を有している。この仮説を確認するために、アミノ酸の位置379、383、385、388、及び389で異なるRagDの点突然変異を準備し、これらの突然変異が、RagB又はLRSとの相互作用に影響を及ぼすかを試験した。379、383、及び389で異なるRagDの突然変異は、LRSと共に免疫沈殿したが、385、及び388で異なる突然変異は、結合能力を失い（図３Ｇ）、RagDのC-末端部位とLRSの相互作用を確認した。これとは対照的に、全ての突然変異は、RagBとの結合能力を維持し、これはRagDがRagBとLRSとで異なる結合部位を有していることを示す。反対に、in-vitro pull-down分析により、RagDと相互作用に関与するLRSのペプチド領域を決定した。HA-tagged RagD-形質感染細胞分解物は、GST融合LRS断片とpull-downした。LRSのaa951-1176間にあるペプチドは、RagDと相互作用したが（データは示されていない）、これはRagDとの相互作用がLRSのC-末端部位で行われることを暗示する。LRSのRagD結合部位を確認するために、LRSの他の欠失突然変異体を準備し、HA-tagged RagDと培養して、どの欠失がRagDとの相互作用に影響するかを試験した。LRSの759-1120、759-1176、及び951-1176間にあるペプチドはRagDに結合する一方、971-1176間にあるペプチドは結合能力を失っており（図３Ｈ）、これはRagDとの相互作用が、LRSの951-971間にあるペプチド領域で行われたことを暗示している。この結論を確認するために、LRSのRagD結合域に位置したS953/V954、R956/K957、及びN969/K970でのアラニン(alanin)置換を準備した。その後、この突然変異のどれがRagDとの相互作用に影響を及ぼすかを試験した。免疫沈殿物分析において、二つの突然変異（S953A/V954AとR956A/K957A)がRagB/RagDヘテロダイマーとの相互作用を示す一方、N969A/K970A突然変異は結合能力を失った（図３Ｉ）。

【0184】

４．LRSはアミノ酸依存方式でRagDとRaptorとの分子複合体を形成する
Raptorがアミノ酸依存性でRagD及びLRSと相互作用するかを調べた。293T細胞に５分間アミノ酸処理を施し、蛋白質分解物を製造して、RaptorとLRS及びRagDとの共-免疫沈殿を行った。RaptorのLRS及びRagDとの相互作用は、アミノ酸の補充後に増加した（図４Ａ）。次に、RagDが、アミノ酸依存方式によりLRSと相互作用するかを調べるた。RagA/RagDヘテロダイマーの構成がアミノ酸により影響を及ぼさない一方で、LRSはアミノ酸依存方式でRagA/RagDヘテロダイマーと相互作用し（図４Ｂ）、LRSとRagDの相互作用がアミノ酸依存方式であることを暗示した。

【0185】

RagDとRaptorの相互作用に対するLRSの重要性を評価するために、外因性LRSの存在又は不在下のRagDとRaptorの相互作用を比べた。外因性LRSの不在下で、RagDはアミノ酸の補充時にRaptorと軽微に相互作用した。しかし、LRSの過発現は、アミノ酸で誘導されたRagD-Raptor結合をかなり増加させた（図４Ｃ）。反対に、内因性LRSの下向調節は、アミノ酸から誘導されたRagD-Raptor結合を弱化させ（図４Ｄ）、これは、LRSがRagDとRaptor結合を増加させることを示唆する。

【0186】

５．LRSは、mTORC1信号伝達のためのロイシンセンサーとして作用する
LRSは、クラスＩアミノアシル-tRNA合成酵素であり、保存されたHIGHモチーフを有し、ATP結合部位を提供する（図５Ａ）。以前の構造的研究は、基質ロイシンサイドチエーンを収容するための巨大な疎水性の袋が、異なる種類のロイシン-tRNA合成酵素の内で、高い水準で保存された残基であるPhe50及びTyr52により形成されることを示した（図５Ａ）(Cusack S、Yaremchuk A、Tukalo M. The 2Å crystal structure of leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-adenylate analogue. EMBO J. 19(2000)、pp. 2351-2361)。ロイシンのα-アミノグループは、Phe50のカルボニル酸素に水素結合を作り、ロイシンアデニル酸（adenylate）の硫酸塩は、Tyr52の主要鎖に水素結合する(Cusack S、Yaremchuk A、Tukalo M. The 2Å crystal structure of leucyl-tRNA synthetase and its complex with a leucyl-adenylate analogue. EMBO J. 19(2000)、pp. 2351-2361.)。

【0187】

これらの保存されたPhe50とPhe52のアラニン置換は、ロイシンに対するＫmの増加によりLRSのleucylation活性をかなり抑制する（図５Ｂと表４）。mTORC1の活性化とRagDとRaptorの複合体形成に対するロイシンとLRSの結合の重要性を判断するために、それらに対するLRSのF50A/Y52A突然変異の効果を調べた。ロイシンから誘導されたS6Kリン酸化が、WT LRSの導入により増加したが、F50A/Y52A突然変異では増加しなかった（図５Ｃ）。また、LRSのF50A/Y52A突然変異は、RagB/RagDヘテロダイマーを結合する能力を喪失し（図５Ｄ）、RagB/RagDヘテロダイマーとRaptorの関連を仲介することができなかった（図５Ｄ）。このような結果から、LRSによるロイシン感知が、mTORC1活性化に重要であることが明らかになった。

【0188】

【表4】

【0189】

mTORC1の活性化に対するロイシンセンサーを明らかにするための努力は、ロイシン類似体の効果と温度に敏感なロイシン-tRNA合成酵素突然変異試験により分析された(Lynch CJ、Fox HL、Vary TC、Jefferson LS、Kimball SR. Regulation of amino acid-sensitive TOR signaling by leucine analogues in adipocytes. J Cell Biochem. 77(2000)、pp. 234-251.; Wang RC、Levine B. Autophagy in cellular growth control. FEBS Lett. 584(2010)、pp. 14171426. Xin Y、Li W、First EA. The “KMSKS” motif in Tyrosyl-tRNA synthetase participates in the initial binding of tRNA、Tyr. Biochemistry 39(2000)、pp. 340-347.)。

【0190】

構造活性関係の研究によれば、変異アミノグループ、変異カルボキシルグループ、荷電されたＲグループ、又はbulkier aliphatic Ｒグループを有するロイシン類似体は、mTORC1アゴニスト活性を失う(Lynch CJ、Fox HL、Vary TC、Jefferson LS、Kimball SR. Regulation of amino acid-sensitive TOR signaling by leucine analogues in adipocytes. J Cell Biochem. 77(2000)、pp. 234-251.)。

【0191】

しかし、LRSのleucylation又はATP-PPi交換活動上のロイシン類似体の効果は明らかには決定されておらず、ロイシン類似体はmTORC1において異なる効果を有するので、追加的な研究が必要である。この研究でロイシンから誘導されるS6Kリン酸化におけるロイシン類似体、ロイシノール、及びロイシンアミドの効果を分析した。ロイシン類似体、ロイシノールは、ロイシンに対抗する競争者であり(Lynch CJ、Fox HL、Vary TC、Jefferson LS、Kimball SR. Regulation of amino acid-sensitive TOR signaling by leucine analogues in adipocytes. J Cell Biochem. 77(2000)、pp. 234-251.)、そうすることによってleucylationを抑制する(Vaughan MH、Hansen BS. Control of initiation of protein synthesis in human cells. Evidence for a role of uncharged transfer ribonucleic acid. J Biol Chem. 248(1973)、pp. 7087-7096.)。興味深いことに、ロイシノールにはS6Kリン酸化の効果はないが、二つの異なる細胞タイプの量依存的方式では、ロイシンから誘導されるS6Kリン酸化を抑制する（図９Ａと９Ｂ）。これと対照的に、ロイシンアミドは、自らS6Kリン酸化をかなり誘導して、このような効果はＬ-ロイシンの存在下でさらに増加する（図９Ａと９Ｂ）。たとえロイシン類似体の効果が多様であっても、それらの効果はLRSの抑制により共通して去ってしまい（図９Ｃと９Ｄ）、アミノ酸信号伝達に対するLRSの重要性を示す。

【0192】

LRSのtRNAチャージング（charging）活性が、RagD結合とmTORC1活性化に関与するか否かについて調べるために、LRS基質、ロイシン、ATP、tRNA^leuを利用したin vitroで競争分析を行った。

【0193】

興味深いことに、ATPではなく、tRNA^leuが、LRSの結合について、RagDと明確に競争したが（図10Ａ)、これは、in vitroでRagDとtRNAが、LRSに排他的接触を示すことを暗示する。LRSとRagD間の相互作用がleucylation活性から独立していることを証明するために、tRNA結合に重要な保存されたKMSKSモチーフのアラニン突然変異（K716A/K719A）をつくった（図10Ｂ)(Hountondji C、Dessen P、Blanquet S. Sequence similarities among the family of aminoacyl-tRNA synthetases. Biochimie 69(1986)、pp.1071-1078.; Xin Y、Li W、First EA. The ‘KMSKS’ motif in Tyrosyl-tRNA synthetase participates in the initial binding of tRNA^Tyr. Biochemistry 39(2000)、pp. 340-347.)。

【0194】

たとえこの突然変異が小さいロイシレーション（leucylation）活性を示しても、ATP-PPi交換活動を維持する（図10Ｃ)。LRSのK716A/K719A突然変異は、野生型LRSのRagB/RagDヘテロダイマー形成効果（図10Ｄ)及びロイシン誘導性mTORC1活性化に差を示さず（図10Ｅ)、これはLRSのtRNAチャージング活性がmTORC1の活性化に関与していないことを暗示する。

【0195】

LRSに対するロイシンのＫm値とmTORC1のロイシン刺激のEC₅₀を比べて、mTORC1信号伝達におけるLRSの参与に対する手がかりを得ることができる。mTORC1のロイシン刺激のEC₅₀は、293T細胞（図11Ａ、11Ｂ)とHeLa細胞で約80μg程度ある。tRNA^leu(leucylation)が存在する場合、LRSに対するロイシンのＫmは、15.9±0.4μMであるが、tRNA^leu(ATP-PPi交換)が存在しない場合、LRSに対するロイシンのＫmは、143±61μMである（図11Ｃ)。したがって、ATP-PPi交換反応におけるLRSに対するロイシンＫmは、mTORC1のロイシン刺激のEC₅₀と比較できる。このような結果は、tRNAではなく、LRSに結合するロイシンが、RagD結合とmTORC1活性化に関与することを明らかに裏付けするものである。

【0196】

６．LRSは、RagDのGTT形態と相互作用する
RagGTPaseは、RasファミリーGTP結合蛋白質であるので、mTORC活性化とLRS結合は、RagGTPaseのGTP/GDP結合状態により影響を受けることがある。実際に、GTP-結合RagA又はRagBのヘテロダイマー、及び、GTP-結合RagC又はRagDのヘテロダイマーは、mTORC1への強い結合を示すことが知られている(Sancak Y、Peterson TR、Shaul YD、Lindquist RA、Thoreen CC、Bar-Peled L、Sabatini DM. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science 320(2008)、pp. 1496-1501.; Kim E、Goraksha-Hicks P、Li L、Neufeld TP、Guan KL. Regulation of TORC1 by Rag GTPases in nutrient response. Nat Cell Biol. 10(2008)、pp. 935-945.)。

【0197】

RagGTPaseヘテロダイマーの中で、mTORC1と強く相互作用するGTP結合RagB及びGTP結合RagDのヘテロダイマーは、mTORC1経路を活性化させるばかりでなく、ロイシン又はアミノ酸の欠乏を鈍くする(Sancak Y、Peterson TR、Shaul YD、Lindquist RA、Thoreen CC、Bar-Peled L、Sabatini DM. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science 320(2008)、pp. 1496-1501.)。

【0198】

連続して、GTP結合RagB及びGDP結合RagDの組合せが、ロイシンとアミノ酸のS6Kリン酸化反応下で高い効果を示すことも観察した（図６Ａ、６Ｂ)。

【0199】

RagDのGTP/GDP状態が、LRS結合に影響を及ぼすか否かを調べた。HA-RagDの形質感染293T細胞分解物はGDPβS又はGTPγSの存在下でGST又はGST-LRSと培養され、次いで免疫ブロット分析が行われた。GDPβSは、LRSのRagDへの結合親和力をかなり減少せたが、GTPγSはそうではなかった（図６Ｃ）。さらに、myc-tagged RagD WT、GTP結合形態（Ｑ121L）又はGTP結合形態（S77L）形質感染細胞を用いて、in vitro結合分析を行った。一貫して、RagDのS77L突然変異は、LRSに対する低い親和力（図６Ｄ）を示し、LRSとRagD間の相互作用は、RagDのGTP/GDP周期により調節された。GTPの細胞内濃度はGDPより高いので（Lowy, 1998）、RagDのGTP形態（Ｑ121L）は、RagD WTと比較できるLRSとの結合親和力を示す。LRSとRagDの結合が、GTP/GDP状態によって影響を受けるか否かを調べた。myc-RagDの異なる形態（WT、GTP、GDP形態）は、293T細胞においてFLAG-LRSと共に発現され、それらのLRSとの結合は、LRSとRagDの免疫共沈殿（coimmunoprecipitation）により比較された。RagD Ｑ121Lは、RagD WTよりLRSに高い親和力を示すが、RagD S77Lは、LRSに極めて弱い結合を有する（図６Ｅ）。次に、RagD GTPaseのGTP/GDP状態で、LRSとRagA/B及びRagDのヘテロダイマー間の相互作用を観察した。
興味深いことに、LRSとRagA/D又はRagB/Dヘテロダイマー間の相互作用は、RagA又はRagBではなく、RagDのGTP/GDP状態により決定された（図６Ｆ、６Ｇ）。GDP-結合RagDではなく、GTP-結合RagDが、LRSと強く相互作用する。このような結果は、LRSは、RagA又はRagBのGTP/GDP周期に及ぼす効果がなく、LRSはGTP結合RagDとダイナミックな関連があって、本質的なGTPase活性によりGTP結合がGDPに変化する時に、GDP-結合RagDから分離する。RagDのGTP形態は、mTORC1活性化を抑制するので、GTPからGDPへの移行を促進するために、LRSは、非活性Ragヘテロダイマーと結合し、mTORC1活性化のための活性Ragヘテロダイマーから分離するものと思われる。

【0200】

７．LRSは、RagD GTPaseのためのGTPase活性化蛋白質の役割をする
LRSは、RagDのGDP形態ではなく、RagDのGTP形態と相互作用するので、LRSが、mTORC1経路を活性化させるRagD GTPaseの機能をするGTPase活性化蛋白質（GAP）を有するか否かを調べた。まず、RagDのアミノ酸から誘導されるGTP/GDP状態を確認した。以前のモデルと一致するように、細胞のアミノ酸刺激は、RagDのGDP形態を増加させた（図12）。in vitro GTPase分析において、WT LRSの断片(759-1176a.a)の追加が、量及び時間依存方式（図７Ａ、Ｂ）で、RagD GTPaseにより、GTP加水分解を増加させ、これはLRSが、RagD GTPaseに対する内在的なGAP活性を有することを示す。アミノ酸配列の配置から、LRSが、幾つかのArf-GAP蛋白質（図７Ｃ）から見つかると推定されるGAPモチーフを有することを発見した。LRSのモチーフが実際にGAP活性に重要であることを証明するために、推定LRS GAPモチーフのアラニン突然変異（H844AとR845A）を作った。in vitro GTPase分析において、H844AとR845A突然変異は、WT LRSがGAP活性（図７Ｄ）を示す一方で、それらのGAP活性を失った。次に、ロイシン誘導性mTORC1の活性化に対するH844A又はR845Aの効果を調べた。WT LRSがロイシンから誘導されたS6Kリン酸化を増加させる一方で、H844AとR845A突然変異は、それらの活性を失った。このような結果は、LRSが、RagD GTPaseに対するGAPとして機能し、mTORC1の活性化を活性させることを明らかに示している。LRSの細胞質におけるARS複合体との結合と、リソソーム内のRagD GTPaseとの結合は、独立的に起るであろう。リソソームLRSは、RagDと相互作用して、Rag GTPaseの非活性ヘテロダイマーから活性形態への転換を促進し、mTORC1（図７Ｆ）の活性化を導く。

【0201】

８．LRSとRagD間の結合親和度の測定のためのELISA分析
精製されたGST-RagDを、多様な濃度のHis-LRS-(1-1176)でコーティングされたplateで培養し、抗GST抗体を用いてELISAを行った。ELISAの結果は、図13の通りである。

【0202】

その結果、RagDがLRSに結合することが示された。さらに、His-LRS-(1-1176)でコーティングされたplateでGST-RagDを培養する過程で、His-LRS-(759-1176)が添加されると、RagDとLRSの結合が阻害され、LRSの759-1176残基が、RagDとの結合に関与して、LRS-(1-1176)とRagD間の結合を阻害したことが示唆された。さらに、このような蛋白質オーバレイ方式（protein overlay method）によるELISA結果は、特異性のある結果であると考えられる。

【0203】

[適用例１]
抗癌と抗腫瘍
多数の癌腫（リンパ腫、黒色腫、乳房癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌)が、mTOR経路で翻訳された突然変異遺伝子を有することが明らかになった(Guertin D ET AL.、An expanding role for mTOR in cancer.Trends Mol.Med.11(2005)、pp354-361)。本発明のLRSとRagD間の結合を阻害する試験製剤は、mTOR経路での翻訳による突然変異遺伝子の発生を抑制するために、mTOR経路を抑制する抗ガン剤として使用することができる。

【0204】

[適用例２]
mTOR経路は、脂質代謝に関与することが知られており、脂肪先駆細胞の過発現による脂質の過度な生産は、mTOR経路の活性化の増加を誘発することが明らかになった(Kim, J. E and Chen, J, Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-γactivity by mammalian target of rapamycin and amino acids in adipogenesis, Diabetes, 52(2004), pp 1748-1756; Cho, H. et al., Regulation of adipocyte differentiation and insulin action with rapamycin. Biochem. biophys. Res. Cmmun., 321(2004), pp 942-948))。特に、mTOR経路が、脂質蓄積と脂肪細胞の成長に深く関与することが明らかになった（Um,S.et al.,Absence of S6K1 protects against age-and dict-induced obesity while enhancing insulin sensitivity、Nature、431(2004)、pp 200-205)。本発明の試験製剤は、mTOR経路の活性を抑制して、肥満に影響を与える過度な脂質生産と脂質蓄積を効果的に防止することができる。

【産業上の利用可能性】

【0205】

以上説明した通り、本発明は、LRSの新規な用途であるmTORC1媒介疾患の予防及び治療剤をスクリーニングする方法と、細胞の大きさを減少させる方法を提供する。本発明の方法は、細胞の大きさを調節できる新たな方法を提供し、スクリーニング方法は、癌などの疾患の新たな治療剤の開発に有用に利用することができる。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図1g】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図2i】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図3f】

【図3g】

【図3h】

【図3i】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図6e】

【図6f】

【図6g】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図7f】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図9d】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【図10d】

【図10e】

【図11a】

【図11b】

【図11c】

【図12】

【図13a】

【図13b】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]