知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特許6174018ＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法及びＡＭＰＫタンパク質活性化剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6174018
(24)【登録日】2017年7月14日
(45)【発行日】2017年8月2日
(54)【発明の名称】ＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法及びＡＭＰＫタンパク質活性化剤
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20170724BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20170724BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20170724BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20170724BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20170724BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20170724BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20170724BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20170724BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20170724BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20170724BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20170724BHJP
C12Q 1/48 20060101ALN20170724BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C07K14/47
C12N9/12
A61K45/00
A61P3/10
A61P3/06
A61P3/04
A61P35/00
!C07K19/00
!C12N15/00 G
!C12Q1/48 ZZNA
【請求項の数】11
【全頁数】19
(21)【出願番号】特願2014-515674(P2014-515674)
(86)(22)【出願日】2013年5月16日
(86)【国際出願番号】JP2013063689
(87)【国際公開番号】WO2013172421
(87)【国際公開日】20131121
【審査請求日】2016年3月23日
(31)【優先権主張番号】特願2012-113424(P2012-113424)
(32)【優先日】2012年5月17日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000001395
【氏名又は名称】杏林製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】井出 智広
(72)【発明者】
【氏名】小林 直樹
(72)【発明者】
【氏名】赤坂 ゆにけ
(72)【発明者】
【氏名】小峰 隆史
(72)【発明者】
【氏名】村上 浩二
【審査官】
海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】
特開２００７−０７７０２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Iryna O. ZUBOVYCH et al.，Mitochondrial dysfunction confers resistance to multiple drugs in Caenorhabditis elegans，Molecular Biology of the Cell，２０１０年 ３月，Vol.21,No.6，P.956-969
【文献】
J. CHOI et al.，Sanguinarine is an allosteric activator of AMP-activated protein kinase，Biochem. Biophys. Res. Commun.，２０１１年 ９月２３日，Vol.413,no.2，P.259-263
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合の阻害を指標とする、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法。
【請求項2】
被検化合物の存在下で、プロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合が、被検化合物の非存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備える、請求項１記載のスクリーニング方法。
被検化合物の存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合が、被検化合物の非存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備える、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
担体上に固定した、プロヒビチンタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質のいずれか一方のタンパク質に、
被検化合物並びにプロヒビチンタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、
前記溶液を除去した後、プロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合が、被検化合物の非存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備える、請求項１記載のスクリーニング方法。
被検化合物並びにプロヒビチンタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、
前記溶液を除去した後、プロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合が、被検化合物の非存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備える、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項4】
担体上に固定した、プロヒビチンタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質のいずれか一方のタンパク質に、被検化合物を含有する溶液を添加する工程と、
プロヒビチンタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、
前記溶液を除去した後、プロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合が、被検化合物の非存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備える、請求項１記載のスクリーニング方法。
プロヒビチンタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、
前記溶液を除去した後、プロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合が、被検化合物の非存在下におけるプロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備える、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項5】
プロヒビチンタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合を測定する方法が、近接効果(proximity effect)を利用する測定法である請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項6】
プロヒビチンタンパク質がプロヒビチン１タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項7】
ＡＭＰＫタンパク質がＡＭＰＫタンパク質βサブユニットである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項8】
プロヒビチンタンパク質が融合タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項9】
ＡＭＰＫタンパク質が融合タンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項10】
単離されたプロヒビチンタンパク質及び単離されたＡＭＰＫタンパク質を混合することにより形成されたプロヒビチンタンパク質−ＡＭＰＫタンパク質複合体。
【請求項11】
細胞内で過剰発現させたプロヒビチンタンパク質及び細胞内で過剰発現させたＡＭＰＫタンパク質が結合することにより形成されたプロヒビチンタンパク質−ＡＭＰＫタンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤及びそのスクリーニング方法に関する。本発明は、また、ＰＨＢタンパク質−ＡＭＰＫタンパク質複合体に関する。【背景技術】
【0002】
5'AMP-activatedprotein kinase（以下、ＡＭＰＫともいう。）タンパク質は、様々な生物で保存され、グルコースの細胞内への取り込み、脂質の酸化やグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）及びミトコンドリアの発生等、細胞のエネルギー代謝に関わっているリン酸基転移酵素である。ＡＭＰＫタンパク質は、α、β及びγの三つのサブユニットから形成される複合体であり、上流キナーゼによりαサブユニットの第１７２番スレオニンがリン酸化され、活性化される。活性化されたＡＭＰＫタンパク質は、代謝の同化経路を阻害し、エネルギー産生経路である異化経路を促進することが知られている。【0003】
ＡＭＰＫタンパク質の活性化によって、同化経路である脂肪酸やタンパク質等の合成が阻害され、細胞増殖が抑制される一方、異化経路である脂肪酸の酸化やグルコース運搬等のエネルギー産生経路が促進される。したがって、ＡＭＰＫタンパク質の活性化は、糖尿病、糖尿病性合併症、脂質代謝異常症、非アルコール性脂肪性肝炎、動脈硬化、肥満、メタボリックシンドローム等の生活習慣病に加え、近年では癌、多発性嚢胞腎、心臓虚血、認知症、神経変性疾患、概日リズム睡眠障害の予防・治療に良い効果をもたらすとされている（非特許文献１〜３）。しかし、ＡＭＰＫタンパク質の活性化機序については未だ明らかにされていない。【0004】
一方、プロヒビチン（以下、ＰＨＢともいう。）タンパク質は、植物、菌類、単細胞真核生物や動物等で高度に保存されているタンパク質であり、ヒトＰＨＢタンパク質は、例えば、特許文献１に開示されている。ＰＨＢタンパク質は、２つのサブユニット、プロヒビチン１（以下、ＰＨＢ１ともいう。）及びプロヒビチン２（以下、ＰＨＢ２ともいう。）によって構成されている環状構造を形成することが知られている。ＰＨＢ１及びＰＨＢ２は相互依存しながら複合体を形成しており、ＰＨＢ１及びＰＨＢ２のいずれかの欠失は、それらからなる複合体全体の欠失を誘導する（非特許文献４〜７)。ＰＨＢタンパク質がミトコンドリア内膜に存在し機能することが報告されている一方で、核において転写調節に関与する報告もある。【0005】
ＰＨＢタンパク質は当初、細胞増殖抑制因子として同定された。しかし、最近、その増殖抑制機能はＰＨＢタンパク質の機能ではなく、ＰＨＢ遺伝子の３’ＵＴＲによるものであることが判明され、更に、ＰＨＢタンパク質自身はむしろ、細胞増殖を正に制御していることが示された（非特許文献８及び９）。また、非特許文献１０には、ＰＨＢ複合体が線虫において脂質代謝の調節に関与することで、寿命に関係していることが示され、更に特許文献２には、ＰＨＢ２タンパク質が脂肪分化を調節することが示されている。しかしながら、ＰＨＢタンパク質のこれらの現象に関与する分子メカニズムは明らかとなっていない。【0006】
また、特許文献３には、ＰＨＢタンパク質と、経口血糖降下剤であるビグアナイドとの結合が開示されている。更に、ラット肝細胞において、ＰＨＢタンパク質のノックダウンにより、ビグアナイドの作用（ＡＭＰＫタンパク質の活性化及びＡＴＰ低下の作用）が抑制されることが開示されている。【0007】
しかし、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との関係については未だ不明である。【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開平５−２７１２９４号公報
【特許文献2】特開２０１１−１１６７５３号公報
【特許文献3】特開２００７−７７０２８号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Nat.Rev.Cancer.,9(8):563-75頁(2009)
【非特許文献2】NatCell Biol., 13(9):1016-23頁 (2011)
【非特許文献3】Nat RevMol Cell Biol., 13(4):251-62頁 (2012)
【非特許文献4】J.Biol.Chem.,278巻, 32091頁(2003)
【非特許文献5】Mol.Cell.Biol.,18巻, 4043頁(1998)
【非特許文献6】Mol.Endocrinol.,22巻, 344頁(2008)
【非特許文献7】Genes.Dev.,22巻, 476頁(2008)
【非特許文献8】CellGrowth Differ., 7(7):871-8頁(1996)
【非特許文献9】PLoSOne. 5(9):e12735. (2010)
【非特許文献10】Nature.461(7265):793-7頁（2009）.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
ＡＭＰＫタンパク質の活性化の分子機構を解明し、ＡＭＰＫタンパク質の活性化を促進する分子を見出すことは、糖尿病、脂質代謝異常症、肥満、メタボリックシンドローム等の生活習慣病及び癌等の治療・予防薬の開発につながる。したがって、本発明の目的の一つは、ＡＭＰＫタンパク質の活性化の分子機構、及びＰＨＢタンパク質との関連を解明することである。本発明の別の目的は、解明された分子機構に基づいた、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤及びそれを探索するためのツールを提供することである。【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、ＰＨＢ１又はＰＨＢ２に対するｓｉＲＮＡが導入されたヒト細胞、即ち、ＰＨＢタンパク質がノックダウンされたヒト細胞における各種遺伝子の発現解析等の実験結果から、ＰＨＢタンパク質のノックダウンはＡＭＰＫタンパク質αサブユニット（以下、ＡＭＰＫαともいう。）の第１７２番スレオニンのリン酸化を抑制せず、むしろ促進することを見出した。すなわち、ＰＨＢタンパク質のノックダウンは、ＡＭＰＫタンパク質の活性化を促進することが明らかになった。また、本発明者らは、ＰＨＢタンパク質がＡＭＰＫタンパク質と結合して複合体を形成すること、この相互作用を阻害することによりＡＭＰＫタンパク質が活性化されることも見出した。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。【0012】
すなわち、本発明は、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用の阻害を指標とする、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質とが直接相互作用して複合体を形成するという分子機構を応用したものである。かかる分子機構は、本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、ユニークな作用機序に基づくＡＭＰＫタンパク質活性化剤を得ることが可能となる。ＡＭＰＫタンパク質活性化剤は、糖尿病、脂質代謝異常症、肥満、メタボリックシンドローム等の生活習慣病及び癌等の治療・予防に応用することが可能である。【0013】
上記スクリーニング方法は、被検化合物の存在下で、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、を備えることが好ましい。【0014】
また、上記スクリーニング方法は、担体上に固定した、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質のいずれか一方のタンパク質に、被検化合物並びにＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、前記溶液を除去した後、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、を備えることが好ましい。【0015】
さらに、上記スクリーニング方法は、担体上に固定した、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質のいずれか一方のタンパク質に、被検化合物を含有する溶液を添加する工程と、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、前記溶液を除去した後、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、を備えることが好ましい。【0016】
上記スクリーニング方法におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定する方法は、好ましくは近接効果(proximity effect)を利用する測定法である。【0017】
また、上記スクリーニング方法において、ＰＨＢタンパク質は好ましくはＰＨＢ１タンパク質である。【0018】
また、上記スクリーニング方法において、ＡＭＰＫタンパク質は好ましくはＡＭＰＫタンパク質βサブユニットである。【0019】
上記スクリーニング方法において、ＰＨＢタンパク質は、融合タンパク質であることが好ましい。また、ＡＭＰＫタンパク質も同様に、融合タンパク質であることが好ましい。【0020】
本発明はまた、単離されたＰＨＢタンパク質及び単離されたＡＭＰＫタンパク質を混合することにより形成されたＰＨＢタンパク質−ＡＭＰＫタンパク質複合体を提供する。【0021】
本発明はまた、細胞内で過剰発現させたＰＨＢタンパク質及び細胞内で過剰発現させたＡＭＰＫタンパク質が結合することにより形成されたＰＨＢタンパク質−ＡＭＰＫタンパク質複合体を提供する。【0022】
本発明はまた、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を阻害する化合物を有効成分とする、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤を提供する。上記ＡＭＰＫタンパク質活性化剤において、ＰＨＢタンパク質がＰＨＢ１タンパク質であることが好ましい。上記ＡＭＰＫタンパク質活性化剤において、ＡＭＰＫタンパク質がＡＭＰＫタンパク質βサブユニットであることが好ましい。【発明の効果】
【0023】
本発明のスクリーニング方法によれば、既存の医薬品とは異なるユニークな作用機序に基づくＡＭＰＫタンパク質活性化剤を得ることが可能である。このような化合物を見出すことで、糖尿病、脂質代謝異常症、肥満、メタボリックシンドローム等の生活習慣病及び癌等の治療・予防に有効な薬を開発することが可能となる。【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＰＨＢをノックダウンしたＨｅｐＧ２細胞からのＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ解析した結果を表す図である。割合は、ｓｉＣｔｒｌ．に対する抑制率を示す。
【図2】ＰＨＢをノックダウンしたＨｅｐＧ２細胞からのタンパク質をウェスタンブロッティング解析した結果を表す図である。矢印は、リン酸化ＡＭＰＫタンパク質のバンド位置を表す。ＡＭＰＫ−ｐＴ１７２は、第１７２番スレオニンがリン酸化されたＡＭＰＫαを表す。
【図3】ＨｅｐＧ２細胞を、共免疫沈降及びイムノブロットした結果を表す図である。ＩＰは、共免疫沈降に用いた抗体を表す。
【図4】ＧＳＴプルダウン法による、ＰＨＢ１タンパク質又はＰＨＢ２タンパク質と、ＡＭＰＫタンパク質αβγ複合体との相互作用の結果を表す図である。
【図5】ＧＳＴプルダウン法による、ＰＨＢ１タンパク質又はＰＨＢ２タンパク質と、ＡＭＰＫタンパク質α，β又はγサブユニットとの相互作用を表す図である。
【図6】共免疫沈降法による、ＰＨＢ１タンパク質と、全長の又はＣ末端欠損変異体のＡＭＰＫタンパク質βサブユニットの相互作用を表す図である。
【図7】化合物Ａ存在下におけるＧＳＴ融合ＰＨＢ１タンパク質をプルダウン及びイムノブロットした結果を表す図である。
【図8】様々な濃度の化合物Ａの存在下で培養したＨｅｐＧ２細胞からのタンパク質をウェスタンブロッティング解析した結果を表す図である。ＡＣＣは、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを表し、ＡＣＣ−ｐＳ７９は、第７９番目セリンがリン酸化されたＡＣＣを表す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【0026】
本発明は、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を指標とすることを特徴とする、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を阻害する、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤を提供する。【0027】
本明細書において、別段規定されない限り、「ＰＨＢタンパク質」という用語は、ＰＨＢ１タンパク質及び／又はＰＨＢ２タンパク質を示し、「ＡＭＰＫタンパク質」という用語は、ＡＭＰＫα、ＡＭＰＫβ及びＡＭＰＫγサブユニットの一つ以上を示す。また、「ＡＭＰＫタンパク質活性化」という用語は、ＡＭＰＫタンパク質が活性化されれば良く、典型的には、ＡＭＰＫタンパク質がリン酸化されることを意味し、より典型的には、ＡＭＰＫαの第１７２番スレオニンがリン酸化されることを意味する。【0028】
本発明によれば、ＰＨＢタンパク質と、ＡＭＰＫタンパク質との相互作用を阻害する機序を有するＡＭＰＫタンパク質活性化剤をスクリーニングして提供することができる。【0029】
第一の実施形態に係るＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下で、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備える。
【0030】
本発明に用いるＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の由来する生物種は特に限定されず、例えば、植物、菌類、単細胞真核生物及び動物等が挙げられる。好ましくは、ＰＨＢタンパク質は動物由来であり、より好ましくはヒト、ラット、マウス、ブタ、サル等の哺乳類由来であり、更に好ましくはヒト由来である。【0031】
本発明に用いるＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質は、全長のタンパク質からなるものであっても良く、一部のペプチド又はタンパク質から構成されても良い。ＰＨＢタンパク質又はＡＭＰＫタンパク質が一部のペプチド又はタンパク質から構成されている場合、それぞれ、両者の相互作用する部位を含む。ＡＭＰＫタンパク質における、ＰＨＢタンパク質と相互作用する部位の一例として、ＡＭＰＫβのＣ末端が挙げられ、特に、ヒトＡＭＰＫβの２６４−２７０アミノ酸残基が挙げられる。【0032】
更に、タンパク質を単離、精製し易い観点から、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質は、全長タンパク質或いは一部のペプチド又はタンパク質を含有する融合タンパク質であることが好ましい。融合タンパク質として、例えばＧＳＴ融合タンパク質、Ｈｉｓ融合タンパク質、ＦＬＡＧ融合タンパク質、ＨＡ融合タンパク質、Ｍｙｃ融合タンパク質等が挙げられる。【0033】
また、ＰＨＢ及びＡＭＰＫタンパク質は突然変異を有しても良い。突然変異体は、両者の相互作用に影響を与えないものであり、好ましくは、突然変異の部位が相互作用に関わる部位ではない。【0034】
ＰＨＢ及びＡＭＰＫタンパク質はまた、細胞から抽出されたものであっても良く、インビトロ翻訳から得られたものであっても良い。細胞から抽出されたタンパク質は、内在性のタンパク質であっても良く、細胞内で過剰発現させたものであっても良い。更に、ＰＨＢ及びＡＭＰＫタンパク質は、例えばAbnova社等より、市販されているものであっても良い。【0035】
内在性タンパク質を用いる場合、ＰＨＢ及びＡＭＰＫタンパク質は、例えば肝細胞；間質細胞；ランゲルハンス細胞；脾細胞；グリア細胞等の神経細胞；膵臓β細胞；骨髄細胞；表皮細胞；上皮細胞；内皮細胞；平滑筋細胞等の筋細胞；繊維芽細胞；繊維細胞；脂肪細胞；マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球等の免疫細胞；軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞等の骨細胞；乳腺細胞等から抽出される。これらの細胞は正常細胞であっても良く、癌細胞、前駆細胞、幹細胞であっても良い。また、これらの細胞を含む組織又は器官からタンパク質を抽出しても良い。【0036】
細胞内でタンパク質を過剰発現させる手段は、当業者が適宜に選べる。好ましくは、細胞内にタンパク質を過剰発現するベクターを導入し、細胞内でタンパク質を合成させる工程を含む。用いられる細胞は特に限定されなく、例えばヒト、マウス及びラット等の哺乳類由来の細胞や大腸菌が挙げられる。かかる過剰発現ベクターの例として、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。細胞内に過剰発現ベクターを導入する方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルス感染法等の公知の遺伝子導入方法が挙げられる。細胞内で過剰発現されるタンパク質は、好ましくはＧＳＴ、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ等のタグを有する融合タンパク質である。このようなタグを有することにより、当該タンパク質をより単離し易くなる。また、タグは、融合タンパク質のＮ末端に付けても、Ｃ末端に付けても良く、好ましくは、タグは、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用に影響を与えない部位に付ける。過剰発現用の細胞、ベクター、プロモーター、及びタグの種類、ベクターの導入方法等は、当業者が適宜に選択できる。【0037】
細胞からタンパク質を抽出する方法は、当業者にとって周知である。タンパク質は、例えば細胞溶解物から抽出されることができる。かかる方法は例えばＮＰ４０やＴｒｉｔｏｎ等の界面活性剤を含有する緩衝液で細胞を溶解させる方法が挙げられる。タンパク質は更に得られた細胞溶解物から単離されても良い。タンパク質の単離方法は、例えば抗原抗体反応を利用する単離方法、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー方法、セファロース等の担体を用いる方法が挙げられる。【0038】
ＰＨＢ及びＡＭＰＫタンパク質はまた、インビトロ翻訳系を用いて得られるものであっても良い。当該インビトロ翻訳系は当業者にとって周知であり、例えばTNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation System （Promega社）等がある。【0039】
用いられるＰＨＢ及びＡＭＰＫタンパク質の長さ、由来する生物、組織又は細胞種、変異の有無及び入手方法等は、同じであっても良く、異なっても良い。例えば、全長のＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質の部分ペプチドや、内在性ＰＨＢタンパク質とインビトロ翻訳で得られたＡＭＰＫタンパク質との組み合わせ等が挙げられる。【0040】
ＰＨＢタンパク質はＰＨＢ１タンパク質であってもＰＨＢ２タンパク質であっても良くその複合体であっても良い。好ましくは、ＰＨＢタンパク質はＰＨＢ１タンパク質である。また、ＡＭＰＫタンパク質はＡＭＰＫα、ＡＭＰＫβ又はＡＭＰＫγサブユニットのいずれかであっても良く、それらの複合体であっても良い。中でも、ＡＭＰＫβが好ましい。【0041】
被検化合物は特に限定されず、合成化合物でも良く、天然物抽出物中に存在する化合物であっても良い。被検化合物としては、例えば、合成化合物、天然化合物、植物抽出物、動物抽出物、発酵生産物、市販の試薬、化合物ライブラリーから選抜された化合物等が挙げられる。被検化合物の分子種も特に制限されず、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、糖、核酸を例示できる。【0042】
本明細書において、「相互作用」は、直接結合して複合体を形成しても良いが、他の分子を介する間接的な相互作用で複合体を形成しても良い。しかし、検出の感度及び特異性をより向上させ、スクリーニング結果の偽陽性をより低減させるため、直接結合して複合体を形成することが好ましい。【0043】
ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を指標とすることは、被検化合物によるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用への影響の程度を同定の基準とすることを意味する。例えば、被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質と、ＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下における両者の相互作用より弱い場合、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と同定できる。【0044】
ＡＭＰＫタンパク質活性化剤の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用低減の割合は、評価方法によって異なる。例えば、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤の存在下（１０μＭ）では、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用は、ＡＭＰＫタンパク質活性化剤の非存在下の５０％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましく、５％以下であることが更に好ましい。【0045】
ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用の測定方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能である。以下、本実施形態に係るタンパク質間相互作用を測定する系について詳細に説明するが、これらの測定系に限定されない。【0046】
タンパク質間相互作用の測定方法は、好ましくは、相互作用を定量する工程を備える。相互作用の定量する方法は例えば、酵素反応を利用する方法、蛍光強度を測定する方法、レポーター遺伝子の転写又は活性化を測定する方法、放射性物質を利用する方法等の相互作用を直接数値として測定する方法、及び相互作用の測定結果をいったん画像として取り込み、画像のドット等を測定する方法が知られている。また、片方のタンパク質に対する標識された抗体を用いて相互作用を測定することもできる。測定結果の客観性及びハイスループットスクリーニングを可能にする観点から、相互作用を直接数値として測定する方法が好ましい。【0047】
上述の測定方法において、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定し易くするため、少なくとも片方のタンパク質が標識されている。タンパク質の標識は特に限定されず、例えばＨＲＰ及びＨＡ等を用いた酵素標識、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＦＡＭ等を用いた蛍光標識、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、３,３',５,５'−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）及び３−アミノ−９−エチルカルバゾル（ＡＥＣ）等の発色物質を用いた標識、放射性標識等が挙げられる。好ましくは、これらの標識は、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質の相互作用に影響を与えず、かつ、タンパク質が高次元構造を取る場合、タンパク質の表面に露出する部位で付加される。【0048】
ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用は、共免疫沈降法を用いて測定することもできる。共免疫沈降法は、目的タンパク質に対する抗体を用いて、当該タンパク質を含む複合体を沈降させ、沈降させた複合体中に別のタンパク質の有無を、イムノブロットを用いて検出することにより、両者の相互作用を判定する方法である。【0049】
タンパク質間相互作用の測定方法として共免疫沈降法を用いる場合、典型的には、まず培養した細胞を溶解させ、細胞溶解物に担体又は特異性のない抗体を添加して遠心分離することにより、非特異的な結合を除去する。次に、担体及び、ＰＨＢタンパク質又はＡＭＰＫタンパク質のいずれか片方に対する抗体を添加して結合させ、遠心分離によって複合体を沈降させる。担体としては、セファロースビーズ、アガロースビーズ、Protein Gビーズ及びProtein Aビーズ等が挙げられる。沈降させた複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさに基づいて分離した後、ＰＶＤＦ等のメンブレンに転写し、他方のタンパク質に対する抗体を一次抗体として添加する。次に、一次抗体を認識する標識された二次抗体を添加し、結合する二次抗体の量を測定する。標識方法は特に限定されず、上記のタンパク質の標識と同様の標識が利用可能である。【0050】
更に、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用は、ＧＳＴプルダウン方法を用いて測定することもできる。ＧＳＴプルダウン方法において、相互作用を測定したい片方のタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質としてGlutathione Sepharose担体とを結合させ、担体−タンパク質複合体を形成させる。得られた複合体に他のタンパク質の有無を、イムノブロットを用いて検出することにより、両者の相互作用を判定できる。【0051】
本発明のタンパク質間相互作用の測定方法としてＧＳＴプルダウン法を用いる場合、まず、Glutathione Sepharose担体と、ＧＳＴ融合ＰＨＢタンパク質又はＧＳＴ融合ＡＭＰＫタンパク質（以下、ＧＳＴ−ＡＭＰＫともいう。）とを結合させ、複合体を形成させる。かかる複合体に他方のタンパク質を含有する液体を添加して結合させ、余分の液体を十分に洗浄した後、複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離して、ＰＶＤＦ等のメンブレンに転写する。添加されたタンパク質が担体−タンパク質複合体に結合するかを、標識された抗体を用いて検出し、両者の相互作用を判定する。標識方法は特に限定されず、上記のタンパク質の標識と同様の標識が利用可能である。【0052】
他のタンパク質間相互作用の測定方法は、当業者が適宜に選択でき、例えば、ファーウェスタン法、プロテイン・フラグメント・コンプリメンテーション・アッセイ（ＰＣＡ）法、蛍光共鳴エネルギー移動法（Fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）、アルファスクリーン(AlphaScreen)法、時間分解―蛍光共鳴エネルギー移動法（Time-resolved fluorescence resonance energy transfer、ＴＲ−ＦＲＥＴ）、シンチレーション接近アッセイ（Scintillation proximityassay、ＳＰＡ）法等の近接効果(proximityeffect)を利用する測定法が挙げられる。同様に細胞内でタンパク質間相互作用を測定する方法として、生物発光共鳴エネルギー移動（Bioluminescence resonance energytransfer、ＢＲＥＴ）、蛍光相互相関分光法（Fluorescence correlation spectroscopy、ＦＣＣＳ）、蛍光タンパク質再構成法(Bimolecular fluorescent complementation、ＢｉＦＣ法)、Duolink in situ Proximity ligation assay (PLA)（Olink Bioscience社）等が挙げられる。【0053】
また、レポーター遺伝子を利用したツーハイブリッド法及びＢｉａｃｏｒｅシステム等の表面プラスモン共鳴方法（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）等の方法も、タンパク質間相互作用の測定方法として使用することができる。【0054】
上記測定方法により測定した相互作用に基づいて、被検化合物がＡＭＰＫタンパク質活性化剤か否かを判定する。具体的には、被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質の活性化剤と判定する。被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用は、被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用と同時期に測定しても良く、別々に測定しても良い。【0055】
本発明の第二の実施形態に係るＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法は、担体上に固定した、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質のいずれか一方のタンパク質に、
被検化合物を含有する溶液並びにＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、
前記溶液を除去した後、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備えることができる。
【0056】
本発明の第三の実施形態に係るＡＭＰＫタンパク質活性化剤のスクリーニング方法は、担体上に固定した、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質のいずれか一方のタンパク質に被検化合物を含有する溶液を添加する工程と、
ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程と、
前記溶液を除去した後、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用が、被検化合物の非存在下におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用より弱い場合に、当該被検化合物をＡＭＰＫタンパク質活性化剤と判定する工程と、
を備えることができる。
【0057】
第二及び第三の実施形態において、担体は特に限定されず、セファロースビーズ、アガロースビーズ、Protein Gビーズ及びProtein Aビーズ等であっても良く、抗ＰＨＢ又は抗ＡＭＰＫ抗体を用いても良い。また、ＧＳＴ融合タンパク質、Ｈｉｓ融合タンパク質、ＨＡ融合タンパク質等を用いる場合、対応するビーズ又は抗体を用いて固定化することもできる。更に、スクリーニングの効率をより向上させるため、ビーズ、融合タンパク質、又は抗体は更に多ウェルプレート上に固定されることが好ましい。多ウェルプレートは６ウェル以上を備えるものが好ましく、４８ウェル以上を備えるものがより好ましく、９６ウェル以上を備えるものが好ましく、３８４ウェル以上を備えるものが極めて好ましい。【0058】
固定するタンパク質は、ＰＨＢタンパク質であっても良く、ＡＭＰＫタンパク質であっても良い。【0059】
ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用は、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質とを反応させて結合させることで測定することができる。かかる反応は、被検化合物の存在下で、担体上に固定した、ＰＨＢタンパク及びＡＭＰＫタンパク質のいずれか一方のタンパク質に、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加して、１分以上、０〜１００℃において放置して反応させることが好ましい。その後、溶液を除去し、結合しない余分なタンパク質を除去するため、洗浄の工程を入れたほうが好ましい。【0060】
ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用の測定方法は特に限定されず、第一の実施形態で説明した方法が利用可能である。しかし、ハイスループットスクリーニングを可能にする観点から、複数のサンプルを同時に測定することができる方法が好ましい。かかる方法は、例えば添加されるタンパク質を標識する方法がある。また、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の他方のタンパク質を含有する溶液を添加する工程の後、及び／又はそれに続く洗浄工程の後、添加されるタンパク質に対する標識された抗体を添加して測定することもできる。更に、ＦＲＥＴやＳＰＲ等のような、タンパク質の結合によって計測値が変化する測定方法を用いても可能である。【0061】
上記測定方法により測定した相互作用に基づいて、被検化合物がＡＭＰＫタンパク質活性化剤か否かを判定する。判定工程は第一の実施形態の判定工程で説明したのと同様である。【0062】
本発明は、また、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を阻害する化合物を有効成分とするＡＭＰＫタンパク質活性化剤を提供することができる。当該ＡＭＰＫタンパク質活性化剤は特に限定されず、好ましくは本発明によるスクリーニング方法を実施することによって被検化合物の中からＡＭＰＫタンパク質活性化剤として判定されるものである。【0063】
ＡＭＰＫタンパク質活性化剤は特に限定されず、合成化合物でも良く、天然物抽出物中に存在する化合物であっても良い。ＡＭＰＫタンパク質活性化剤としては、例えば、合成化合物、天然化合物、植物抽出物、動物抽出物、発酵生産物、市販の試薬、化合物ライブラリーから選抜された化合物等が挙げられる。ＡＭＰＫタンパク質活性化剤の分子種も特に制限されず、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、糖、核酸を例示できる。【0064】
また、本発明のＡＭＰＫタンパク質活性化剤の例として、下記式（１）で表される化合物（５−（２，４−ジオキソ−３−ブチルイミダゾリジン−１−イル）メチル−２−メトキシ−Ｎ−［４−（４−フルオロフェノキシ）フェニルメチル］ベンズアミド、化合物Ａともいう）を挙げることができる（国際公開第２０１２／２６４９５号）。【0065】
【化1】
【0066】
本発明は、また、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との複合体（以下、ＰＨＢタンパク質―ＡＭＰＫタンパク質複合体ともいう。）を提供することができる。かかる複合体は、単離されたＰＨＢタンパク質と単離されたＡＭＰＫタンパク質、又は細胞内で過剰発現させたＰＨＢタンパク質と細胞内で過剰発現させたＡＭＰＫタンパク質とを結合させて形成される。かかるタンパク質の単離及び細胞内で過剰発現させる方法は、第一実施形態で説明した方法が利用できる。【0067】
上記複合体は、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用機序のさらなる解明に使用することができる。例えば、ＰＨＢタンパク質―ＡＭＰＫタンパク質複合体を形成させて、結晶構造解析をすることにより、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合部位を同定することができる。このようなＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用機序の解明は、上記複合体を標的とする薬剤の設計等に有用である。かかる結晶構造解析の方法は公知であり、例えばＸ線構造解析が挙げられる。【0068】
上記複合体を標的とする薬剤等は、上記複合体におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を制御する効果を有することが好ましく、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を負に制御する効果を有することが更に好ましい。【0069】
ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質の由来は限定されない。また、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質は、融合タンパク質であっても良い。かかる融合タンパク質は、例えば、第一実施形態で説明した融合タンパク質である。【0070】
ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質はまた、全長のタンパク質であっても良く、一部のペプチド又はタンパク質であっても良い。さらに、ＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質は、突然変異を有しても良い。様々な部位を有するＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質から形成される複合体、又は突然変異を有しないＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質から形成される複合体と、突然変異を有するＰＨＢタンパク質及びＡＭＰＫタンパク質から形成される１つ以上の複合体とを用いることにより、様々な複合体におけるＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を測定して比較することができる。それにより、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との結合部位等、相互作用に影響を及ぼす又は及ぼさない部位を特定することができる。【実施例】
【0071】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【0072】
（実施例１：ｓｉＲＮＡを用いたＰＨＢタンパク質のノックダウン）ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞にヒトＰＨＢ１或いはヒトＰＨＢ２に対するｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi、Invitrogen社）をLipofectamine RNAiMAX（Invitrogen社）を用いてトランスフェクションした。
【0073】
トランスフェクション７２時間後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞から、RNeasy Mini Kit（Qiagen社）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡはTaqMan GeneExpression Assays（AppliedBiosystems社、ＰＨＢ１：Ｈｓ＿００８５５０４４＿ｇ１、ＰＨＢ２：Ｈｓ＿００２００７２０＿ｍ１）により7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＨＢ１或いはＰＨＢ２のノックダウンによる遺伝子の転写量に対する影響を検出した。【0074】
ｓｉＲＮＡの配列はそれぞれ以下の通りである。ｓｉＰＨＢ１：５’−ＵＵＧＧＣＡＡＵＣＡＧＣＵＣＡＧＣＵＧＣＣＵＵＧＧ−３’(配列番号１)
５’−ＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＵＧＡＧＣＵＧＡＵＵＧＣＣＡＡ−３’(配列番号２)
ｓｉＰＨＢ２：５’−ＵＡＣＧＡＵＵＣＵＧＵＧＡＵＧＵＧＧＣＧＡＵＣＧＵ−３’(配列番号３)
５’−ＡＣＧＡＵＣＧＣＣＡＣＡＵＣＡＣＡＧＡＡＵＣＧＵＡ−３’(配列番号４)
【0075】
図１にＰＨＢ１或いはＰＨＢ２に対するｓｉＲＮＡが導入された場合のＰＨＢ１及びＰＨＢ２のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。ｓｉＰＨＢ１又はｓｉＰＨＢ２の導入はそれぞれ、ＰＨＢ１又はＰＨＢ２の転写量を特異的に抑制した。したがって、用いられたｓｉＰＨＢ１及びｓｉＰＨＢ２は、効率的に、かつ特異的に標的遺伝子の発現を抑制したことが示唆された。【0076】
（実施例２：ＰＨＢのノックダウンによるＡＭＰＫタンパク質リン酸化に対する影響）ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞にヒトＰＨＢ１或いはヒトＰＨＢ２に対するｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi、Invitrogen社）をLipofectamine RNAiMAX (Invitrogen社)を用いてトランスフェクションした。トランクフェクション７２時間後、細胞を溶解バッファー（１％ＮＰ−４０、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭβ−グリセロリン酸、ｐＨ７．４）で溶解し、細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、細胞抽出液に含まれるタンパク質を大きさにより分離した。その後、分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗リン酸化ＡＭＰＫα抗体及び抗ＡＭＰＫα抗体（いずれもCell Signaling Technology社)、抗ＰＨＢ１抗体（SantaCruz Biotechnology社）、抗ＰＨＢ２抗体（Millipore社）によりウェスタンブロッティングを行った。
【0077】
図２にＰＨＢ１或いはＰＨＢ２のノックダウンした場合におけるＡＭＰＫαタンパク質のリン酸化のウェスタンブロッティングの結果を示す。ＰＨＢ１或いはＰＨＢ２のいずれのｓｉＲＮＡを用いてもＰＨＢ１及びＰＨＢ２のタンパク質の量が減少し、リン酸化ＡＭＰＫαの量が上昇した。この時、ＡＭＰＫαの量は変化しなかった。したがって、ＰＨＢ１或いはＰＨＢ２のノックダウンによりＡＭＰＫタンパク質の活性化が誘導されることが示唆された。【0078】
（実施例３：ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用の確認）ＰＨＢタンパク質が相互作用を介してＡＭＰＫタンパク質の制御に関与する可能性を検討するため、共免疫沈降を行った。陰性コントロールとして抗ＩｇＧ抗体を用いた。
【0079】
ＨｅｐＧ２細胞から調製した細胞抽出液にProtein G Sepharose（GE Healthcare社）を添加し遠心分離を行い、非特異的な結合を除去した。得られた上清に抗ＰＨＢ１抗体（Santa Cruz Biotechnology社）或いは抗ＡＭＰＫα抗体（Cell Signaling Technology社）及びProtein G Sepharoseを加え４時間、４℃にてインキュベートして結合させ、遠心分離を行い、余分の細胞抽出液を除いた。洗浄して非特異的な結合を除去した後、Protein G Sepharoseに結合する複合体を、共免疫沈降物として精製した。得られた共免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより大きさに基づいて分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗ＰＨＢ１抗体による共免疫沈降物に対しては抗ＰＨＢ１抗体、抗ＡＭＰＫα抗体を用いて、また、抗ＡＭＰＫα抗体による共免疫沈降物に対しては抗ＡＭＰＫα抗体、抗ＡＭＰＫβ抗体（Cell Signaling Technology社）、抗ＰＨＢ１抗体、抗ＰＨＢ２抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＰＨＢ１タンパク質とＡＭＰＫαタンパク質が共沈降されるかを検出した。【0080】
図３ａに、抗ＰＨＢ１抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＰＨＢ１タンパク質と共に沈降するＡＭＰＫαが検出された。【0081】
図３ｂに、抗ＡＭＰＫα抗体による共免疫沈降の結果を示す。共免疫沈降物から、ＡＭＰＫαと共に沈降するＡＭＰＫβ、ＰＨＢ１タンパク質及びＰＨＢ２タンパク質が検出された。【0082】
抗ＰＨＢ１抗体による共免疫沈降物中にＡＭＰＫαが検出されたこと、並びに、逆に抗ＡＭＰＫα抗体による共免疫沈降物中にＰＨＢ１及びＰＨＢ２が検出されたことから、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質が細胞内で相互作用して複合体を形成することが示唆された。【0083】
（実施例４：ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との直接相互作用の確認）ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質の直接相互作用の可能性を、ＧＳＴプルダウン法を用いて検討した。
【0084】
具体的には、GlutathioneSepharose 4 Fast Flow（GE Helthcare社）担体と、市販のＧＳＴタンパク質、ＧＳＴ融合ＰＨＢ１タンパク質（以下、ＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質ともいう。）又はＧＳＴ融合ＰＨＢ２タンパク質（以下、ＧＳＴ−ＰＨＢ２タンパク質ともいう。）（いずれもAbnova社）とを、それぞれ結合させ、ＧＳＴ担体―タンパク質複合体とした。ＧＳＴ担体−タンパク質複合体と、ＡＭＰＫタンパク質（Calbiochem社）とを、ＮＥＴバッファー（０．５％ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で３時間、４℃にてインキュベートして結合させた。ＮＥＴバッファーで洗浄した後、サンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、１％β−メルカプトエタノール、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ブロモフェノールブルー）を添加し、サンプルを調製した。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗ＡＭＰＫα及び抗ＧＳＴ抗体によりウェスタンブロッティングを行い、ＡＭＰＫタンパク質がGlutathione Sepharoseに結合したＧＳＴタンパク質、ＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質或いはＧＳＴ−ＰＨＢ２タンパク質と結合してプルダウンされるかを検出した。【0085】
図４に、ＧＳＴプルダウン法の結果を示す。ＧＳＴタンパク質によってプルダウンされた複合体ではＡＭＰＫαが検出されなかったが、ＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質及びＧＳＴ−ＰＨＢ２タンパク質によってプルダウンされた複合体ではＡＭＰＫαが検出された。また、ＧＳＴ−ＰＨＢ２タンパク質によってプルダウンされた複合体で検出されたＡＭＰＫαの量は、ＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質によってプルダウンされた複合体で検出された量に比べて少なかった。したがって、ＰＨＢタンパク質、特にＰＨＢ１タンパク質が直接ＡＭＰＫタンパク質と相互作用することが示された。【0086】
（実施例５：ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質サブユニットとの相互作用の確認）ＧＳＴプルダウン法を用いて、ＰＨＢタンパク質と相互作用するＡＭＰＫタンパク質サブユニットを同定した。
【0087】
ＧＳＴ担体−タンパク質複合体を、実施例４に準じて調製した。TNT Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega)を用いて、［３５Ｓ］メチオニン(PerkinElmer)でラベル化した、ＡＭＰＫα，β及びγ並びにＰＨＢ１タンパク質を調製した。ＧＳＴ担体−タンパク質複合体と、３５Ｓラベル化タンパク質とを混合し、実施例４に準じてＧＳＴプルダウン法を行った。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、オートラジオグラフィーにて、３５Ｓラベル化タンパク質がＧＳＴ担体−タンパク質複合体によってプルダウンされるか検出した。【0088】
図５にプルダウンの結果を示す。ＧＳＴタンパク質によってプルダウンされた複合体では、いずれの３５Ｓラベル化タンパク質も検出されなかった。ＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質によってプルダウンされた複合体では、３５Ｓラベル化ＡＭＰＫα及び３５Ｓラベル化ＡＭＰＫγは検出されなかったが、３５Ｓラベル化ＡＭＰＫβが検出された（図５ａ）。また、ＧＳＴ−ＰＨＢ２タンパク質によってプルダウンされた複合体でも、３５Ｓラベル化ＡＭＰＫβが検出された（図５ｂ）。逆に、ＧＳＴ−ＡＭＰＫβによってプルダウンされた複合体でも、３５Ｓラベル化ＰＨＢ１タンパク質が検出された（図５ｃ）。したがって、ＰＨＢ１タンパク質及びＰＨＢ２タンパク質は、ＡＭＰＫタンパク質複合体のうちＡＭＰＫβサブユニットを介して相互作用することが示唆された。【0089】
（実施例６：ＡＭＰＫタンパク質βサブユニットにおける、ＰＨＢタンパク質との相互作用に重要な領域の同定）ＡＭＰＫタンパク質βサブユニットにおける、ＰＨＢタンパク質との相互作用に重要な領域を同定するため、ＡＭＰＫタンパク質βサブユニットの欠損変異体を用いて以下の実験を行った。
【0090】
Ｎ末端にＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号５）を付加した、全長の又は各種欠損変異体のＡＭＰＫタンパク質βサブユニットの発現ベクター、及びＣ末端にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号６）を付加したＰＨＢ１タンパク質の発現ベクターを、Lipofectamine LTX (invitrogen)を用いてＨｅｐＧ２細胞に導入し、一晩３７℃にて培養した。抗ＨＡアフィニティマトリックス（Roche）を用いて、実施例３に準じて免疫沈降を行った。抗ＨＡ抗体及び抗Ｆｌａｇ抗体（いずれもCellSignaling Technology）を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＡＭＰＫタンパク質βサブユニットとＰＨＢ１タンパク質が共沈降されるか検討した。【0091】
結果を図６に示す。全長のＡＭＰＫタンパク質βサブユニットによりＰＨＢ１タンパク質が共沈降されたことから、細胞内においてＡＭＰＫタンパク質βサブユニットとＰＨＢ１タンパク質が相互作用することが確認された。しかしながら、ＡＭＰＫタンパク質βサブユニットのＣ末端を欠損した各種変異体によりＰＨＢ１タンパク質が共沈降されなかったことから、ＡＭＰＫタンパク質βサブユニットとＰＨＢ１タンパク質の相互作用には、ＡＭＰＫタンパク質βサブユニットのＣ末端（特に２６４−２７０番目のアミノ酸残基）が必要であることが示された。【0092】
（実施例７：化合物ＡのＰＨＢ１タンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用に対する影響）ＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質（５００ｎｇ）をGlutathione Sepharose 4 Fast Flow（１０μＬ）に結合させ、ＧＳＴ担体−タンパク質複合体とした。ＧＳＴ担体−タンパク質複合体に化合物Ａ（最終濃度１０μＭ）及びＡＭＰＫタンパク質（１００ｎｇ）を加え、ＮＥＴ Ｂｕｆｆｅｒ（３００μＬ）中で３時間、４℃にてインキュベートした。ＮＥＴバッファーでＧＳＴ担体−タンパク質複合体を洗浄後、サンプルバッファー（５０μＬ）を添加してサンプルを調製した。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ウェスタンブロッティングを行い、ＡＭＰＫタンパク質がGlutathione Sepharoseに結合したＧＳＴタンパク質或いはＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質と結合してプルダウンされるかを検出した。
【0093】
図７に、化合物Ａの添加により、ＧＳＴ−ＰＨＢ１タンパク質によりプルダウンされるＡＭＰＫαは著明に減少した。したがって、化合物ＡはＰＨＢ１タンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を阻害することが示唆された。【0094】
（実施例８：化合物ＡのＡＭＰＫαリン酸化に対する影響）ＨｅｐＧ２細胞の培養系に化合物Ａを各々の最終濃度となるように添加して、更に３時間培養した後、溶解バッファーで細胞を溶解し細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、抽出液に含まれるタンパク質を大きさに基づいて分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ウェスタンブロッティングによりＰＨＢ１、ＰＨＢ２、ＡＭＰＫα及びリン酸化ＡＭＰＫαを検出した。
【0095】
図８に、化合物Ａの濃度依存的に、リン酸化ＡＭＰＫα、ＡＭＰＫα、リン酸化ＡＭＰＫαのリン酸化基質であるＡＣＣ、リン酸化ＡＣＣ、ＰＨＢ１及びＰＨＢ２タンパク質のウェスタンブロッティング解析の結果を示す。リン酸化ＡＭＰＫα及びリン酸化ＡＣＣの量について、化合物Ａの濃度依存的な上昇が認められた。一方、化合物Ａの添加は、ＡＭＰＫα、ＡＣＣ、ＰＨＢ１及びＰＨＢ２の量に顕著な影響を与えなかった。これにより、化合物Ａは、ＰＨＢタンパク質とＡＭＰＫタンパク質との相互作用を阻害することにより、ＡＭＰＫタンパク質を活性化することが示された。【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明のスクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なるＡＭＰＫタンパク質活性化剤を提供する。このような化合物は、糖尿病、脂質代謝異常症、肥満、メタボリックシンドロームなどの生活習慣病や癌などの治療・予防に有効な薬となり得る。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]