特許 6169495 妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するための方法およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6169495

(24)【登録日】2017年7月7日

(45)【発行日】2017年7月26日

(54)【発明の名称】妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するための方法およびシステム

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20170713BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20170713BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20170713BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20170713BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20170713BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170713BHJP

   C12N 15/02 20060101ALN20170713BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   C07K16/18

   C12P21/08

   C12M1/34 F

   C07K16/46

   A61K39/395 D

   A61P9/12

   G01N33/53 N

   !C12N15/00 C

【請求項の数】30

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2013-552737(P2013-552737)

(86)(22)【出願日】2012年2月7日

(65)【公表番号】特表2014-511375(P2014-511375A)

(43)【公表日】2014年5月15日

(86)【国際出願番号】US2012024198

(87)【国際公開番号】WO2012109282

(87)【国際公開日】20120816

【審査請求日】2015年2月2日

(31)【優先権主張番号】61/440,169

(32)【優先日】2011年2月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513198917

【氏名又は名称】アガミン・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100089037

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】ポール・クシー

(72)【発明者】

【氏名】ウー・エス・ジョー

【審査官】 天野 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０７６４６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５１１６１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０７５４７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０７−１０１９９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２８０７５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ９／１２

Ｃ０７Ｋ １６／１８

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｃ１２Ｎ １５／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するための組成物であって、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２を有する重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８を有する軽鎖ＣＤＲとを含む抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含み、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片はｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、組成物。

【請求項2】

前記重鎖は、配列番号３０、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記軽鎖は、配列番号３２、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記抗ｓＦｌｔ−１抗体は、ｓＦｌｔ−１のドメイン１〜３のうちの１つ以上に結合する、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記妊娠関連高血圧性障害は、子癇または子癇前症である、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記妊娠関連高血圧性障害は、子癇前症である、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記対象は、妊娠中のヒトまたは分娩後のヒトである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記対象は、妊娠中のヒトである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の組成物であって、
（ａ）前記対象から血液を取り出すことと、
（ｂ）血液またはその構成成分中のｓＦｌｔ−１のレベルを低下させるために、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が付着した固体支持体に前記血液またはその構成成分を通過させることと、
（ｃ）前記血液またはその構成成分を前記対象の体に戻すことと、
を含む方法により対象における妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するための、組成物。

【請求項10】

前記血液またはその構成成分は、血漿を含み、前記方法は、ある量の前記対象の血液を取り出すことと、前記血液を血漿と細胞成分とに分離することと、前記固体支持体に前記血漿を通過させることと、
を含む、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含み、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が固体支持体に付着され、前記抗体：ｓＦｌｔ−１の比率が５０であるとき、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、インビトロ分析において、ヒト血漿から少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％のｓＦｌｔ−１を枯渇させ、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片がｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含み、前記抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が固体支持体に付着され、前記抗体：ｓＦｌｔ−１の比率が１００であるとき、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、インビトロ分析において、ヒト血漿から少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％のｓＦｌｔ−１を枯渇させ、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片がｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含み、前記抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が固体支持体に付着され、前記抗体：ｓＦｌｔ−１の比率が２５０であるとき、前記抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、インビトロ分析において、ヒト血漿から少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％のｓＦｌｔ−１を枯渇させ、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片がｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を有する１つ以上の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８と少なくとも９０％同一である１つ以上の軽鎖ＣＤＲと、を含む、抗ｓＦｌｔ−１抗体であって、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片がｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、抗ｓＦｌｔ−１抗体。

【請求項15】

配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２を有する重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８を有する軽鎖ＣＤＲと、を含む、請求項１４に記載の抗ｓＦｌｔ−１抗体。

【請求項16】

前記重鎖は、配列番号３０、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１４または１５に記載の抗ｓＦｌｔ−１抗体。

【請求項17】

前記軽鎖は、配列番号３２、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１４または１５に記載の抗ｓＦｌｔ−１抗体。

【請求項18】

前記抗ｓＦｌｔ−１抗体は、ｓＦｌｔ−１のドメイン１〜３のうちの１つ以上に結合する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項19】

以下を含むシステムであって、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片がｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、システム：
（ａ）抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片であって、前記抗体が固体支持体に付着され、前記抗体：ｓＦｌｔ−１のモル比が５０であるとき、インビトロ分析において、ヒト血漿から少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％のｓＦｌｔ−１を枯渇させる、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と、
（ｂ）対象からの血液またはその構成成分を前記固体支持体に結合した前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片まで運んで、前記血液またはその構成成分を前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させ、それによって前記血液またはその構成成分からｓＦｌｔ−１を除去するようにするための第１の手段と、
（ｃ）前記血液またはその構成成分が前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触した後に、前記血液またはその構成成分を前記対象まで運ぶための第２の手段。

【請求項20】

請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の抗ｓＦｌｔ−１抗体、またはｓＦｌｔ−１との結合について請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の抗ｓＦｌｔ−１抗体と競合する抗体を含む、請求項１９に記載のシステム。

【請求項21】

請求項１９または２０のいずれか１項に記載のシステムであって、 第１の手段は、
（ｉ）対象の血液系に到達するための、前記対象の血管に挿入される、アクセスデバイスと、
（ｉｉ）前記アクセスデバイスを、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片に流体的に接続し、それによって、前記対象の血液またはその構成成分を前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片まで流れさせ、それと接触させる、導管システムと、を備える、システム。

【請求項22】

請求項１９または２０のいずれか１項に記載のシステムであって、前記第２の手段は、
（ｉ）導管システムと、
（ｉｉ）戻しデバイスと、を備え、前記戻しデバイスは、前記対象の血管に挿入され、前記導管システムは、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片に接触している前記血液またはその構成成分を前記戻しデバイスに流体的に接続して、前記血液またはその構成成分の前記対象への戻しが可能となるようにさせる、システム。

【請求項23】

前記第１の手段は、前記対象の血液を血漿と細胞成分とに分離するためのデバイスを備える、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項24】

前記対象の血液を血漿と細胞成分とに分離するための前記デバイスは、遠心分離機またはアフェレシスデバイスである、請求項２３に記載のシステム。

【請求項25】

固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含み、前記抗体が固体支持体に付着され、前記抗体：ｓＦｌｔ−１のモル比が５０であるとき、前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、インビトロ分析において、ヒト血漿から少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％のｓＦｌｔ−１を枯渇させる、カラムであって、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片がｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、カラム。

【請求項26】

前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２と少なくとも９０％同一の配列を有する１つ以上の重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８と少なくとも９０％同一である１つ以上の軽鎖ＣＤＲと、を含み、ｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない、請求項２５に記載のカラム。

【請求項27】

前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２を有する重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８を有する軽鎖ＣＤＲと、を含む、請求項２６に記載のカラム。

【請求項28】

前記重鎖は、配列番号３０、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２６または２７に記載のカラム。

【請求項29】

前記軽鎖は、配列番号３２、またはそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項２６または２７に記載のカラム。

【請求項30】

前記抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ヒトｓＦｌｔ−１のドメイン１〜３のうちの１つ以上に結合する、請求項２５に記載のカラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、子癇前症および子癇等の妊娠関連高血圧性障害を治療するための方法、システム、デバイス、および装置に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年２月７日に出願された米国特許出願第６１／４４０，１６９号に対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

子癇前症は、妊娠の５〜１０％に影響を及ぼし、その結果、母体および胎児の高い罹患率ならびに死亡率をもたらす、高血圧、浮腫、およびタンパク尿の症候群である。子癇前症は、１年当たり世界中で少なくとも２００，０００人の妊産婦死亡の原因である。子癇前症の症状は、典型的には、妊娠第２０週後に現れ、通常、血圧および尿を日常的に監視することによって検出される。しかしながら、これらの監視方法は、効果的な治療が利用可能な場合には、対象または発育中の胎児へのリスクを低減させることができる初期段階の子癇前症の診断には無効である。

【0004】

子癇前症の症状は、一般的に、以下のうちのいずれかを含む：（１）妊娠２０週後の収縮期血圧（ＢＰ）１４０ｍｍＨｇ超および拡張期ＢＰ９０ｍｍＨｇ超、（２）新たに発症したタンパク尿（尿検査時のディップスティックで１＋、２４時間蓄尿中のタンパク質３００ｍｇ超、もしくはタンパク質／クレアチニン比０．３超のランダム尿）、または（３）分娩後１２週までの高血圧およびタンパク尿の解消。子癇前症の症状は、腎障害および糸球体内皮症または糸球体肥大も含み得る。子癇の他の症状は、妊娠または最近の妊娠の影響に起因する以下の症状のうちのいずれかであり得る：発作、昏睡、血小板減少、肝浮腫、肺水腫、または脳浮腫。

【0005】

子癇前症は、軽度から致死的まで重症度が異なり得る。軽度型の子癇前症は、床上安静および頻繁に監視することによって治療することができる。中程度から重度の場合は入院を勧められ、発作を予防するための血圧薬または抗痙攣薬が処方される。状態が母体または胎児の生命を脅かすようになった場合、妊娠が中止され、胎児を早産させる。

【0006】

いくつかの要因が、胎児および胎盤の発育ならびに子癇前症に関連していると報告されている。それらは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、可溶性Ｆｌｔ−１受容体（ｓＦｌｔ−１）、および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）を含む。ＶＥＧＦは、内皮細胞特異的マイトジェン、血管新生誘導因子、および血管透過性の媒介物質である。ＶＥＧＦはまた、糸球体毛細血管の修復に重要であることも示されている。ＶＥＧＦは、米国特許第５，３３２，６７１号、米国特許第５，２４０，８４８号、および米国特許第５，１９４，５９６号、ならびにＣｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，４８：１１２０−１１２８に開示されている。ＶＥＧＦは、グリコシル化ホモ二量体として存在し、少なくとも４つの異なる代替スプライシングされたアイソフォームを含む。天然ＶＥＧＦの生物活性は、血管内皮細胞または臍帯静脈内皮細胞の選択的増殖の促進、および血管新生の誘導を含む。ＶＥＧＦは、いくつかのファミリーメンバーまたはアイソフォーム（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１６５、またはＶＥＧＦ１２１）を含み、例えば、Ｔｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１１９４７−１１９５４、Ｎｅｕｆｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １５：１５３−１５８、米国特許第６，４４７，７６８号、米国特許第５，２１９，７３９号、および米国特許第５，１９４，５９６号を参照されたい。Ｇｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２２２−３２３０に記載されるＫＤＲ選択的ＶＥＧＦおよびＦｌｔ選択的ＶＥＧＦ等のＶＥＧＦの突然変異型も知られている。ＶＥＧＦの改良型は、ＬｅＣｏｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：８９０−８９３に記載されている。

【0007】

ＶＥＧＦは、多くの異なる組織から得られる内皮細胞中に差次的に発現される２つの相同性の膜貫通型チロシンキナーゼ受容体であるｆｍｓ様チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ−１）およびキナーゼドメイン受容体（ＫＤＲ）にホモ二量体として結合する。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６３６５７は、ヒトＦｌｔ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を提供する。Ｆｌｔ−１は、胎盤の形成に寄与する栄養膜細胞によって高度に発現されるが、ＫＤＲは発現されない。ＰｌＧＦは、同じく胎盤の発育に関与するＶＥＧＦファミリーのメンバーである。ＰｌＧＦは、細胞栄養芽層およびシンシチウム栄養芽層によって発現され、内皮細胞の増殖、遊走、および活性化を誘導することができる。ＰｌＧＦは、ホモ二量体としてＦｌｔ−１受容体に結合するが、ＫＤＲ受容体には結合しない。ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦの両方が、胎盤の発育に非常に重要な分裂促進活性および血管形成に寄与する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許出願第６１／４４０，１６９号

【特許文献2】米国特許第５，３３２，６７１号

【特許文献3】米国特許第５，２４０，８４８号

【特許文献4】米国特許第５，１９４，５９６号

【特許文献5】米国特許第６，４４７，７６８号

【特許文献6】米国特許第５，２１９，７３９号

【特許文献7】米国特許第５，１９４，５９６号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｃｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，４８：１１２０−１１２８

【非特許文献2】Ｔｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１１９４７−１１９５４

【非特許文献3】Ｎｅｕｆｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １５：１５３−１５８

【非特許文献4】Ｇｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２２２−３２３０

【非特許文献5】ＬｅＣｏｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：８９０−８９３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

完全長Ｆｌｔ−１受容体の膜貫通および細胞質ドメインを欠損するｓＦｌｔ−１が、ヒト臍帯静脈内皮細胞の培養培地において同定され、後に、胎盤組織においてｓＦｌｔ−１のインビボでの発現が実証された。ｓＦｌｔ−１は、ＶＥＧＦに高親和性で結合するが、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激しない。妊娠関連高血圧性障害（例えば、子癇前症もしくは子癇）に罹患しているかまたはそれを発症するリスクのある妊娠中の女性から採取された血清試料中に見られたｓＦｌｔ−１レベルの上昇は、ｓＦｌｔ−１が、胎児および／または胎盤の適切な発育および血管形成に必要とされる機能的な増殖因子の栄養膜細胞および母体の内皮細胞に結合して枯渇させる「生理的シンク」としての役割を果たしていることを示唆するものである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、対象におけるｓＦｌｔ−１に関連する障害を治療または予防するために、対象の血中ｓＦｌｔ−１レベルを低下させるのに十分な量でおよび十分な時間の間、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドを対象にエクスビボで提供することを含む、対象における妊娠関連高血圧性障害等のｓＦｌｔ−１に関連する障害を治療または予防する方法を提供する。

【0012】

特定の実施形態において、本方法は、ある量の対象の血液を除去することと、対象の血液またはその構成成分中のｓＦｌｔ−１を、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドに結合させ、それによって、対象の血液またはその構成成分中のｓＦｌｔ−１の量を減少させるために、血液またはその構成成分（例えば、血漿）を、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドと接触させること（抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、固体支持体に結合している）と、血液またはその構成成分を対象に戻すこととを含む。

【0013】

本発明は、抗ｓＦｌｔ−１抗体およびそのｓＦｌｔ−１結合断片を提供する。抗体は、前述のエクスビボ法において使用され、また対象に投与することもできる。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１抗体は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。いくつかの実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号３０および３２、またはそれと少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を含む。

【0014】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。いくつかのそのような実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号１４および１６、またはそれと少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を含む。

【0015】

本発明の特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、ｓＦｌｔ−１へのリガンド結合をブロックしない。ｓＦｌｔ−１リガンドは、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ（それらのアイソフォームを含む）を含む。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、Ｆｌｔ−１中には存在しないｓＦｌｔ−１中のエピトープに結合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ｓＦｌｔ−１アイソフォームのカルボキシ末端からのアミノ酸を含むエピトープに結合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ヒトｓＦｌｔ−１のドメイン１〜３のうちの１つ以上に結合する。

【0016】

抗体が、血液またはその構成成分からｓＦｌｔ−１を枯渇させる能力は、必ずしも結合親和性に依存するわけではなく、抗体が結合するｓＦｌｔ−１の領域による影響を受け得ることが観察される。本発明の特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。いくつかの実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号３０および３２、またはそれと少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を含む抗体との結合について競合する。

【0017】

本発明の特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。いくつかの実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号１４および１６、またはそれと少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を有する抗体との結合について競合する。

【0018】

特定の実施形態において、妊娠関連高血圧性障害は、子癇または子癇前症である。特定の実施形態において、妊娠関連高血圧性障害は、子癇前症である。特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１関連障害は、腎疾患である。

【0019】

特定の実施形態において、血液またはその構成成分は血漿であり、方法は、ある量の対象の血液を除去することと、血漿を、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片と接触させる前に、血液を血漿と細胞成分とに分離することとを含む。

【0020】

特定の実施形態において、対象は、妊娠中のヒト、分娩後のヒト、またはヒト以外（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、またはネコ）である。特定の実施形態において、対象は、妊娠中のヒトまたは分娩後のヒトである。特定の実施形態において、対象は、妊娠中のヒトである。

【0021】

本発明は、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドと、血液を、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片と接触させ、それによって血液からｓＦｌｔ−１を除去するために、対象からの血液を、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドまで運ぶための第１の手段と、血液が抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片と接触した後に、血液を対象まで運ぶための第２の手段とを備えるシステムを提供する。

【0022】

本発明の特定の実施形態において、妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するために、血液よりもむしろ血漿が、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドと接触させられる。したがって、特定の実施形態において、第１の手段は、対象の血液を血漿と細胞成分とに分離するためのデバイスを含む。

【0023】

特定の実施形態において、第１の手段は、対象の血液系にアクセスするために対象の血管に挿入される、カテーテル、針、カニューレ等のアクセスデバイスと、アクセスデバイスを、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片に流体的に接続し、それによって対象の血液を抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片まで流れさせ、それらと接触させる、チューブ、パイプ、中空ファイバ等の導管システムと、任意選択的に、アクセスデバイスおよび導管システムを通して抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片まで対象からの血液を移動させるためのポンプ（例えば、蠕動ポンプ）等を備える。

【0024】

特定の実施形態において、第２の手段は、チューブ、パイプ、中空ファイバ等の導管システムと、カテーテル、針、カニューレ等の戻しデバイスとを備え、戻しデバイスは、対象の血管（例えば、静脈）に挿入され、導管システムは、血液または血漿の対象への戻しを可能にするように、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドと接触している血液または血漿を戻しデバイスに流体的に接続する。任意選択的に、第２の手段は、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドから導管システムを通して戻しデバイスまで血液または血漿を移動させるためのポンプ（例えば、蠕動ポンプ）等も備える。このポンプ等は、第１の手段の一部であるものと同じポンプ等であり得るか、または代替として、血液または血漿を対象まで運ぶための第２の手段のための原動力は、第２の手段に特有の別個のポンプ等であり得る。

【0025】

特定の実施形態において、対象の血液を血漿と細胞成分とに分離するためのデバイスは、遠心分離機またはアフェレシスデバイス、例えば、プラスマフェレシスデバイスである。

【0026】

特定の実施形態において、第１および／または第２の手段はまた、導管システムにおいて血液の圧力および／または流速を測定するための１つ以上のセンサを含み得る。

【0027】

本発明はまた、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドを含むカラムを提供し、カラムは、子癇または子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する際に使用するのに好適である。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明の一実施形態の略図を示し、対象からの血液が血漿と細胞成分とに分離され、細胞成分が対象に戻され、抗ｓＦｌｔ−１抗体との接触がｓＦｌｔ−１の血漿を枯渇させるように抗ｓＦｌｔ−１抗体が付着されたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズで充填したカラムまで血漿が運ばれ、ｓＦｌｔ−１の枯渇した血漿が対象に戻される。

【図2】固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体およびＶＥＧＦ_１２１を含むｓＦｌｔ−１結合構成成分の使用によるｓＦｌｔ−１を含む溶液からのｓＦｌｔ−１の枯渇（パネルＡ）と、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔによる精製されたモノクローナル抗体およびＦｌｔ−１の見かけのＫ_ｄ測定（パネルＢ）を示す。

【図3】固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその抗ｓＦｌｔ−１抗原結合断片を含むカラムの一実施形態を示す。カラムは、円筒状の筐体１と、２つの接続キャップ２および３とを備え、キャップ２は、対象からの血液または血漿を、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片まで送達するための手段に接続され、キャップ３は、血液または血漿が、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１抗原結合断片と接触した後に、ｓＦｌｔ−１の枯渇した血液または血漿を対象に戻すための手段に接続されている。上方ディスク４は、キャップ２内に挿入された障壁であり、固体支持体５を入り口開口部から離して維持する。同様のディスクが下方キャップ３内に存在するが、図示されていない。固体支持体５は、この図においてビーズの形態で表されているが、いずれの便利な形状であってもよい。抗ｓＦｌｔ−１抗体は図示されていないが、固体支持体５に結合している。１、２、３、および４は、血液適合性の合成材料からできており、従来技術によって相互接続されている。

【図4】流速が抗体ＡＧ１０ＢによるｓＦｌｔ−１の枯渇に与える影響を示す。

【図5】線流速が抗体ＡＧ１０ＢによるｓＦｌｔ−１の枯渇に与える影響を示す。

【図6】滞留時間が抗体ＡＧ１０ＢによるｓＦｌｔ−１の枯渇に与える影響を示す。

【図7】ＡＧ１０Ｂの密度がｓＦｌｔ−１の枯渇に与える影響を示す。

【図8】様々なＡＧ１０Ｂ：ｓＦｌｔ−１比にわたる血漿からのｓＦｌｔ−１の枯渇を示す。非特異的抗体ＥｒｂｉｔｕｘはｓＦｌｔ−１を枯渇させず、ＡＧ１０Ｂの効果が特異的であることが示唆される。

【図9】様々なＡＧ１０Ｂ：ｓＦｌｔ−１比にわたる血清からのｓＦｌｔ−１の枯渇を示す。

【図10】ｓＦｌｔ−１の枯渇がカラム床体積による影響を受けないことを示す。

【図11】ヘパリンの存在下における抗体ＡＧ１０ＢによるｓＦｌｔ−１の枯渇を示す。

【図12】抗体ＡＧ１０ＢとｓＦｌｔ−１との結合がＶＥＧＦ結合をブロックしないことを示す。

【図13】セファロースビーズ上に固定化されたＡＧ１０Ｂが補体系を活性化させないことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明は、対象の血中ｓＦｌｔ−１レベルを低下させるのに十分な量でおよび十分な時間の間、限定されないが、ｓＦｌｔ−１リガンドおよび結合タンパク質、抗ｓＦｌｔ−１抗体およびそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む抗ｓＦｌｔ−１結合物質を対象にエクスビボで提供することを含む、ｓＦｌｔ−１に関連する疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、対象の血中ｓＦｌｔ−１レベルを低下させるのに十分な量でおよび十分な時間の間、限定されないが、ｓＦｌｔ−１リガンドおよび結合タンパク質、抗ｓＦｌｔ−１抗体およびそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む抗ｓＦｌｔ−１結合物質を対象にエクスビボで提供し、それによって、対象における妊娠関連高血圧性障害を治療または予防することを含む、妊娠関連高血圧性障害を有するかまたは発症するリスクがあり、したがって妊娠関連高血圧性障害の治療または予防を必要とする対象における妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、早期分娩を治療する方法を提供する。ｓＦｌｔ−１レベルは、典型的には正常な妊娠の最後の数週間の間に上昇し、高血圧性障害を伴わない場合がある。したがって、本発明は、妊娠後期および分娩の非高血圧性ｓＦｌｔ−１関連障害を治療するため、またはそのような障害を回避するために予防的に使用される。別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患を治療または予防する方法を提供する。

【0030】

「可溶性Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）」（ｓＶＥＧＦ−Ｒ１としても知られる）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６３６５７によって定義されるタンパク質と同一または相同であるＦｌｔ−１受容体の可溶型を指し、ｓＦｌｔ−１の生物活性を有する。ｓＦｌｔ−１の生物活性は、任意の標準的な方法を使用して、例えば、ＶＥＧＦへのｓＦｌｔ−１の結合を測定することによって測定することができる。ｓＦｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを欠損している。ｓＦｌｔ−１は、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦに高親和性で結合することができるが、増殖または血管新生を誘導することはできず、したがって、Ｆｌｔ−１受容体およびＫＤＲ受容体とは機能的に異なる。ｓＦｌｔ−１は、最初にヒト臍帯内皮細胞から精製され、後に、栄養膜細胞によってインビボで産生されることが示された。本明細書において使用される場合、ｓＦｌｔ−１は、あらゆるｓＦｌｔ−１のファミリーメンバーまたはアイソフォームを含む。非限定的な例として、スプライス変異体として認識されるｓＦｌｔ−１のアイソフォームが挙げられる。スプライス変異体は、共通の転写開始部位を有するが、Ｆｌｔ−１をコードする３０個全部のスプライシングされたエキソンを含まない。あるアイソフォームは、最初に１３個のエキソン、続いてイントロン１３の一部およびポリ（Ａ）シグナル配列を有するｍＲＮＡによってコードされ、最初の６つのＩｇ様ドメインを含むが、７番目のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内ドメインは含まない（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６３６５７、Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３，９０：１０７０５−９）。別のアイソフォームは、最初に１４個のエキソン、続いて新しい代替スプライシングされた末端エキソン１５、およびポリ（Ａ）シグナル配列を有するｍＲＮＡによってコードされる。アイソフォームは、７番目の細胞外Ｉｇ様ドメインで切断される（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＩ１８８３８２、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２１：３８８５−３８９５）。他のいくつかの代替スプライシングされたｍＲＮＡおよびそれらの翻訳産物も報告されるかまたは予測されている。これらのタンパク質の各々は、最初の翻訳終止コドンまでｍＲＮＡの代替スプライシングされた３’末端によってコードされるアミノ酸を含む固有のＣ末端配列を含む。また、ｓＦｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１受容体の酵素的切断から生じる分解産物または断片を意味することもでき、そのような分解産物または断片がｓＦｌｔ−１の生物活性を維持する。１つの例において、胎盤から放出される特異的メタロプロテイナーゼは、Ｆｌｔ−１受容体の細胞外ドメインを切断してＦｌｔ−１のＮ端部分を循環中に放出し得る。

【0031】

「エクスビボ」は、本明細書に開示される治療または予防の方法を対象の体の外で、すなわち体外で、実施することを指し、それによって、対象の血液または血液成分（例えば、血漿）が、対象の体外で抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させられる。

【0032】

「抗ｓＦｌｔ−１抗体」は、ｓＦｌｔ−１に結合することができる抗体を指す。抗ｓＦｌｔ−１抗体の「ｓＦｌｔ−１結合断片」は、ｓＦｌｔ−１に結合する能力を保持する抗ｓＦｌｔ−１抗体の一部を指す。

【0033】

「ｓＦｌｔ−１リガンド」は、ｓＦｌｔ−１に結合する増殖因子またはその誘導体を指す。自然発生型のｓＦｌｔ−１リガンドは、限定されないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）を含む。ＶＥＧＦは、好ましくはＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｂである。ＶＥＧＦは、限定されないが、ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１６５、およびＶＥＧＦ_１８９を含むそのアイソフォームを含む。ＰｌＧＦは、限定されないが、ＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ−２、ＰｌＧＦ−３、およびＰｌＧＦ−４を含むそのアイソフォームを含む。誘導体は、限定されないが、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの融合タンパク質、ならびにｓＦｌｔ−１に結合するＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの配列変異体を含む。

【0034】

「ｓＦｌｔ−１結合物質」は、抗体、抗体断片、リガンド、およびｓＦｌｔ−１に選択的に結合するあらゆる他の結合分子（例えば、天然または合成のタンパク質、ポリペプチド、およびポリマー）を含む。

【0035】

本発明の抗体は、患者からの血液または血漿中のｓＦｌｔ−１を効率的に枯渇させるのに効果的である。ｓＦｌｔ−１は、可溶性であり得るかまたは血流中に循環する微小粒子であり得る。本発明によれば、組織に結合したｓＦｌｔ−１を放出するため、対象にヘパリンを投与することができ、ｓＦｌｔ−１のエクスビボでの枯渇を促進し、対象内に残された非循環ｓＦｌｔ−１のプールを最小限に抑える。

【0036】

抗体配列の非限定的な例を提供する。本発明は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む、単離されたｓＦｌｔ−１抗体（そのｓＦｌｔ−１結合断片を含む）を提供する。また、本発明は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２と実質的に同一である１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８と実質的に同一である１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含むｓＦｌｔ−１抗体を提供する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号３０および３２、またはそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を含む。

【0037】

本発明は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む単離されたｓＦｌｔ−１抗体、ならびに配列番号２、配列番号４、および配列番号６と実質的に同一である１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２と実質的に同一である１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含むｓＦｌｔ−１抗体をさらに提供する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号１４および１６、またはそれと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を含む。

【0038】

「同一性」は、２つの配列の最適な整列のために導入される必要があるギャップの数およびギャップの長さを考慮に入れた、２つのアミノ酸または核酸配列によって共有される同一の位置の数またはパーセンテージを指す。「実質的に同一である」とは、保存的アミノ酸置換、例えば、１つのアミノ酸の同じクラスの別のアミノ酸への置換（例えば、バリンをグリシンに、アルギニンをリジンに等）によってのみ、またはタンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置における１つ以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する。好ましくは、アミノ酸配列は、別のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９０％類似する。配列類似性を決定するための方法およびコンピュータプログラムは公に入手可能であり、限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）、およびＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を含む。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも類似性を決定するために使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源から公に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；ＢＬＡＳＴ ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／））。配列を比較する際に、これらの方法によって種々の置換、欠失、および他の修飾が説明される。保存的置換は、典型的には、以下の群の中での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。

【0039】

抗体が血液またはその構成成分からｓＦｌｔ−１を枯渇させる能力は、必ずしも結合親和性に依存するわけではなく、抗体が結合するｓＦｌｔ−１のドメインまたはエピトープ等の特定の他の特徴にも依存し得ることが本明細書において観察される。本発明の特定の実施形態において、本発明の抗ｓＦｌｔ−１抗体またはｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、配列番号１８、配列番号２０、および配列番号２２と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。いくつかのそのような実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号３０および３２、またはそれと少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を含む抗体との結合について競合する。

【0040】

本発明の特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、配列番号２、配列番号４、および配列番号６と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２と実質的に同じ配列を有する１つ、２つ、または３つの軽鎖ＣＤＲとを含む抗体との結合について競合する。いくつかのそのような実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその結合断片は、配列番号１４および１６、またはそれと少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％同一の配列から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの可変領域を含む抗体との結合について競合する。

【0041】

次の表１は、本明細書に開示される抗ｓＦｌｔ−１抗体「１０１」および「１０２」の可変ドメインおよびＣＤＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対応する配列番号を列挙する。

【0042】

【表1】

【0043】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、本明細書において１０１、１０２、またはＡＧ１０Ａ〜Ｄと称される抗体のうちの１つ以上によって結合されるヒトｓＦｌｔ−１上のエピトープに結合する。各々の抗体が、他方の抗体と抗原との結合を競合的に阻害する（ブロックする）場合、２つの抗体は競合する（すなわち、同じまたは重複するエピトープに結合する）。つまり、競合結合アッセイにおいて測定した場合に、１ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、または１００ｘ過剰な一方の抗体が、他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは、７５％、９０％、またはさらには９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照）。一方の抗体が、別の抗体と同じかまたは重複するエピトープに結合するかどうかを決定するさらなる方法は、当該技術分野において周知である。

【0044】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ヒトｓＦｌｔ−１に結合するが、ヒトＦｌｔ−１には結合しない。特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１に結合する抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインを認識する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、Ｆｌｔ−１中には存在しないｓＦｌｔ−１中のエピトープを認識する。特定の実施形態において、そのようなＦｌｔ−１中には存在しないエピトープは、ｓＦｌｔ−１のカルボキシ末端からのアミノ酸を含む。特定の実施形態において、そのようなＦｌｔ−１中には存在しないエピトープは、ｓＦｌｔ−１の不連続エピトープまたは立体構造エピトープである。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、Ｆｌｔ−１のリガンド結合部位に結合する。

【0045】

本発明によると、特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１−結合断片は、対象への投与に特に好適である。例えば、抗体は、対象の免疫原性および／または過敏症を最小限に抑えるように修飾することができる。そのような修飾は、対象のエクスビボでの治療に使用されるカラムまたは他の固体支持体から抗体が浸出した場合、さらなる安全要因を提供することができる。さらに、特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１−結合断片は、子癇または子癇前症を治療するためにインビボで投与することができる。したがって、エクスビボおよびインビボの両方の治療のために、本発明に従って使用される抗体は、キメラまたはヒト化抗体、および抗ｓＦｌｔ−１抗体の抗原結合断片を含む。キメラ抗体１０Ａ（Ｖ_Ｈ：配列番号３５、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）は、抗体１０２の可変領域およびヒトＩｇＧ１の定常領域を含む。抗体はまた、他の効果を最小限に抑えるかまたは排除するように修飾することができる。例えば、本明細書に提供されるキメラ抗体１０Ｂ（Ｖ_Ｈ：配列番号３７、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）の定常領域は、グリコシル化を防止する突然変異Ｎ２９８Ｑを含む。この突然変異を含む抗体は、補体活性化およびＦｃとの結合等のエフェクター機能が欠如している。キメラ抗体ＡＧ１０Ｃ（Ｖ_Ｈ：配列番号３８、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）は、抗体の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合を妨害する突然変異Ｉ２５４Ａを含む。ＦｃＲｎ受容体は、胎児への胎盤全体にわたる母体のＩｇＧの輸送を促進する。したがって、ＡＧ１０Ｃは、治療対象においてｓＦｌｔ−１に結合するだろうが、成長中の胎児には輸送されない。本発明の一実施形態において、エクスビボまたはインビボ投与のための抗体は、両方の突然変異（例えば、キメラ抗体ＡＧ１０Ｄ、Ｖ_Ｈ：配列番号３９、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）を含む。

【0046】

ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、ｓＦｌｔ−１の活性を中和するために使用され、１つの考えられる機構は、ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦ等の増殖因子のためのｓＦｌｔ−１上の結合部位の直接的なブロッキングによるものである。しかしながら、他の機構もまた考えられる。例えば、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ＶＥＧＦまたはＰｌＧＦとｓＦｌｔ−１との結合がブロックされないように、ｓＦｌｔ−１上の部位に結合することができる。いずれの場合においても、ｓＦｌｔ−１は、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片によって捕捉されることによって血液または血漿から除去され、もはや血液または血漿中のＶＥＧＦまたはＰｌＧＦ等の遊離増殖因子に結合するために利用することができず、よってそれらの濃度を低下させる。さらに、固体支持体に結合した抗体またはその結合断片によって捕捉されると、ｓＦｌｔ−１は、もはや膜に結合したＦｌｔ−１またはＫＤＲとのヘテロ二量体を形成するために利用することができない。

【0047】

本発明の抗ｓＦｌｔ−１抗体は、Ｆｌｔ−１の１つ以上の細胞外Ｉｇ様ドメインに結合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ｓＦｌｔ−１のドメイン１〜３のうちの１つ以上に結合し、リガンド結合をブロックする。Ｆｌｔ−１のドメインの構造について記述されている。（例えば、Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１５（１８）：４９１９−２７を参照）。例えば、１番目のＩｇ様ドメインは、Ｐｒｏ３２の辺りからＩｌｅ１２８の辺りに及ぶ。２番目のＩｇ様ドメインは、Ｐｒｏ１３４の辺りからＴｈｒ２２６の辺りに及ぶ。３番目のＩｇ様ドメインは、Ｖａｌ２３２の辺りからＬｙｓ３３１の辺りに及ぶ。受容体二量体の形成のために重要であると考えられる４番目のＩｇ様ドメインは、Ｐｈｅ３３３の辺りからＰｒｏ４２８の辺りに及ぶ。５番目のＩｇ様ドメインは、Ｔｙｒ４３１の辺りからＴｈｒ５５３の辺りに及ぶ。６番目のＩｇ様ドメインは、Ｇｌｙ５５８の辺りからＡｒｇ６５６の辺りに及ぶ。７番目のＩｇ様ドメインは、Ｔｙｒ６６２の辺りからＴｈｒ７５１の辺りに及ぶ。

【0048】

そのような抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドが本明細書に開示されるエクスビボ法において用いられる場合、それはｓＦｌｔ−１リガンドによって結合されないｓＦｌｔ−１分子に結合し、血液または血漿からそれらのｓＦｌｔ−１分子を除去する。他の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ｓＦｌｔ−１のドメイン１〜３のうちの１つ以上に結合し、リガンド結合をブロックしない。特定の他の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ｓＦｌｔ−１に結合し、結合されたリガンドが置換される。よって、特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１リガンドを大きく減少させることなく、対象におけるｓＦｌｔ−１の量が減少される。

【0049】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、二量体化を防止するようにｓＦｌｔ−１に結合する。安定した受容体−リガンド複合体が受容体二量体に結合したリガンド二量体を含むように、Ｆｌｔ−１リガンドとＦｌｔ−１との結合は協同的であると考えられる。したがって、受容体二量体化をブロックすることは、受容体−リガンドの相互作用を不安定化させる。本明細書に開示されるエクスビボ法において二量体化をブロックする抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドが用いられる場合、そのような抗体または結合断片は、ｓＦｌｔ−１に結合し、循環するｓＦｌｔ−１の量を減少させる。よって、ｓＦｌｔ−１リガンドを大きく減少させることなく、対象におけるｓＦｌｔ−１の量が減少される。結合したｓＦｌｔ−１の二量体化がブロックされるため、リガンドを含む任意のｓＦｌｔ−１単量体の安定性が低下する。よって、対象におけるｓＦｌｔ−１リガンドのいかなる減少も不十分であり得る。

【0050】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ｓＦｌｔ−１に結合するが、リガンド結合またはｓＦｌｔ−１の二量体化を実質的にはブロックまたは阻害しない。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、ｓＦｌｔ−１の全てのアイソフォームに存在するエピトープに結合する。

【0051】

一実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、ｓＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン１に結合する。別の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、ｓＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２に結合する。別の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、ｓＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン３に結合する。さらに別の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、ｓＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン１〜２に結合する。別の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、ｓＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン２〜３に結合する。さらに別の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドは、ｓＦｌｔ−１のＩｇ様ドメイン１および３に結合する。

【0052】

本発明の方法およびシステムにおいて使用するのに好適な抗ｓＦｌｔ−１抗体（例えば、１０１、１０２、ＡＧ１０Ａ〜Ｄ）が本明細書において開示される。これらの抗ｓＦｌｔ−１抗体に基づいて、本発明の方法およびシステムにおいて使用するのにさらなる抗ｓＦｌｔ−１抗体を設計および生成すること、例えば、本明細書に開示される抗ｓＦｌｔ−１抗体の可変領域配列および／またはＣＤＲを含むさらなる抗ｓＦｌｔ−１抗体を設計および生成することは、当業者にとって日常的な事柄であろう。さらに、本明細書に開示される抗ｓＦｌｔ−１抗体の可変領域配列および／またはＣＤＲに対して、アミノ酸においてある特定のレベルの同一性を有する可変領域配列またはＣＤＲを含むさらなる抗ｓＦｌｔ−１抗体を設計することも日常的な事柄であろう。

【0053】

さらなる抗ｓＦｌｔ−１抗体を設計および生成する際に、当業者は、抗体の特定の周知の特徴によって誘導されるかもしれない。典型的な自然発生型抗体の構造は周知であり、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を含み、各軽鎖は、鎖間ジスフィルド結合によって重鎖に共有結合的に結合している。２つの重鎖は、さらなるジスフィルド結合によって互いに結合している。個々の重鎖および軽鎖は、同様のサイズ（１１０〜１２５個のアミノ酸）および構造を有するが機能の異なるドメイン内に折り畳むことができる。軽鎖は、１つの可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および／または１つの定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含むことができる。重鎖も同様に、抗体のクラスまたはアイソタイプに応じて１つの可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および／または３つもしくは４つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、およびＣ_Ｈ４）を含むことができる。ヒトにおいて、アイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧは、サブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ_１−２およびＩｇＧ_１−４）にさらに細分化される。

【0054】

それらの名前から分かるように、可変ドメインは、抗体ごとに著しいアミノ酸配列の可変性を示す。この可変性は、通常、抗原結合部位の位置で最大となる。超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つの領域は、フレームワーク可変領域と称される可変性のより低い領域によって支持されるＶ_ＬおよびＶ_Ｈの各々に見出される。

【0055】

抗体分子の特定の部分を個別に検討することが都合がよいことが分かっている。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインからなる抗体の部分は、Ｆｖ（可変断片）と表され、抗原結合部位を構成する。１つのポリペプチド鎖上にＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインを含む抗体断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と称され、通常、可動性リンカーによって結合された一方のドメインのＮ末端および他方のドメインのＣ末端を含む（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号および国際公開第８８／０９３４４号を参照）。

【0056】

本明細書に開示される特定の実施形態の場合、ｓｃＦｖ断片は全長抗体の定常ドメインのいくらかまたは全てを欠損しているため、ｓｃＦｖ断片を用いることが有利であるかもしれない。したがって、それらは、全長抗体の使用に関連する副作用のうちのいくつかを克服することができる。例えば、ｓｃＦｖ断片は、重鎖定常領域と他の生体分子との間の特定の望ましくない相互作用を示さない傾向がある。

【0057】

特定の実施形態において、固体支持体には多価一本鎖抗体を付着させることができ、それぞれの一本鎖が第１のペプチドリンカーによって共有結合的に結合された１つのＶ_Ｈおよび１つのＶ_Ｌドメインを有する複数の一本鎖抗体が、少なくとも１つ以上の第２のペプチドリンカーによって共有結合的に結合されて多価一本鎖抗体を形成する。多価一本鎖抗体のそれぞれの鎖は、可変軽鎖断片および可変重鎖断片を含み、第２のペプチドリンカーによって少なくとも１つの他の鎖に結合される。第２のペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも１５個〜１００個未満のアミノ酸残基からなる。

【0058】

特定の実施形態において、固体支持体には二重特異性抗体を付着させることができ、２つの一本鎖抗体が合わさって二重特異性抗体を形成する。二重特異性抗体は、２つの鎖および２つの結合部位を有し、それぞれがｓＦｌｔ−１に特異的である。二重特異性抗体のそれぞれの鎖は、Ｖ_Ｌドメインに接続されたＶ_Ｈドメインを含む。ドメインは、同じ鎖上のドメイン間の対形成を防止するのに十分短いリンカーによって接続され、したがって、異なる鎖上の相補性ドメイン間の対形成を促進して２つの抗原−結合部位を再形成する。

【0059】

特定の実施形態において、固体支持体には三重特異性抗体を付着させることができ、３つの一本鎖抗体が合わさって三重特異性抗体を形成する。三重特異性抗体では、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈドメインのアミノ酸末端が、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈドメインのカルボキシ末端に直接、すなわち、いずれのリンカー配列も使用せずに融合される。三重特異性抗体は、頭‐尾様式で環状に配置されたポリペプチドを含む３つのＦｖ頭部を有する。

【0060】

特定の実施形態において、固体支持体にはＦａｂ断片を付着させることができる。Ｆａｂ断片は、Ｖ_Ｌ、Ｃ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、およびＣ_Ｈ１ドメインからなる抗体の断片である。パパイン消化に続いて単純に産生されるものはＦａｂと称され、重鎖ヒンジ領域が欠損している。ペプシン消化後に、重鎖ヒンジを保持する種々のＦａｂが産生される。鎖間ジスフィルド結合が損なわれていないこれらの二価断片はＦ（ａｂ’）_２と称され、一方、一価Ｆａｂ’は、ジスフィルド結合が保持されない場合に生じる。

【0061】

よって、本明細書に開示される方法およびシステムにおいて使用するための抗ｓＦｌｔ−１抗体およびそのｓＦｌｔ−１結合断片は、限定されないが、ｓＦｌｔ−１に結合する、自然発生型抗体、（Ｆａｂ’）_２等の二価断片、Ｆａｂ等の一価断片、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体等を含む。

【0062】

特定の実施形態において、抗体またはその断片の特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。抗原と抗原の解離（Ｋ_ｄ）の平衡定数によって表される親和性は、抗原決定基と抗体−結合部位との間の結合強度の尺度である。結合活性は、抗体とその抗原との間の結合の強度の尺度である。結合活性は、エピトープと抗体上のその抗原結合部位との間の親和性と、特定のエピトープの抗原結合部位の数を意味する抗体の価数との両方に関連する。抗体は、典型的には、１０^−５〜１０^−１１リットル／モルの解離定数（Ｋ_ｄ）で結合する。通常、１０^−４リットル／モルよりも大きないずれのＫ_ｄも、非特異的結合を示唆すると考えられる。Ｋ_ｄの値が低いほど、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度が強い。

【0063】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはｓＦｌｔ−１結合断片は、約１０^−５〜１０^−１１リットル／モル、約１０^−６〜１０^−１０リットル／モル、または約１０^−７〜１０^−９リットル／モルの解離定数（Ｋ_ｄ）でｓＦｌｔ−１に結合する。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはｓＦｌｔ−１結合断片は、少なくとも約１０^−５リットル／モル、少なくとも１０^−６リットル／モル、少なくとも１０^−７リットル／モル、少なくとも１０^−８リットル／モル、少なくとも１０^−９リットル／モル、少なくとも１０^−１０リットル／モル、または少なくとも１０^−１１リットル／モルの解離定数（Ｋ_ｄ）でｓＦｌｔ−１に結合する。特定の実施形態において、Ｋ_ｄは、１０^−９リットル／モル〜１０^−１０リットル／モルである。特定の実施形態において、Ｋ_ｄは、１０^−１０リットル／モル〜１０^−１１リットル／モルである。

【0064】

本明細書に開示される方法およびシステムにおいて使用するのに好適な抗ｓＦｌｔ−１抗体は、直接突然変異、親和性成熟の方法、ファージディスプレイ、または鎖シャッフリングによって結合特性が向上されたものをさらに含む。親和性および特異性は、ＣＤＲを突然変異させ、所望の特徴を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることによって修飾または向上させることができる（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照）。ＣＤＲは、様々な方法で突然変異させることができる。１つの方法は、さもなければ同一の抗原結合部位の集団において、特定の位置で２０個全てのアミノ酸が見出されるように、個々の残基または残基の組み合わせを無作為化することである。代替として、エラープローンＰＣＲ法によって様々なＣＤＲ残基に突然変異を誘導することができる（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）を参照）。例えば、重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌の突然変異誘発株において増殖させることができる（例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−３６８（１９９６）を参照）。これらの突然変異誘発の方法は、当業者に既知の多くの方法を例示するものである。

【0065】

抗ｓＦｌｔ−１抗体は、標準的なハイブリドーマ技術によって（例えば、参照により、本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２１１−２１３（１９９８））、またはヒト免疫グロブリンγ重鎖およびκ軽鎖を生成するトランスジェニックマウスを使用することによって（例えば、Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．から調達したＫＭマウス）得ることができる。当該技術分野で既知の特定のマウスにおいて、ヒト抗体を生成するゲノムのかなりの部分がマウスのゲノムに挿入され、マウスの内因性マウス抗体の生成を不足させる。そのようなマウスは、任意選択的に、好適なアジュバント、例えば、完全または不完全フロインドアジュバント中、ｓＦｌｔ−１（例えば、ヒトｓＦｌｔ−１）の一部または全てを用いて免疫することができる。

【0066】

本明細書に開示される方法およびシステムにおいて使用するのに好適な抗体の調製方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第６，３６５，１５７号、および米国特許第６，１６５，４６４号、米国特許出願公開第２００６／００６７９３７号、国際公開第０６／０３４５０７号に記載される（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる）。

【0067】

本明細書に開示される方法およびシステムにおいて使用するのに好適な抗ｓＦｌｔ−１抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化もしくはキメラ抗体、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）_２断片を含み得る。特定の実施形態において、抗体は、マウスモノクローナル抗体である。抗ｓＦｌｔ−１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ等の様々な抗体アイソタイプを含み得る。

【0068】

「キメラ抗体」は、別のタンパク質の少なくとも一部（典型的には、免疫グロブリン定常ドメイン）に結合した抗体分子の少なくとも抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。

【0069】

「ヒト化抗体」は、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域（ＦＲ）と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）（「インポート」配列）とを含む抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化抗体は、通常、少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の全てを実質的に含み、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンまたはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むことが最適である。「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とは、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の各々の中の可変領域中の３つの超可変配列を意味する。「フレームワーク領域（ＦＲ）」とは、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の３つの超可変配列（ＣＤＲ）のいずれかの側に位置するアミノ酸の配列を意味する。ヒト化抗体のＦＲおよびＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、インポートＣＤＲまたはヒトまたはコンセンサスヒトＦＲは、その部位のＣＤＲまたはＦＲ残基がコンセンサス配列またはインポート配列のどちらにも対応しないように、少なくとも１つの残基の置換、挿入、または欠失によって突然変異誘発させることができる。しかしながら、そのような突然変異は、広範囲には及ばない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、親のＦＲ配列およびＣＤＲ配列の残基に対応する。

【0070】

抗ｓＦｌｔ−１抗体は、抗ｓＦｌｔ−１抗体を発現するハイブリドーマから直接得ることができるか、またはクローン化して、好適な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞）中に組み換えることによって発現させることができる。好適な宿主細胞は、植物細胞、哺乳類細胞、および大腸菌および酵母等の微生物を含む。代替として、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、トランスジェニック非ヒト動物または植物、例えば、トランスジェニックマウスにおいて組み換えることによって生成することもできる。

【0071】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、固体支持体に付着する前または後に修飾され得る。可能な修飾は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、保護基またはブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、または細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合を含む。特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【0072】

抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその抗原結合断片は、ｓＦｌｔ−１関連障害のエクスビボでの治療に好適である。好適とは、抗体が、有効な量で有効な時間の間使用されたときに、対象の血液または血漿中のｓＦｌｔ−１濃度を効果的に低下させることを意味する。例えば、５０ｍｌ／分の流速を用いると、１００分で５リットルの血漿（約２．５（倍）のヒトの血液量）が生成される。本明細書に例示されるように、あるアッセイにおいて、１ｍｌカラムに適用した１ｍｌ／分の流速を用いたところ、抗体ＡＧ１０Ｂは、試験液からｓＦｌｔ−１の９４％を枯渇させた。これは、５０ｍｌカラムを使用した場合の５０ｍｌ／分の流速に相当する（また、滞留時間１分に相当する）。別のアッセイは、固体支持体上のＡＧ１０Ｂの濃度を０．８ｍｇ／ｍｌのビーズから０．４ｍｇ／ｍｌビーズに減少させたときに、試験試料中のｓＦｌｔ−１の枯渇がわずかに減少されたのみであったことを示している。

【0073】

研究目的で、抗ｓＦｌｔ−１抗体が結合した０．１〜５０ｍLのセファロースビーズを含む種々の寸法のカラムを、緩衝液または動物血清またはヒト血漿中に添加した組換えｓＦｌｔ−１、あるいは子癇前症患者の羊水または血漿中の天然ｓＦｌｔ−１を枯渇させる能力について検査する。ｓＦｌｔ−１枯渇実験は、流速０．０５〜５０ｍL／分、線流速１０〜３００ｃｍ／時間、および滞留時間０．２５〜５分で、ビーズ１ｍL辺り０．０２５〜２０ｍｇの抗体（ビーズ１個当たり６５００万〜５２０億個の抗体分子）で抗ｓＦｌｔ−１抗体が結合したセファロースビーズを含むカラムを用いて行われる。これらのｓＦｌｔ−１枯渇実験では、カラム床体積の１〜４００倍の、ｓＦｌｔ−１を含む緩衝液、血清、または血漿が、５：１〜５，０００：１（ｗ／ｗ）の抗ｓＦｌｔ−１抗体：ｓＦｌｔ−１比、または１．２５：１〜１，２５０：１のモル比でカラムに適用される。これらの様々な条件下で、抗ｓＦｌｔ−１抗体が結合したセファロースビーズを含むカラムは、緩衝液、血清、または血漿中のｓＦｌｔ−１を５０〜１００％枯渇させる。

【0074】

臨床治療の場合、抗ｓＦｌｔ−１抗体が結合した２５〜７５０ｍLのセファロースビーズを含む種々の寸法のカラムを使用して、子癇前症を含む高い血中ｓＦｌｔ−１レベルに関連する疾患に罹患している患者の血漿由来のＶＥＧＦまたはＰｌＧＦのアイソフォーム等の単独のまたはリガンドと複合させた種々のアイソフォームの天然ｓＦｌｔ−１を枯渇させる。臨床治療に使用されるカラムは、流速１０〜１００ｍｌ／分、線流速３０〜１８０ｃｍ／時間、および滞留時間０．５〜３分で、ビーズ１ｍｌ辺り０．１〜５ｍｇの抗体（ビーズ５０ｍｌ当たり５〜１００ｍｇ、ビーズ１個当たり２億６０００万〜５２億個の抗体分子）で抗ｓＦｌｔ−１抗体が結合したセファロースビーズを含む。平均体重の患者は、体内を循環する約８リットルの血液（約４リットルの血漿）を有する。種々の形態の０．０８〜０．４８ｍｇの天然ｓＦｌｔ−１（血漿中のｓＦｌｔ−１レベル４０ｎｇ／ｍｌの患者の場合）を含む、カラム床体積の血漿の４０〜２４０倍（５０ｍｌカラムの場合）に相当する体内の総血漿体積の約０．５〜３倍（２〜１２リットルの血漿）が、５０：１〜２，０００：１（ｗ／ｗ）の抗ｓＦｌｔ−１抗体：ｓＦｌｔ−１比、または１２．５：１〜５００：１のモル比で抗ｓＦｌｔ−１抗体が結合したビーズを含むカラムに適用される。これらの様々な条件下で、抗ｓＦｌｔ−１抗体が結合したセファロースビーズを含むカラムは、高い血中ｓＦｌｔ−１レベルを有する患者の血漿からｓＦｌｔ−１の５０〜１００％を枯渇させることができる。

【0075】

よって、本発明は、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を対象にエクスビボで提供することを含む、対象における妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する方法を提供し、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が固体支持体に付着され、抗体：ｓＦｌｔ−１のモル比が５００であるとき、抗ｓＦｌｔ−１抗またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、インビトロ分析において、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または７０％〜８０％、または８０％〜９０％、または９０％〜９５％、または９５％〜９９％のｓＦｌｔ−１をヒト血漿から枯渇させる。別の実施形態において、本発明は、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を対象にエクスビボで提供することを含む、対象における妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する方法を提供し、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が固体支持体に付着され、抗体：ｓＦｌｔ−１比が２５０であるとき、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、インビトロ分析において、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または７０％〜８０％、または８０％〜９０％、または９０％〜９５％、または９５％〜９９％のｓＦｌｔ−１をヒト血漿から枯渇させる。別の実施形態において、本発明は、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を対象にエクスビボで提供することを含む、対象における妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する方法を提供し、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が固体支持体に付着され、抗体：ｓＦｌｔ−１モル比が１００であるとき、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、インビトロ分析において、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または７０％〜８０％、または８０％〜９０％、または９０％〜９５％、または９５％〜９９％のｓＦｌｔ−１をヒト血漿から枯渇させる。さらに他の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が固体支持体に付着され、抗体：ｓＦｌｔ−１のモル比が５０、２５、または１２．５であるとき、インビトロ分析において、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または７０％〜８０％、または８０％〜９０％、または９０％〜９５％、または９５％〜９９％のｓＦｌｔ−１が、ヒト血漿から枯渇する。抗ｓＦｌｔ−１抗体およびそのｓＦｌｔ−１結合断片は、Ｆｌｔ−１Ｉｇ様ドメイン１〜３に種々の組み合わせで結合するもの、ならびに、単独で、または組み合わせて、またはＩｇ様ドメイン２および／もしくは３と組み合わせてＩｇ様ドメイン４、５、６、または７に結合する抗体も含む。

【0076】

分析方法に従って、ヒト血清にｓＦｌｔ−１が添加される。本明細書に例示されるように、ドメイン１〜３からなるｓＦｌｔ−１タンパク質を使用した。他のドメインまたはドメインの組み合わせに対するｓＦｌｔ−１抗体が検査される場合、関連するドメインを含むｓＦｌｔ−１分子が使用される。ｓＦｌｔ−１分子の比限定的な例は、ｓＦｌｔ−１のドメイン１〜３、ドメイン１〜４、ドメイン１〜５、ドメイン１〜６、ドメイン１〜７、ドメイン２〜３、ドメイン２〜４、ドメイン２〜５、ドメイン２〜６、またはドメイン２〜７を含む（ｓＦｌｔ−１の種々のドメインの発現を示すことに関しては、例えば、Ｂａｒｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０３８２−８８を参照）。特定の実施形態において、分析は、ｓＦｌｔ−１を添加した血漿中に混合した、セファロースビーズに結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を使用して行われる。特定の実施形態において、０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４、または５分の臨床カラム上の滞留時間を再現した期間にわたって分析が行われる。そのような分析は、カラム内のビーズに結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはｓＦｌｔ−１結合断片の溶液と、所望の滞留時間を実現するための流速で適用されるｓＦｌｔ−１を添加した血漿を使用して行うことができる。代替として、羊水、血清（例えば、ウマ血清）、または緩衝液（例えば、ＰＢＳ）に添加したｓＦｌｔ−１を使用して分析を行うこともできるが、血漿、特にヒト血漿が好ましい。分析は、種々の密度でカラム支持体（例えば、セファロースビーズ）に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片、および種々の濃度で血漿中に添加されたｓＦｌｔ−１を使用して分析を行うことができる。抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、０．０２５、０．０５０、０．１、０．２５、０．５、１、または２ｍｇ／ビーズの量でセファロースビーズに結合させることができる。流速は、０．０５、０．１、０．２５、０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０、または１００ｍｌ／分であってもよく、線流速は、１０、２０、３０、５０、１００、１５０、１８０、２４０、または３００ｃｍ／時間であってもよい。

【0077】

本発明の抗体は、患者からの血液または血漿中のｓＦｌｔ−１を効率的に枯渇させるのに効果的である。ｓＦｌｔ−１は、可溶性であり得るおよび／または血流中に循環する微小粒子であり得る。特定の実施形態において、本発明の抗体が固体支持体（例えば、セファロースビーズ）に付着され、抗体：ｓＦｌｔ−１比が５０になるようにｓＦｌｔ−１を含む溶液と接触させられると、ｓＦｌｔ−１抗体は、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のｓＦｌｔ−１を枯渇させる（それらに結合する）。特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１抗体は、７０％〜８０％、８０％〜９０％の、または９０％〜９５％、９５〜９９％ののｓＦｌｔ−１を枯渇させる。溶液は、血液、血漿、血清、または緩衝液であってもよい。特定の実施形態において、本発明の抗体が固体支持体（例えば、セファロースビーズ）に付着され、抗体：ｓＦｌｔ−１比が１００になるようにｓＦｌｔ−１を含む溶液と接触させられると、ｓＦｌｔ−１抗体は、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のｓＦｌｔ−１を枯渇させる。特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１抗体は、７０％〜８０％、または８０％〜９０％、または９０％〜９５％、または９５〜９９％ののｓＦｌｔ−１を枯渇させる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、固体支持体（例えば、セファロースビーズ）に付着され、抗体：ｓＦｌｔ−１比が２５０になるようにｓＦｌｔ−１を含む溶液と接触させられると、ｓＦｌｔ−１抗体は、少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のｓＦｌｔ−１を枯渇させる。特定の実施形態において、ｓＦｌｔ−１抗体は、７０％〜８０％、８０％〜９０％の、または９０％〜９５％、９５〜９９％ののｓＦｌｔ−１を枯渇させる。

【0078】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはｓＦｌｔ−１結合断片は、好適な条件下において、ｓＦｌｔ−１を含む対象の血液または血漿中のｓＦｌｔ−１の濃度を、約５０ｎｇ／ｍｌ未満、約４０ｎｇ／ｍｌ未満、約２５ｎｇ／ｍｌ未満、約１０ｎｇ／ｍｌ未満、約５ｎｇ／ｍｌ未満、約４ｎｇ／ｍｌ未満、約３ｎｇ／ｍｌ未満、約２ｎｇ／ｍｌ未満、約１ｎｇ／ｍｌ未満、約０．７５ｎｇ／ｍｌ未満、または約０．５ｎｇ／ｍｌまで低下させることができる。

【0079】

特定の実施形態において、例えば、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を使用して、固体支持体に固定化することによってｓＦｌｔ−１分子が血漿から除去される。ｓＦｌｔ−１が固体支持体に固定化されると、ｓＦｌｔ−１が溶液中に遊離している場合と比較してリガンド結合には不利である。したがって、対象におけるｓＦｌｔ−１レベルが低下し、循環するｓＦｌｔ−１リガンドのいずれの減少も不十分であり得る。

【0080】

特定の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体は固体支持体に結合し、固体支持体には抗エンドグリン抗体またはそのエンドグリン結合断片は結合していない。本明細書に開示される方法の特定の実施形態において、方法は、対象の血液中のエンドグリンの量を実質的に減少させない。本明細書に開示されるシステムの特定の実施形態において、システムは、対象の血液からエンドグリンを大幅に除去することはできない。

【0081】

特定の実施形態において、本発明の方法は、
（ａ）対象から血液を除去することと、
（ｂ）血液またはその構成成分中のｓＦｌｔ−１のレベルを低下させるために、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドが付着した固体支持体に血液またはその構成成分を通過させることと、
（ｃ）血液またはその構成成分を対象の体に戻すこととを含む。

【0082】

特定の実施形態において、血液は血漿と細胞成分とに分離され、血漿のみが抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させられ、細胞成分は、そのような接触なしに対象に戻されるか、または特定の実施形態において、対象に戻されるのではなく廃棄される。

【0083】

したがって、特定の実施形態において、本方法は、ある量の対象の血液を除去することと、血液を血漿と細胞成分とに分離することと、血漿中のｓＦｌｔ−１を抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片に結合させ、それによって対象の血漿中のｓＦｌｔ−１の量を減少させるために、血漿を抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させることと、血漿を対象に戻すことと、任意選択的に、細胞成分を対象に戻すこととを含む。

【0084】

上記実施形態を実施する場合、細胞成分は任意の時点で対象に戻すことができる。すなわち、細胞成分は、血漿が抗ｓＦｌｔ−１抗体もしくはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させられる前に対象に戻されてもよいか、または細胞成分は、血漿が抗ｓＦｌｔ−１抗体もしくはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させられた後に対象に戻されてもよい。特定の実施形態において、細胞成分は、血漿が抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触された後に血漿と合わされてもよく、合わされた細胞成分および血漿は、同じ導管システムおよび／または同じ戻しデバイスを通して同時に対象に戻される。

【0085】

特定の実施形態において、妊娠関連高血圧性障害は子癇または子癇前症である。特定の実施形態において、妊娠関連高血圧性障害は子癇である。特定の実施形態において、障害は慢性腎疾患である。

【0086】

特定の実施形態において、患者は、妊娠中のヒト、分娩後のヒト、または妊娠中もしくは分娩後の非ヒト（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、またはネコ）である。特定の実施形態において、対象は、妊娠中のヒトまたは分娩後のヒトである。特定の実施形態において、対象は妊娠中のヒトである。

【0087】

任意選択的に、本明細書に開示される方法は、標準的な子癇前症または子癇の治療を用いて治療中の対象に対して実施することができる。そのような標準的な治療は、当業者に既知であり、米国特許出願公開第２００４／０１２６８２８号、米国特許出願公開第２００５／００２５７６２号、米国特許出願公開第２００５／０１７０４４４号、および米国特許出願公開第２００６／００６７９３７号、ならびに国際公開第２００４／００８９４６号、国際公開第２００５／０７７００７号、および国際公開第０６／０３４５０７号に記載される方法を含む。

【0088】

本明細書に開示される方法は、ｓＦｌｔ−１結合物質の組み合わせを使用して実施することができる。例えば、抗ｓＦｌｔ−１抗体、そのｓＦｌｔ−１結合断片、およびｓＦｌｔ−１リガンドのうちの２つ以上が使用されてもよい。

【0089】

本明細書に開示される方法は、慢性高血圧症薬を用いて治療中の対象に対して実施することができる。妊娠中の高血圧症を治療するために使用される薬物は、メチルドパ、ヒドララジン塩酸塩、またはラベタロールを含む。

【0090】

特定の実施形態において、本発明の方法は、対象に降圧薬化合物を投与するステップをさらに含むことができる。そのような投与は、従来の方法、例えば、降圧薬化合物を含む経口剤形を投与することによるものであってもよい。

【0091】

特定の実施形態において、本発明の方法は、限定されないが、ＶＥＧＦＲリガンドを含む増殖因子またはサイトカインを対象に投与することをさらに含むことができる。一実施形態において、増殖因子はＶＥＧＦである。別の実施形態において、増殖因子はＰｌＧＦである。

【0092】

本明細書に開示される方法は、子癇前症または子癇の治療または予防のために妊娠中に、あるいは分娩後の子癇前症または子癇を治療するために妊娠後に実施することができる。

【0093】

「治療」とは、治療目的で、本明細書に開示されるエクスビボ法を実施することを指す。「治療する」こと、または「治療」のために使用することは、既に妊娠関連高血圧性障害を有するかまたはそれに罹患していると診断された対象に、その対象の状態を改善するために治療薬を投与することを指す。例えば、本明細書に記載されるように、本明細書に記載される特徴的な症状のうちのいずれかの同定に基づいて、または対象の血液中のｓＦｌｔ−１の濃度の測定に基づいて、対象が子癇前症または子癇を有するかまたはそれに罹患していると診断することができる。

【0094】

「予防する」とは、まだ病気ではないが、妊娠関連高血圧性障害を発症しやすいか、またはさもなければ発症するリスクのある対象、例えば、子癇前症または子癇を発症するリスクがあると判断される対象の予防的処置を意味する。

【0095】

「妊娠関連高血圧性障害」は、血圧の上昇と関連するかまたはそれによって特徴付けられる妊娠中の任意の状態または疾患を指す。これらの状態および疾患の中に含まれるのは、子癇前症（早期子癇前症、重度子癇前症を含む）、子癇、妊娠高血圧、ＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝酵素の上昇、血小板減少）、胎盤剥離、妊娠中の慢性高血圧症、子宮内胎児発育遅延を伴う妊娠、および胎内発育遅延（ＳＧＡ）児を伴う妊娠である。

【0096】

「子癇前症」とは、タンパク尿もしくは浮腫、または両方を伴う高血圧、腎糸球体不全、脳浮腫、肝浮腫、あるいは妊娠または最近の妊娠の影響による血液凝固異常によって特徴付けられる多系統障害を指す。早期、軽度、中程度、および重度子癇前症等の全ての形態の子癇前症が、この定義に含まれる。子癇前症は、通常、妊娠２０週後に起こる。子癇前症は、通常、以下の症状のうちのいくつかの組み合わせとして定義される：（１）妊娠２０週後の収縮期血圧（ＢＰ）１４０ｍｍＨｇ超および拡張期ＢＰ９０ｍｍＨｇ超（通常、４〜１６８時間空けて２回測定される）、（２）新たに発症したタンパク尿（尿検査時のディップスティックで１＋、２４時間蓄尿中のタンパク質３００ｍｇ超、またはタンパク質／クレアチニン比０．３超のランダム尿試料が１つ）、ならびに（３）分娩後１２週までの高血圧およびタンパク尿の解消。重度子癇前症は、通常、（１）拡張期ＢＰ１１０ｍｍＨｇ超（通常、４〜１６８時間空けて２回測定される）、または（２）２４時間畜尿中のタンパク質が３．５グラム以上の測定値、もしくはディップスティックでタンパク質が少なくとも３＋の２つのランダム尿標本によって特徴付けられるタンパク尿として定義される。子癇前症では、高血圧およびタンパク尿は、通常、互いに７日以内に起こる。重度子癇前症では、重度の高血圧、重度のタンパク尿、およびＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝酵素の上昇、血小板減少）、または子癇が、同時に起こり得るか、または１度に１つの症状のみが起こり得る。ＨＥＬＬＰ症候群は、血小板減少症（１００，０００細胞／μｌ未満）、ＬＤＨの増加（６００ＩＵ／Ｌ超）、およびＡＳＴの増加（７０ＩＵ／Ｌ超）の兆候によって特徴付けられる。時に、重度子癇前症は、発作の発生につながる可能性がある。この重症型の症状を「子癇」という。子癇はまた、例えば、肝臓（例えば、肝細胞障害、門脈周囲の壊死）ならびに中枢神経系（例えば、脳浮腫および脳出血）等の、いくつかの臓器または組織の機能不全または損傷を含むこともできる。発作の病因は、脳浮腫および腎臓の微小血管の局所痙攣の発症に対して２次性であると考えられる。

【0097】

「対象」は、限定されないが、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、もしくはネコを含む哺乳動物である。

【0098】

子癇前症または子癇等の妊娠関連高血圧性障害を「発症するリスクがある」とは、現在は妊娠関連高血圧性障害を有していないが、妊娠関連高血圧性障害を発症する確率が平均よりも高い対象を指す。そのようなリスクのある対象は、約３ｎｇ／ｍｌ超、約４ｎｇ／ｍｌ超、約５ｎｇ／ｍｌ超、約６ｎｇ／ｍｌ超、約７ｎｇ／ｍｌ超、約８ｎｇ／ｍｌ超、約９ｎｇ／ｍｌ超、約１０ｎｇ／ｍｌ超、約１５ｎｇ／ｍｌ超、約２０ｎｇ／ｍｌ超、約２５ｎｇ／ｍｌ超、約３０ｎｇ／ｍｌ超、約４０ｎｇ／ｍｌ超、または約４５ｎｇ／ｍｌ超の血中ｓＦｌｔ−１濃度を有するが、子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害の他の徴候を示さない妊娠中の女性を含む。

【0099】

本明細書に記載される方法を実施することができる妊娠の段階は、対象の総体的な健康および子癇前症の症状の重症度を含む種々の臨床的要因に依存する。一般に、一旦、子癇前症または子癇前症の素因が検出されてから本方法を用いることができる。治療は、１〜１００日、より好ましくは１〜６０日、１〜１０日、または１〜５日、最も好ましくは１〜２０日の範囲の期間の間継続することができる。

【0100】

特定の実施形態において、本方法は、妊娠１４週目、妊娠１６週目、妊娠１８週目、妊娠２０週目、妊娠２２週目、妊娠２４週目、妊娠２６週目、妊娠２８週目、妊娠３０週目、妊娠３２週目、妊娠３４週目、または妊娠３６週目以降に対象に対して実行される。特定の実施形態において、本方法は、妊娠１４週目〜１６週目、妊娠１６週目〜１８週目、妊娠１８〜２０週目、妊娠２０〜２２週目、妊娠２２〜２４週目、妊娠２４〜２６週目、妊娠２６〜２８週目、妊娠２８〜３０週目、妊娠３０〜３２週目、妊娠３２〜３４週目、または妊娠３４〜３６週目に対象に対して実行される。

【0101】

特定の実施形態において、対象の血液または血漿は、ｓＦｌｔ−１を所望のレベルまで低下させるために必要な程度のみ抗ｓＦｌｔ−１抗体またはリガンドと接触させられる。所望のレベルは、例えば、正常な妊娠に特徴的なｓＦｌｔ−１のレベルであり得る。正常な妊娠において、ｓＦｌｔ−１の血清濃度は、８〜１２週から１６〜２０週に低下し、２６〜３０週で徐々に上昇し、３５〜３９週で急上昇し、分娩後に正常レベルに戻ることが観察されている。したがって、一実施形態において、所望のレベルは、対象の妊娠の段階の正常レベルである。別の実施形態において、レベルは、対象の妊娠の段階の正常レベルよりも高いかまたは低い。当業者は、例えば、エクスビボ手技が行われる患者および頻度に応じて、所望のレベルを決定することができるであろう。

【0102】

所望のｓＦｌｔ−１レベルは、例えば、対象が治療を受ける期間の長さ（すなわち、特定の流速で処理される血液または血漿の体積）、固定化した抗体もしくはリガンド上の流速、および／またはｓＦｌｔ−１に結合する抗体もしくはリガンドを担持する固体支持体の結合能を制御することによって達成することができる。一実施形態において、治療時のｓＦｌｔ−１レベルを測定するために診断薬が使用される。別の実施形態において、治療薬は、リアルタイムでのｓＦｌｔ−１レベルの測定値を提供し、所望のｓＦｌｔ−１レベルに達すると治療が中止される。別の実施形態において、期間、流速、および／または能力は、手技の開始時に対象において診断されるｓＦｌｔ−１レベルおよび達成することが所望されるｓＦｌｔ−１レベルに基づいてあらかじめ決められる。

【0103】

特定の実施形態において、本方法は、対象に本方法が実施される前の対象における血中ｓＦｌｔ−１レベルと比較して１０％〜９０％、２０％〜８０％、または３０％〜５０％対象の血中ｓＦｌｔ−１レベルを低下させる。特定の実施形態において、本方法は、対象に本方法が実施される前の対象における血中ｓＦｌｔ−１レベルと比較して１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％対象の血中ｓＦｌｔ−１レベルを低下させる。

【0104】

固体支持体に付着した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、子癇前症または子癇に罹患しているかまたはそれを発症するリスクのある対象の体液からｓＦｌｔ−１を除去するために使用することができる。特定の実施形態において、固体支持体に付着した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、血液または血漿からｓＦｌｔ−１を除去するために使用される。特定の実施形態において、固体支持体に付着した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片は、当該技術分野で既知の体外免疫吸着剤デバイスにおいて使用される。血液または血漿は、付着させた支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片に暴露され、（遊離しているかまたは他の血中タンパク質との複合体として）循環するｓＦｌｔ−１の部分的なまたは完全な除去をもたらし、続いて血液または血漿が対象の体に戻される。本明細書に開示される方法は、血液または血漿を抗ｓＦｌｔ−１抗体に接触させる前に介在する細胞除去ステップ、例えば、遠心分離ステップを含むかまたは含まない、連続フロー構成において実行され得る。

【0105】

本明細書に記載される方法において使用するための固体支持体は、好ましくは、無毒性であるべきであり、血液または血液成分に暴露されたときに安定であるべきである。固体支持体は、当該技術分野で周知であるものの中から選択することができる。例えば、任意の好適な多孔質材料が固体支持体として使用され得る。好適な固体支持体の例として、例えば、炭水化物に基づく材料、例えば、種々の種類のＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（架橋されたビーズ形態のアガロース）、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ４Ｂ（登録商標）、４ＦＦ（登録商標）、ＣＬ−４Ｂ（登録商標）、およびＣＬ−６Ｂが挙げられる。

【0106】

固体支持体は、有機分子、無機分子、または有機分子と無機分子との組み合わせからなってもよく、１つ以上の官能基、例えば、活性化剤との共有結合を形成するのに好適なヒドロキシ基からなってもよい。固体支持体は、親水性化合物、疎水性化合物、またはそれらの任意の組み合わせからなってもよい。固体支持体は、ポリマーまたはコポリマーからなってもよい。

【0107】

固体支持体において使用するための好適な材料の例として、限定されないが、アガロース、セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、多糖類、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリウレタン、フッ化ポリビニリデン、ポリプロピレン、フルオロカーボン、例えば、ポリ（テトラフルオロエチレン−コ−ペルフルオロ（アルキルビニルエーテル））、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（アゾラクトン）、ポリスチレン、セラミック、およびナイロンが挙げられる。

【0108】

固体支持体はいずれか特定の形状である必要はない。例えば、固体支持体は、ビーズ、膜、ゲル、カラム、チップ、プレート、チューブ、シート、繊維、または中空ファイバの形態であり得る。固体支持体はまた、その中を血液または血漿が通るチューブ、パイプ、または中空ファイバの１つ以上の長さの内部のコーティングの形態であってもよい。そのような実施形態において、チューブ、パイプ、または中空ファイバは、該チューブ、パイプ、または中空ファイバを通る血液または血漿によって接触される固体支持体の量を最大化するために、好ましくはコイル状であるか、またはさもなければ屈曲もしくは湾曲している。

【0109】

抗体およびリガンドを固体支持体に付着させる方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される方法において使用される抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を固体支持体に付着させるために使用することができる。そのような方法は、限定されないが、臭化シアン、１，１’−カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）、またはトリエチルアミンの使用を含む。

【0110】

一般に、固体支持体をアルデヒド、エポキシド、シアン、活性化カルボン酸等の活性化剤と接触させることにより、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片の付着のために固体支持体を活性化することができる。

【0111】

抗体を固体支持体に付着させる方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国特許第５，８７４，１６５号、米国特許第３，９３２，５５７号、米国特許第４，７７２，６３５号、米国特許第４，２１０，７２３号、米国特許第５，２５０，６１２３号、欧州特許出願第ＥＰ １ ３５２ ９５７ Ａ１号、および国際公開第２００４／０７４４７１号を参照されたい。典型的には、固体支持体は、エポキシド（例えば、エピクロロヒドリンの使用による）、シアン（例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ））、Ｎ，Ｎ−炭酸ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）、アルデヒド、または活性化カルボン酸（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、またはカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）活性化エステル）等の反応性官能基で活性化される。活性化基は、ＣＮＢｒの場合に一般的であるように、固体支持体に直接的に付着させることができるか、または活性化基は、典型的には、酸素および／または窒素原子で任意選択的に置換された炭素の直鎖であるリンカーまたはスペーサー分子の一部であってもよい。そのようなリンカーの典型的な例は、リンカーのブタンジオールジグリシジルエステル（一般的なエポキシドカップリング剤）に見られる炭素と酸素の１０員鎖である。活性化された固体支持体は、次いで、カップリング条件下で抗体と接触させられる。

【0112】

他のリンカーは、１〜３０個の炭素原子を含む分岐鎖、非分岐鎖、または環状炭素鎖を含み得る。特定の実施形態において、リンカーは、３０個以上の炭素原子からなり得る。リンカーは、窒素、酸素、または硫黄等の少なくとも１つのヘテロ原子を含み得る。

【0113】

市販品ＡＦＦＩ−ＧＥＬ １５（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）がリンカーの介在によるカップリングに使用されてもよい。ＡＦＦＩ−ＧＥＬ １５（登録商標）は、正電荷を帯びた二級アミンを含むリンカーアームの一部としてＮＨＳ活性化カルボン酸で誘導体化されたアガロース支持体である。電荷を帯びた別のリンカーは、米国特許第５，２６０，３７３号に開示される。アルギニンからなるより短いリンカーが、アガロース支持体へのカップリングを促進するために使用されてもよい。アルギニンリンカーは、ＮＨＳで活性化され、正電荷を帯びる。

【0114】

抗ｓＦｌｔ−１抗体、その結合断片、ならびにｓＦｌｔ−１特異的ポリペプチドおよびリガンドは、より均一な配向および効率的なｓＦｌｔ−１結合を提供するような様式で固体支持体に共有結合的に結合することができる。大半の方法は、所定の位置で固有の化学基を用いてタンパク質を修飾し、その基を固体支持体上の相補基と反応させることを伴う。別の実施形態において、抗ｓＦｌｔ−１抗体、抗体断片、およびリガンドは、固体支持体に結合させることができるＮ末端またはＣ末端リンカーを用いて生成される。特定の実施形態において、ポリペプチドおよびリガンドは、固体支持体上で直接合成される。

【0115】

本明細書に開示される方法に従う治療の有効性を判定するために、当該技術分野で既知の診断方法を使用して治療中に対象の子癇前症または子癇を監視することができる。好適な診断方法は、例えば、米国特許第７，３３５，３６２号、米国特許第７，４３５，４１９号、および米国特許第７，４０７，６５９号に開示される。

【0116】

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法を使用した治療または予防に好適な対象を特定するために、対象の血液中のｓＦｌｔ−１の濃度を測定および／または監視する診断方法が用いられる。特定の実施形態において、診断方法は、子癇前症または子癇等の妊娠関連高血圧性障害を発症するリスクのある対象を特定するために用いられ、対象は、約５ｎｇ／ｍｌ超、約６ｎｇ／ｍｌ超、約７ｎｇ／ｍｌ超、約８ｎｇ／ｍｌ超、約９ｎｇ／ｍｌ超、約１０ｎｇ／ｍｌ超、約１５ｎｇ／ｍｌ超、約２０ｎｇ／ｍｌ超、約２５ｎｇ／ｍｌ超、約３０ｎｇ／ｍｌ超、約４０ｎｇ／ｍｌ超、または約４５ｎｇ／ｍｌ超の血中ｓＦｌｔ−１濃度を有するが、子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害の他の徴候を示さない妊娠中の女性である。

【0117】

したがって、本発明は、妊娠関連高血圧性障害を有するかまたは発症するリスクのある対象を特定し、次いで、そのように特定された対象に対して本明細書に開示されるエクスビボ法を実ｖし、それによって妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する方法を提供する。特定の実施形態において、妊娠中のヒトは、妊娠中期の間の対象の血液中のｓＦｌｔ−１濃度が、約３．５ｎｇ／ｍｌ超、約４ｎｇ／ｍｌ超、約５ｎｇ／ｍｌ超、約７．５ｎｇ／ｍｌ超、約１０ｎｇ／ｍｌ超、約２０ｎｇ／ｍｌ超、約３０ｎｇ／ｍｌ超、約４０ｎｇ／ｍｌ超、または約５０ｎｇ／ｍｌ超であると測定された場合に、本明細書に開示される方法による治療または予防に好適な対象として特定される。

【0118】

対象の血中ｓＦｌｔ−１レベルが測定されるおよび／または監視される特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、対象の血液中のｓＦｌｔ−１濃度が、約５０ｎｇ／ｍｌ未満、約４５ｎｇ／ｍｌ未満、約４０ｎｇ／ｍｌ未満、約３５ｎｇ／ｍｌ未満、約３０ｎｇ／ｍｌ未満、約２５ｎｇ／ｍｌ未満、約２０ｎｇ／ｍｌ未満、約１５ｎｇ／ｍｌ未満、約１０ｎｇ／ｍｌ未満、約７．５ｎｇ／ｍｌ未満、約５ｎｇ／ｍｌ未満、約４ｎｇ／ｍｌ未満、約３ｎｇ／ｍｌ未満、約２ｎｇ／ｍｌ未満、約１．５ｎｇ／ｍｌ未満、または約１ｎｇ／ｍｌ未満になるまで用いることができる。

【0119】

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、妊娠関連高血圧性障害の症状に改善が検出されるまで用いることができる。特定の実施形態において、妊娠関連高血圧性障害は子癇前症であり、改善とは、１４０ｍｍＨｇ未満（収縮期）および／または９０ｍｍＨｇ未満（拡張期）の値まで血圧が低下することである。

【0120】

本発明は、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含むカラム等の筐体またはチャンバを提供し、該筐体またはチャンバは、子癇または子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する際に使用するのに好適である。

【0121】

特定の実施形態において、筐体またはチャンバはカラムである。「カラム」は、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片またはｓＦｌｔ−１リガンドが、付着することができるかまたは付着された固体支持体を含む、略円筒状の容器、チャンバ、または筐体を指す。

【0122】

特定の実施形態において、カラムは、約５ｍｌ〜２０００ｍｌ、約１０ｍｌ〜約１０００ｍｌ、約５０ｍｌ〜約５００ｍｌ、または約２００ｍｌ〜約４００ｍｌの体積の、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む。特定の実施形態において、カラムは、約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約２５ｍｌ、約５０ｍｌ、約１００ｍｌ、約２００ｍｌ、約３００ｍｌ、約５００ｍｌ、約７５０ｍｌ、約１０００ｍｌ、約１５００ｍｌ、または約２０００ｍｌの体積の、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む。特定の実施形態において、カラムは、１つ以上の抗凝血性物質、例えば、ヘパリンを含む。特定の実施形態において、カラム内部の細菌、マイコプラズマ、および／またはウイルスの量を減少させることが企図される様式でカラム内部が処理されている。特定の実施形態において、カラム内部は滅菌される。

【0123】

特定の実施形態において、カラムは、ヒト血液または血漿から少なくとも１０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも１５０μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも３００μｇ、少なくとも４００μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも６００μｇ、少なくとも７００μｇ、少なくとも８００μｇ、少なくとも９００μｇ、少なくとも１０００μｇ、少なくとも１５００μｇ、または少なくとも２０００μｇのｓＦｌｔ−１を除去するために十分な、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む。特定の実施形態において、カラムは、ヒト血液または血漿から少なくとも１０μｇ〜２０００μｇ、少なくとも２０μｇ〜１０００μｇ、少なくとも５０μｇ〜５００μｇ、または少なくとも１００μｇ〜２００μｇのｓＦｌｔ−１を除去するために十分な、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む。

【0124】

本発明は、子癇または子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するためのデバイスを作製する方法であって、
（ａ）固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を生成するために、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を固体支持体に付着させることと、
（ｂ）固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む筐体またはチャンバを生成するために、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片をカラム等の筐体またはチャンバ内に導入することと、
（ｃ）固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む筐体またはチャンバを、対象からの血液または血漿を固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその抗ｓＦｌｔ−１抗原結合断片まで運ぶための手段に流体的に接続することと、
（ｄ）固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む筐体またはチャンバを、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片からの血液または血漿を対象まで運ぶための手段に流体的に接続することと、を含み、該手段は、対象からの血液または血漿を固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその抗ｓＦｌｔ−１抗原結合断片に接触させ、それによって血液または血漿からｓＦｌｔ−１を除去することができるように筐体またはチャンバに接続される、方法を提供する。

【0125】

本発明は、透析またはアフェレシスデバイスまたはシステムが、患者からの血液または血漿と固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはその抗ｓＦｌｔ−１抗原結合断片との接触を提供し、それによって血液または血漿からｓＦｌｔ−１を除去してｓＦｌｔ−１の枯渇した血液または血漿を生成することができるように、透析またはアフェレシスデバイスまたはシステムに、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含むカラム等の筐体またはチャンバを提供するように透析またはアフェレシスデバイスまたはシステムを改良することを含む、子癇または子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するためのデバイスを作製する方法を提供する。

【0126】

特定の実施形態において、本発明は、子癇または子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するエクスビボ法において使用するのに好適な抗ｓＦｌｔ−１抗体を同定する方法であって、
（ａ）ｓＦｌｔ−１に結合する抗体を得ることと、
（ｂ）結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体を含む固体支持体を生成するために、ｓＦｌｔ−１に結合する抗体を固体支持体に付着させることと、
（ｃ）結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体を含む固体支持体が、対象由来の流体試料中のｓＦｌｔ−１に結合し、それによって流体試料からｓＦｌｔ−１を除去することができるかどうかを判定することと、を含み、
結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体を含む固体支持体が対象由来の流体試料中のｓＦｌｔ−１に結合し、それによって流体試料からｓＦｌｔ−１を除去できる場合、ステップ（ａ）の抗体は、子癇または子癇前症等の妊娠関連高血圧性障害を治療または予防するエクスビボ法において使用するのに好適な抗ｓＦｌｔ−１抗体として同定される、方法を提供する。

【0127】

特定の実施形態において、対象は哺乳動物である。特定の実施形態において、対象はヒトである。

【0128】

特定の実施形態において、流体試料は、血液、血漿、羊水、または尿である。

【0129】

改良された透析またはアフェレシスシステムは、本明細書に開示される方法を実施するために使用することができ、改良された透析またはアフェレシスシステムは、血液が、除去され、結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む固体支持体を通過させられ、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片によって血液からｓＦｌｔ−１が除去された後に対象の体に戻される手段を提供する。いくつかの実施形態において、アフェレシスシステムは、プラスマフェレシスシステムであり、血液ではなく血漿が、結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片を含む固体支持体を通過させられ、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片によって血漿からｓＦｌｔ−１が除去された後に対象の体に戻される。

【0130】

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、全血または血漿等の体液の除去および体外治療を可能にする当該技術分野で既知のデバイスの改良版を使用して実行することができる。そのようなデバイスの１つは、透析機である。透析機は日常的に使用されており、流速を制御する方法、気泡を除去する方法、ならびに透析の間に適切な電解質バランス、血糖、酸素負荷、温度、無菌性、および他の重要な要因を維持する方法は、当該技術分野において周知であり、また確立されている。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、既存の透析システムを使用して実行されてもよく、その場合、ダイアライザーが、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が付着した固体支持体を含むカラム等の筐体またはチャンバによって置き換えられる。筐体またはチャンバを通って血液が流れると、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片が血液からｓＦｌｔ−１を除去し、それによって血液中のｓＦｌｔ−１濃度を低下させ、子癇前症または子癇等の妊娠関連高血圧性障害を治療または予防する。

【0131】

本明細書に記載される方法を実施するために使用することができる別の周知のデバイスは、アフェレシスシステム、例えば、プラスマフェレシスシステムである。プラスマフェレシスは、血液の特定の細胞成分の体外操作および除去を伴い、その後、所望の臨床効果を誘発するために血液が対象に再注入される。プラスマフェレシスの間、最初に、針またはカテーテル等のアクセスデバイスを介して体から血液が取り出される。次いで、細胞分離装置によって血液から血漿が除去される。血液細胞から血漿を分離するためには一般的に３つの手段が使用される：（１）不連続フロー遠心分離：典型的には１度に３００ｍｌの体積の血液が除去され、血液細胞から血漿を分離するために遠心分離される、（２）連続フロー遠心分離：連続的に回転させて血漿を取り出すために遠心分離が使用される、（３）血漿濾過：標準的な血液透析機器を使用して血漿が濾過される。

【0132】

本明細書に開示される方法において使用するための改良に好適なアフェレシスデバイスは、例えば、米国特許第５，０９８，３７２号、米国特許第５，１１２，２９８号、および米国特許第６，３１９，４７１号に記載される。他の好適なデバイスは、ＰｌａｓｍａＳｅｌｅｃｔ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＩＦＥ−１８（登録商標）血漿療法デバイス、Ｂ．Ｂｒａｕｎ（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤｉａｐａｃｔ（登録商標）ＣＲＲＴ、１２０１ Ｏａｋ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｃｏ．８０２１５所在のＣｏｂｅ ＢＣＴ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄの製品であるＣＯＢＥ ＳＰＥＣＴＲＡ（登録商標）、およびＧａｍｂｒｏ ＢＣＴ，Ｉｎｃ．のＥＬＵＴＲＡ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを含む。

【0133】

本明細書に開示されるシステムの特定の実施形態において、対象の血液系に到達するためのアクセスデバイスおよび／または対象に血液、血漿、または血液の細胞成分を戻すための戻しデバイスは、例えば、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒｅ（Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって販売される単一ルーメンカテーテルまたは二重ルーメンカテーテル等の単一ルーメンカテーテルまたは二重ルーメンカテーテルである。そのようなカテーテルは、ポリウレタンが体温まで加熱すると血管の輪郭に適合する感熱性ポリウレタンでできていてもよい。

【0134】

本明細書に開示される方法の特定の実施形態において、対象から血液を除去することは、血液から少なくとも約６５０ミリリットルの血漿を得るのに十分な量の血液を対象から除去することを含む。特定の実施形態において、対象から血液を除去することは、少なくとも２リットルの血液を対象から除去することを含む。特定の実施形態において、対象から血液を除去することは、実質的に全ての対象の血液量が、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させられるまで、対象から連続的に血液を除去することを含む。特定の実施形態において、対象から血液を除去することは、対象の全血液量の約２／３、約１／２、約１／４、約１／５、または約１／１０が、抗ｓＦｌｔ−１抗体またはそのｓＦｌｔ−１結合断片と接触させられるまで、対象から連続的に血液を除去することを含む。特定の実施形態において、対象から血液を除去することは、対象の血液中のｓＦｌｔ−１濃度が事前に選択された濃度に達するまで対象から連続的に血液を除去することを含む。特定の実施形態において、事前に選択された濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌ未満、約４０ｎｇ／ｍｌ未満、約２５ｎｇ／ｍｌ未満、約１０ｎｇ／ｍｌ未満、約５ｎｇ／ｍｌ未満、約４ｎｇ／ｍｌ未満、約３ｎｇ／ｍｌ未満、約２ｎｇ／ｍｌ未満、約１ｎｇ／ｍｌ未満、約０．７５ｎｇ／ｍｌ未満、または約０．５ｎｇ／ｍｌ未満である。特定の実施形態において、事前に選択された濃度は、約４０〜５０ｎｇ／ｍｌ、約３０〜４０ｎｇ／ｍｌ、約２０〜３０ｎｇ／ｍｌ、約１０〜２０ｎｇ／ｍｌ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌ、約５〜８ｎｇ／ｍｌ、約３〜７ｎｇ／ｍｌ、約１〜５ｎｇ／ｍｌ、約１〜３ｎｇ／ｍｌ、約０．７５〜２ｎｇ／ｍｌ、または約０．５〜１ｎｇ／ｍｌである。

【0135】

血液または血漿中のｓＦｌｔ−１の濃度は、連続的にまたは所定の間隔で自動的に測定することができる。例えば、対象由来の血漿試料は、ｓＦｌｔ−１またはｓＦｌｔ−１を含む粒子に結合する標識化試薬と反応させることができ、ｓＦｌｔ−１の量が測定できる。代替として、ｓＦｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１を含む粒子を含む）に特異的に結合するリンカー試薬を含むセンサが、結合したｓＦｌｔ−１の量を連続的に検出するために使用されてもよい。血液濾過の手順は、対象からの血液または血漿中で検出されるｓＦｌｔ−１の濃度が所定値を下回ったときに終了する。

【実施例】

【0136】

実施例１
抗ｓＦｌｔ−１抗体またはリガンドが結合した固体支持体を含むカラムデバイスを使用したヒト羊水からのｓＦｌｔ−１の除去
実験条件は、臨床設定における使用に近いものとなるように設計したが、それよりも小規模である。約４０ｎｇ／ｍｌの高いｓＦｌｔ−１レベルを有するヒト子癇前症患者から羊水を得た。

【0137】

ヒト第ＶＩＩＩ因子に対するポリクローナル抗体を使用した対照カラム１本を除いて、使用した抗体は全てｓＦｌｔ−１に結合するマウスモノクローナル抗体であった。アミノ酸Ｓｅｒ２７〜Ｉｌｅ３２８を含むヒトｓＦｌｔ−１タンパク質（Ｉｇ様ドメイン１〜３）でマウスを免疫することにより、抗ｓＦｌｔ−１モノクローナル抗体を作製した。このタンパク質はまた、カルボキシ末端にポリ‐ヒスチジン親和性タグを有していた。ｓＦｌｔ−１に結合した１２個の抗体を選択し、ｓＦｌｔ−１に対する結合親和性について検査した。

【0138】

抗ｓＦｌｔ−１抗体を固相（アガロースビーズ）に付着させることにより、生体液からｓＦｌｔ−１タンパク質を除去するためのデバイスを作製した。アガロースビーズを臭化シアンで化学処理してビーズ上に反応性化学基を作製した。次いで、これらの活性化ビーズを抗体と混合し、該抗体をビーズに共有結合的に付着させた。

【0139】

次いで、スクリーン／フリットを底に含む１ｍｌカラムに、抗体の付着したビーズを注入し、カラム内にビーズを保持するが、流体または溶液はカラムを通過させる、。ビーズに付着した抗ｓＦｌｔ−１抗体を含む得られたデバイスに、子癇前症患者からの羊水をデバイスの上部に加え、デバイスを通ってカラムから流れ出た溶液を回収した。デバイスを通過させる前および後の羊水中のｓＦｌｔ−１の量を測定し、枯渇したｓＦｌｔ−１の割合（％）を計算した。

【0140】

さらなる詳細は以下の通りである：

【0141】

（１）抗ｓＦｌｔ−１抗体に結合した０．１ｍｌのアガロースビーズを１ｍｌカラムに加えた。

【0142】

（２）５００μｇの抗体をアガロースビーズに結合させた。

【0143】

（３）４ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でカラムを洗浄した。

【0144】

（４）子癇前症患者からの羊水１ｍｌ（約４０ｎｇのｓＦｌｔ−１タンパク質を含む）をカラムの上部に加えた。

【0145】

（５）約１ｍｌ／１５分の流速でカラム上に羊水を流した（２１〜２４℃）。

【0146】

（６）羊水を回収し、再度、デバイスに２回適用し、合計で３回カラムを通過させた。

【0147】

（７）３回目にカラムを通過させた後、フロースルー液を回収し、ｓＦｌｔ−１の濃度を検査した。

【0148】

（８）４ｍｌの緩衝液でデバイスを洗浄し、ビーズ／カラムに非特異的に結合したあらゆる材料を除去した。次いで、０．５ｍｌの０．５Ｍ酢酸（ｐＨ３．０）をデバイスに加え、結合したｓＦｌｔ−１をデバイスから分離した。溶出液の画分を回収し、ｓＦｌｔ−１の濃度を測定して何らかの変化があったかどうかを判定した。

【0149】

ｓＦｌｔ−１に対する親和性および羊水から除去されたｓＦｌｔ−１の割合（％）を含む例示的な抗体についての結果を下の表２に示す。

【0150】

【表2】

【0151】

ＶＥＧＦ_１２１を用いて同様の方法を使用した。細菌中にＶＥＧＦ_１２１を発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、臭化シアンで活性化したアガロースビーズに結合させた。その他の点においては、アガロースビーズに結合したＶＥＧＦ_１２１を含むカラムに羊水を適用するための手順は、抗体の場合と実質的に同じであった。

【0152】

抗ｓＦｌｔ−１抗体およびＶＥＧＦ_１２１についての結果を図２に示す。

【0153】

この結果は、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体およびｓＦｌｔ−１リガンドが、子癇前症患者の羊水からｓＦｌｔ−１を特異的に除去することができたことを示す。抗体またはリガンドが付着していない、マトリクス／ビーズのみを含む対照カラムデバイスは、羊水からｓＦｌｔ−１タンパク質を除去しなかった。血液凝固因子ＶＩＩＩに結合する抗体を含む対照カラムデバイスも、ｓＦｌｔ−１を除去しなかった。しかしながら、ｓＦｌｔ−１に結合する抗体またはリガンドがカラム内に使用されたときに、フロースルー羊水のｓＦｌｔ−１タンパク質レベルが８７％まで低下した。個々の抗体がｓＦｌｔ−１を除去する際にどれくらい効果的であるかにおいて有意な変動が観察された（１１〜８７％）。精製モノクローナル抗体とｓＦｌｔ１との間の結合の見かけのＫｄを表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定した（図２Ｂ）。抗体を固相に固定化し、ｓＦｌｔ−１（ドメイン１〜３）は液相中にあった。抗体親和性（動力学的な結合実験にて測定）（図２Ｂ）とデバイスの有効性（図２Ａ）との間に直接的な相関関係は認められなかった。また、オン速度またはオフ速度とデバイスの有効性との間にも相関関係は認められなかった。これらの結果は、子癇前症を含む妊娠関連高血圧性障害を治療するために、固体支持体に結合した抗ｓＦｌｔ−１抗体を含むデバイスを使用することができることを示す。

【0154】

実施例２
キメラ化
マウス可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラモノクローナル抗体を生成した。キメラ抗体のいくつかの変種を生成した。抗体ＡＧ１０Ａ（Ｖ_Ｈ：配列番号３５、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）は、抗体１０２の重鎖および軽鎖可変ドメインとヒトＩｇＧ１定常領域とからなる。抗体ＡＧ１０Ｂ（Ｖ_Ｈ：配列番号３７、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）には、定常領域のグリコシル化部位を除去する突然変異（Ｎ２９８Ｑ）が組み込まれている。抗体ＡＧ１０Ｃ（Ｖ_Ｈ：配列番号３８、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）にはＦｃＲｎとの結合を妨害する突然変異（Ｉ２５４Ａ）が組み込まれている。抗体ＡＧ１０Ｄ（Ｖ_Ｈ：配列番号３９、Ｖ_Ｌ：配列番号３６）には上述の突然変異が両方とも組み込まれている。

【0155】

実施例３
固定化された抗体ＡＧ１０Ｂの特徴
抗体ＡＧ１０ＢのｓＦｌｔ−１枯渇特性に関する種々の検査を行った。

【0156】

流速―４０ｎｇ／ｍLのｓＦｌｔ１（インプット）を添加した４０床体積のウマ血清を、ＡＧ１０Ｂモノクローナル抗体（０．８ｍｇ）に結合した充填セファロースビーズ１ｍLを含むカラムに適用し、フロースルー画分（ＦＴ）を回収した。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）を使用して、インプット中のｓＦｌｔ１およびＦＴ画分の濃度を測定した。式、ｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）＝［（ｓＦｌｔ１_{インプット}−ｓＦｌｔ１_ＦＴ）／ｓＦｌｔ１_{インプット}］を用いてｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）を計算した。流速によるｓＦｌｔ−１の枯渇の変動を表３および図４に示す。

【0157】

【表3】

【0158】

線流速―４０ｎｇ／ｍLのｓＦｌｔ１（インプット）を添加した４０床体積のウマ血清を、ＡＧ１０Ｂモノクローナル抗体（０．８ｍｇ）に結合したセファロースビーズ１ｍLを含むカラムに適用し、フロースルー画分（ＦＴ）を回収した。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）を使用して、インプット中のｓＦｌｔ１およびＦＴ画分の濃度を測定した。式、ｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）＝［（ｓＦｌｔ１_{インプット}−ｓＦｌｔ１_ＦＴ）／ｓＦｌｔ１_{インプット}］を用いてｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）を計算した。線流速によるｓＦｌｔ−１の枯渇の変動を表４および図５に示す。

【0159】

【表4】

【0160】

滞留時間―４０ｎｇ／ｍLのｓＦｌｔ１（インプット）を添加した４０床体積のウマ血清を、ＡＧ１０Ｂモノクローナル抗体（０．８ｍｇ）に結合したセファロースビーズ１ｍLを含むカラムに適用し、フロースルー画分（ＦＴ）を回収した。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）を使用して、インプット中のｓＦｌｔ１およびＦＴ画分の濃度を測定した。式、ｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）＝［（ｓＦｌｔ１_{インプット}−ｓＦｌｔ１_ＦＴ）／ｓＦｌｔ１_{インプット}］を用いてｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）を計算した。カラム滞留時間によるｓＦｌｔ−１の枯渇の変動を表５および図６に示す。

【0161】

【表5】

【0162】

モノクローナルＡｂ密度―組換えｓＦｌｔ１を添加したウマ血清を、種々の量のＡＧ１０Ｂに結合さたセファロースビーズ（約１．５×１０^６ビーズ／ｍｌ）を含む１-ｍLカラム上に流速０．５ｍL／分（滞留時間２分）で適用した。

【0163】

１ｍｌ当たり０．８ｍｇのＡｂ（約３．２×１０^１５個の分子）の場合、これはビーズ１個当たり約２．１×１０^９個の分子に相当する。同様に、０．４ｍｇのＡｂ（１．６×１０^１５個の分子）では、１ビーズ当たり約１．０５×１０^９個の分子が存在する。ビーズの表面積が２．５×１０^−４ｃｍ^２であると仮定すると、ビーズ１ｍL当たり０．８ｍｇのＡｂは、ビーズ表面積１ｃｍ^２（細孔を含まない）当たり約８．４×Ｅ^１２個のＡｂ分子に相当する。ｓＦｌｔ１の枯渇量をｓＦｌｔ１インプット合計で除すことによりｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）を測定した。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）を使用してｓＦｌｔ１の濃度を測定した。ＭＡｂ密度によるｓＦｌｔ−１の枯渇の変動を表６および図７に示す。

【0164】

【表6】

【0165】

血漿および血清からのｓＦｌｔ−１の枯渇
組換えｓＦｌｔ１を添加した正常なヒト血漿を、ＡＧ１０ＢまたはＥｒｂｉｔｕｘに結合したセファロースビーズを含有する０．１ｍLカラム上に適用した。広範囲のＡｂ：リガンド比について枯渇の割合（％）を測定した。ＡＧ１０Ｂ：ｓＦｌｔ１比が２００：１未満のときにカラム能力の低下が生じる（図８）。滞留時間および流速が変数になるように重力によりカラム操作を行った。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）によりｓＦｌｔ１の量を測定した。

【0166】

組換えｓＦｌｔ１を添加したウマ血清を、ＡＧ１０Ｂに結合したセファロースビーズを含む１-ｍLカラム上に適用した。様々な範囲のＭＡｂ：リガンド比について枯渇の割合（％）を測定した。ＡＧ１０Ｂ：ｓＦｌｔ１比が２５：１未満のときにカラム能力の低下が生じる（図９）。滞留時間１分で１ｍL／分のカラム操作を行った。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）によりｓＦｌｔ１の量を測定した。

【0167】

ＡＧ１０ＢによるｓＦｌｔ−１の枯渇は、カラムサイズによって変動しない。４０床体積の４０ｎｇ／ｍLのｓＦｌｔ１を添加したウマ血清を、ＡＧ１０Ｂモノクローナル抗体（それぞれ、０．８ｍｇまたは４０ｍｇ）に結合したセファロースビーズを含む１-ｍLまたは５０-ｍLカラムのいずれかに滞留時間２分で適用し、フロースルー画分（ＦＴ）を回収した。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）を使用して、インプット中のｓＦｌｔ１およびＦＴ画分の濃度を測定した。式、ｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）＝［（ｓＦｌｔ１_{インプット}−ｓＦｌｔ１_ＦＴ）／ｓＦｌｔ１_{インプット}］を用いてｓＦｌｔ１の枯渇の割合（％）を計算した。図１０は、１ｍLおよび５０ｍL両方のデバイスカラムが血清中のｓＦｌｔ１タンパク質のほぼ全てを枯渇させることができることを示す。

【0168】

ヘパリンは、ＡＧ１０ＢによるｓＦｌｔ−１の枯渇に干渉しない。０．４５Ｕのヘパリンを含むかまたは含まない組換えｓＦｌｔ１を含むウマ血清を、ＡＧ１０Ｂに結合したセファロースビーズを含む０．１-ｍLカラム上に適用した。ＡＧ１０Ｂを含むカラムに流通させる前（負荷）および後（ＦＴ）に、ｓＦｌｔ１レベルについて試料をアッセイした。Ｒ＆Ｄ Ｆｌｔ−１ ＤｕｏＳｅｔキット（ＤＹ３２１）を使用してｓＦｌｔ１レベルをアッセイした（表７、図１１）。

【0169】

【表7】

【0170】

ｓＦｌｔ−１に結合したＡＧ１０Ｂは、ｓＦｌｔ−１とＶＥＧＦとの結合をブロックしない。図１２に示すように、ｓＦｌｔ１またはＶＥＧＦのいずれかでＥＬＩＳＡプレートを被覆した。洗浄後、ｓＦｌｔ−１で被覆されたウェルにはＰＢＳを加え、ＶＥＧＦで被覆されたウェルにはＰＢＳまたはｓＦｌｔ１のいずれかを加えた。洗浄後、ｓＦｌｔ−１に結合した固定化ＶＥＧＦを含むウェルにはＡＧ１０Ｂまたは１８Ｆ１（ｓＦｌｔ１−ＶＥＧＦ相互作用をブロックする抗体）を加え、ＰＢＳで被覆されたウェルには、ＡＧ１０Ｂと事前に複合体化したｓＦｌｔ１、または１８Ｆ１と事前に複合体化したｓＦｌｔ１を加えた。図１２に示されるように、ＡＧ１０Ｂは、ｓＦｌｔ１およびｓＦｌｔ１／ＶＥＧＦ複合体に結合する。事前に複合体化したｓＦｌｔ１／ＡＧ１０ＢもＶＥＧＦに結合する。対照的に、ブロッキング抗体である１８Ｆ１はｓＦｌｔ１／ＶＥＧＦ複合体に結合しない。同様に、１８Ｆ１のｓＦｌｔ１への添加は、ＶＥＧＦおよびｓＦｌｔ１の相互作用を防止する。

【0171】

補体活性化―ビーズに結合されたＡＧ１０Ｂは、ビーズ単独の場合と同じ程度にしか補体を活性しない（図１３）。精製モノクローナル抗体ＡＧ１０Ｂに結合したセファロースビーズを含む０．１-ｍLカラム、または抗体を含まない陰性対照カラム（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ビーズ）に、精製ｓＦｌｔ１を添加したヒト血漿を適用した。試料を３７℃まで加熱し、製造者の指示に従ってＱｕｉｄｅｌ ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ３ａ Ｐｌｕｓ ＥＩＡキットを使用して、補体活性化産物Ｃ３ａについてアッセイした。キット内に提供されるＣ３ａ標準物質を使用して、血漿画分中のＣ３ａ濃度を測定するために使用される標準曲線を作成した。

【0172】

ＡＧ１０Ｂは、ｓＦｌｔ−１のｄ１〜ｄ３ドメインのエピトープに結合する。表８は、ＡＧ１０Ｂが、ＰＥ患者の羊水（ＡＦ）中に存在する天然ｓＦｌｔ１の形態、およびｓＦｌｔ１の２つの組換え形態（ｄ１〜ｄ３ドメインまたは完全長）のエピトープに結合することを示す。ｓＦｌｔ１上の結合部位についてＶＥＧＦと競合するブロッキング抗体１８Ｆ１は、ＶＥＧＦの存在下においてｓＦｌｔ１（ｄ１−ｄ３）に効率的に結合することができない。５０８抗体はｓＦｌｔ１（ｄ１〜ｄ３）に結合することはできないが、ＡＦ中の天然ｓＦｌｔ１アイソフォームに結合することができることから、ｓＦｌｔ１上の結合エピトープがｄ１〜ｄ３ドメインの外部に位置する可能性が示唆される。陰性対照抗体Ｅｂｘは、ｓＦｌｔ１の天然形態または組換え形態に結合することはできない。

【0173】

【表8】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]