特許 6167075 ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８およびその検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6167075

(24)【登録日】2017年6月30日

(45)【発行日】2017年7月19日

(54)【発明の名称】ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８およびその検出方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20060101AFI20170710BHJP

   A01H 5/02 20060101ALI20170710BHJP

   A01H 5/06 20060101ALI20170710BHJP

   A01H 5/04 20060101ALI20170710BHJP

   A01H 5/10 20060101ALI20170710BHJP

   A01H 5/12 20060101ALI20170710BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20170710BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170710BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170710BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20170710BHJP

【ＦＩ】

   A01H5/00 AZNA

   A01H5/02

   A01H5/06

   A01H5/04

   A01H5/10

   A01H5/12

   A01H1/00 A

   C12N5/10

   C12N15/00 A

   C12Q1/68 A

【請求項の数】23

【外国語出願】

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2014-163010(P2014-163010)

(22)【出願日】2014年8月8日

(62)【分割の表示】特願2008-513729(P2008-513729)の分割

【原出願日】2006年5月26日

(65)【公開番号】特開2015-6192(P2015-6192A)

(43)【公開日】2015年1月15日

【審査請求日】2014年8月8日

(31)【優先権主張番号】60/685,584

(32)【優先日】2005年5月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】501231613

【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100156122

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 剛

(72)【発明者】

【氏名】マリアン・マルベン

(72)【発明者】

【氏名】ジェニファー・ラインハート

(72)【発明者】

【氏名】ナンシー・テイラー

(72)【発明者】

【氏名】エレン・ディキンソン

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０６−５００４７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／００６６５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０７００２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Mol. Appl. Genet.，１９８２年，vol. 1，361-370

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｈ ５／００

Ａ０１Ｈ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣｉＮｉｉ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号：９を含むグリホサート耐性ダイズ植物またはその器官。

【請求項2】

種子が配列番号：９を含む、請求項１記載のグリホサート耐性ダイズ植物の種子。

【請求項3】

細胞、花粉、胚珠、花、苗条、根または葉と定義された、請求項１記載のグリホサート耐性ダイズ植物器官。

【請求項4】

配列番号：９を含むグリホサート耐性ダイズ植物のいずれかの世代の子孫植物とさらに定義された、請求項１記載のグリホサート耐性ダイズ植物。

【請求項5】

該植物のゲノムが、ＤＮＡ増幅方法において試験された場合、単位複製配列を生成し、該単位複製配列が配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４を含む、請求項１記載のグリホサート耐性ダイズ植物。

【請求項6】

種子のＤＮＡが、ＤＮＡ増幅方法において試験された場合、単位複製配列を生成し、該単位複製配列が配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４を含む、請求項２記載のグリホサート耐性ダイズ植物の種子。

【請求項7】

（ａ）配列番号：９を含む第１のグリホサート耐性ダイズ植物を配列番号：９を欠く第２のダイズ植物と交配させて、子孫植物を生成し；次いで
（ｂ）配列番号：９を含む少なくとも１つの第１のグリホサート耐性子孫植物を選択する工程を含むことを特徴とする、グリホサート除草剤に耐性なダイズ植物を生成する方法。

【請求項8】

該第１のグリホサート耐性子孫植物を自配して第２世代の子孫を生成し、次いで、配列番号：９に同型接合の少なくとも１つの第１のグリホサート耐性植物を選択することをさらに含む、請求項７記載の方法。

【請求項9】

試料中の事象ＭＯＮ８９７８８に対応する核酸の存在を検出する方法であって、
（ａ）ダイズＤＮＡの試料を得；次いで
（ｂ）事象ＭＯＮ８９７８８からのＤＮＡ配列の存在につき試料をアッセイすることを含み、
ここに、ＤＮＡ試料のアッセイが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３もしくは配列番号：４またはそれらの相補体の少なくとも１つの核酸配列の存在を検出することを含むことを特徴とする、該方法。

【請求項10】

事象ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物を含む圃場における雑草の成長を防除する方法であって、雑草の成長を防除するのに有効なグリホサート量で圃場を処理することを含み、ダイズ植物がグリホサートに対する耐性を示すことを特徴とする、該方法。

【請求項11】

圃場の処理が、Ｖ１からＲ４成長期まで実行されることを特徴とする、請求項１０記載の方法。

【請求項12】

該単位複製配列が配列番号：１を含む、請求項５記載のグリホサート耐性ダイズ植物。

【請求項13】

該単位複製配列が配列番号：２を含む、請求項５記載のグリホサート耐性ダイズ植物。

【請求項14】

該単位複製配列が配列番号：３を含む、請求項５記載のグリホサート耐性ダイズ植物。

【請求項15】

該単位複製配列が配列番号：４を含む、請求項５記載のグリホサート耐性ダイズ植物。

【請求項16】

該単位複製配列が配列番号：１を含む、請求項６記載のグリホサート耐性ダイズ植物の種子。

【請求項17】

該単位複製配列が配列番号：２を含む、請求項６記載のグリホサート耐性ダイズ植物の種子。

【請求項18】

該単位複製配列が配列番号：３を含む、請求項６記載のグリホサート耐性ダイズ植物の種子。

【請求項19】

該単位複製配列が配列番号：４を含む、請求項６記載のグリホサート耐性ダイズ植物の種子。

【請求項20】

ＤＮＡ試料のアッセイが、配列番号：１またはそれらの相補体の少なくとも１つの核酸配列の存在を検出することを含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。

【請求項21】

ＤＮＡ試料のアッセイが、配列番号：２またはそれらの相補体の少なくとも１つの核酸配列の存在を検出することを含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。

【請求項22】

ＤＮＡ試料のアッセイが、配列番号：３またはそれらの相補体の少なくとも１つの核酸配列の存在を検出することを含むことを特徴とする、請求項９記載の方法。

【請求項23】

ＤＮＡ試料のアッセイが、配列番号：４またはそれらの相補体の少なくとも１つの核酸配列の存在を検出することを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２００５年５月２７日付で出願した米国仮出願第６０／６８５，５８４号の優先権を主張し、その全開示をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
本発明は、ＭＯＮ８９７８８と指定される新しくかつ特殊な遺伝子組換えダイズ形質転換事象、それから誘導したダイズ培養品種、その植物器官、種子および生産物に関する。また、本発明は、植物器官抽出物または種子抽出物中のＭＯＮ８９７８８に特異的なＤＮＡ分子の存在を検出するアッセイ方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ダイズ（Glycine max）は世界の多数の領域における重要な作物である。バイオテクノロジー方法は、農業形質および生産物の質の改良のためにダイズに適用された。ダイズ生成に重要なかかる１つの農業形質は、除草剤耐性、特に、グリホサート除草剤に対する耐性である。除草剤耐性のダイズ事象は、雑草を管理するための有用な形質であろう。

【0003】

グリホサートとしても知られているＮ−ホスホノメチルグリシンは、広域スペクトルの植物種に対し活性を有するよく知られた除草剤である。グリホサートは、環境において望ましく短い半減期を有する安全な除草剤であるRoundup^R (Monsanto Co., St. Louis, MO)の有効成分である。植物表面に適用された場合、グリホサートは植物を介して全体に移動する。グリホサートは、芳香族アミノ酸の合成のために前駆体を提供するシキミ酸経路のその抑制により植物毒素である。グリホサートは、植物中で見出された酵素５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を抑制する。

【0004】

グリホサート耐性は、グリホサートに対しより低い親和性を有し、従って、グリホサートの存在下それらの触媒活性を保持するＥＰＳＰＳ変異体の発現によって達成できる（米国特許第５，６３３，４３５号；第５，０９４，９４５号；第４，５３５，０６０号および第６，０４０，４９７号）。また、植物組織においてグリホサートを分解する酵素（米国特許第５，４６３，１７５号）は、グリホサートに対する細胞耐性を付与できる。かかる遺伝子は、グリホサートに対して耐性である遺伝子組換え作物の生成に用いられ、それにより、グリホサートが作物被害の最小の懸念で、有効な雑草防除に用いられるのを可能にする。例えば、グリホサート耐性は、トウモロコシ（米国特許第５，５５４，７９８号）、小麦（米国特許第６，６８９，８８０号）、綿（米国特許第６，７４０，４８８号）、ダイズ（ＷＯ ９２００３７７）およびキャノーラ（米国特許出願第２００４００１８５１８号）に遺伝子操作された。また、グリホサート耐性についての導入遺伝子および他の除草剤に対する耐性についての導入遺伝子、例えば、バー遺伝子(Tokiら, 1992; Thompsonら, 1987; ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素 (DeBlockら, 1987), グルホシネート除草剤に対する耐性について)は、選択マーカーまたはスコアマーカーとして有用であり、他の農業的に有用な形質と連結された植物の選択に有用な発現型を提供できる。

【0005】

植物における外来遺伝子の発現は、恐らく染色質構造（例えば、異質染色質）または組込み部位に近い転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近隣により、それらの染色体の位置によって影響されることが知られている(Weisingら, 1988)。この理由のために、導入された注目する遺伝子の最適な発現によって特徴付けられた事象を同定するために多数の事象をスクリーニングすることがしばしば必要である。例えば、事象中の導入された遺伝子の発現レベルにおける広範囲の変化が存在し得ることが、植物および他の生物に観察されている。また、導入された遺伝子構築体に存在する転写調節エレメントから期待されたパターンに対応し得ない空間的または一時的なパターンの発現における差、例えば、様々な植物組織における導入遺伝子の相対的な発現における差が存在し得る。この理由のため、何百から何千もの異なった事象を生成し、商業目的のための導入遺伝子の所望の発現レベルおよびパターンを有する単一事象についてそれらの事象をスクリーニングすることが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルまたはパターンを有する事象は、従来の育種方法を用いて、性的異系交配によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するのに有用である。かかる交配の子孫は、元来の形質転換体の導入遺伝子発現特性を維持する。この戦略を用いて、局所的な栽培条件に良好に適応される多数の品種における信頼できる遺伝子発現を保証する。

【0006】

性的交配の子孫が注目する導入遺伝子を含むかを決定するために特定の事象の存在を検出できることは有利であろう。さらに、例えば、特定の事象を検出する方法は、市販前承認を必要とし、組換え作物植物から誘導した食品をラベルする規制に従うことに有用であろう。ポリ核酸プローブを用いるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）およびＤＮＡハイブリダイゼーションのごとき、いずれかのよく知られたポリ核酸検出方法による導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般的に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子等のごとき、頻繁に使用される遺伝子エレメントに焦点を合わせる。結果的に、かかる方法は、挿入された導入遺伝子ＤＮＡに隣接する染色体ＤＮＡ（「フランキングＤＮＡ」）の配列が知られていない限りは、異なった事象、特に、同一のＤＮＡを用いて生成されたものを区別するのに有用ではないかもしれない。事象に特異的なＰＣＲアッセイは、例えば、Windelsら (1999)によって言及され、彼らは、挿入導入遺伝子およびフランキングＤＮＡ間の結合にわたるプライマーセット、具体的には、挿入断片からの配列を含む第１のプライマー、およびフランキングＤＮＡからの配列を含む第２のプライマーを用いてＰＣＲによるグリホサート耐性ダイズ事象40-3-2を同定した。また、遺伝子組換え植物事象に特異的なＤＮＡ検出方法は、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第６，８９３，８２６号；第６，８２５，４００号；第６，７４０，４８８号；第６，７３３，９７４号および第６，６８９，８８０号；第６，９００，０１４号および第６，８１８，８０７号に記載されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、グリホサート耐性ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８（ＭＯＮ１９７８８またはＧＭ＿Ａ１９７８８ともいう）、ならびにＭＯＮ８９７８８から誘導された植物およびその子孫ならびに植物組織についての検出方法に有用であるこれらのダイズ植物中に含まれるＤＮＡ分子に関する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、米国培養菌保存施設（American Type Culture Collection, ATCC）で受入番号ＰＴＡ−６７０８で寄託された代表的な種子を有するＭＯＮ８９７８８（ＭＯＮ１９７８８ともいう）で指定されたダイズ遺伝子組換え事象およびその子孫を提供する。本発明のもう一つの態様は、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８の植物の植物細胞または再生可能な器官ならびに種子である。また、本発明は、限定されるものではないが、ＭＯＮ８９７８８から誘導された細胞、花粉、胚珠、花、苗条、根、葉、および生産物、例えば、ダイズのミール、粉末および油を含むダイズ事象ＭＯＮ８９７８８の植物器官を含む。

【0009】

本発明の１つの態様は、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８植物もしくは種子または植物の器官もしくは種子から誘導された生産物からのＤＮＡ導入遺伝子／ゲノムの結合領域の存在を検出するための組成物および方法を提供する。配列番号：１および配列番号：２ならびにその相補体よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子組換え／ゲノムの結合ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子が提供され、その結合分子は、ダイズ細胞のゲノムに挿入された異種ＤＮＡ、ならびに挿入部位ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８に隣接するダイズ細胞からのゲノムＤＮＡを含む挿入部位にわたる。本発明の１つの態様において、かかる結合配列（junction sequence）は、各々、配列番号：９のヌクレオチド１０９３−１１１３または５３９６−５４１６を含むと定義され得る。本発明の他の態様において、結合は、フランキングゲノムおよび導入遺伝子のさらなる部分を含むと定義でき、例えば、配列番号：９のヌクレオチド１０７３−１１１３、１０４３−１１１３、１０９３−１１３３、１０９３−１１６３、１０４３−１１６３、５３７６−５４１６、５３４６−５４１６、５３９６−５４３６、５３９６−５４１６、５３９６−５４６６または５３４６−５４６６により与えられた１以上の配列を含むと定義し得る。従って、かかる配列ならびにこれらの配列を含む植物および種子は、本発明の１つの態様を形成する。

【0010】

ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８からのＤＮＡ導入遺伝子／ゲノム領域の配列番号：３またはその相補体である新規なＤＮＡ分子が提供される。そのゲノム中に配列番号：３を含むダイズ植物および種子は、本発明の態様である。配列番号：３は、さらにその全体の配列番号：１を含む。

【0011】

本発明のもう一つの態様により、ＤＮＡ導入遺伝子／ゲノム領域の配列番号：４またはその相補体であるＤＮＡ分子が提供され、このＤＮＡ分子はダイズ事象ＭＯＮ８９７８８に新規である。そのゲノム中に配列番号：４を含むダイズ植物および種子は、本発明の態様である。配列番号：４は、さらにその全体の配列番号：２を含む。

【0012】

本発明のもう一つの態様により、２つの核酸分子がＤＮＡ検出方法における使用に提供され、ここに、第１の核酸分子は、配列番号：３のＤＮＡ分子の導入遺伝子領域のいずれかの部分の少なくとも１１以上の近接するポリヌクレオチドを含み、第２の核酸は、配列番号：３の５’フランキングダイズゲノムＤＮＡ領域のいずれかの部分の同様の長さの分子であり、ここに、一緒に用いた場合のこれらの核酸分子は、単位複製配列を生成するＤＮＡ増幅方法におけるプライマーとして有用である。ＤＮＡ増幅方法におけるこれらのプライマーを用いて生成された単位複製配列は、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８ ＤＮＡに診断的である。配列番号：１を含む配列番号：３の一部分に相同的または相補的である記載されたプライマーにより生成された単位複製配列は、本発明の態様である。

【0013】

本発明のもう一つの態様により、２つの核酸分子が、ＤＮＡ検出方法における使用に提供され、第１の核酸分子は、配列番号：４のＤＮＡ分子の導入遺伝子領域のいずれかの部分の少なくとも１１以上の近接するポリヌクレオチドおよび、配列番号：４の３’フランキングダイズゲノムＤＮＡのいずれかの部分の同様の長さの第２の核酸分子を含み、一緒に用いた場合のこれらの核酸分子は単位複製配列を生成するＤＮＡ増幅方法におけるプライマーとして有用である。ＤＮＡ増幅方法におけるこれらのプライマーを用いて生成された単位複製配列は、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８ ＤＮＡに診断的である。配列番号：２を含む一部分の配列番号：４に相同的または相補的である記載されたプライマーにより生成された単位複製配列は、本発明の態様である。

【0014】

配列番号：３もしくは配列番号：４または配列番号：９もしくはその相補体から誘導したいずれかの核酸プライマー対は、本発明のもう一つの具体例であり、ここに、それらは、ＤＮＡ増幅に用いた場合、各々、配列番号：１もしくは配列番号：２または配列番号：９のいずれかの部分を含む単位複製配列のごときダイズ事象ＭＯＮ８９７８８誘導組織に診断的な単位複製配列を生じる。特定の具体例において、プライマー対は、プライマーＡ（配列番号：５）およびプライマーＤ（配列番号：８）よりなり得る。

【0015】

本発明のもう一つの態様は、事象ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物もしくは種子、または植物または種子から誘導した生産物であり、ここに、ダイズ植物もしくは種子、または生産物から単離される場合のゲノムＤＮＡは、配列番号：１または配列番号：２を含むＤＮＡ増幅方法における単位複製配列を生成する。

【0016】

依然として、本発明のもう一つの態様は、ＭＯＮ８９７８８を含む植物または種子から誘導したダイズ植物、種子または生産物であり、ここに、ダイズ植物、種子または生産物から単離された場合のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ増幅方法における単位複製配列を生成し、ＤＮＡプライマー分子配列番号：５および配列番号：６は、ＤＮＡ増幅方法に用いられる。

【0017】

さらに本発明のもう一つの態様は、ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物、種子、植物または種子から誘導した生産物または商品であり、ここに、ダイズ植物、種子または生産物から単離された場合のゲノムＤＮＡが、ＤＮＡ増幅方法における単位複製配列を生成し、ＤＮＡプライマー分子配列番号：７および配列番号：８が、ＤＮＡ増幅方法に用いられる。生産物または商品は、限定なくして、ＭＯＮ８９７８８を含む１以上の以下の生産物：レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、食用油、脱脂されたダイズフレーク、脱脂もしくは焼いたダイズミールを含めたダイズミール、豆乳凝乳、豆腐、ダイズ粉、ダイズ蛋白濃縮物、単離されたダイズ蛋白、植物蛋白水解物、加工ダイズ蛋白（textured soy protein）およびダイズ蛋白繊維を含むまたはそれらから誘導される食品または飼料生産物を含み得る。

【0018】

本発明のもう一つの態様により、試料におけるダイズ事象ＭＯＮ８９７８８ ＤＮＡに特に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料とＤＮＡプライマー対とを接触させ；（ｂ）核酸増幅反応を行い、それにより単位複製配列を生成し；次いで、（ｃ）単位複製配列を検出することを含み、該単位複製配列は配列番号：１または配列番号：２を含む。ＤＮＡ増幅に用いた場合に配列番号：１または配列番号：２を含む単位複製配列を生成するＤＮＡプライマー分子を含むキットは、本発明のさらなる態様である。

【0019】

本発明のもう一つの態様により、試料中のダイズ事象ＭＯＮ８９７８８ ＤＮＡに特に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８からのゲノムＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、対照ダイズ植物ＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしないプローブとＤＮＡを含む試料とを接触させ、；（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に付し；次いで、（ｃ）ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８ ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含み、ここに、前記プローブは配列番号：１または配列番号：２を含む。試料は、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８を含む子孫種子、植物または植物器官、またはＭＯＮ８９７８８を含む植物から誘導した以下のいずれかの生産物：レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、食用油、脱脂されたダイズフレーク、脱脂もしくは焼いたダイズミールを含めたダイズミール、豆乳凝乳、豆腐、ダイズ粉、ダイズ蛋白濃縮物、単離されたダイズ蛋白、植物蛋白水解物、加工ダイズ蛋白およびダイズ蛋白繊維を含み得る。配列番号：１または配列番号：２に相同的または相補的なＤＮＡ分子を含むＤＮＡプローブを含むキットは、本発明の態様である。また、配列番号：１８、配列番号：１９または配列番号：２０またはそれらの相補体を含むＤＮＡ分子を含むキットは、本発明の態様である。

【0020】

本発明のもう一つの態様により、グリホサートの適用を許容するダイズ植物を生成する方法が提供され、それは、（ａ）事象ＭＯＮ８９７８８を含む第１の親グリホサート耐性ダイズ植物、およびグリホサート耐性を欠く、第２の親ダイズ植物を性的交配させ、それにより、複数子孫植物を生成し；次いで、（ｂ）グリホサートの適用を許容する子孫植物を選択する工程を含む。加えて、育種方法は、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８を含む親の植物と、グリホサートに耐性でもある第２の親のダイズ植物に交配し、次いで、各親で見出されたグリホサート耐性の発現型に遺伝子的に連結した分子マーカーＤＮＡによりグリホサート耐性の子孫を選択する工程を含み得る。

【0021】

本発明のもう一つの態様は、ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物の圃場における雑草を防除する方法であり、ここに、該方法は、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−６７０８として寄託された代表的な種子の事象ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ種子を圃場に植え、該種子が、発芽するのを可能とし、次いで、該圃場における雑草生長を防除するのに有効な量のグリホサートで該植物を処理することを含む。

【0022】

本発明の前記および他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面からより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、事象ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物のゲノムにおける導入遺伝子挿入断片の組織化を示す。

【図2A】図２Ａは、ダイズからの商品生産物の加工を示す。

【図2B】図２Ｂは、ダイズからの商品生産物の加工を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

（詳細な説明）
本発明は、グリホサート耐性を供するＭＯＮ８９７８８と指定される新規なダイズ形質転換事象、ならびにその事象を含む植物、植物器官および種子および生産物から生成された植物器官および種子および生産物に関する。本発明は、ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ細胞のゲノム中に新規なＤＮＡ分子ならびに、試料中のＭＯＮ８９７８８ ＤＮＡを同定するための様々なＤＮＡ検出方法に用いることができるＤＮＡ分子を提供する。本発明は、グリホサート除草剤で事象ＭＯＮ８９７８８を含む植物を含む圃場における雑草を処理することにより、ＭＯＮ８９７８８を含む植物の圃場における雑草を防除する方法を提供する。

【0025】

以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義し、かつ本発明の実施における当業者をガイドするために提供される。特記しない限りは、用語は、関連技術分野における当業者により慣例的用法により理解されるべきものである。また、分子生物学における共通の用語の定義は、Riegerら (1991)およびLewin (1994)に見出すことができる。米国特許法施行規則§１．８２２に記載されたＤＮＡ塩基についての命名法が用いられる。

【0026】

本明細書に用いた「ダイズ」なる用語は、Glycine maxを意味し、ダイズで生育できる全ての植物品種を含む。
本明細書に用いた、「含む」なる用語は、「限定されるものではないが、...を含む」を意味する。
「グリホサート」とはＮ−ホスホノメチルグリシンおよびその塩類をいい、グリホサートはRoundup^Ｒ除草剤(Monsanto Co.)の有効成分である。「グリホサート除草剤」での処理とは、Roundup^R、Roundup Ultra^R, Roundup Pro^R除草剤またはグリホサートを含むいずれの他の除草剤処方での処理もいう。グリホサートの商業的処方の例は、限定なくして、ROUNDUP^R、ROUNDUP^R ULTRA、ROUNDUP^R ULTRAMAX、ROUNDUP^R CT、ROUNDUP^R EXTRA、ROUNDUP^R BIACTIVE、ROUNDUP^R BIOFORCE、RODEO^R、POLARIS^R、SPARK^RおよびACCORD^R除草剤として、Monsanto Companyにより販売されるもの、その全てはグリホサートをそのイソプロピルアンモニウム塩として含有する；ROUNDUP^R WEATHERMAX（グリホサートカリウム塩）、ROUNDUP^R DRYおよびRIVAL^R除草剤としてMonsanto Companyにより販売されるもの、それはグリホサートをそのアンモニウム塩として含有する； ROUNDUP^R GEOFORCEとしてMonsanto Companyにより販売されるもの、それはグリホサートをそのナトリウム塩として含有する；およびグリホサートをトリメチルスルホニウム塩として含有するTOUCHDOWN^R除草剤としてSyngenta Crop Protectionにより販売されるものを含む。これらのグリホサート除草剤処方のいずれかでの事象ＭＯＮ８９７８８を含むグリホサート耐性ダイズ植物を含む圃場の処理は、圃場における雑草生長を防除し、ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物の生長または収穫に影響しないであろう。

【0027】

遺伝子組換え「事象」は、異種ＤＮＡ、例えば、注目する導入遺伝子を含む核酸構築体での植物細胞の形質転換、植物のゲノム中への導入遺伝子の挿入に起因する植物の集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入により特徴付けられた特定の植物の選択により生成される。「事象」なる用語は、異種ＤＮＡを含む元来の形質転換体および形質転換体の子孫をいう。また、「事象」なる用語は、異種導入遺伝子ＤＮＡおよびフランキングゲノムＤＮＡを含む形質転換体およびもう一つの品種間の性的交配により生成された子孫をいう。また、「事象」なる用語は、挿入されたＤＮＡ（例えば、自配に起因する元来の形質転換体および子孫）を含む１つの親系および挿入されたＤＮＡを含まない親系の性的交配の結果として、注目する導入遺伝子を含む挿入されたＤＮＡを受け入れる子孫に移されることが期待できるであろう挿入されたＤＮＡおよび挿入されたＤＮＡに直ちに隣接するフランキングゲノム配列を含む元来の形質転換体からのＤＮＡをいう。

【0028】

グリホサート耐性ダイズ植物は、ＭＯＮ８９７８８を含む遺伝子組換えグリホサート耐性ダイズ植物から成長したダイズ植物、またはグリホサート耐性表現型を発現するかかる植物の交配の子孫であるダイズ植物、ならびにグリホサートに対する耐性を欠く第２の親ダイズ植物を最初に性的に交配させ、それにより、複数の第１の子孫植物を生成し、次いで、グリホサート除草剤の適用に耐性である子孫植物を選択することにより生育できる。これらの工程は、さらに、第２の親のダイズ植物または第３親のダイズ植物へのグリホサート耐性子孫植物の戻し交配、次いで、グリホサートでの適用もしくは形質と関連した分子マーカーでの同定による子孫の選択、それにより、グリホサート除草剤の適用を許容するダイズ植物を生成することを含む。事象ＭＯＮ８９７８８において導入遺伝子の挿入の５’および３’部位で同定された結合ＤＮＡ分子を含む分子マーカーを用いてもよい。

【0029】

また、２つの異なる遺伝子組換え植物を交配させて、２つの独立して分離している外来性の導入遺伝子を含む子孫を生成できると理解される。従前に記載された親植物への戻し交配および非遺伝子組換え植物との異系交配が、栄養繁殖であると考えられる。異なった形質および作物に一般的に用いられる他の育種方法の記載は、いくつかの引用文献の１つ、例えば、Fehr, (1987)に見出すことができる。

【0030】

「プローブ」は、通常の検出可能は標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素に結合する単離された核酸である。かかるプローブは標的核酸の鎖に、本発明の場合には、その事象からのＤＮＡを含むダイズ植物もしくは種子から、またはその植物もしくは種子の試料もしくは抽出物からの事象ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物からのゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸もしくはリボ核酸だけではなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために用いることができるポリアミドおよび他のプローブ物質を含む。

【0031】

「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的核酸鎖にアニーリングされて、プライマーと標的ポリ核酸鎖の間のハイブリッドを形成し、次いで、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより標的ポリ核酸鎖に沿って伸長された単離ポリヌクレオチド酸である。本発明のプライマー対は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅方法により、標的ポリ核酸分子の増幅のためのそれらの使用をいう。

【0032】

プローブおよびプライマーは、長さが一般的には、１１個以上のポリヌクレオチド、好ましくは１８個以上のポリヌクレオチド、より好ましくは２４個以上または３０個以上のポリヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的分子に特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的分子との完全な配列同一性を有するが、標的核酸とは異なり、高ストリンジェンシー条件下での標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブは、通常の方法により設計し得る。

【0033】

プローブおよびプライマーを調製および用いる方法は、例えば、Sambrookら (1989); Ausubelら (1992);およびInnisら (1990)に記載されている。ＰＣＲプライマー対（プライマーセット）は、例えば、Primer(Version 0.5, ^C 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)のごときその目的を意図したコンピュータプログラムを用いることにより、公知の配列から誘導できる。

【0034】

本明細書に開示されたフランキングゲノムＤＮＡおよび挿入断片配列に基づいたプライマーおよびプローブ（配列番号：１−４および９）を用いて、通常の方法、例えば、ＭＯＮ８９７８８を含む種子の貯蔵物から対応するＤＮＡ分子を単離し、次いで、かかる分子の核酸配列を決定することにより、開示された配列を確認および必要ならば補正できる。さらなる関連するＤＮＡ分子は、導入遺伝子挿入断片およびゲノムのフランキング領域を含むＭＯＮ８９７８８を含む細胞のゲノムから単離でき、これらの分子のフラグメントをプライマーまたはプローブとして用いてもよい。

【0035】

本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。いずれかの従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、試料中のＭＯＮ８９７８８事象からＤＮＡの存在を同定できる。核酸分子またはそのフラグメントは、ある環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズできる。本明細書に用いた、２つの核酸分子は、２つの分子が逆平行の二本鎖の核酸構造を形成でき、高ストリンジェンシー条件下でこの構造を維持するのに十分な長さであるならば、互いに特異的にハイブリダイズできるという。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、もう一つの核酸分子の「相補体」であるという。本明細書に用いた分子は、分子のうちの一方のすべてのヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を示すという。２つの分子が、それらが少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニーリングされ続けることを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズできるならば、「最小に相補的」であるという。同様に、分子は、それらが従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニーリングされ続けることを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズできるならば、「相補的」であるという。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら, 1989およびHaymesら (1985)により記載されている。従って、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成するための分子の能力を完全には排除しない限りは、許容可能である。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、使用された特定の溶媒および塩濃度下で安定した二本鎖構造を形成できるのに十分に相補的であることを単に必要とする。

【0036】

本明細書に用いた、実質的に相同的な配列は、それが高ストリンジェンシー条件下で比較されている核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズするであろう核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促す適当なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃での６.０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いて、５０℃での２.０×ＳＳＣの洗浄が当業者に知られているか、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃での約２.０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃での約０.２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に増加できる。温度および塩の双方が変更できるか、または温度または塩濃度の一方を一定に保持し、他方を変更し得る。好ましい具体例において、本発明の核酸は、中程度のストリンジェントな条件下、例えば、約２.０×ＳＳＣおよび約６５℃で、１以上の配列番号：１−４および９に記載された核酸分子およびその相補体またはいずれかのフラグメントに特異的にハイブリダイズするであろう。特に好ましい具体例において、本発明の核酸は、高ストリンジェンシー条件下で、１以上の配列番号：１−４および９に記載された核酸分子、その相補体またはいずれかのフラグメントに特異的にハイブリダイズするであろう。本発明の１つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１もしくは配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体またはいずれかのフラグメントを含む。本発明のもう一つの態様において、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号：１または配列番号：２に記載された核酸配列またはその相補体またはいずれかのフラグメントと８０％と１００％との間、９０％と１００％との間の配列同一性を共有する。配列番号：１、配列番号：２またはその相補体またはいずれかのフラグメントを含む分子マーカーＤＮＡ分子を植物育種方法におけるマーカーとして用いて、ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなすCreganら (1997)における単純な配列反復ＤＮＡマーカー分析につき記載された方法と同様の遺伝子交配の子孫を同定し得る。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られた多数の方法より検出でき、これらは、限定されるものではないが、蛍光性タグ、放射活性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを含む。

【0037】

特定の増幅プライマー対を用いる（例えば、ＰＣＲによる）標的核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが結合する標的核酸配列にだけハイブリダイズするのを可能とし、好ましくは、ＤＮＡの熱増幅反応において、ユニークな増幅産物、単位複製配列を生成する条件である。

【0038】

「（標的配列）に特異的な」なる用語は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含む試料中の標的配列にだけハイブリダイズすることを示す。

【0039】

本明細書に用いた「増幅されたＤＮＡ」または「単位複製配列」とは、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物をいう。例えば、性的交配に起因するダイズ植物が遺伝子組換え事象ＭＯＮ８９７８８を含むか、または圃場から採取したダイズ試料がＭＯＮ８９７８８を含むか、またはミール、粉末または油のごときダイズ抽出物がＭＯＮ８９７８８を含むかを決定するために。ダイズ植物組織試料または抽出物から抽出したＤＮＡを、挿入された異種導入遺伝子ＤＮＡの挿入部位に隣接しているゲノムの領域から誘導したプライマー、ならびに事象ＤＮＡの存在に診断的である単位複製配列を生成するために挿入された異種導入遺伝子ＤＮＡから誘導した第２のプライマーを含むプライマー対を用いる核酸増幅方法に付してもよい。単位複製配列はある長さでのものであり、また、事象に診断的である配列を有する。単位複製配列は、長さが、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対、または＋約５０ヌクレオチド塩基対、または＋約２５０ヌクレオチド塩基対、または約３５０塩基対の組み合わせた長さの範囲内に有り得る。

【0040】

あるいは、プライマー対は、全挿入断片ヌクレオチド配列を含む単位複製配列を生成するように挿入されたＤＮＡの両側でのフランキングゲノム配列から誘導できる。植物ゲノム配列から誘導したプライマー対のメンバーは、挿入された導入遺伝子ＤＮＡ分子からある距離で配置でき、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から約２万のヌクレオチド塩基対までの範囲で有り得る。「単位複製配列」なる用語の使用は、ＤＮＡの熱増幅反応において形成し得るプライマー二量体を特に除外する。

【0041】

核酸増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含めた、当該技術分野において知られた種々の核酸増幅反応方法のいずれによっても達成できる。種々の増幅方法が当該技術分野において知られ、特に、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、およびInnisら (1990)に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、２２ｋｂ以下のゲノムＤＮＡおよび４２ｋｂ以下のバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発されている(Chengら, 1994)。これらの方法ならびにＤＮＡ増幅の当該技術分野において知れた他の方法は、本発明の実施に用いてもよい。ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８からの異種ＤＮＡ挿入断片の配列またはフランキング配列は、本明細書に提供された配列から誘導されたプライマーを用いる事象ゲノムからのかかる分子の増幅に続いて、ＰＣＲ単位複製配列または単離されたクローニングした導入遺伝子／ゲノムＤＮＡに適用された標準的ＤＮＡ配列決定方法により確認でき、必要ならば、補正できる。

【0042】

これらの方法により生成された単位複製配列は、複数の技術により検出し得る。隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ導入遺伝子配列の双方を重ねるＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される場合、かかる１つの方法は遺伝子ビット分析（Genetic Bit Analysis）(Nikiforovら, 1994)である。オリゴヌクレオチドはマイクロウェルプレートのウェル中に固定される。（挿入された配列における１つのプライマーおよび隣接したフランキングゲノム配列におけるものを用いる）注目する領域のＰＣＲにより、単鎖のＰＣＲ産物は、その固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズでき、予測された次の塩基に特異的なＤＮＡポリメラーゼおよび標識されたｄｄＮＴＰを用いて、一塩基伸長反応用の鋳型として機能できる。読み取りは、蛍光性またはＥＬＩＳＡベースであり得る。シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長により挿入断片／ゲノム配列の存在を示す。

【0043】

もう一つの方法は、Winge (2000)により記載されたピロシークエンシング（Pyrosequencing）技術である。この方法において、隣接したゲノムＤＮＡおよび挿入断片ＤＮＡ結合を重ねるオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、注目する領域（挿入された配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列におけるもの）からの単鎖のＰＣＲ産物にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５'ホスホ硫酸およびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄＮＴＰは個々に加えられ、組込みの結果、測定される光シグナルを生じる。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または複数塩基伸長による導入遺伝子挿入断片／フランキング配列の存在を示す。

【0044】

Chenら (1999)により記載された蛍光偏光法は、本発明の単位複製配列を検出するために用いることができる方法である。この方法を用いて、ゲノムフランキングおよび挿入されたＤＮＡ結合を重ねるオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、注目する領域（挿入されたＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列におけるもの）からの単鎖のＰＣＲ産物にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰが組み込まれる。組込みは、蛍光測定器を用いて、偏光における変化として測定できる。偏光における変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長により導入遺伝子挿入断片／フランキングゲノム配列の存在を示す。

【0045】

Taqman^Ｒ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)が、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量する方法として記載され、それはその製造者により提供された使用説明書において十分に理解される。略言すると、ゲノムフランキングおよび挿入断片ＤＮＡ結合を重ねるＦＲＥＴオリゴヌクレオチド・プローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入断片ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列におけるもの）は、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルする。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部位から離れて蛍光性の部位が切断および遊離される。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによりフランキングゲノム／導入遺伝子挿入断片配列の存在を示す。

【0046】

分子ビーコン（Molecular Beacons）は、Tyangiら (1996)に記載された配列検出における使用につき記載されている。略言すると、フランキングゲノムおよび挿入断片ＤＮＡ結合を重ねるＦＲＥＴオリゴヌクレオチド・プローブが設計される。ＦＲＥＴプローブのユニークな構造の結果、それは、蛍光性およびクエンチング部位を密接に近いままとする二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入断片ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列におけるもの）は、耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下でサイクルする。成功したＰＣＲ増幅後、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光性およびクエンチング部位のプローブ二次構造および空間的分離を除去する。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによりフランキングゲノム／導入遺伝子挿入断片配列の存在を示す。

【0047】

マイクロフリディクス（microfluidics）（米国特許公開第２００６０６８３９８号、米国特許第６，５４４，７３４号）のごとき記載された他の方法は、ＤＮＡ試料を分離および増幅する方法およびデバイスを提供する。光学色素を用いて、特異的なＤＮＡ分子を検出および定量した(WO/05017181)。特異的なＤＮＡ分子を結合し、次いで、検出できるＤＮＡ分子またはナノビーズの検出のための電子センサーを含むナノチューブ・デバイス(WO/06024023)は、本発明のＤＮＡ分子を検出するのに有用である。

【0048】

ＤＮＡ検出キットは、本願明細書に開示された組成物、およびＤＮＡ検出の技術における記載または知られた方法を用いて開発できる。このキットは、試料中のダイズ事象ＤＮＡの同定に有用であり、ＤＮＡを含むダイズ植物を生育させる方法に適用できる。このキットは、配列番号：１−４および９に相同的または相補的であるＤＮＡプライマーもしくはプローブ、またはＤＮＡの導入遺伝子の遺伝子エレメントに含まれたＤＮＡに相同的または相補的であるＤＮＡプライマーもしくはプローブを含むこともでき、これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応において、またはＤＮＡハイブリダイゼーション方法におけるプローブとして用いることができる。ダイズゲノム中に含まれ、図１に示した導入遺伝子の遺伝子エレメントのＤＮＡの構造は、導入遺伝子挿入断片に隣接するダイズＡ３２４４ゲノムの５’ゲノム領域、アグロバクテリウムチュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からの右境界領域（ＲＢ）の一部分を含む挿入断片、キメラプロモーターＦＭＶ／Ｔｓｆ１および関連する連結エレメント（米国特許第６，６６０，９１１号；ＦＭＶ／Ｅ１Ｆ１αともいう）、それはアラビドプシス（Arabidopsis）ＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドコード配列（本願明細書において、ＣＴＰ２またはＴＳ−ＡｔＥＰＳＰＳ ＣＴＰ２といい、米国特許第５，６３３，４３５号、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ（本願明細書において、ＣＰ４ ＥＰＳＰＳまたはａｒｏＡ：ＣＰ４という）に作動可能に連結され、アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＰ４およびコード配列から単離される、および植物細胞における増強された発現のために修飾されたコード配列、米国特許第５，６３３，４３５号）に作動可能に連結され、それは、エンドウ・リブロース１,５−ビスリン酸カルボキシラーゼからの３’終了領域に作動可能に連結され（本明細書において、Ｅ９ ３'またはＴ−Ｐｓ.ＲｂｃＳ：Ｅ９といい、Coruzziら, (1984）、アグロバクテリウムチュメファシエンス株からの左境界（ＬＢ）領域の一部分、およびその導入遺伝子に隣接するダイズＡ３２４４ゲノムの３’ゲノムの領域を含む。ＤＮＡ増幅方法におけるプライマーとして有用なＤＮＡ分子は、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８に含まれた導入遺伝子挿入断片の遺伝子エレメントの配列から誘導できる。これらのプライマー分子は、導入遺伝子挿入断片に隣接するダイズのゲノムから誘導したＤＮＡプライマー分子も含むプライマーセットの一部として用いることができる。ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介方法、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号および第７，００２，０５８号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された方法によるダイズ系Ａ３２４４の形質転換（米国特許第５，６５９，１１４号）により生成された。

【0049】

本発明の発明者は、そのゲノム中のＭＯＮ８９７８８のＴ型ゲノム領域（Ｔ型は、導入遺伝子および植物ゲノムの関連するハプロタイプ領域の組合せである）を含むダイズ系が、従前の４０−３−２ Ｔ型ゲノム領域を含む系に対し改善された収率を有することを見出した。これは、米国における複数の位置から採取された収率データを含めた複製された圃場試験において実証された（米国特許出願第６０／６８５５８４号）。

【0050】

以下の実施例は、本発明のある種の好ましい具体例の例を実証するために含まれる。以下の実施例に開示された技術が、発明者が本発明の実施において良好に機能することを見出したアプローチを表し、かくして、その実施のための好ましい様式の例を構成すると考えることができることは当業者により考えられるであろう。しかしながら、当業者は、本開示に徴して、多数の変更が、開示された特定の具体例においてなすことができ、依然として、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、同様または類似する結果を与えることを認識するであろう。

【実施例】

【0051】

実施例１
ＭＯＮ８９７８８ゲノムＤＮＡに診断的な単位複製配列の生成
遺伝子組換えダイズ事象ＭＯＮ８９７８８からのＤＮＡを、ダイズ種子、栄養組織またはミールを含む組織から抽出する。ＤＮＡを、製造者の使用説明書(Qiagen Corp. Valencia, CA)に従いQiagen's DNeasy Plant Miniprep Kitを用いて組織から単離する。

【0052】

ＭＯＮ８９７８８を含む植物のゲノムにおけるＴ−ＤＮＡ（導入遺伝子を含む転移ＤＮＡ）の５’末端に隣接するゲノムＤＮＡの一部分を含むＰＣＲ産物を生成する。このＤＮＡ産物は、配列番号：３を含む。そのＰＣＲは、導入遺伝子プロモーター中に配置された第２のプライマー（ＤＮＡプライマーＢ、配列番号：６）と対になった導入遺伝子挿入断片の５’末端（ＤＮＡプライマーＡ、配列番号：５、図１参照）に隣接するゲノムＤＮＡ配列にハイブリダイズするように設計された１つのプライマーを用いて行うこともできる（米国特許第６，６６０，９１１号、配列番号：２８、ここに出典明示して本明細書の一部とみなし、配列番号：９に見出される）。

【0053】

ＭＯＮ８９７８８を含む植物のゲノムにおけるＴ−ＤＮＡの３’末端に隣接するゲノムＤＮＡの一部分を含む導入遺伝子挿入断片の３’末端からＰＣＲ産物を生成する。このＤＮＡ産物は、配列番号：４を含む。各事象の挿入断片の３’末端に隣接するゲノムＤＮＡにハイブリダイズするように設計され、その挿入断片の３’末端にてＴ−Ｐｓ.ＲｂｃＳ：Ｅ９ ３'転写終了配列に配置された第２のプライマー（ＤＮＡプライマーＣ、配列番号：７）と対をなす１つのプライマー（ＤＮＡプライマーＤ、配列番号：８）を用いてＰＣＲを行うこともできる。

【0054】

ＰＣＲ鋳型は、約５０ｎｇのゲノムＤＮＡを含む。ネガティブ対照としての非遺伝子組換えダイズ栽培品種からの約５０ｎｇのゲノムＤＮＡを利用する。各ＰＣＲ反応液は、５μｌのREDAccuTa^TM LA DNA Polymerase Mix用１０×緩衝液(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)、２００μＭの各ｄＮＴＰ(Sigma-Aldrich)、０.４μＭの各プライマー、および２.５単位のJumpStart^TM REDTaq^TM DNA Polymerase (Sigma-Aldrich)を５０μｌの合計容積反応液中に含有する。ＰＣＲ反応を、以下のサイクル条件下：９４℃、３分間の１サイクル；９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間または１分間の３２または３５サイクル；７２℃で１０分間の１サイクルで行う。

【0055】

ＤＮＡ事象プライマー対を用いて、ＭＯＮ８９７８８ゲノムＤＮＡに診断的な単位複製配列を生成する。これらの事象プライマー対は、限定されるものではないが、その記載されたＤＮＡ増幅方法に用いられるプライマーＡおよびＢ（配列番号：５および６）および事象プライマー対ＣおよびＤ（配列番号：７および８）を含む。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応に用いた場合に、ダイズＭＯＮ８９７８８事象誘導の組織に診断的な配列番号：１もしくは配列番号：２を含む単位複製配列を生成する各々、配列番号：３もしくは配列番号：４、またはその相補体から誘導されたいずれのプライマー対も利用し得る。表１および表２に示したＤＮＡ増幅条件を用い、適当な事象プライマー対を用いて、ＭＯＮ８９７８８に診断的な単位複製配列を生成できる。ＭＯＮ８９７８８に診断的な単位複製配列を生成するのに用いたこれらの方法のいずれの修飾も、当該技術分野における技量内にある。ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物または種子のＤＮＡを推定上含む抽出物、あるいはＤＮＡ増幅方法において試験する場合に、ダイズ事象ＭＯＮ８９７８８に診断的な単位複製配列を生成するＭＯＮ８９７８８を含む植物から誘導された生産物を増幅用の鋳型として利用して、ＭＯＮ８９７８８が存在するかを決定し得る。

【0056】

単位複製配列は、ＰＣＲ方法に用いた場合に、事象ＭＯＮ８９７８８に診断的な単位複製配列を生成する配列番号：３または配列番号：４から誘導した少なくとも１つのプライマー配列の使用により生成される。例えば、ＭＯＮ８９７８８単位複製配列の生成は、表２に示したStratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーを用いて、または当業者に知られた方法および装置により行うことができる。

【0057】

【0058】

緩やかに混合し、もし必要ならば（サーモサイクラー上のホットトップなし）、各反応の上部に１−２滴の鉱油を滴下する。Stratagene Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA), MJ Engine (MJR-Biorad, Hercules, CA), Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer, Boston, MA)またはEppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany) サーモサイクラー中で以下のサイクリングパラメーター（表２）を用いてそのＰＣＲを進める。MJ EngineまたはEppendorf Mastercycler Gradientサーモサイクラーを計算モードで試行する。最大に設定されたランプ速度でPerkin-Elmer 9700 サーモサイクラーを試行する。

【0059】

【0060】

実施例２
導入遺伝子／ゲノム領域の配列決定およびサザン解析
ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定は、プライマーとしてさらなるＤＮＡ分子を設計するために用いることができ、ＭＯＮ８９７８８を含むダイズ植物または種子の同定を探索するＤＮＡを提供する。５’および３’導入遺伝子／ゲノム配列を表す予測されたサイズのＰＣＲ産物を、電気泳動による２.０％のアガロースゲル上のＰＣＲ産物の分離により単離した。ダイズゲノム中への導入遺伝子挿入間の挿入断片結合にわたる５’および３’ＤＮＡ領域を含むＰＣＲ産物を単離する。ＭＯＮ８９７８８についての５’および３’ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動に続いて、QIAquick Gel Extraction Kit (カタログ番号 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA)を用いるアガロース・マトリックスから単離することにより精製する。次いで、精製されたＰＣＲ産物を配列決定し（例えば、BI Prism^TM 377, PE Biosystems, Foster City, CA）、解析する(例えば、DNASTAR配列解析ソフトウェア, DNASTAR Inc., Madison, WI)。

【0061】

ＤＮＡ配列を、図１に示した事象ＭＯＮ８９７８８の導入遺伝子／ゲノム領域を表すヌクレオチド塩基対セグメントにつき決定し、配列番号：９と同定した。配列番号：９に含まれたゲノムおよび導入遺伝子エレメントを表３に記載する。５’および３’フランキング領域は配列番号：９に含まれ、それらを配列番号：２１および２２に与える。

【0062】

結合配列は、新規なＤＮＡ配列であり、ポリ核酸検出アッセイにおいて検出された場合にＭＯＮ８９７８８ ＤＮＡに診断的である比較的短いポリヌクレオチド分子である。配列番号：１および配列番号：２における結合配列は、ＭＯＮ８９７８８における導入遺伝子フラグメントおよびダイズゲノムＤＮＡの挿入部位の各側に１０のポリヌクレオチドを表す。より長いまたはより短いポリヌクレオチド結合配列は、配列番号：３または配列番号：４から選択できる。結合分子（５'結合領域 配列番号：１、および３'結合領域 配列番号：２）は、ＤＮＡ検出方法におけるＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマー分子として有用である。

【0063】

事象に特異的なＤＮＡ分子の検出のためのTaqman^Ｒ方法(Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA)に用いたプライマーおよびプローブを事象ＭＯＮ８９７８８のために開発した。プライマー分子は、ＳＱ２８２４（配列番号：１０）、ＳＱ２８２６（配列番号：１１）、ＳＱ１１４１（配列番号：１２）、ＳＱ１１４２（配列番号：１３）、ＳＱ５５４３（配列番号：１４）といい、プローブ分子を、ＰＢ８７１−６ＦＡＭ（配列番号：１５）、ＰＢ２１９１−ＶＩＣ（配列番号：１６）およびＰＢ５７−ＶＩＣ（配列番号：１７）という。プライマーおよびプローブを製造者の使用説明書に従いTaqman^Ｒ方法に用いて、ＭＯＮ８９７８８を含むＤＮＡに診断的な単位複製配列を供する。加工製品（例えば、ミール）を含むダイズ組織は、この方法につきＤＮＡの有用な源である。ダイズミールから単位複製配列を生成するために用いたさらなるプライマーは配列番号：１８〜２０を含む。

【0064】

【0065】

サザンブロット解析
ＭＯＮ８９７８８および対照ダイズゲノムＤＮＡ（各々の約１５μｇ）を含む植物からのゲノムＤＮＡを、１５μｌの対応する製造者の緩衝液(NEB, Beverly, MA)を含む１５０μｌの全容積において、種々の制限エンドヌクレアーゼ（１４０Ｕ）で消化する。制限エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｂｇｌ１１、ＢａｍＨ１、Ｎｃｏ１、Ｈｉｎｄ１１１、Ｂｃｌ１をＭＯＮ８９７８８のサザン解析に用いる。エンドヌクレアーゼ消化を適当な温度で少なくとも６時間行う。インキュベーション後、ＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２.５容のエタノールで沈殿させる。引き続いて、ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、４０μｌのＴＢＥに再懸濁させる。ローディングバッファー（０.２Ｘ）を試料に添加し、次いで、３０ボルトにて１６〜１８時間アガロースゲル（０.８％）上の電気泳動に付す。ゲルを臭化エチジウムで染色し、次いで、脱プリン溶液（０.１２５Ｎ ＨＣＬ）で１０分間、変性溶液（０.５Ｍ水酸化ナトリウム、１.５Ｍ塩化ナトリウム）で３０分間、および最後に中和溶液（０.５Ｍ Ｔｒｉｚｍａ塩基、１.５Ｍ塩化ナトリウム）で３０分間処理する。ＤＮＡを、４〜６時間、Turboblotter (Schleicher and Schuell, Dassel, Germany)を用いて、Hybond-N膜に移し、次いで、ＵＶ光を用いて膜に固定した。

【0066】

薄膜は、４５℃で２〜４時間、２０ｍｌのDIG Easy Hyb溶液(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; カタログ番号1603558)で予めハイブリダイズする。配列番号：１、もしくは配列番号：２、もしくは配列番号：３、もしくは配列番号：４に相同的または相補的である放射活性ＤＮＡプローブ（^３２Ｐ ｄＣＴＰ）、あるいはその一部分を、Radprime DNA Labelingキット(Invitrogen, Carlsbad, CA; カタログ番号18428-011)を用いて作成する。非取り込み型のヌクレオチドをSEPHADEX G-50カラム(Invitrogen)を用いて除去する。プレハイブリダイゼーション溶液を１ｍｌ当たり１００万カウントの最終濃度まで変性したプローブを含む予め暖めた１０ｍｌのDIG Easy Hyb溶液と交換する。ブロットを１６〜１８時間４５℃でハイブリダイズする。

【0067】

ブロットを４５℃にて低ストリンジェンシー溶液（０.１Ｘ ＳＤＳ、５Ｘ ＳＤＳ）で、次いで繰り返し、６５℃にて高ストリンジェンシー溶液（０.１Ｘ ＳＤＳ、０.１％ＳＤＳ）で洗浄する。ブロットを、蛍光スクリーン(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)に＞２時間曝露し、その曝露をData Storm 860 machine (Amersham Biosciences)を用いて読み取る。例示されたこれらの方法および条件は、試料中のＤＮＡを検出する当業者により飾され得る。

【0068】

実施例３
雑草防除
ＭＯＮ８９７８８を含むダイズの圃場における雑草の成長の防除。圃場にＭＯＮ８９７８８を含むダイズ種子を植え、種子は、植物に発芽することを可能とし、植物の圃場をグリホサートを含む除草剤処方で処理する。約０.２５ポンドａｅ／Ａ（グリホサート酸当量のポンド／エーカー）から３ポンドのａｅ／Ａ以上の処置率にて有効量のグリホサート処方を圃場に適用する。割合は、圃場における除草の成長を防除するのに必要なしばしば約０.７５ポンドａｅ／Ａから１.５ポンドａｅ／Ａの範囲にて栽培期に１以上の処置の頻度にて適用した。ＭＯＮ８９７８８を含む植物からの種子を処理した植物から収穫する。

【0069】

前記に開示され、特許請求の範囲に引用された事象ＭＯＮ８９７８８を表すダイズ種子のMonsanto Technology LLCの寄託を米国培養菌保存施設 (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20110でブダペスト条約下行った。事象ＭＯＮ８９７８８（ＭＯＮ１９７８８またはＧＭ＿Ａ１９７８８としても知られる）を含む寄託についてのＡＴＣＣ受入番号は、２００５年５月１１日に寄託されたＰＴＡ−６７０８である。その寄託は、３０年の期間の寄託、最後の請求後５年、または特許の有効期間、それより長期間維持され、その期間中に必要ならば置き換えるであろう。

【0070】

本発明の原理を示しかつ記載して、かかる原理から逸脱せずに、配置および詳細において本発明を修飾できることは当業者には明らかであろう。発明者らは、添付した特許請求の範囲の精神および範囲内にある修飾のすべてを特許請求する。

【0071】

個々の刊行物または特許出願が参照により組込まれるように特にかつ個々に示されるように、この明細書において引用された刊行物および公開された特許文献のすべてを、同じ程度まで参照により本願明細書に組込む。

【0072】

参考文献
以下の引用文献は、それらが本願明細書に記載されたものに補充された例示的な手続または他の詳細を提供する範囲まで、ここに出典明示して特に本明細書の一部とみなす。
米国特許第４，５３５，０６０号
米国特許第４，６８３，１９５号
米国特許第４，６８３，２０２号
米国特許第５，０９４，９４５号
米国特許第５，４６３，１７５号
米国特許第５，５５４，７９８号
米国特許第５，６３３，４３５号
米国特許第５，６３３，４３５号
米国特許第５，６５９，１１４号
米国特許第６，０４０，４９７号
米国特許第６，３８４，３０１号
米国特許第６，５４４，７３４号
米国特許第６，６６０，９１１号

【0073】

米国特許第６，６６０，９１１号
米国特許第６，６８９，８８０号
米国特許第６，６８９，８８０号
米国特許第６，７３３，９７４号
米国特許第６，７４０，４８８号
米国特許第６，７４０，４８８号
米国特許第６，８１８，８０７号
米国特許第６，８２５，４００号
米国特許第６，８９３，８２６号
米国特許第６，９００，０１４号
米国特許第７，００２，０５８号
米国出願６０／６８５５８４
米国公開２００４００１８５１８
米国公開２００６０６８３９８

【0074】

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【0075】

ＰＣＴ出願ＷＯ ９２００３７７
ＰＣＴ出願ＷＯ／０５０１７１８１
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【図1】

【図2A】

【図2B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]