特許 6170297 乾燥微生物菌体製剤の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6170297

(24)【登録日】2017年7月7日

(45)【発行日】2017年7月26日

(54)【発明の名称】乾燥微生物菌体製剤の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20170713BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 B

   C12N1/20 E

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2012-284745(P2012-284745)

(22)【出願日】2012年12月27日

(65)【公開番号】特開2013-198476(P2013-198476A)

(43)【公開日】2013年10月3日

【審査請求日】2015年12月21日

(31)【優先権主張番号】特願2012-55057(P2012-55057)

(32)【優先日】2012年2月24日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】397077760

【氏名又は名称】株式会社林原

(72)【発明者】

【氏名】工藤 尚樹

(72)【発明者】

【氏名】渋谷 孝

(72)【発明者】

【氏名】三宅 俊雄

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００４４９６５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００２／０６２９６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−２２３９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１９７８２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１９２４９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Castro H.P. et al，Journal of Applied Microbiology，１９９７年，Vol.82，pp.87-94

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

栄養物を含む滅菌された液体培地に乳酸菌を増殖させて主培養液を得る工程、得られた主培養液に安定化基剤として、トレハロースを終濃度１乃至３０％（ｗ／ｖ）で共存せしめ、４乃至１０時間追加培養し追加培養液を得る工程、得られた追加培養液を噴霧乾燥する工程、及び乾燥された乳酸菌製剤を採取する工程を含んでなる、生存率が８０％以上である乾燥乳酸菌製剤の製造方法。

【請求項2】

前記噴霧乾燥工程における乾燥風の乾燥室の入口温度が５０〜１３０℃、出口温度が２０〜７０℃であることを特徴とする請求項１記載の乾燥乳酸菌製剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乾燥微生物菌体製剤の製造方法、より詳細には、栄養物を含む滅菌された液体培地に微生物菌体を増殖させて主培養液を得る工程、次いで主培養液で得られる微生物菌体に安定化基材を共存せしめ追加培養し追加培養液を得る工程、更に追加培養液を微生物菌体懸濁液としてパルス燃焼式乾燥又は噴霧乾燥により乾燥し、安定化基剤を含有せしめた乾燥微生物菌体製剤を採取する工程を含んでなる乾燥微生物菌体製剤の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

カビ、酵母、枯草菌、乳酸菌などは食品微生物の代表であり、古くから酒、ビール、味噌、醤油、パン、納豆、漬け物などの各種醸造・発酵製品や、チーズ、ヨーグルト、乳酸菌飲料などの各種乳酸菌など、食品製造分野で利用されてきた。近年、その利用分野は多岐にわたり、微生物の種類によっては、プロバイオティクスとして、整腸、感染予防、免疫賦活、カルシウム吸収促進などの作用が期待され、健康食品、医薬品、化粧品などへの応用、更には、家畜、ペット動物を含む哺乳類、鳥類、魚類を対象とした飼料やサイレージの製造などへの応用が注目されている。

【0003】

従来より、有用な微生物を有効に活用する目的で、その菌体を乾燥し、安定な乾燥微生物菌体として長期間保存する方法に関する提案が数多くなされている。有用微生物を安定に乾燥する方法としては、凍結真空乾燥法がよく知られている。凍結真空乾燥法は、水分を比較的多量に含む又は含ませた微生物菌体又はその懸濁液を凍結する工程、凍結した試料を真空乾燥する工程、及び、乾燥した試料を粉砕・粉末化する工程からなっている。この方法は、低温条件下で生菌体を比較的安定に保ちつつ乾燥できることから、微生物の生存率を高く維持したまま乾燥する上で好適であり、食品分野をはじめとして幅広い分野で適用されている。しかしながら、この方法は、微生物菌体を凍結させるため、冷エタノール、液体窒素などの冷媒や凍結機を必要とし、また、大量生産に不向きであるなどの問題点があった。製品の品質及び生産コストの両方を考慮すると、微生物菌体の乾燥方法として、容易に行うことができ、且つ、菌の生存率を高く維持した乾燥微生物菌体を製造できる方法が求められていた。

【0004】

近年、含水原料の乾燥方法としてパルス燃焼式乾燥法が提案されている。この方法は、ジェットエンジン技術を基本としており、パルス式の爆発燃焼ガス雰囲気中に含水原料を導入し、熱風及び爆発時の物理的衝撃（超音波及び圧力を含む）により一瞬にして脱水・乾燥を行うもので、原料の焼け焦げや成分の化学変化を生じない効率的な乾燥方法として注目されている。（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３などを参照）。また、微生物菌体の乾燥に応用した例として、微生物菌体懸濁液を８０℃以下で乾燥する方法が知られている。しかしながら、この方法を採用した場合、主培養液で得られる微生物菌体懸濁液に対する乾燥菌体の生存率は向上したとは言え、その多くは２３乃至５８％であり、最高でも約６０％までしか得られておらず、更なる向上が望まれる。（特許文献４及び非特許文献１を参照）

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平３−１８６３０２号公報

【特許文献2】特許第３１１４８９３号公報

【特許文献3】特開２００１−８７７３７号公報

【特許文献4】特開２００６−１９７８９

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】大阪府環境農林水産総合研究所報告 第２号 ２１乃至２３（２００９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来用いられてきた微生物菌体の乾燥方法が有する種々問題点を解決するために為されたもので、とりわけ、微生物菌体懸濁液からの生存率の向上した高品質の乾燥微生物菌体製剤の製造方法を提供することを課題とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決するために、乾燥微生物菌体製剤の製造方法を改善することを目的として、乾燥機にかける微生物菌体の培養工程に着目し鋭意研究を続けてきた。

【0009】

その結果、パルス燃焼式乾燥又は噴霧乾燥にかける微生物菌体懸濁液として、従来のように液体培地中で、微生物を増殖させた培養液をそのまま乾燥処理するのではなく、これに安定化基剤を共存せしめ、更に比較的短時間、培養し得られる追加培養液を乾燥処理することにより、意外にも、乾燥時の微生物生存率を８０％以上、好ましくは９０％以上にも向上しうることを見出し、本発明を完成した。

【0010】

即ち、本発明は、パルス燃焼式乾燥又は噴霧乾燥にかける微生物菌体懸濁液として主培養液を直接用いるのではなく、主培養液で得られる微生物菌体に、新たに、糖質、蛋白質、ミネラル、ｐＨ調整剤などから選ばれる安定化基剤を共存せしめた後、比較的短時間追加培養し得られる追加培養液を用いることによって、主培養液を直接用いる場合とは違って、微生物の生存率を格段に向上させた高品質の乾燥微生物菌体製剤の製造方法を提供することによって上記の課題を解決するものである。

【発明の効果】

【0011】

本発明の乾燥微生物菌体製剤の製造方法によれば、パルス燃焼式乾燥又は噴霧乾燥をそのまま利用することにより、生存率の格段に優れた高品質の乾燥微生物菌体製剤を安価に、大量且つ安定して提供することがきわめて容易である。このようにして得られた乾燥微生物菌体製剤は、幅広い分野、とりわけ、食品分野、飼料分野などで有利に利用できる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明でいう微生物とは産業上有用な微生物である限り特に限定されず、例えば、カビ、酵母、放線菌、枯草菌、酢酸菌、乳酸菌、その他の細菌をも包含する。これら微生物は、菌体懸濁液の状態で、パルス燃焼式乾燥機にかけ乾燥することができる。本発明に用いる微生物菌体懸濁液としては、まず、栄養物を含む滅菌された液体培地に微生物菌体の種培養液を無菌的に植菌し、当該微生物を増殖させ主培養液を得、次いでこれに含まれる微生物菌体に安定化基剤を共存せしめ、比較的短時間追加培養し得られる追加培養液を用いる。主培養時の液体培地に用いられる栄養物としては、微生物菌体の増殖に適したものが好ましく、通常、炭素原、窒素原、ミネラル源及びビタミン源などや、更には、これらを複合的に含有している天然物由来物質などが適宜用いられる。炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、異性化糖、スクロース、マルトース、乳糖、マルトオリゴ糖、水飴、澱粉などがある。窒素源としては、例えば、尿素、アンモニウム塩、硝酸塩、アミノ酸、ペプチド類などがある。ミネラル源としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、硫酸塩、鉄塩、亜鉛塩、マンガン塩、銅塩などがある。ビタミン源としては、例えば、チアミン、リボフラビン、ビオチン、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどがある。天然物由来物質としては、例えば、酵母エキス、糖蜜、脱脂大豆、脱脂米ぬか、小麦フスマ、コーンスティープリカー、ビール粕、酒粕などがある。上記の栄養物を含む液体培地は、通常、１２１℃、２０分間オートクレーブして滅菌される。主培養培地に植菌される種培養液の量は、通常、０．５乃至５％（ｖ／ｖ）が採用される。主培養は、当該微生物の増殖に至適な条件、例えば、嫌気性、好気性、温度、ｐＨなどに配慮しつつ、通常、２０乃至６４時間程度行なわれる。

【0013】

本発明の乾燥原料に用いる微生物菌体懸濁液は、安定化基剤共存下での追加培養工程が必須である。この追加培養工程は主培養と違って、時間も比較的短時間、好ましくは４乃至１０時間程度で、微生物菌体の増殖がほとんどないか、若しくは、あったとしても極めてわずかである。換言すれば、追加培養工程は、乾燥工程までに微生物菌体を予め安定化基剤と共存、接触させ、わずか数時間培養環境下に保持することにより、乾燥微生物菌体の生存率を格段に向上させることのできる工程である。追加培養時に微生物菌体に共存せしめる安定化基剤としては、それの増殖を目的とするものではなく、追加培養工程、その後の乾燥工程、更には乾燥後の乾燥菌体の安定維持に寄与できるものであればよく、例えば、糖質、蛋白質、ミネラル、天然物由来物質、ｐＨ調整剤などから選ばれる物質、望ましくは、２種以上の物質が採用される。糖質としては、例えば、トレハロース、スクロース、グルコシルトレハロース、エルロース、シクロニゲロシルニゲロース、シクロマルトシルマルトース、シクロデキストリンなどの非還元オリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、澱粉、プルラン、マンナンなどの多糖類などが好適であり、これらから選ばれる１種又は２種以上の糖質が、濃度、好ましくは、１乃至３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、２乃至１０％（ｗ／ｖ）で用いられる。また、蛋白質としては、例えば、カゼイン、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、コラーゲンなどから選ばれる１種又は２種以上の蛋白質が、濃度、好ましくは、０．１乃至２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、０．５乃至１０％（ｗ／ｖ）で用いられる。またミネラルとしては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、マンガン塩などから選ばれる１種又は２種以上のミネラルが、濃度、好ましくは、０．０００１乃至６％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、０．０００１乃至３％（ｗ／ｖ）で用いられる。また、天然物由来物質としては、スキムミルク、酵母エキス、脱脂大豆、脱脂米ぬか、小麦フスマ、焼酎粕、ウィスキー粕などが好適であり、これらから選ばれる１種又は２種以上の天然物由来物質が、濃度、好ましくは、０．０１乃至２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、０．１乃至１０％（ｗ／ｖ）で用いられる。また、ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、塩酸、硫酸、リン酸、有機酸などが利用され、通常、好適環境として弱酸性乃至中性附近、より好ましくはｐＨ５．０乃至７．０の範囲に保持するのが望ましい。

【0014】

本発明の製造方法において用いる乾燥方法としては、パルス燃焼式乾燥又は噴霧乾燥を用いることができる。

【0015】

パルス燃焼式乾燥に用いることのできるパルス燃焼式乾燥機としては、パルス燃焼ガスを発生し、且つ、空気を吹き込むことによりパルス燃焼ガスの温度を調節できるものであるかぎり特に限定されることなく用いることができる。具体的なパルス燃焼式乾燥機としては、例えば、パルテック株式会社製、登録商標『ハイパルコン』などが挙げられる。微生物菌体を乾燥させる際の温度として、対象微生物の生存率を高く維持するには、できるだけ低い温度が好ましく、一方、低い温度ではその乾燥効率は低下する。好ましい乾燥温度は対象とする微生物の種類によって異なるものの、通常８０℃以下、望ましくは、５０乃至７０℃の範囲で行うのが好ましい。

【0016】

噴霧乾燥としては、公知の噴霧乾燥装置を用いることができ、高圧ノズル式、回転円板法、及び、圧縮空気を利用した２流路ノズル又は４流路ノズルのものを例示することができる。また、乾燥風の乾燥室の入口における温度は、通常１５乃至４００℃、好ましくは２５乃至２００℃、より好ましくは５０乃至１３０℃であり、乾燥風の乾燥室の出口における温度は、通常５乃至１３０℃、好ましくは１０乃至１００℃、より好ましくは２０乃至７０℃である。

【0017】

本発明の製造方法により採取される乾燥微生物菌体製剤は、微生物の生存率が高く維持された高品質な微生物菌体を含有せしめた粉末製剤である。本粉末製剤は、必要に応じて、顆粒、錠剤等に成形して、各種食品、医薬品、化粧品、飼料等の分野に有利に利用できる。

【0018】

以下、本発明を実験でより詳細に説明し、次いで若干の実施態様を実施例で説明する。

【0019】

＜乾燥微生物の生存率に及ぼす微生物菌体懸濁液及び安定化基剤の影響＞
微生物として乳酸菌を用い、菌体懸濁液の調製方法の違い及び安定化基剤共存の有無が与えるパルス燃焼式乾燥又は噴霧乾燥により得られる乾燥乳酸菌の生存率への影響について比較検討した。

【0020】

＜乳酸菌の培養と菌体懸濁液の調製＞
エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ） ＨＬ−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５０４）を乳酸菌用ＭＲＳ培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社販売）１０ｍｌに植菌し、３５℃で２４時間静置培養したものを第一の種培養液とした。別途調製した培地組成％（ｗ／ｖ）が酵母エキス２．０、粉飴５．０、リン酸二カリウム０．２、クエン酸二アンモニウム０．２、酢酸ナトリウム０．５、硫酸マグネシウム０．０２、硫酸マンガン０．００４ 及びフスマ（微粉）１．０からなる滅菌された液体培地２００ｍｌに第一の種培養液２ｍｌを無菌的に植菌し、同様に３５℃で２４時間静置培養し、第２の種培養液とした。次いで、この第２の培養液１００ｍｌを別途新たに調製した前記の培地組成からなる液体培地１０Ｌに対し無菌的に植菌し、３５℃で２４時間静置培養して、生菌数が３．６１×１０^９／ｍｌの主培養液を得た。

【0021】

＜乳酸菌懸濁液の乾燥方法＞
上記乳酸菌主培養液１０．１Ｌからそれぞれ均一になるように１Ｌずつ採取し下記の実験１乃至７に供した。それぞれの実験で調製した乳酸菌懸濁液を乾燥原料とし、パルス燃焼式乾燥機（「ハイパルコン小型テスト機」、パルテック株式会社製）を用い、温度６０℃、蒸発量２Ｌ／時間の条件で運転して、乳酸菌懸濁液を脱水、乾燥し、乾燥乳酸菌製剤を得た。

【0022】

＜実験１＞
主培養液１Ｌに、別途調製した水５００ｍｌにトレハロース５０ｇ、スキムミルク５０ｇ及び炭酸カルシウム５ｇを懸濁溶解させ加熱滅菌した安定化基材含有溶液を加え、３５℃、６時間追加培養を行い、得られる追加培養液を乾燥原料用乳酸菌懸濁液としてパルス燃焼式乾燥機にかけ、脱水・乾燥し、乾燥乳酸菌製剤として約１１０ｇを得た。

【0023】

＜実験２＞
主培養液１Ｌを、４℃にて遠心分離（８，０００ｒ．ｐ．ｍ． ２０分間）し、菌体を沈殿として回収した。この湿菌体に対し、更にトレハロース５０ｇ、スキムミルク５０ｇ及び炭酸カルシウム５ｇを水に懸濁・溶解した安定化基材含有溶液１．５Ｌを加え、湿菌体を均一に懸濁・分散させ、実験１と同様に追加培養した。得られる追加培養液を乾燥原料用菌体懸濁液として、実験１と同様にパルス燃焼式乾燥機にかけ脱水、乾燥し、乾燥乳酸菌製剤として約１０５ｇを得た。

【0024】

＜実験３＞
主培養液１Ｌに、実験１と同様に安定化基材含有溶液５００ｍｌを加え追加培養し、次いでこの培養液に対し、更にトレハロース３０ｇ、スキムミルク３０ｇ及び炭酸カルシウム３ｇを懸濁・溶解させ、得られる懸濁液を乾燥原料用乳酸菌懸濁液として、実験１と同様にパルス燃焼式乾燥機にかけ、脱水・乾燥し、乾燥乳酸菌製剤約１７０ｇを得た。

【0025】

＜実験４＞
主培養液１Ｌを、追加培養することなく、そのまま実験１と同様にパルス燃焼式乾燥機にかけ乾燥乳酸菌製剤約２０ｇを得た。

【0026】

＜実験５＞
主培養液１Ｌを、安定化基材を加えることなく、主培養と同じ培養条件で６時間追加培養し、これを実験１と同様にパルス燃焼式乾燥機にかけ乾燥乳酸菌製剤として約２０ｇを得た。

【0027】

＜実験６＞
主培養液１Ｌを、追加培養することなく、４℃にて遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し菌体を沈殿として回収した。この菌体に対し、更にトレハロース５０ｇ、スキムミルク５０ｇ及び炭酸カルシウム５ｇを水に懸濁・溶解した安定化基材含有溶液１．５Ｌを加え、菌体を均一に懸濁・分散させ得られる菌体懸濁液を実験１と同様にパルス燃焼式乾燥機にかけ、脱水・乾燥し、乾燥乳酸菌製剤として約１１０ｇを得た。

【0028】

＜実験７＞
主培養液１Ｌを、追加培養することなく、これに安定化基材としてトレハロース５０ｇ、スキムミルク５０ｇ及び炭酸カルシウム５ｇを懸濁・溶解させ、得られる菌体懸濁液を実験１と同様にパルス燃焼式乾燥機にかけ脱水・乾燥し、乾燥乳酸菌製剤として約１１０ｇを得た。

【0029】

＜生菌数測定と生存率（％）＞
乾燥原料である乳酸菌懸濁液及び各乾燥方法により得た乾燥乳酸菌製剤の生菌数は以下のようにして測定した。すなわち、乳酸菌培養液１ｍｌ又は乾燥乳酸菌製剤１ｇを適宜、滅菌水にて希釈した。次いで、希釈乳酸菌懸濁液１ｍｌを、常法に従い、予め滅菌しておいたＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（極東製薬株式会社販売）２０ｍｌと混釈してシャーレに播き、３５℃で２４時間静置することにより平板培養し、平板上に生じたコロニーの数を計測した。このコロニー数にそれぞれの試料における希釈倍率、及び、培養液量又は乾燥乳酸菌製剤の質量を乗じて総生菌数を算出した。また、乾燥原料である乳酸菌培養液の生菌数を基に、各乾燥乳酸菌製剤における乳酸菌の生存率を次式、生存率（％）＝（乾燥乳酸菌製剤の総生菌数／乾燥原料の総生菌数）×１００にて算出した。結果は表１に示す。

【0030】

【表1】

【0031】

表１の結果から明らかなように、対照の乾燥処理する前の主培養液１，０００ｍｌの総菌数が３．６１×１０^１２個であったのに対し、実験４の安定化基剤を含有させることなく、主培養液をそのまま乾燥処理したものの総菌数は、３．１８×１０^１１個、乾燥処理前に対する生存率は８．８％であり、また、実験５の安定化基剤を含有させることなく主培養液の培養をそのまま６時間延長した乾燥処理前の総菌数が３．３４×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は、２．５１×１０^１１個、乾燥処理前に対する生存率は７．５％である。実験４、５の結果から、追加培養の有無にかかわらず安定化基剤を含有させない培養液を乾燥したものの生存率は極めて低く、１０％未満である。また、実験６の主培養液を追加培養することなく遠心分離し、得られる菌体を安定化基剤含有溶液に懸濁させた乾燥処理前の総菌数が３．５０×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は１．５３×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は４３．７％であり、また実験７の主培養液を追加培養することなく、これに安定化基剤を加え懸濁・溶解させた乾燥処理前の総菌数が３．５５×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は、１．８６×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は５２．４％である。実験６、７の結果から、安定化基剤を含有させても追加培養せずに培養液を乾燥したものの生存率は４４乃至５２％程度である。一方、実験１の主培養液に安定化基剤を含有させ追加培養し、得られる追加培養液に含まれる、乾燥処理前の総菌数が４．１８×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は４．１２×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は９９．５％であり、また、実験２の主培養液を遠心分離し、この沈殿菌体を安定化基剤溶液に懸濁に安定化基剤を含有させ追加培養し、得られる追加培養液に含まれる乾燥処理前の総菌数が３．８２×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は３．４０×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は８９．０％であり、また、実験３の主培養液に安定化基剤を含有させ、追加培養し、得られる追加培養液に、更に安定化基剤を含有せしめた乾燥処理前の総菌数が４．０７×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は３．９５×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は９７．１％である。実験１、２、及び３の結果から安定化剤共存下で追加培養した培養液を菌体懸濁液としてパルス燃焼式乾燥機にかけ、得られる乾燥乳酸菌はその生存率が、８０％以上、好ましくは９０％以上にもなり格段に向上している。

【0032】

次いで、上記の結果を受け、乾燥方法をパルス燃焼式乾燥から噴霧乾燥に変更して同様に比較検討した。すなわち、実験１、４、５、６及び７において乾燥方法をパルス燃焼式乾燥から噴霧乾燥に変更した実験８、９、１０、１１及び１２を行い、菌体懸濁液の調製方法の違い及び安定化基剤共存の有無が与える噴霧乾燥により得られる乾燥乳酸菌の生存率への影響について比較検討した。乳酸菌の培養、菌体懸濁液調製、生菌数測定及び生存率（％）の算出については、パルス燃焼式乾燥の場合と同様に行い、表２に結果を示した。

【0033】

なお、噴霧乾燥は卓上型スプレードライヤー（ＳＤ−１型 東京理化器械株式会社製）を用い、乾燥風の乾燥室の入口での温度が１００℃、出口での温度が５０℃の条件で行った。

【0034】

【表2】

【0035】

表２の結果から明らかなように、対照の乾燥処理する前の主培養液１，０００ｍｌの総菌数が３．６２×１０^１２個であったのに対し、実験９の安定化基剤を含有させることなく、主培養液をそのまま乾燥処理したものの総菌数は、３．３０×１０^１１個、乾燥処理前に対する生存率は９．２％であり、また、実験１０の安定化基剤を含有させることなく主培養液の培養をそのまま６時間延長した乾燥処理前の総菌数が３．４２×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は、２．９０×１０^１１個、乾燥処理前に対する生存率は８．６％である。実験９、１０の結果から、追加培養の有無にかかわらず安定化基剤を含有させない培養液を乾燥したものの生存率は極めて低く、１０％未満である。また、実験１１の主培養液を追加培養することなく遠心分離し、得られる菌体を安定化基剤含有溶液に懸濁させた乾燥処理前の総菌数が３．４８×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は１．７５×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は５０．４％であり、また実験１２の主培養液を追加培養することなく、これに安定化基剤を加え懸濁・溶解させた乾燥処理前の総菌数が３．６０×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は、１．９３×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は５３．６％である。実験１１、１２の結果から、安定化基剤を含有させても追加培養せずに培養液を乾燥したものの生存率は５０乃至５４％程度である。一方、実験８の主培養液に安定化基剤を含有させ追加培養し、得られる追加培養液に含まれる、乾燥処理前の総菌数が４．１５×１０^１２個であったのに対し、これを乾燥処理したものの総菌数は４．００×１０^１２個、乾燥処理前に対する生存率は９６．４％であることから、乾燥法を噴霧乾燥にした場合においても安定化剤共存下で追加培養した培養液を菌体懸濁液として乾燥し、得られる乾燥乳酸菌はその生存率が９０％以上にもなり格段に向上している。

【0036】

以上の結果から、本発明の生存率を向上させた乾燥微生物を製造するためには、乾燥原料である微生物懸濁液を、主培養後に安定化基剤と共存、接触せしめる追加培養工程は、主培養とは違って、時間も比較的短時間、好ましくは、４乃至１０時間程度で、微生物菌体の増殖もほとんどないか、若しくは、あったとしてもわずかなものである。追加培養を経た微生物は、予め安定化基剤と共存、接触しつつ、わずか数時間培養環境下に保持されるだけで、その後の脱水・乾燥などで被るであろうストレス障害を上手に緩和若しくは回避する能力を獲得しているものと推察できる。本発明の方法により得られた乾燥微生物菌体は、生存率が高く、本来の活性を維持した高品質の乾燥微生物製剤であり、各種食品、医薬品、化粧品、飼料等向け微生物製剤として有利に利用できる。

【0037】

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

【実施例1】

【0038】

＜乾燥乳酸菌製剤＞
ラクトバチルス・プランタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＩＦＯ ３０７０を１０ｍｌの乳酸菌用ＭＲＳ培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社販売）に無菌的に植菌し、３５℃で２４時間静置液体培養したものを第２の種培養液とした。別途、同様に調製した２００ｍｌのＭＲＳ培地に種培養液１ｍｌを植菌し、同様に３５℃で２４時間静置培養したものを第２の種培養液とした。次いで、第２の種培養液を、別途調製した培地組成％（ｗ／ｖ）が、酵母エキス２．０、粉飴５．０、リン酸二カリウム０．２、クエン酸二アンモニウム０．２、酢酸ナトリウム０．５、硫酸マグネシウム０．０２、硫酸第一鉄０．００４及び脱脂大豆（微粉）１．０からなる滅菌された液体培地５.４Ｌに１％（ｖ／ｖ）の割合で植菌し、３５℃で２４時間静置培養し、主培養液を得た。主培養液の生菌数はｍｌ当り２．９２×１０^９個であった。この主培養液５Ｌに対し、別途調製したトレハロース５００ｇ、スクロース２５０ｇ、スキムミルク２５０ｇ、小麦フスマ（微粉）２５ｇ、炭酸カルシウム５０ｇを水２．５Ｌに懸濁溶解させ加熱滅菌した安定化基剤含有溶液を加え、３５℃、７時間追加培養を行い得られる追加培養液を乳酸菌懸濁液として実験で述べたのと同様の条件でパルス燃焼式乾燥機にかけ脱水乾燥し、乾燥乳酸菌製剤として約１，０５０ｇを得た。生菌数を測定したところ、乾燥にかける前の乳酸菌総数は１．２５×１０^１３個であり、これを乾燥したものの総菌数は１．２２×１０^１３個で、その生存率は約９８％であった。本品は、乳酸菌の生存率が高く、本来の活性を維持した高品質の乾燥乳酸菌製剤であり、食用又は飼料用乳酸菌などとして有利に利用できる。

【実施例2】

【0039】

＜乾燥酵母菌製剤＞
グルコース２ｇ、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン２ｇを含む液体培養２００ｍｌにパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉａｅ）を無菌的に植菌し、２７℃で４０時間好気的に培養したものを種培養液とした。別途、同様に調製した同組成の液体培地５Ｌに２％（ｖ／ｖ）の割合で植菌し、２７℃で４０時間好気的に培養し、主培養液を得た。主培養液の菌数はｍｌ当り２．０×１０^８個であった。この主培養液に対し、別途調製したトレハロース５００ｇ、スキムミルク２５０ｇ及び炭酸カルシウム１０ｇを水２．５Ｌに懸濁・溶解させ加熱滅菌した安定化基剤含有溶液を加え、２７℃で１０時間追加培養を行い、得られた追加培養液を酵母懸濁液として、実験で述べた同様の条件で、パルス燃焼式乾燥機にかけ乾燥酵母菌製剤として約７６０ｇを得た。生菌数を、公知のＹＭ寒天培地（和光純薬工業株式会社販売）を使用する方法により、乳酸菌の場合に準じて、測定したところ、乾燥にかける前の酵母菌総数は２．０×１０^１２個であり、これを乾燥したものの総菌数は１．９×１０^１２個で、その生存率は約９５％であった。本品は酵母菌の生存率が高く、本来の活性を維持した高品質の乾燥酵母菌製剤であり、食品又は飼料用酵母などとして有利に利用できる。

【実施例3】

【0040】

＜乾燥乳酸菌製剤＞
実施例１と同じ操作にて、安定化基剤を含有させ追加培養して得た乳酸菌懸濁液０．５Ｌを、卓上型スプレードライヤー（ＳＤ−１型 東京理化器械株式会社製）にて、乾燥風の乾燥室の入口での温度が１００℃、出口での温度が７０℃にて噴霧乾燥を行い、乾燥乳酸菌製剤として約３５０ｇ得た。生菌数を測定したところ、乾燥にかける前の乳酸菌総数は１．２３×１０^１３個であり、これを乾燥したものの総菌数は１．１９×１０^１３個で、その生存率は約９７％であった。本品は、乳酸菌の生存率が高く、本来の活性を維持した高品質の乾燥乳酸菌製剤であり、食用又は飼料用乳酸菌などとして有利に利用できる。

【実施例4】

【0041】

＜乾燥酵母菌製剤＞
実施例２と同じ操作にて、安定化基剤を含有させ追加培養して得た酵母懸濁液０．５Ｌを、実施例３と同じ操作にて噴霧乾燥し、乾燥酵母菌製剤として約３５０ｇを得た。生菌数を、実施例２に準じて、測定したところ、乾燥にかける前の酵母菌総数は１．９×１０^１２個であり、これを乾燥したものの総菌数は１．８×１０^１２個で、その生存率は約９６％であった。本品は酵母菌の生存率が高く、本来の活性を維持した高品質の乾燥酵母菌製剤であり、食品又は飼料用酵母などとして有利に利用できる。

【産業上の利用可能性】

【0042】

本発明の微生物菌体製剤の製造方法によれば、従来の方法では生存率を高く維持しつつ乾燥微生物菌体製剤を得ることができなかったところ、容易に、且つ、生存率良く乾燥することができ、微生物本来の活性がよく保持された高品質の乾燥微生物菌体製剤を容易に製造することができる。本発明の方法によって得られた乾燥微生物菌体製剤は幅広い分野、とりわけ食品分野、飼料分野などで有利に用いることができ、本発明は斯界に大きく貢献する発明であるといえる。