特許 6170838 癌処置用ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6170838

(24)【登録日】2017年7月7日

(45)【発行日】2017年7月26日

(54)【発明の名称】癌処置用ペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20170713BHJP

   A61K 38/08 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20170713BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20170713BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   A61K38/08

   A61P35/00

   A61P9/10

   A61P19/02

   A61P17/06

   A61P3/04

   A61P25/28

   A61P27/06

【請求項の数】7

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2013-545367(P2013-545367)

(86)(22)【出願日】2011年12月21日

(65)【公表番号】特表2014-501746(P2014-501746A)

(43)【公表日】2014年1月23日

(86)【国際出願番号】EP2011073606

(87)【国際公開番号】WO2012085096

(87)【国際公開日】20120628

【審査請求日】2014年12月17日

(31)【優先権主張番号】10196278.5

(32)【優先日】2010年12月21日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】12/974,958

(32)【優先日】2010年12月21日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512317032

【氏名又は名称】ジーン シグナル インターナショナル ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(72)【発明者】

【氏名】アル−ムハンマド，サルマン

(72)【発明者】

【氏名】コリン，シルビ

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第００／０７５１６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平１１−５００６０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０３５００３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０５８０１１４９（ＵＳ，Ａ）

【文献】 The Journal of Biological Chemistry，１９９２年，Vol.267,No.36，pp.25958-25966

【文献】 The EMBO Journal ，１９９４年，Vol.13,No.10，pp.2313-2321

【文献】 BUNNEY TOM D，PHOSPHOINOSITIDE SIGNALLING IN CANCER : BEYOND PI3K AND PTEN，NATURE REVIEWS，２０１０年 ５月，V10 N5，P342-352

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３７のアミノ酸配列からなる、ペプチド。

【請求項2】

配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、薬学的組成物。

【請求項3】

癌を処置するための請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

血管新生関連疾患を処置するための請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記血管新生関連疾患が、眼の新生血管疾患、アテローム性動脈硬化、関節炎、乾癬、肥満、およびアルツハイマー病を含む群から選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記眼の新生血管疾患が、静脈うっ血性網膜症、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、老人性黄斑変性、角膜血管新生、および新生血管緑内障を含む群から選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

少なくとも１種の細胞傷害性薬物、化学療法薬剤または抗癌剤をさらに含む、請求項３に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチド、このペプチドを含む組成物、ならびに癌の処置のためのその使用法に関する。

【背景技術】

【0002】

神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）およびインスリンなどの多くの成長因子およびホルモンは、細胞表面チロシンキナーゼ受容体の相互作用を介したシグナルを媒介する。リガンド結合により開始する膜を通過する細胞外シグナルの伝達は、細胞内の標的生化学経路を最終的に制御する複合シグナリング事象の増殖を引き起こす。

【0003】

ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋｓ）は、ホルモンおよび成長因子受容体の細胞質ドメインならびに癌遺伝子産物に関連して発見されたヘテロ二量体脂質キナーゼの広範囲にわたるファミリーを意味する。これらの受容体の下流のエフェクターとして作用するＰＩ３Ｋｓは、受容体の刺激を補充し、かつイノシトールのリン酸化誘導体産物を介した第２のメッセンジャーシグナリング経路の活性化を媒介する（Ｆｒｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．，１９９４，１２２６：２３７−２６８）。

【0004】

クラスＩＰＩ３Ｋｓは、８５ｋＤａの調節サブユニット（ｐ８５）および１１０ｋＤａの触媒サブユニット（ｐ１１０）を含むＳＨ２ドメインから構成され、イノシトール環のＤ３の位置でホスホチジルイノシトールのリン酸化を触媒する（Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１６５５−１６５７ （２００２）、 Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：１５３−８ （１９９６））。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ＰＩ３Ｋｓは、細胞伝達、有糸分裂誘発、タンパク質輸送、細胞生存および増殖、ＤＮＡ合成、アポトーシス、神経突起成長ならびにインシュリン促進グルコース輸送（Ｆｒｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．，１９９４，１２２６，２３７−２６８参照）を媒介する成長因子を含む幅広い生物学的影響において中心的役割を果たす。多くの異なるシグナリング経路は、これらの無数の事象を直接制御するというよりも、活性複合体を標的とするなどのより一般的であり、促進性のあるシグナリング経路を提供することを示唆する。

【0006】

ＰＩ３Ｋｓシグナリング中に含まれるタンパク質の阻害剤は、処置薬として提案されてきた。このような阻害剤の例は、ワートマニン、デメトキシビリジン、クエルセチンおよびＬＹ２９４００２を含む。これら阻害剤は、まずこのｐ１１０サブユニットを標的とし、かつ臨床試験での使用を限定する毒性および短い半減期を表す。

【0007】

これらの阻害剤に対する代替的な試みが、ｓｉＲＮＡによるｐ８５の特異的阻害などのＲＮＡ干渉により重要な経路タンパク質の発現を特異的に阻害してきた。

【0008】

本発明の目的は、ＰＩ３Ｋｓシグナリングの阻害剤の発見であった。好ましくは、この阻害剤は、以下の、ｓｉＲＮＡより高い安定性、細胞浸透／拡散の利点を有し、ｓｉＲＮＡより長い半減期を有する。

【0009】

驚くべきことに、この発明者は、生体内で癌を低減することのできる以下に定義されるリン酸化ＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフを有するペプチドを発見した。

【0010】

モチーフＹＭＸＭの中のホスホチロシン残基を有する配列は、ＳＨ２ドメインに結合することが知られている。ｐ８５は、２つのＳＨ２ドメインを有することが記述され、かつモチーフＹＭＸＭの中のホスホチロシン残基とこれら２つのＳＨ２ドメインとの結合が、ＰｔｄＩｎｓ（３）、ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ_２およびＰｔｄＩｎｓ （３，４，５）Ｐ_３を生成するホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）のリン酸化触媒を引き起こすｐ８５およびｐ１１０を活性化させることが記述される。

【0011】

リン酸化ＹＭＸＭモチーフを含む合成ペプチドで、生体外でＰＩ３Ｋを活性する技術が知られている（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９ （７）：１−４）。ＰＩ３Ｋシグナリングの活性化は、癌の発達に関連することが知られており、したがって当業者は、癌処置の際にＰＩ３Ｋシグナリングを活性化するペプチドを使用して導入を行わない。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の１つの目的は、リン酸化ｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフを含むペプチドである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ（配列番号）１）。
式中、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅであり、Ｘ_２は、いずれかのアミノ酸であり、
このペプチドは、４〜５０のアミノ酸を含み、
このペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０，配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３または配列番号６４ではない。

【0013】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸を含み、かつ、リン酸化ＧｐＹＸ_１ＦＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１５）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0014】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸を含み、かつ、リン酸化ＥｐＹＸ_１ＮＸ_１Ｄモチーフ（配列番号１９）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0015】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸を含み、かつ、リン酸化ＧｐＹＸ_１ＰＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１４）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0016】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸を含み、かつ、リン酸化ＤｐＹＸ_１ＦＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１６）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0017】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸を含み、かつ、リン酸化ＧｐＹＸ_１ＭＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１７）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0018】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸を含み、かつ、リン酸化ＤｐＹＸ_１ＮＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１８）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0019】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸を含み、かつ、リン酸化ＤｐＹＸ_１ＴＸ_１Ｑモチーフ（配列番号２０）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0020】

本発明の別の目的は、リン酸化ｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフ（配列番号１）を含む４〜５のアミノ酸のペプチドを含む医薬組成物であり、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅであり、Ｘ_２は、いずれかのアミノ酸である。

【0021】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＧｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｓモチーフ（配列番号３３）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅであり、Ｘ_２はＰ、Ｆ、またはＭである。

【0022】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＤｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｓモチーフ（配列番号３４）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅであり、Ｘ_２はＰまたはＮである。

【0023】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＥｐＹＸ_１ＮＸ_１Ｄモチーフ（配列番号３５）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0024】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＤｐＹＸ_１ＴＸ_１Ｑモチーフ（配列番号３６）を含み、各Ｘ_１は独立してＭまたはＮｌｅである。

【0025】

本発明の別の目的は、癌を処置するための上述の薬学的組成物である。

【0026】

本発明の別の目的は、血管形成関連疾患を処置するための上述の医薬組成物である。

【0027】

本発明の別の目的は、少なくとも１種の細胞傷害性薬物、化学療法薬剤または抗癌剤をさらに含む上述の医薬組成物である。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】生体外の血管新生アッセイの各画像（１８時間後に撮影された画像）である。

【図2】ＩＲＳ−１による酵素ＰＩ−３Ｋの制御サブユニット（ｐ８５）の動員上のチロシンリン酸化および非リン酸化ペプチドの影響を表す。

【図3】（Ａ）は、ｍＴｏｒの活性上のＧＳ−０およびＧＳ−１の影響を表し、（Ｂ）はｍＴｏｒの活性上のＧＳ−０およびＧＳ−２の影響を表す。

【図4】８ｍｇ／ｋｇのＧＳ−０または８ｍｇ／ｋｇのＧＳ−１において、ビヒクルで処理されたマウス関連ＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍の平均腫瘍量曲線である。

【図5】８ｍｇ／ｋｇのＧＳ−０または８ｍｇ／ｋｇのＧＳ−２において、ビヒクルで処理されたマウス関連ＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍の平均腫瘍量曲線である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

定義
本明細書で使用されるように、用語「ペプチド」は、２つのアミノ酸から５０のアミノ酸のアミノ酸配列を意味する。好ましくは、このペプチドは、３〜４５のアミノ酸、より好ましくは、３〜４０のアミノ酸、さらに好ましくは４〜３０のアミノ酸を含む。特に好ましい実施形態は、５〜１５のアミノ酸または５〜１０のアミノ酸などの、４〜２０のアミノ酸を含むペプチドを含む。本明細書に使用されるように、「アミノ酸」は、当業者によく知られている完全な名称、それらアミノ酸の３つの文字のコード、またはそれらアミノ酸の１つの文字のコードにより表される。ペプチドのアミノ酸残基は、以下の、フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦ、ロイシンはＬｅｕまたはＬ、イソロイシンはＩｌｅまたはＩ、メチオニンはＭｅｔまたはＭ、バリンはＶａＩまたはＶ、セリンはＳｅｒまたはＳ、プロリンはＰｒｏまたはＰ、スレオニンはＴｈｒまたはＴ、アラニンはＡｌａまたはＡ、チロシンはＴｙｒまたはＹ、ヒスチジンはＨｉｓまたはＨ、グルタミンはＧｌｎまたはＱ、アスパラギンはＡｓｎまたはＮ、リシンはＬｙｓまたはＫ、アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤ、グルタミン酸はＧｌｕまたはＥ、システインはＣｙｓまたはＣ、トリプトファンはＴｒｐまたはＷ、アルギニンはＡｒｇまたはＲ、およびグリシンはＧｌｙまたはＧの通り、省略される。用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸および合成アミノ酸の両方、ならびにＤアミノ酸およびＬアミノ酸の両方を含む。「標準アミノ酸（Ｓｔａｎｄａｒｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」または「天然に存在するアミノ酸」は、天然に存在するペプチド中に見出された一般的な２０の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸残基」は、天然のペプチド源から合成して調製するまたは由来することに関係のない標準アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を意味する。たとえば、ナフチルアミンは、合成を容易にするためトリプトファンに置換することができる。置換することのできる他の合成アミノ酸は、限定するものではないが、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、Ｌ−α−ヒドロキシリシルおよびＤ−α−メチルアラニル、Ｌ−α−メチルアラニルなどのα−アミノ酸、β−アミノ酸類、ならびにイソキノリルを含む。

【0030】

本明細書に使用される「アミノ酸」は、同様に、限定するものではないが、塩、（アミド類などの）アミノ酸誘導体および置換基を含む、化学的に修飾されたアミノ酸をも含む。本発明のペプチド内に含まれ、かつ特にカルボキシまたはアミノ末端のアミノ酸は、活性に逆影響することなくペプチドの循環半減期を変化することのできる他の化学基とのメチル化、アミド化、アセチル化または置換により修飾することができる。さらに、ジスルフィド結合は、本明細書のペプチド中に存在しても、またしなくてもよい。

【0031】

本発明のペプチドは、天然の標準アミノ酸類または非標準アミノ酸類を含んでもよい。ペプチド模倣薬は、以下の修飾、ｉ）１つ以上のペプチド−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−結合（接続）が、−ＣＨ_２−カルバメート結合（−ＣＨ_２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−）、ホスホン酸結合、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）結合、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）結合、−ＣＨ_２−二級アミン結合などの非ぺプチジル結合またはアルキル化ペプチジル結合（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−）により置換されたペプチドであって、このＲは、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルである、ペプチド修飾と、ｉｉ）Ｎ末端が、−ＮＲＲ^１基、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−ＮＲＳ（Ｏ）^２Ｒ基、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基に誘導化され、このＲおよびＲ^１は、水素またはＲおよびＲ^１が両方水素ではない条件でＣ_１−Ｃ_４アルキルであるペプチド修飾と、ｉｉｉ）Ｃ末端が、Ｃ（Ｏ）Ｒ^２に誘導化され、Ｒ^２が、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシおよび−ＮＲ^３Ｒ^４〜なる群から選択され、Ｒ^３およびＲ^４が、独立して、水素およびＣ_１−Ｃ_４アルキルからなる群から選択される修飾と、を有するペプチドを含む。

【0032】

本明細書に使用されている用語「保存アミノ酸の置換」は、以下の５つ、すなわち、
I．Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙである微小の、脂肪性、非極性またはわずかに極性の残基と、
II．Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎの極性、負電荷の残基およびこれらのアミド類と、
III．Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓの極性、正電荷残基と、
IV．Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓの、大型の脂肪性、非極性残基
V．Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの大型の芳香族残基と、
の群のうちの１つの中の交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）アミノ酸残基として定義される。

【0033】

本明細書で使用される用語「処置する」は、特定の障害または条件の予防法、もしくは特定の障害または条件に関連する兆候の軽減、および／またはこの兆候の除去および防止を含む。「予防的」処置は、ある疾患の兆候を表さないまたは、この疾患に関連する病態を発達させるリスクを減少させる目的で、疾患の早期兆候のみを表す対象へ投与する処置である。この「治療的」処置は、これらの兆候を減少させるまたは除去する目的のための病態の兆候を表す対象へと投与する処置である。化合物の「薬学的有効量」は、この化合物が投与される対象に有効であるよう十分に提供される化合物の量である。
本発明

【0034】

本発明の一目的は、リン酸化ｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフ（配列番号１）を含む。

【0035】

本発明によると、チロシンＹはリン酸化（ｐＹ）である。

【0036】

本発明によると、リン酸化ｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフ中の各アミノ酸Ｘ_１は、独立して、Ｍ（メチオニン）またはＮｌｅ（ノルロイシン）に対応する。したがって、本発明のペプチドは、リン酸化ｐＹＭＸ_２Ｍモチーフ、ｐＹＭＸ_２Ｎｌｅモチーフ、ｐＹＮｌｅＸ_２Ｍモチーフ、またはｐＹＮｌｅＸ_２Ｎｌｅモチーフを含む。好ましくは、Ｙ＋１位置のＸ_１は、独立して、ＭまたはＮｌｅであり、かつＹ＋３位置のＸ_１は、Ｍである。

【0037】

本発明により、リン酸化ｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフ中のアミノ酸Ｘ_２は、いずれかのアミノ酸に対応し、好ましくは、天然に存在するいずれかのアミノ酸に対応する。好ましくは、Ｘ_２は、Ｐ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、ＫおよびＦからなる群から選択される。より好ましくは、Ｘ_２は、Ｆ、Ｎ、およびＴからなる群から選択される。

【0038】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、ＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶ（配列番号２）、ＮＧＤｐＹＭＰＭＳＰＧＶ（配列番号３）、ＰＮＧｐＹＭＭＭＳＰＳＧ（配列番号４）、ＴＧＤｐＹＭＮＭＳＰＶＧ（配列番号５）、ＳＥＥｐＹＭＮＭＤＬＧＰ（配列番号６）、ＫＫＨＴＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶＡ（配列番号７）、ＲＫＧＮＧＤＧｐＹＭＰＭＳＰＫＳＶ（配列番号８）、ＫＫＲＶＤＰＮＧｐＹＭＭＭＳＰＳＧＳ（配列番号９）、ＫＫＫＬＰＡＴＧＤｐＹＭＮＭＳＰＶＧＤ（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１０）、ＫＫＧＳＥＥｐＹＭＮＭＤＬＧＰＧＲ（配列番号１１）、ＫＫＳＲＧＤｐＹＭＴＭＱＩＧ（配列番号１２）、ＫＫＳＲＧＮｐＹＭＴＭＱＩＧ（配列番号１３）、ＥＥＥＹＭｐＰＭＥＤＬＹ （配列番号２９）、ＤＧＧｐＹＭＤＭＳＫＤＥ（配列番号３０）、ＫＫＫＥＥＥＥＥＥｐＹＭＰＭＥＤＬ（配列番号３１）、ＫＫＳＲＧＤｐＹＮｌｅＴＭＱＩＧ（配列番号３２）、ＴＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶ（配列番号４１）、ＤＰＮＧｐＹＭＭＭＳＰＳＧ（配列番号４３）、ＧＮＧＤｐＹＭＰＭＳＰＫＳ（配列番号４４）、ＲＥＮＥｐＹＭＰＭＡＰＱＩＨ（配列番号４５）、ＥＥＥＥｐＹＭＰＭＥＤＬＹＬ（配列番号４６）、ＴＤＤＧｐＹＭＰＭＳＰＧＶＡ（配列番号４７）、ＧＮＧＤｐＹＭＰＭＳＰＫＳＶ（配列番号４８）、ＳＤＧＧｐＹＭＤＭＳＫＤＥＳ（配列番号４９）、ＲＤＧｐＹＭＴＭＱＩＧ（配列番号５０）、ＩＤＶｐＹＭＩＭＶＫ（配列番号５１）、ＤＧＧｐＹＭＤＭＳＫＤＥ（配列番号５２）、ＨＳＤｐＹＭＮＭＴＰＲ（配列番号５３）、ＮＧＤｐＹＭＰＭＳＰＫＳ（配列番号５４）、ＧＤｐＹＭＰＭＳＰＫＳ（配列番号５５）、ＤｐＹＭＰＭＳＰＫＳ（配列番号５６）、ｐＹＭＰＭＳＰＫＳ（配列番号５７）、ｐＹＭＰＭＳＰ（配列番号５８）、ｐＹＭＰＭＳ（配列番号５９）、ｐＹＭＰＭ（配列番号６０）、ｐＹＭＰＭＳＰＡＳ（配列番号６１）、ｐＹＭＰＭＳＡＫＳ（配列番号６２）、ｐＹＭＰＭＡＰＫＳ（配列番号６３）またはｐＹＭＡＭＳＰＫＳ（ 配列番号６４）ではない。

【0039】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、ＧＮＧＤｐＹＭＰＭＤＰＫＳ（配列番号４２）ではない。

【0040】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、４〜５０のアミノ酸を含む。

【0041】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、４〜４０のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、４〜３０のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜２５のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜２０のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜１８のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜１５のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５か１４のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜１３のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜１２のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜１１のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜１０のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜９のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜８のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜７のアミノ酸を含む。本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６のアミノ酸を含む。

【0042】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５〜５０のアミノ酸、５〜４０のアミノ酸、５〜３０のアミノ酸、５〜２５のアミノ酸、５〜２０のアミノ酸、５〜１８のアミノ酸、５〜１５のアミノ酸、５〜１４のアミノ酸、５〜１３のアミノ酸、５〜１２のアミノ酸、５〜１１のアミノ酸、５〜１０のアミノ酸、５〜９のアミノ酸、５〜８のアミノ酸、５〜７のアミノ酸、６のアミノ酸からなる、あるいは実質的にこれらからなる。

【0043】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、５０、４０、３０、２０のアミノ酸の長さ、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６のアミノ酸の長さを有し、かつリン酸化ＧｐＹＸ_１ＰＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１４）を含み、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0044】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５０、４０、３０、２０のアミノ酸の長さを有し、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６のアミノ酸の長さを有し、かつリン酸化ＧｐＹＸ_１ＦＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１５）を含み、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0045】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５０、４０、３０、２０のアミノ酸の長さ、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６のアミノ酸の長さを有し、かつリン酸化ＧｐＹＸ_１ＭＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１７）であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0046】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５０、４０、３０、２０のアミノ酸の長さ、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６のアミノ酸の長さを有し、かつリン酸化ＤｐＹＸ_１ＮＸ_１Ｓモチーフ（配列番号１８）であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0047】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５０、４０、３０、２０のアミノ酸の長さ、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６のアミノ酸の長さを有し、かつリン酸化ＥｐＹＸ_１ＮＸ_１Ｄモチーフ（配列番号１９）であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0048】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、５０、４０、３０、２０のアミノ酸の長さ、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６のアミノ酸の長さを有し、かつリン酸化ＤｐＹＸ_１ＴＸ_１Ｑモチーフ（配列番号２０）であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0049】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、ＰＤＳＳＴＬＨＴＤＤＧｐＹＸ_１ＰＸ_１ＳＰＧＶＡＰＶＰＳＧＲＫＧＳＧ（配列番号２１）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＰＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0050】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、ＰＤＳＳＴＬＨＴＤＤＧｐＹＸ_１ＦＸ_１ＳＰＧＶＡＰＶＰＳＧＲＫＧＳＧ（配列番号２２）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＦＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0051】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、ＰＶＰＳＧＲＫＧＳＧＤｐＹＸ_１ＰＸ_１ＳＰＫＳＶＳＡＰＱＱＩＩＮＰＩ（配列番号２３）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＰＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0052】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、ＲＲＨＰＱＲＶＤＰＮＧｐＹＸ_１ＭＸ_１ＳＰＳＧＧＣＳＰＤＩＧＧＧＰＳ（配列番号２４）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＭＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0053】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、ＳＧＧＫＬＬＰＣＴＧＤｐＹＸ_１ＮＸ_１ＳＰＶＧＤＳＮＴＳＳＰＳＤＣＹ （配列番号２５）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＮＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0054】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、ＰＲＥＥＥＴＧＴＥＥｐＹＸ_１ＫＸ_１ＤＬＧＰＧＲＲＡＡＷＱＥＳＴＧＶ（配列番号２６）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＫＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0055】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、ＰＲＥＥＥＴＧＴＥＥｐＹＸ_１ＮＸ_１ＤＬＧＰＧＲＲＡＡＷＱＥＳＴＧＶ（配列番号２７）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＮＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0056】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、ＡＶＰＳＳＲＧＤｐＹＸ_１ＴＸ_１ＱＭＳＣＰＲＱＳＹＶＤＴＳＰＡＡＰＶ（配列番号２８）またはリン酸化ｐＹＸ_１ＴＸ_１モチーフを含む２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６のアミノ酸断片であり、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅである。

【0057】

当業者によく知られている化学合成または酵素を使用する合成により合成的に本明細書に記述されるペプチドを作製することができる。代替的に、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を、タンパク質発言ベクター内へ導入し、適切な宿主生物（たとえば、バクテリアまたは昆虫細胞など）中に作製し、その後精製する。追加的なポリペプチド（タグ）を、ペプチドを精製しまたは識別する目的で添加することができる。タンパク質タグは、たとえば、ポリペプチドをマトリックスへと高い親和性で吸収させ、かつその後に、いずれかの重要な範囲へ溶出する複合体なしにマトリックスを適切なバッファーで厳密に洗浄させ、かつ実質的に吸収した複合体を選択的に溶出させる。当業者に知られているタンパク質タグの例は、（Ｈｉｓ）_６タグ、ａＭｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、親和性のあるキチン結合を有するインテインタグ、またはマルトース−結合タンパク質（ＭＢＰ）タグである。これらのタンパク質タグを、Ｎ−末端、Ｃ−末端および／または内部に位置することができる。

【0058】

本発明の１つの目的は、上述されるペプチドであり、このペプチドは修飾される。

【0059】

本明細書中に提供されるペプチドを当業者によく知られている方法により修飾することができる。

【0060】

たとえば、このペプチドを、１つ以上のリン酸塩、酢酸塩などの官能基、または多様な脂質および糖の添加により修飾することができる。本発明のペプチドは、同様に、ペプチド誘導体として存在することができる。この用語「ペプチド誘導体」は、アミノ基（−ＮＨ−）を有する化合物を意味し、より詳細には、ペプチド結合を意味する。ペプチドは、置換されたアミド類とみなされてもよい。アミド基のように、このペプチド結合は、共鳴安定化の高い度合を示す。このペプチド中のＣ−Ｎ単結合は、概して約４０％の二重結合性を有し、かつＣ＝Ｏ二重結合は、約４０％の単結合性を有する。「保護基」は、保護されていない官能基を含む（タンパク質分解などの）望ましくない反応を防ぐ基である。アミノ保護基の特定の例は、ホルミル、トリフルオロアセチル、ベンジルオキシカルボニル、（オルト−またはパラ−）クロロベンジルオキシカルボニルおよび（オルト−またはパラ−）ブロモベンジルオキシカルボニルなどの置換型ベンジルオキシカルボニル、ならびにｔ−ブトキシカルボニルおよびｔ−アミルオキシカルボニル（ａｍｉｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）などの脂肪性オキシカルボニルを含む。このアミノ酸のカルボキシル基を、エステル基内への転換を介して保護することができる。このエステル基は、ベンジルエステル、メトキシベンジルエステルなどの置換型ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル、またはｔ−ブチルエステルなどのアルキルエステルを含む。保護基の必要がない場合であっても、ニトロもしくはトシル、メトキリベンゼンスルホニルまたはメチレンスルホニル（ｍｅｓｉｔｙｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）などのアリールスルホニルによりこのグアニジノ部を保護することができる。イミダゾールの保護基は、トシル、ベンジルおよびジニトロフェニルである。トリプトファンのインドール基を、ホルミルにより保護してもまた保護しなくてもよい。

【0061】

これらペプチドの修飾において、特にこれらの生体内での生存を改善することを目的とする。１つの型の修飾は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のＮまたはＣ末端への添加である。ＰＥＧは、水との高い溶解度、溶液中の高移動度、および低免疫原性などの、ペプチドを理想のキャリヤとする多くの特性を有することが当業者に知られている。この修飾は、同様に、エキソペプチダーゼからのペプチドをも保護し、したがって、生体内で全体の安定性を増加させる。

【0062】

エンドペプチターゼまたはエキソペプチダーゼによるペプチドの分解に現在使用される他の修飾は、アセチル化またはグリコシル化などのＮ−末端修飾、ペプチドの特定の部位の天然ではないアミノ酸（β―アミノおよびα―トリフルオロメチルアミノ酸）のアミド化および使用などのＣ−末端修飾を含む。

【0063】

ペプチドの分子の寸法を増加させる別の代替的方法は、ヒトγイムノグロブリンのＦｃドメインに対するペプチドの遺伝的融合またはアルブミンへのペプチドの融合である。

【0064】

本発明の別の目的は、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされた本明細書に上述される少なくとも１つのペプチドを含む薬学的組成物であり、このペプチドは、リン酸化ｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフ（配列番号１）を含み、各Ｘ_１は、独立してＭまたはＮｌｅであり、Ｘ_２は、いずれかのアミノ酸であり、好ましくは、天然に存在するいずれかのアミノ酸である。

【0065】

用語「薬学的に許容可能な」は、過度の毒性がなく、哺乳類に対して投与されてもよい化合物および組成物を意味する。したがって、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、動物、好ましくはヒトに投与される場合に、有害な、アレルギー性、または他の有害な反応を生成しない賦形剤である。この薬学的に許容可能な賦形剤は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。ヒトへの投与の場合の調製は、ＦＤＡの生物局の基準で要求される、無菌性、発熱性、総括的安全性および純度の基準と合致するべきである。

【0066】

適切な賦形剤は、水、生理食塩水、リンガー液、ブドウ糖溶液およびエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩、酢酸塩、ゼラチン、コラーゲン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、植物油などの溶液を含む。たとえば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどの適切な保存剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤および緩衝剤を追加的に含んでもよい。

【0067】

本明細書の組成物に使用されてもよい薬学的に許容可能な賦形剤の別の例は、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、置換型植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩またはプロタミン、硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、蜜蝋、ポリエチレン‐ポリオキシプロピレン‐ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂などの塩または電解質を含む。

【0068】

１つの実施形態において、本発明の組成物は、界面活性剤（たとえば、ヒドロキシプロピルセルロース）、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体性ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒および分散媒などのキャリヤ、それらとのの適切な混合物、たとえば、ピーナッツ油およびごま油などの植物油、糖または塩化ナトリウムなどの等張剤、たとえば、レシチンなどのコーティング剤、たとえば、ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤、たとえば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムクロロブタノール、チメロサールなどの保存剤、たとえば、ホウ酸、炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの緩衝液、たとえば、デキストラン４０、デキストラン７０、ブドウ糖、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなどの等張化剤、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ尿素などの酸化防止剤および保存剤、たとえば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロクサマー２８２、およびチロキサポールなどの非イオン性湿潤剤および非イオン性清澄剤、たとえば、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース（ｙｄｒｏｘｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどの粘度変性剤などのいくつかの賦形剤を含んでいてもよい。

【0069】

１つの実施形態において、この組成物は薬学的に許容可能な塩のペプチドを含んでもよい。

【0070】

薬学的に許容可能な塩の例は、無機塩基を有する塩、有機塩を有する塩、無機酸を有する塩、有機酸を有する塩、塩基性アミノ酸または酸性アミノ酸などを有する塩を含む。無機塩を有する塩の例は、ナトリウム塩、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、ならびにアンモニウム塩を含む。有機塩基を有する塩の例は、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、およびＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンを有する塩を含む。無機酸を有する塩の例は、塩酸、ホウ酸、硝酸、硫酸、およびリン酸を有する塩を含む。有機酸を含む塩の例は、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸を有する塩を含む。塩基性アミノ酸を有する塩の例は、アルギニン、リシンおよびオルニチンを有する塩を含む。産生アミノ酸を有する塩の例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を有する塩を含む。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｐ １４１８，１９８５に開示され、その全開示が、本明細書に参照により組み込まれる。

【0071】

本発明の１つの実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＧｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｓモチーフ（配列番号３３）を含み、各Ｘ_１は独立して、ＭまたはＮｌｅであり、Ｘ_２は、Ｐ、Ｆ、またはＭである。

【0072】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＤｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１Ｓモチーフ（配列番号３４）を含み、各Ｘ_１は独立して、ＭまたはＮｌｅであり、Ｘ_２は、ＰまたはＮである。

【0073】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＥｐＹＸ_１ＮＸ_１Ｄモチーフ（配列番号３５）を含み、各Ｘ_１は独立して、ＭまたはＮｌｅである。

【0074】

本発明の別の実施形態において、このペプチドは、６〜２０のアミノ酸およびリン酸化ＤｐＹＸ_１ＴＸ_１Ｑモチーフ（配列番号３６）を含み、各Ｘ_１は独立して、ＭまたはＮｌｅである。

【0075】

本発明の別の目的は、癌を処置または癌処置に使用される上述のペプチドまたは上述の薬学的組成物である。

【0076】

本発明の別の目的は、癌を処置する方法であり、薬学的に有効な量の本発明のペプチドの少なくとも１つを必要に応じて対象に投与することを含む方法である。

【0077】

本発明により、この対象は、いずれかの動物、好ましくはヒトである。

【0078】

「薬学的に有効な用量または量」は、望ましい生物学的結果となる十分な値の用量を意味する。この結果は、ある疾患の兆候、症状、または原因の軽減または生物学的系の他の望ましい変化であり得る。好ましくは、この用量または量は、癌細胞を死滅させることにより癌の状態を軽減させるのに十分であり、癌の成長および／または転移を阻害する結果となるために十分な量を意味する。

【0079】

本発明のペプチド、組成物、および方法により処置される癌は、限定するものではないが、
心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；
肺：非小細胞肺癌、気管支原性肺癌（扁平細胞、未分化微小細胞（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ）、未分化大細胞、腺癌）、肺胞性（細気管支）細胞腫、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様の過誤腫（ｃｈｏｎｄｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｈａｍａｒｔｏｍａ）、中皮腫；
胃腸管系：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（細胞腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（腺管癌ｄｕｃｔａｌ、腺癌、膵島細胞腺腫、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍）、小腸造影（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、結腸、結腸直腸、直腸；
泌尿生殖路：腎臓（腺癌、Ｗｉｈｎ腫瘍（Ｗｉｈｎ’ｓ ｔｕｍｏｒ）［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胚性癌腫、奇形腫、絨毛癌、肉腫、間細胞腫、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；
肝臓：肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；
骨：骨肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫、多発性骨髄腫、悪性骨巨細胞腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨症（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ））、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫および巨細胞腫；
神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；
婦人科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢胞腺癌、分類不能癌］、悪性顆粒膜／莢膜細胞腫（ｇｒａｎｕＥｏｓａ−ｔｈｅｃａｌ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒｓ）、セルトリー・ライデッグ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫ｍ）、腟（腎明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状横紋筋肉腫［胎児型横紋筋肉腫］、卵管［細胞腫］）；
血液学的：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫［悪性リンパ腫］；
皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子性異形成母斑（ｍｏｌｅｓ ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｎｅｖｉ）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；および
副腎：神経芽細胞腫を含む。

【0080】

本発明のペプチド、組成物および方法により処置される癌は、限定するものではないが、乳癌、前立腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、脳の癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、皮膚癌、小腸癌、大腸癌、咽頭癌、頭頸部癌、口腔癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および血液性癌を含む。

【0081】

本発明のペプチド、組成物および方法により処置される癌は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌および非小細胞肺癌を含んでもよい。

【0082】

本発明のペプチド、組成物および方法により処置される癌は、乳癌、結腸癌、（結腸直腸癌）、および肺癌（非小細胞肺癌）を含んでもよい。

【0083】

本発明のペプチド、組成物および方法により処置される癌は、リンパ腫または白血病を含んでもよい。

【0084】

本発明のペプチド、組成物および方法により処置される癌は乳癌、膀胱癌、結腸癌、口腔腫瘍、進行性腫瘍、ヘアリーセル白血病、黒色腫、進行行性頸部腫瘍（ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ）、転移性腎細胞癌、非ホジキンスリンパ腫，転移性乳癌、乳腺癌、進行性黒色腫、膵臓、胃、神経膠芽腫、肺、卵巣、非小細胞肺癌、前立腺、小細胞肺癌、腎細胞癌、多様な固形腫瘍、多発性骨髄腫、転移性前立腺癌、悪性神経膠腫、腎癌、リンパ腫、不応性転移性疾患、難治多発性骨髄腫（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）、子宮頸癌、カポジ肉腫、反復性未分化神経膠腫（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｇｌｉｏｍａ）、および転移性結腸癌などの血管形成関連疾患を含んでも良い。

【0085】

本発明のペプチド、組成物および方法は、腫瘍細胞の転移の疾患をも防ぎ、または減少させる。

【0086】

さらに本発明の範囲内に含まれるものは、血管形成疾患に関連する疾患を処置または予防する方法であり、本発明のペプチドの薬学的有効量を処理するような必要のある対象へ投与することを含む。

【0087】

血管形成関連疾患は、新生血管疾患（たとえば、静脈うっ血性網膜症、糖尿病網膜症、未熟児網膜症（網膜静脈閉塞症、老人性黄斑変性、角膜血管新生、新生血管緑内障）、アテローム性動脈硬化、関節炎、乾癬、肥満およびアルツハイマー病を含む。

【0088】

さらに本発明の範囲内に含まれるものは、再狭窄、炎症、自己免疫疾患およびアレルギー／喘息などの過剰増殖性障害を処置または防止する方法であり、本発明の薬学的有効量のペプチドの処理を必要とするような対象に投与することを含む。

【0089】

本発明により、本発明のペプチドは、傾向的、局所的、または、皮下注射、経皮吸収または筋肉内注射、物質徐放貯蔵部の埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｅｐｏｔｓ）、静脈内注射、鼻腔内投与などを含む、非経口的方法により投与されてもよい。

【0090】

本発明の１つの実施形態において、本発明のペプチドは、眼球内に投与されてもよい。本明細書に使用される「眼球内に」は、眼球内の投与経路によりという意味を有する。１つの実施形態において、眼球内の投与経路は、目の内部に投与するものであり、好ましくは、目の後嚢部内へ、より好ましくは、硝子体内へ投与するものである。好ましい眼球内経路は、硝子体内注射である。本明細書に使用される、「目の内側」は、限定するものではないが、眼球内に見出されるいずれかの機能的（例えば、視覚のための）または構造的組織または眼球内部を部分的にまたは完全に整列させる組織または細胞相を含む。領域の特定の例は、前眼房、後眼房、硝子体腔、脈絡膜、網膜黄斑、および網膜ならびに後眼部の領域または部位を血管新生するまたは神経支配する血管および神経を含む。

【0091】

本発明の１つの実施形態において、本発明のペプチドは、たとえば、本発明のペプチドまたは組成物を含む点眼用溶液の点眼投与または眼の洗浄などの目への局所的な投与により投与されてもよい。

【0092】

本発明により、本発明のペプチドを含む組成物は、水性溶液、乳濁液、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであってもよい。

【0093】

本発明によりこのペプチドは、この組成物のミリリットルまたはグラムあたり約０．０００１〜５００ｍｇ、好ましくは、この組成物のミリリットルまたはグラムあたり約０．００１〜５０ｍｇ、より好ましくはこの組成物のミリリットルまたはグラムあたり約０．０１〜５ｍｇ、さらに好ましくはこの組成物のミリリットルまたはグラムあたり約０．１ｇ〜１ｍｇの量の本発明のペプチドを含む。

【0094】

本発明により、この組成物は、組成物の総容積の約０．０１重量％〜９０重量％、好ましくは、約０．１重量％〜１０重量％、より好ましくは約１〜５重量％の量の本発明のペプチドを含む。

【0095】

本発明の別の実施形態において、本発明の少なくとも１つのペプチドを含む組成物は、少なくとも１種の細胞傷害性薬物、化学療法剤または抗癌剤をさらに含んでもよい。

【0096】

本発明の別の実施形態において、本発明の少なくとも１つのペプチドを含む組成物は、細胞傷害性薬物、化学療法剤または抗癌剤の少なくとも１つと組み合わせて使用してもよい。

【0097】

抗癌剤の例は、限定するものではないがたとえば、シクロホスファミド（ＣＴＸ；ｅ．ｇ． ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ；ｅ．ｇ． ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、シスプラチンｃ（ＣｉｓＰ；ｅ．ｇ． ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））、オキサリプラチン（ｅ．ｇ． ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、ブスルファン（ｅ．ｇ． ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ），ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃなどのアルキル化作用を有するアルキル化剤（複数可）、たとえば、メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；ｅ．ｇ． ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（ｔｈｉｏｃｇｕａｎｉｎｅ）（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（ｅ．ｇ． ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などの代謝抵抗物質、たとえば、アクチノマイシン Ｄ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；ｅ．ｇ． ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンなどの抗菌剤、たとえば、たとえば、ビンクリスチン（ＶＣＲ）およびビンブラスチンなどのビンカアルカロイド類、ならびに、たとえば、パクリタキセル（ｅ．ｇ． ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびパクリタキセル誘導体などの他の抗腫瘍剤、細胞分裂阻害剤、デキサメタゾン（ＤＥＸ；ｅ．ｇ． ＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標））などのグルココルチコイド、およびたとえばプレドニゾンなどの副腎皮質ステロイド、たとえばヒドロキシ尿素などのヌクレオシド酵素阻害剤、たとえば、アスパラギナーゼなどのアミノ酸枯渇酵素（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）、ロイコボリン、フォリン酸、ラルチトレキセド、および他のフォリン酸誘導体および類似の多様な抗腫瘍剤を含む。また、
以下の薬剤、アミホスチン（ｅ．ｇ． ＥＴＨＹＯＬ（登録商標）），ダクチノマイシン、メクロレタミン（（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ｌｏｒｎｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｌｉｐｏ）（ｅ．ｇ． ＤＯＸＩＬ（登録商標））、ゲムシタビン（ｅ．ｇ． ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、リポダウノルビシン塩酸塩（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ ｌｉｐｏ）（ｅ．ｇ． ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（ｅ．ｇ．ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ ７−エチルｌ−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、ミトキサントロン、トポテカン、リュープロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、またはクロラムブシルも、同様に追加的に使用されてもよい。

【0098】

化学療法的レジメンにおける上述の細胞傷害性薬物、化学療法剤および他の抗癌剤の使用は、一般的に、癌利用技術において特徴づけられる。これらを本明細書で使用するにあたり、毒性を管理し、かついくらか調節して投与経路および用量を制御するため、同一の考察下で使用した。一般的なこの細胞傷害性薬物の有効な用量は、製造者により推奨される範囲内であり得、かつ、動物モデルにおける生体外反応（複数可）により示され、最大約１桁の大きさの濃度または量にまで低減することができる。したがって、この実際の用量は、内科医の判断、患者の状態、および初代悪性培養細胞または抗癌剤を投与された組織試料（ｈｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ）の生体外反応の反応性または適切な動物モデルにおいて得られた反応性に基づく処置法の有効性に依存するものである。

【0099】

本発明は、以下の実験の詳細からよりよく理解されるものである。しかしながら、開示される特定の方法および結果が、以下に続く請求項をより完全に開示するための本発明の単なる例示であり、いずれの方法も限定する意図を持たないことが、当業者に理解される。

【実施例】

【0100】

実施例１
材料および方法。
材料
ＥＧＭ−２ＭＶ培地は、Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）製である。カルシウム―マグネシウムのないＰＢＳ、トリプシン―ＥＤＴＡ（バーセネート液）は、Ｅｕｒｏｂｉｏ（Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で調製された。マトリゲルは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ， Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。細菌用ＬＢ培地、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔおよび高忠実度のＰｌａｔｉｎｕｍ ＨＩＦＩ酵素を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。Ｒｎｅａｓｙミニキット、ＱｉａｑｕｉｃｋおよびＱｉａｐｒｅｐミニプレップを、ロシュ・アプライド・サイエンスのＱｉａｇｅｎ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。ＧｅｎｅＣｕｓｔにより、化学的修飾としてＮ−末端のアセチル化およびＣ−末端のアミド化を有するよう化学的にペプチドを合成した。すべてのペプチドは、ＨＰＬＣ−精製ステップを対象とし、少なくとも９５％の純度を有する凍結乾燥した粉末として準備された。

【0101】

方法
血管新生アッセイ
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）の血管新生をＡｌ−Ｍａｈｍｏｏｄ ｅｔ ａｌ（２００９，ＪＰＥＴ，２００９；５８：９３３）により開示されるマトリゲルアッセイを使用して生体外で導入した。本方法は、内皮細胞の分化に基づき、マトリゲルマトリックス上に毛管構造を形成する。マトリゲルは、調製されたＥＨＳマウス腫瘍であり、このことは、IV型コラーゲン、エンタクチン、プロテオヘパラン硫酸、および他の成長因子を含む基底膜タンパク質の複合混合物を表す。

【0102】

短時間に、２５０μｌのマトリゲルを２４ウェル培養プレートに移し、３７℃で３０分間インキュベートし、マトリックス溶液を凝固させる。完全なＥＧＭ−２ＭＶ増殖培地において増殖させたＨＭＥＣをトリプシンにより収集し、同一の増殖培地において懸濁し、７０ ０００個の細胞を含む５００μｌを、ペプチドが存在する、またはペプチドが存在しない各ウェル中の凝固させたマトリゲルの上に添加した。３７℃で１８〜２４時間、５％のＣＯ_２を含む加湿された大気中に維持した。内皮チューブ形成を倒立光学顕微鏡下で発見し、かつ撮影した。

【0103】

増殖アッセイ
５０００のＨＭＥＣ［５０００細胞／増殖培地（ｍｌ）］を９６−ウェル細胞培養グレードμプレート（１００μ／ウェル）中に播種し、３７℃で４２時間、指示される最終濃度の指示されるペプチドとインキュベートした。この細胞増殖を、メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）を使用して測定した。ＭＴＴ（シグマ）を、５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中に溶解し、この溶液を（０．２２μｍで）濾過し、かつ１０μｌを９６ウェルμプレートの各ウェルに添加した。３７℃のインキュベートから３時間後、この上清を廃棄し、各ウェルに１００μｌのＤＭＳＯを添加することにより溶解した。５７０℃での光学密度を、ＫＣ４（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｃｏｌｍａｒ Ｆｒａｎｃｅ）に連結したμＱｕａｎｔμリーダーを使用して測定し、この細胞増殖の阻害を、（最大の増殖反応を表す処置していないＨＵＶＥＣのウェルから得られたＯＤ）対照と比較して測定した。このブランクとしてのウェルのＯＤ値（細胞のないウェルから得られるＯＤ値）を引いてこのＯＤを計測し、対照（最大増殖反応、すなわち１００％を表す処置していないＨＵＶＥＣのウェルから得られたＯＤ）と比較して細胞増殖の阻害を計測した。

【0104】

タンパク質定量
血清欠乏性ＨＭＥＣを、異なる濃度のペプチドと、３７℃で２４時間インキュベートし、６時間５％のＣＯ_２下においた。氷冷したＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をタンパク質抽出バッファー（ＰＥＢ）（ｐＨ ７．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ トリトン、２５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロ−リン酸塩、１ｍＭ Ｎａ_３Ｖｏ_４、１μｇ／ｍｌロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）、１μＭ ＰＭＳＦ）で懸濁した。このタンパク質含有物をブラッドフォード法により測定した。

【0105】

細胞処置および免疫沈降法
ＥＧＭ−２ＭＶ（８０％のコンフルエンス）において増殖したヒトＥＣを本発明のペプチドまたはビヒクルと、指定された時間、インキュベートし、冷却されたＰＢＳにおいて３回洗浄し、４度で３０分間インキュベートすることにより、直接、氷冷した溶解バッファー（ｐＨ ７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５μｇ／ｍｌ ロイペプチン，１μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡおよび１μｇ／ｍｌ アプロチニン）中に溶解した。細胞溶解物を１０４ｇで１０分間スピン（遠心）し、不溶性物質を廃棄し、かつ上清をブラッドフォード法により測定したタンパク質含有物を調整した。２５μｌのタンパク質Ｇプラスアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で細胞溶解物（１ｍｌ）を３０分間プレクリアし、その後、タンパク質に２μｇの示された抗体を添加し、１時間インキュベートした。この免疫複合体を、タンパク質アガロースビーズでプルダウンし、このビーズを溶解バッファーで３回洗浄した。この免疫沈降物を還元条件下でＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％ビス―トリスゲル電気泳動により分離した。この膜を０．１％のｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５％（ｗ／ｖ）脱脂乳で１時間ブロッキングした。この膜を、示された第１の抗体で２時間インキュベートした後、３回洗浄し、適切なＨＲＰ−接合型第２の抗体でインキュベートし、強化した化学発光、ＥＣＬ ｐｌｕｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｖｅｌｉｚｙ，Ｆｒａｎｃｅ）により明らかにした。

【0106】

結果
以下のペプチドを検出した。
・ＧｐＹＭＦＭＳ ＧＳ−１ （配列番号３７）
・ＥｐＹＭＮＭＤ ＧＳ−２ （配列番号３８）
・ＤｐＹＭＴＭＱ ＧＳ−３ （配列番号３９）
・ＮＹＩＣＭＧ ＧＳ−０ （対照としてチロシン非リン酸化ペプチドを使用した） （配列番号４０）

【0107】

生体外上での本発明によりリン酸化ｐＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_１モチーフを有するペプチドの影響
設計されたチロシンリン酸化および非リン酸化ペプチドを、生体外の血管新生上での影響を試験した。各ペプチドのＨＭＥＣおよび５００μｇ／ｍｌの最終濃度を使用して生体外血管新生アッセイの結果を、図１に表示した。これらの結果において、対照として使用したチロシン非リン酸化ペプチドＧＳ−０は、生体外血管新生阻害活性を有さなかったかつ／または無視できるほど小さいものであったことを示した（図１）。同様に、同一の図中に表示される結果において、チロシンリン酸化微小ペプチドＧＳ−１、ＧＳ−２、およびＧＳ−３は、生体外血管新生阻害活性を有することを示した。

【0108】

ｐ８５関連上のＩＲＳ−１に対するペプチドの影響
ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化が、酵素ＰＩ−３Ｋの調節サブユニット（ｐ８５）への会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を引き起こし、かつこの事象が、この後の重要な酵素活性を増加させることが広く認められているように、ＩＲＳ−１による酵素ＰＩ−３Ｋの調節サブユニット（ｐ８５）の動員におけるチロシンリン酸化および非リン酸化ペプチドの影響を見出した。そのため、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を、チロシンリン酸化および非リン酸化ペプチド（最終濃度が、５００μｇ／ｍｌのペプチド）とインキュベートし、続いて細胞を溶解させ、タンパク質ＩＲＳ−１を免疫沈降した。この免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分解し、タンパク質を膜に移し、この膜を、抗−ｐ８５ ＰＩ３Ｋモノクローナル抗体で免疫ブロットした。

【0109】

図２に表示された結果において、対照として使用したチロシン非リン酸化ペプチドＧＳ−０がＩＲＳ−１により酵素ＰＩ３Ｋの調節サブユニット（ｐ８５）の動員上の影響がないかつ／または無視できるほど小さいことを示す。同様に、同一の図に示された結果において、チロシンリン酸化ＧＳ−２が、ＩＲＳ−１により酵素ＰＩ３Ｋの調節サブユニット（ｐ８５）の動員上で適度な阻害効果を有し、かつチロシンリン酸化ペプチドＧＳ−１が、ＩＲＳ−１により酵素ＰＩ３Ｋの調節サブユニット（ｐ８５）の動員上で非常に強い阻害効果を有することを示す。

【0110】

ＨＭＥＣ中のｍＴＯＲ上のペプチドの影響
ＧＳ−０およびＧＳ−１とのインキュベートの後のＨＭＥＣ中のｍＴＯＲの状態を調査した。ＨＭＥＣ（ビヒクル）が、ｍＴＯＲの重要なレベルを持つという結果を示した（図３ＡおよびＢ、抗―ｍＴｏｒ抗体、Ｏｚｙｍｅ２９７１（Ｓｅｒ２４４８））。ペプチドＧＳ−０とインキュベートしたＧＳ−０ＨＭＥＣ細胞系は、インキュベートした細胞として、等量のｍＴＯＲを有する。対照的に、ＧＳ−１およびＧＳ−２とそれぞれインキュベートしたＨＭＥＣ細胞系は、ビヒクルまたはＧＳ−０とインキュベートしたＨＭＥＣと比較してより少ない量のｍＴＯＲを有する。
実施例２

【0111】

方法
細胞培養
Ｈ４６０細胞系は、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）と適合する細胞（学）を有する。細胞を、５％のＣＯ_２を含む加湿した３７℃の大気中において、１０％のＦＣＳを含むＭＥＭ培地中で増殖させた。マイコプラズマがないことを、ＰＣＲマイコプラズマ検出キット（タカラ）を使用して確認した。

【0112】

ヌードマウスの腫瘍異種移植片および処置
すべての実験は、Ｇｅｎｏｐｏｌｅ’ｓ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより概説され、すべての実験を会の動物ケアのガイドラインに従って実行した。生後５〜６週間の雌のＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（ｎ＝３０）を使用した。この動物を、１２時間光を当て、１２時間暗闇に置くスケジュールで、層流キャビネット内で病原体フリーの条件下で飼育し、オートクレーブした標準的な固形飼料および水を自由に与えた。このＮＣＩ−Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬ細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）から獲得し、細胞を、１μＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＲＰＭＩ１６４０培地において増殖した。（２００μｌのＨＢＳＳ中１０^７細胞の）腫瘍細胞を、マウスの側腹部に皮下注射した。移植後、腫瘍量をノギス（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｌｉｐｅｒ）により測定し、Ｂａｌｓａｒｉ Ａ ｅｔ ａｌ． （Ｂａｌｓａｒｉ Ａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４０：１２７５−１２８１）に記述されるよう測定した。約１５０ｍｍ^３の腫瘍量がこの動物に無作為に存在し、かつ、この動物を５つの動物の５つのグループに分けた。対照マウス（グループ１）に、毎日ビヒクル（１０％のＤＭＳＯを含む緩衝生理食塩水）を腹腔内に注射した。ＧＳ−０をビヒクル内に溶解し、かつ（グループ２）に毎日（１２回）腹腔内に注射した。ＧＳ−１をビヒクル内に溶解し、かつ（グループ３）に毎日（１２回）腹腔内に注射した。腫瘍量および体重を処置期間（１２日）中、１日おきに測定した。

【0113】

ペプチドの調製および希釈
対象ペプチドＧＳ−０と同様に、ＧＳ−１を、ＤＭＳＯ中に可溶化し、この結果として得られる溶液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１０倍に希釈し、１０ｍｌのＤＭＳＯを含むＰＢＳ１ｍｌあたり１ｍｇの濃度にした。この濃度で、すべてのペプチドがＰＢＳ中１０％のＤＭＳＯ中に可溶となった。

【0114】

結果
ＮＣＩ−Ｈ４０を有するマウスの平均体重および毒性の課題
体重管理および毒性の結果を、表１に示す。このビヒクルでは、マウスの行動に影響がなく、体重増加は標準的であり、どの動物も早期に死亡しなかった。８ｍｇ／ｋｇの用量で試験物質ＧＳ−０およびＧＳ−１で処置した過程の間、これらのマウスに毒性および体重の減少が見られなかった。

【表1】

【0115】

生体外腫瘍増殖
平均腫瘍量の結果を、図４および表２に示す。ビヒクル、ＧＳ−０およびＧＳ−１で処置したマウスの平均腫瘍量の時間ごとの進化に関して、処置期間（１２日）中、３つのグループの動物の間に、統計的にみて重要な差異があったことを示した。処置の終わりには、ビヒクルおよびＧＳ−０で処置されたグループの平均腫瘍量は、お互いに、統計学的に差（ｐ＞０．０５）がない１１６５．６４＋７６９．２２（ｎ＝５）および１１１４．８３＋５３４．５０（ｎ＝５）ｍｍ^３であり、このことは、腫瘍ＮＣＩ−Ｈ４６０の生体内増殖上で重要な影響がない（ｐ＞０．０５）ことを示す。

【0116】

マウスの平均腫瘍量の時間ごとの進化に関して、ＧＳ−１で処置したマウスが、処置期間（１２日）において、ビヒクルおよびＧＳ−０で処置したマウスと統計学的に異なる平均腫瘍量を有することを示した（図４および表２）。グループ１、ビヒクル処置動物（１１６５．６４＋７６９．２２ｍｍ^３；ｎ＝５）と比較して、ＧＳ−１（２３４．９８＋６９．２２ｍｍ^３；ｎ＝５）で処置したグループの動物において、平均腫瘍量が非常に低減した。このビヒクルで処置したグループおよびＧＳ−１で処置したグループの間の差異は、推計的有意性（ｐ＝０．０００４）に達した。ＧＳ−１（２３４．９８＋６９．２２ｍｍ^３；ｎ＝５）で処置したグループおよびＧＳ−０（１１１４．８３＋５３４．５０ｍｍ^３；ｎ＝５）で処置したグループの間の差異は、同様に、統計学的に異なり（ｐ＜０．０５）、このことは、ペプチドＧＳ−１が、腫瘍ＮＣＩ−Ｈ４６０の生体内増殖において非常に重要かつ有力な影響（ｐ＝０．０００４）を有することを示す。したがって、ペプチドＧＳ−１の有力な生体内抗腫瘍活性で、１２日間連続で８ｍｇ／ｋｇのＧＳ−１を毎日注射することが、生体内の腫瘍増殖を約８０％阻害することが認識されることを示す。

【表2】

結果として、ペプチドＧＳ−１で、生体内のＮＣＩ−Ｈ４６０に対して統計的に重要かつ有力な抗腫瘍活性を示す。
実施例３

【0117】

方法
細胞培養
Ｈ４６０細胞系は、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ） と適合する細胞（学）を有する。この細胞を、５％のＣＯ_２を含む加湿した３７℃の大気中において、１０％のＦＣＳを含むＭＥＭ培地中で増殖させた。マイコプラズマがないことを、ＰＣＲマイコプラズマ検出キット（タカラ）を使用して確認した。

【0118】

ヌードマウスの腫瘍異種移植片および処置
すべての実験は、Ｇｅｎｏｐｏｌｅ’ｓ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより概説され、すべての実験を会の動物ケアのガイドラインに従って実行した。生後５〜６週間の雌のＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（ｎ＝３０）を使用した。この動物を、１２時間光を当て、１２時間暗闇に置くスケジュールで、層流キャビネット内で病原体フリーの条件下で飼育し、オートクレーブした標準的な固形飼料および水を自由に与えた。このＮＣＩ−Ｈ４６０ヒトＮＳＣＬ細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）から獲得し、細胞を、１μＭのピルビン酸ナトリウムを追加したＲＰＭＩ１６４０培地において増殖した。（２００μｌのＨＢＳＳ中１０^７細胞の）腫瘍細胞を、マウスの側腹部に皮下注射した。移植後、腫瘍量をノギス（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｌｉｐｅｒ）により測定し、Ｂａｌｓａｒｉ Ａ ｅｔ ａｌ． （Ｂａｌｓａｒｉ Ａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４０：１２７５−１２８１）に記述されるよう測定した。約１５０ｍｍ^３の腫瘍量がこの動物に無作為に存在し、かつ、この動物を５つの動物の５つのグループに分けた。対照マウス（グループ１）に、毎日ビヒクル（１０％のＤＭＳＯを含む緩衝生理食塩水）を腹腔内に注射した。ＧＳ−０をビヒクル内に溶解し、かつ（グループ２）に毎日（１２回）腹腔内に注射した。ＧＳ−２をビヒクル内に溶解し、かつ（グループ３）に毎日（１２回）腹腔内に注射した。腫瘍量および体重を処置期間（１２日）中、１日おきに測定した。

【0119】

ペプチドの調製および希釈
対象ペプチドＧＳ−０と同様に、ＧＳ−２を、ＤＭＳＯ中に可溶化し、この結果として得られる溶液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１０倍に希釈し、１０ｍｌのＤＭＳＯを含むＰＢＳ１ｍｌあたり１ｍｇの濃度にした。この濃度で、すべてのペプチドがＰＢＳ中１０％のＤＭＳＯ中に可溶となった。

【0120】

結果
ＮＣＩ−Ｈ４０を有するマウスの平均体重および毒性の課題
体重管理および毒性の結果を、表３に示す。このビヒクルでは、マウスの行動に影響がなく、体重増加は標準的であり、かつどの動物も早期に死亡しなかった。８ｍｇ／ｋｇの用量で試験物質ＧＳ−０およびＧＳ−２で処置した過程の間、これらのマウスに毒性および体重の減少が見られなかった。

【表3】

【0121】

生体内腫瘍増殖
この平均腫瘍量の結果を図５および表４に示す。ビヒクル、ＧＳ−０およびＧＳ−２で処置したマウスの平均腫瘍量の時間ごとの進化に関して、処置期間（１２日）中、３つのグループの動物の間に、統計的にみて重要な差異があったことを示した。処置の終わりの時点では、ビヒクルおよびＧＳ−０で処置されたグループの平均腫瘍量は、お互いに、統計学的に差（ｐ＞０．０５）がない、１１６５．６４＋７６９．２２（ｎ＝５）および１１１４．８３＋５３４．５０（ｎ＝５）ｍｍ^３であり、このことは、腫瘍ＮＣＩ−４６０の生体内の増殖に重要な影響がない（ｐ＞０．０５）ことを示す。

【0122】

同様に、マウスの平均腫瘍量の時間ごとの進化に関して、ＧＳ−２で処置したマウスが、処置期間（１２日）において、ビヒクルおよびＧＳ−０で処置したマウスと統計学的に異なる平均腫瘍量を有することを示した（図４および表２）。グループ１、ビヒクル処置動物（１１６５．６４＋７６９．２２ｍｍ^３；ｎ＝５）と比較して、ＧＳ−２（２９７．２８＋１４２．６７ｍｍ^３；ｎ＝５）で処置したグループの動物において、平均腫瘍量が非常に低減した。このビヒクルで処置したグループおよびＧＳ−１で処置したグループの間の差異は、推計的有意性（ｐ＝０．００６５）に達した。ＧＳ−２（２９７．２８＋１４２．６７ｍｍ^３；ｎ＝５）で処置したグループおよびＧＳ−０（１１１４．８３＋５３４．５０ｍｍ^３；ｎ＝５）で処置したグループの間の差異は、同様に、統計学的に異なり（ｐ＜０．０５）、このことは、ペプチドＧＳ−２が、腫瘍ＮＣＩ−Ｈ４６０の生体内増殖において非常に重要かつ有力な影響（ｐ＝０．００６５）を有することを示す。したがって、ペプチドＧＳ−１の有力な生体内抗腫瘍活性で、１２日間連続で８ｍｇ／ｋｇのＧＳ−２を毎日注射することが、生体内の腫瘍増殖を約８０％阻害することが認識されることを示す。

【表4】

結果として、ペプチドＧＳ−２で、生体内のＮＣＩ−Ｈ４６０に対して統計的に重要かつ有力な抗腫瘍活性を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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