特許 6169561 メソテリンを標的とする組換え免疫毒素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6169561

(24)【登録日】2017年7月7日

(45)【発行日】2017年7月26日

(54)【発明の名称】メソテリンを標的とする組換え免疫毒素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170713BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20170713BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170713BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170713BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170713BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170713BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170713BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20170713BHJP

   C07K 14/21 20060101ALN20170713BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K19/00ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 L

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   !C07K16/30

   !C07K14/21

【請求項の数】22

【全頁数】61

(21)【出願番号】特願2014-509467(P2014-509467)

(86)(22)【出願日】2012年5月4日

(65)【公表番号】特表2014-515921(P2014-515921A)

(43)【公表日】2014年7月7日

(86)【国際出願番号】US2012036456

(87)【国際公開番号】WO2012154530

(87)【国際公開日】20121115

【審査請求日】2015年5月1日

(31)【優先権主張番号】61/483,531

(32)【優先日】2011年5月6日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】513278976

【氏名又は名称】ザ ガバメント オブ ザ ユナイテツド ステイツ オブ アメリカ アズ リプリゼンテツド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒユーマン サービシズ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】パスタン， イラ エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】ウェルドン， ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ビアーズ， リチャード

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０３２９５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５２３１０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２６８８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１４５３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０３２０２２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｍ−Ｌ１−ＦＣＳ−ＦＬ−機能的ＰＥドメインＩＩＩを有する融合ポリペプチドを含むキメラ分子であって、ここで、
Ｍが、メソテリンと特異的に結合する抗体、またはメソテリンと特異的に結合するその断片であり、
Ｌ１が、１〜１０個の連続したアミノ酸残基からなり、
ＦＣＳが、フューリンによって切断できる連続したアミノ酸残基からなるフューリン切断部位であり、
ＦＬが、グリシンおよびセリンから独立して選択される３〜８個の連続したアミノ酸残基からなり、
機能的ＰＥドメインＩＩＩが、配列番号１の位置３９５〜６１３と配列が少なくとも９０％同一である連続したアミノ酸残基からなり、（ｉ）配列番号１の６０９〜６１３に対応する１つもしくは複数の残基における置換、（ｉｉ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンによる、配列番号１の位置４９０に対応する位置のアルギニンの置換、（ｉｉｉ）配列番号１の残基に対応する１つもしくは複数の残基の置換であって、配列番号１の残基がＰＥドメインＩＩＩのエピトープもしくはサブエピトープの免疫原性を維持する置換、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの任意のものの組合せを含み、ＡＤＰリボシル化によるＥＦ−２の不活性化活性を有する、機能的ＰＥドメインＩＩＩであり、ＦＬを有さないキメラ分子と比較して、メソテリンを発現する細胞に対する増強された細胞毒性を提供する、キメラ分子。

【請求項2】

抗体が、ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’_２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、またはジスルフィドで安定化されたＦｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）断片である、請求項１に記載の分子。

【請求項3】

抗体断片が、重鎖とＬ１との連結によって分子の残りの部分と融合している、ジスルフィドで安定化された軽鎖免疫グロブリン可変領域および重鎖免疫グロブリン可変領域を含む、請求項１に記載の分子。

【請求項4】

抗体が、
ＧＹＴＭＮ（配列番号５１）のＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号５２）のＣＤＲ２アミノ酸配列、およびＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号５３）のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶ_Ｈ鎖と、
ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号５４）のＣＤＲ１アミノ酸配列、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５５）のＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびにＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号５６）、ＱＱＷＳＫＨＰＬＴ（配列番号５７）、ＱＱＷＳＧＨＰＬＴ（配列番号５８）、ＱＱＷＳＡＨＰＬＴ（配列番号５９）、ＱＱＷＳＱＩＰＬＴ（配列番号６０）、ＱＱＷＧＦＮＰＬＴ（配列番号６１）、ＱＱＷＧＴＮＰＬＴ（配列番号６２）、ＱＱＷＧＳＨＰＬＴ（配列番号６３）、ＱＱＷＧＤＦＰＬＴ（配列番号６４）、ＱＱＷＧＤＨＰＬＴ（配列番号６５）、ＱＱＷＳＡＨＰＬＴ（配列番号６６）、およびＱＱＷＳＧＹＰＴＴ（配列番号６７）からなる群から選択されるＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶ_Ｌ鎖と
を含む、請求項１に記載の分子。

【請求項5】

Ｖ_Ｌ ＣＤＲ３のアミノ酸配列がＱＱＷＳＫＨＰＬＴ（配列番号５７）である、請求項４に記載の分子。

【請求項6】

Ｌ１が３〜５個のアミノ酸の長さである、請求項１に記載の分子。

【請求項7】

Ｌ１がＡＳＧＧ（配列番号１９）である、請求項１に記載の分子。

【請求項8】

ＰＥドメインＩＩＩが、Ｄ４０３、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｒ５０５、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｒ５５１、Ｒ５７６およびＬ５９７からなる群から選択される配列番号１のアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基の、アラニン、グリシンまたはセリンの置換を有する、請求項１に記載の分子。

【請求項9】

ＰＥドメインＩＩＩが、Ｄ４０６、Ｒ４３２、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５１３、Ｅ５４８、Ｋ５９０およびＱ５９２からなる群から選択される配列番号１のアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基の、アラニン、グリシンまたはセリンによる置換を有する、請求項１に記載の分子。

【請求項10】

ＦＬが、ＧＧＳ、（ＧＧＳ）_２（配列番号１８）、ＧＳＧＧ（配列番号７１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号７２）、ＧＧＳＧ（配列番号７３）、ＧＳＧ、またはＧＧＧである、請求項１に記載の分子。

【請求項11】

ＦＬがＧＧＳである、請求項１に記載の分子。

【請求項12】

フューリン切断配列がＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ（配列番号１７）である、請求項１に記載の分子。

【請求項13】

ＰＥ機能的ドメインＩＩＩが、配列番号４の位置２０〜２３７または配列番号５の位置２０〜２３７のアミノ酸配列を有する、ＬＲのＰＥ機能的ドメインＩＩＩである、請求項１に記載の分子。

【請求項14】

抗体が、配列番号６のジスルフィドで安定化されたＳＳ１可変軽鎖および配列番号７の配列のＳＳ１可変重鎖を含む、請求項１に記載の分子。

【請求項15】

配列番号６のＳＳ１可変軽鎖および配列番号８のＳＳ１可変重鎖−ＰＥ融合ポリペプチドを含み、可変軽鎖および可変重鎖がジスルフィドで安定化された抗体を形成する、請求項１に記載の分子。

【請求項16】

ＦＣＳが、配列番号１の位置２７４〜２８４と配列が同一であるか、アミノ酸配列ＲＨＲＳＫＲＧＷＥＱＬ（配列番号２９）のものである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分子。

【請求項17】

請求項１から１６のいずれか一項に記載の分子と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項18】

請求項１から１６のいずれか一項に記載の分子をコードしている核酸。

【請求項19】

請求項１８に記載の核酸を含むベクター。

【請求項20】

請求項１８に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項21】

請求項１から１６のいずれか一項に記載のキメラ分子を含む、それを必要としている対象においてメソテリンを過剰発現する癌を処置するための組成物。

【請求項22】

癌が、肺腺癌、卵巣癌、中皮腫または／および類表皮癌である、請求項２１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２０１１年５月６日に出願の米国仮特許出願第６１／４８３５３１号の優先権を主張するものである。

【0002】

連邦支援の研究開発の下でなされた発明の権利に関する記述
該当なし

【0003】

コンパクトディスクで提出した「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリストの付属書類の参照
該当なし

【背景技術】

【0004】

組換え免疫毒素（ＲＩＴ）とは、抗体断片を細菌または植物源に由来する細胞毒性タンパク質と組み合わせた、操作した治療的タンパク質である。ＲＩＴは、化学療法戦略に関連する二次毒性の多くを伴わずに細胞の標的排除の選択剤となるように設計されている。癌を処置するためのＲＩＴは、腫瘍関連細胞表面抗原に対する抗体の可変断片（Ｆｖ）をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＰＥ）の断片と融合させることによって構築することができる。シュードモナス属外毒素Ａの３８ｋＤａの切断（ＰＥ３８）を使用したＲＩＴは臨床治験において注目すべき成功を達成したが、乏しい固形腫瘍侵入、高い免疫原性、および非特異的毒性を含めた制限を有する（Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１５（１６）：５２７４〜９（２００９）、Ｈａｓｓａｎ Ｒら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１３（１７）：５１４４〜９（２００７）、Ｗａｙｎｅ ＡＳら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１６（６）：１８９４〜９０３（２０１０）、Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２７（１８）：２９８３〜９０（２００９）、Ｓａｍｐｓｏｎ ＪＨら、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ．、１０（３）：３２０〜９（２００８）、Ｐｏｗｅｌｌ ＤＪ Ｊｒら、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ．、１７９（７）：４９１９〜２８（２００７）、Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．、２３（２７）：６７１９〜２９（２００５）、Ｐａｌ ＬＨら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、２（３）：３５０〜３（１９９６））。

【0005】

ＲＩＴを用いた処置の結果を改善する試みでは、ＰＥ中毒経路の知識がこれらのタンパク質の設計を理解するために重要である。ＲＩＴは受容体媒介性エンドサイトーシスによって内部移行され、リソソーム内の系を通ってゴルジへと輸送され、ここで小胞体（ＥＲ）への逆行性輸送を受ける。この輸送段階中、毒素は、ジスルフィド結合の還元およびＦｖをＰＥ断片から分離するＰＥ３８中の部位でのプロテアーゼフューリンによる切断によって活性化される。続いて、活性化されたＰＥはサイトゾルへと転位せねばならず、ここでこれは翻訳装置の必須構成要素である伸長因子２をＡＤＰリボシル化して失活させる。これによりタンパク質合成が停止され、最終的に細胞死がもたらされる（ＰＥ中毒経路の総説には９を参照されたい）。ＰＥに基づくＲＩＴの細胞毒性活性を改善するために設計された以前の戦略には、ＰＥのＣ末端残基であるＲＥＤＬＫ（配列番号１５）をカノニカルなＥＲ保留シグナルＫＤＥＬ（配列番号１６）で置換することが含まれる（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ Ｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６６（２６）：１７３７６〜８１（１９９１）、Ｄｕ Ｘ、Ｈｏ Ｍ、およびＰａｓｔａｎ Ｉ、Ｊ ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３０（６）：６０７〜１３（２００７）、Ｒｏｚｅｍｕｌｌｅｒ Ｈ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．、９２（６）：８６１〜７０（２００１）、Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪおよびＰａｓｔａｎ Ｉ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３０７（Ｐｔ１）：２９〜３７（１９９５））。この変化は、恐らくはゴルジからＥＲへの逆行性輸送の効率を改善することによって、ＰＥの細胞毒性を増強させることが知られている。この戦略は有効であるが、典型的にはＲＩＴの非特異的毒性も増強させる。別の戦略は、Ｆｖとその標的との間の親和性を改善することによってＲＩＴ−受容体複合体の生産的内部移行を増強させ、それによって細胞中の毒素の量を増加させることである（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ Ｇら、Ｃｈｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、８（４）：９９５〜１００２（２００２）、Ｄｅｃｋｅｒ Ｔら、Ｂｌｏｏｄ．、１０３（７）：２７１８〜２６（２００４））。

【0006】

より最近では、プロテアーゼ耐性ＲＩＴは、有効な免疫毒素処置に対する潜在的な障壁であるリソソーム内の系中の分解に耐えるように設計されている（Ｊｏｈａｎｎｅｓ ＬおよびＤｅｃａｕｄｉｎ Ｄ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１２（１８）：１３６０〜８（２００５）、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｄ．、Ｗｈｙ ｔｏｘｉｎｓ、Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．、７（２）：８７〜９５（１９９６））。この「リソソーム分解耐性」（ＬＲ）変異体ＲＩＴは、ＰＥ３８のプロテアーゼ感受性領域を除去し、ＲＩＴ ＨＡ２２に由来する高い親和性の抗ＣＤ２２ ＦｖでこれをＢ細胞ＣＤ２２受容体へとターゲッティングすることによって生成した（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥ、Ｂｌｏｏｄ．、１１３（１６）：３７９２〜８００（２００９））。ＬＲ突然変異は細胞系に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に重大な影響を与えなかったが、マウスにおいて非特異的毒性を大きく低下させ、患者由来の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞に対する活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで劇的に増強した。さらに、ＬＲ変異体は２つの主要なマウスＢ細胞エピトープ群（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７７（１２）：８８２２〜３４（２００６））および抗原プロセシング部位をＰＥ３８から排除し、マウスにおいてその免疫原性を低下させることを助ける（Ｈａｎｓｅｎ ＪＫら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３３（３）：２９７〜３０４（２０１０））。ＲＩＴのモジュラー性質が原因で、ＰＥのＬＲ変異体は、１つのＦｖを別のもので交換することによって他の腫瘍関連抗原を標的とすることができる。したがって、ＰＥのドメインＩＩおよびＩｂの還元を開示する当技術分野は、一般に、プロテアーゼ感受性部位および抗原部位を分子から除去することの利点を教示する。また、当技術分野は、一般に、これらの変化の結果もたらされる最も小さいＲＩＴの薬物動態学的利点も教示する。

【0007】

臨床的に意味のある標的候補は、中皮腫ならびに肺、卵巣、および膵臓の癌が含まれる癌においてしばしば高度に発現されている、腫瘍関連抗原メソテリンである。したがって、その表面上にメソテリンを発現する癌細胞を特異的に標的とする、改善されたＲＩＴの必要性が存在する。本発明は、メソテリンを発現または過剰発現する癌を処置するためのＲＩＴ、医薬組成物、および方法を提供することによって、これらおよび他の必要性に備える。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、低下した免疫原性、リソソームプロテアーゼに対する改善された耐性、およびメソテリンを発現する細胞に対する改善された細胞毒性を有する、改善されたシュードモナス属外毒素Ａ（「ＰＥ」）を提供する。構造的に、本発明の改善されたＰＥは、ＰＥのドメインＩが除去されており、ＰＥのドメインＩＩのほとんどが除去されており、機能的ＰＥドメインＩＩＩを有しており、任意選択で、ａ）ＰＥドメインＩＩＩのアミノ酸残基の位置Ｄ４０６、Ｒ４３２、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５１３、Ｅ５４８、Ｋ５９０および／もしくはＱ５９２の、グリシン、アラニンもしくはセリンによる置換、ならびに／または、ｂ）ＰＥドメインＩＩＩのアミノ酸残基の位置Ｄ４０３、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｒ５０５、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｒ５５１、Ｒ５７６および／もしくはＬ５９７の、グリシン、セリン、もしくはアラニンによる置換を有している。改善は、３〜８個のアミノ酸の長さであり、配列がグリシン、および／またはセリン残基からなる短い柔軟なペプチドリンカー（「ＦＬ」）の、改善されたＰＥのフューリン切断部位と機能的ＰＥドメインＩＩＩとの間への挿入にある。したがって、短いリンカーはグリシン、および／またはセリン残基からなる。一部の実施形態では、リンカーは式：（Ｘａａ１）_ｎのペプチドであり、式中、それぞれのＸａａ１はグリシンおよびセリンから独立して選択され、ｎは３〜８である。本発明の改善されたＰＥ分子は、Ｂ細胞エピトープを除去することで高い細胞毒性活性を保持する。驚くべきことに、短い柔軟なリンカーを含めることで、フューリンによる分子の切断を実質的に変更せずに分子の細胞毒性が改善される。改善されたＰＥ分子は、本明細書中で（ＬＲ／ＦＬ／８Ｘ、配列番号４）およびＬＲ／ＦＬ／８Ｍ（配列番号５）と呼ぶ、本発明の特定の実施形態によって例示されている。さらに、配列番号４または５に見出されるように、ＰＥ分子が配列番号１のＰＥの機能的ドメインと比較してその機能的ドメインＩＩＩ中に１つまたは複数の突然変異を有する実施形態も存在する。さらなる実施形態では、ネイティブ配列の小胞体保持機能も有する、配列番号１の６０９〜６１３に対応する１つまたは複数の残基中のさらなる置換も企図される。さらなる実施形態では、ＰＥドメインＩＩフューリン切断部位は修飾されているか、または別のフューリン切断部位によって置換されている。

【0009】

上記のうちの任意のものと一貫して、さらに一部の実施形態では、ＰＥは、配列番号２のＰＥ毒素の機能的ドメイン（位置１２〜２３０）への１つもしくは複数の突然変異を有する機能的ドメインＩＩＩを含むか、またはＰＥドメインＩＩＩの１つもしくは複数のエピトープを除去する以下の表から選択される：

＊エピトープは、たとえば、Ｏｎｄａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２００８、１０５（３２）：１１３１１〜６およびＷＯ２００７／０１６１５０号に記載されている。

【0010】

関連する一態様では、本発明は、（ａ）メソテリンターゲッティング部分と、それとコンジュゲートまたは融合した（ｂ）上記に提供した修飾されたシュードモナス属外毒素Ａ（「ＰＥ」）とを含むキメラ分子であるＲＩＴ（「本発明のＲＩＴ」）を提供する。一部の実施形態では、前記部分は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体およびＦ（ａｂ’）_２からなる群から選択される抗体、または抗体のＣＤＲを含むポリペプチドである。ＳＳ１およびＭＯＲａｂ−００９が好ましいターゲッティング部分である。さらに、抗メソテリン抗体は可変重（「Ｖ_Ｈ」）鎖および可変軽（「Ｖ_Ｌ」）鎖を含むことができ、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖はそれぞれ第１、第２および第３の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有しており、前記重鎖のそれぞれ第１のＣＤＲ（「ＣＤＲ１」）、第２のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）、および第３のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）は、ＣＤＲ１（ＧＹＴＭＮ、配列番号５１）、ＣＤＲ２（ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ、配列番号５２）、およびＣＤＲ３（ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ、配列番号５３）について示したアミノ酸残基配列を有しており、前記Ｖ_Ｌ鎖のそれぞれＣＤＲ１、２および３は、ＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ、配列番号５４）、ＣＤＲ２（ＤＴＳＫＬＡＳ、配列番号５５）、およびＣＤＲ３（ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ、配列番号５６）について示したアミノ酸残基配列を有する。一部の実施形態では、軽鎖のＣＤＲ３は修飾されており、ＱＱＷＳＫＨＰＬＴ（配列番号５７）、ＱＱＷＳＧＨＰＬＴ（配列番号５８）、ＱＱＷＳＡＨＰＬＴ（配列番号５９）、ＱＱＷＳＱＩＰＬＴ（配列番号６０）、ＱＱＷＧＦＮＰＬＴ（配列番号６１）、ＱＱＷＧＴＮＰＬＴ（配列番号６２）、ＱＱＷＧＳＨＰＬＴ（配列番号６３）、ＱＱＷＧＤＦＰＬＴ（配列番号６４）、ＱＱＷＧＤＨＰＬＴ（配列番号６５）、ＱＱＷＳＡＨＰＬＴ（配列番号６６）、またはＱＱＷＳＧＹＰＴＴ（配列番号６７）の配列を有する。一部のさらなる実施形態では、抗メソテリン抗体はｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）_２である。さらに一部のさらなる実施形態では、ＲＩＴ中で使用する抗メソテリン抗体は、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、およびＶ_Ｈ ＣＤＲ２からなる群から選択されるＣＤＲ中に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷ（式中、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、ＷはＡまたはＴである）から選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされている。

【0011】

さらなる一態様では、本発明は、（ａ）上記に提供した本発明のＲＩＴと（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0012】

関連する一態様では、本発明は、上述の修飾されたシュードモナス属外毒素Ａ（「ＰＥ」）のＦＬまたはＲＩＴをコードしている単離核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、メソテリンターゲッティング抗体の全体あるいは断片（可変軽鎖もしくは重鎖またはＣＤＲ）をさらにコードしている。

【0013】

したがって、第１の実施形態群では、本発明は、以下の式：ＦＣＳ−ＦＬ−ＰＥ機能的ドメインＩＩＩまたはＬ１−ＦＣＳ−ＦＬ−ＰＥ機能的ドメインＩＩＩの連続したポリペプチド配列を含む、単離した修飾されたシュードモナス属外毒素Ａ（「ＰＥ」）を提供し、式中、Ｌ１は、１〜１０個のアミノ酸残基の長さの連続したペプチド配列からなり、ＦＣＳは、フューリン切断部位もしくは配列（たとえばＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ、配列番号１７）、またはフューリンによって切断可能な別の配列を表し、ＦＬは、グリシンおよびセリンから独立して選択される３〜８個のアミノ酸残基からなる柔軟なリンカーペプチド配列を表し、ＰＥ機能的ドメインＩＩＩは配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、任意選択で、（ｉ）配列番号１の６０９〜６１３に対応する１つもしくは複数の残基における置換、（ｉｉ）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンによる、配列番号１の位置４９０に対応する位置のアルギニンの置換、（ｉｉｉ）配列番号１の残基に対応する１つもしくは複数の残基の置換であって、配列番号１の残基がＰＥドメインＩＩＩのエピトープもしくはサブエピトープの免疫原性を維持する置換、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの任意のものの組合せを含む。好ましい実施形態では、ＰＥ機能的ドメインは、ＬＲ／ＦＬ／８Ｘ（配列番号４）またはＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（配列番号３）のＰＥ機能的ドメインである。

【0014】

さらなる実施形態群では、本発明は、（ａ）細胞表面上のメソテリンと特異的に結合するリガンド、またはターゲッティング部分と、それとコンジュゲートまたは融合した（ｂ）上述の修飾されたシュードモナス属外毒素Ａ（ＰＥ）とを含むキメラ分子またはＲＩＴを提供する。一部の実施形態では、リガンドは、抗体または抗原認識能力を保持しているその断片である。好ましい実施形態では、抗体はＳＳ１親抗体に由来する。好ましくは、ＲＩＴは、ＦＣＳと機能的ドメインＩＩＩとの間にＧＧＳ ＦＬが挿入されたＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｘである。したがって、これらのＲＩＴは、配列番号６のＳＳ１可変軽鎖および配列番号８または配列番号９のＳＳ１可変重鎖組換え免疫毒素配列を含むことができ、ＳＳ１可変軽鎖および重鎖はジスルフィドで安定化された抗体を形成する。

【0015】

さらなる実施形態群では、本発明は、細胞外部上にメソテリンを発現または過剰発現する標的細胞を死滅させるまたは標的細胞の成長を阻害する治療方法を提供する。この方法は、細胞を本発明のＲＩＴと接触させることを含む。メソテリンは、卵巣癌、中皮腫およびいくつかの他の種類のヒト癌の表面上に存在する分化抗原である。本発明のＲＩＴは、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、卵巣、胃、扁平細胞の癌、中皮腫およびメソテリンを発現する他の悪性細胞を死滅させるまたはその成長を阻害するために使用することができる。これらの状態に罹患している、および本発明のＲＩＴによるそのような処置を必要としている患者を処置する方法が企図される。

【0016】

さらなる実施形態群では、本発明は、上述の突然変異させたＰＥおよびＲＩＴをコードしている核酸を提供する。

【0017】

上記のうちの任意のものの一部の実施形態では、柔軟なリンカーはＧＧＳまたはＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８）である。

【0018】

さらに他のさらなる実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体およびＦ（ａｂ’）_２からなる群から選択される。上記の一部のさらなる実施形態では、抗体はＳＳ１または再操作したＳＳ１（ＳＳ１抗体のｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体、もしくはＦ（ａｂ’）_２、またはＳＳ１抗体のＣＤＲ部分を提供する断片（複数可））である。一部の実施形態では、抗体のＣＤＲをターゲッティング部分として使用する。一部の実施形態では、抗体はヒトまたはヒト化されたものである。一部の実施形態では、修飾されたＰＥはＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（配列番号３）またはＬＲ／（Ｘａａ１）_ｎ／８Ｘ（配列番号４）またはＬＲ／（Ｘａａ１）_ｎ／８Ｍ（配列番号５）である。一部のさらなる実施形態では、キメラ分子はＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｘ（配列番号６および７）またはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（配列番号６および８）であり、そのそれぞれのターゲッティング部分はＳＳ１抗体のＶ_ＬおよびＶ_Ｈ部分を含む。

【0019】

さらなる実施形態は当業者に明らかであり、本明細書中に記載されている。

【0020】

したがって、一部の実施形態では、本発明は、抗メソテリン抗体断片を含むキメラ分子を提供し、抗体断片は３〜８個のアミノ酸の長さの第１のペプチドリンカーと配列が直接接合しており、これはフューリンポリペプチド切断部位ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ（配列番号１７）と配列が直接接合しており、これはＧｌｙおよびＳｅｒから選択される３〜６個のアミノ酸からなる第２のペプチドリンカーと配列が直接接合しており、これはシュードモナス属外毒素Ａの機能的ドメインＩＩＩのＮ末端アミノ酸と配列が直接接合している。一部のさらなる実施形態では、機能的ドメインはＬＲまたはＬＲ／８ＭのドメインＩＩＩであり、抗体断片はＳＳ１−ＬＲのｄｓＦｖである。一部の実施形態では、第１のペプチドリンカー（Ｌ１）は、ｄｓＦｖのＶＨ部分のカルボキシ末端と配列が直接接合している。また、キメラ分子の医薬組成物、およびメソテリンを過剰発現する癌を、それを必要としている対象において処置する方法におけるその使用も提供されている。さらなる実施形態では、癌は肺腺癌、卵巣癌、中皮腫、または類表皮癌である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】組換え免疫毒素を示す図である。（Ａ）組換え免疫毒素ＳＳ１Ｐは、重鎖からの短いペプチドリンカー（ＡＳＧＧ、配列番号１９）を介してシュードモナス属外毒素Ａ（ＰＥ３８）の３８ｋＤａ断片とカップリングされた、抗メソテリンモノクローナル抗体ＳＳ１からの可変断片（Ｆｖ）のジスルフィドで安定化された（ｄｓ）重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）ポリペプチド鎖からなる。ＰＥ３８は、ネイティブシュードモナス属外毒素ＡからのドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ、およびドメインＩｂの断片から構成される。ドメインＩＩには、ジスルフィド結合を形成するシステインによって結合された、フューリンプロテアーゼ切断部位（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ、配列番号１７）を含有する、溶媒に曝されたループが含まれる。（Ｂ）ＳＳ１Ｐのリソソーム分解耐性変異体であるＳＳ１−ＬＲは、ドメインＩＩからのフューリン切断部位を含有する１１個の残基のストレッチ以外は、ＰＥのドメインＩｂおよびドメインＩＩを欠く。ＳＳ１−ＬＲのフューリン切断部位の周りに突然変異（下線）を用いて様々な構築体を作製した（配列番号２０〜２４）。

【図2-1】メソテリン陽性細胞系に対するＳＳ１−ＬＲの細胞毒性を示す図である。細胞系Ｌ５５、およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍを漸増濃度のＳＳ１Ｐ（白丸、実線）またはＳＳ１−ＬＲ（白四角、破線）と共にインキュベーションした。３日後、細胞生存度を比色ＷＳＴ−８アッセイで評価し、未処置とシクロヘキサミドで処置した対照で正規化した。６回の反復からの平均値および標準誤差がプロットされている。ＳＳ１−ＬＲは、配列番号６のジスルフィドで安定化されたＳＳ１ Ｖ_Ｌポリペプチド鎖および配列番号７４のＳＳ１ Ｖ_Ｈ−ＰＥポリペプチド鎖を含む。

【図2-2】メソテリン陽性細胞系に対するＳＳ１−ＬＲの細胞毒性を示す図である。細胞系ＨＡＹおよびＫＢ３１を漸増濃度のＳＳ１Ｐ（白丸、実線）またはＳＳ１−ＬＲ（白四角、破線）と共にインキュベーションした。３日後、細胞生存度を比色ＷＳＴ−８アッセイで評価し、未処置とシクロヘキサミドで処置した対照で正規化した。６回の反復からの平均値および標準誤差がプロットされている。ＳＳ１−ＬＲは、配列番号６のジスルフィドで安定化されたＳＳ１ Ｖ_Ｌポリペプチド鎖および配列番号７４のＳＳ１ Ｖ_Ｈ−ＰＥポリペプチド鎖を含む。

【図2-3】メソテリン陽性細胞系に対するＳＳ１−ＬＲの細胞毒性を示す図である。細胞系Ｍ３０およびＡ４３１／Ｋ５を漸増濃度のＳＳ１Ｐ（白丸、実線）またはＳＳ１−ＬＲ（白四角、破線）と共にインキュベーションした。３日後、細胞生存度を比色ＷＳＴ−８アッセイで評価し、未処置とシクロヘキサミドで処置した対照で正規化した。６回の反復からの平均値および標準誤差がプロットされている。ＳＳ１−ＬＲは、配列番号６のジスルフィドで安定化されたＳＳ１ Ｖ_Ｌポリペプチド鎖および配列番号７４のＳＳ１ Ｖ_Ｈ−ＰＥポリペプチド鎖を含む。

【図2-4】メソテリン陽性細胞系に対するＳＳ１−ＬＲの細胞毒性を示す図である。細胞系ＯＶＣＡＲ−８およびＡ１８４７を漸増濃度のＳＳ１Ｐ（白丸、実線）またはＳＳ１−ＬＲ（白四角、破線）と共にインキュベーションした。３日後、細胞生存度を比色ＷＳＴ−８アッセイで評価し、未処置とシクロヘキサミドで処置した対照で正規化した。６回の反復からの平均値および標準誤差がプロットされている。ＳＳ１−ＬＲは、配列番号６のジスルフィドで安定化されたＳＳ１ Ｖ_Ｌポリペプチド鎖および配列番号７４のＳＳ１ Ｖ_Ｈ−ＰＥポリペプチド鎖を含む。

【図3】高用量のＳＳ１−ＬＲが強力な抗腫瘍活性を有することを示す図である。Ａ４３１／Ｋ５異種移植腫瘍を有するヌードマウスを、移植後５、７、および９日目に、ＲＩＴ緩衝液（ＰＢＳ中に０．２％のＨＳＡ、×印、実線）、０．３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐ（白丸、実線）、または６（白四角、破線）もしくは１５（黒四角、破線）ｍｇ／ｋｇの用量のＳＳ１−ＬＲを用いて静脈内で処置した。矢印は処置を投与した日を示す。腫瘍サイズを２２日間にわたって測定した。点は、処置群中のすべてのマウスの平均腫瘍サイズを表す（ｎ＝６匹）。エラーバーはそれぞれの平均値の標準誤差を示す。

【図4】内部移行された免疫毒素のプロセシングを示す図である。Ａ４３１／Ｋ５細胞を（Ａ）ＳＳ１Ｐまたは（Ｂ）ＳＳ１−ＬＲと共に連続的にインキュベーションし、０から２４時間の様々な時点で溶解し、抗ＰＥ抗体を用いた非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットによって分析した。完全長、還元された、およびフューリンで切断されたバンドを示す。（Ｃ）それぞれの時点におけるすべてのバンドの合計強度に対するフューリンで切断されたバンドの強度を、ＳＳ１Ｐ（白丸、実線）およびＳＳ１−ＬＲ（白四角、破線）について示す。

【図5】柔軟なリンカーの付加がＳＳ１−ＬＲの細胞毒性を増強させることを示す図である。細胞系（Ａ）ＫＢ３１および（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍを漸増濃度のＳＳ１Ｐ（白丸、実線）、ＳＳ１−ＬＲ（白四角、破線）、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ（白菱形、実線）、またはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ Ｒ２７９Ｇ（黒六角形、線なし）と共にインキュベーションした。３日後、細胞生存度を非比色（ａｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）ＷＳＴ−８アッセイで評価し、未処置とシクロヘキサミドで処置した対照で正規化した。６回の反復からの平均値および標準誤差がプロットされている。

【図6】患者細胞に対するＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの細胞毒性を示す図である。中皮腫を有する患者の胸膜液または腹水から培養した細胞を、漸増濃度のＲＩＴ ＳＳ１Ｐ（白色バー）またはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（灰色バー）と共にプレートした。４日後、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色して、インタクトな細胞を検出した。生じた５９５ｎｍでの吸光度を未処置の対照に対して正規化した。３回の反復からの平均値および標準誤差がプロットされている。アスタリスクなし＝ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。

【図7】ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍのｉｎ ｖｉｖｏ挙動を示す図である。Ａ）ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの抗腫瘍活性。Ｌ５５異種移植腫瘍を有するヌードマウスを、移植後７、９、および１２日目に、ＲＩＴ緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ中に０．２％のＨＳＡ、×印、実線）、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐ（白丸、実線）、または０．４（白四角、破線）もしくは２．５（黒四角、破線）ｍｇ／ｋｇの用量のＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを用いて静脈内で処置した。矢印は処置を投与した日を示す。腫瘍サイズを３０日間にわたって測定した。点は、処置群中のすべてのマウスの平均腫瘍サイズを表す（ｎ＝７匹）。エラーバーはそれぞれの平均値の標準誤差を示す。Ｂ）毛細血管漏出症候群のラットモデル。ラットを、ＰＢＳ、ＳＳ１Ｐ、またはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを用いて静脈内で処置し、２４時間後に観察し、続いて屠殺した。安楽死させた動物からの胸水を採取し、測定した。数匹のラットの肺を固定し、切片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Ｃ）２００×の拡大率での代表的な画像を示す。Ｄ）ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの薬物動態学。ＢａｌｂＣマウスに１０μｇのＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍのどちらかを静脈内注射し、注射時から２から６０分間の間のいくつかの間隔で出血させた。様々な間隔での血清中の免疫毒素の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、単一指数崩壊関数に当てはめた。対応する半減期（ｔ_１／２）を示す。それぞれの点は１匹のマウスの血清中の免疫毒素の濃度であり、それぞれの時間間隔での濃度は少なくとも２匹の異なるマウスから決定した。

【図8】ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍに対するヒト抗原性を示す図である。置換アッセイを使用してヒト血清におけるＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの既存の抗体との反応性を比較して、血清抗体を検出するＥＬＩＳＡのシグナルを２つのＲＩＴが５０％低下させた濃度を決定した（ＩＣ５０）。ＳＳ１Ｐ対ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの相対的ＩＣ_５０値がここにプロットされている。すべての血清について、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの抗原性はＳＳ１Ｐと比較して劇的に低下している。

【図9】患者細胞に対するＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの細胞毒性の要約を示す図である。相対的生存度対処置。中皮腫を有する患者の胸膜液または腹水から培養した細胞を、漸増濃度のＳＳ１Ｐ（白色バー）またはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（灰色バー）と共にプレートした。４日後、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色して、インタクトな細胞を検出した。生じた５９５ｎｍでの吸光度を未処置の対照に対して正規化した。３回の反復からの平均値および標準誤差がプロットされている。アスタリスクはｐ＜０．０１（＊＊）またはｐ＜０．００１（＊＊＊）の有意差を示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、ＰＥに基づく抗メソテリンＲＩＴ ＳＳ１Ｐに基づく抗メソテリンＲＩＴの、毒性がより低い、免疫原性がより低い変異体を提供する。ＰＥに基づく抗ＣＤ２２ ＲＩＴ ＨＡ２２−ＬＲを用いた以前の研究に基づいて生成した、本発明者らによるＳＳ１−ＬＲの初期評価は（Ｗｅｌｄｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１１３（６）：３７９２〜３８００（２００９））、選ばれたメソテリン発現細胞系において大きく変動する活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで示した。マウスＡ４３１／Ｋ５異種移植腫瘍アッセイでは、ＳＳ１−ＬＲ（配列番号６および７）はＳＳ１Ｐよりも活性が低かったが、ＳＳ１−ＬＲをはるかにより高い用量で投与して顕著な腫瘍回帰を達成することができた。ＳＳ１Ｐと比較したその大きく変動する活性の原因を探索しながら、本発明者らはＳＳ１−ＬＲの内部移行およびプロセシングを調査し、フューリンで切断されたＳＳ１−ＬＲの割合がＳＳ１Ｐのそれよりもはるかに低かったことを見出した。このことは減少したフューリン切断がＳＳ１−ＬＲの活性を制限している可能性を示唆しており、本発明者らはこの仮説を試験するためにいくつかの突然変異体を設計し、生成した。フューリン切断部位の後に短いＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを付加することは細胞系に対するＳＳ１−ＬＲの活性を増強させたが、驚くべきことに、増強された細胞毒性は増強されたフューリン切断に対応していなかった。本発明は、フューリンによるＰＥの切断のいかなる効果とも独立した抗メソテリンＲＩＴ構築体の細胞毒性における、短い柔軟なリンカーの重要性のこの驚くべき発見に関する。さらなる研究では、ＰＥの免疫原性を低下させることが示されている、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳへの８個の点突然変異を組み込み、その後、この分子を、中皮腫を有する患者からの原発性悪性細胞に対して試験した。最終分子、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（配列番号６および８）は、ＳＳ１Ｐに類似した細胞毒性を実証した。さらに、本発明によるＲＩＴは、哺乳動物において著しく低下した非特異的な毒性（たとえば毛細血管漏出症候群）をもたらすことができる。

【0023】

ＳＳ１−ＬＲとＳＳ１Ｐとの間の抗腫瘍効果の約２０倍の差異が、ｉｎ ｖｉｖｏ Ａ４３１１Ｋ５異種移植腫瘍マウスモデルを使用して観察された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性データはＡ４３１／Ｋ５細胞に対する細胞毒性４倍の減少を示しているため、この差異は完全に細胞毒性に起因させることはできない。そうではなく、この差異の残りの部分はマウスにおけるＳＳ１−ＬＲの薬物動態学的特性が原因である可能性が高い。本発明者らは以前に、ＨＡ２２−ＬＲはマウスにおいてＨＡ２２よりもほぼ２倍短い血清半減期を有することを示しており（それぞれ７．８対１４．６分間）、この差異は、より小さなＬＲ分子の腎臓濾過の増加が原因であると仮定した（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥ、Ｂｌｏｏｄ．、１１３（１６）：３７９２〜８００（２００９））。崩壊曲線下面積を検査することによって、この半減期の差異は１時間の間に利用可能なタンパク質の約４倍の差異を示唆している。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏの活性の差異は減少した細胞毒性およびより短い半減期の両方に起因している可能性がある。

【0024】

ＳＳ１−ＬＲはｉｎ ｖｉｖｏでＳＳ１Ｐよりも低い抗腫瘍活性を実証したが、その非特異的毒性もマウスにおいて大きく低下した。本発明者らは、この特性を利用して、異種移植腫瘍アッセイにおいてＳＳ１−ＬＲの用量をＳＳ１Ｐを超えて劇的に増加させ（５０倍）、大きく増強された抗腫瘍効果がもたらされた。以前の実験により、ＳＳ１Ｐの単一用量の静脈内ＬＤ５０はＢａｌｂ／Ｃマウス中では１．０ｍｇ／ｋｇであり（Ｆｉｌｐｕｌａ Ｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．、１８（３）：７７３〜８４（２００７））、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス中では０．７５ｍｇ／ｋｇである（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６１（１３）：５０７０〜７（２００１））ことが多様に示されている。臨床スケジュールに類似したＱＯＤ×３投薬スケジュールを使用して、マウスは０．３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐの最大用量を耐用した（非公開の観察）。しかし、ＳＳ１−ＬＲはＡ４３１／Ｋ５異種移植抗腫瘍実験において１５ｍｇ／ｋｇの用量を用いてＱＯＤ×３で投与し、悪影響はなかった。以前に、２０ｍｇ／ｋｇの単一の静脈内用量のＨＡ２２−ＬＲはマウスに対して毒性を示さず（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥ、Ｂｌｏｏｄ．、１１３（１６）：３７９２〜８００（２００９））、本発明者らは４５ｍｇ／ｋｇと高い単一用量のＨＡ２２・ＬＲをマウスに与え、死亡がもたらされなかった（非公開の観察）。どのＬＲ分子も臨床的に試験していないが、この効果は、ＬＲ変異体ＲＩＴがヒト患者において減少した毒性を有し得ることを示唆しており、これは用量規制毒性を防止し、より高い用量を投与することを可能にする可能性がある。

【0025】

ＳＳ１−ＬＲはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで有効であったが、本発明者らはＳＳ１Ｐと比較して一般に減少した活性に懸念を持っていた。この相違の１つの可能な説明は細胞内中毒経路の差異である。ＰＥ３８のＬＲ変異体はＰＥのドメインＩＩおよびＩｂ中に大規模な欠失を含有しており、これらの欠失が、サイトゾルへと輸送されるＰＥの能力に負の影響を与えた可能性がある。興味深いことに、ＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲで処理した細胞の溶解物中の完全長およびプロセシングされたＰＥを検出するための本発明者らの初期実験は、フューリンでプロセシングされたＲＩＴの量の劇的な差異を示した。ＳＳ１Ｐで処理した細胞中の全ＲＩＴの大部分がプロセシングされたが、ＳＳ１−ＬＲで処理した細胞中では全ＲＩＴのほんの少ししかプロセシングされなかった。この結果は、乏しいフューリン切断がＳＳ１−ＬＲの活性を制限している可能性を示唆しており、本発明者らはＰＥ中毒経路のこのステップを改善しようと試みた。

【0026】

フューリン切断部位の接近可能性を増加させることによってＳＳ１−ＬＲの細胞毒性を増強させる本発明者らの試みにより、より活性のあるＲＩＴが生成されたが、フューリン切断の増強を実証することができなかった。短いＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーの付加（ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ、図１Ｂ）、より長いリンカー（ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ×２、図１Ｂ）、または短いＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーによって隣接されたフューリン部位の反復（ＳＳ１−ＬＲ／２×フューリン、図１Ｂ）の付加はすべて、中程度の細胞毒性の増加を与えた。しかし、これらの分子はいずれも、処理したＡ４３１／Ｋ５細胞においてフューリンで切断されたＳＳ１−ＬＲの割合を増強させず、ｉｎ ｖｉｔｒｏフューリン切断速度を増加させなかった。本発明者らは、リンカーの付加が別の機構、恐らくは試験した細胞中の分子の細胞内輸送に関連する機構によって細胞毒性を増強させているはずだと結論づけた。

【0027】

また、これらの実験は、ＳＳ１Ｐの細胞毒性の保持におけるフューリン切断の絶対的必要性も実証した。切断に必須のアルギニンをグリシンへと変化させたＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ中の点突然変異（ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ Ｒ２７９Ｇ、図１Ｂ）は、フューリンによって切断されなかったタンパク質を生じた。このＲＩＴは、ＮＣＩ−Ｈ３２２ＭおよびＫＢ３１細胞のどちらに対しても活性を示さなかった。ＰＥ中毒経路におけるフューリン切断の必要性は最近疑問視されていたが（Ｍｏｒｌｏｎ−Ｇｕｙｏｔ Ｊら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、７７（７）：３０９０〜９（２００９））、フューリンが中毒中に重要な役割を果たすという多くの証拠が存在する（Ｏｒｎａｔｏｗｓｋｉ Ｗら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７（１１）：３４８９〜９７（２００７）、Ｓｈｉｒｙａｅｖ ＳＡら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８２（２９）：２０８４７〜５３（２００７）、Ｓａｒａｃ ＭＳら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、７０（１２）：７１３６〜９（２００２）、Ｃｈｉｒｏｎ ＭＦ、Ｆｒｙｌｉｎｇ ＣＭ、およびＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ Ｄ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７２（５０）：３１７０７〜１１（１９９７）、Ｇｕ Ｍら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、６４（２）：５２４〜７（１９９６）、Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ ＮＭ、Ｍｏｅｈｒｉｎｇ ＪＭ、およびＭｏｅｈｒｉｎｇ ＴＪ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６９（５０）：３１８３１〜５（１９９４）、Ｍｏｅｈｒｉｎｇ ＪＭら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６８（４）：２５９０〜４（１９９３））。ここに提示する事例では、ＰＥ中毒は、フューリンプロセシングに適した部位を含有していなければ失敗する。フューリン切断と細胞毒性との間の関係性を探索するための研究が続いている。

【0028】

本発明者らの研究室における別の一連の研究により、Ｂ細胞エピトープの排除が原因で非常に低い免疫原性を有するＨＡ２２の変異体であるＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍが最近生成された（Ｏｎｄａ Ｍら、発表のためにＰＮＡＳに提出）。ＨＡ２２−ＬＲ−８ＭはＰＥのＬＲ変異体と同じ欠失を含有するが、ＰＥのドメインＩＩＩ中に８個の点突然変異も取り込んでいる。これらの突然変異をＳＳ１Ｐ内に配置してＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを作製した。ＨＡ２２−ＬＲ−８ＭとＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍとの間の唯一の差は、フューリン切断部位後の抗体ＦｖおよびＧＧＳリンカーである。ＲＩＴに対する免疫応答の膨大な大多数はＰＥに向けられているため、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは同様に低下した免疫原性を示すはずである。

【0029】

中皮腫を有する患者からの原発性悪性細胞に対するＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの細胞毒性をＳＳ１Ｐと比較した、結果により、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭがＳＳ１Ｐに匹敵するまたはそれよりも良好な細胞毒性を有していたことが示された。良好な活性に加えて、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは、低下した非特異的毒性および低い免疫原性を含めた、ＳＳ１Ｐを超える潜在的な利点を有する。本明細書中に記載した実験は、その低い免疫原性、低い非特異的毒性、および良好な細胞毒性が原因で、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍが診療所にとって優れた候補となることを示唆している。

【0030】

定義
単位、接頭辞、および記号は、その国際単位系（ＳＩ）に許容される形態で示す。数値範囲は、範囲を定義する数値を包括する。別段に指定しない限りは、核酸は左から右に５’から３’の配向で記載されており、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの配向で記載されている。本明細書中に提供する表題は、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではなく、これは明細書を全体として参照することによって行うことができる。したがって、直下に定義する用語は、明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。

【0031】

ネイティブシュードモナス属外毒素Ａ（「ＰＥ」）とは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって分泌され、真核細胞においてタンパク質合成を阻害する、非常に活性のある単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）である。ネイティブＰＥ配列は、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第５，６０２，０９５号の配列番号１に記載されている。その作用方法はＡＤＰ−リボシル化による伸長因子２（ＥＦ−２）の不活性化である。外毒素は、協調作用して細胞毒性を引き起こす３つの構造的ドメインを含有する。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は細胞結合を媒介する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）はサイトゾル内への転位を司っており、ドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は伸長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ＰＥの元の構造では、ドメインＩＩＩは残基４００〜６１３ではなく４０５〜６１３として分類されている。Ａｌｌｕｒｅｄ ＶＳ、Ｃｏｌｌｉｅｒ ＲＪ、Ｃａｒｒｏｌｌ ＳＦおよびＭｃＫａｙ ＤＢ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８３、１３２０〜１３２４（１９８６）。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は未定義のままであるが、その大部分であるアミノ酸３６５〜３８０は、細胞毒性を失わずに欠失させることができる。Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６４：１４２５６〜６１（１９８９）を参照されたい。数々のそのような修飾が当分野で知られており、それだけには限定されないが、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩおよびＩＩＩ中の様々なアミノ酸の欠失、単一アミノ酸置換、ならびにカルボキシル末端におけるＫＤＥＬ（配列番号１６）およびＲＥＤＬ（配列番号２６）などの１つまたは複数の配列の付加が含まれる。Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１４２５６〜１４２６１（１９８９）を参照されたい。本発明の免疫毒素は標的細胞中で転位およびＥＦ−２リボシル化が可能である。

【0032】

本明細書中において、ＰＥの突然変異は、ネイティブＰＥ（配列番号１）の６１３個のアミノ酸の配列の特定の位置に存在するアミノ酸残基を参照して記載し、議論中の特定の突然変異においてその残基が置き換えられたアミノ酸が続く。したがって、たとえば用語「Ｒ４９０Ａ」とは、言及した分子の位置４９０の「Ｒ」（標準の一文字コードでアルギニン）が「Ａ」（標準の一文字コードでアラニン）によって置き換えられていることを示し、「Ｋ５９０Ｑ」とは、位置５９０に通常存在するリシンがグルタミンで置き換えられていることを示す。一般的なアミノ酸の標準の一文字コードを以下に示す。

【0033】

用語「ＰＥ機能的ドメインＩＩＩ」または「機能的ＰＥドメインＩＩＩ」とは、ネイティブＰＥ（ネイティブ配列は配列番号１である）の残基３９５〜６１３をいう。ドメインＩＩＩの構造的な境界は残基４０５〜６１３に設定されているが、機能分析により、ドメインＩＩＩはＡＤＰ−リボシル化活性を保持するためにドメインＩｂのセグメントを必要とすることが示されている（Ｈｗａｎｇ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、４８：１２９〜１３６（１９８７）、Ｓｉｅｇａｌｌ，Ｃ．Ｂ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６４：１４２５６〜１４２６１（１９８９））。したがって、ＰＥ機能的ドメインＩＩＩはＰＥの残基３９５〜６１３によって定義される（Ｋｉｈａｒａ，Ａ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、５：５３２〜５３８（１９９４））。本明細書中では、機能的ＰＥドメインＩＩＩの配列には、抗原性を低下させるための任意選択の修飾および任意選択の代替小胞体保持配列が含まれる。

【0034】

ＰＥドメインＩＩＩの末端残基ＲＥＤＬＫ（配列番号１５）は、生じるＲＩＴの細胞毒性を本発明に従って増加させる方法で変動させることができる。たとえば、配列ＫＤＥＬ（配列番号１６）、ＲＥＥＬ（配列番号２７）またはＲＤＥＬ（配列番号２８）で終わる突然変異させたＰＥを用いて作製した免疫毒素は、ネイティブ末端配列を保有するＰＥ３８を用いて作製した免疫毒素よりも標的細胞に対してはるかに高い細胞毒性とすることができる。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、３０７（Ｐｔ１）：２９〜３７（１９９５）を参照されたい。また、これらの配列の反復も本ＲＩＴ中に使用することができる。たとえば、米国特許第５，８５４，０４４号、第５，８２１，２３８号、および第５，６０２，０９５号、ならびに国際公開ＷＯ９９／５１６４３号を参照されたい。ＫＤＥＬ（配列番号１６）で終わるＰＥはｉｎ ｖｉｔｒｏ目的に有用である一方で、動物においてより非特異的な毒性を有する場合があり、ｉｎ ｖｉｖｏ使用にはより好ましくない。

【0035】

用語「メソテリン」とは、一部のヒト細胞の表面上に存在し、たとえばＫ１抗体によって結合されるタンパク質およびその断片をいう。メソテリンの核酸およびアミノ酸配列は、たとえば、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９７／２５，０６８号ならびに米国特許第６，０８３，５０２号および６，１５３，４３０号に記載されている。Ｃｈａｎｇ，Ｋ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５７：９０（１９９４）、Ｃｈａｎｇ，Ｋ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１３６（１９９６）、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７１：６３８（１９９７）、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３４：９（１９９７）、および米国特許第６，８０９，１８４号も参照されたい。メソテリンは約６９ｋＤａの前駆タンパク質として発現され、その後プロセシングされて３０ｋＤａのタンパク質を放出する一方で、背景中に記載した４０ｋＤａのグリコシルホスファチジルイノシトール連結の細胞表面糖タンパク質を細胞表面に付着したまま残す。４０ｋＤａの糖タンパク質が、本明細書中で用語「メソテリン」と呼ぶものである。メソテリンの核酸およびアミノ酸配列はいくつかの種から記録されており、たとえば、ヒト（ＮＭ＿００５８２３．４→ＮＰ＿００５８１４．２およびＮＭ＿０１３４０４．３→ＮＰ＿０３７５３６．２）、マウス（ＮＭ＿０１８８５７．１→ＮＰ＿０６１３４５．１）、ラット（ＮＭ＿０３１６５８．１→ＮＰ＿１１３８４６．１）、ウシ（ＮＭ＿００１１００３７４．１→ＮＰ＿００１０９３８４４）である。

【0036】

参照の利便上、本明細書中で使用する用語「抗体」には、コンテキストによりそうではないことが必要とされない限り、全（場合によっては本明細書中で「インタクト」と呼ぶ場合もある）抗体、抗原認識および結合の能力を保持する抗体断片（全抗体の修飾によって生成したか組換えＤＮＡ方法を使用して新規合成したものかにかかわらない）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびに抗体模倣体が含まれる。抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３もしくはＩｇＧ_４）、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥであり得る。

【0037】

ＩｇＧサブクラスの定常領域の配列は、長年の間当分野で周知であった（たとえば、Ｈｏｎｊｏら、Ｃｅｌｌ、１８：５５９〜６８（１９７９）、Ｔｕｃｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０６：１３０３〜６（１９７９）、Ｙａｍａｗａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８３：７８６〜９（１９８０）、Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１０：４０７１〜９（１９８２）、Ｅｌｌｉｓｏｎら、ＤＮＡ、１：１１〜８（１９８１）、ＥｌｌｉｓｏｎおよびＨｏｏｄ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、７９：１９８４〜８（１９８２））。可変領域のＣＤＲが抗体の特異性を決定するため、標的細胞表面抗原に対する抗体のＣＤＲまたはＦｖを選択した抗体内に移植または操作して、標的細胞表面抗原に対する特異性をその抗体に与えることができる。たとえば、標的細胞表面抗原に対する抗体のＣＤＲを既知の三次元構造のヒト抗体フレームワーク上に移植して（たとえば、ＷＯ９８／４５３２２号、ＷＯ８７／０２６７１号、米国特許第５，８５９，２０５号、第５，５８５，０８９号、および第４，８１６，５６７号、ＥＰ特許出願第０１７３４９４号、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３（１９８８）、ならびにＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３（１９９１）を参照）、ヒトに投与した際に免疫原性応答をわずかしか生じさせないまたはまったく生じさせない抗体を形成することができる。あるいは、抗体の定常領域は、マウスなどの非ヒト動物中に見出される残基を、典型的にはヒト中で見出される残基で置き換えることによって操作することができる。この様式で操作された抗体は「ヒト化抗体」と呼ばれ、副作用を誘発する危険性がより低く、より長く循環中に留まることができるため、好ましい。抗体をヒト化する方法は当分野で知られており、たとえば、米国特許第６，１８０，３７７号、第６，４０７，２１３号、第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、および５，５３０，１０１号に記載されている。

【0038】

用語「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部分、一般にはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む分子を意味する。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片、単一ドメイン抗体（たとえば、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ、Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）１９８（３）：１５７〜７４、Ｓａｅｒｅｎｓら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００８）８（５）：６００〜８、Ｈａｒｍｓｅｎおよびｄｅ Ｈａａｒｄ、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）７７（１）：１３〜２２を参照）、ヘリックスで安定化された抗体（たとえばＡｒｎｄｔら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３１２：２２１〜２２８（２００１））、ダイアボディー（以下を参照）、単鎖抗体分子（「ｓｃＦｖ」、たとえば米国特許第５，８８８，７７３号を参照）、ジスルフィドで安定化された抗体（「ｄｓＦｖ」、たとえば、米国特許第５，７４７，６５４号および第６，５５８，６７２号を参照）、ならびにドメイン抗体（「ｄＡｂ」、たとえば、Ｈｏｌｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２１（１１）：４８４〜４９０（２００３）、Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４１４：５２１〜５２６（１９９７）、Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、ＥＭＢＯ Ｊ、１７：３５１２〜３５２０（１９９８）、Ｒｅｉｔｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９０：６８５〜６９８（１９９９）、ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：４７５〜４７９（２００１）を参照）が含まれる。

【0039】

用語「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する、同じポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ）中で可変軽鎖ドメイン（「Ｖ_Ｌ」または「ＶＬ」）と接続された可変重鎖ドメイン（「Ｖ_Ｈ」または「ＶＨ」）を含む小さな抗体断片をいう。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするためには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を作製することを強いられる。ダイアボディーおよびその産生は、たとえば、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）中により完全に記載されている。

【0040】

用語「親抗体」とは、突然変異または変動させて親抗体と同じエピトープと結合するがより高い親和性で結合する抗体またはその断片を得る、任意の目的抗体を意味する。

【0041】

「ターゲッティング部分」とは、免疫コンジュゲートを目的細胞にターゲッティングすることを意図する、免疫コンジュゲートの一部分である。典型的には、ターゲッティング部分は抗体または抗原認識能力を保持している抗体の断片、たとえば、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）_２である。

【0042】

「毒性部分」とは、免疫毒素が目的細胞に対して細胞毒性であるようにする、免疫毒素の一部分である。本発明の目的である免疫毒素に関して、毒性部分は、以下にある程度詳述する、その非特異的な細胞毒性を低下させるために修飾／突然変異されたシュードモナス属外毒素Ａである。

【0043】

典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。それぞれの重鎖および軽鎖は定常領域および可変領域を含有する（この領域は「ドメイン」としても知られる）。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている。様々な軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成要素である軽鎖および重鎖の合わせたフレームワーク領域は、ＣＤＲを三次元空間内に配置およびアラインメントする役割を果たす。

【0044】

ＣＤＲは主に抗原のエピトープとの結合を司っている。それぞれの鎖のＣＤＲは典型的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から開始して順次付番されており、また、典型的にはその特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定される。したがって、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン中に位置している一方で、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。

【0045】

「Ｖ_Ｈ」または「ＶＨ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂを含めた免疫グロブリン重鎖の可変領域をいう。「Ｖ_Ｌ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂを含めた免疫グロブリン軽鎖の可変領域をいう。

【0046】

語句「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、伝統的な二本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが接合されて１本の鎖を形成している抗体をいう。典型的には、リンカーペプチドが２本の鎖の間に挿入されて、正式な折り畳みおよび活性結合部位の作製を可能にする。

【0047】

語句「ジスルフィド結合」または「システイン−システインジスルフィド結合」とは、２つのシステイン間の共有的相互作用をいい、システインの硫黄原子が酸化されてジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合の平均結合エネルギーは、水素結合の１〜２ｋｃａｌ／ｍｏｌと比較して約６０ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

【0048】

語句「ジスルフィドで安定化されたＦｖ」または「ｄｓＦｖ」とは、軽鎖と重鎖との間にジスルフィド結合が存在する、免疫グロブリンの可変領域をいう。本発明のコンテキストでは、ジスルフィド結合を形成するシステインは抗体鎖のフレームワーク領域内にあり、抗体のコンホメーションを安定化させる役割を果たす。典型的には、フレームワーク領域内の置換が抗原結合を妨げない位置にシステインが導入されるように、抗体を操作する。

【0049】

用語「リンカーペプチド」には、重鎖の可変ドメインを軽鎖の可変ドメインと間接的に結合させる役割を果たす、抗体結合断片（たとえばＦｖ断片）内のペプチドへの言及が含まれる。

【0050】

用語「ホットスポット」とは、特に高い天然の変動の部位である、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域のヌクレオチド配列の一部分を意味する。ＣＤＲ自体が超可変性の領域であるとみなされているが、突然変異はＣＤＲ全体にわたって均等に分布されていないことが分かっている。特定の部位、すなわちホットスポットが、集中的な突然変異を受けるこれらの部位として同定されている。ホットスポットはいくつかの構造的な特徴および配列によって特徴づけられている。これらの「ホットスポットモチーフ」を使用してホットスポットを同定することができる。特に良好に特徴づけられている２つのコンセンサス配列モチーフは、テトラヌクレオチド配列ＲＧＹＷおよびセリン配列ＡＧＹ（式中、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、ＷはＡまたはＴである）である。

【0051】

特定の抗原と免疫学的に反応性のある抗体は、ファージもしくは類似のベクター内での組換え抗体のライブラリの選択などの組換え方法によって［たとえば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６（１９８９）、およびＶａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９〜３１４（１９９６）を参照］、または動物を抗原もしくは抗原をコードしているＤＮＡで免疫化することによって、作製することができる。

【0052】

用語「エフェクター部分」とは、ターゲッティング部分によってターゲッティングされた細胞に対して効果を与えること、または免疫コンジュゲートの存在を同定することを意図する、免疫コンジュゲートの一部分を意味する。本発明のコンテキストでは、エフェクター部分は修飾されたまたは突然変異させたシュードモナス属外毒素Ａである。

【0053】

用語「免疫コンジュゲート」には、抗体へのエフェクター分子の共有結合への言及が含まれる。

【0054】

用語「有効量」または「ために有効な量」または「治療上有効な量」には、細胞のタンパク質合成を少なくとも５０％阻害すること、または細胞を死滅させることなどの、所望の結果を生じるために十分な治療剤の用量への言及が含まれる。

【0055】

本発明のコンテキストでは、毒素は突然変異させたシュードモナス属外毒素Ａである。

【0056】

用語「接触させる」には、直接的な物理的会合状態に置くことへの言及が含まれる。

【0057】

「発現プラスミド」は、プロモーターと作動可能に連結されている、目的分子をコードしているヌクレオチド配列を含む。

【0058】

本明細書中で使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は互換性があるように使用され、アミノ酸残基のポリマーへの言及が含まれる。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。また、これらの用語は、タンパク質が機能的に保たれるように保存的アミノ酸置換を含有するポリマーにも適用される。

【0059】

用語「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」には、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（「ペプチド」と総称）内に組み込まれているアミノ酸への言及が含まれる。アミノ酸は天然に存在するアミノ酸であることができ、別段に限定されない限りは、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能することができる天然アミノ酸の既知の類似体を包含することができる。

【0060】

本明細書中で言及するアミノ酸および類似体は、以下の表Ａのように略記の表示によって記載する。

【0061】

タンパク質を説明する場合の「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に変更させない、タンパク質のアミノ酸組成の変化をいう。したがって、特定のアミノ酸配列の「保存的に修飾された変異」とは、タンパク質の活性に重大でないアミノ酸のアミノ酸置換、または重大なアミノ酸の置換でさえも活性が実質的に変更されないような、同様の特性（たとえば、酸性、塩基性、正もしくは負荷電、極性もしくは非極性など）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸置換をいう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当分野で周知である。表Ｂ中の以下の６つの群はそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。

【0062】

表Ｂ
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
また、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（第２版、１９９２）も参照されたい。

【0063】

用語「コンジュゲートさせる」、「接合させる」、「結合させる」または「連結させる」とは、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすることをいう。本発明のコンテキストでは、この用語には、抗体部分をエフェクター分子（ＥＭ）と接合させることへの言及が含まれる。連結は、化学的手段または組換え手段のどちらかによるものであることができる。化学的手段とは、２つの分子間に共有結合が形成されて１つの分子を形成するような、抗体部分とエフェクター分子との間の反応をいう。

【0064】

本明細書中で使用する「組換え」には、タンパク質を発現することができるＤＮＡの内在性コピーをそのネイティブ状態では有さない細胞を使用して産生されるタンパク質への言及が含まれる。細胞は、適切な単離核酸配列の導入によって遺伝子変更されているため、組換えタンパク質を産生する。また、この用語には、異種核酸の導入もしくはネイティブでない形態への［０］ネイティブ核酸の変更によって修飾された［０］細胞、もしくは核酸、もしくはベクターへの言及、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することへの言及も含まれる。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見つからない遺伝子を発現する、ネイティブ形態内で見出される遺伝子の突然変異体を発現する、または、そうでなければ異常に発現される、過小発現される、もしくはまったく発現されないネイティブ遺伝子を発現する。

【0065】

本明細書中で使用する「核酸」または「核酸配列」には、一本鎖または二本鎖のどちらかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーへの言及が含まれ、別段に限定されない限りは、天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で核酸とハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体が包含される。別段に指定しない限りは、特定の核酸配列には、その相補的配列および保存的変異体、すなわち、コドンのゆらぎ位置に存在する核酸およびタンパク質へと翻訳された場合にアミノ酸の保存的置換をもたらす変異体が含まれる。

【0066】

本明細書中で指定した核酸に関して使用する「コードしている」には、指定したタンパク質への翻訳の情報を含む核酸への言及が含まれる。情報はコドンの使用によって指定される。典型的には、アミノ酸配列は核酸によって「ユニバーサル」遺伝暗号を使用してコードされている。しかし、一部の植物、動物、および真菌ミトコンドリアである細菌マイコプラズマ・カプリコルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：２３０６〜２３０９（１９８５））または繊毛虫巨核中に存在するものなどのように、これらの生物の翻訳機構を使用して核酸を発現させる場合は、ユニバーサルコードの変形を使用し得る。

【0067】

語句「インフレームで融合させる」とは、接合された核酸配列が元のポリペプチド鎖を含む単鎖タンパク質（「融合タンパク質」）へと翻訳されるように、ポリペプチドをコードしている２つ以上の核酸配列を接合させることをいう。

【0068】

本明細書中で使用する「発現された」には、核酸がタンパク質へと翻訳されたことへの言及が含まれる。タンパク質は、発現されて細胞内に留まり、細胞表面膜の構成成分となり得るか、または細胞外基質もしくは培地内へ分泌され得る。

【0069】

「宿主細胞」とは、発現ベクターの複製または発現を支持することができる細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類、もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。

【0070】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列のコンテキストにおける用語「同一」またはパーセント「同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して測定して、または目視検査によって、最大一致について比較およびアラインメントした場合に、同じである、または指定されたパーセンテージの同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。

【0071】

２つの核酸またはポリペプチドのコンテキストにおける語句「実質的に同一」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して測定して、または目視検査によって、最大一致について比較およびアラインメントした場合に、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、さらにより好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、さらにより好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的な同一性が少なくとも約５０個の残基の長さである配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００個の残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は少なくとも約１５０個の残基にわたって実質的に同一である。最も好ましい実施形態では、配列は、比較ペプチドまたはコード領域の全長にわたって実質的に同一である。

【0072】

配列比較では、典型的には、１つの配列が試験配列を比較する参照配列として役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合は部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムのパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0073】

比較のための配列の最適アラインメントは、たとえば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２（１９８１）のローカル相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４（１９８８）の類似度検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．５７５中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．の合弁企業、（１９９５年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）によって実施することができる。

【0074】

パーセント配列同一性および配列類似度を決定するために適したアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌら、（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さの単語とアラインメントした際に何らかの正値閾値スコアＴに一致するまたはそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短い単語を同定することによって高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近隣単語スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期近隣単語ヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして役割を果たす。その後、単語ヒットを、累積アラインメントスコアを増加できる限りそれぞれの配列に沿って両方向に伸長する。ヌクレオチド配列では、累積スコアはパラメータＭ（一対の一致する残基の報酬スコアであり、常に＞０である）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコアであり、常に＜０である）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアづけマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合、１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積が原因で累積スコアがゼロ以下になった場合、またはどちらかの配列の末端に達した場合に、それぞれの方向への単語ヒットの伸長を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸがアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、単語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは単語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアづけマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５（１９８９）を参照）を初期設定として使用する。

【0075】

パーセント配列同一性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似度の統計分析も行う（たとえばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じるであろう確率の指標を提供する。たとえば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。

【0076】

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載のように、第１の核酸によってコードされているポリペプチドが第２の核酸によってコードされているポリペプチドと免疫学的交差反応性を有することである。したがって、たとえば２つのペプチドが保存的置換のみによって異なる場合、ポリペプチドは典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載のように、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

【0077】

用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」には、細胞を得た生物の体内への言及が含まれる。「ｅｘ ｖｉｖｏ」および「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」とは、細胞を得た生物の体外を意味する。

【0078】

語句「悪性細胞」または「悪性腫瘍」とは、侵襲性であるおよび／または転移を受けることができる腫瘍または腫瘍細胞、すなわち癌細胞をいう。

【0079】

本明細書中で使用する「哺乳動物細胞」には、ヒト、ラット、マウス、モルモット、チンパンジー、またはマカクを含めた哺乳動物に由来する細胞への言及が含まれる。細胞はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し得る。

【0080】

抗原に関する用語「選択的に反応性」とは、全抗体または部分的抗体と抗原を保有する細胞または組織とが優先的に会合し、その抗原を欠く細胞または組織とはそうではないことをいう。もちろん、特定の度合の非特異的な相互作用が分子と非標的細胞または組織との間に起こり得ることが認識されている。そうとはいえ、選択的反応性は、抗原の特異的認識によって媒介されるものであると識別し得る。選択的に反応性のある抗体は抗原と結合するが、これらは低い親和性で結合する場合がある。他方で、特異的結合は、抗体と抗原を保有する細胞との間で、結合した抗体と抗原を欠く細胞との間よりもはるかにより強力な会合をもたらす。典型的には、特異的結合は、標的抗原を欠く細胞または組織と比較して、５倍より高い、より好ましくは１０倍より高い、最も好ましくは１００倍より高い、標的抗原を保有する細胞または組織と結合した抗体の量の増加をもたらす（単位時間あたり）。そのような条件下におけるタンパク質との特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体を必要とする。様々な免疫アッセイ様式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために適している。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するためにルーチン的に使用されている。特異的免疫反応性を決定するために使用することができる免疫アッセイの様式および条件の説明には、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）を参照されたい。

【0081】

用語「免疫学的反応性条件」には、特定のエピトープに対して作製された抗体が、実質的にすべての他のエピトープとの結合よりも検出可能により高い度合で、および／またはそれを実質的に排除してそのエピトープと結合することを可能にする条件への言及が含まれる。免疫学的反応性条件は抗体結合反応の様式に依存し、典型的には免疫アッセイプロトコルにおいて利用されるものまたはｉｎ ｖｉｖｏで遭遇する条件である。免疫アッセイの様式および条件の説明には、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。好ましくは、本発明の方法で用いる免疫学的反応性条件は、典型的には生きた哺乳動物または哺乳動物細胞の内部条件（たとえば、温度、容積モル浸透圧濃度、ｐＨ）への言及が含まれる「生理的条件」である。一部の器官は極限条件となっていることが認識されているが、生物内および細胞内の環境は、通常はｐＨ７付近であり（すなわち、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、より典型的にはｐＨ６．５〜７．５）、優勢溶媒として水を含有し、０℃より高く５０℃より低い温度で存在する。容積モル浸透圧濃度は細胞の生存度および増殖を支持する範囲内にある。

【0082】

用語「患者」、「対象」、「個体」とは、互換性があるように、哺乳動物、たとえば、ヒトまたは非ヒト霊長類、家庭用哺乳動物（たとえばイヌ科動物またはネコ科動物）、農業用哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ科動物）、実験室用哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ）をいう。

【0083】

用語「同時投与する」とは、個体の血液中に２つの活性薬剤が同時に存在することをいう。同時投与する活性薬剤は、同時にまたは順次送達することができる。

【0084】

本明細書中で使用する用語「処置すること」および「処置」とは、用語が適用される疾患もしくは状態、またはそのような疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状のいずれかの発症を遅延させること、進行を遅らせるもしくは逆行させること、または軽減もしくは予防することをいう。

【0085】

腫瘍または癌の成長または進行に関する用語「阻害すること」、「低下させること」、「減少させること」とは、当分野で知られている任意の方法を使用して対象において腫瘍または癌の成長、拡大、転移を測定可能な量だけ阻害することをいう。腫瘍量が、本発明のＰＥをたとえばキメラ分子の一部として同時投与する前の腫瘍量と比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、８０％、または１００％低下している場合に、腫瘍または癌の成長、進行または拡大は阻害されている、低下または減少している。一部の実施形態では、腫瘍または癌の成長、進行または拡大は、ＰＥを投与する前の腫瘍量と比較して少なくとも約１倍、２倍、３倍、４倍、またはそれより高く阻害されている、低下または減少している。

【0086】

組換え免疫毒素の構成要素
Ａ．フューリン切断部位（ＦＣＳ）
フューリン切断部位は、フューリンによって切断可能な任意のポリペプチド部位であることができる。Ｄｕｃｋｅｒｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１７（１）：１０７〜１１２（２００４）によって報告されているように（本明細書中で以降「Ｄｕｃｋｅｒｔら」とし、その全体で本明細書中に参考として組み込まれており、特にそれが開示するフューリン切断可能配列およびモチーフに関する）、フューリンは、同書のページ１０７の「サブチリシン（ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ）／ケキシン様前駆タンパク質転換酵素と呼ばれる進化的に保存されている二塩基性および一塩基性に特異的なＣＡ２^＋依存性セリンプロテアーゼのファミリー」中の酵素である。「対塩基性アミノ酸切断酵素」すなわち「ＰＡＣＥ」としても知られるフューリンは、このファミリーの７つの哺乳動物メンバーのうちの１つであり、いくつかの内在性ヒトタンパク質のプロセシングに関与している。一般に、たとえばＴｈｏｍａｓ Ｇ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、（１０）：７５３〜６６（２００２）を参照されたい。これは主にトランスゴルジ網中に見出される膜会合タンパク質である。ヒトフューリンの配列は１９９０年代初期から知られている。たとえば、Ｈａｔｓｕｚａｗａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２６７：１６０９４〜１６０９９（１９９２）、Ｍｏｌｌｏｙ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１６３９６〜１６４０２（１９９２）を参照されたい。

【0087】

最小限の切断部位は、典型的にはアミノ酸残基の一文字コードでＲ−Ｘ−Ｘ−Ｒであり、切断は２番目の「Ｒ」の後に起こる。Ｄｕｃｋｅｒｔらは、哺乳動物タンパク質、病原性細菌のタンパク質、およびウイルスタンパク質を含めた、フューリン切断部位を有すると文献中で報告されている３８個のタンパク質の配列に関して入手可能な情報を要約している。総説した切断モチーフのうちの３１個、すなわち８１％がＲ−Ｘ−［Ｒ／Ｋ］−Ｒコンセンサス配列を有しており、そのうちの１１個、すなわち２９％がＲ−Ｘ−Ｒ−Ｒを有しており、２０個、すなわち５２％がＲ−Ｘ−Ｋ−Ｒであったと報告されている。切断モチーフのうちの３個は最小限の切断配列のみを含有していた。Ｄｕｃｋｅｒｔらはモチーフをさらにアラインメントし、切断モチーフ自体のそれぞれのフューリン中および周辺残基中の両方のそれぞれの位置で見出される残基を同定した。Ｄｕｃｋｅｒｔらの図１Ａは、それぞれの位置で最も一般的に見出される残基を相対的な大きさ別で示す。慣例により、フューリン切断部位周辺の残基は容易に切断できる結合（典型的には記号「↓」によって示されている）から付番されている。Ｎ末端に向かって数えて基質残基はＰ１、Ｐ２などと命名されている一方で、Ｃ末端に向かって数えて残基はＰ１’、Ｐ２’などと命名されている。たとえば、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ，Ｎ．Ｃ．およびＪ．Ｗ． Ｔｈｏｒｎｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２９：８０〜８７（２００４）、Ｔｈｏｍａｓ Ｇ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３：７５３〜７６６（２００２）を参照されたい。したがって、慣例に従って、以下の配列を使用して最小限の切断配列の残基および周辺残基をアラインメントおよび付番することができる。
Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’
式中、最小限のフューリン切断配列はＰ４〜Ｐ１として付番されている。Ｄｕｃｋｅｒｔらの、フューリンによって切断される３８個の配列のアラインメントは、様々な位置に存在する残基に応じて許容される変異を同定している。たとえば、Ｐ４の残基がＲでない場合は、Ｐ２およびＰ６にアルギニンまたはリシン残基を有することによってこれを補償することができる。同書のページ１０９。

【0088】

ネイティブＰＥ中では、フューリン切断は毒素のドメインＩＩ中に位置するアルギニンに富んだループ内のアルギニン２７９とグリシン２８０との間で起こる。ＰＥのドメインＩＩ中のネイティブフューリン切断配列を以下に示し（数字は６１３個のアミノ酸のネイティブＰＥ配列中での残基の位置を示す）、アラインメントして上述の慣例下でのその付番を示した。
２７４− Ｒ Ｈ Ｒ Ｑ Ｐ Ｒ Ｇ Ｗ Ｅ Ｑ Ｌ −２８４（配列番号１７）
Ｐ６−Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’
本発明の根底にある研究では、位置Ｐ３およびＰ２で置換を行って以下の配列を形成し、置換に下線を引いた。
２７４− Ｒ Ｈ Ｒ Ｓ Ｋ Ｒ Ｇ Ｗ Ｅ Ｑ Ｌ −２８４（配列番号２９）
この配列はネイティブ配列よりも速い切断速度を示し、免疫毒素の例で使用した場合に、ネイティブ配列とほぼ同じ、標的細胞に対する細胞毒性をもたらした。

【0089】

このことおよび本発明者らの以前の研究に基づいて、ターゲッティング分子をＰＥドメインＩＩＩに付着させるために使用するフューリン切断配列は、最小限のフューリン切断配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒ、または当分野で知られているもしくはＤｕｃｋｅｒｔらの図１Ａによって許容されている他のフューリン切断配列のうちの任意のものであることができる［ただし、Ｐ２’として同定された位置に残基が存在する場合は、これはトリプトファンであるべきであり、トリプトファンでなくても、バリンまたはアラニンであるべきではない］。たとえば、一部の実施形態では、配列は、ＲＫＫＲ（配列番号３０）、ＲＲＲＲ（配列番号３１）、ＲＫＡＲ（配列番号３２）、ＳＲＶＡＲＳ（配列番号３３）、ＴＳＳＲＫＲＲＦＷ（配列番号３４）、またはＡＳＲＲＫＡＲＳＷ（配列番号３５）であることができる。

【0090】

Ｄｕｃｋｅｒｔら中に注記されているように、Ｐ２、Ｐ４およびＰ６での３個の残基のうちの少なくとも２個が塩基性であるように位置Ｐ２およびＰ６のアルギニンまたはリシン残基によって補償されている場合は、位置Ｐ４にＲ（主にバリン）よりも低い好ましさの残基を使用することができる。したがって、一部の実施形態では、フューリン切断可能配列は、ＲＲＶＫＫＲＦＷ（配列番号３６）、ＲＮＶＶＲＲＤＷ（配列番号３７）、またはＴＲＡＶＲＲＲＳＷ（配列番号３８）である。位置Ｐ１の残基は、ネイティブ配列中に存在するアルギニン、またはリシンであることができる。したがって、たとえば上述の配列のうちの任意のものにおいて、リシンで位置Ｐ１のアルギニンを置換することができる。

【0091】

一部の実施形態では、フューリン切断可能配列の配列は、ＰＥのフューリン切断配列の配列：Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ（配列番号１５）、または、最小限のフューリン切断配列を含有しており、フューリンによって切断可能である限りは、ネイティブ配列の切断されたバージョンに従う。したがって、一部の実施形態では、フューリン切断可能配列は、Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ（配列番号３９）、Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ（配列番号４０）、Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ（配列番号４１）、Ｈ−Ｒ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ（配列番号４２）、またはＲ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ（配列番号４３）であることができる。一部の実施形態では、配列は、Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ（配列番号２９）、または、最小限のフューリン切断配列を含有しており、フューリンによって切断可能である限りはこの配列の切断されたバージョンである。したがって、一部の実施形態では、フューリン切断可能配列は、Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ（配列番号４４）、Ｒ−Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ（配列番号４５）、Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ（配列番号４６）、Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ（配列番号４７）、Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｇ−Ｗ−Ｅ−Ｑ−Ｌ（配列番号４８）、またはＲ−Ｈ−Ｒ−Ｓ−Ｋ−Ｒ（配列番号４９）であることができる。任意の特定のフューリン切断可能配列を、ＳＳ１−ＬＲで使用した抗体を用いて免疫毒素とし、生じる免疫毒素をｉｎ ｖｉｔｒｏでメソテリン^＋細胞系に対して試験することによって、容易に試験することができる。

【0092】

任意の特定の配列がフューリンによって切断可能であるかどうかは、当分野で知られている方法によって決定することができる。たとえば、配列がフューリンによって切断可能であるかどうかは、配列をフューリンと共にフューリン緩衝液（０．２ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＣａＣｌ_２）中、１：１０の酵素：基質のモル比、２５℃で１６時間インキュベートすることによって、試験することができる。これらの条件は、ＰＥのフューリン切断に最適であると以前に確立されている。好ましくは、使用するフューリンはヒトフューリンである。組換えの切断されたヒトフューリンは、たとえばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）から市販されている。また、Ｂｒａｖｏら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２６９（１４）：２５８３０〜２５８３７（１９９４）も参照されたい。また、適切なＦＣＳはＰＣＴ特許公開ＷＯ２００９／０３２９５４号（２００９年３月１２日公開）中にも教示されており、これは、特にそれ中に開示されているフューリン切断配列に関して本明細書中に参考として組み込まれている。

【0093】

Ｂ．機能的ドメインＩＩＩ
構造的に、ドメインＩｂは残基３６５〜３９９を含むと理解されている。本明細書中にさらに記述するように、ＰＥのドメインＩＩＩの構造的境界は残基４０５に開始されるとみなされているが、機能分析により、ドメインＩＩＩはＡＤＰ−リボシル化活性を保持するために構造的ドメインＩｂのセグメントを必要とすることが示されている。したがって、機能的ドメインＩＩＩはＰＥの残基３９５〜６１３として定義され、したがって本発明の毒素が、以下にさらに記載する特定の許容される変異と共にＰＥの残基３９５〜６１３を含有することが好ましい。フューリン切断配列中のもの以外の残基３６５〜３９４の欠失が望ましく、これは、ＰＥ分子のこれらの部分中に存在するすべての免疫原性エピトープを排除するためである。本発明のＰＥでは、フューリン切断配列（またはその切断もしくは修飾された変異体）はそのカルボキシル末端でドメインＩＩＩに付着しており、両者の間にはグリシンおよびセリンから独立して選択される３〜８個のアミノ酸の柔軟なリンカーが挿入されている。

【0094】

好ましい実施形態では、ＰＥ分子の機能的ドメインは、ドメインＩＩＩ内の位置Ｄ４０６およびＱ５９２に通常存在するアミノ酸残基の代わりにアラニン、グリシン、セリンまたはグルタミンの置換を有するように修飾されている。位置Ｄ４０６およびＱ５９２での置換は、ドメインＩＩＩ内の位置Ｒ４３２、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５１３、Ｅ５４８およびＫ５９０でのアラニン、グリシン、セリンまたはグルタミンの置換と組み合わせることができる。さらに、一部の実施形態では、Ｄ４０３、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｒ５０５、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｒ５５１、Ｒ５７６およびＬ５９７から選択される位置のアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリンまたはグルタミンで置換されている。位置での残基への置換 ドメインＩＩＩ内の置換 ドメインＩＩＩのアミノ酸残基の位置Ｄ４０６、Ｒ４３２、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５１３、Ｅ５４８、Ｋ５９０およびＱ５９２。一部の実施形態では、ＰＥ機能的ドメインＩＩＩは、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭのＰＥ機能的ドメインのアミノ酸配列と実質的に同一または同一である。一部の実施形態では、ＰＥ機能的ドメインＩＩＩは、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＸのＰＥ機能的ドメインのアミノ酸配列と実質的に同一または同一である。

【0095】

ネイティブＰＥおよび上述の変異体の配列は、保存的置換を有し、細胞毒性能力を保持し、望ましくは、ＰＥのネイティブ配列と比較して抗原性が低下している可能性があることが理解されている。好ましい実施形態では、ＰＥまたはその細胞毒性断片の修飾された変異体は、目的のＰＥ機能的ドメインＩＩＩ、すなわちＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍのものと、アミノ酸レベルで少なくとも８０％の配列類似度、好ましくは少なくとも８５％の配列類似度、より好ましくは少なくとも９０％の配列類似度、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似度を有する。２０１０年９月１０日に出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４８５０４号に対応する、２０１１年３月１７日に公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１１／０３２０２２号は、ＰＥの機能的ドメインＩＩの抗原性を低下させる適切な突然変異を開示している。この公開された出願は、機能的ドメインＩＩＩの免疫原性の低下をもたらす、それ中に開示されている突然変異および置換（ｓｕｂｓｉｔｕｔｉｏｎ）および分子に関して、その全体で参考として組み込まれている。

【0096】

用語「保存的に修飾された変異体」はアミノ酸および核酸配列のどちらにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸配列、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は本質的に同一の核酸配列をいう。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が任意の所与のポリペプチドをコードしている。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードしている。したがって、コドンによってアラニンが指定されているすべての位置で、コードされているポリペプチドを変更せずに、このコドンを、記載した対応するコドンのうちの任意のものへと変更することができる。そのような核酸変異は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードしている本明細書中のすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレント変異も記載している。当業者には、核酸中のそれぞれのコドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ以外）を修飾して、機能的に同一である分子を得ることができることが理解されよう。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸のそれぞれのサイレント変異はそれぞれの記載した配列に黙示される。

【0097】

アミノ酸配列に関して、当業者には、コードされている配列中の単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変更、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列への個々の置換、欠失または付加は、変更によりアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換されることがもたらされる「保存的に修飾された変異体」であることが理解されよう。

【0098】

ＰＥの細胞毒性または抗原性のアッセイ
本発明で用いるシュードモナス属外毒素は、当業者に周知のアッセイによって所望のレベルの細胞毒性についてアッセイすることができる。したがって、ＰＥの細胞毒性断片およびそのような断片の保存的に修飾された変異体は、細胞毒性について容易にアッセイすることができる。多数の候補ＰＥ分子を、当分野で周知の方法によって細胞毒性について同時にアッセイすることができる。たとえば、候補分子の部分群を細胞毒性についてアッセイすることができる。所望の細胞毒性断片（複数可）が同定されるまで、陽性反応の候補分子の部分群を継続的に再分割して再アッセイすることができる。そのような方法は、多数のＰＥの細胞毒性断片または保存的変異体の迅速なスクリーニングを可能にする。抗原性は、ＷＯ２００７／０１６１５０号に教示されているアッセイを含めた当分野で知られている任意の方法でアッセイすることができる。

【0099】

Ｃ．抗メソテリン抗体
キメラ分子のターゲッティング構成要素は細胞表面マーカーメソテリンと特異的に結合する。キメラ分子の標的である細胞表面抗原は当分野で周知であり、たとえば、Ｍｕｆｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ（２００６）１１：３３７〜４３、Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００）６：３２６〜３３４およびＫｒｅｉｔｍａｎ、ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００６）８（３）：Ｅ５３２〜Ｅ５５１中に要約されている。メソテリンを標的とすることによってその成長、拡大および／または進行を低下または阻害することができる例示的な癌には、卵巣癌、中皮腫、非小細胞肺癌、肺腺癌、輸卵管癌、頭頸部癌、子宮頸癌および膵癌が含まれる。別の好ましい実施形態では、ターゲッティング部分は抗体断片、好ましくは細胞上の表面マーカーと特異的に結合する抗体断片である。好ましい抗体断片は単鎖Ｆｖである。本明細書中では、細胞毒素がｓｃＦｖと融合されている、細胞毒素に基づく免疫毒素の構築および特徴づけが記載されている。毒素または細胞毒性断片を融合させることができる他の好ましい抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ヘリックスで安定化された抗体、ダイアボディー、ジスルフィドで安定化された抗体、および単一ドメイン抗体（たとえばラクダ抗体）が含まれる。メソテリンに対する抗体には、ＳＳ１、ＳＳＰ１、ＨＮ１、ＨＮ２、ＭＮ、Ｋ１およびその変異体が含まれる。ＭＯＲＡｂ−００９（ＳＳ１のヒト化したバージョン）が特に適切な抗体である。

【0100】

ＳＳ１Ｐは、メソテリン発現細胞系を特異的に死滅させ、マウスにおいてメソテリン発現腫瘍の回帰を引き起こすことが示されている（Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、８：３５２０〜６（２００２）、Ｏｎｄａ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６１：５０７０〜７（２００１））。これらの研究および適切な安全性データに基づいて、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）においてＳＳ１Ｐを用いた２つの第Ｉ相治験がメソテリン発現癌を有する患者で実施されている（それ中に開示されているＳＳ１Ｐの主題に関して、それぞれ本明細書中に参考として組み込まれているＣｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９５：６６９〜７４（１９９８）、Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２１：２９ａ（２００２））。さらに、メソテリンを標的とする他の治療が前臨床開発中である（Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｍ．ら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２００：２９７〜３０６（２００４））。ＨＮ１およびＨＮ２は、たとえばＦｅｎｇら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２００９）８（５）：１１１３〜８に記載されているヒト抗メソテリン抗体である。リソソームプロテアーゼの切断クラスターが除去されているＳＳ１Ｐ免疫毒素。これらの変異体は、たとえば、それ中に開示されている抗体、ＦＣＳ、および機能的ドメインＩＩＩに関してその全体で本明細書中に組み込まれている、Ｗｅｌｄｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、（２００９）１１３（１６）：３７９２〜８００およびＷＯ２００９／０３２９５４号に記載されている。

【0101】

本発明のＲＩＴには、それだけには限定されないが、ＰＥ分子と抗体または他のターゲッティング剤との共有結合が存在する分子が含まれる。細胞毒素と抗体または抗体断片との融合は、典型的には抗体または抗体断片のＣ末端に対するものである。そのような融合は、典型的には組換えＤＮＡ技術を用いて達成する。特定のターゲッティング剤の選択肢は、ターゲッティングされる特定の細胞に依存する。免疫毒素を標的とする抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、または組換え抗体、たとえばキメラもしくは可変領域断片であることができる。抗体が非組換えである場合は、免疫毒素は抗体と毒性部分との化学的コンジュゲーションによって形成されなければならない。抗体を組換えによって生成する場合は、化学結合または組換え融合によって抗体を毒素と接合させることができる。組換え融合では、抗体をコードしているｃＤＮＡを、インフレームで、毒素をコードしているｃＤＮＡを既に含有するプラスミド内に挿入する。もちろん、その逆も行うことができ、毒素ｃＤＮＡを、抗体をコードしているｃＤＮＡを保有するプラスミド内に挿入することができる。免疫毒素の大きさは潜在的に大きいため、抗体の断片のみを毒性部分と接合させることが望ましい場合がある。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）_２断片をポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体から作製し、その後、化学結合によって毒素と接合させることができる。あるいは、抗体の可変領域が必須のフレームワーク領域と接続されているｃＤＮＡを生成することができる。その後、これらのより小さな抗体は、二本鎖Ｆｖ抗体として、または重鎖および軽鎖領域が直接もしくはペプチドリンカーを介してのどちらかで接合されている場合は単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）として分泌される。リソソームプロテアーゼの切断クラスターが除去されている特に好ましいメソテリン抗体および断片は、本発明と同じ譲受人に与えられ、特にそれ中に開示されている抗体の主題に関してその全体で参考として組み込まれている、２０００年５月２６日に出願のＰＣＴ／ＵＳ２００９／０１４８２９号に対応する、２０００年７月１２日に公開のＰＣＴ特許公開ＷＯ／２０００／０７３３４６号に開示されている。

【0102】

ｓｃＦｖを作製する１つの方法は、免疫原で免疫化したマウスの脾臓のｍＲＮＡから作製したファージディスプレイライブラリを介したものである（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３４：９〜２０（１９９７））。タンパク質免疫原が哺乳動物中で天然に見出されるが、原核生物中で組換えによって発現させる場合、タンパク質は正しいグリコシル化パターンを有さず、正しいコンホメーションを有さない場合がある。この免疫原に応答してマウス中で発生させた抗体は、ネイティブ状態のタンパク質を認識しない場合がある。この問題に対する１つの解決策は、哺乳動物細胞中で作製したネイティブタンパク質を用いて動物を免疫化することであるが、十分な量の一部のタンパク質、特に細胞表面タンパク質の、哺乳動物細胞からの精製は可能でない場合がある。別の解決策は、それほど一般的ではないが、免疫原をコードしているｃＤＮＡで動物を免疫化することである。適切なプロモーターの調節下にあるｃＤＮＡを動物内に導入する。ブースト注射の後、かつ抗体価が最大に達した際に、動物を屠殺し、脾臓を取り出して、ファージディスプレイライブラリを作製する。メソテリンをコードしているＤＮＡを含有するプラスミドでマウスを免疫化することによって、本発明者らは高力価の抗メソテリン抗体を誘発させることができる。脾臓ＲＮＡおよびファージディスプレイ技術を使用して、高い親和性でメソテリンと結合する、本発明者らがＳＳ ｓｃＦｖと呼ぶ単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を単離することができる。

【0103】

本発明で使用するための抗メソテリン抗体は、ＦＣＳのアミノ末端を介してＦＣＳと連結させることができる。同様に、ＦＣＳは抗体の重鎖、軽鎖、Ｆｃ（定常領域）またはフレームワーク領域と直接連結させることができる。連結は、抗体のアミノもしくはカルボキシル末端を介して、または内部のアミノ酸残基を介して起こることができる。本発明の多価免疫コンジュゲート組成物中で使用する抗体は、同じまたは異なるメソテリンエピトープに向けることができる。

【0104】

本発明の好ましい実施形態では、抗メソテリン抗体は、ｓｃＦｖまたはジスルフィドで安定化されたＦｖ抗体などの組換え抗体である。Ｆｖ抗体は典型的には約２５ｋＤａであり、完全な抗原結合部位を含有し、１つの重鎖および軽鎖あたり３つのＣＤＲを有する。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖が近接せずに発現される場合、Ｆｖ抗体の鎖は典型的には非共有的相互作用によって一緒に保たれる。しかし、これらの鎖は希釈の際に解離する傾向にあるため、鎖をグルタルアルデヒド、分子間ジスルフィド、またはペプチドリンカーによって架橋結合させる方法が開発されている。

【0105】

特に好ましい実施形態では、抗体は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖ抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、折り畳まれて二本鎖抗体中で見出されるものに類似した抗原結合部位を作製する単鎖を含む。折り畳まれた後、非共有的相互作用が単鎖抗体を安定化させる。より好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは組換えによって生成する。当業者は、本発明の抗体の保存的変異体を作製できることに気付くであろう。ｓｃＦｖ断片中で用いられるそのような保存的変異体は、正しい折り畳みおよびＶ_ＨとＶ_Ｌ領域との間の安定化に必要な重大なアミノ酸残基を保持する。本発明の一部の実施形態では、ｓｃＦｖ抗体は軽鎖を介してＦＣＳに直接連結されている。

【0106】

一部の抗体実施形態のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は一緒に直接接合させることができる一方で、当業者には、領域を１つまたは複数のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって分離し得ることが理解されよう。ペプチドリンカーおよびその使用は当分野で周知である。たとえば、すべて本明細書中に参考として組み込まれている、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８：５８７９（１９８８）、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３６（１９８８）、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：１３６２（１９９０）、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，１３２，４０５号およびＳｔｅｍｍｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：２５６〜２６５（１９９３）を参照されたい。一般に、ペプチドリンカーは、領域を接合させることまたはそれらの間に何らかの最小距離もしくは他の空間的な関係性を保つこと以外の具体的な生物活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成的アミノ酸は、折り畳み、実効電荷、疎水性などの分子の何らかの特性に影響を与えるように選択し得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体には、任意選択で５０個以下のアミノ酸、一般には４０個以下のアミノ酸、好ましくは３０個以下のアミノ酸、より好ましくは２０個以下のアミノ酸の長さのペプチドリンカーが含まれる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号５０）、好ましくは２、３、４、５、または６つのそのような配列のコンカテマーである。しかし、リンカー内の一部のアミノ酸置換を行うことができることを理解されたい。たとえば、バリンでグリシンを置換することができる。

【0107】

好ましくは、抗体またはその断片は突然変異させた抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含み、ポリペプチドは親抗体よりも抗原に対して少なくとも５倍高い結合親和性を有し、ポリペプチドは相補性決定領域（ＣＤＲ）中の少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換によって親抗体から異なる配列を有し、アミノ酸はＡＧＹまたはＲＧＹＷ（式中、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、ＷはＡまたはＴである）から選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされている。置換は軽鎖または重鎖可変領域のＣＤＲ３中で起こることができる。置換は軽鎖または重鎖可変領域のＣＤＲ１またはＣＤＲ２中で起こることができる。一部の実施形態では、抗メソテリン抗体は、２００６年７月２５日に発行の米国特許第７，０８１，５１８号に開示されており、そのような抗体、その核酸配列（ｅｑｕｅｎｃｅｓ）、使用および作製方法に関して参考として組み込まれている抗体材料である。

【0108】

抗メソテリン抗体は可変重（「Ｖ_Ｈ」）鎖および可変軽（「Ｖ_Ｌ」）鎖を含むことができ、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖はそれぞれ第１、第２および第３の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有しており、前記重鎖のそれぞれ第１のＣＤＲ（「ＣＤＲ１」）、第２のＣＤＲ（「ＣＤＲ２」）、および第３のＣＤＲ（「ＣＤＲ３」）は、ＣＤＲ１（ＧＹＴＭＮ、配列番号５１）、ＣＤＲ２（ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ、配列番号５２）、およびＣＤＲ３（ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ、配列番号５３）について示したアミノ酸残基配列を有しており、前記Ｖ_Ｌ鎖のそれぞれＣＤＲ１、２および３は、ＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ、配列番号５４）、ＣＤＲ２（ＤＴＳＫＬＡＳ、配列番号５５）、およびＣＤＲ３（ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ、配列番号５６）について示したアミノ酸残基配列を有する。一部の実施形態では、軽鎖のＣＤＲ３は修飾されており、ＱＱＷＳＫＨＰＬＴ（配列番号５７）、ＱＱＷＳＧＨＰＬＴ（配列番号５８）、ＱＱＷＳＡＨＰＬＴ（配列番号５９）、ＱＱＷＳＱＩＰＬＴ（配列番号６０）、ＱＱＷＧＦＮＰＬＴ（配列番号６１）、ＱＱＷＧＴＮＰＬＴ（配列番号６２）、ＱＱＷＧＳＨＰＬＴ（配列番号６３）、ＱＱＷＧＤＦＰＬＴ（配列番号６４）、ＱＱＷＧＤＨＰＬＴ（配列番号６５）、ＱＱＷＳＡＨＰＬＴ（配列番号６６）、またはＱＱＷＳＧＹＰＴＴ（配列番号６７）の配列を有する。一部の実施形態では、Ｖ_ＨはリンカーペプチドＧＶＧＧＳＧ_４ＳＧ_４Ｓ（配列番号２５）によってＶ_Ｌと接続されている。一部のさらなる実施形態では、抗メソテリン抗体はｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）_２である。さらに一部のさらなる実施形態では、ＲＩＴ中で使用する抗メソテリン抗体は、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、およびＶ_Ｈ ＣＤＲ２からなる群から選択されるＣＤＲ中に少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸は、ＡＧＹまたはＲＧＹＷ（式中、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴであり、ＷはＡまたはＴである）から選択されるホットスポットモチーフに属するヌクレオチドを含むコドンによってコードされている。

【0109】

Ｄ．Ｌ１
抗体は、好ましくは単結合または１〜１０個の連続したアミノ酸の長さのポリペプチドである追加のリンカーによってＦＣＳと連結されている。一部の実施形態では、このリンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のアミノ酸の長さである。一部の好ましい実施形態では、リンカーはグリシンおよびセリン残基からなる。一部のさらなる実施形態では、リンカーはＡＳＧＧ（配列番号１９）またはＡＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号６８）である。好ましい実施形態では、リンカーは、抗体のカルボキシル末端をＦＣＳのＮ末端に直接接合した連続したポリペプチド鎖を形成する。

【0110】

Ｅ．柔軟なリンカー
柔軟なリンカーは、ＦＣＳをＰＥ機能的ドメインＩＩＩへと直接カップリングさせる。柔軟なリンカーは式（Ｘａａ１）_ｎの連続したペプチドであり、式中、それぞれのＸａａ１はグリシンおよびセリンから独立して選択され、ｎは３〜８である。好ましい実施形態では、ｎは３である。より好ましい実施形態では、リンカーはＧＧＳである。他の実施形態では、ｎは４、５、６、または７である。他の実施形態では、柔軟なリンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号５０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号６９）、ＧＧＧＧＳＧ（配列番号７０）またはＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８）である。

【0111】

柔軟なリンカーはＦＣＳのＣ末端と連続して融合されており、ＰＥの機能的ドメインＩＩＩと連続して直接融合されており、したがって、ＦＣＳおよび機能的ドメインＩＩＩと１つの連続したペプチド鎖を形成する。

【0112】

免疫コンジュゲートの生成
ｉ．非組換え方法
本発明の非組換え実施形態では、抗体などのターゲッティング分子は、当業者に知られている任意の数の手段を使用して本発明のＰＥ分子と連結されている。共有および非共有付着手段をどちらも本発明のＰＥ分子に使用し得る。

【0113】

ＰＥ分子を抗体または他のターゲッティング分子（「ＴＭ」）と付着させるための手順は、ＴＭの化学構造に応じて変動する。ポリペプチドは、典型的には様々な官能基、たとえば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ_２）またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含有し、これらは、抗体上の適切な官能基と反応してたとえばＰＥ分子の結合をもたらすために利用可能である。

【0114】

あるいは、抗体または他のＴＭは、追加の反応性官能基を曝露または付着させるために誘導体化されている。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄから入手可能なものなどのいくつかのリンカー分子のうちの任意のものの付着を含み得る。

【0115】

本明細書中で使用する「リンカー」とは、ＴＭをＰＥ分子と接合させるために使用する分子である。リンカーは抗体およびエフェクター分子の両方と共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、それだけには限定されないが、直鎖または分枝鎖状の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれる。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合は、その側鎖を介して（たとえばジスルフィド連結を介してシステインと）リンカーを構成的アミノ酸と接合させ得る。しかし、好ましい実施形態では、リンカーはアルファ炭素アミノおよび末端アミノ酸のカルボキシル基と接合させる。

【0116】

一部の状況では、免疫コンジュゲートがその標的部位に到達した際にＰＥ分子をＴＭから遊離させることが望ましい。したがって、これらの状況では、免疫コンジュゲートは標的部位の近傍で切断可能な連結を含む。ＰＥ分子をＴＭから放出させるためのリンカーの切断は、標的細胞の内部または標的部位の近傍のどちらかで免疫コンジュゲートが供される酵素活性または条件によって促され得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件下で（たとえば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝された場合に）切断可能なリンカーを使用し得る。

【0117】

ｉｉ．組換え方法
本発明の核酸配列は、たとえば、適切な配列のクローニング、またはＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０〜９９（１９７９）のリン酸トリエステル方法、Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９〜１５１（１９７９）のリン酸ジエステル方法、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９〜１８６２（１９８１）のジエチルホスホルアミダイト方法、たとえばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：６１５９〜６１６８（１９８４）などに記載されている自動合成機を使用したＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．、２２（２０）：１８５９〜１８６２（１９８１）によって記載されている固相ホスホルアミダイトトリエステル方法、および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法などの方法による直接化学合成を含めた、任意の適切な方法によって調製することができる。化学合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを生じる。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として使用したＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、二本鎖ＤＮＡへと変換し得る。当業者には、ＤＮＡの化学合成は約１００個の塩基の配列に限定される一方で、より短い配列のライゲーションにより長い配列が得られる可能性があることが理解されよう。

【0118】

好ましい実施形態では、本発明の核酸配列をクローニング技法によって調製する。適切なクローニングおよびシーケンシング技法の例、ならびに当業者に多くのクローニングの実行を指導するために十分な指示は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（編）、ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９８７）、またはＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ（１９８７）中に見出される。また、生物学的試薬および実験器具の製造者からの製品情報も有用な情報を提供する。そのような製造者には、ＳＩＧＭＡ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ（モンタナ州Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、スイスＢｕｃｈｓ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、ならびに当業者に知られている多くの他の商業的供給業者が含まれる。

【0119】

また、ネイティブＰＥをコードしている核酸を修飾して本発明の免疫コンジュゲートを形成することもできる。部位特異的突然変異誘発による修飾は当分野で周知である。ＰＥをコードしている核酸はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法によって増幅することができる。増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、自立配列複製システム（３ＳＲ）が含まれる。多種多様なクローニング方法、宿主細胞、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法が当業者に周知である。

【0120】

好ましい実施形態では、免疫コンジュゲートは、選択された抗体または他のＴＭをコードしているｃＤＮＡを、本発明の所望のＰＥをコードしているｃＤＮＡを含むベクター内に挿入することによって調製する。挿入は、ターゲッティング剤（議論を容易にするために、本明細書中の議論ではターゲッティング剤がＦｖであると仮定するが、等しい効果で他のターゲッティング剤を置換することができる）およびＰＥがインフレームで、すなわち機能的Ｆｖ領域および機能的ＰＥ領域を含有する１つの連続したポリペプチドで読み取られるように行う。特に好ましい実施形態では、毒素がｓｃＦｖのカルボキシル末端に位置するように、本発明のＰＥをコードしているｃＤＮＡをｓｃＦｖとライゲーションさせる。他の好ましい実施形態では、毒素がｓｃＦｖのアミノ末端に位置するように、本発明のＰＥをコードしているｃＤＮＡをｓｃＦｖとライゲーションさせる。

【0121】

本発明のＰＥ、抗体、または免疫コンジュゲートをコードしている核酸を単離およびクローニングした後、所望のタンパク質を細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞などの組換え操作した細胞中で発現させ得る。当業者は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、ならびにＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞系などの様々な高等真核細胞を含めた、タンパク質の発現に利用可能な数々の発現系に精通していることが予想される。原核生物または真核生物中でのタンパク質の発現について知られている様々な方法を詳細に記載する試みは行わない。手短に述べると、本発明の単離タンパク質をコードしている天然または合成核酸の発現は、典型的には、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーター（構成的または誘導性のどちらかである）と作動可能に連結させ、次いで発現カセット内に取り込ませることによって達成される。カセットは、原核生物または真核生物のどちらにおける複製および組込みにも適切であることができる。典型的な発現カセットは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにタンパク質をコードしているＤＮＡの発現の制御に有用なプロモーターを含有する。クローニングした遺伝子の高レベルの発現を得るためには、最小でも、転写を指揮するための強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現カセットを構築することが望ましい。大腸菌では、これには、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃ、またはラムダプロモーターなどのプロモーター、リボソーム結合部位および好ましくは転写終結シグナルが含まれる。真核細胞では、制御配列にはプロモーターならびに好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、およびポリアデニル化配列に由来するエンハンサーが含まれることができ、また、スプライスドナーおよびアクセプター配列が含まれ得る。本発明のカセットは、大腸菌には塩化カルシウム形質転換または電気穿孔、哺乳動物細胞にはリン酸カルシウム処理、電気穿孔またはリポフェクションなどの周知の方法によって、選択された宿主細胞内へと移行させることができる。カセットによって形質転換させた細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子などのカセット中に含有される遺伝子によって与えられる、抗生物質に対する耐性によって選択することができる。

【0122】

当業者には、その生物活性を消失させずに、本発明のポリペプチド（すなわち、ＰＥまたは本発明のＰＥから形成した免疫コンジュゲート）をコードしている核酸に修飾を行うことができることが理解されよう。一部の修飾は、クローニング、発現、またはターゲッティング分子の融合タンパク質内への取り込みを容易にするために行い得る。そのような修飾は当業者に周知であり、たとえば、終止コドン、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加したメチオニン、好都合に位置する制限部位を作製するためにいずれかの末端に配置した追加のアミノ酸、または精製ステップを補助するための追加のアミノ酸（ポリＨｉｓなど）が含まれる。

【0123】

組換え方法に加えて、本発明の免疫コンジュゲートおよびＰＥは、標準のペプチド合成を使用して全体的または部分的に構築することもできる。約５０個未満のアミノ酸の長さの本発明のポリペプチドの固相合成は、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、次いで配列中の残りのアミノ酸を順次付加することによって達成し得る。固相合成の技法は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ＴＨＥ ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＡＮＡＬＹＳＩＳ，ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，ＢＩＯＬＯＧＹ．、第２巻：ＳＰＥＣＩＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、パートＡ、ページ３〜２８４、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９〜２１５６（１９６３）、およびＳｔｅｗａｒｔら、ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ（１９８４）によって記載されている。より長いタンパク質は、より短い断片のアミノおよびカルボキシル末端の縮合によって合成し得る。カルボキシル末端の活性化（たとえばカップリング試薬Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｃｙｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）を使用することによる）によってペプチド結合を形成する方法は当業者に知られている。

【0124】

ｉｉｉ．精製
発現させた後、本発明の組換え免疫コンジュゲートおよびＰＥは、硫安塩析、親和性カラム、カラムクロマトグラフィーなどを含めた当技術分野の標準手順に従って精製することができる（一般にＲ．Ｓｃｏｐｅｓ、ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照）。薬学的使用には少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、９８〜９９％以上の均一性が最も好ましい。必要に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、治療的に使用する場合は、ポリペプチドは内毒素を実質的に含まないべきである。

【0125】

大腸菌などの細菌からの、単鎖抗体の発現および／または単鎖抗体を含めた適切な活性型への再折り畳みの方法が記載されており、周知であり、本発明の抗体に適用可能である。すべて本明細書中に参考として組み込まれている、Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０５：２６３〜２７０（１９９２）、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：５４５（１９９１）、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５（１９８９）およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４（１９８９）を参照されたい。

【0126】

多くの場合、大腸菌または他の細菌からの機能的異種タンパク質は封入体から単離し、強力な変性剤を使用した可溶化、および続く再折り畳みを必要する。可溶化ステップ中では、当分野で周知のように、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しなければならない。例示的な還元剤を含む緩衝液は、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８、６Ｍのグアニジン、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＤＴＥ（ジチオエリスリトール）である。本明細書中に参考として組み込まれているＳａｘｅｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９：５０１５〜５０２１（１９７０）中に記載されおり、特にＢｕｃｈｎｅｒら、上記によって記載されているように、ジスルフィド結合の再酸化は、還元型および酸化型の低分子量チオール試薬の存在下で起こることができる。

【0127】

復元は、典型的には、変性および還元されたタンパク質を再折り畳み緩衝液中で希釈（たとえば１００倍）することによって達成される。例示的な緩衝液は、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０、０．５ＭのＬ−アルギニン、８ｍＭの酸化グルタチオン、および２ｍＭのＥＤＴＡである。

【0128】

二本鎖抗体精製プロトコルへの改変として、重鎖および軽鎖領域を別々に可溶化および還元し、その後、再折り畳み溶液中で合わせる。これら２つのタンパク質を、一方のタンパク質に対する他方のモル比が５倍モル濃度過剰を超えないように混合した場合に、好ましい収率が得られる。酸化還元シャフリングが完了した後に過剰の酸化グルタチオンまたは他の酸化性の低分子量化合物を再折り畳み溶液に加えることが望ましい。

【0129】

２．医薬組成物および投与
一態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのキメラタンパク質、好ましくは標的毒素と、任意選択で薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物または医薬品を提供する。医薬組成物または医薬品は、それだけには限定されないが悪性疾患または癌を含めた状態を処置するために患者に投与することができる。

【0130】

ａ．配合物
本発明で使用するための医薬組成物または医薬品は、１つまたは複数の生理的に許容される担体または賦形剤を使用して標準の技法によって配合することができる。適切な薬学的担体は本明細書およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）中に記載されている。本発明のキメラタンパク質は、吸入、局所、経鼻、経口、非経口、または直腸によるものを含めた、任意の適切な経路による投与のために配合することができる。したがって、医薬組成物の投与は、シリンジまたは他の装置を用いて、皮内、真皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、吸入、脳内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜内、冠内、皮下または腫瘍内注射によって行い得る。また、経皮投与も企図され、吸入またはエアロゾル投与も企図される。錠剤およびカプセルは経口、直腸または経膣で投与することができる。

【0131】

投与のための組成物は、一般的に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶かしたキメラタンパク質、好ましくは標的毒素の溶液を含む。たとえば緩衝生理食塩水などの様々な水性担体を使用することができる。これらの溶液は無菌的であり、望ましくない物質を一般に含まない。これらの組成物は慣用の周知の滅菌技法によって滅菌し得る。組成物は、必要に応じてｐＨ調整剤、緩衝剤、毒性調整剤などの生理的条件に近づけるための薬学的に許容される補助物質、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの配合物中の融合タンパク質の濃度は幅広く変動することができ、選択された特定の投与様式および患者の要求に応じて、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される。

【0132】

本発明の標的毒素組成物は、静脈内投与または体腔内への投与を含めた非経口投与に適している。

【0133】

本発明のキメラタンパク質、好ましくは標的毒素は、注射による、たとえばボーラス注射または持続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、単位剤形で、たとえばアンプルまたは複数用量容器中に、保存料を添加して提示することができる。注射用組成物は好ましくは等張水溶液または懸濁液であり、坐薬は好ましくは脂肪性の乳濁液または懸濁液から調製する。組成物は滅菌し得る、ならびに／あるいは保存料、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を制御するための塩および／または緩衝剤などのアジュバントを含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、たとえば無菌的な発熱物質を含まない水で構成するためするための粉末形態であることができる。さらに、これらは他の治療上価値のある物質も含有し得る。組成物はそれぞれ慣用の混合、顆粒化またはコーティング方法に従って調製し、約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の活性成分を含有する。

【0134】

本発明の標的毒素組成物の徐放性の非経口配合物は、植込錠、油性注射剤、または粒子系として作製することができる。タンパク質送達系の幅広い概要には、本明細書中に参考として組み込まれているＢａｎｇａ，Ａ．Ｊ．、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ，ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ，ＡＮＤ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、（１９９５）を参照されたい。粒子系には、ミクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは治療的タンパク質を中心コアとして含有する。ミクロスフェアでは、治療剤は粒子全体にわたって分散されている。約１μｍ未満の粒子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセルは一般にそれぞれナノ粒子、ナノスフェア、およびナノカプセルと呼ばれる。毛細管は、ナノ粒子のみが静脈内投与されるように約５μｍの直径を有する。微粒子は典型的には約１００μｍの直径であり、皮下または筋肉内投与する。たとえば、どちらも本明細書中に参考として組み込まれているＫｒｅｕｔｅｒ Ｊ．、ＣＯＬＬＯＩＤＡＬ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ページ２１９〜３４２（１９９４）ならびにＴｉｃｅおよびＴａｂｉｂｉ、ＴＲＥＡＴＩＳＥ ＯＮ ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ、Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ページ３１５〜３３９（１９９２）を参照されたい。

【0135】

本発明の標的毒素組成物のイオン徐放性のためにポリマーを使用することができる。徐放性薬物送達で使用するための様々な分解性および非分解性ポリマーマトリックスが当分野で知られている（Ｌａｎｇｅｒ Ｒ．、Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２６：５３７〜５４２（１９９３））。たとえば、ブロックコポリマーｐｏｌａｘａｍｅｒ ４０７は、低温では粘稠であるが可動性の液体として存在するが、体温では半固体のゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの配合および持続的送達に有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、９：４２５〜４３４（１９９２）、およびＰｅｃら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．、４４（２）：５８〜６５（１９９０））。あるいは、ヒドロキシアパタイトがタンパク質の徐放性のマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、１１２：２１５〜２２４（１９９４））。さらに別の態様では、リポソームが脂質カプセル化薬物の徐放性および薬物ターゲッティングに使用されている（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、ＬＩＰＯＳＯＭＥ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州Ｌａｎｃａｓｔｅｒ（１９９３））。治療的タンパク質の徐放性送達の数々のさらなる系が知られている。たとえば、そのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第５，０５５，３０３号、第５，１８８，８３７号、第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、第４，９５７，７３５号および第５，０１９，３６９号、第５，０５５，３０３号、第５，５１４，６７０号、第５，４１３，７９７号、第５，２６８，１６４号、第５，００４，６９７号、第４，９０２，５０５号、第５，５０６，２０６号、第５，２７１，９６１号、第５，２５４，３４２号ならびに第５，５３４，４９６号を参照されたい。

【0136】

経皮施用のために適した配合物には、担体を用いた有効量の本発明の組成物が含まれる。好ましい担体には、宿主の皮膚を通過することを援助するための、吸収性の薬理学的に許容される溶媒が含まれる。たとえば、経皮装置は、裏打ちメンバーと、組成物を任意選択で担体と共に含有するリザーバーと、任意選択で、調節されたかつ事前に決定された速度で長期にわたる期間の間、組成物を宿主の皮膚に送達するための速度調節障壁と、装置を皮膚に固定するための手段とを含む帯具の形態である。また、マトリックス経皮配合物も使用し得る。

【0137】

局所的施用、たとえば皮膚および眼への施用に適した配合物は、好ましくは、当分野で周知の水溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。そのようなものは、可溶化剤、安定化剤、等張性増強剤、緩衝剤および保存料を含有し得る。

【0138】

経口投与には、医薬組成物または医薬品は、たとえば、薬学的に許容される賦形剤を用いて慣用の手段によって調製した錠剤またはカプセルの形態をとることができる。活性成分、すなわち本発明の組成物を以下のものと一緒に含む錠剤およびゼラチンカプセルが好ましい：（ａ）希釈剤または充填剤、たとえば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース（たとえば、エチルセルロース、結晶セルロース）、グリシン、ペクチン、ポリアクリレートおよび／またはリン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、（ｂ）潤滑剤、たとえば、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩、ステアリン酸金属塩、コロイド状二酸化ケイ素、硬化植物油、コーンスターチ、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび／またはポリエチレングリコールと、錠剤ではさらに（ｃ）結合剤、たとえば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはヒドロキシプロピルメチルセルロース、所望する場合は（ｄ）崩壊剤、たとえば、デンプン（たとえば、ジャガイモデンプンもしくはナトリウムデンプン）、グリコレート、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡混合物、（ｅ）湿潤剤、たとえばラウリル硫酸ナトリウム、ならびに／あるいは（ｆ）吸収剤、着色料、香料および甘味料。

【0139】

錠剤は、当分野で知られている方法に従ってフィルムコーティングまたは腸溶コーティングし得る。経口投与のための液体調製物は、たとえば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形態をとることができ、または、使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提示することができる。そのような液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、たとえば懸濁剤、たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂、乳化剤、たとえばレシチンまたはアカシア、非水性ビヒクル、たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油、および保存料、たとえばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸を用いて、慣用の手段によって調製することができる。調製物は必要に応じて緩衝塩、香料、着色料、および／または甘味剤も含有することができる。所望する場合は、経口投与用の調製物を適切に形成して、活性組成物の徐放性を与えることができる。

【0140】

吸入による投与には、キメラタンパク質、好ましくは抗体および／または標的毒素は、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｅｔｈａｎｅ）、二酸化炭素、または他の適切なガスを使用して、好都合に送達し得る。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するための弁を提供することによって単位用量を決定することができる。吸入器または注入器で使用するための、たとえばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、キメラタンパク質、好ましくは抗体および／または標的毒素と、適切な粉末基材、たとえばラクトースまたはデンプンとの粉末混合物を含有させて配合することができる。

【0141】

また、組成物は、直腸組成物、たとえば坐薬または保留浣腸で、たとえば慣用の坐薬基剤、たとえばカカオ脂または他のグリセリドを含有させて配合することもできる。

【0142】

さらに、組成物はデポー調製物として配合することができる。そのような長期作用配合物は、植込み（たとえば皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば、組成物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（たとえば許容される油中の乳濁液として）もしくはイオン交換樹脂を用いて、またはやや溶けにくい誘導体として、たとえばやや溶けにくい塩として配合することができる。

【0143】

所望する場合は、組成物は、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有することができるパックまたはディスペンサー装置で提示することができる。パックは、たとえば、金属またはプラスチック箔、たとえばブリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサー装置には投与の指示を添付することができる。

【0144】

ｂ．用量
本発明の一実施形態では、医薬組成物または医薬品は、癌などの疾患または悪性状態を予防、処置、または調節するために治療上有効な用量で患者に投与する。医薬組成物または医薬品は、患者において有効な治療的または診断的応答を誘発するために十分な量で患者に投与する。有効な治療的または診断的応答とは、疾患または悪性状態の症状または合併症を少なくとも部分的に停止させるまたは遅らせる応答である。これを達成するために十分な量が「治療上有効な用量」として定義される。

【0145】

投与するキメラタンパク質、好ましくは標的毒素、または組成物の用量は、温血動物（哺乳動物）の種、体重、年齢、個々の状態、処置する領域の表面積および投与形態に依存する。また、用量の大きさは、特定の対象における特定の化合物の投与に付随するすべての有害作用の存在、性質、および程度によっても決定される。約５０〜７０ｋｇの哺乳動物に投与するための単位用量は約５〜５００ｍｇの活性成分を含有し得る。典型的には、本発明の化合物の用量は、所望の効果を達成するために十分な用量である。

【0146】

最適な投薬スケジュールは、対象の身体内のキメラタンパク質、好ましくはターゲッティングされる毒素の蓄積の測定から計算することができる。一般に、用量は体重１ｋｇあたり１ｎｇ〜１，０００ｍｇであり、１日、１週間、１カ月、または１年に１回または複数回与え得る。当業者は最適な用量、投薬方法および反復率を容易に決定することができる。当業者は、当分野で知られており、本明細書中に開示されている確立されたプロトコルに従って、人間にキメラタンパク質、好ましくは標的毒素を投与するための最適な投薬を決定できるであろう。

【0147】

組成物の最適な用量、毒性、および治療上の有効性は、個々の組成物の相対的効力に応じて変動する場合があり、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって、たとえばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定することによって、決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。毒性がある副作用を示す組成物を使用することができるが、正常細胞への潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低下させるために、そのような組成物を患部組織の部位へとターゲッティングする送達系を設計するには注意を払うべきである。

【0148】

たとえば動物研究（たとえば、げっ歯類およびサル）から得られたデータを使用して、ヒトで使用するための用量範囲を処方することができる。本発明の化合物の用量は、好ましくは、わずかな毒性のみまたは毒性なしでＥＤ_５０が含まれる循環濃度の範囲内にある。用量は、用いる剤形および投与経路に応じてこの範囲内で変動することができる。本発明の方法で使用する任意の組成物について、治療上有効な用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養物中で決定されたＩＣ_５０（症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）が含まれる循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。一般に、キメラタンパク質、好ましくは標的毒素の用量当量は、典型的な対象で約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。

【0149】

静脈内投与のための本発明の典型的な標的毒素組成物は約０．１〜１０ｍｇ／患者／日となろう。０．１から約１００ｍｇまで／患者／日の用量を使用し得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に知られているまたは明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）などの出版物中により詳細に記載されている。

【0150】

本明細書中に記載の組成物の例示的な用量には、対象または試料の重量１キログラムあたりミリグラムまたはマイクログラム量の組成物が含まれる（たとえば、約１マイクログラム／キログラム〜約５００ミリグラム／キログラム、約１００マイクログラム／キログラム〜約５ミリグラム／キログラム、または約１マイクログラム／キログラム〜約５０マイクログラム／キログラム）。さらに、適切な用量の組成物は達成する所望の効果に関する組成物の効力に依存することが理解されよう。これらの組成物のうちの１つまたは複数を哺乳動物に投与する場合、医師、獣医師、または研究者は、たとえば、まず比較的低い用量を処方し、続いて、適切な応答が得られるまで用量を増加させ得る。さらに、任意の特定の哺乳動物対象の具体的な用量レベルは、用いた具体的な組成物の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食習慣、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに調節する発現または活性の度合を含めた様々な要因に依存することが理解されよう。

【0151】

本発明の一実施形態では、本発明のキメラタンパク質、好ましくは標的毒素を含む医薬組成物または医薬品は、たとえば、対象重量１ｋｇあたり約１ｍｇの化合物（１ｍｇ／ｋｇ）〜約１ｇ／ｋｇの範囲の１日用量で投与する。別の実施形態では、用量は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量である。さらに別の実施形態では、用量は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は約２５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇである。好ましい用量は約１０ｍｇ／ｋｇである。１日用量を１日１回投与するか、または部分用量に分割して複数用量、たとえば１日に２回、３回、もしくは４回で投与することができる。しかし、当業者には理解されるように、本明細書中に記載の組成物は様々な量で様々な時点に投与し得る。また、当業者には、それだけには限定されないが、疾患または悪性状態の重篤度、以前の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含めた特定の要因が対象を有効に処置するために必要な用量および時間に影響を与え得ることも理解されよう。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の処置には、単一の処置が含まれることができるか、または、好ましくは一連の処置が含まれることができる。

【0152】

処置が成功した後、対象は、処置した疾患または悪性状態の再発を予防するために維持療法を受けることが望ましい場合がある。

【0153】

ｃ．投与
本発明の組成物は治療処置のために投与することができる。治療的応用では、組成物を、癌などの疾患または悪性状態を患っている患者に、疾患およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与する。これを達成するために十分な量は「治療上有効な用量」として定義される。この使用に有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般的状態に依存する。有効量の化合物とは、症状の自覚的な緩和、または臨床家もしくは他の有資格観察者によって注目される客観的に同定可能な改善のどちらかを提供するものである。

【0154】

有効量の決定は、特に本明細書中に提供した詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力範囲内にある。一般に、効果的または有効な量の免疫コンジュゲートは、まず低用量または少量の免疫コンジュゲートを投与し、その後、処置した対象において最小限の毒性副作用または毒性副作用なしで所望の効果が観察されるまで、投与した用量または複数の用量を漸増的に増加させる、必要に応じて第２または第３の医薬品を追加することによって決定する。

【0155】

組成物の単一または複数投与は、患者によって要求および耐用される用量および頻度に応じて投与する。いずれにしても、組成物は、患者を有効に処置するために十分な量の本発明のタンパク質を提供すべきである。好ましくは、用量を１回投与するが、治療的結果が達成されるまで、または副作用により治療が正当に中断されるまでのどちらかまで、定期的に施用してもよい。一般に、用量は、患者に許容されない毒性を生じずに疾患の症状または兆候を処置または寛解させるために十分である。

【0156】

所望の治療効果を達成するために、組成物を複数日間、治療上有効な１日用量で投与し得る。したがって、対象において本明細書中に記載の疾患または悪性状態を処置するための組成物の治療上有効な投与は、３日間から２週間またはそれより長い範囲の期間の間続く、定期的な（たとえば毎日の）投与を必要とし得る。典型的には、組成物は、少なくとも連続した３日間、多くの場合は少なくとも連続した５日間、しばしば少なくとも１０日間、場合によっては２０、３０、４０またはそれより長い連続した日数の間投与する。連続した１日用量が治療上有効な用量を達成するために好ましい経路であるが、化合物または組成物を毎日投与しなくても、対象において組成物の治療上有効な濃度を維持するために十分な頻度で投与が繰り返される限りは、治療上有益な効果を達成することができる。たとえば、組成物を隔日、３日毎、または、より高い用量範囲が用いられ対象によって耐用される場合は、週に１回投与することができる。

【0157】

３．腫瘍成長を阻害する方法
本発明の組成物は、様々な方法において使用が見出される。たとえば、本発明のＰＥ分子は、たとえばキメラ分子の一部として、（ｉ）１つまたは複数の表面マーカーを保有する細胞においてアポトーシスを誘導すること、（ｉｉ）１つまたは複数の細胞表面マーカーを保有する細胞の望まない成長、過剰増殖または生存を阻害すること、（ｉｉｉ）癌などの状態を処置すること、および（ｉｖ）１つまたは複数の細胞表面マーカーを保有する細胞の存在によって引き起こされる疾患を発生した哺乳動物の治療を提供することにおいて使用が見出される。

【0158】

細胞表面マーカーとしてメソテリンを発現する任意の細胞または腫瘍細胞を使用して、本発明の方法を実施することができる。本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。細胞に言及する場合、この用語には細胞の集団、すなわち複数の細胞も含まれることが理解されよう。

【0159】

１つまたは複数の細胞表面マーカーを保有する細胞においてアポトーシスを誘導するための組成物の使用
アポトーシスは、多細胞生物の発生および恒常性のどちらにおいても中心的な役割を果たす。「アポトーシス」とはプログラム細胞死をいい、膜小疱形成（ｂｌｏｂｂｉｎｇ）、クロマチンの縮合および断片化、アポトーシス小体の形成ならびに陽性「ＴＵＮＥＬ」（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介性ＵＴＰニック末端標識）染色パターンなどの特定の細胞特徴によって特徴づけられている。アポトーシスプロセスの後のステップは形質膜の分解であり、これはアポトーシス細胞を様々な色素（たとえばヨウ化プロピジウム）に対して漏出性にさせる。

【0160】

アポトーシスは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体／リガンドのスーパーファミリーに属するいくつかの細胞死受容体とそのリガンドとの間の複数の相互作用からなる最終エフェクター機構の際に収束する、複数の独立したシグナル伝達経路によって誘導することができる。最も良好に特徴づけられた細胞死受容体は、ＣＤ９５（「Ｆａｓ」）、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）、細胞死受容体３（ＤＲ３またはＡｐｏ３／ＴＲＡＭＯ）、ＤＲ４およびＤＲ５（ａｐｏ２−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）である。アポトーシスの最終エフェクター機構は、カスパーゼと命名される一連のプロテイナーゼの活性化である。これらのカスパーゼの活性化は一連の生命維持細胞タンパク質の切断および細胞死をもたらす。

【0161】

本発明は、メソテリンを発現する細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供する。一態様では、細胞においてアポトーシスを誘導する方法は、細胞表面マーカーとしてメソテリンを発現する細胞を本発明のＲＩＴに曝露するまたは接触させるステップを含む。典型的には、細胞を有効量の免疫コンジュゲートに曝露または接触させ、接触がアポトーシスの誘導をもたらす。

【0162】

本発明の別の態様では、対象に本発明のＲＩＴを投与するステップを含む、その表面上にメソテリンを発現する腫瘍細胞がアポトーシスを受けるように誘導する方法を提供する。

【0163】

１つまたは複数の細胞表面マーカーを保有する細胞の成長、過剰増殖、または生存を阻害するための組成物の使用
本発明の１つの目的は、本発明の組成物を使用した癌の処置の改善された治療戦略を提供することである。本発明の一態様では、細胞の望まない成長、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つを阻害する方法が提供されている。この方法は、表面マーカーとしてメソテリンを発現する細胞を、本明細書中に記載の有効量の本発明のＰＥと、たとえばキメラ分子の一部として接触させるステップを含み、接触させるステップは、細胞の望まない成長、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つの阻害をもたらす。一実施形態では、この方法は、細胞が１つまたは複数の細胞表面マーカー、たとえば細胞表面受容体を発現するかどうかを決定するステップを含む。典型的には、細胞を有効量の免疫コンジュゲートに曝露または接触させ、接触させることで、細胞の望まない成長、過剰増殖、または生存のうちの少なくとも１つの阻害がもたらされる。

【0164】

したがって、本発明の一態様では、メソテリンを保有する細胞の集団の成長を阻害する方法が提供されている。好ましい実施形態では、この方法は、（ａ）細胞の集団を本発明によるキメラタンパク質と接触させるステップを含む。多くの腫瘍は転移を形成する。したがって、本発明の別の態様では、本発明の組成物を転移の形成を予防するために使用する。この方法は、腫瘍細胞に本発明の組成物を投与するステップを含み、投与することで転移の予防がもたらされる。好ましい実施形態では、組成物は細胞表面抗原に対する抗体を含む標的毒素と本発明のＰＥとを含む。典型的には、細胞を有効量の免疫コンジュゲートに曝露または接触させ、接触させることで転移の予防がもたらされる。その成長、拡大および／または進行を阻害することができる例示的な癌には、卵巣癌、中皮腫、非小細胞肺癌、肺腺癌および膵癌が含まれる。

【0165】

癌を処置するための組成物の使用
本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。したがって、本発明の別の態様では、癌性状態を患っている対象を処置する方法が提供されている。この方法は、癌を診断された対象に、本明細書中に記載の治療上有効な量の本発明のＲＩＴを投与するステップを含み、癌性状態は１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現する細胞の望まない成長または増殖によって特徴づけられており、投与するステップは対象の処置をもたらす。典型的には、細胞を有効量の免疫毒素に曝露または接触させ、接触させることで対象の処置がもたらされる。

【0166】

本発明の一実施形態では、本発明のＰＥを含む免疫毒素を使用して、メソテリン−ＣＡ１２５の結合相互作用によって媒介される癌を患っている対象を処置する。その成長、拡大および／または進行が少なくとも部分的にＣＡ１２５／メソテリン結合によって媒介される例示的な癌には、卵巣癌、中皮腫、非小細胞肺癌、肺腺癌および膵癌が含まれる。

【0167】

癌を処置する方法は、任意選択で以下のステップのうちの１つまたは複数を含み得る：個体から組織または体液の生体試料を得るステップ、生体試料を表面マーカーに向けられた抗体と接触させることによって、生体試料をメソテリンの発現についてスクリーニングする、または、表面マーカーｍＲＮＡを検出することによって、生体試料を表面マーカーポリヌクレオチドの発現についてスクリーニングするステップ。これは、当分野で知られている標準の技術、たとえば、ウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティングまたはＰＣＲを使用して行うことができる。

【0168】

１つまたは複数の細胞表面マーカーを保有する細胞の存在によって引き起こされる疾患を発生した対象を処置するための組成物の使用
また、メソテリンを優先的に保有するまたは過剰発現する細胞の存在または異常な増殖によって引き起こされる疾患を発生した哺乳動物の治療をもたらす方法も提供されている。好ましい実施形態では、この方法は、前記哺乳動物に本発明のＲＩＴを投与するステップが含まれる。典型的には、細胞を有効量の免疫毒素に曝露または接触させ、接触させることで対象の処置がもたらされる。

【0169】

別の実施形態では、本発明は、本発明のＲＩＴを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで標的細胞を排除することを提供する。たとえば、本発明のＲＩＴを含むキメラ分子を使用して、標的細胞を培養中の細胞集団から一掃することができる。したがって、たとえば、メソテリンを発現する癌に罹患している患者から培養した細胞は、培養物を本明細書中に記載のメソテリンに向けられたキメラ分子と接触させることによって癌細胞を一掃することができる。

【0170】

一部の例では、標的細胞が生体試料内に含有され得る。本明細書中で使用する「生体試料」とは、標的細胞および非標的細胞を含有する生体組織または体液の試料である。そのような試料には、それだけには限定されないが、生検からの組織、血液、および血液細胞（たとえば白血球）が含まれる。生体試料は、典型的には多細胞性の真核生物、好ましくはラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギなどの哺乳動物、より好ましくはマカク、チンパンジー、またはヒトなどの霊長類から得る。最も好ましくは、試料はヒトに由来する。

【0171】

本発明のＲＩＴを用いた処置に対する応答を監視する方法
本発明は、本発明のＲＩＴで処置することができる癌を患っているまたはそれに罹りやすい患者において、腫瘍成長の阻害を検出する方法を提供する。この方法は、本発明のＲＩＴを使用して患者に投与している処置過程を監視するために特に有用である。この方法は、症候性患者に対する治療処置および無症候性患者に対する予防的処置のどちらを監視するためにも使用することができる。

【0172】

監視方法は、本発明のＲＩＴの用量を投与する前の患者における腫瘍量のベースライン値を決定し、これを処置後の腫瘍量の値または処置を受けていない患者における腫瘍量と比較することを伴う。

【0173】

腫瘍量の値の有意な減少（すなわち、そのような測定値の平均からの１標準偏差として表す、同じ試料の反復測定における典型的な実験誤差限界より大きなもの）は、陽性の処置結果を示す（すなわち、本発明のＲＩＴの投与が腫瘍の成長および／または転移の進行を遮断したこと）。

【0174】

他の方法では、腫瘍量の対照値（すなわち平均および標準偏差）を対照集団または正常集団（たとえば腫瘍量＝ゼロ）について決定する。典型的には、対照集団中の個体は以前に処置を受けていない。その後、本発明のＲＩＴを投与した後の患者における腫瘍量の測定値を対照値と比較する。対照値に対する腫瘍量の有意な減少（たとえば平均から１標準偏差より大きなもの）は、陽性の処置結果を示す。有意な減少または増加の欠如は陰性の処置結果を示す。

【0175】

他の方法では、腫瘍量の対照値（たとえば平均および標準偏差）は、本明細書中に記載の本発明のＲＩＴのレジメンを、たとえばキメラ分子の一部として受ける処置を受けた個体の対照集団から決定する。患者における腫瘍量の測定値を対照値と比較する。患者における測定レベルに対照値から有意差（たとえば１標準偏差より大きなもの）がない場合、処置を中断することができる。患者における腫瘍量レベルが対照値よりも有意に高い場合、薬剤の投与の継続が正当となる。

【0176】

他の方法では、現在処置を受けていないが以前に処置過程を受けた患者を腫瘍量について監視して、処置の再開が必要であるかどうかを決定する。患者における腫瘍量の測定値を、患者において以前の処置過程後に以前達成された腫瘍量の値と比較することができる。以前の測定値に対する腫瘍量の有意な増加（すなわち、同じ試料の反復測定における典型的な誤差限界より大きなもの）は、処置を再開することができる指標である。あるいは、患者において測定された値を、処置過程を受けた後に患者の集団で決定された対照値（平均＋標準偏差）と比較することができる。あるいは、患者における測定値を、疾患の症状がないままの、予防的処置をした患者の集団、または疾患特徴の寛解を示す、治療的処置した患者の集団における対照値と比較することができる。これらすべての事例において、対照レベルに対する腫瘍量の増加（すなわち、標準偏差より大きなもの）は、患者において処置を再開するべきことの指標である。

【0177】

分析用の組織試料は、典型的には患者からの血液、血漿、血清、粘液、組織生検、腫瘍、腹水または脳脊髄液である。試料を新形成の指標について分析することができる。新形成または腫瘍量は、当分野で知られている任意の方法、たとえば、有資格の病理学者による生検の視覚的観察、または他の可視化技法、たとえば、Ｘ線撮影、超音波、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して検出することができる。

【0178】

キット、容器、装置、およびシステム
上述の診断、研究、および治療の応用で使用するために、キットおよびシステムも本発明によって提供されている。本発明のキットは、本発明のＲＩＴを、たとえばキメラ分子の一部として含む。さらに、キットおよびシステムには、本発明の方法を実施するための指示（すなわちプロトコル）を含有する指示資料が含まれ得る。指示は様々な形態で対象キット中に存在していてよく、そのうちの１つまたは複数がキット中に存在していてよい。指示資料は典型的には書面または印刷物を含むが、それだけには限定されない。そのような指示を保存し、それを最終使用者に伝達することができる任意の媒体が本発明によって企図される。そのような媒体には、それだけには限定されないが、電子記憶媒体（たとえば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（たとえばＣＤ ＲＯＭ）などが含まれる。そのような媒体には、そのような指示資料を提供するインターネットサイトへのアドレスが含まれ得る。

【0179】

キットおよびシステムの意図する使用者ならびに使用者の特定の要求に応じて、多種多様なキット、システム、および組成物を本発明に従って調製することができる。

【0180】

たとえば、経口、経膣、直腸、経皮、または注射用の用量（たとえば、筋肉内、静脈内、もしくは皮下注射用）における、単位用量の活性組成物を有するキットが提供されている。そのようなキットの中には、単位用量を含有する容器に加えて、疾患または悪性状態の処置における組成物の使用および付随する利点を記載する情報添付文書が存在する。適切な活性組成物および単位用量は本明細書中に上述したものである。

【0181】

前述の発明は明瞭性および理解のために図解および実施例によってある程度詳述されているが、当業者には、本発明の教示に鑑みて、必ずしも本発明の精神および範囲から逸脱せずに特定の変形、変化、改変および均等物置換をそれに行い得ることが容易に明らかであろう。その結果、本明細書中に記載の実施形態は様々な改変、変化などを受ける場合があり、本発明の範囲は、それに添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ決定される。当業者には、本質的に同様の結果を得るために変化、変更または改変させることができる様々な重大でないパラメータが容易に理解されるであろう。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書中で使用する用語は特定の実施形態を説明することのみが目的であり、限定することを意図しないことも理解されよう。

【0182】

本発明の要素のそれぞれは、複数の実施形態を含有するものとして本明細書中に記載されているが、別段に指摘しない限りは、本発明の所与の要素の実施形態のそれぞれを本発明の他の要素の実施形態のそれぞれと共に使用することができ、それぞれのそのような使用が本発明の明確な実施形態を形成することを意図することを理解されたい。

【0183】

本明細書中で引用する、ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列の受託番号を含めた、引用した特許、特許出願、および科学文献は、それぞれの個々の出版物、特許または特許出願が具体的かつ個々に参考として組み込まれていると示されている場合と同様に、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。本明細書中で引用した任意の参考文献と本明細書の具体的な教示との間に矛盾がある場合はすべて、後者が優位であるように解決すべきである。同様に、単語または語句の当分野で理解されている定義と本明細書中で具体的に教示されている単語または語句の定義との間に矛盾がある場合はすべて、後者が優位であるように解決すべきである。

【0184】

上記開示から理解できるように、本発明は幅広い応用を有する。

【0185】

本発明は、例示的のみであり、いかなる様式でも本発明の定義および範囲を限定することを意図しない、以下の実施例によってさらに例示されている。

【実施例】

【0186】

以下の実施例は、特許請求した発明を限定するためではなく、それを例示するために提供する。

【0187】

タンパク質
ＳＳ１Ｐ（ＳＳ１（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８）およびＳＳ１Ｐに由来するすべての突然変異体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（λＤＥ３）中でＳＳ１（ＶＨ）−ＰＥおよびＳＳ１（Ｖ_Ｌ）のベクターから発現させ、続いて記載のように再折り畳みおよび精製を行った（Ｐａｓｔａｎ Ｉ、Ｂｅｅｒｓ Ｒ、およびＢｅｒａ ＴＫ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２４８：５０３〜１８（２００４））。ＳＳ１ＰのストックはＡｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（メリーランド州Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ）によって調製された。すべての他のＲＩＴは分子生物学研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、国立癌研究所（メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）で調製された。ＳＳ１Ｐ中の突然変異は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を使用して、Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）からのプライマーを用いて作製した。

【0188】

細胞系
様々なメソテリン陽性のヒト由来の細胞系をこの研究で使用した。Ｌ５５肺腺癌およびＭ３０中皮腫細胞系はＳｔｅｖｅｎ Ａｌｂｅｌｄａ博士、ペンシルベニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）（ペンシルベニア州Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）によって提供された。ＨＡＹ中皮腫細胞系はステーリン癌研究財団（Ｓｔｅｈｌｉｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（テキサス州Ｈｏｕｓｔｏｎ）によって提供された。ＯＶＣＡＲ−８およびＡ１８４７卵巣癌細胞系は、それぞれ国立癌研究所（メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）の小林久隆博士およびＳ．Ａａｒｏｎｓｏｎ博士によって提供された。ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ肺腺癌細胞系は国立癌研究所（メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のＭｉｔｃｈｅｌｌ Ｈｏ博士から入手した。ＫＢ３１細胞系はヒト表皮癌ＫＢ細胞系のサブクローンである（Ａｋｉｙａｍａ Ｓら、Ｓｏｍａｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．、１１（２）：１１７〜２６（１９８５））。細胞系Ａ４３１／Ｋ５は、ヒトメソテリンを形質移入させ（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＰＳら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６６９〜６７４（１９９８））、ダルベッコ改変必須培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン、および７５０μｇ／ｍｌのＧ−４１８（ジェネティシン）を添加したＤＭＥＭ）中で成長させた、Ａ４３１類表皮癌細胞系の誘導体である。別段に指定しない限りは、すべての細胞系は、３７℃で、５％のＣＯ_２を用いて、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕのペニシリン、および１００μｇのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で成長させた。

【0189】

細胞毒性アッセイ
免疫毒素で処理した細胞系の生存度を、細胞計数キット−８ ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を使用して、本質的に技術マニュアルに記載されているように測定した。手短に述べると、５，０００〜１０，０００個の細胞／ウェルを９６ウェルプレートにプレートし、付着させ、様々な濃度のＲＩＴと共に、７２時間、０．２ｍｌの最終体積でインキュベーションし、その後、１０μｌのＣＣＫ−８試薬をそれぞれのウェルに加えた。４５０ｎｍでの最大吸光度を有するウェルが約１ＯＤの値に達するまで、プレートを３７℃でインキュベーションした。値をシクロヘキサミド（１０μｇ／ｍｌ）と緩衝液（ＰＢＳ中に０．２％のヒト血清アルブミン）対照との間で正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭプログラムを使用して勾配変化を有する標準の４−パラメータＳ字方程式に当てはめて、５０％の細胞死（ＥＣ_５０）が存在していた免疫毒素の濃度を得た。

【0190】

中皮腫を有する患者からの細胞の生存度のアッセイを記載のようにアッセイした。手短に述べると、中皮腫を有する患者の胸膜液または腹水から細胞を入手し、５×１０^４個の細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレート中に、陰性対照として様々な濃度のＲＩＴ ＳＳ１Ｐ、ＳＳ１−ＬＲ、ＢＬ２２（抗ＣＤ２２／ＰＥ３８）、および陽性対照としてＨＢ２１（抗トランスフェリン受容体／ＰＥ３８）と共に播種した。細胞を９６時間インキュベーションし、固定し、クリスタルバイオレット色素で染色した。それぞれのウェルの色強度は、Ｖｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）によって５９５ｎｍの波長で決定した。それぞれの値を３つ組で決定した。ＡＮＯＶＡによる生じたデータの統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を使用して行った。

【0191】

マウス異種移植抗腫瘍アッセイ
以前に記載のように、２４匹の雌ヌードマウスにＡ４３１／Ｋ５細胞を０日目に側腹部にて皮下注射した（Ｚｈａｎｇ Ｙ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１２（１５）：４６９５〜７０１（２００６））。次の６週間の間、腫瘍体積をノギスによって定期的に測定した。移植の５日後に平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に達した際に、マウスを４つの６匹の群に分け、ＰＢＳ中に０．２ｍｌの０．２％のＭＳＡ（ビヒクル単独）、あるいはＳＳ１Ｐ（０．３ｍｇ／ｋｇ）またはＳＳ１−ＬＲ（６．０もしくは１５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを含有するビヒクルをＱＯＤ×３で注射した。その腫瘍が１０００ｍｍ^３を超えた場合、または実験の終わりにマウスを安楽死させた。動物は、国立癌研究所の動物実験委員会によって承認された国立衛生研究所の指針に従って扱った。

【0192】

ＲＩＴ内部移行アッセイ
Ａ４３１／Ｋ５細胞（１０^６個／ウェル）を６ウェルプレート（１０ｃｍ^２／細胞）にプレートし、終夜放置してインキュベートした。翌日、それぞれのウェル中の培地を、１μｇの評価するＲＩＴを含有する１ｍｌの新鮮な培地で交換した。細胞を様々な時間間隔の間３７℃でインキュベーションし、その後、ウェルを２ｍｌの冷ＰＢＳ、１ｍｌの冷剥離用緩衝液（０．２Ｍのグリシン中に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ２．５）、および再度２ｍｌの冷ＰＢＳで手短にすすいだ。続いて、細胞を、２００μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、モンタナ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸Ｎａ、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０）で溶解した。試料は、ウサギ抗ＰＥ３８ポリクローナル抗体を使用した非還元性トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットによって分析した。

【0193】

ＳＳ１−ＬＲの変動する細胞毒性
ＳＳ１−ＬＲを用いた初期実験により、これが選ばれたメソテリン発現細胞系に対してＳＳ１Ｐと比較して大きく変動する細胞毒性を有することが実証され、４倍を超える高い活性から２０倍低い活性の範囲であった。しかし、この一般的な傾向は、より低い活性の分子に向かうものであった。ＳＳ１−ＬＲは、試験した８つの細胞系のうちの５つに対してＳＳ１Ｐと比較して２０％を超える低い活性を有しており、単一の細胞系に対して２０％を超える高い活性しか有していなかった。この傾向は、典型的には細胞系および患者細胞のどちらに対しても同様または増加した細胞毒性を実証したＬＲ分子の抗ＣＤ２２バージョンであるＨＡ２２−ＬＲとは著しく異なっている（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥ、Ｂｌｏｏｄ．、１１３（１６）：３７９２〜８００（２００９））。これらの観察は、メソテリンを発現する上皮細胞とＣＤ２２を発現するＢ細胞とのＰＥの中毒経路において内因的な相違が存在することを示している。

【0194】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＳ１−ＬＲ活性
免疫毒素ＳＳ１Ｐ（図１Ａ）はＰＥ３８と接合した、ジスルフィドで安定化された二本鎖抗メソテリンＳＳ１ Ｆｖからなる（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＰＳら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６６９〜６７４（１９９８）、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＰＳおよびＰａｓｔａｎ Ｉ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：５６８〜５７２（１９９９）、Ｒｅｉｔｅｒ ＹおよびＰａｓｔａｎ Ｉ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２：２４５〜２５２（１９９６））。本発明者らはＬＲ突然変異（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥ、Ｂｌｏｏｄ．、１１３（１６）：３７９２〜８００（２００９）、ＰＥΔ２５１−２７３およびΔ２８５−３９４）をＳＳ１Ｐ内に導入してＳＳ１−ＬＲ変異体（図１Ｂ）を作製し、いくつかのメソテリン発現細胞系に対するその活性をｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＳ１Ｐと比較して評価した。図２は８つの異なる細胞系からの代表的な細胞毒性アッセイを示す。

【0195】

肺癌細胞系Ｌ５５（Ａ）はどちらのＲＩＴに対しても同様の感度を示した。対照的に、肺癌系統ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（Ｐａｌ ＬＨら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、２（３）：３５０〜３（１９９６））はＳＳ１ＰよりもＳＳ１−ＬＲに対して約３倍低い感度であった。中皮腫細胞系ＨＡＹ（Ｇ）はＳＳ１ＰよりもＳＳ１−ＬＲに対して４倍を超える高い感度であったが、Ｍ３０中皮腫系統（Ｄ）はＳＳ−１ Ｐ−ＬＲに対して約２０％低い感度であった。メソテリンを安定に形質移入させた上皮系統であるＡ４３１／Ｋ５細胞系（Ｈ）（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＰＳら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：６６９〜６７４（１９９８）、Ｃｈａｎｇ ＫおよびＰａｓｔａｎ Ｉ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、９３、１３６〜１４０（１９９６））は、ＳＳ１Ｐと比較してＳＳ１−ＬＲに対して約４倍低い感度であった。さらに、子宮頸癌系統ＫＢ３１（Ｃ）はＳＳ１Ｐによって死滅されやすいが、そのＥＣ_５０はＳＳ１−ＬＲよりも２０倍低い。また、卵巣癌細胞系Ａ１８４７（Ｆ）およびＯＶＣＡＲ−８（Ｅ）のＳＳ１−ＬＲに対する感受性も評価した。ＳＳ１−ＬＲはＡ１８４７系統に対してＳＳ１Ｐに類似したＥＣ_５０を示したが、ＯＶＣＡＲ−８系統に対しては２倍低下したＥＣ_５０を示した。表Ｉはこのデータを要約しており、ＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲを比較する相対的ＥＣ_５０値を提示する。ＳＳ１Ｐと比較したＳＳ１−ＬＲの活性は様々な細胞系間で幅広く変動する。

【0196】

データを分析する際、本発明者らは、ＳＳ１−ＬＲが、評価した多くの細胞系（ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＫＢ３１、Ｍ３０、ＯＶＣＡＲ−８、およびＡ１８４７）の生存度を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキサミドで処理した細胞によって定義される対照レベルまで完全に低下させることに失敗したことに注目した。このことは、細胞の部分集団がＳＳ１Ｐに対して感受性であるが、ＳＳ１−ＬＲに対して耐性であり得ることを示唆していた。本発明者らは、ＯＶＣＡＲ−８およびＡ１８４７細胞を４日間、１０ｎｇ／ｍｌのＳＳ１−ＬＲと共にインキュベートし、生存細胞がある場合はそれを培養することを試みることによって、この可能性を評価した。ＲＩＴ処理後にさらなる細胞成長は観察されなかった。本発明者らは、本発明者らのアッセイによって完全な代謝阻害は得られなかったが、ＳＳ１−ＬＲに耐性のあるこれらの細胞系の部分集団は存在しないことを結論づけた。

【0197】

ｉｎ ｖｉｖｏ ＳＳ１−ＬＲ活性
次に、本発明者らは、マウス異種移植腫瘍モデルを使用してＳＳ１−ＬＲの有効性を評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した細胞系のうち、Ａ４３１／Ｋ５のみが本発明者らの異種移植モデル中で一貫して成長した。平均約１００ｍｍ^３のＡ４３１／Ｋ５異種移植腫瘍を有するヌードマウスを、６．０または１５ｍｇ／ｋｇの用量のＳＳ１−ＬＲを用いてＱＯＤ×３（隔日で３回の用量）で静脈内処置した。比較のために、さらなる群を、緩衝液（ＰＢＳ中に０．２％のＨＳＡ）またはこの投薬スケジュール下におけるＳＳ１Ｐの最大耐量である０．３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐのどちらかを用いてＱＯＤ×３で静脈内処置した。それぞれのマウスの腫瘍サイズを移植後２２日間の間、定期的に測定した（図３）。

【0198】

ＰＢＳで処置したマウスの腫瘍は、移植後１４日目に１０００ｍｍ^３を超える平均サイズまで迅速に成長した。５、７および９日目に０．３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐで処置したマウスは、平均腫瘍サイズを１２日目に最小で約５３ｍｍ^３とした腫瘍回帰を示した。２０日目までにすべての腫瘍が迅速な成長を再開していた。６．０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１−ＬＲの用量は、０．３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐよりもわずかに効力が低かった。６．０ｍｇ／ｋｇのＳＳ１−ＬＲで処置したマウスにおける腫瘍は７および９日目に平均最小サイズ９２ｍｍ^３に達し、１８日目までにすべてが迅速な成長を再開した。１５ｍｇ／ｋｇのＳＳ１−ＬＲの用量は０．３ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐよりも有意に良好な抗腫瘍活性を実証した。１５ｍｇ／ｋｇのＳＳ１−ＬＲで処置したマウスにおける腫瘍は平均最小サイズ１７ｍｍ^３まで退行した。２２日目に６つの腫瘍のうちの４つが成長を再開し、１つの腫瘍が１８日目から１０ｍｍ^３で変化なしであり、１つの腫瘍が１５日目後に検出不可能であった。このモデルにおいてＳＳ１−ＬＲはＳＳ１Ｐよりも約２０倍低い活性であるが、その低い非特異的毒性により、高用量でマウスを処置し、優れた抗腫瘍効果を達成することが可能となる。

【0199】

内部移行されたＲＩＴのプロセシング
ＳＳ１ＰとＳＳ１−ＬＲとの間の細胞内輸送およびプロセシングの相違が、２つのＲＩＴ間で観察された活性の変動を説明している可能性がある。この仮説を試験するために、本発明者らはＡ４３１／Ｋ５細胞中でのＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲの内部移行およびプロセシングをウエスタンブロットによって検査した（図４）。Ａ４３１／Ｋ５細胞は高レベルのメソテリンを発現し（約１０６部位／細胞）、可視化のために大量のＲＩＴを内部移行させるため、これを選択した。本発明者らは、１μｇ／ｍｌのＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲのどちらかを用いた様々な時間間隔での連続したインキュベーションで処理したＡ４３１／Ｋ５細胞の全細胞溶解液に対して非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットを行った。図４ＡはＳＳ１Ｐ処理の時間経過を示す一方で、図４ＢはＳＳ１−ＬＲ処理の時間経過を示す。

【0200】

予想通り、ＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲで処理したＡ４３１／Ｋ５細胞は、２つのＲＩＴの完全長型（それぞれ６２ｋＤａおよび５０ｋＤａ）ならびに還元型（それぞれ５１ｋＤａおよび３９ｋＤａ）の指標である位置に突出したバンドを有する。どちらのＲＩＴもＦｖ領域中に３つのジスルフィド結合を含有しており、これらはＶＨおよびＶＬ断片中のそれぞれ１つの鎖内結合、ならびにＶ_ＨとＶ_Ｌとの間の１つの鎖間結合である（図１）。ＳＳ１Ｐは、ドメインＩＩ中、フューリン切断部位に隣接するシステイン残基（Ｃｙｓ^２６５およびＣｙｓ^２８７）間にさらなるジスルフィド結合を含有する。ＳＳ１Ｐ中のさらなるジスルフィド結合の酸化状態はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＳＳ１Ｐの遊走を変化させ、観察された二重線を引き起こすと考えられる（図４Ａ、還元）。これらのバンドは還元剤で処理した際に単一バンドへと崩壊する（データ示さず）。

【0201】

また、本発明者らは、ＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲのＣ末端フューリン切断断片（それぞれ３４ｋＤａおよび２４ｋＤａ）に対応するバンドも観察されると予想した。ＳＳ１Ｐで処理した細胞からの溶解物は３４ｋＤａ付近にフューリン切断断片の指標である突出したバンドを示す。対照的に、ＳＳ１−ＬＲで処理した細胞からの溶解物は２４ｋＤａに対応する弱いバンドしか示さない。それぞれのバンドの強度はＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定量した。図４Ｃは、それぞれの時点におけるフューリンで切断された断片の総バンド強度のパーセントを示す。フューリンで切断されたＳＳ１Ｐは、すべてのバンドの強度の合計の３０％をわずかに超える最大に達する一方で、ＳＳ１−ＬＲは合計強度の６％の最大に達する。それぞれの時点における切断されたＳＳ１Ｐと切断されたＳＳ１−ＬＲの割合との間には５倍を超える差異が存在し、これは、ＳＳ１−ＬＲがＳＳ１Ｐよりも低い効率でフューリンによってプロセシングされている可能性を示唆している。

【0202】

柔軟なリンカー突然変異体
本発明者らのデータはＳＳ１−ＬＲがＳＳ１Ｐよりも低い効率でフューリンによってプロセシングされることを示唆しているため、本発明者らは、そのフューリン切断効率を増加させることによってＳＳ１−ＬＲの活性を増強させることを試みた。フューリン切断部位への変化が、細胞内フューリン切断の効率を改善することによってＳＳ１−ＬＲの活性を増強させることができるかどうかを探索するために、本発明者らはいくつかの突然変異体を設計した。本発明者らの戦略は、短い構造化されていないＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを付加することによってフューリン切断部位の柔軟性、したがってフューリンへのその接近可能性を増加させることであった。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ（図１Ｂ）には１１個の残基のフューリン切断部位のＣ末端にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーが含まれ、ＮＣＩＨ３２２ＭおよびＫＢ３１細胞系のどちらに対しても増強された活性を有する（図５）。リンカーの長さの増加（ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ×２、図１Ｂ）は活性をさらに増強させない（データ示さず）。また、さらなるリンカー領域を用いたフューリン切断部位の重複（ＳＳ１−２×フューリン、図１Ｂ）も、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳを超えて活性を増強させることに失敗した（データ示さず）。ＳＳ１−ＬＲとは異なり、伸長させたリンカー突然変異体はすべて、シクロヘキサミド対照と同等の完全な代謝阻害を実証する。さらに、フューリン切断の重要性を確認するために、本発明者らは、フューリンによるこの部位の切断を不可能にするＲ２７９Ｇ突然変異が含まれる突然変異体ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ Ｒ２７９Ｇを調製した。この突然変異体はＮＣＩ−Ｈ３２２ＭおよびＫＢ３１細胞のどちらに対しても完全に不活性であり（図５）、活性におけるフューリン切断の必要性を実証している。

【0203】

その後、本発明者らは、ＧＧＳリンカーがＳＳ１−ＬＲのフューリン切断効率を増強させたという本発明者らの仮説を試験した。しかし、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳで処理したＡ４３１／Ｋ５細胞のウエスタンブロット分析は、全ＲＩＴに対する切断されたものの割合の改善を示さなかった（データ示さず）。同様に、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳのｉｎ ｖｉｔｒｏフューリン切断もフューリン切断速度の改善を示さなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳの改善された細胞毒性はフューリン切断の増強が原因のものではなく、その代わりに異なる機構の結果であることを示している。可能性のある説明には、細胞内輸送中の毒素の転位の増強が含まれる。

【0204】

患者細胞に対する活性
この研究の継続中に、既知のＢ細胞エピトープを排除することによってＲＩＴで処置した患者においてＰＥの免疫原性を低下させるために、ドメインＩＩＩ中の一連の８個の点突然変異を設計した（Ｏｎｄａ Ｍら、発表のためにＰＮＡＳに提出）。これらの突然変異（Ｄ４０６Ａ、Ｒ４３２Ｇ、Ｒ４６７Ａ、Ｒ４９０Ａ、Ｒ５１３Ａ、Ｅ５４８Ｓ、Ｑ５９２Ａ、およびＫ５９０Ｓ）はＲＩＴの活性に影響を与えないが、その代わりにタンパク質の免疫原性を低下させる。本発明者らはこれら８個の突然変異をＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ内に取り込ませ、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍと呼ばれる新しい変異体を作製し、その細胞毒性を、中皮腫を有する患者の胸膜液または腹水から採取した初代細胞に対して試験した。患者から採取した体液は細胞の混合物を含有しており、そのすべては悪性ではなく、これらはメソテリンを一様に発現しない。したがって、アッセイは相対的活性の良好な評価を提供するが、これは絶対的細胞毒性の概算でしかない。細胞を初期継代において様々な濃度のＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍで処理し、記載のように生存度を４日後にクリスタルバイオレットアッセイによって評価した。ＳＳ１Ｐに対する応答について評価したいくつかの患者細胞のうち、２つ（ＮＣＩ−Ｍ−０２およびＮＣＩ−Ｍ−０３）が処理に対する良好な応答を示した（１００ｎｇ／ｍｌの用量レベルで生存度の＞６５％の減少）。本発明者らは、これら２つの集団に対するＳＳ１Ｐ−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの活性を評価し、ＳＳ１Ｐの活性と比較した。データを図６に未処置の対照値の小数値として提示する。

【0205】

患者細胞ＮＣＩ−Ｍ−０２およびＮＣＩ−Ｍ−０３はどちらもＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍのどちらを用いた処理に対しても感受性があり、１００ｎｇ／ｍｌ以下の用量で未処置の対照と比較して６０％を超える生存度の減少を示した。ＮＣＩ−Ｍ−０２およびＮＣＩ−Ｍ−０３は１．０および１０ｎｇ／ｍｌの用量レベルのＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍに特に感受性があり、これらの濃度のＳＳ１Ｐと比較した場合に有意により高い細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）が実証された（ｐ＜０．０５）。また、対照として、患者細胞をＲＩＴ ＢＬ２２およびＨＢ２１でも処置した（データ示さず）。Ｂ細胞特異的マーカーＣＤ２２を標的とするＢＬ２２は、１００ｎｇ／ｍｌの用量でどちらの細胞集団の生存度にも影響を与えなかった。遍在性のトランスフェリン受容体を標的とし、ほぼすべての細胞に対して非常に活性であることが知られているＨＢ２１は、１０ｎｇ／ｍｌの用量でどちらの細胞系の生存度もほぼ９０％だけ低下させた。全体的に、データは、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍが２つの異なる患者細胞集団に対してＳＳ１Ｐと同様またはそれより良好な細胞毒性を有していたことを示す。本発明者らは、２つの抗メソテリン免疫毒素は、同一の挙動ではないが匹敵する細胞毒性活性を有すると結論づける。

【0206】

実施例２．
さらに、改善された治療特性を有するＳＳ１Ｐの変異体であるＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの構築、評価および対比に関する拡張報告。上述のように、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは、ＲＩＴを改善することが以前に示されている突然変異、およびその活性を増強させる新しい突然変異を取り込んでいる。ＳＳ１−ＬＲは、１１個の残基のＰＥフューリン切断部位によってＳＳ１ Ｆｖと接合したＰＥの触媒断片を含有するＳＳ１Ｐの切断された変異体である。ＳＳ１−ＬＲの細胞毒性を７つの細胞系で評価し、ＳＳ１Ｐよりも実質的に低いことが見出された。培養細胞におけるＳＳ１−ＬＲのさらなる分析により、中毒経路中のフューリンによるプロセシングが乏しかったことが示された。フューリン切断を改善するために、本発明者らは３個の残基のリンカーをＳＳ１−ＬＲ内に導入し、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳを作製した。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳは、細胞系に対する活性が有意により高かったが、フューリン切断の増強を示さなかった。本発明者らは、Ｂ細胞エピトープを排除することによってＲＩＴの免疫原性を減少させることが示されている８個の点突然変異をＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳの触媒断片内に導入した。この新しいＲＩＴ、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは、優れた抗腫瘍活性、げっ歯類における低い非特異的毒性、および抗ＳＳ１Ｐヒト血清との反応性の低下を本明細書中で示す。さらに、中皮腫を有する患者からの初代細胞は、ＳＳ１Ｐと比較してＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍに対する応答の増強を示す。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは、その低い抗原性、低い非特異的毒性、および高い活性が原因で臨床開発の優れた治療候補である。

【0207】

いくつかのメソテリン陽性のヒト由来の細胞系をこの研究で使用した。これらの細胞は、一般に、実施例１中に提供したように供給され、成長させた。

【0208】

細胞毒性アッセイ
免疫毒素で処理した細胞系の生存度を、細胞計数キット−８ ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を使用して測定した。細胞（２，０００個の細胞／ウェル）を９６ウェルプレートにプレートし、終夜放置して接着させ、様々な濃度のＲＩＴと共に、７２時間、０．２ｍｌの最終体積でインキュベーションした。インキュベーション期間の終わりに、１０μｌのＣＣＫ−８試薬をそれぞれのウェルに加え、４５０ｎｍでの最大吸光度を有するウェルが約１ＯＤの値に達するまで、プレートを３７℃でインキュベーションした。値を、シクロヘキサミド（１０μｇ／ｍｌ）および０．２％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する緩衝液（ＣａおよびＭｇを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））の対照の間で正規化し、その後、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）を使用して、プラトーの勾配変化、ベースライン、およびヒル勾配を有するＳ字方程式に当てはめた。続いて、方程式を使用して、細胞生存度を５０％のレベルまで低下させたＲＩＴの濃度（ＥＣ_５０）を内挿した。

【0209】

本質的に記載されているように、中皮腫を有する患者からの細胞を培養し、ＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍに対するその応答について評価した（Ｘｉａｎｇ Ｘら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１１、６：ｅ１４６４０）。Ｄ−ＰＢＳおよび１０ｎｇ／ｍｌのＨＢ２１（抗トランスフェリン受容体／ＰＥ４０）を細胞死の陰性および陽性対照として使用した。それぞれの条件を３つ組で評価した。ＡＮＯＶＡによる生じたデータの統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。

【0210】

マウス異種移植抗腫瘍アッセイ
２８匹の雌ヌードマウスに、０．２ｍｌのＲＰＭＩ中の５×１０^６個のＬ５５細胞を、４ｍｇ／ｍｌのｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）と共に、０日目に側腹部にて皮下注射した。次の３０日間の間、腫瘍体積をノギスによって定期的に測定した。移植後の７日間（約１００ｍｍ^３の平均腫瘍）、マウスを４つの均等な群に分け、７、９、および１２日目に、０．２ｍｌのＤ−ＰＢＳ中に０．２％のＨＳＡ（ビヒクル）、あるいはＳＳ１Ｐ（０．４ｍｇ／ｋｇ）またはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（０．４もしくは２．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを含有するビヒクルを静脈内注射した。この実験およびすべての続く動物実験は、国立癌研究所の動物実験委員会によって承認された国立衛生研究所の指針に従って扱った。

【0211】

マウス血清薬物動態学
９匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの群に、０．２ｍｌのＤ−ＰＢＳ中の１０μｇのＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを０．２％のＨＳＡと共に静脈内注射した。３匹のマウスの群を２および２０、５および３０、または１０および６０分間の時間間隔で出血させた。以前に記載のように酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって血清を分析した（Ｂａｎｇ Ｓら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００５、１１：１５４５〜５０．２５））。

【0212】

ラット毛細血管漏出アッセイ
ＲＩＴ誘導性毛細血管漏出症候群の以前に記載されているラットモデル（Ｓｉｅｇａｌｌ ＣＢら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９４、９１：９５１４〜８）を使用してＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの非特異的毒性を評価した。手短に述べると、６〜８週齢の雌のＷｉｓｔａｒ Ｆｕｒｔｈａｎｄ Ｒｏｗｅｔｔ、ｎｕ／ｎｕ（無胸腺症）ラット（Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）にＤ−ＰＢＳ、ＳＳ１Ｐ（０．２もしくは０．３ｍｇ／ｋｇ）、またはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（６もしくは１２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。２４時間後、ＣＯ_２に曝すことによってラットを安楽死させた。死体を背殿位にし、腹側胸壁を取り除き、３ｍｌのシリンジおよび２７．５ゲージの針を使用して体液を吸引することによって、胸水を安楽死させた動物から採取した。いくつかのラットからの肺を取り出し、３日間、１０％のホルマリン中で固定し、切片を作製し、染色した。

【0213】

ＲＩＴ内部移行アッセイを本質的に上述のように行い、試料はウサギ抗ＰＥ３８ポリクローナル抗体を使用した非還元性ウエスタンブロットによって分析した。

【0214】

抗原性アッセイ。
ＣＤ２２−ｒＦｃおよびＨＡ２２をＥＬＩＳＡによるＰＥに特異的な抗体の検出に使用した以外は本質的に記載されているように、患者血清中におけるＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍと抗体との結合を分析した（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１１、１０８：５７４２〜７）。

【0215】

結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＳ１−ＬＲ活性。
免疫毒素ＳＳ１Ｐ（図１）は、ＰＥ３８と接合した、ジスルフィドで安定化された二本鎖抗メソテリンＳＳ１ Ｆｖである。本発明者らはＬＲ突然変異（（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥら、Ｂｌｏｏｄ、２００９、１１３：３７９２〜８００）、ＰＥΔ２５１−２７３およびΔ２８５−３９４）をＳＳ１Ｐ内に導入してＳＳ１−ＬＲを作製し、７つのメソテリン発現細胞系に対するその活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。表２は少なくとも３つの別々の細胞毒性実験からのデータを平均ＥＣ_５０値および平均の標準誤差として要約する。ＳＳ１Ｐと比較して、ＳＳ１−ＬＲはＨＡＹ細胞系に対して活性がより高かったが、残りの系統に対しては活性がより低かった。ＳＳ１−ＬＲの活性は様々な細胞系間で広く変動していたが、卵巣癌系統に対して活性が最も低かった。

【0216】

ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ
免疫原性は、依然としてＰＥに基づくＲＩＴの顕著な問題のままである（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥら、ＦＥＢＳ Ｊ．、２０１１年１２月、２７８（２３）：４６８３〜７００）。ＨＡ２２−ＬＲをＨＡ２２と比較する研究（Ｈａｎｓｅｎ ＪＫら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２０１０、３３：２９７〜３０４）により、本発明者らはＳＳ１−ＬＲがＳＳ１Ｐよりも低い免疫原性を有すると期待したが、それにもかかわらずＰＥの残りの要素は中和抗体を迅速に誘発する。ＰＥ中の免疫原性Ｂ細胞エピトープを除去するために、ドメインＩＩＩ中の一連の８個の点突然変異が最近設計された（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１１、１０８：５７４２〜７）。これらの突然変異（Ｄ４０６Ａ、Ｒ４３２Ｇ、Ｒ４６７Ａ、Ｒ４９０Ａ、Ｒ５１３Ａ、Ｅ５４８Ｓ、Ｑ５９２Ａ、およびＫ５９０Ｓ）はマウスにおいてＨＡ２２−ＬＲの免疫原性を劇的に低下させるが、その細胞毒性を大きく消失させない。本発明者らは、突然変異をＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ内に取り込ませ、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍと呼ばれる新しい変異体を作製し、このＲＩＴを７つのメソテリン発現細胞系に対して試験した。これらの実験からのＥＣ_５０値は表２に報告されている。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭはＳＳ１−ＬＲよりも活性が高く、時折ＳＳ１Ｐよりも活性が高いが（ＨＡＹ、Ｌ５５）、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳよりも低い活性である。活性の減少は特に卵巣癌系統で明らかである。

【0217】

非特異的な毒性
抗ＣＤ２２ ＲＩＴ ＨＡ２２を用いた以前の研究では、本発明者らは、２ｍｇ／ｋｇのＨＡ２２の単一の静脈内用量がマウスに対して致死的であった一方で、２０ｍｇ／ｋｇのＨＡ２２−ＬＲの用量は毒性を示さなかったことを見出した（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥら、Ｂｌｏｏｄ、２００９、１１３：３７９２〜８００）。本発明者らはそれ以降、４５ｍｇ／ｋｇと高い単一用量のＨＡ２２−ＬＲをマウスに与えて死亡がもたらされず（非公開の観察、データ示さず）、ＳＳ１−ＬＲおよびその変異体から同様の挙動を期待した。以前の実験では、ＳＳ１Ｐの単一用量の静脈内ＬＤ_５０を、Ｂａｌｂ／Ｃマウス中では１．０ｍｇ／ｋｇ（Ｆｉｌｐｕｌａ Ｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２００７、１８：７７３〜８４）およびＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス中では０．７５ｍｇ／ｋｇとされた（Ｏｎｄａ Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００１、６１：５０７０〜７）。臨床スケジュールに類似したＱＯＤ×３（隔日で３回投与）投薬スケジュールを使用して、マウスは０．４ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐの最大用量を耐用したが（非公開の観察、データ示さず）、ＳＳ１−ＬＲを与えたマウスは、毒性なしで１５ｍｇ／ｋｇのＱＯＤ×３までの用量を受けた（データ示さず）。

【0218】

マウスにおけるＬＲに基づくＲＩＴの非特異的毒性の低下は興味深いが、臨床治験で観察される主要な毒性とは関連性がない可能性がある。マウスにおけるＲＩＴ非特異的毒性は肝損傷の結果であり（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥら、Ｂｌｏｏｄ、２００９、１１３：３７９２〜８００、Ｏｎｄａ Ｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１６５：７１５０〜６）、これは患者で一般的に観察されない。非特異的毒性のより関連性のある動物モデルは、ラットにおけるＲＩＴ誘導性毛細血管漏出症候群である（Ｓｉｅｇａｌｌ ＣＢら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９４、９１：９５１４〜８、Ｓｉｅｇａｌｌ ＣＢら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９９７、３：３３９〜４５）。体液が血管から間質腔内に漏出する毛細血管漏出症候群は、ＰＥに基づくＲＩＴの臨床治験で観察される一般的な毒性である。このモデルを使用して、本発明者らは、２ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐを用いて静脈内で処置したラットが２４時間後に病気のように見えたことを観察し、これらは努力呼吸およびその胸腔中に体液の蓄積を有する（図７Ａ）。ＳＳ１Ｐの用量が３ｍｇ／ｋｇまで増加することで胸水の体積が増加した。対照的に、Ｄ−ＰＢＳまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍのどちらかで処置したラットは病気の兆候を示さず、体液を保持しなかった。６ｍｇ／ｋｇおよび１２ｍｇ／ｋｇのＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの用量の投与は、観察可能な効果がなかった。Ｄ−ＰＢＳ、ＳＳ１Ｐ、およびＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍで処置したラットの肺を固定および染色した際、Ｄ−ＰＢＳまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍで処置したものは正常に見えた一方で、ＳＳ１Ｐで処置したラットからのものは重篤な損傷の兆候を示した（図７Ｂ）。どのＬＲに基づく分子も臨床的に試験していないが、この観察は、ＬＲに基づくＲＩＴが患者における毒性を減少させた可能性があるという提案を強化する。

【0219】

ｉｎ ｖｉｖｏ ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ活性
次に、本発明者らは、Ｌ５５肺癌細胞系を使用したマウス異種移植腫瘍モデルを用いてＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの有効性をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。平均約１００ｍｍ^３の腫瘍を有する７匹のヌードマウスの群を、７、９、および１２日目に０．４および２．５ｍｇ／ｋｇの用量のＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍで静脈内処置した。比較のために、さらなる群を、ビヒクル（Ｄ−ＰＢＳ中に０．２％のＨＳＡ）またはこの投薬スケジュール下におけるＳＳ１Ｐの最大耐量である０．４ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐを用いて同じスケジュールで静脈内処置した。それぞれのマウスの腫瘍サイズを移植後３０日間の間、定期的に測定した（図７Ｃ）。

【0220】

ビヒクルで処置したマウスの腫瘍は、移植後１６日目に約５００ｍｍ^３の平均サイズまで成長した。０．４ｍｇ／ｋｇのＳＳ１Ｐで処置したマウスは、腫瘍が約５００ｍｍ^３のサイズに達するまでに移植後２３日目までを要した、腫瘍成長の短い遅延を示した。本発明者らは０．４ｍｇ／ｋｇのＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍで処置したマウスでほぼ同一の応答を観察し、これはこのモデルにおいてＳＳ１ＰとＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍとの間に偶奇性を示唆している。ＳＳ１Ｐは、その非特異的毒性が原因でこのスケジュールで０．４ｍｇ／ｋｇより高い用量でマウスに投与することはできないが、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍははるかにより高い用量でマウスに与えることができ、悪影響はなかった。約６倍高い用量のＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（２．５ｍｇ／ｋｇ）をこの腫瘍モデルで試験した。本発明者らはこのマウス群で有意な（対のある両側ｔ検定を使用してｐ＜０．０１）腫瘍回帰を観察し、その腫瘍は９日目に最小サイズ約７３ｍｍ^３に達した。また、このマウス群は増強された腫瘍成長の阻害も経験し、移植後３０日目に約５００ｍｍ^３のサイズに達した。

【0221】

ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭはマウスＬ５５異種移植腫瘍モデルにおいてＳＳ１Ｐに同等の活性を有していたが、これはｉｎ ｖｉｔｒｏでＬ５５細胞に対してＳＳ１Ｐと比較して増強された活性を実証した。この活性の不一致は、２つの分子間のマウス血清半減期の差異によって説明することができる。マウスにおけるＨＡ２２−ＬＲ（約５１ｋＤａ）の半減期をＨＡ２２（約６３ｋＤａ）に比較する以前の研究（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥら、Ｂｌｏｏｄ、２００９、１１３：３７９２〜８００）は、ＨＡ２２−ＬＲがＨＡ２２よりほぼ２倍短い半減期を有していたことを示した（それぞれ７．８および１４．６分間）。本発明者らは、この差異はより小さな分子の腎臓濾過の増加が原因であると仮定し、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ（約５０ｋＤａ）をＳＳ１Ｐ（約６３ｋＤａ）と比較した際に同様の結果を期待した。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを注射したマウスから採取した血清試料の分析は１３分間の半減期を示し、それと比較してＳＳ１Ｐでは半減期は１９分間であった（図７Ｄ）。本発明者らは、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭとＳＳ１Ｐとの間の半減期の差異がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの２つの分子間の相対的活性の不一致の原因であると結論づけた。

【0222】

ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの抗原性
ＲＩＴ ＨＡ２２を用いた以前の研究に基づいて（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１１、１０８：５７４２〜７）、本発明者らは、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍ中の突然変異がＢ細胞エピトープをＳＳ１Ｐから除去するであろうと期待した。この提案を評価するために、本発明者らは、ＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭとＳＳ１Ｐを用いた処置に応答して中和抗体を発生した５人の患者からの血清との反応性を比較した。まず、患者血清をＳＳ１ＰまたはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍのどちらかと混合した。続いて、血清中の未結合のＰＥ３８特異的抗体を、ＩＣＣ−ＥＬＩＳＡを使用して検出した（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１１、１０８：５７４２〜７）。これらのデータから、ＥＬＩＳＡシグナルが５０％低下したＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの濃度（ＩＣ_５０）を決定した。以前に報告されているように（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００６、１７７：８８２２〜３４）、ＩＣ_５０値は抗体−抗原の相互作用の親和性と相関している。図８は、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍに対するＳＳ１ＰのＩＣ_５０値をパーセンテージとしてプロットしている。すべての患者血清について、ＳＳ１Ｐ対ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭのＩＣ_５０値の比は実質的に１０％未満であり、これは、血清中のＳＳ１Ｐ反応性抗体の主要な画分がＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍと非反応性であったことを示している。

【0223】

患者細胞に対する活性
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの細胞系統に対するＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの本発明者らの評価を補足するために、本発明者らは、その活性を、中皮腫を有する患者の胸膜液または腹水から初代細胞を入手した初代細胞に対してさらに試験し、数継代の間培養中に維持した［０］。患者から採取した体液は細胞の混合物を含有しているため、アッセイは相対的活性の良好な評価を提供するが、これは絶対的細胞毒性の概算でしかない。２人の追加の患者からの細胞を様々な濃度のＳＳ１Ｐで処理し、その生存度を４日後にクリスタルバイオレットアッセイを使用して評価した。初期継代中皮腫患者細胞ＮＣＩ−Ｍ−１６およびＮＣＩ−Ｍ−１９はＳＳ１Ｐを用いた処理に対して明白な応答を示した（１００ｎｇ／ｍｌの用量レベルで＞７５％の生存度の減少）。本発明者らは、これら２人の追加の患者に由来する細胞集団に対するＳＳ１Ｐ−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの活性を評価した。データは、小数値をＤ−ＰＢＳ（１００％生存可能）と１０ｎｇ／ｍｌの抗トランスフェリン受容体／ＰＥ４０ ＲＩＴ ＨＢ２１（０％生存可能）との対照処置の間で正規化して、図９に提示する。すべての患者細胞集団はＳＳ１Ｐ−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを用いた処理に非常に感受性であり、これはＳＳ１Ｐを超えて有意に増強された細胞毒性を実証している。

【0224】

ＳＳ１Ｐは、中皮腫を処置するために現在臨床開発中であるが、メソテリンを発現する様々な固形腫瘍を処置する潜在性を有する、シュードモナス属外毒素Ａに基づく抗メソテリン組換え免疫毒素である。臨床治験では、ＳＳ１Ｐは控えめであるが励みになる結果を達成している。しかし、その有効性は用量規制毒性および患者における中和抗体の迅速な生成によって制限されている。ここでは、本発明者らは、低い抗原性を有するＳＳ１Ｐの変異体であるＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍが優れた活性およびげっ歯類において著しく低下した非特異的毒性を有することを報告する。

【0225】

ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは、ＰＥに基づく抗メソテリンＲＩＴ ＳＳ１Ｐの、活性が高く、毒性がより低く、抗原性がより低い変異体である。本発明者らによるＳＳ１−ＬＲの初期評価は、選ばれたメソテリン発現細胞系に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで高度に変動するが一般に低い活性を示した（表１および２）。ＳＳ１Ｐと比較して低いその活性の理由を探索する中で、本発明者らはＳＳ１−ＬＲの内部移行およびプロセシングを調査し、２つのＲＩＴで処理した細胞においてフューリンで切断されたＳＳ１−ＬＲの割合がＳＳ１Ｐのそれよりもはるかに低かったことを見出した。これは、減少したフューリン切断がＳＳ１−ＬＲの活性を制限している可能性があることを示唆しており、本発明者らはこの仮説を試験するためにいくつかの突然変異体を設計および生成した。フューリン切断部位の後に短いＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを付加することは、フューリン切断を増強させなかったが、細胞系に対するＳＳ１−ＬＲの活性を増強させた。ＳＳ１−ＬＲをＧＧＳリンカーおよびＰＥの免疫原性を低下させることが示されている８個の点突然変異と組み合わせることによって、本発明者らは最終分子、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを作製した。ＳＳ１Ｐと比較して、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは、ラット毛細血管漏出モデルにおける非特異的毒性の大きな低下、患者細胞に対する細胞毒性の増強、および患者血清中の抗体との反応性の低下を実証した。ＳＳ１−ＬＲを用いた初期実験は、細胞系に対するＳＳ１Ｐと比較して変動する細胞毒性を実証した。しかし、主な傾向は、より低い活性の分子に向かうものであった。ＳＳ１−ＬＲはＨＡＹ系統に対してより活性であり、他の６つの系統に対してより低い活性であった。この傾向は、ほとんどの細胞系および患者細胞に対して同様または増強された細胞毒性を実証したＬＲ分子の抗ＣＤ２２バージョンであるＨＡ２２−ＬＲとは著しく異なっている（Ｗｅｌｄｏｎ ＪＥら、Ｂｌｏｏｄ、２００９、１１３：３７９２〜８００）。この不一致は、上皮細胞上のメソテリンを標的とするＰＥとＢ細胞上のＣＤ２２を標的とするＰＥの中毒経路との間に内因的な相違が存在することを示唆している。

【0226】

ＳＳ１Ｐと比較して一般に減少したＳＳ１−ＬＲの活性に関して、この相違の１つの可能な説明は細胞内中毒経路の差異である．ＰＥ３８のＬＲ変異体はＰＥのドメインＩＩおよびＩｂ中に大規模な欠失を含有しており、これらの欠失が、サイトゾルへと輸送されるＰＥの能力に負の影響を与えた可能性がある。ＳＳ１ＰおよびＳＳ１−ＬＲで処理したＡ４３１／Ｋ５細胞の溶解物中の完全長およびプロセシングされたＰＥを検出するための本発明者らの実験は、フューリンでプロセシングされたＲＩＴの量の劇的な差異を示した。ＳＳ１Ｐで処理した細胞中の全ＲＩＴの大部分がプロセシングされたが、ＳＳ１−ＬＲで処理した細胞中では全ＲＩＴのほんの少ししか切断されなかった。この結果は、乏しいフューリン切断がＳＳ１−ＬＲの活性を制限している可能性を示唆しており、本発明者らはＰＥ中毒経路のこのステップを改善しようと試みた。

【0227】

柔軟なリンカーをＳＳ１−ＬＲフューリン部位に付け加えることによって、本発明者らはより活性のあるＲＩＴを生成したが、フューリン切断の増強を実証することができなかった。短いＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ、図１）、より長いリンカー（ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ×２、図１）、または短いＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーによって隣接されたフューリン部位の反復（ＳＳ１−ＬＲ／２×フューリン、図１）の付加はすべて、中程度の細胞毒性の増加を与えた。しかし、これらの分子はいずれも、処理したＡ４３１／Ｋ５細胞においてフューリンで切断されたＳＳ１−ＬＲの割合を増強させず、ｉｎ ｖｉｔｒｏフューリン切断率を増加させなかった（データ示さず）。本発明者らは、リンカーの付加が別の機構、恐らくは細胞内輸送または増強された毒素安定性に関連する機構によって細胞毒性を増強させているはずだと結論づけ、これらの可能性を探索し続けている。また、本発明者らの実験はＳＳ１Ｐの細胞毒性におけるフューリン切断の必要性も実証した。切断に必須のアルギニンをグリシンへと変化させたＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ中の点突然変異（ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ Ｒ２７９Ｇ、図１）は、フューリンによって切断されなかったタンパク質を生じた。このＲＩＴはすべての細胞に対して非常に乏しい活性を示し、試験した７つの細胞系のうちの６つに対して１２０μｇ／ｍｌの濃度で無視できる活性しか有していなかった。切断不可能な突然変異体はＡ４３１／Ｋ５細胞に対してのみ１μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０を示すが（表２）、それにもかかわらずその活性は激しく損なわれていた。さらに、この細胞系における人工的に高いメソテリンの発現は、メソテリンを自然に発現する系統を代表するものではない可能性がある。ＰＥ中毒経路におけるフューリン切断の必要性は最近疑問視されていたが（Ｍｏｒｌｏｎ−Ｇｕｙｏｔ Ｊら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、２００９、７７：３０９０〜９）、フューリンが中毒中に重要な役割を果たすという多くの証拠が存在する（Ｏｒｎａｔｏｗｓｋｉ Ｗら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００７、１１７：３４８９〜９７、Ｓｈｉｒｙａｅｖ ＳＡら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００７、２８２：２０８４７〜５３、Ｓａｒａｃ ＭＳら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、２００２、７０：７１３６〜９、Ｃｈｉｒｏｎ ＭＦら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９７、２７２：３１７０７〜１１、Ｇｕ Ｍら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、１９９６、６４：５２４〜７、Ｉｎｏｃｅｎｃｉｏ ＮＭら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９４、２６９：３１８３１〜５、およびＭｏｅｈｒｉｎｇ ＪＭら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９３、１８：２５９０〜４）。ここに提示する事例では、ＰＥ中毒は、フューリンプロセシングに適した部位が存在しなければ一般に失敗する。

【0228】

本発明者らの研究室により、Ｂ細胞エピトープの排除が原因で非常に低い免疫原性を有するＲＩＴであるＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍが最近生成された（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１１、１０８：５７４２〜７）。ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍは、ＰＥのＬＲ変異欠失およびドメインＩＩＩ中に追加の８個の点突然変異を含有する。これらの突然変異をＳＳ１Ｐ内に配置してＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを作製した。ＲＩＴに対する免疫応答の大多数はＰＥに向けられているため、本発明者らはＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍが同様に低下した免疫原性を示すことを予想する。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍが実際にヒトＢ細胞エピトープをＳＳ１Ｐから除去することを確認するために、本発明者らは、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭとＳＳ１Ｐを用いた処置を受けている間に中和抗体を発生した患者からの血清との反応性を検査した。試験した５つの事例のうち、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭはＳＳ１Ｐと比較して劇的に低下した抗原性を示した。この結果はＨＡ２２およびＨＡ２２−ＬＲ／８Ｍの観察と一貫しており（Ｏｎｄａ Ｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０１１、１０８：５７４２〜７）、本発明者らがＰＥに基づくＲＩＴ中の免疫原性エピトープの多くを同定および除去したことを示している。

【0229】

ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの細胞毒性を、いくつかの細胞系、マウス腫瘍モデル、および中皮腫を有する患者からの初代細胞において評価した。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍは、肺癌および中皮腫細胞系においてＳＳ１Ｐと比較して優れた細胞毒性を実証したが、卵巣癌系統に対しては乏しい活性であった。卵巣系統はＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳに感受性があるためこの結果は予想外であり、ＰＥの触媒ドメイン中の８個の点突然変異がＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの活性を妨害している可能性があることを示している。マウス腫瘍モデルでは、Ｌ５５異種移植腫瘍はＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭおよびＳＳ１Ｐと同様に応答したが、抗腫瘍効果を増強させるためにより高い用量のＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍを投与することができる。最後に、中皮腫を有する患者からの原発性悪性細胞に対して試験した際、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭはＳＳ１Ｐを超える顕著に増強された細胞毒性を示した。全体的に、本発明者らによるＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの評価は優れた細胞毒性活性を示した。

【0230】

高い活性および低い抗原性に加えて、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８ＭはＳＳ１Ｐと比較して低下した非特異的毒性を示した。ＲＩＴ誘導性毛細血管漏出症候群のラットモデルがこの差異を有効に実証している。ＰＢＳで処置したラットとＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍで処置したものとの間に有意差は存在しなかった一方で、ＳＳ１Ｐで処置したラットは、衰弱性の肺中の体液の蓄積を発生した。毛細血管漏出症候群（血液漏出症候群とも呼ばれる）は体液が毛細管から漏出した場合に起こり、血清アルブミン、体液保持の低下、浮腫、および体重増加をもたらす。この毒性は、ＰＥに基づくものを含めた様々な免疫毒素で処置した患者において頻繁に観察されており、恐らくは標的外れの内皮細胞損傷から生じる。ＲＩＴのターゲッティングされない毒性を制限することは、より用量を安全に投与することを可能にすることによって、その有効性を増強させる潜在性を有する場合がある。この実験は、本明細書中に記載の他のものと共に、ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍが診療所にとって優れた候補となることを示唆している。ＳＳ１−ＬＲ／ＧＧＳ／８Ｍの低い抗原性、低い非特異的毒性、および高い細胞毒性は、抗メソテリンＲＩＴの将来の開発において非常に有望である。

【0231】

本明細書中に記載した実施例および実施形態は例示目的のためのみであり、それに鑑みた様々な修正および変化が当業者に示唆され、本出願の精神および視野内ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書中で引用したすべての受託番号、出版物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにその全体で本明細書中に参考として組み込まれている。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]