特許 6169170 小麦からのサッカリド画分、単離方法及び本発明の使用分野

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6169170

(24)【登録日】2017年7月7日

(45)【発行日】2017年7月26日

(54)【発明の名称】小麦からのサッカリド画分、単離方法及び本発明の使用分野

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/899 20060101AFI20170713BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20170713BHJP

   A61K 8/9794 20170101ALI20170713BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20170713BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20170713BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/899

   A61P17/02

   A61P17/00

   A61K8/9794

   A61Q19/00

   A61K131:00

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2015-515497(P2015-515497)

(86)(22)【出願日】2013年6月4日

(65)【公表番号】特表2015-518871(P2015-518871A)

(43)【公表日】2015年7月6日

(86)【国際出願番号】EP2013061461

(87)【国際公開番号】WO2013182551

(87)【国際公開日】20131212

【審査請求日】2016年5月17日

(31)【優先権主張番号】FI2012A000104

(32)【優先日】2012年6月4日

(33)【優先権主張国】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】514309398

【氏名又は名称】ファルマチェウティチ ダモル エス．ピー．エー．

(74)【代理人】

【識別番号】100166338

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 正夫

(74)【代理人】

【識別番号】100152054

【弁理士】

【氏名又は名称】仲野 孝雅

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(72)【発明者】

【氏名】リッチオ・ロドルフォ

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０５−１７８７５０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ８／９７

Ａ６１Ｑ １９／００

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

分子量が３，０００〜３０，０００ダルトンの範囲内にある発芽した小麦種子から得られる画分を調製する方法であって、
ａ）水又は天然若しくは人工支持体上で、実生が得られるまでの、小麦種子の発芽
ｂ）前記実生の加熱処理
ｃ）水溶液中で得られる材料の解離
ｄ）滅菌されている第１透明溶液が得られるまで固形残留物を除去すること
ｅ）分子量が３，０００ダルトン未満の画分と分子量が３０，０００ダルトンを超える画分とを除去し、分子量が３，０００〜３０，０００ダルトンの範囲内にある画分の精製を達成すること
を提供し、
前記段階ａ）は、暗闇中、６０％Ｒ．Ｈを超える湿度、温度５〜２０℃で行われ、水又は不活性人工生長支持体上で、高さが３〜１５ｃｍにまで至る実生を得、
前記段階ｂ）は、高温（８５〜１５０℃）にて、任意には水を加えて、２５〜１２０分間行われ；また、この段階は、得られたままの又は寸法を小さくしたサイズに粉砕した植物材料に関して行われ、
前記段階ｃ）は、ｐＨ２〜７及び低温（２〜１０℃）にて行われる、方法。

【請求項2】

段階ｄ）は、合成膜、ろ紙、プレス、又は液固抽出器を用いて行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の方法によって得られるサッカリド画分。

【請求項4】

請求項１に従って得られる画分であって、皮膚上若しくは粘膜上の潰瘍、創傷又は皮膚の疾患の治療で用いるための活性成分としての、画分。

【請求項5】

請求項４に記載の画分の使用であって、いずれにしても皮膚の疾患を治療する化粧品の調製のための成分としての使用。

【請求項6】

賦形剤及び通常のキャリア物質と混合された請求項３に記載の画分を有効量で含有する医薬組成物。

【請求項7】

バイアル、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、溶液、薬剤、坐薬、胚珠、せっけん、フォーム、錠剤、粉末、又はミルクの形態である請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

賦形剤及び通常のキャリア物質と混合された請求項３に記載の画分を有効量で含有する化粧品組成物。

【請求項9】

バイアル、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、溶液、薬剤、坐薬、胚珠、せっけん、フォーム、錠剤、粉末、又はミルクの形態である請求項８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、天然抽出物、特には穀物からの抽出物の分野と、それらの単離方法とに関するものである。

【背景技術】

【0002】

現在、タンパク質型（例えば成長因子等）又はグリシン型（例えばヒアルロン酸、未処理デンプン若しくは加水分解デンプン及びその画分、他のＧＡＧ、グリコサミノグリカン等）の高分子、並びに各種植物（例えばアロエベラ、センテラアジアティカ等）から得られる化学的な定義のない抽出物の臨床及び化粧用途が普及しており、これらの製品は、広く使用され、例えば、表皮組織にかかわる疾患（例えば創傷又は潰瘍）において又は化粧目的のために使用される。

【0003】

ＥＰ ７４３ ３２３（出願人が同一である）には、例えば、デンプンから得られるサッカリド画分が記載されている。

【0004】

少ない研究ではあるが、例えば非特許文献１及び非特許文献２を参照すると、植物の発芽及び生長に用いられる方法を特定することなく得られ、ペプチド画分、ヘキソース及びヘキソサミンをも含有するサッカリド画分が記載されている。

【0005】

これらの抽出物は、上皮再形成段階ひいては瘢痕形成の刺激剤として使用され、皮膚炎の場合の無痛化剤、例えば皮膚軟化剤等があり、一般には皮膚及び粘膜の非感染性疾患すべてに使用される。

【0006】

上述の目的に使用される産物の有効性を広げるため、活性の増大した化合物を単離するため、そして、過度にコストをかけず例えば成長因子及び先に示した多くのグルコース材料等の産物を得るため、未だに上述したタイプの新規化合物の単離を研究対象としている。

【0007】

しかしながら、既に述べたとおり、上述した全ての天然抽出物（小麦抽出物を含む）は、不確定で多数の各種タイプの物質及び／又は高分子からなり、その大部分が特定されていない；そして、更には、特定されている成分のいずれかに活性が起因すると考えることも常に可能というわけではない。

【0008】

このような理由からも、植物材料及びそれから任意に精製され得る画分を得るための手段は、十分に標準化して記載されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】ＥＰ ７４３ ３２３

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】D’Agostino et al.“A fraction purified from Triticumvulgare has trophic effects on CaCO-2”[GASTROENTEROLOGY, ELSEVIER, PHILADELPHIA, vol. 104, n°4, Suppl, 1 January 1993, pp. 819]

【非特許文献2】Fiore et al.“Differential activities of Triticumvulgare extract and its fractions in mouse fibroblasts”[ACTA THERAPEUTICA Vol. 19, n°2, 1993 pages 151-162]

【発明の概要】

【0011】

逆に、驚くべきことには、本発明の主題である画分は−特定され且つ化学的に特徴付けられていることに加え、全抽出物の全活性を示しており、それ故に全抽出物の作用に関与する主要部分を表している。

【0012】

小麦の胚芽を水中で離解した（macerated）ものから抽出される画分であって、分子量が３〜３０ｋダルトンの範囲内にある画分について記載する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】参照ブランク（水）、本発明に従う画分（図中、ＣＰ画分と標識されている）、及び本発明に従う方法の段落（ｄ）で得られる画分が分離される図中ＴＶＥと示された画分をそれぞれ解析することによって得られたクロマトグラムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、小麦の胚芽を水中で離解したものから得られる抽出物の画分に関するものであり、それは、明らかに植物及び動物由来のものを除き、成長因子に特有である多数の生物学的特徴を有しており、また、タンパク質ではなく多糖の化学構造を有する；全く予期していなかった前述の特徴は、この画分を、薬剤並びに創傷及び潰瘍の治療に有用な製品の調製に対して特に興味のあるものにする。

【0015】

更に具体的には、本発明は、従来技術について述べたとろで上述したように既知の類似抽出物を得るために通常使用される条件下で、発芽した小麦の種子から得られる画分に関するものであり、分子量が３〜３０ｋダルトンの範囲内にある。

【0016】

覚えておくべきことは、本発明に従う画分が発芽していない種子には見られないものであり、そして、この画分（即ち３〜３０ｋダルトンの範囲内にある画分）だけが−又は主として−上述した特徴を有している。

【0017】

本発明によれば、本方法は、既知の方法に従って発芽した小麦から得られる生の抽出物の調製と、それに続くその活性画分の精製とを提供する。

【0018】

上述の方法は、以下に示す工程を含む：

【0019】

ａ）明るさ（好ましくは暗闇）、湿度（好ましくは６０％を超える湿度）、温度（好ましくは５〜２０℃）のあらゆる条件下で、小麦種子を発芽させ、水中及び／又は不活性である天然若しくは人工の生長支持体上で、好ましくは高さが３〜１５ｃｍにまで生長した苗条を得る；

【0020】

ｂ）次の工程の準備をし且つ微生物の増殖を防止するため、得られた植物材料（任意には予防的に小さいサイズに粉砕したものや水を加えたもの）を、８５〜１２５℃の範囲内にある温度にて、任意には水を加えて、加熱する；

【0021】

ｃ）得られた材料を離解させるが、該材料は、水中に置かれ（好ましくはｐＨ２〜４）、任意には解離のため低温（最高１０℃）にて放置する；

【0022】

ｄ）ろ過、プレス若しくはプレスにより、又は抽出器等の同等な他のシステムによって、固形残留物を除去し、滅菌され得る第１の透明溶液（生の抽出物として理解される）を得る

【0023】

ｅ）上述の溶液から、分子量が３，０００〜３０，０００ダルトンである画分を精製し、それ故に活性画分の含有率が上昇した第２の溶液を与える

【0024】

ｆ）上述の第２溶液から、分子量が３，０００〜３０，０００の範囲内にあることを特徴とする精製活性画分を単離する。

【0025】

必要に応じて、工程ａ）の前に、精製水で種子を湿らせてもよい。

【0026】

工程ｂ）及び工程ｄ）に言及される滅菌は、通常の技術に従い、好ましくはオートクレーブ中において行われる。

【0027】

工程ｃ）は、好ましくはｐＨ２〜４にて、好ましくは１〜７２時間行われる。

【0028】

工程ｃ）及び工程ｄ）における固形残留物の除去は、カール過程で行われてもよい。この場合、工程ｃ）の水に代えて、工程ｄ）で得られた溶液を、工程ｂ）に従って発芽した新しい実生に加えて、工程ｃ−ｄを繰り返す。このようにして、より増大した収率を得ることが可能になる。

【0029】

分子量が３０００未満及び３０，０００を超える画分の除去（工程ｅ）は、当該技術の専門家によって知られる通常の方法によって、例えばゲルろ過又は限外ろ過によって行われてもよい。

【0030】

類推によって、上述の技術を用い、興味のある画分を単離する。

【0031】

これまでに述べた分子量は、本発明の主題である画分を精製するために使用される限外ろ過膜について言及することを目的としている：かかる値は、球状タンパク質について言及しており、それ故に、それから分離された画分の真の分子量の指標にすぎないと考えられる：その理由でますます、サッカリド型で、線状及び枝分かれした構造を有し、それ故に決して球状ではない考察中の画分を選択する。

【0032】

その最終形態において、本発明の主題である画分は、通常の方法を用いて乾燥又は凍結乾燥されてもよいし、好ましくは、予め確立された既知の濃度で水溶液中に入れておく；任意には保存剤が加えられ及び／又は滅菌される。

【0033】

総称的に述べた上記方法は、以下に示す具体例によってより明確に説明される：

【実施例】

【0034】

１．発芽
湿らせた木材セルロース５ｋｇを一連の適したスチールタンク中に分布させる；この上に、次いで、予め水で刺激された小麦種子２．４ｋｇを分布させる；高さが５〜１５ｃｍの実生が得られるまで、暗闇にて数日間（４〜１０日）空調管理されたチャンバー内において、その種子を発芽させる。生長の間、その支持体は、十分な量の水を加えることにより毎日湿らされる。

【0035】

チャンバーの温度を５〜２０℃の範囲内に維持する；そして、相対湿度は≧６０％である。

【0036】

２．加熱
タンクの内容物を、密閉された適切な容器に置いて、次に１気圧にて１時間オートクレーブ処理する（約１２１℃）。

【0037】

３．解離及び抽出
次いで、その材料を適切な容量のあるスチール容器中に移し、１０％ｖ／ｖ硫酸１２０ｍｌ及び１０％ｖ／ｖ塩酸６０ｍｌを含有する精製水１００ｌを加える。解離は１〜７２時間進めることができる。次いで、その水相を３００気圧の圧力下で抽出し、使い尽くされた固相を除去する。

【0038】

このようにして得られる液体（「第１プレス」と定義される）に、１０％ｖ／ｖ硫酸１２０ｍｌ及び１０％ｖ／ｖ塩酸６０ｍｌを補充し、更に同等数の別のタンクの内容物と混合する。次いで、「第１プレス」と記載される手順を繰り返し、それ故に「第２プレス」を得る。

【0039】

同じ操作を再度繰り返し、それ故に「第３プレス」及び「第４プレス」を得る。

【0040】

抽出を得るために植物材料と接触させて置いておくと、その液相が精力的に混ざり、次いで冷所（５〜９℃）にて約２４〜７２時間置かれる。

【0041】

最終液体もまた冷所（５〜９℃）にて約２４〜７２時間置かれてもよい。

【0042】

４．ろ過及び滅菌
第４プレスからの液体を通常の方法によりろ過する；次に、１気圧１時間と等しいサイクルを適用して、それを適切な容器中でオートクレーブ処理する。

【0043】

５．限外ろ過
カットオフが３ｋダルトンであるカートリッジを備える適切な限外ろ過器具を用いて、先に得た液体を、該器具が認める最大まで限外ろ過する；保持された液体に水を加え、限外ろ過を２〜３回繰り返し、溶出した相中に含まれる低分子量を処分する。

【0044】

次いで、同じ方法を用いるが上記カートリッジをカットオフが３０ｋダルトンのものに置き換えて、３，０００ダルトンを超える分子量を含有する残留物を更に限外ろ過する：しかしながら、この場合、保持された残留物は、３０，０００ダルトンより大きな分子量を示しており、処分される一方、溶出した相には、分子量が３，０００〜３０，０００ダルトンの範囲内にある活性画分が含まれる。

【0045】

次いで、活性画分を含有する溶液をそのまま又は適切な支持体上で凍結乾燥させる（又は干上がらせる）；又はそれを滅菌する（実際は、保存剤、例えば２％ｗ／ｗフェノキシエタノールを加える）。

【0046】

Ａ．活性画分に関する化学データ
１．画分のクロマトグラフ分析
ＨＰＡＥ（高圧陰イオン交換）クロマトグラフシステムを選択し、特には炭水化物分析に使用されるＰＡＤ検出器（パルスアンペロメトリック検出器）と連結させた。

【0047】

上記クロマトグラフシステムは、以下の特徴を有する：
・バイナリ勾配を有する線形溶出のポンプシステム
溶離液１：０．５ＭのＮａＯＨ
溶離液２：０．５ＭのＮａＯＨ中における１Ｍの酢酸ナトリウム

【0048】

その勾配は、以下に示す線形プログラムによって課せられる（１．０ｍｌ／ｍｉｎに等しい一定流量）。ここで、％２は、ポンプ２に関連する溶離液の割合を全混合物に対して示す：

【0049】

【表1】

【0050】

・クロマトグラフィーカラム
Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１ Ｇｕａｒｄ プレカラム（１０〜３２）又は同等物付きＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１（４×２５０ｍｍ）であり、３５℃にて維持される。
・金電極を取り付けられたＰＡＤ検出器であり、以下に示す操作条件下にある：

【0051】

【表2】

【0052】

^＊標準溶液の調製
脱イオン水１００ｍｌ中における濃度が４〜１２ｍｇの範囲内にある一連の活性画分溶液を、参照基準として理解される、純粋な活性画分の濃縮溶液に基づいて調製する；又は参照基準に対して較正させた作業標準を用いる。

【0053】

^＊手順
ブランクとして１００μｌを注入して、溶離液システムの勾配におけるジャンプによる数ピークを除き、関連クロマトグラムが平面的であることを確認する。

【0054】

次いで、テスト溶液のそれぞれを１００μｌ注入する。

【0055】

精製した活性画分のサンプルのクロマトグラムは、Ｒｔが約４４分の単一ピークを有しており、正確に活性画分に対応する（図１参照。「ＣＰ画分」と標識されたサンプル）。

【0056】

精製した又は部分的に精製した抽出物のサンプルのクロマトグラムは、一連のピークを持つ特徴的なコースを示しており、その中でも、Ｒｔが約４４分のピークは活性画分に関するものである。

【0057】

２．加水分解を受けた画分のクロマトグラフ分析
このコントロール検査は、試験画分の多糖構造を構成する個々の単糖の性質を確認するために行われる。

【0058】

加水分解したサンプルに対して、ＨＰＡ（高性能イオン交換）クロマトグラフィーを用いる。

【0059】

器具の種類は、無処置の、即ち加水分解していない、画分を調べるために上述したものと同等である。

【0060】

手順
上記画分に０．３５％（ｖ／ｖ）ＨＣｌを加え、１００°にて２０時間加水分解させることにより、活性画分濃度が５〜７５ｍｇ／１００ｍｌの範囲内にあるサンプルに対して、加水分解を行う。

【0061】

ＨＰＡ分析条件は次の通りである：
Ｃａｒｂｏｐａｃｋ ＰＡ１，４×２５０ｍｍカラム
定組成溶離液 ０．０１７Ｎ ＮａＯＨ
一定流量 １ｍｌ／ｍｉｎ
ＰＥＤ検出
注入量：水で１〜１００に希釈された、加水分解サンプルの溶液７５μｌ

【0062】

より一般的な単糖を標準として用いて同等の分析を行う。

【0063】

調査中のサンプルには、多量のグルコースが支配的に存在していることが証明されたが、ここで、他のピーク（他の単糖又は類似物：マンノース、ガラクトース、グルコサミン、ペントース等に関するもの）は、見られないか又は微量にだけしか存在していない。

【0064】

加水分解の前に行われる同一の分析は、どんな単糖も存在していないことが類似して得られ、画分が多糖構造からなることを明らかにする。

【0065】

Ｂ．画分の生物学的活性
本発明に従う画分は、あらゆるタイプの創傷及び／又は潰瘍について、動物由来の成長因子と同様な、インビボでの顕著な再上皮形成及び治療的活性を持つことが分かった。それ故に、それは、創傷及び潰瘍を治療するための医薬品製造に使用できる。

【0066】

また、それは、インビトロで、線維芽細胞における細胞増殖とＯＤＣ活性のかなりの活性化を示す。

【0067】

また、成長因子に特有であるイノシトールリン脂質加水分解機構の活性化も実証された。

【0068】

治療活性は、以下において、様々な薬理学的研究によって説明される。

【0069】

１．線維芽細胞の細胞増殖の刺激テスト
線維芽細胞は、組織修復機構において基本的な役割を果たす細胞である。それ故に、上記テストは、本産物の治療的効果がこれら生物の細胞増殖刺激機構の結果として観察されるかどうかを確認するために行われる。

【0070】

手順
３Ｔ３マウス線維芽細胞の培養物を、１０％ｖ／ｖ仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリン（１０Ｕ／ｍｌ）が補充されたＤＭＶ培地に置く。これら培養物を、２５ｍｌＦａｌｃｏｎボトル中、５％ＣＯ２を含有する湿潤雰囲気において３７℃にて培養し、４〜６日毎に継代する。それ故に、集密的培養物をＰＢＳ３ｍｌで洗浄し、０．２５％のトリプシンを用いて３７℃にてトリプシン処理する。そのトリプシンを不活性化させるため、ＤＭＥ２ｍｌを加え、遠心分離後に得られる細胞ペレットを、播種に適している密度に達するまで、新鮮な培地で希釈する。

【0071】

低濃度のＣＳを含有する培地に静止状態で置いておかれた線維芽細胞に対して口蓋の刺激効果をテストする。５％ＣＳが補充されたＤＭＥ中のプレートにつき約２０００〜４０００細胞の密度にて、細胞を播種する。その培地を１８時間後に新しくし、０．６％ＣＳを含有する新鮮な培地と交換し、細胞を放置して、次の各活性テストの前に更に４８時間成長させる。問題になっているテストについては、本産物（水中で濃度２０ｍｇ／１００ｍｌに希釈したもの）を毎日加え、成長期間を通して２〜２０％ｖ／ｖの間で濃度を増大させる。

【0072】

５日目が終わり、培養物をトリプシン処理により細胞数を刺激し、その細胞をコールターカウンタで数える。

【0073】

結果
示された希釈度での本産物の添加は、細胞増殖の顕著で用量依存的な刺激を生じさせる。その効果は、本産物（先に示されたように希釈したもの）の５％の割合で有意なものになり始め、１０〜２０％で最大であり、濃度等価性のためのＣＳで示されたものよりわずかに低い量であるが、最高点ではコントロールと比べて少なくとも４倍大きい。

【0074】

２．ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）活性化テスト
オルニチンデカルボキシラーゼは、スペルミデン−ポリアミンの合成における重要な酵素であり、オリニチンアミノ酸のプトレシンへの転換を触媒する。これらポリアミンは、細胞増殖の過程を制御する上で補助的にかかわる。上記テストは、作られた線維芽細胞の成長を刺激する作用がＯＤＣ活性の増加と相関するかどうかを確認することによって行われる。

【0075】

手順
ＯＤＣの活性は、０．６％ＣＳ（仔ウシ血清）を含有する培地で成長した３Ｔ３細胞においてテストされ、線維芽細胞成長刺激テストにおいて上述したように用意される。

【0076】

ＯＤＣ活性は、１％から１０％ｖ／ｖに量を増加させる際に本産物（水中で希釈され、濃度２０ｍｇ／１００ｍｌ）を添加して、６時間後にＲｕｓｓｅｌｌ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６０ １４２０（１９６８）］に記載される方法によって測定される。

【0077】

結果
上記濃度で且つ上記テストされた条件下で、本産物は−添加の６時間後に及び用量依存的に−ＯＤＣの顕著な刺激を示し、コントロールより約４倍大きく、濃度等価性のためのＣＳと同程度である。

【0078】

３．イノシトール−リン脂質加水分解の刺激テスト
ある物質が活性化及び細胞増殖に関与する過程を活性化させることが可能である主要な生化学的機構の一つは膜イソシトールリン脂質の加水分解の特異的刺激にあり、それは、順に、第２メッセンジャー、イノシトール三リン酸（ＩｎｓＰ３）及びジアシルグリセロールの増加を生じることが文書で広く証明されている。この機構は、とりわけ、シグナル伝達の他のシステムと、例えば、インスリン及びインスリン様の因子の、ＥＧＦ（上皮増殖因子）の作用に関与するチロシンキナーゼの活性化と密接に関連がある。

【0079】

それ故に、３Ｔ３細胞におけるイノシトールリン酸の蓄積（ホスホイノシチド加水分解の特有の指標である）に関する本産物の効果を、ベースライン条件下及び、線維芽細胞におけるリン脂質の代謝の活性化因子であることが知られている、ＣＳ血清による刺激後の両方で、評価することは、かなり有利である。

【0080】

手順
イノシトールリン脂質の加水分解は、０．６％ＣＳ（仔ウシ血清）を含有する培地で成長した３Ｔ３細胞においてテストされ、線維芽細胞成長刺激テストにおいて上述したように用意される。

【0081】

静止状態に到達した時点で、細胞をＨａｍ Ｆ−１０培地（低濃度イノシトール）で洗浄し、０．６％ＣＳを加えて２４時間、２−［３Ｈ］ミオイノシトール０．６μｍｏｌを加えて２４時間３７℃にてインキュベートして、膜イノシトールリン脂質を標識する。このインキュベートの終わりに、１０ｍｍｏｌのＬｉＣｌ及び０．１％ＢＳＡを含有するＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で細胞を洗浄する。次いで、１０％ＣＳが有りの場合と無しの場合で、本産物（濃度が４ｍｇ／１００ｍｌの水溶液）の量を０から２０％（ｖ／ｖ）に増加させて、細胞を２４時間インキュベートする。

【0082】

次いで、イノシトールリン酸を以下の技術を用いて測定する：インキュベーション培地を吸引除去し、細胞を１／１／１（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノール／水で抽出し、遠心分離を受け、水相を取り、ギ酸塩形態で１ｍｌのＤｏｗｅｘ−１カラム上に装填し、カラムを水２４ｍｌで洗浄して、組み込まれていない標識付きイノシトールを除去する；次いで、０．２ｍギ酸アンモニウム及び０．１Ｍギ酸により洗浄してイノシトールリン酸を溶出する。次いで、シンチレーション分光により放射活性を決定する。

【0083】

結果
上記濃度で且つ上記テストされた条件下で、本産物は、イノシトールリン脂質の加水分解の顕著で且つ用量依存的な刺激を示し、コントロールより約４倍大きく、ＣＳ濃度等価物と同程度である。注目すべきは、本産物とＣＳの同時存在が、ＣＳ単独（及び本産物単独）よりも大きな活性化に導くことであり、２つの成分の間に有利な相乗効果があることが示唆される。

【0084】

４．実験的創傷に関するインビボでの治療テスト
インビボでの治療テストが、動物に対して局所塗布により行われ、創傷の治療における本産物の有効性を実証する。

【0085】

手順
上記テストは、２２０〜２５０ｇの範囲の重さがあるウィスター系雄ラットに対して行われる。テスト前の１週間、動物は、温度、湿度及び明るさが制御された条件に置かれる。なお、餌及び水には自由にアクセスできる。動物は、それぞれが１０匹の動物を含む同種の実験的グループに細分類される；一方のグループは、コントロールとして使用され、プラセボにより処置され、他方のグループは、本産物で処置される。

【0086】

テストの初日の朝に、すべての動物は、外科的処置を受け、以下の方法で得られる標準創傷を作る：軽い麻酔（１０％エチルウレタン、投与量１０ｍｌ／ｋｇ）を受け、そのようにした各動物の腰部領域を正確に剪毛し、消毒後、皮膚を直径２．５ｃｍの金属ディスクの刃で、局所処置の場合には８．５で、カットし、次いで、皮膚及び皮下組織を曲がった鉗子を用いて除去する。実質的に同一の創傷を全ての動物において得る。

【0087】

各処置日の後に、創傷を適切に覆い、個別のケージに動物を入れておく。

【0088】

創傷の程度は、プラニメーター（透明な紙のシート上で創傷をトレースする）を用いて、９日間（局所処置の場合は５日間）毎日測定される。

【0089】

局所塗布を用いる毎日の処置
コントロールグループの動物の創傷は、生理溶液（０．９％ＮａＣｌ）からなるプラセボが含浸した無菌ガーゼで処置される。
他方のグループの動物の創傷は、水中に溶解した濃度２０ｍｇ／１００ｍｌである本産物が含浸した無菌ガーゼで処置される。

【0090】

結果
本産物で処置された動物は、修復過程の加速が観察され、コントロールグループと比較して、創傷領域において顕著な減少が示され、処置の終わりで平均約２０〜３０％の減少である。

【0091】

医薬品及び／又は化粧品の調製
本発明の主題である活性画分は、薬学的及び美容的活性のある製品を調製するために使用されてもよい。

【0092】

その用量は、病変及び処置されるべき組織の種類、伸展の程度、患者のパラメータ（歳、性、体重）並びに医薬又は化粧品組成物の種類により変化し得る。活性画分の用量は、使用される画分の精製の程度に応じても変化し得る。

【0093】

本発明の主題である画分は、当業者に知られる賦形剤及び通常のキャリア物質と混合した前述の画分を有効量含有する組成物の形態で投与されてもよい。

【0094】

本発明の組成物は、既知の方法及び通常の技術を用いて調製されてもよい。

【0095】

最終調製物には他の活性成分が存在してもよい。

【0096】

医薬又及び化粧品組成物の例としては、バイアル、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、溶液、薬剤、坐薬、胚珠、せっけん、フォーム、錠剤、粉末、ミルクがある。

【図1】