特許 6175170 ＶＩＳＴＡ制御性Ｔ細胞メディエータタンパク質、ＶＩＳＴＡ結合剤、およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6175170

(24)【登録日】2017年7月14日

(45)【発行日】2017年8月2日

(54)【発明の名称】ＶＩＳＴＡ制御性Ｔ細胞メディエータタンパク質、ＶＩＳＴＡ結合剤、およびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20170724BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20170724BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 N

   A61P37/06

【請求項の数】9

【外国語出願】

【全頁数】123

(21)【出願番号】特願2016-147969(P2016-147969)

(22)【出願日】2016年7月28日

(62)【分割の表示】特願2013-502683(P2013-502683)の分割

【原出願日】2011年3月25日

(65)【公開番号】特開2016-222702(P2016-222702A)

(43)【公開日】2016年12月28日

【審査請求日】2016年8月1日

(31)【優先権主張番号】61/449,882

(32)【優先日】2011年3月7日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/436,379

(32)【優先日】2011年1月26日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/390,434

(32)【優先日】2010年10月6日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】12/732,371

(32)【優先日】2010年3月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509239956

【氏名又は名称】トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】ノエル，ランドルフ・ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，リリ

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０１２２３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１１６１８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０２７８２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５３５７５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１６８８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／００８４０８２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 J. Exp. Med.，２０１１年 ３月 ７日，Vol.208，No.3，p.577-592

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

インビボでＴ細胞免疫を抑制することを必要とする対象においてそれを行うための医薬の製造における、アゴニスト抗-ＶＩＳＴＡ抗体または抗体フラグメントの使用。

【請求項2】

対象が自己免疫性疾患、アレルギー性疾患または炎症性疾患を有する、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記アゴニスト抗-ＶＩＳＴＡ抗体または抗体フラグメントがヒトＶＩＳＴＡに結合する、請求項１または２に記載の使用。

【請求項4】

前記対象が、乾癬、皮膚炎、アトピー性皮膚炎；全身性強皮症、硬化症；クローン病，潰瘍性大腸炎；呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；湿疹、喘息、アテローム性動脈硬化症；白血球接着不全症；リウマチ性関節炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；糖尿病；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および脈管炎；悪性貧血（アジソン病）；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器損傷症候群；溶血性貧血、クリオグロブリン血症またはクームス陽性貧血；重症筋無力症；抗原抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート・イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体性腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性ニューロパシー；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；ならびに自己免疫性血小板減少症から選択される症状を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。

【請求項5】

前記対象が、リウマチ性関節炎、急性関節炎、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性性関節炎、感染性関節炎、ライム病関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、および若年発症リウマチ性関節炎、変形性関節炎、関節炎クロニカプログレディエンテ、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、反応性関節炎、および強直性脊椎炎、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、プラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、および爪の乾癬等の乾癬、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、慢性アレルギー性蕁麻疹、慢性特発性蕁麻疹、慢性自己免疫性蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、強皮症、全身性強皮症、硬化症、全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄−視覚ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、および失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｕｌｃｅｒｏｓａ）、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、ポリープ性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｐｏｌｙｐｏｓａ）、壊死性腸炎、貫壁性大腸炎、自己免疫性炎症性腸疾患、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、成人もしくは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、ブドウ膜の全てもしくは一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ様脊椎炎、突発性難聴、ＩｇＥ媒介性疾患、アナフィラキシー、アレルギー性鼻炎、アトピー性鼻炎、脳炎、ラスムッセン脳炎、辺縁系および／または脳幹脳炎、ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、自己免疫性ブドウ膜炎、糸球体腎炎（ＧＮ）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性腎症、膜性または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、急速進行性ＧＮ、アレルギー状態、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus：ＳＬＥ）または全身性ループスエリテマトーデス（systemic lupus erythematodes）、皮膚ＳＬＥ、亜急性皮膚紅斑性狼瘡、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、ループス（ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、腎外性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛性ループスを含む）、若年発症糖尿病、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性尿崩症、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅発性過敏症に関連した免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、リンパ腫様肉芽腫症、ヴェグナー肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、脈管炎関連症状、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む溶血性貧血もしくは免疫性溶血性貧血、悪性貧血（ａｎｅｍｉａ ｐｅｒａｉｃｉｏｓａ）、アジソン病、赤芽球貧血、または赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、敗血症、外傷、または出血、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病もしくは症候群、免疫複合体性腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性ニューロパシー、ＩｇＭ多発性ニューロパシーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパシー等の慢性ニューロパシー、血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫性精巣炎および卵巣炎、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）；亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群、腫瘍随伴症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、イートン・ランバート症候群、スティッフマンもしくはスティッフパーソン症候群、脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、胸腺腫関連重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋緊張病、オプソクローヌスもしくはオプソクローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、感覚性ニューロパシー、多巣性運動ニューロパシー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、肝炎、リンパ性間質性肺炎、閉塞性細気管支炎、ギラン・バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆汁性肝硬変症、肺線維症、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアック病（Ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症、冠動脈疾患、自己免疫性耳疾患、オプソクローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増加症、原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパシー；腫瘍随伴症候群、癲癇、片頭痛、不整脈、筋障害等のチャネル病、炎症性ミオパシー、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼病、網膜ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝障害、線維筋痛、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期認知症、自己免疫性脱髄疾患等の脱髄疾患、糖尿病性腎症、ドレスラー症候群、円形脱毛症、クレスト症候群、混合結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復性流産、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎；アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎等の肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア症、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎、またはフックス毛様体炎等の毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、エコーウイルス感染、心筋ミオパシー、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン・バーウイルス感染、流行性耳下腺炎、エヴァン症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺機能亢進症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型腎症、良性家族性および虚血再灌流損傷、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、アスペルミオジェネース（ａｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｅ）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、癩性結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性聴力損失、血色素尿症発作、性腺機能低下症；限局性回腸炎、白血球減少症、感染性単核球症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経性眼炎、肉芽種性睾丸炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルヴァン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮症、抗精子抗体に起因する不妊症、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤおよびエプスタイン・バーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、リーシュマニア等の寄生虫症、毒素性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞浸潤を伴う疾患、白血球接着不全症、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅発性過敏症に関連した免疫応答、白血球漏出を伴う疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、末梢性ニューロパシー、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、完全脱毛症、拡張型心筋ミオパシー、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性もしくは非化膿性副鼻腔炎、急性もしくは慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭、上顎、または蝶形骨副鼻腔炎、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症等の好酸球関連障害、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルートン症候群、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、膠原病に関連した自己免疫障害、リウマチ、神経系疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、血管拡張、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏症、脳虚血、および血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏症障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、心筋または他の組織の再灌流傷害、急性炎症性成分を伴う皮膚病、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性障害、眼および眼窩炎症性障害；顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈障害、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、ならびに子宮内膜症から選択される症状を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。

【請求項6】

前記アゴニスト抗体またはフラグメントが、Ｔ細胞と骨髄由来のＡＰＣとの間の同族相互作用中のＴ細胞応答を抑制する、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。

【請求項7】

前記アゴニスト抗体またはフラグメントが、Ｔｒｅｇ細胞を促進する、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。

【請求項8】

対象が、多発性硬化症、ＥＡＥ、Ｉ型糖尿病、卵巣炎、および甲状腺炎から選択される細胞媒介性自己免疫疾患を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。

【請求項9】

別の免疫調節因子および／または抗原の使用を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

導入
〔０００１〕本出願は、２０１０年３月２６日出願の米国特許第１２／７３２，３７１号、２０１０年１０月６日出願の米国特許仮出願第６１／３９０，４３４号、２０１１年１月２６日出願の米国特許仮出願第６１／４３６，３７９号、および２０１１年３月７日出願の米国特許仮出願第６１／４４９，８８２号への優先権を主張する。これらの出願の全ては、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【0002】

〔０００２〕 本出願は、我々が、Ｔ細胞活性化のＶ−領域免疫グロブリン含有抑制因子（Ｖ−ｒｅｇｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（ＶＩＳＴＡ）またはＰＤ−Ｌ３と指定される、新規の造血的に制限された構造的に異なったＩｇ−スーパーファミリー阻害リガンドを発見し、特徴化し、かつ機能的に定義したことに関する。細胞外ドメインは、Ｂ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１との相同性を有し、ＰＤ−Ｌ１同様に、ＶＩＳＴＡは、免疫に絶大な影響を与える。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１とは異なり、ＶＩＳＴＡの発現は、造血コンパートメント内に限局する。骨髄性抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での発現が最も顕著であるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞上およびＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のサブセット上での発現も大いに興味深い。可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、またはＡＰＣ上でのＶＩＳＴＡ発現は、インビトロＴ細胞増殖、サイトカイン産生を強力に阻害し、Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現を誘導する。逆に、新たに開発された抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体は、インビトロでのＶＩＳＴＡ＋ＡＰＣによるＴ細胞応答のＶＩＳＴＡ誘導免疫抑制を妨害した。さらに、インビボでの抗ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発達を強化し、腫瘍特異的保護的免疫応答の発達を促進して、それに続いて腫瘍寛解を伴った。ＶＩＳＴＡ−／−マウスの初期研究は、自発性炎症性疾患の初期の兆候を明らかにしており、それらの最終的な病理学的運命が決定される。全ての他のＰＤ−リガンド関連分子（例えば、Ｂ７−Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６）とは異なり、ＶＩＳＴＡの造血制限は、その著明な抑制活性および特有の構造特性とともに、ＶＩＳＴＡが、新規かつ機能的に非冗長性である、免疫の中心的な負の制御因子であり、その発現が、主に骨髄限定的であることを説明する。

【背景技術】

【0003】

〔０００３〕 免疫応答の誘導は、Ｔ細胞増殖、分化、収縮、およびＴ細胞記憶の確立を必要とする。Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に遭遇し、ＡＰＣ上でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）相互作用を介して情報交換しなければならない。ＴＣＲとＭＨＣとの相互作用が確立されると、Ｔ細胞とＡＪＰＣとの間の他の組の受容体−リガンド接触、すなわち、ＣＤ１５４／ＣＤ４０およびＣＤ２８／Ｂ７．１−Ｂ７．２を介する共刺激が必要とされる。これらの接触間の相乗効果は、インビボにおいて、病原体および腫瘍を取り除くことができ、ある場合には、自己免疫を誘導することができる生産的免疫応答をでもたらすことが示唆される。

【0004】

〔０００４〕 別のレベルの制御、すなわち、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が特定されている。この特定のＴ細胞のサブセットは、胸腺で生成され、末梢に送達され、インビトロおよびインビボでＴ細胞応答を一定かつ誘導可能に制御することができる（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ（２０００）Ｃｅｌｌ １０１（５）：４５５−８、Ｓｈｅｖａｃｈ（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４２３−４９、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ａｎｄ
Ａｂｂａｓ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（３）：２５３−７）。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋表現型で表され、高レベルの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、およびグルココルチコイド誘導可能なＴＮＦ受容体関連タンパク質（ＧＩＴＲ）も発現する（ＭｃＨｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１６（２）：３１１−２３、Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．３（２）：１３５−４２）。５日齢の新生児胸腺摘出による細胞の排除または抗ＣＤ２５を用いた抗体除去は、自己免疫性病理学の誘導、ならびに増大した抗腫瘍応答を含む外来抗原および自己抗原に対するＴ細胞応答の悪化をもたらす（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１（１）：７２−８７、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１５１−６４、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｍｍｕｎ．２：１）。加えて、Ｔｒｅｇは、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体を用いたＴｒｅｇの除去が、移植寛容の消失および迅速な移植片拒絶をもたらすため（Ｊａｒｖｉｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ７６：１３７５−９）、移植寛容の誘導および維持に関与している（Ｈａｒａ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（６）：３７８９−３７、Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１９９−２１０）。ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇの表面上でのアゴニストモノクローナル抗体とＧＩＴＲとのインビトロまたはインビボライゲーションが、Ｔｒｅｇ活性の迅速な終結をもたらし（ＭｃＨｕｇｈ，ｅｔ
ａｌ．（２００２）上記参照、Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２）上記参照）、また、自己免疫性病理（Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２）上記参照）および移植寛容の消失ももたらすため、Ｔｒｅｇによって発現される受容体の中でも、重要な成分のようである。

【0005】

〔０００５〕 共刺激および共阻害リガンドならびに受容体は、Ｔ細胞活性化のために「第２のシグナル」のみならず、自己への免疫を制限しながら、感染に対する免疫応答を最大にするように、正および負のシグナルのバランスのとれたネットワークも提供する。最も良く特徴付けられている共刺激リガンドは、Ｂ７．１およびＢ７．２であり、それらは、プロフェッショナルＡＰＣによって発現され、それらの受容体は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４である（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｊ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、およびＳｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．（２００５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ２３，５１５−５４８、Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．およびＦｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２，１１６−１２６）。ＣＤ２８は、ナイーブおよび活性化Ｔ細胞によって発現され、最適なＴ細胞活性化にとって非常に重要である。対照的に、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の際に誘導され、Ｂ７．１／Ｂ７．２に結合することによってＴ細胞活性化を阻害し、したがって、ＣＤ２８媒介性共刺激を障害する。ＣＴＬＡ−４は、その細胞質ＩＴＩＭモチーフを介して、負のシグナルも伝達する（Ｔｅｆｔ，Ｗ．Ａ．、Ｋｉｒｃｈｈｏｆ，Ｍ．Ｇ．、およびＭａｄｒｅｎａｓ，Ｊ．（２００６）．Ａｎｎｕ
Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ２４，６５−９７、Ｔｅｆｔ，Ｗ．Ａ．、Ｋｉｒｃｈｈｏｆ，Ｍ．Ｇ．、およびＭａｄｒｅｎａｓ，Ｊ．（２００６）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４，６５−９７．）。Ｂ７．１／Ｂ７．２ノックアウト（ＫＯ）マウスは適応免疫反応において障害を有するが（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，Ｆ．、Ｓｅｔｈｎａ，Ｍ．Ｐ．、Ｂｏｙｄ，Ｓ．Ｄ．、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ａ．Ｎ．、Ｔｉｖｏｌ，Ｅ．Ａ．、Ｊａｃｏｂｙ，Ｄ．、Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｂ．、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｍ、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、およびＳｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．（１９９７））Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６，３０３−３１３、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，Ｆ．、Ｈｏｄｅｓ，Ｒ．Ｊ．、Ｒｅｉｓｅｒ，Ｈ．、Ｈａｔｈｃｏｃｋ，Ｋ．Ｓ．、Ｌａｓｚｌｏ，Ｇ．、ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ａ．Ｊ．、Ｋｉｍ，Ｊ．、Ｄｕ，Ｌ．、Ｌｏｍｂａｒｄ，Ｄ．Ｂ．ら（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，９０７−９０９）、一方で、ＣＴＬＡ−４ ＫＯマウスは、炎症を適切に制御することができず、全身性自己免疫疾患を発現する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｃ．Ａ．、Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｔ．Ｊ．、およびＡｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（１９９７
）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７，８８５−８９５、Ｔｉｖｏｌ，Ｅ．Ａ．、Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，Ｆ．、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ａ．Ｎ．、Ｌｙｎｃｈ，Ｗ．Ｐ．、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｊ．Ａ．、およびＳｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３，５４１−５４７、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．、Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｔｉｍｍｓ，Ｅ．、Ｗａｋｅｈａｍ，Ａ．、Ｓｈａｈｉｎｉａｎ，Ａ．、Ｌｅｅ，Ｋ．Ｐ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ Ｂ．、Ｇｒｉｅｓｓｅｒ，Ｈ．、およびＭａｋ，Ｔ．Ｗ．（１９９５）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，９８５−９８８）。

【0006】

〔０００６〕 Ｂ７ファミリーリガンドは、共刺激Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳリガンド）およびＢ７−Ｈ３、ならびに共阻害Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１またはＢ７ｘ）、およびＢ７−Ｈ６を含むまでに拡張している（Ｂｒａｎｄｔ，Ｃ．Ｓ．、Ｂａｒａｔｉｎ，Ｍ．、Ｙｉ，Ｅ．Ｃ、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．、Ｇａｏ，Ｚ．、Ｆｏｘ，Ｂ．、Ｈａｌｄｅｍａｎ，Ｂ．、Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ，Ｃ．Ｄ．、Ｋａｉｆｕ，Ｔ．、Ｃｈａｂａｎｎｏｎ，Ｃら（２００９）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０６，１４９５−１５０３、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｊ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、およびＳｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．（２００５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３，５１５−５４８）。

【0007】

〔０００７〕 誘導可能な共刺激（ＩＣＯＳ）分子は、活性化Ｔ細胞上で発現され、Ｂ７−Ｈ２に結合する（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｓ．Ｋ、Ｗｈｏｒｉｓｋｅｙ，Ｊ．Ｓ．、Ｋｈａｒｅ，Ｓ．Ｄ．、Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｕ．、Ｇｕｏ，Ｊ．、Ｈｏｒａｎ，Ｔ．、Ｓｈｉｈ，Ｇ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．、Ｃｏｃｃｉａ，Ｍ．Ａ．、Ｋｏｈｎｏ，Ｔら（１９９９）．Ｎａｔｕｒｅ ４０２，８２７−８３２）。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化、分化、および機能にとって重要であり、Ｔヘルパー細胞誘導Ｂ細胞活性化、Ｉｇクラススイッチ、および胚中心（ＧＣ）形成に必須である（Ｄｏｎｇ，Ｃ、Ｊｕｅｄｅｓ，Ａ．Ｅ．、Ｔｅｍａｎｎ，Ｕ．Ａ．、Ｓｈｒｅｓｔａ，Ｓ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．、Ｒｕｄｄｌｅ，Ｎ．Ｈ．、およびＦｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９，９７−１０１、Ｔａｆｕｒｉ，Ａ．，Ｓｈａｈｉｎｉａｎ，Ａ．，Ｂｌａｄｔ，Ｆ．，Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｓ．Ｋ．，Ｊｏｒｄａｎａ，Ｍ．，Ｗａｋｅｈａｍ，Ａ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｌ．Ｍ．，Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｄ．，Ｃｈａｎ，Ｖ．Ｓ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９，１０５−１０９、Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｓ．Ｋ．、Ｗｈｏｒｉｓｋｅｙ，Ｊ．Ｓ．、Ｋｈａｒｅ，Ｓ．Ｄ．、Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｕ．、Ｇｕｏ，Ｊ．、Ｈｏｒａｎ，Ｔ．、Ｓｈｉｈ，Ｇ．、Ｚｈａｎｇ，Ｍ．、Ｃｏｃｃｉａ，Ｍ．Ａ．、Ｋｏｈｎｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４０２，８２７−８３２）。その一方で、プログラム死１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞応答を負に制御する。ＰＤ−１ ＫＯマウスは、遺伝的背景に応じて、ループス様の自己免疫疾患または自己免疫性拡張型心筋ミオパシーを発現する（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．、Ｎｏｓｅ，Ｍ．、Ｈｉａｉ，Ｈ．、Ｍｉｎａｔｏ，Ｎ．、およびＨｏｎｊｏ，Ｔ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
１１，１４１−１５１、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．、Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．、Ｔａｎａｋａ，Ｙ．、Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．、Ｈａｒａ，Ｍ．、Ｍａｔｓｕｍｏｒｉ，Ａ．、Ｓａｓａｙａｍａ，Ｓ．、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ａ．、Ｈｉａｉ，Ｈ．、Ｍｉｎａｔｏ，Ｎ．、およびＨｏｎｊｏ，Ｔ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１，３１９−３２２）。自己免疫は、リガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両方によるシグナル伝達の喪失に起因する可能性が最も高い。最近になって、ＣＤ８０は、阻害性シグナルを変換してＴ細胞にするＰＤ−Ｌｌの第２の受容体として同定された（Ｂｕｔｔｅ，Ｍ．Ｊ．、Ｋｅｉｒ，Ｍ．Ｅ．、Ｐｈａｍｄｕｙ，Ｔ．Ｂ．、Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．、およびＦｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７，１１１−１２２）。Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４の受容体は、依然として不明のままである。

【0008】

〔０００８〕 最も良く特徴づけられている共刺激リガンドは、Ｂ７．１およびＢ７．
２であり、それらは、Ｂ７ファミリーリガンドおよび受容体等の多くの重要な免疫制御因子から成るＩｇスーパーファミリーに属する。Ｉｇスーパーファミリーの成員は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現され、それらの受容体は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４である。ＣＤ２８は、ナイーブおよび活性化Ｔ細胞によって発現され、最適なＴ細胞活性化にとって非常に重要である。対照的に、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化に続いて誘導され、Ｂ７．１／Ｂ７．２に結合することによってＴ細胞活性化を阻害し、ＣＤ２８媒介性共刺激を障害する。Ｂ７．１およびＢ７．２ノックアウト（ＫＯ）マウスが、適応免疫応答機能において障害を有する一方で、ＣＴＬＡ−４ ＫＯマウスは、炎症を適切に制御することができず、全身性自己免疫疾患を発現する。時間とともに、Ｂ７ファミリーリガンドは、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳリガンド）およびＢ７−Ｈ３等の共刺激リガンド、ならびにＢ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１またはＢ７ｘ）、およびＢ７−Ｈ６等の共阻害リガンドを含むまでに拡張している。したがって、さらなるＣＤ２８ファミリー受容体が同定されている。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞上で発現され、Ｂ７−Ｈ２に結合する。ＩＣＯＳは、正の共制御因子であり、Ｔ細胞活性化、分化、および機能にとって重要である。その一方で、プログラム死１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞応答を負に制御する。ＰＤ−１ ＫＯマウスは、ループス様の自己免疫疾患、または拡張型心筋ミオパシーを発現した。ＶＩＳＴＡ（本発明の焦点である免疫抑制分子）とは対照的に、２つの阻害性Ｂ７ファミリーリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、はっきりと異なる発現パターンを有する。ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣおよびマクロファージ上で誘導可能に発現される一方で、ＰＤ−Ｌ１は、造血細胞および非造血細胞型の両方の上で広範囲に発現される。ＰＤ−１受容体の免疫抑制の役割と一致して、ＰＤ−Ｌ１−／−およびＰＤ−Ｌ２−／−マウスを用いた研究は、両リガンドともに、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害する重複した役割を有することを示している。ＰＤ−Ｌ１欠乏は、自己免疫性糖尿病の非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）モデルおよび多発性硬化症（実験的自己免疫性脳脊髄炎、ＥＡＥ）のマウスモデルの両方において、疾患の進行を高める。ＰＤ−Ｌ１−／−Ｔ細胞は、両疾患モデルにおいて、上昇したレベルの炎症性サイトカインを産生する。加えて、ＮＯＤマウスの研究は、ＰＤ−Ｌ１の組織発現（すなわち、膵臓内）が、炎症を局部的に制御するその能力に特異的に寄与することを実証している。ＰＤ−Ｌ１はまた、同種胎児への母体免疫応答を決定的に制御する胎盤合胞体栄養細胞上で高度に発現される。

【0009】

〔０００９〕 免疫制御への分子のこのファミリーの強力な影響を考慮して、癌マウスモデルにおける実質的な試みが、分子のこのファミリーを標的とことによって保護抗腫瘍免疫を誘導することができることを示している。抗ＣＴＬＡ−４が関与する研究は、黒色腫のマウスモデルおよび臨床試験における改善された治療的有用性を立証している。Ｂ１６−ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｖａｘ）のワクチン投与を受けたマウスは、ＣＴＬＡ−４遮断抗体と組み合わせられると、Ｂ１６黒色腫の拒絶を促進する。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、広範囲のマウス腫瘍モデルにおいて、改善された抗腫瘍免疫および宿主生存も立証する。最後に、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１は、共阻害分子の同一のファミリーに属するが、それらが、Ｔ細胞活性化を阻害するために異なる非冗長機構を使用し、組み合わせて使用されるときに、マウス黒色腫における宿主生存を強化する抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１／Ｌの能力に相乗効果が存在することを証拠が示している。

【0010】

〔００１０〕 前述に基づいて、免疫、特にＴ細胞免疫を制御するこれらのファミリーメンバーの重要な役割を考慮すると、別の新規のＢ７型ファミリーメンバーならびにそのリガンドおよび調節因子の解明は有用であろう。

【発明の概要】

【0011】

〔００１１〕 本発明は、活性を調節し、かつ／またはその対抗受容体への特定の制御性Ｔ細胞タンパク質の結合を特異的に結合もしくはブロックする治療方法に関する。ＰＤ
−Ｌ３またはＶＩＳＴＡと指定されるこのタンパク質は、新規の構造的に異なったＩｇ−スーパーファミリー阻害リガンドであり、その細胞外ドメインは、Ｂ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１との相同性を有する。この分子は、本明細書において、同義に、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ、すなわちＴ細胞活性化のＶ−ドメイン免疫グロブリン抑制因子（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（ＶＩＳＴＡ）と称される。ＶＩＳＴＡは、主に造血コンパートメント内で発現され、骨髄性ＡＰＣおよびＴ細胞上で高度に制御される。ＶＩＳＴＡ阻害経路の治療的介入は、多種多様の癌の治療のためにＴ細胞媒介性免疫を調節する新規の取り組みを表す。

【0012】

〔００１２〕 本発明は、具体的には、膀胱癌、卵巣癌、および黒色腫を含む特定の癌を治療するための、ＶＩＳＴＡまたはＰＤ−Ｌ３に特異的な抗体の使用に関する。
〔００１３〕 加えて、本発明は、具体的には、アレルギー、自己免疫、および炎症状態等の免疫抑制が治療的に所望される状態を治療するためにＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質、特に多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、およびそれらを発現するウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）の使用に関する。

【0013】

〔００１４〕 以下に開示されるように、ＶＩＳＴＡの発現は、造血コンパートメントだけに限定されているようであり、このタンパク質は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｔ^ｒｅｇ、およびＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのより低いレベルの発現を伴って、成熟骨髄性細胞（ＣＤ１１ｂ^{ｂｒｉｇｈｔ}）上で高度に発現される。可溶性ＶＩＳＴＡタンパク質、例えば、可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質、またはＡＰＣ上でのＶＩＳＴＡ発現は、インビトロでＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖ならびにサイトカイン産生を抑制する。抗ＶＩＳＴＡ抗体、例えば、抗ＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体（１３Ｆ３）が、インビトロでＶＩＳＴＡ^＋ＡＰＣによってＴ細胞応答のＶＩＳＴＡ誘導抑制を阻止したことも観察される。また、抗ＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体が、インビボで、ＥＡＥに悪影響を及ぼし、脳炎誘発性Ｔｈ１７ｓの頻度を増加させたことが発見されている。さらに、以下に詳細に開示されるように、抗ＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体が、複数（４匹）のマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍寛解を誘導することが見出されている。これらのモデルにおける骨髄由来の抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）上のＶＩＳＴＡ発現は、非常に高度であり、ＶＩＳＴＡ^＋ＭＤＳＣが、腫瘍特異的免疫を抑制することを示唆する。本明細書に示されるように、ＶＩＳＴＡは、インビトロおよびインビボの両方で、マウスおよびヒト（インビトロのみ）において、Ｔ細胞上での免疫抑制活性を発揮し、自己免疫の発症および癌への免疫応答を制御する重要なメディエータである。具体的に、データは以下を示す：
〔００１５〕 （１）ＶＩＳＴＡは、Ｉｇスーパーファミリーの新しいメンバーであり、ＰＤ−Ｌ１とのかすかな配列相同性を有するＩｇ−Ｖドメインを含有する。我々は、本明細書において、Ｉｇ融合タンパク質として産生されるとき、または人工的なＡＰＣ上で過剰発現されるとき、ＶＩＳＴＡは、マウスおよびヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖ならびにサイトカイン産生の両方を阻害することを開示する。

【0014】

〔００１６〕 （２）骨髄性ＡＰＣ上でのＶＩＳＴＡ発現は、インビトロＴ細胞応答を阻害する。
〔００１７〕 腫瘍内微小環境におけるＭＤＳＣ上でのＶＩＳＴＡ発現は、極めて高度である。多くの細胞表面分子の表現型および機能分析が、Ｔ細胞のＭＤＳＣ媒介抑制に関与すると先に示唆されている。ＣＤ１１５、ＣＤ１２４、ＣＤ８０、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２はＭＤＳＣによって発現されたが、それらの発現レベルまたは陽性細胞の割合において、ＭＤＳＣと免疫抑制活性を欠く腫瘍を含まないマウス由来の細胞との間の差異は見出されなかった。したがって、我々は、ＶＩＳＴＡが、ＭＤＳＣ上における主要なＢ７負の制御因子であることを予測する。

【0015】

〔００１８〕 （４）抗体媒介性ＶＩＳＴＡ遮断は、自己腫瘍に対する保護免疫を誘導する。
〔００１９〕 それに基づいて、ＶＩＳＴＡは、保護抗腫瘍免疫の発達を妨害する、ＭＤＳＣ上での支配的な負の免疫制御分子のようである。したがって、抗ＶＩＳＴＡ抗体でこの分子の活性をブロックすることは、ヒトおよび他の哺乳動物における保護抗腫瘍免疫の発達を可能にする。

【0016】

〔００２０〕 したがって、本発明は、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインまたはそのフラグメントの複数のコピーと、免疫調節因子として、かつ異なる癌、例えば、膀胱癌、卵巣癌、およびリンパ腫、自己免疫疾患、アレルギー、感染、および炎症状態、例えば、多発性硬化症および関節炎の治療のために、ＶＩＳＴＡの活性を結合または調節する（アゴナイズまたはアンタゴナイズする）ＶＩＳＴＡ結合剤、例えば、その小分子および抗体またはフラグメントとを含む、可溶性ＶＩＳＴＡタンパク質、例えば、融合タンパク質および多量体ＶＩＳＴＡタンパク質を使用する方法に関する。

【0017】

〔００２１〕 以下に詳細に説明されるように、このタンパク質は、新規の阻害リガンドであり、細胞外Ｉｇ−Ｖドメインが、２つの既知のＢ７ファミリーリガンドであるプログラム死リガンド１および２（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２）に対して相同性を有し、かつ特有の配列特徴、ならびにインビトロおよびインビボにおいて、ＡＰＣおよびＴ細胞の一部分上で特徴的な発現パターンを呈する（これがＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを他のＢ７ファミリーリガンドと区別する）。このタンパク質は、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖および分化に機能的影響を与える（ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖、ならびにサイトカイン産生を抑制する）とみられている。この発現パターンおよびＴ細胞への阻害影響に基づいて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡは、恐らく、Ｔ細胞と骨髄由来のＡＰＣとの間の同族相互作用中のＴ細胞応答を負に制御する制御リガンドとして機能する。

【0018】

〔００２２〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡが、リガンドのＢ７ファミリーのメンバーのようである一方で、この分子は、他のＢ７ファミリーリガンドとは異なり、Ｉｇ−Ｃドメインを有さずＩｇ−Ｖドメインのみを含有し、系統発生学的に、よりＢ７ファミリー受容体プログラム死−１（ＰＤ−１）に近い。それに基づいて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ、およびそれに特異的なアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、Ｔ細胞活性化および分化を制御し、より広範には、免疫応答を制御する制御ネットワークを調節することができる。とりわけ、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに特異的な抗体は、自己免疫、炎症性応答、および疾患、アレルギー、癌、感染性疾患、ならびに移植術における免疫応答の調節に有用である。

【0019】

〔００２３〕 したがって、本発明は、一部分において、好ましくは、インビボでＶＩＳＴＡを調節する配列番号１もしくは３に特異的にハイブリダイズする遺伝子によってコードされるヒトもしくはマウスＰＤ−Ｌ３または配列番号２、４、もしくは５に説明されるＶＩＳＴＡポリペプチドと少なくとも７０〜９０％同一のアミノ酸配列を含む、単離した可溶性ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質または融合タンパク質、例えば、可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質または多量体ＶＩＳＴＡタンパク質、あるいはそのオルソログもしくはフラグメント、および薬学的に許容される担体を含有する、例えば、治療、診断、または免疫調節用途のための組成物に関する。いくつかの実施形態において、可溶性または多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、異種（非ＶＩＳＴＡ）タンパク質に直接的もしくは間接的に結合され得るか、あるいはウイルスベクターまたは例えば、Ｔ細胞等のトランスフェクト免疫細胞を含有する細胞によって発現され得る。

【0020】

〔００２４〕 本発明は、任意で、Ｉｇポリペプチド、例えば、Ｆｃ領域または受容体
分子等の別のタンパク質をコードする配列に融合される、配列番号２、４、もしくは５に説明されるヒトまたはマウスＶＩＳＴＡアミノ酸配列と少なくとも７０〜９０％同一のＶＩＳＴＡタンパク質をコードする単離核酸、またはそのフラグメントもしくはオルソログを含む発現ベクター、および前記ベクターを含有する宿主細胞も提供する。

【0021】

〔００２５〕 本発明は、特定的に、単離結合剤、好ましくは、配列番号２、４、もしくは５に説明されるアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質、またはその変異体、フラグメント、もしくはオルソログに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントにも関する。好ましい実施形態において、結合剤は、インビトロまたはインビボでＶＩＳＴＡ活性を調節する（刺激または拮抗する）。最も好ましい実施形態では、結合剤は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体である。

【0022】

〔００２６〕 本発明は、免疫細胞の応答が調節されるように、一次シグナルの存在下で、免疫細胞を、ＶＩＳＴＡタンパク質、またはそれに特異的な結合剤とインビトロまたはインビボで接触させることによって、免疫細胞応答を調節するための方法をさらに提供する。（ＶＩＳＴＡまたはその調節因子の相互作用は、免疫細胞にシグナルを伝送し、免疫応答を制御する。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質は、高レベルで、骨髄樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージを含む骨髄性抗原提示細胞上で発現され、より低い密度で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現される。免疫活性化の際に、骨髄性ＡＰＣ上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現は上方制御されるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現は下方制御される。）したがって、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸およびポリペプチド、およびそのアゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、免疫応答の調節に有用である。

【0023】

〔００２７〕 別の態様では、本発明は、ＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする、好ましくは、可溶性融合タンパク質および多量体ＶＩＳＴＡタンパク質ならびにＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡをコードする核酸の検出のためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして好適な核酸フラグメントをコードする単離核酸分子を提供する。一実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子は、本明細書に示される配列番号１もしくは３のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡあるいはその補体をコードするヌクレオチド配列（例えば、ヌクレオチド配列の全長）と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である。

【0024】

〔００２８〕 別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子は、配列番号２、４、もしくは５のアミノ酸配列に対して特定の割合の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子は、配列番号２、４、もしくは５のアミノ酸配列の全長またはその細胞外ドメインと少なくとも約７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0025】

〔００２９〕 別の好ましい実施形態では、単離核酸分子は、ヒトもしくはマウスまたはＶＩＳＴＡのアミノ酸配列あるいはその中の保存領域もしくは機能ドメインをコードする。さらに別の好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号２、４、または５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。さらに別の好ましい実施形態では、核酸分子は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０以上のヌクレオチド長である。さらに好ましい実施形態では、核酸分子は、少なくとも約５０、１００、
１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０以上のヌクレオチド長であり、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を有するか、あるいは（本明細書に記載の）ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ機能を調節するポリペプチドをコードする。

【0026】

〔００３０〕 本発明の別の実施形態は、核酸分子、好ましくは、非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする核酸分子と比較して、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子を特異的に検出するＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子を特徴とする。例えば、一実施形態において、かかる核酸分子は、少なくとも約８８０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０以上のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号２、４、もしくは５に示されるポリペプチドまたはその補体をコードする核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、かかる核酸分子は、少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００以上のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０以上のヌクレオチド長を含むＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのフラグメントをコードする核酸分子にハイブリダイズし、配列番号２、４、もしくは５のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドあるいはその補体をコードする配列番号１および３の開示の核酸配列の少なくとも１５（すなわち、１５隣接）のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列またはその補体を含む核酸分子にハイブリダイズする。

【0027】

〔００３１〕 さらに他の好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号２もしくは４もしくは５のアミノ酸配列を含むポリペプチドの自然発生対立遺伝子変異体をコードし、核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは３を含む核酸分子の補体またはその補体にハイブリダイズする。

【0028】

〔００３２〕 本発明の別の実施形態は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子に対してアンチセンスであり、例えば、配列番号１もしくは３に示されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子のコード鎖に対してアンチセンスである単離核酸分子を提供する。

【0029】

〔００３３〕 本発明の別の態様は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子を含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、ベクターは、組換え発現ベクターである。
〔００３４〕 別の実施形態では、本発明は、本発明のベクターを含有する宿主細胞を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含有する宿主細胞を提供する。本発明は、好適な培地で、宿主細胞、例えば、組換え発現ベクターを含有する本発明の非ヒト哺乳類細胞等の哺乳類宿主細胞を培養することによって、ポリペプチド、好ましくは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを産生するための方法も提供し、したがって、ポリペプチドが産生される。

【0030】

〔００３５〕 本発明の別の態様は、単離もしくは組換えＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはそのフラグメントもしくは部分）を特徴とする。一実施形態において、単離ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ融合タンパク質は、以下のドメインのうちの少なくとも１つ以上を含む：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。

【0031】

〔００３６〕 好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、以下のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜
貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの少なくとも１つ以上を含み、配列番号２もしくは４もしくは５のアミノ酸配列と少なくとも約７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、以下のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの少なくとも１つ以上を含み、（本明細書に記載の）ＶＩＳＴＡまたはＰＤ−Ｌ３活性を有する。

【0032】

〔００３７〕 さらに別の好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ３ポリペプチドは、以下のドメイン：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの少なくとも１つ以上を含み、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１または３のヌクレオチド配列を含む核酸分子の補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。

【0033】

〔００３８〕 別の実施形態では、本発明は、配列番号２もしくは４もしくは５のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントまたは部分を特徴とし、フラグメントは、配列番号２もしくは４のアミノ酸配列の少なくとも１５個のアミノ酸（すなわち、隣接アミノ酸）を含む。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、配列番号２、４、もしくは５のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る。別の実施形態では、本発明は、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列またはその補体と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のヌクレオチド配列から成る核酸分子によってコードされるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを特徴とする。本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列を含む核酸分子の補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列から成る核酸分子によってコードされるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを特徴とする。

【0034】

〔００３９〕 本発明のポリペプチドまたはその部分、例えば、その生物学的に活性な部分は、非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列）に作動可能に結合されて、融合ポリペプチドを形成することができる。本発明はさらに、本発明のポリペプチド、好ましくは、ヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体等の抗体を特徴とする。

【0035】

〔００４０〕 本発明はまた、所望の機能特性、例えば、ＴＣＲ活性化へのタンパク質の抑制効果、抗ＣＤ３に対するＣＤ４Ｔ細胞増殖性応答へのタンパク質の抑制効果、同族ＣＤ４Ｔ細胞の抗原特異的増殖性応答の抑制、ＩＬ−２およびガンマインターフェロン等の特定のサイトカインの発現へのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの抑制効果等の、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの免疫への特定の効果の調節に基づいて、このタンパク質またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質に対して産生されるモノクローナル抗体のパネルから、所望の機能特性を有する抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体を選択する方法に関する。特に好ましい実施形態では、インビトロにおいて、可溶性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−タンパク質、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の存在下で、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ関連免疫機能へのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの抑制効果を強化する、治療薬として使用される抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体が選択される。これは、思いがけなくも（以下に示される）、これらの抗体が、インビボで、それらの免疫へのインビトロ効果からの予想に反して挙動する、すなわち、これらの抗またはＶＩＳＴＡモノクローナル抗体が免疫抑制的であるため、好ましい。

【0036】

〔００４１〕 加えて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド（またはその生物学的に活性な部分）またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の調節因子、すなわち、前
述の方法を用いて選択されるもの等の抗体は、薬学的に許容される担体を任意で含む薬学的組成物に組み込まれ得る。

【0037】

〔００４２〕 別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質は、免疫細胞活性化を阻害するか、または低下させるために、阻害シグナルとして使用される。この実施形態において、阻害シグナルは、免疫細胞上で阻害性受容体（例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１）に結合し、それによって、（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃポリペプチドを介して）活性化受容体に結合する一次シグナルに拮抗する。阻害は、例えば、第２のメッセンジャー生成の阻害；増殖の阻害；免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、例えば、食作用の減少、抗体産生の減少、細胞傷害性の減弱、免疫細胞のメディエータ（サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および／もしくはアレルギー性応答のメディエータ等）産生不全；またはアネルギーの発達を含む。

【0038】

〔００４３〕 特定の実施形態において、一次シグナルは、ＴＣＲに結合して、一次刺激シグナルを開始するリガンド（例えば、ＣＤ３または抗ＣＤ３）である。かかるＴＣＲリガンドは、商業的供給源から容易に入手可能であり、特定の例として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手されるハイブリドーマ細胞から調製された抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３、および抗ＣＤ３モノクローナル抗体Ｇ１９−４が挙げられる。代替実施形態では、一次シグナルは、ホルボールエステル（例えば、ホルボールミリスチン酸アセテート）等のタンパク質キナーゼＣ活性化因子、およびカルシウムイオノフォア（例えば、細胞質カルシウム濃度を上昇させるイオノマイシン）等を含む他の機構を介して、Ｔ細胞に送達される。かかる作用物質の使用は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体をバイパスするが、刺激シグナルをＴ細胞に送達する。一次シグナルの役割を果たす他の作用物質は、天然および合成リガンドを含み得る。天然リガンドは、ペプチドの存在の有無にかかわらず、ＭＨＣを含み得る。他のリガンドは、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、ＰＨＡ等のマイトジェン、または他のスーパー抗原、ペプチド−ＭＨＣ四量体（Ａｌｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４（５２８４）：９４−６）および可溶性ＭＨＣ二量体（Ｄａｌ Ｐｏｒｔｏ，ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６６７１−５）を含み得るが、それらに限定されない。

【0039】

〔００４４〕 本発明の方法に従って活性化された免疫細胞活は、後に、エクスビボで拡大され、様々な疾患の治療および予防において使用することができ、例えば、クローニングおよび拡張されたヒトＴ細胞は、インビトロそれらの制御活性を維持する（Ｇｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６５２）：７３７−４２）。拡張の前に、Ｔ細胞の供給源は、対象（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット等の哺乳動物、またはそれらの遺伝子導入種）から得られる。Ｔ細胞を、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、脾臓組織、腫瘍、またはＴ細胞株を含むいくつかの供給源から得ることができる。Ｔ細胞を、ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離等の当業者に既知の任意の数の技術を用いて、対象から採血される単位血液から得ることができる。

【0040】

〔００４５〕 別の態様では、本発明は、生体試料を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、タンパク質、またはポリペプチドを検出することができる作用物質と接触させることによって、生体試料中のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、タンパク質、またはポリペプチドの存在を検出するための方法を提供し、したがって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、タンパク質、またはポリペプチドの存在が、生体試料中で検出される。このＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現を使用して、炎症部位等のある特定の疾患部位を検出することができる。

【0041】

〔００４６〕 別の態様では、本発明は、生体試料を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性の指標を検出することができる作用物質と接触させることによって、生体試料中のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性の存在を検出するための方法を提供し、したがって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性の存在が、生体試料中で検出される。

【0042】

〔００４７〕 別の態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を調節するための方法を提供し、細胞中のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性が調節されるように、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを発現することができる細胞を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を調節する作用物質、好ましくは、抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体と接触させることを含む。一実施形態において、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を阻害する。別の実施形態では、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を刺激する。さらなる実施形態では、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を妨害または強化する。一実施形態において、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドに特異的に結合する抗体である。別の実施形態では、作用物質は、ペプチド、ペプチド模倣物、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに結合する他の小分子である。

【0043】

〔００４８〕 さらに別の実施形態では、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子の転写、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡの翻訳、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの翻訳後修飾を調節することによって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの発現を調節する。別の実施形態では、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスのヌクレオチド配列を有する核酸分子である。

【0044】

〔００４９〕 一実施形態において、本発明の方法は、対象に、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ調節因子である作用物質を投与することによって、異常な、不十分な、または望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸発現もしくは活性を特徴とする障害または状態を有する対象を治療するために使用される。好ましい一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ調節因子は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、好ましくは、以下に記載の可溶性融合タンパク質または多量体ＶＩＳＴＡタンパク質または抗ＶＩＳＴＡ抗体である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ調節因子は、例えば、アデノウイルスベクター中のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子である。別の実施形態では、本発明は、対象を、免疫応答を調節する追加の作用物質で治療することをさらに提供する。

【0045】

〔００５０〕 さらに別の実施形態では、本発明は、抗原、およびＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を調節する（強化または阻害する）作用物質を含むワクチンを提供する。好ましい実施形態において、ワクチンは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を阻害する。

【0046】

〔００５１〕 本発明はまた、（ｉ）ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする遺伝子の異常な修飾または変異、（ｉｉ）遺伝子の誤制御、および（ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの異常な翻訳後修飾のうちの少なくとも１つを特徴とする遺伝子変化の存在または不在を同定するための診断アッセイを提供し、遺伝子の野生型形態は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を有するポリペプチドをコードする。

【0047】

〔００５２〕 別の態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を有するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを含む指標組成物を提供すること、指標組成物を試験化合物と接触させること、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの
活性を調節する化合物を同定するために、指標組成物におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性への試験化合物の効果を決定することによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに結合するか、またはその活性を調節する化合物を同定するための方法を提供する。

【0048】

〔００５３〕 一態様では、本発明は、免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を調節するための方法を特徴とし、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを発現する抗原提示細胞を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの形態、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を調節する作用物質からなる群から選択される作用物質と接触させることを含み、したがって、免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用が調節される。好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を調節する作用物質は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体である。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用は、上方制御される。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用は、下方制御される。一実施形態において、方法はさらに、免疫細胞または抗原提示細胞を、免疫応答を調節する追加の作用物質と接触させることを含む。

【0049】

〔００５４〕 一実施形態において、接触させるステップは、インビトロで行われる。別の実施形態では、接触させるステップは、インビボで行われる。一実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹枝状細胞、Ｂ細胞、および骨髄性細胞からなる群から選択される。

【0050】

〔００５５〕 別の態様では、本発明は、免疫細胞の活性化を阻害するか、または増加させるための方法に関し、細胞におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの活性もしくは発現を増加させるか、または阻害することを含み、したがって、免疫細胞活性化が阻害されるか、または増加する。

【0051】

〔００５６〕 さらに別の態様では、本発明は、抗原、およびＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を阻害する作用物質を含むワクチンに関する。

【0052】

〔００５７〕 さらに別の態様では、本発明は、抗原、およびＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を促進する作用物質を含むワクチンに関する。

【0053】

〔００５８〕 別の態様では、本発明は、免疫応答の上方制御から恩恵を受ける状態を有する対象を治療するための方法に関し、対象の免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を阻害する作用物質を投与することを含み、したがって、免疫応答の上方制御から恩恵を受ける状態が治療される。好ましい一実施形態において、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに結合し、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を阻害するブロッキング抗体または小分子を含む。別の実施形態では、本方法はさらに、対象に対する免疫応答を上方制御する第２の作用物質を投与することを含む。別の態様では、本発明は、免疫応答の下方制御から恩恵を受ける状態を有する対象を治療するための方法に関し、対象の細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を刺激する作用物質を投与することを含み、したがって、免疫応答の下方制御から恩恵を受ける状態が治療される。

【0054】

〔００５９〕 例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質または結合剤で治療される状態は、腫瘍、病原性感染、炎症性免疫応答もしくは状態、好ましくは、比較的顕著ではない炎症状態、または免疫抑制疾患からなる群から選択される。特定の例として、多発性硬化症、甲状腺炎、リウマチ性関節炎、ＩＩ型およびＩ型糖尿病、ならびに膀胱癌、卵巣癌、黒色腫、肺癌、および他の癌等の転移性癌を含む進行性および初期癌が挙げられ、ＶＩＳＴＡは、効果的な抗腫瘍応答を抑制する。ある場合には、個人に、抗ＶＩＳＴＡ抗体もしくはＶＩＳＴＡ融合タンパク質をコードする核酸を発現する細胞またはウイルスベクターが投与され得る。

【0055】

〔００６０〕 一実施形態において、作用物質は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を刺激する抗体または小分子を含む。別の実施形態では、方法はさらに、対象に、ＰＤ−Ｌ!、ＰＤ−Ｌ２、もしくはＣＴ
ＬＡ−４融合タンパク質、またはそれに特異的な抗体等の免疫応答を下方制御する第２の作用物質を投与することを含む。

【0056】

〔００６１〕 本発明に従って、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質、結合剤、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアンタゴニストまたはアゴニストを用いて治療可能な例示的な状態は、例として、移植、アレルギー、感染性疾患、癌、および炎症性または自己免疫障害、例えば、炎症性免疫障害を含む。前述の特定の例として、１型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性疾患、アレルギー性障害、喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚障害、クローン病および潰瘍性大腸炎等の胃腸障害、移植拒絶反応、連鎖球菌感染後および自己免疫性腎不全、敗血症性ショック、全身性炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、および毒物注入；自己炎症性疾患、ならびに変形性関節炎、結晶性関節炎、および被膜炎、ならびに他の関節症を含む変性性骨および関節疾患が挙げられる。さらに、本方法および組成物を使用して、腱炎、靱帯炎、および外傷性関節損傷を治療することができる。

【0057】

〔００６２〕 別の態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの活性を調節する化合物についてスクリーニングするための細胞に基づくアッセイに関し、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ標的分子を発現する細胞を、試験化合物と接触させること、およびＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定することを含む。

【0058】

〔００６３〕 さらに別の態様では、本発明は、標的分子へのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの結合を調節する化合物についてスクリーニングするための細胞を含まないアッセイに関し、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、試験化合物と接触させること、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。

【0059】

〔００６４〕 別の実施形態では、本発明は、第１および第２の抗原濃度において、Ｔ細胞活性化またはサイトカイン産生へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの効果を調節する化合物、例えば、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体を同定する方法に関し、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ標的分子を発現するＴ細胞を、第１の抗原濃度において試験化合物と接触させること、第１の抗原濃度においてＴ細胞増殖またはサイトカイン産生を調節する試験化合物の能力を決定すること、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ標的分子を発現するＴ細胞を、第２の抗原濃度において試験化合物と接触させること、および第２の抗原濃度においてＴ細胞増殖またはサイトカイン産生を調節する試験化合物の能力を決定することを含み、それによって、第１および第２の抗原濃度Ｔ細胞活性化またはサイトカイン産生を調節する化合物を同定する。

【0060】

〔００６５〕 他の特定の実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質のパネルをスクリーニングして、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞分化、増殖、および／もしくはサイトカイン産生へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの効果をインビトロまたはインビボで阻害または促進するものを選択する。

【0061】

〔００６６〕 好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに特異的な主題のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質、核酸、およびリガンド、好ましくはＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ機能に所望な効果を与える抗体は、癌、自己免疫疾患、アレルギー、炎症性障害または感染、より具体的には、重症複合型免疫不全等の免疫系障害、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、リンパ球増殖性症候群、炎症性腸疾患、アレルギー、喘息、移植片対宿主疾患、および移植拒絶反応；細菌およびウイルス等の感染性病原体への免疫応答；ならびにリンパ腫および白血病等の免疫系の癌等の状態を治療するために使用される。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1A】配列分析。Ａ．マウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの全長アミノ酸配列。Ｂ．マウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡと、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４を含む、選択されたＢ７ファミリーリガンドとの間の細胞外Ｉｇドメインのアミノ酸配列アラインメント。Ｃ．ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、およびＩＣＯＳを含む、Ｂ７ファミリー受容体とのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ Ｉｇドメインのアラインメント。Ｉｇ−ｖドメイン「．．．．」、Ｉｇ−ｃドメイン「＿＿＿＿」。アラインメントを、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズム（Ｌｏｇ予想による複数の配列比較）を用いて行った。Ｄ．ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡと他のＢ７ファミリーリガンドおよび受容体との間のＩｇ−Ｖドメインの配列同一性（％）を、ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて計算する。Ｅ．ヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとマウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとの間の配列相同性。同一の残基を、黒色で網掛けしている。高度保存残基および半保存残基を、それぞれ、黒色および薄灰色で網掛けしている。

【図1B】同上。

【図1C】同上。

【図1D】同上。

【図1E】同上。

【図2】他の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーメンバーとのマウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの系統発生分析。マウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ、およびＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮ３Ａ３、ＢＴＮ２Ａ２、およびＢＴＮ１Ａ１を含む、他のＩｇスーパーファミリーメンバーの全長配列を、ＰｈｙＭＬアルゴリズム（系統発生最大尤度）を用いて分析した。分岐の距離を、系統樹分岐接合点で示した。

【図3A】ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの組織発現および造血細胞発現パターン。Ａ．マウス組織由来の全長ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのＲＴ−ＰＣＲ。レーン：（１）筋肉（２）心臓（３）目（４）胸腺（５）脾臓（６）小腸（７）腎臓（８）肝臓（９）脳（１０）乳腺（１１）肺（１２）卵巣（１３）骨髄。Ｂ．精製造血細胞型由来の全長ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのＲＴ−ＰＣＲ。レーン（１）腹腔マクロファージ（２）脾臓ＣＤ１１ｂ＋単球（３）脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（４）脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（５）脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞（６）脾臓Ｂ細胞。Ｃ〜Ｅ．胸腺および脾臓由来の脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上（Ｃ）、ＣＤ１１ｂ＋単球上（Ｄ）、ならびに脾臓および腹膜腔由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣサブセット上（Ｅ）でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現のフローサイトメトリー分析。Ｆ．脾臓Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および顆粒球も分析する。Ｇ．腸間膜リンパ節、末梢リンパ節、脾臓、血液、および腹膜腔を含む異なる組織部位由来の造血細胞上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの示差的発現。少なくとも３回の独立した実験からの代表的なデータを示す。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図3E】同上。

【図3F】同上。

【図3G】同上。

【図4A-1】ＧＮＦ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）遺伝子アレイデータベース、ならびにＮＣＢＩ ＧＥＯ（遺伝子発現オムニバス）データベースからのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの遺伝子アレイデータ。

【図4A-2】同上。

【図4A-3】同上。

【図4B】同上。

【図4C-1】同上。

【図4C-2】同上。

【図4C-3】同上。

【図4D】同上。

【図5】ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡハムスターモノクローナル抗体の特異性。ＲＦＰに融合されるＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのいずれかを過剰発現するマウスＥＬ４細胞株を、ハイブリドーマ培養物由来の上清を用いて染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。２つの代表的な陽性クローンを示す。

【図6】インビトロで培養された脾臓細胞上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現と、他のＢ７ファミリーリガンドとの比較。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ高単球、およびＣＤ１１ｃ＋ＤＣを含む、造血細胞型上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡおよび他のＢ７ファミリーリガンド（すなわち、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４）の発現を比較した。活性化を伴って、かつ活性化を伴わないで、細胞を、新鮮に単離するか、またはインビトロで２４時間培養するかのいずれかを行った。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート結合された□ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）で活性化し、ＣＤ１１ｂ高単球およびＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、ＩＦＮアルファ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）で活性化した。３つの独立した実験の代表的な結果を示す。

【図7A】免疫化中のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡおよび他のＢ７ファミリーリガンドのインビボ発現パターンの比較。ＤＯ１１．１０ＴＣＲ遺伝子導入マウスの側腹部を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化されたトリオボアルブミン（ＯＶＡ）で免疫した。流入領域および非流入領域リンパ節細胞を、免疫化の２４時間後に収集し、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現について、フローサイトメトリーを用いて分析した。少なくとも４つの独立した実験の代表的な結果を示す。Ａ．高レベルのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを発現するＣＤ１１ｂ＋細胞の集団を、免疫化から２４時間経った時点で、流入領域リンパ節内でＣＦＡ単独ではなく、ＣＦＡ／ＯＶＡで誘導した。これらの細胞は、Ｆ４／８０＋マクロファージおよびＣＤ１１Ｃ＋樹枝状細胞の混合表現型である。Ｂ．ＣＤ１１ｂ高単球、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、およびＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現を、免疫化から２４時間経った時点で分析した。

【図7B】同上。

【図8】免疫化に応答した、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現の喪失。ＤＯ１１．１０マウスの側腹部を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化されたトリオボアルブミン（ＯＶＡ）で免疫した。流入領域および非流入領域リンパ節細胞を、免疫化の４８時間後に収集し、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現について、フローサイトメトリーを用いて分析した。２つの独立した実験の代表的な結果を示す。

【図9A】固定化ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を阻害した。Ａ．ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、共吸収ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇと共に、またはそれを伴わずに、プレート結合された□ＣＤ３で刺激した。ＣＦＳＥ低細胞の割合を定量化し、Ｂに示す。Ｃ．ＰＤ−１ ｋｏマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞も、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇによって抑制された。Ｄ．ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ媒介性抑制は持続的であり、遅れて作動することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇの存在下で、７２時間（ｉ）、もしくは２４時間（ｉｉ、ｉｉｉ、およびｉｖ）のいずれかの期間活性化した。２４時間予備活性化した細胞を採取し、特定された条件下でさらに４８時間再刺激した。７２時間の培養後に、細胞の増殖を分析した。（ｉｉ）ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇで予備活性化し、抗ＣＤ３で再刺激した細胞、（ｉｉｉ）抗ＣＤ３で予備活性化し、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇで再刺激した細胞、（ｉｖ）ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇと予備活性化し、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇで再刺激した細胞。二重のウェルを、全ての条件について分析した。少なくとも４つの実験の代表的な結果を示す。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図9D】同上。

【図10】類似したＰＤ−Ｌ１−ＩｇおよびＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質のＣＤ４＋Ｔ細胞増殖への阻害効果。バルク精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥで標識化し、滴定量のＰＤ−Ｌ１−ＩｇまたはＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質とともに、プレート結合された□ＣＤ３で刺激した。ＣＦＳＥ希釈物を７２時間時点で分析し、ＣＦＳＥ低細胞の割合を定量化した。二重のウェルを、全ての条件について分析した。２つの独立した実験の代表的な結果を示す。

【図11A】ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞および記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖へのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの抑制効果。Ａ．ナイーブ（ＣＤ２５〜ＣＤ４４低ＣＤ６２Ｌ高）および記憶（ＣＤ２５〜ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低）ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを分類し、ＣＦＳＥで標識化し、指示された比率のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇとともに、プレート結合された抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ）で刺激した。ＣＦＳＥ分裂特性を試験することによって、細胞増殖を７２時間時点で分析した。ＣＦＳＥ低細胞の割合（％）によって決定した増殖性細胞の割合（％）を計算し、Ｂに示す。二重のウェルを、全ての条件について分析した。２つの独立した実験の代表的な結果を示す。

【図11B】同上。

【図12A】ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、初期のＴＣＲ活性化および細胞増殖を抑制したが、アポトーシスを直接誘導しなかった。バルク精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート結合された抗ＣＤ３をＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇ（それぞれ、２．５μｇ／ｍＬおよび５ｇ／ｍＬ）とともに、１：２の比率で用いて刺激した。細胞を、２４時間および４８時間時点でのＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ４４の発現について、フローサイトメトリーを用いて分析した。細胞を、初期アポトーシスマーカーアネキシン−Ｖ、および細胞死マーカー７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）でも染色した。２つの独立した実験の代表的な結果を示す。

【図12B】同上。

【図13A】ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を阻害した。Ａ〜Ｂ．バルク精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート結合された抗ＣＤ３、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇを用いて、述べられた比率で刺激した。培養上清を、２４時間および４８時間後に収集した。ＩＬ−２およびＩＦＮ□のレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。Ｃ〜Ｄ．ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ナイーブ（ＣＤ２５〜ＣＤ４４低ＣＤ６２Ｌ高）および記憶（ＣＤ２５〜ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低）細胞集団に分類した。細胞を、プレート結合された□ＣＤ３およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇを１：２の比率で用いて刺激した。培養上清を、４８時間時点で収集し、ＩＬ−２およびＩＦＮ□の濃度について、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。Ｅ．バルク精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレート結合された□ＣＤ３、および指示された比率のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇで刺激した。培養上清中のＩＦＮ□を、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。全ての条件について、６つの二重ウェルの上清をＥＬＩＳＡ分析のためにプールした。少なくとも３つの実験の代表的な結果を示す。

【図13B】同上。

【図13C】同上。

【図13D】同上。

【図13E】同上。

【図14A】ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ媒介性抑制は、ＣＤ２８によって提供される中程度のレベルの共刺激を克服することができたが、高レベルの共刺激によって完全に逆転し、かつ外因性ＩＬ−２によって部分的に救助された。Ａ〜Ｂ．ＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート結合された□ＣＤ３をＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇのいずれかとともに、１：１の比率および１：２の比率で用いることによって活性化した。サイトカイン救助について、可溶性ｍＩＬ−２、ｍＥＬ７、ｍＩＬ１５、およびｍＩＬ−２３（全て４０ｎｇ／ｍＬ）を、細胞培養物に添加した（Ａ）。共刺激の効果を試験するために、□ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）を、□ＣＤ３およびＩｇタンパク質とともに示される比率で固定化した（Ｂ）。ＣＦＳＥ分裂特性を試験することによって、細胞増殖を、７２時間時点で分析した。Ｃ〜Ｄ．より低いレベルの共刺激の存在下で、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの抑制活性を試験するために、滴定量の□ＣＤ２８を、抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍＬ）およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質または対照−Ｉｇ融合タンパク質（１０μｇ／ｍＬ）で被覆して、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激した。細胞増殖を、７２時間時点で分析した。増殖性ＣＦＳＥ低細胞の割合を定量化し、Ｄに示した。二重のウェルを、全ての条件について分析した。３つの独立した実験の代表的なＣＦＳＥ特性を示す。

【図14B】同上。

【図14C】同上。

【図14D】同上。

【図15A】抗原提示細胞上で発現されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡは、ＣＤ４Ｔ細胞増殖を抑制した。Ａ〜Ｃ．ＭＨＣＩＩ分子Ｉ−Ａｄおよび共刺激分子Ｂ７−２を安定的に発現するＣＨＯ細胞株を、親細胞株として使用した。細胞を、ＰＤ−Ｌ３もしくＶＩＳＴＡ−ＲＦＰまたはＲＦＰ制御分子のいずれかを発現するレトロウイルスで形質導入した。形質導入された細胞を分類して、均一の発現レベルを達成した。抗原提示細胞としてそれらの能力を試験するために、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＣＨＯ−ＲＦＰ細胞を、マイトマイシンＣで処理し、滴定量のＯＶＡペプチドの存在下で、ＯＶＡ特異的遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞Ｄ０１１．１０と混合した。ＤＯ１１細胞の増殖を、ＣＦＳＥ分裂プロファイル（Ａ〜Ｂ）、またはトリチウム混入（Ｃ）のいずれかによって、７２時間時点で分析した。Ｄ．骨髄由来樹枝状細胞を、１０日間の培養期間中にＲＦＰまたはＢ７Ｂ−Ｈ５−ＲＦＰレトロウイルスで形質導入した。形質導入されたＣＤ１１ｃ＋ＲＦＰ＋ＤＣおよび非形質導入されたＣＤ１１ｃ＋ＲＦＰ＋ＤＣを分類かつ使用して、滴定量のＯＶＡペプチドの存在下で、ＯＶＡ特異的遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞ＯＴＩＩを刺激した。ＣＦＳＥ分裂を試験することによって、細胞増殖を３日目に分析した。全ての実験について、二重ウェルを、全ての条件について分析し、３つの独立した実験の代表的な結果を示す。

【図15B】同上。

【図15C】同上。

【図15D】同上。

【図16】レトロウイルスによって形質導入された骨髄由来ＤＣにおけるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの表面発現レベル。方法の節に記載されるように、骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）を、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｍｌ）の存在下で培養し、ＲＦＰまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−ＲＦＰレトロウイルスのいずれかで形質導入した。１０日目に、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの表面発現レベルを培養したＢＭＤＣ上で分析し、新鮮分離した腹腔マクロファージと比較した。

【図17】抗ＰＤＬ３モノクローナル抗体が、受身伝達ＥＡＥモデルにおいて有効性を呈することを示す。この養子免疫伝達ＥＡＥモデルにおいて、ドナーＳＪＬマウスをＣＦＡおよびＰＬＰペプチドで免疫した。１０日目に、流入領域リンパ節由来の全リンパ球を単離し、ＰＬＰペプチド、ＩＬ−２３（２０ｎｇ／ｍＬ）、および抗ＤＦＮｇ（１０μｇ／ｍＬ）と共に４日間、インビトロで培養した。次いで、拡張したＣＤ４Ｔ細胞を精製し、ナイーブの受容マウスに養子導入した。疾患の進行を監視し、以下のようにスコア化した：０：疾患なし、０．５：尾の正常な状態の喪失、１：尾を引きずる、２：尾を引きずる＋後肢不全麻痺、２．５：片方の後肢麻痺、３：両方の後肢麻痺、３．５：前肢衰弱、４：後肢麻痺＋片方の前肢麻痺。疾患スコアが４に達した場合、マウスを屠殺した。＊、マウスを屠殺した。

【図18】抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体が、コラーゲン誘導関節炎の動物モデルにおいて、有効性（関節炎の症状の軽減）を呈することを示す。

【図19】抗原提示細胞上で発現されたＶＩＳＴＡが、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を抑制したことを示す。

【図20】抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＭＢ４９腫瘍細胞を移植したマウスにおける腫瘍成長を阻害したことを示す。

【図21A】４つの異なるマウス抗腫瘍モデルにおけるＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示す。

【図21B】同上。

【図21C】同上。

【図21D】同上。

【図21E】同上。

【図22】ＣＤ４０／ＴＬＲアゴニストワクチンの有効性へのＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体の増強効果を示す。

【図23】ＣＮＳ細胞上でのＶＩＳＴＡ発現を示す。

【図24】ＥＡＥモデルにおけるＴ細胞の運命および機能へのＶＩＳＴＡの影響を示す。

【発明を実施するための形態】

【0063】

＊定義
〔００９１〕 本発明をより詳細に説明する前に、以下の定義が提供される。
〔００９２〕 本明細書において使用される「免疫細胞」という用語は、造血源であり、かつ免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、Ｂ細胞およびＴ細胞等のリンパ球；天然キラー細胞；ならびに単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球等の骨髄性細胞が含まれる。

【0064】

〔００９３〕 本明細書において使用される「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞という用語はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方を含む。

【0065】

〔００９４〕 「抗原提示細胞」という用語は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹枝状細胞、およびランゲルハンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状膠細胞、線維芽細胞、および乏突起膠
細胞）を含む。

【0066】

〔００９５〕 「抗原」という用語は、本明細書において、抗原への免疫応答の調節が治療的に所望され得る抗原を指す。関心の特定の抗原への所望の強化された免疫応答の場合において、かかる抗原は、誘発され得る保護的免疫応答が例示的な感染性疾患抗原を含むが、それに限定されない。例えば、考慮対象のＨＩＶ由来の抗原は、タンパク質ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、逆転写酵素、および他のＨＩＶ成分である。ヒト乳頭腫ウイルス由来のＥ６およびＥ７タンパク質も考慮の対象内である。さらに、単純ヘルペスウイルス由来のＥＢＮＡ１抗原も考慮の対象内である。考慮の対象となる他のウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅ−Ｓ抗原、および他の肝炎、例えば、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ等のウイルス成分等の肝炎ウイルス抗原；血球凝集素、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、Ｍ２、および他のインフルエンザウイルス成分等のインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質および他の麻疹ウイルス成分等の麻疹ウイルス抗原；タンパク質Ｅ１およびＥ２および他の風疹ウイルス成分等の風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス成分等のロタウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂおよび他のサイトメガロウイルス抗原成分等のサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質、および他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分等の呼吸器合胞体ウイルス抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、および他の単純ヘルペスウイルス抗原成分等の単純ヘルペスウイルス抗原；ｇｐｌ、ｇｐｌｌ、および他の水疱瘡ウイルス抗原成分等の水疱瘡ウイルス抗原；タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ、および他の日本脳炎ウイルス抗原成分等の日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質、および他の狂犬病ウイルス抗原成分等の狂犬病ウイルス抗原；ウエストナイルウイルスｐｒＭおよびＥタンパク質；ならびにエボラエンベロープタンパク質である。ウイルス抗原のさらなる例については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ，Ｈｏｗｌｅｙ Ｐ．Ｍ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆
Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）を参照されたい。加えて、細菌抗原も開示される。本発明の組成物および方法において使用され得る細菌抗原には、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、および他の百日咳細菌抗原成分等の百日咳細菌抗原；ジフテリア毒素またはトキソイドおよび他のジフテリア細菌抗原成分等のジフテリア細菌抗原；破傷風毒素またはトキソイドおよび他の破傷風細菌抗原成分等の破傷風細菌抗原；Ｍタンパク質および他の連鎖球菌抗原成分等の連鎖球菌抗原；ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＳｄｒＤ、およびＳｄｒＥ等のブドウ球菌抗原；リポ多糖類、フラジェリン、および他のグラム陰性細菌抗原成分等のグラム陰性桿菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、ＥＳＡＴ−６、および他のマイコバクテリア抗原成分等のヒト型結核菌抗原；ヘリコバクターピロリ菌抗原成分；肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多糖類および他の肺炎球菌抗原成分等の肺炎球菌抗原；莢膜多糖類および他のインフルエンザ菌抗原成分等のインフルエンザ菌抗原；炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、および他の炭疽菌抗原成分等の炭疽菌抗原；ペスト菌由来のＦ１およびＶタンパク質；ｒｏｍｐおよび他のリケッチア細菌抗原成分等のリケッチア細菌抗原が含まれるが、それらに限定されない。本明細書に記載の細菌抗原には、任意の他の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア、またはクラミジア抗原も含まれる。原虫および他の寄生虫抗原の例には、メロゾイト表面抗原、種虫表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ １ ５５／ＲＥＳＡ、および他のマラリア原虫抗原成分等の熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ−１、ｐ３０および他のトキソプラズマ抗原成分等のトキソプラズマ抗原；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン、および他の住血吸虫抗原成分等の住血吸虫抗原；リーシュマニア主要抗原および他のリーシュマニア抗原等のｇｐ６３、リポホスホグリカンおよびその関連タンパク質、ならびに他のリーシュマニア
抗原成分；ならびに７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原および他のトリパノソーマ抗原成分等のクルーズトリパノソーマ抗原が挙げられるが、それらに限定されない。真菌抗原の例には、カンジダ種、アスペルギルス種、ブラストミセス種、ヒストプラスマ種、コクシジオイデス種、癜風菌および他の種、エクソフィアラウェルネッキイ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）および他の種、黒色砂毛症菌および他の種、トリコスポルムベイゲリイ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｕｍ ｂｅｉｇｅｌｉｉ）および他の種、小胞子菌種、白癬菌種、表皮菌種、スポロトリックスシェンキイおよび他の種、フォンセケアペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ）および他の種、ワンゲリアデルマティティディス（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）および他の種、シュードアレシェリアボイジイおよび他の種、マズレラグリセアおよび他の種、クモノスカビ種、アブシディア種、およびケカビ種由来の抗原が挙げられるが、それらに限定されない。プリオン病抗原の例には、ＰｒＰ、ベータアミロイド、および他のプリオン関連タンパク質が挙げられる。

【0067】

〔０１２３〕 上述の感染体および寄生体に加えて、非感染体に対する望ましい免疫原性強化の別の分野は、癌抗原を発現する細胞が身体から望ましく排除される癌を含むが、それに限定されない異常増殖性疾患の分野である。本発明の組成物および方法において使用され得る腫瘍抗原には、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、乳房、膀胱、卵巣、精巣、黒色腫、テロメラーゼ；Ｐ糖タンパク質等の多剤耐性タンパク質；ＭＡＧＥ−１、アルファフェトプロテイン、癌胎児性抗原、変異体ｐ５３、乳頭腫ウイルス抗原、ガングリオシド、または黒色腫もしくは他の腫瘍細胞の他の炭水化物含有成分が含まれるが、それらに限定されない。任意の型の腫瘍細胞由来の抗原が、本明細書に記載の組成物および方法において使用され得ることが、本発明によって企図される。抗原は、癌細胞であり得るか、または膜タンパク質等の癌細胞から単離される免疫原性物質であり得る。普遍的なスルビビンおよびテロメラーゼ抗原ならびに精巣癌抗原のＭＡＧＥファミリーが含まれる。自己免疫に関与することが示されており、かつ本発明の方法において、耐性を誘導するために使用され得る抗原には、多発性硬化症のミエリン塩基性タンパク質、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質、およびプロテオリピドタンパク質、ならびにリウマチ性関節炎のＣＩＩコラーゲンタンパク質が含まれるが、それらに限定されない。

【0068】

〔０１２４〕 抗原は、非限定的な例として、強力なＴ細胞媒介性免疫（樹枝状細胞を介して）を動員するワクチンが必要とされる、ＨＺＶ−１、ＥＢＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ポックスウイルス、マラリア、またはＨＳＶ等の感染体の一部分であり得る。

【0069】

〔０１２５〕 「腫瘍」という用語は、組織新生物の形態、具体的には、多少脱阻害される内因性組織の自発的、自主的、および不可逆的な過剰成長の形態の少なくとも１つの細胞または細胞集団を表し、その成長は、原則として、特定の細胞および組織機能の多少顕著な喪失と関連付けられる。この細胞または細胞集団は、その成長に関して、それ自体で、または宿主生物の制御機構によって効果的に阻害されず、例えば、黒色腫もしくは癌腫である。腫瘍抗原は、悪性細胞自体の中または上に存在する抗原のみならず、内皮細胞および他の血管成分を含む腫瘍の間質支持組織上に存在する抗原も含む。

【0070】

〔００９６〕 本明細書において使用される「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞共刺激の調節によって影響されるＴ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答には、Ｂ細胞応答（例えば、抗体産生）、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン産生および細胞傷害性）、ならびにサイトカイン応答細胞、例えば、マクロファージの活性化が含まれる。本明細書において使用される、免疫応答に関連した「下方調節」という用語が、任意の１つ以上の免疫応答の減少を含む一方で、免疫応答に関連した「上方調節」という用語は、任意の１つ以上の免疫応答の増加を含む。１つの種類の免疫応答の
上方調節が、別の種類の免疫応答の対応する下方調節につながり得ることが理解される。例えば、ある特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の産生の上方調節は、細胞免疫反応の下方調節につながり得る。

【0071】

〔００９７〕 本明細書において使用される「共刺激受容体」という用語は、共刺激シグナルを、免疫細胞、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳに伝送する受容体を含む。本明細書において使用される「阻害性受容体」という用語は、負のシグナルを免疫細胞に伝送する受容体を含む。

【0072】

〔００９８〕 本明細書において使用される、活性化免疫細胞に関連した「共刺激する」という用語は、増殖またはエフェクター機能を誘導する第２の非活性化受容体媒介性シグナル（「共刺激シグナル」）を提供する共刺激分子の能力を含む。例えば、共刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞−受容体媒介性シグナルを受容したＴ細胞において、サイトカイン分泌をもたらし得る。例えば、活性化受容体を介して細胞受容体媒介性シグナルを受容した免疫細胞は、本明細書において、「活性化免疫細胞」と称される。

【0073】

〔００９９〕 阻害性受容体によって変換される阻害シグナルは、共刺激受容体（ＣＤ２８またはＩＣＯＳ等）が、免疫細胞上に存在しない場合でも発生し得、したがって、単に共刺激分子の結合に対する阻害性受容体と共刺激受容体との間の競合に左右されるものではない（Ｆａｌｌａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０５）。免疫細胞への阻害シグナルの伝送は、免疫細胞における無応答性、アネルギー、またはプログラム化された細胞死をもたらし得る。好ましくは、阻害シグナルの伝送は、アポトーシスが関与しない機構を介して作動する。

【0074】

〔００１００〕 本明細書において使用される「アポトーシス」という用語は、当分野で既知の技術を用いて特徴化することができるプログラム化された細胞死を含む。アポトーシス細胞死は、例えば、細胞断片化に至る細胞収縮、膜ブレブ形成、およびクロマチン凝縮を特徴とし得る。アポトーシスを経験する細胞は、特徴のあるパターンのヌクレオソーム間ＤＮＡ開裂も示す。

【0075】

〔００１０１〕 本明細書において「自己免疫」または「自己免疫疾患もしくは状態」という用語、本明細書において「自己免疫疾患」という用語は、個人自身の組織に起因し、かつそれに対する疾患もしくは障害、またはその同時分離もしくは顕在化、あるいはそれからもたらされる状態である。自己免疫疾患もしくは障害の例には、関節炎（急性関節炎、慢性リウマチ性関節炎、痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性性関節炎、感染性関節炎、ライム病関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、および若年発症リウマチ性関節炎、変形性関節炎、関節炎クロニカプログレディエンテ、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、反応性関節炎、ならびに強直性脊椎炎等のリウマチ性関節炎）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、および爪の乾癬等の乾癬、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹等の蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、強皮症（を含む全身性強皮症）、全身性硬化症等の硬化症、脊髄−視覚ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）等の多発性硬化症（ＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、および失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｕｌｃｅｒｏｓａ）、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、ポリープ性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｐｏｌｙｐｏｓａ）、壊死性腸炎、および貫壁性大腸炎等の大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患）、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発
性硬化性胆管炎、上強膜炎、成人もしくは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ブドウ膜の全てもしくは一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ様脊椎炎、突発性難聴、アナフィラキシーならびにアレルギー性およびアトピー性鼻炎等のＩｇＥ媒介性疾患、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系および／または脳幹脳炎等の脳炎、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎等のブドウ膜炎、原発性ＧＮ、免疫媒介性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性腎症、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、および急速進行性ＧＮ等の慢性もしくは急性糸球体腎炎等のネフローゼ症候群を伴う糸球体腎炎（ＧＮ）および伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、アレルギー状態、アレルギー反応、アレルギー性もしくはアトピー性湿疹を含む湿疹、気管支喘息（ａｓｔｈｍａ ｂｒｏｎｃｈｉａｌｅ）、気管支喘息（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔｈｍａ）、および自己免疫喘息等の喘息、Ｔ細胞浸潤を伴う疾患および慢性炎症性応答、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、皮膚ＳＬＥ等の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または全身性ループスエリテマトーデス、亜急性皮膚紅斑性狼瘡、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、ループス（腎炎、脳炎、小児、腎外性、腎外、円板状、脱毛性）、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年発症（Ｉ型）糖尿病、成人発症糖尿病（ＩＩ型尿病を含む）、自己免疫性糖尿病、特発性尿崩症、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅発性過敏症に関連した免疫応答、結核、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ヴェグナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎（大血管脈管炎（リウマチ性多発筋痛症および巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中血管脈管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎を含む）、顕微鏡的多発性動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性、皮膚、または過敏性脈管炎、全身性壊死性脈管炎、およびチャーグ・ストラウス脈管炎もしくは症候群（ＣＳＳ）等のＡＮＣＡ関連脈管炎を含む）を含む脈管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む溶血性貧血もしくは免疫性溶血性貧血、悪性貧血（ａｎｅｍｉａ ｐｅｒｎｉｃｉｏｓａ）、アジソン病、赤芽球貧血または赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、敗血症、外傷、または出血等に続発する多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）もしくはベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡等の類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡、および紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病もしくは症候群、免疫複合体性腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性ニューロパシー、ＩｇＭ多発性ニューロパシーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパシー等の慢性ニューロパシー、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を含む血小板減少症（例えば、心筋梗塞患者によって発現されるような）、および自己免疫または慢性もしくは急性ＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）等の免疫媒介性血小板減少症、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎等の甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）等の多腺性症候群、ランバート・イートン筋無力症候群またはイートン・ランバート症候群等の神経学的腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、スティッフマンもしくはスティッフパーソン症候群、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）またはアレルギー性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｌｌｅｒｇｉｃａ）および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ） 等の脳脊髄炎、胸腺腫関連重症筋無力
症等の重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋緊張病、オプソクローヌスもしくはオプソクローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパシー、多巣性運動ニューロパシー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ性間質性肺炎、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆汁性肝硬変症、肺線維症、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアック病（Ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＧＥＤ）等の自己免疫性耳疾患、自己免疫性聴力損失、オプソクローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、難治性もしくは再発性多発性軟骨炎等の多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパシー、腫瘍随伴症候群、癲癇、片頭痛、不整脈、筋障害、難聴、失明、周期性四肢麻痺、およびＣＮＳのチャネル病等のチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシー、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼病、網膜ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性血液障害、線維筋痛、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期認知症、自己免疫性脱髄疾患等の脱髄疾患、糖尿病性腎症、ドレスラー症候群、円形脱毛症、クレスト症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症、および毛細血管拡張症）、男性および女性自己免疫性不妊症、混合結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復性流産、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎等の肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア症、毛様体炎 等の慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎、またはフックス毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、エコーウイルス感染、心筋ミオパシー、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン・バーウイルス感染、流行性耳下腺炎、エヴァン症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺機能亢進症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型腎症、良性家族性および虚血再灌流損傷、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、アスペルミオジェネース（ａｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｅ）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、癩性結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性聴力損失、血色素尿症発作、性腺機能低下症、限局性回腸炎、白血球減少症、感染性単核球症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経性眼炎、肉芽種性睾丸炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルヴァン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮症、抗精子抗体に起因する不妊症、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤおよびエプスタイン・バーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、リーシュマニア等の寄生虫症、毒素性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞浸潤を伴う疾患、白血球接着不全症、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅発性過敏症に関連した免疫応答、白血球漏出を伴う疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患
、混合結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、末梢性ニューロパシー、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、完全脱毛症、拡張型心筋ミオパシー、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性もしくは非化膿性副鼻腔炎、急性もしくは慢性副鼻腔炎、篩骨、前頭、上顎、または蝶形骨副鼻腔炎、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増加症等の好酸球関連障害、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、
多内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルートン症候群、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、膠原病に関連した自己免疫障害、リウマチ、神経系疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、血管拡張、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏症、脳虚血、および血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏症障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、心筋または他の組織の再灌流傷害、急性炎症性成分を伴う皮膚病、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性障害、眼および眼窩炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈障害、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、および子宮内膜症が挙げられるが、それらに限定されない。

【0076】

〔００１０２〕 「癌」および「癌性」という用語は、典型的には制御されていない細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、それらに限定されない。かかる癌のより特定の例には、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺アデノ癌腫、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌または腎臓癌、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および種々の種類の頭部および頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫；ならびに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）が挙げられる。

【0077】

〔００１０３〕 「アレルギー性疾患」という語句は、アレルギー反応を伴う疾患を指す。より具体的には、「アレルギー性疾患」は、そのアレルゲンへの曝露と病理学的変化の発現との間に強い相関関係が存在し、かつその病理学的変化が免疫機構を有すると立証されている、アレルゲンが同定される疾患と定義される。本明細書において、免疫機構とは、白血球が、アレルゲン刺激に対して免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンの例には、ダニ抗原および花粉抗原が挙げられる。代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ならびに花粉および昆虫アレルギーが含まれる。アレルギー体質は、アレルギー体質の親の子どもに継承され得る遺伝因子である。家族性アレルギー性疾患は、アトピー性疾患とも呼ばれており、原因となる遺伝因子は、アトピー性体質である。「アトピー性皮膚炎」は、アトピー性疾患、特に、皮膚炎症状を伴う疾患の一般用語である。好ましい例には、湿疹、アレルギー性鼻炎、枯草熱、蕁麻疹、および食物アレルギーからなる群から選択されるアレルギー状態が挙げられる。アレルギー状態には、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻風邪、枯草熱、気管支喘息、蕁麻疹（ｕｒ
ｔｉｃａｒｉａ）（蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ））、および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性状態が含まれる。

【0078】

「喘息」は、炎症、気道狭窄、および吸入物質への気道の反応性の増加を特徴とする呼吸器系の障害を指す。喘息は、排他的ではないが、高い頻度で、アトピー性またはアレルギー性症状と関連付けられる。

【0079】

〔００１０４〕 本明細書において、「炎症状態または炎症性疾患」という語句は、リウマチ性疾患（リウマチ性関節炎、変形性関節炎、乾癬性関節炎を含むが、それらに限定されない）脊椎関節症（強直性脊椎炎、反応性関節炎、ライター症候群を含むが、それらに限定されない）、結晶性関節炎（痛風、偽痛風、カルシウムピロリン酸沈着症を含むが、それらに限定されない）、ライム病疾患、リウマチ性多発筋痛症；結合組織病（全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群を含むが、それらに限定されない）；脈管炎（結節性多発性動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群を含むが、それらに限定されない）；外傷または虚血によって生じた結果を含む炎症状態、サルコイドーシス；アテローム硬化性血管疾患、アテローム性動脈硬化症、および血管閉塞性疾患（アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、心筋梗塞、発作、末梢血管疾患を含むが、それらに限定されない）、ならびに血管ステント再狭窄を含む血管疾患；ブドウ膜炎、角膜疾患、虹彩炎、虹彩毛様体炎、および白内障を含む眼疾患を含む群から選択される疾患または状態を含む慢性または急性炎症性疾患を含む。

【0080】

〔００１０５〕 本発明による治療に適している癌という用語には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、またはリンパ性悪性疾患が含まれるが、それらに限定されない。かかる癌のより具体的な例には、膀胱、卵巣、黒色腫、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺アデノ癌腫、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌または腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌および種々の種類の頭部および頸部癌、ならびにＢ−細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連した異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連した浮腫等）、およびメーグス症候群が挙げられる。好ましくは、癌は、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭部および頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、ならびに多発性骨髄腫からなる群から選択される。例示的な実施形態（実施例を参照のこと）において、癌は、早期進行性（転移性を含む）膀胱癌、卵巣癌、または黒色腫である。別の実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。本発明の治療に適している癌性状態には、転移性癌が含まれ、骨髄由来の抑制因子細胞によるＶＩＳＴＡ発現は、抗腫瘍応答および抗侵襲性免疫応答を抑制する。本発明の方法は、血管新生化腫瘍の治療に特に好適である。

【0081】

〔００１８〕 本発明はまた、化学療法もしくは放射線療法または他の生物学との併用で、癌、すなわち、個人における癌を治療し、かつその活性を強化するのに好適であり、骨髄由来の抑制因子細胞によるＶＩＳＴＡ発現は、抗腫瘍応答および化学療法もしくは放射線療法の有効性または生物学的有効性を抑制する。本発明に従って、抗癌活性を呈する
任意の化学療法剤を使用することができる。好ましくは、化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体および関連阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位複合体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、およびゴナドトロピン放出ホルモン類似体からなる群から選択される。より好ましくは、化学療法剤は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセル、およびドセタキセルからなる群から選択される。２つ以上の化学療法剤を、抗ＶＥＧＦ抗体の投与との併用で、投与する混合物中で使用することができる。１つの好ましい併用化学療法は、５−ＦＵを含むフルオロウラシル系、および１つ以上の他の化学療法剤（複数を含む）である。併用化学療法に好適な投与計画は、当分野で既知であり、例えば、Ｓａｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ ＡＳＣＯ １８：２３３ａおよびＤｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５５：１０４１−７で説明されている。生物学的製剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４融合タンパク質に対する抗体、ならびにサイトカイン、成長因子アンタゴニストおよびアゴニスト、ホルモンおよび抗サイトカイン抗体等の別の免疫増強剤であり得る。

【0082】

〔００１０６〕 受容体に結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の形態に応じて、シグナルは、例えば、受容体に結合するために、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の活性化形態と競合することによって、（例えば、受容体の架橋をもたらすＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の多価形態によって、または抗原提示細胞上で受容体に結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの可溶型によって）伝送されるか、あるいは（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の可溶性一価形態によって、またはそれが抗原提示細胞上でＦｃ受容体に結合しないように、当分野で既知の方法を用いて変質されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの可溶型によって）阻害されるかのいずれかであり得る。しかしながら、可溶性分子が刺激性であり得る事例が存在する。本明細書に記載の日常的なスクリーニングアッセイを用いて、種々の調節剤の効果を、容易に実証することができる。

【0083】

〔００１０７〕 本明細書において使用される「活性化受容体」という用語は、抗原、複合抗原（例えば、ＭＨＣ分子との関連で）、または抗体に結合する免疫細胞受容体を含む。かかる活性化受容体には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体、およびＦｃ受容体が含まれる。

【0084】

〔００１０８〕 例えば、Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞上に存在し、ＣＤ３分子と関連している。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣ分子との関連において抗原（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬によって）によって刺激される。ＴＣＲを介するＴ細胞活性化は、多数の変化、例えば、タンパク質リン酸化反応、膜脂質の変化、イオン流出、環状ヌクレオチドの変質、ＲＮＡ転写の変化、タンパク質合成の変化、および細胞体積の変化をもたらす。

【0085】

〔００１０９〕 本明細書において使用される「Ｂ細胞受容体」（ＢＣＲ）という用語は、膜Ｉｇ（ｍＩｇ）とＢ細胞上で見出される他の膜貫通ポリペプチド（例えば、ＩｇアルファおよびＩｇベータ）との間の複合体を含む。ｍＩｇのシグナル変換機能は、オリゴマーまたは多量体抗原による受容体分子の架橋によって誘発される。Ｂ細胞は、抗免疫グロブリン抗体によっても活性化され得る。ＢＣＲ活性化時、Ｂ細胞中で、チロシンリン酸化反応を含む多数の変化が発生する
〔００１１０〕 「Ｆｃ受容体」（ＦｃＲ）という用語は、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）のＦｃ部分への細胞表面受容体を含む。Ｆｃ受容体は、免疫応答に関与する多くの細胞上で見出される。これまでに同定されているヒトＦｃＲの中では、ＩｇＧ（ＦｃガンマＲ
と指定される）、ＩｇＥ（ＦｃエプシロンＲ１）、ＩｇＡ（ＦｃアルファＲ）、および重合ＩｇＭ／Ａ（Ｆｃ．μαＲ）を認識するものである。ＦｃＲは、以下の細胞型において見出される：ＦｃエプシロンＲＩ（マスト細胞）、ＦｃエプシロンＲＩＩ（多くの白血球）、ＦｃアルファＲ（好中球）、およびＦｃμアルファＲ（腺上皮、肝細胞）（Ｈｏｇｇ，Ｎ．（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：１８５−８６）。広く研究されたＦｃガンマＲは、細胞性免疫防御の中心であり、炎症のメディエータの放出の刺激および自己免疫疾患の発病に関与する加水分解酵素に関与する（Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｃ（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ｍｍｕｎｏｌ．６：２５１−８７）。マクロファージ／単球、多形核白血球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＦｃガンマＲが、ＩｇＧによって媒介される特定の認識の要素を与えるため、ＦｃガンマＲは、エフェクター細胞とＩｇを分泌するリンパ球との間に決定的なつながりを提供する。ヒト白血球は、少なくとも３つの異なるＩｇＧの受容体、すなわちｈ ＦｃガンマＲＩ（単球／マクロファージ上で見出される）、ｈＦｃガンマＲＩＩ（単球、好中球、好酸球、血小板、場合によってＢ細胞、およびＫ５６２細胞株上で見出される）、ならびにＦｃγＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中球、好酸球、およびマクロファージ上で見出される）を有する。

【0086】

〔００１１１〕 Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞への共刺激シグナルの伝送は、シクロスポリンＡによって阻害されないシグナル伝達経路を含む。加えて、共刺激シグナルは、Ｔ細胞中でサイトカイン分泌（例えば、ＩＬ−２および／もしくはＩＬ−１０）を誘導することができ、かつ／またはＴ細胞中で抗原に対する無応答性の誘導、アネルギーの誘導、もしくは細胞死の誘導を防止することができる。

【0087】

〔００１１２〕 本明細書において使用される「阻害シグナル」という用語は、免疫細胞上で阻害性受容体分子を介して伝送されるシグナルを指す。かかるシグナルは、活性化受容体（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃ分子を介して）を介してシグナルを刺激し、例えば、免疫細胞における第２のメッセンジャー生成、増殖、もしくはエフェクター機能の阻害、例えば、減少した食作用、抗体産生、もしくは細胞傷害性、または免疫細胞のメディエータ（サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および／もしくはアレルギー性応答のメディエータ等）産生不全、またはアネルギーの発達の阻害をもたらし得る。

【0088】

〔００１１３〕 本明細書において使用される「無応答性」という用語は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインを介する刺激への免疫細胞の屈折性を含む。例えば、免疫抑制剤への曝露または高用量の抗原により、無応答性が発生し得る。

【0089】

〔００１１４〕 本明細書において使用される「アネルギー」または「耐性」という用語は、活性化受容体媒介性刺激への屈折性を含む。かかる屈折性は、概して、抗原特異的であり、寛容化抗原への曝露が終わった後に持続する。例えば、（無応答性とは対照的に）Ｔ細胞におけるアネルギーは、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ−２の欠如を特徴とする。Ｔ細胞が抗原に曝露され、かつ第２のシグナル（共刺激シグナル）の不在下で第１のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３媒介シグナル）を受容するときに、Ｔ細胞アネルギーが発生する。これらの条件下で、同一の抗原への細胞の再曝露は（共刺激分子の存在下で再曝露が発生する場合でさえ）、サイトカイン産生不全、したがって、増殖不全をもたらす。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、非連関抗原への応答を開始することができ、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と培養されるときに増殖することができる。例えば、指標細胞株を用いてＥＬＩＳＡまたは増殖アッセイによって測定されるように、Ｔ細胞アネルギーを、Ｔリンパ球によるＩＬ−２産生の欠如によって観察することもできる。あるいは、受容体遺伝子構築物を使用することができる。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーのまたは制御下で異種プロモーターによって、またはエンハンサー内で見出すことができるＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩＬ−２遺伝子転写を開始し損なう（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１
１３４）。

【0090】

〔００１１５〕 共刺激シグナルの調節は、免疫細胞のエフェクター機能の調節をもたらす。したがって、「ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性」という用語は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドがその天然結合パートナー（複数を含む）に結合する能力、免疫細胞共刺激または阻害シグナルを調節する能力、および免疫応答を調節する能力を含む。

【0091】

〔００１１６〕 免疫細胞における阻害シグナルの調節は、免疫細胞の増殖および／または免疫細胞によるサイトカイン分泌の調節をもたらす。
〔００１１７〕 本明細書において使用される「自然発生」核酸分子は、自然に発生する（例えば、天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。

【0092】

〔００１１８〕 本明細書において使用される「アンチセンス」核酸分子は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的なヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列、または遺伝子のコード鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸分子は、センス核酸分子に水素結合し得る。

【0093】

〔００１１９〕 本明細書において使用される「コード領域」という用語が、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す一方で、「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’非翻訳領域）を指す。

【0094】

〔００１２０〕 本明細書において使用される「ベクター」という用語は、それが結合された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製の能力がある（例えば、複製の細菌起源を有する細菌性ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合される遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と称される。概して、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、同義に使用され得る。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターのかかる他の形態を含むよう意図されている。

【0095】

〔００１２１〕 本明細書において使用される「宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクター等の本発明の核酸分子が導入された細胞を指すよう意図される。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において同義に使用される。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的子孫も指すことを理解されたい。変異または環境の影響のいずれかによりある特定の修飾が後世において発生し得るため、かかる子孫は、事実上、親細胞と同一ではない場合もあるが、本明細書において使用される用語の範囲内に依然として含まれる。

【0096】

〔００１２２〕 本明細書において使用される「遺伝子導入動物」は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウスを指し、動物の細胞のうちの１つ以上が、「導入遺伝子」を含む。「導入遺伝子」という用語は、遺伝子導入動物が発育する細胞のゲノムに組み込まれ、かつ例えば、遺伝子導入動物の１つ以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を誘導する成熟動物のゲノム中に残存する外因性ＤＮＡを指す。

【0097】

〔００１２３〕 本明細書において使用される「相同組換え動物」は、内在性遺伝子が、動物の発育前に、内在性遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞に導入される外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変化した、遺伝子導入非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウスの一種を指す。

【0098】

〔００１２４〕 本明細書において使用される「単離タンパク質」は、細胞から単離されるか、または組換えＤＮＡ技術によって産生されるときに、他のタンパク質、細胞物質、および培養培地を実質的に含まないタンパク質、あるいは化学的に合成されるときに、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。

【0099】

〔００１２５〕 「単離」もしくは「精製」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質が得られる細胞または組織源からの細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成されるときには、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言い回しは、タンパク質が、それが単離されるか、または組換えによって産生される細胞の細胞成分から分離されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質の調製物を含む。一実施形態において、「細胞物質を実質的に含まない」という言い回しは、約３０％（乾燥重量）未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質（本明細書において「夾雑タンパク質」とも称される）、より好ましくは、約２０％未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質、さらにより好ましくは、約１０％未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質、および最も好ましくは、約５％未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質を有するＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質の調製物を含む。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換えによって産生されるとき、それはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、および最も好ましくは、約５％未満を占める。

【0100】

〔００１２６〕 「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質の調製物を含む。一実施形態において、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質、より好ましくは、約２０％未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質、さらにより好ましくは、約１０％未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質、および最も好ましくは、約５％未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質を有するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質の調製物を含む。

【0101】

〔００１２７〕 本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）、ならびに全抗体分子を含む。本明細書において使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが示されている。抗体の「抗
原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨＩドメインから成る一価フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨＩドメインから成るＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知であり、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３、およびＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７８を参照のこと）を形成する単一タンパク質鎖とすることができる合成リンカーによって連結され得る。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含するよう意図されている。特定のｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列は、全てのＩｇＧ分子または他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に結合され得る。ＶＨおよびＶ１を、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ、または他のフラグメントの生成において使用することもできる。二重特異性抗体等の一本鎖抗体の他の形態も包含される。二重特異性抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現される二価の二重特異性抗体であるが、リンカーを用いると、それが短すぎて、同一の鎖上の２つのドメインの間の対合を可能にすることができず、それによって、ドメインを別の鎖の相補性ドメインと対にさせ、かつ２つの抗原結合部位を作成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。

【0102】

〔００１２８〕 さらに、抗体またはその抗原結合部分は、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドを有する抗体もしくは抗体部分の共有もしくは非共有会合によって形成される、より大きいイムノアドヘシン分子の一部であり得る。かかるイムノアドヘシン分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するために、ストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３−１０１）、ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するために、システイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体部分を、それぞれ、全抗体のパパインまたはペプシン消化等の従来の技術を用いて、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、およびイムノアドヘシン分子を、本明細書に記載の標準の組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。

【0103】

〔００１２９〕 抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル；異種、同種、もしくは同系；またはそれらの修正された形態、例えば、ヒト化、キメラ等であり得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子に特異的に、または実質的に特異的に結合する。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の１つの種のみを含有する抗体分子の集団を指すが、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用すること
ができる抗原結合部位の複数の種を含有する抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原への単一の結合親和性を示す。

【0104】

〔００１３０〕 本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト細胞によって生成されるであろう抗体により酷似するよう変化した可変および定常領域を有する、非ヒト細胞によって生成される抗体を含むよう意図されている。例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列において見出されるアミノ酸を組み込むために、非ヒト抗体アミノ酸配列を変化させることによる。本発明のヒト化抗体は、例えば、ＣＤＲにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、ランダムもしくは部位特異的変異誘発によって導入されるインビトロでの変異によって、またはインビボでの体細胞変異によって）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体も含む。

【0105】

〔００１３１〕 本明細書において使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すよう意図されている（例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。

【0106】

〔００１３２〕 本明細書における「オリゴマー化ドメイン」は、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインまたはそのフラグメントに付着されるときに、オリゴマー化を促進するドメインを指す。本オリゴマー化ドメインは、さらなるジスルフィド結合によってさらに安定化することができる自己会合性αヘリックス、例えば、ロイシンジッパーを含む。ドメインは、膜全域でのベクトル折り畳み、インビボでのポリペプチドの機能的結合タンパク質への折り畳みを促進すると考えられるプロセスに適合するよう設計される。その例は、当分野で既知であり、一例として、コイル状ＧＣＮ４、およびＣＯＭＰを含む。

【0107】

〔００１３３〕 αヘリックスコイルドコイルは、恐らく、タンパク質において見出される最も広く知られているサブユニットオリゴマー化モチーフである。したがって、コイルドコイルは、様々な異なる機能を果たす。転写活性化因子のいくつかのファミリーにおいて、例えば、短いロイシンジッパーは、ＤＮＡ上でのＤＮＡ結合領域の配置に重要な役割を果たす（Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ７１：１２２３−１２３７）。コイルドコイルは、中間径フィラメントタンパク質のオリゴマーを形成するためにも使用される。さらに、コイルドコイルタンパク質は、小胞膜およびウイルス膜融合の両方において重要な役割を果たすようである（Ｓｋｅｈｅｌ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ，１９９８，Ｃｅｌｌ ９５：８７１−８７４）。両方の場合において、融合される膜に埋め込まれる疎水性配列は、長いαヘリックスの束から成る棒状複合体の同一の端部に配置される。この分子配列は、膜融合のために複合体が組み立てられるときに、近接した膜並置を引き起こすと考えられている。コイルドコイルは、多くの場合、オリゴマー化を制御するために使用される。これは、ＧＣＮ４、ウイルス融合ペプチド、ＳＮＡＲＥ複合体、およびある特定のｔＲＮＡシンテターゼ等であって、それらに限定されない転写因子を含む多くの種類のタンパク質中に見出される。非常に長いコイルドコイルが、トロポミオシン、中間径フィラメント、および紡錘体極体成分等のタンパク質中に見出される。コイルドコイルは、平行配向または逆平行配向で会合する高度に組織化された様式で、相互の周囲でスーパーコイル状であるいくつかのαヘリックスを含む。二量体および三量体が最も一般的であるが、ヘリックスは、同一のタンパク質または異なるタンパク質由来であり得る。コイルドコイルは、それらの疎水性の継ぎ目を埋めるために一体となる成分ヘリックスによって形成される。疎水性の継ぎ目がそれぞれのヘリックスに巻き付くと、ヘリックスも相互に巻き付くようにねじれ、疎水性の継ぎ目を埋め、スーパーコイルを形成
する。これは、この構造をコイルドコイルと定義する穴の中への取手パッキング（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ ｐａｃｋｉｎｇ）として既知の、隣接したヘリックス間の側鎖の特徴的な相互嵌合である。並列構造がより一般的であるが、ヘリックスは、この種の相互作用が発生するために同一の方向に走る必要はない。逆並列構造は、三量体において非常にまれであり、五量体においては未知であるが、２つのヘリックスが、多くの場合、短いループによって結合される分子内二量体においてはより一般的である。細胞外空間では、ヘテロ三量体コイルドコイルタンパク質ラミニンが、基底膜の形成において重要な役割を果たす。他の例として、その中で３つ（トロンボスポンジン１および２）または５つ（トロンボスポンジン３、４、およびＣＯＭＰ）の鎖が結合される、トロンボスポンジンならびに軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）がある。分子は、花束様の外観を有し、それらのオリゴマー構造の理由は、恐らく、細胞受容体とのＣ末端ドメインの多価相互作用である。酵母転写活性化因子ＧＣＮ４は、３０を超える同定された基本領域ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ＤＮＡ結合モチーフを含有する真核細胞タンパク質のうちの１つである（Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ７１：１２２３−１２３７）。ｂＺＩＰ二量体は、それらのカルボキシ末端３４残基上に平行コイルドコイルを形成し、かつそれらのアミノ末端に向かって徐々に分岐して、ＤＮＡ結合部位の主溝を通過する、一対の連続的なアルファヘリックスである。コイルドコイル二量体化界面は、ＤＮＡ軸に対してほぼ垂直に配向され、複合体にＴ文字の外観を与える。ｂＺＩＰは、平行アルファヘリックスコイルドコイル中でともに密集する疎水性および無極性残基の４−３の７個単位の繰り返し（４−３ ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ）を含有する（Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ７１：１２２３−１２３７）。二量体の安定性は、７個単位の繰り返しの位置ａおよびｄにおけるロイシンおよび無極性残基の並列パッキング、ならびにＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチドの結晶構造に示される限定された数のヘリックス内およびヘリックス間塩橋に起因する（Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ７１：１２２３−１２３７）。別の例には、Ｍｒ５２，０００のサブユニットのホモ三量体（Ｐａｕｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，１９８１，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９７：３６７−３７５）としてウシ気管軟骨から単離されるＣＭＰ（マトリリン−１）があり、それぞれのサブユニットは、ｖＷＦＡｌモジュール、単一ＥＧＦドメイン、ｖＷＦＡ２モジュール、および５つの７個単位に及ぶコイルドコイルドメインから成る（Ｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８１２６−８１３４、Ｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｓｏｎ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７４７−２５７５３）。精製ＣＭＰの電子顕微鏡検査は、その中でそれぞれのサブユニットが、コイルドコイルに対応する共通点から出現する楕円を形成する花束様の三量体構造を示した（Ｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｓｏｎ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７４７−２５７５３）。マトリリン−１中のコイルドコイルドメインは、広範囲にわたって研究されている。三量体構造は、非変性状態下での鎖間ジスルフィド結合の完全還元後に保持される（Ｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｐａｕｌｓｓｏｎ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７４７−２５７５３）。さらに別の例には、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）がある。非コラーゲン蓄積糖タンパク質、ＣＯＭＰは、最初に軟骨内で同定された（Ｈｅｄｂｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６１３２−６１３６）。タンパク質は、Ｎ末端７個単位の繰り返し領域（ｃｃ）から成る５つのサブユニットの５２４ｋＤａのホモ五量体であり、４つの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様のドメイン（ＥＦ）、７つのカルシウム結合ドメイン（Ｔ３）、およびＣ末端球状ドメイン（ＴＣ）が続く。このドメイン構成によると、ＣＯＭＰは、トロンボスポンジンのファミリーに属する。位置ａおよびｄで優先的に疎水性残基を有する７個単位の繰り返し（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎは、ヘリックスコイルドコイルドメインを形成する（Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｐａｒｒｙ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：４８８−４８９）。近年、ＣＯＭＰ（ＣＯＭＰｃｃ）の組換え五本鎖コイルドコイルドメインが結晶化され、その構造は、０．２ｎｍの解像度で解析された（Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：７６１−７６５）。

【0108】

〔００１３４〕
本発明のポリペプチドおよび核酸分子を指すとき、「ファミリー」という用語は、共通の構造ドメインまたはモチーフを有し、かつ本明細書で定義される十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する、２つ以上のポリペプチドまたは核酸分子を意味するよう意図されている。かかるファミリーメンバーは、自然発生的であるか、または非自然発生的であり得、同一の種または異なる種のいずれかに由来し得る。例えば、ファミリーは、ヒト由来第１のポリペプチド、ならびにヒト由来の他のはっきりと異なるポリペプチドを含有し得るか、またはあるいは、非ヒト由来の相同体、例えば、サルポリペプチドを含有し得る。ファミリーのメンバーは、共通の機能的特性も有し得る。

【0109】

〔００１３５〕 例えば、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのファミリーは、好ましくは、少なくとも１つの「シグナルペプチドドメイン」を含む。本明細書において使用される「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、分泌および膜結合ポリペプチドのＮ末端で発生し、かつ多数の疎水性アミノ酸残基を含有する、約１５個以上のアミノ酸を含有するペプチドを含む。例えば、シグナル配列は、少なくとも約１０〜３０個のアミノ酸残基、好ましくは、約１５〜２５個のアミノ酸残基、より好ましくは、約１８〜２０個のアミノ酸残基、およびさらにより好ましくは、約１９個のアミノ酸残基を含有し、少なくとも約３５〜６５％、好ましくは、約３８〜５０％、およびより好ましくは、約４０〜４５％の疎水性アミノ酸残基（例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはフェニルアラニン）を有する。当分野で「シグナルペプチド」とも称される、かかる「シグナル配列」は、かかる配列を含有するポリペプチドを脂質二重層に指向する役目を果たし、分泌および膜結合ポリペプチドにおいて切断される。以下に記載されるように、シグナル配列は、天然ヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのアミノ酸配列内で特定され、天然マウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのアミノ酸配列内でも特定された。

【0110】

〔００１３６〕 本発明の別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ本発明のポリペプチドは、「膜貫通ドメイン」の存在に基づいて特定される。本明細書において使用される「膜貫通ドメイン」という用語は、原形質膜にわたる長さの約１５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、膜貫通ドメインは、約少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、または４５個のアミノ酸残基を含み、原形質膜にわたる。膜貫通ドメインは、疎水性残基が豊富であり、典型的には、アルファヘリックス構造を有する。好ましい実施形態において、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の膜貫通ドメインアミノ酸が疎水性であり、例えば、ロイシン、イソロイシン、チロシン、またはトリプトファンである。膜貫通ドメインは、例えば、Ｚａｇｏｔｔａ，Ｗ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２３５−２６３に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＤＬ３の膜貫通ドメイン領域は、本明細書において特定される（例えば、図１を参照のこと）。

【0111】

〔００１３７〕 別の実施形態では、本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子は、ポリペプチドまたは対応する核酸分子における「ＩｇＣドメイン」の不在および「ＩｇＶドメイン」の存在に基づいて特定される。本明細書において使用されるＩｇＶおよびＩｇＣドメインは、Ｉｇスーパーファミリーメンバードメインとして当分野で認識されている。これらのドメインは、Ｉｇ折り畳みと呼ばれるはっきりと異なる折り畳みパターンを有する構造単位に対応する。Ｉｇ折り畳みは、２つのベータシートのサンドイッチから成り、それぞれ、全てではないが大部分のドメインにおいて、２つのシートの間で保存ジスルフィド結合を有する５〜１０個のアミノ酸の逆平行ベータ鎖から成る。Ｉｇ、ＴＣＲ、およびＭＨＣ分子のＩｇＣドメインは、同一の種類の配列パターンを共有し、Ｉｇスーパーファミリー内のＣｌセットと呼ばれる。他のＩｇＣドメインは、他のセットに含まれる。
ＩｇＶドメインはまた、配列パターンを共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインは、Ｃ−ドメインよりも長く、追加の対のベータ鎖を形成する。ＩｇＶドメインを構成する天然ヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸残基を、図１で見ることができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナー（複数を含む）への結合のために、ＩｇＶドメインの存在が必要とされる可能性が高い。

【0112】

〔００１３８〕 別の実施形態では、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子は、ポリペプチドまたは対応する核酸分子における「細胞外ドメイン」の存在に基づいて特定される。本明細書において使用される「細胞外ドメイン」という用語は、テールとして細胞の表面から伸びるＮ末端アミノ酸を表す。本発明の細胞外ドメインは、ＩｇＶドメインを含み、かつシグナルペプチドドメインを含み得る（図１を参照のこと）。

【0113】

〔００１３９〕 さらに別の実施形態では、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子は、ポリペプチドまたは対応する核酸分子における「細胞質ドメイン」の存在に基づいて特定される。本明細書において使用される「細胞質ドメイン」という用語は、細胞質ドメインを含むことが予測される、テールとして細胞の細胞質に広がるＣ末端アミノ酸を表す。

【0114】

〔００１４０〕 好ましい実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子は、以下のドメインのうちの少なくとも１つ以上を含む：シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン。

【0115】

〔００１４１〕 本発明の単離ポリペプチド、好ましくは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、配列番号２もしくは４もしくは５のアミノ酸配列と十分に同一のアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号１もしくは３もしくはフラグメントまたはその補体と十分に同一のヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書において使用される「十分に同一」という用語は、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一もしくは同等の（例えば、類似した側鎖を有するアミノ酸残基）、十分な数もしくは最低数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含有する第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指し、したがって、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列は、共通の構造ドメインもしくはモチーフおよび／または共通の機能的活性を共有する。例えば、共通の構造ドメインを共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、ドメインのアミノ酸配列にわたって少なくとも３０％、４０％、もしくは５０％の相同性、好ましくは、６０％の相同性、より好ましくは、７０％〜８０％、およびさらにより好ましくは、９０〜９５％の相同性を有し、少なくとも１つ、および好ましくは２つの構造ドメインまたはモチーフを含有し、本明細書において十分に同一であると定義される。さらに、少なくとも３０％、４０％、もしくは５０％、好ましくは、６０％、より好ましくは、７０〜８０％、もしくは９０〜９５％の相同性を共有し、かつ共通の機能的活性を共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書において十分に同一であると定義される。

【0116】

〔００１４２〕 本明細書において同義に使用される、「ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性」、「ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの生物学的活性」、または「ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの機能的活性」は、標準の技術に従って、インビボまたはインビトロで決定される、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−応答細胞または組織上で、あるいはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド結合パートナー上で発現される活性を指す。これらの活性は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を調節することを含む。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ結合パートナーとの会合等の直接的活性である。本明細書において使用される「標的分子」または「結合パートナー」は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ媒介性機能が達成されるよ
うに、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドが自然において結合するか、または相互作用する、すなわち、Ｔ細胞上で発現される分子である。あるいは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドによって媒介される細胞シグナル伝達活性等の間接的活性である。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの生物学的活性は、本明細書に記載されている。例えば、本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドおよびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニストまたはアンタゴニストは、以下の活性のうちの１つ以上を有し得る：（１）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を抑制もしくは促進する、（２）サイトカイン産生を抑制もしくは促進する、（３）Ｔ細胞と骨髄由来のＡＰＣとの間の同族相互作用中のＴ細胞応答を負に制御する制御リガンドとして機能する、（４）早期のＴＣＲ活性化を抑制し、細胞分裂を停止させることによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を負に制御するが、アポトーシスへの最小の直接的影響を伴う、（５）ＡＰＣとＴ細胞との間の同族相互作用中の抗原特異的Ｔ細胞活性化を抑制もしくは促進する、および／または（６）Ｔ細胞媒介性免疫応答を抑制もしくは促進する、（７）免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球の活性化を調節する、ならびに（８）生物、例えば、マウスもしくはヒト生物の免疫応答、例えば、炎症性免疫応答を調節する。

【0117】

〔００１４３〕 したがって、本発明の別の実施形態は、１つ以上のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を調節する単離ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質およびポリペプチドを特徴とする。これらのポリペプチドは、シグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの１つ以上を有し、好ましくは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ活性を有する、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを含む。

【0118】

〔００１４４〕 さらなる好ましいＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、少なくとも１つの細胞外ドメイン、ならびにシグナルペプチドドメイン、ＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの１つ以上を有し得、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書における配列番号１または３のヌクレオチド配列の補体を含む核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。例示される単離ヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびにヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの予測されるアミノ酸配列が、本明細書における配列表に含有される。

【0119】

〔００１４５〕 ヒトＶＩＳＴＡまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞転写プロファイリングスクリーンにおいて上方制御される分子として同定された。発明者によるマウスＣＤ４^＋Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリから回収された同一の９３０ｂｐ遺伝子産物の特徴付けは、大きさおよび配列を裏付けた。コンピュータ上での配列分析および構造分析は、成熟時の３０９個のアミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質を予測する。その細胞外ドメインは、２３個のアミノ酸のストーク領域、２１個の残基の膜貫通セグメント、および９７個のアミノ酸の細胞質ドメインに結合される１３６個のアミノ酸の単一の細胞外Ｉｇ−Ｖドメインを含有する。ＶＩＳＴＡの細胞質テールは、いかなるシグナル伝達ドメインをも含有しない。ＶＩＳＴＡ Ｉｇ−ＶドメインでのＢＬＡＳＴ配列検索は、Ｂ７ファミリーのＰＤ−Ｌ１を、ボーダーラインの有意なｅ値スコアを有する最も近い進化的に関連したタンパク質と同定した。Ｂ７ファミリーメンバーであるＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４との構造に基づくＶＩＳＴＡの配列アラインメントは、全てのＩｇ−Ｖドメインタンパク質において系統的に保存されるいくつかのアミノ酸を強調する。

【0120】

〔００１４６〕 本発明の種々の態様を、以下の項においてさらに詳細に説明する。
〔０１２７〕 Ｉ．ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ単離核酸分子
〔００１４７〕 本発明の一態様は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまた
はその生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子、ならびにＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡをコードする核酸分子（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡ）を特定するハイブリダイゼーションプローブとして使用されるのに十分な核酸フラグメント、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用されるフラグメントに関する。本明細書において使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むよう意図されている。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。

【0121】

〔００１４８〕
「単離核酸分子」という用語は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離される核酸分子を含む。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離」という用語は、ゲノムＤＮＡが自然に伴う染色体から分離される核酸分子を含む。好ましくは、「単離」核酸分子は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で自然に核酸に隣接する配列（すなわち、核酸分子の５’および３’末端に配置される配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子は、核酸分子が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で自然に核酸分子に隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子等の「単離」核酸分子は、組換え技術によって産生されるとき、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まない場合もあるか、あるいは化学的に合成されるとき、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない場合もある。

【0122】

〔００１４９〕
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列またはその部分を有する核酸分子は、標準の分子生物学的技術および本明細書に提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１もしくは３の核酸配列の全てもしくは一部分を用いて、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されるように）標準のハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いることによって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子を単離することができる。

【0123】

〔００１５０〕
さらに、配列番号１もしくは３の全てもしくは一部分を包含する核酸分子またはオルソログもしくは変異体を、配列番号１、２、３、４、もしくは５の配列に基づいて設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離することができる。

【0124】

〔００１５１〕
標準のＰＣＲ増幅技術に従って、本発明の核酸分子を、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはあるいはゲノムＤＮＡを用いて、かつ適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。そのように増幅された核酸分子を、適切なベクターにクローニングし、かつＤＮＡ配列分析で特徴付けることができる。さらに、ＰＤ−Ｌ３ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて、標準の合成技術によって調製することができる。

【0125】

〔００１５２〕
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子をコードする単離ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡは、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のうちのいずれかの部分の補体である核酸分子を含む。配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、それが、それぞれ、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それによって、安定した二重鎖を形成することができるように、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的な核酸分子である。

【0126】

〔００１５３〕
さらに別の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列の全長、またはこれらのヌクレオチド配列のうちのいずれかの部分と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のヌクレオチド配列を含む。

【0127】

〔００１５４〕
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１もしくは３の核酸配列の部分、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの部分、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−ポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメントのみを含み得る。ヒトＰＤ−Ｌ２遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の種からの他のＰＤ−Ｌ２ファミリーメンバーならびにＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ相同体の特定および／またはクローニングにおける使用のために設計されるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは３のセンス配列、配列番号１もしくは３のアンチセンス配列、あるいは配列番号１もしくは３の自然発生対立遺伝子変異体または変異体の少なくとも約１２または１５、好ましくは、約２０または２５、より好ましくは、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５個の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。

【0128】

〔００１５５〕
一実施形態において、本発明の核酸分子は、約５０〜１００より大きい、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０以上のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは３の核酸分子またはその補体にハイブリダイズする。さらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、約８８０〜９００より大きい、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１０５０、１０５０〜１１００、１１００〜１１５０以上のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは３の核酸分子またはその補体にハイブリダイズする。さらに別の実施形態では、本発明の核酸分子は、５０〜１００より大きい、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００以上のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは３においてコード領域を含む核酸分子またはその補体にハイブリダイズする。さらにさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、約５０〜１００より大きい、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５
０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８５０〜９００、９００〜９５０以上のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含み、配列番号１もしくは３のコード領域を含む配列の少なくとも約１５（すなわち、１５隣接）のヌクレオチドまたはその補体を含み、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子またはその補体にハイブリダイズする。

【0129】

〔００１５６〕
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴヌクレオチド配列に基づくプローブを、同一もしくは相同ポリペプチドをコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用することができる。好ましい実施形態では、プローブは、それに付着される標識基をさらに含み、例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子であり得る。例えば、対象由来の細胞の試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡをコードする核酸のレベルを測定する、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡのレベルを検出することによって、またはゲノムＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子が変異または欠失したかを決定することによって、かかるプローブを、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを誤発現する細胞または組織を特定するための診断検査キットの一部として使用することができる。

【0130】

〔００１５７〕
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの生物学的活性（例えば、その天然結合パートナー（複数を含む）に結合し、かつ／または免疫細胞活性を調節する能力）を有するポリペプチドをコードする配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列の一部分を単離することによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのコードされた部分を発現することによって（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのコードされた部分の活性を評価することによって、「ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを調製することができる。

【0131】

〔００１５８〕
本発明は、遺伝暗号の縮重のため、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列とは異なり、したがって、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする核酸分子をさらに包含する。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２、４、または５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドを有する。

【0132】

〔００１５９〕
当業者であれば、配列番号１および３に示されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴヌクレオチド配列に加えて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることを理解するであろう。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子におけるかかる遺伝的多型は、天然対立遺伝子変異のため、集団内の個人の間に存在し得る。本明細書において使用される「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド、好ましくは、哺乳類ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指し、非コード制御配列、およびイントロンをさらに含むことができる。

【0133】

〔００１６０〕
ヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの対立遺伝子変異体は、機能的および非機能的なＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの両方を含む。機能的な対立遺伝子変異体は、天然ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナー（複数を含む）に結合す
る能力、ならびに／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生およびリンパ球活性化を調節する能力を維持する、ヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド自然発生アミノ酸配列変異体である。機能的な対立遺伝子変異体は、典型的には、配列番号２、４、もしくは５の１つ以上のアミノ酸の同類置換のみを含有するか、またはポリペプチドの重要ではない領域における重要ではない残基の置換、欠失、もしくは挿入を含有する。

【0134】

〔００１６１〕
非機能的な対立遺伝子変異体は、天然ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合する能力、および／または本明細書に記載のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性のうちのいずれをも調節する能力を有しない、ヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの自然発生アミノ酸配列変異体である。非機能的な対立遺伝子変異体は、典型的には、配列番号２、４、または５のアミノ酸配列の非同類置換、欠失、もしくは挿入、または途中切断、あるいはポリペプチドの重要な残基または重要な領域、例えば、ＩｇＶドメインにおける置換、挿入、もしくは欠失を含有する。

【0135】

〔００１６２〕
本発明は、ヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの非ヒト、非マウスオルソログをさらに提供する。ヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのオルソログは、非ヒト、非マウス生物から単離されるポリペプチドであり、本明細書に開示のヒトおよびマウスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドと同一の結合活性および／またはリンパ球活性化調節活性、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を調節する能力を有する。ヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３ポリペプチドのオルソログは、配列番号２、４、もしくは５と実質的に同一のアミノ酸配列を含むとして、容易に特定され得る。

【0136】

〔００１６３〕
さらに、他のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡファミリーメンバーをコードし、したがって、配列番号１もしくは３のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内に収まるよう意図されている。例えば、別のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡは、マウスもしくはヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのヌクレオチド配列に基づいて特定され得る。さらに、異なる種由来のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードし、したがって、配列番号１もしくは３のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内に収まるよう意図されている。例えば、サルＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡを、マウスもしくはヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのヌクレオチド配列に基づいて特定することができる。

【0137】

〔００１６４〕
本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡの天然対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準のハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書に開示のｃＤＮＡを用いて、本明細書に開示のＰＤ−Ｌ２核酸またはその部分とのそれらの相同性に基づいて単離することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子と同一の染色体または遺伝子座にマッピングすることによって、本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡの天然対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子をさらに単離することができる。

【0138】

〔００１６５〕
したがって、別の実施形態では、単離本発明の核酸分子は、少なくとも１５、２０、２
５、３０以上のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子にハイブリダイズする。他の実施形態では、核酸は、少なくとも７００、７５０、８００、８５０、８８０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１０５０、１０５０〜１１００、１１００〜１１５０以上のヌクレオチド長である。

【0139】

〔００１６６〕
本明細書において使用される「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、相互に著しく同一または相同のヌクレオチド配列が相互にハイブリダイズされたままとなる、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明するよう意図される。好ましくは、その条件は、相互に少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％または９０％同一の配列が相互にハイブリダイズされたままの条件である。かかるストリンジェントな条件は、当業者に既知であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（１９９５），第２項、第４項、および第６項における現在のプロトコルで見出すことができる。さらなるストリンジェントな条件を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、第７章、第９章、および第１１章で見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例には、約６５〜７０℃の４倍もしくは６倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃の４倍のＳＳＣに加えて５０％のホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、その後、１×ＳＳＣ中で約６５〜７０℃での１回以上の洗浄が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらに好ましい非限定的な例には、４５℃の６倍のＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、その後、６５℃の０．２倍のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄が挙げられる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例には、約６５〜７０℃の１倍のＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃の１倍のＳＳＣに加えて５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後、約６５〜７０℃の０．３倍のＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。低下したストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例には、約５０〜６０℃の４倍または６倍のＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（またはあるいは約４０〜４５℃の６倍のＳＳＣに加えて５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）その後、約５０〜６０℃の２倍のＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。上述の値に対して中間の範囲、例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃はまた、本発明によって包含されるよう意図される。ＳＳＰＥ（１倍のＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を、ハイブリダイゼーションにおいて、かつ洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１倍のＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）の代わりに用いることができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、それぞれ洗浄を１５分間行う。５０個未満の塩基対の長さであると予想されるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低いはずであり、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。１８個未満の塩基対の長さのハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）−２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１８〜４９個の塩基対の長さのハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋１］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１倍のＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。当業者であれば、遮断剤（例えば、ＢＳＡまたはサケもしくはニシン精子担体ＤＮＡ）、洗剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰ等を含むが、それらに限定
されない追加の試薬を、膜、例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜への核酸分子の非特異的なハイブリダイゼーションを減少させるために、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加してもよいことも認識する。特に、ナイロン膜を用いる場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定的な例は、約６５℃の０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後の６５℃の０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄であり、例えば、Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１９９１−１９９５を参照されたい（またはあるいは、０．２倍のＳＳＣ、１％のＳＤＳ）。

【0140】

〔００１６７〕
好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは３の配列にハイブリダイズする単離本発明の核酸分子は、自然発生核酸分子に対応する。本明細書において使用される「自然発生」核酸分子とは、自然に発生する（すなわち、天然ポリペプチドをコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。

【0141】

〔００１６８〕
集団内に存在し得るＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列の自然発生対立遺伝子変異体に加えて、当業者であれば、変異によって配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列に変化を導入することができ、それによって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの機能的能力を変化させることなく、コードされたＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすことをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を配列番号１もしくは３の配列で行うことができる。「非必須」アミノ酸残基が、生物学的活性を変化させることなく、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの野生型配列（例えば、配列番号２、４、もしくは５の配列）から変化することができる残基である一方で、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド、例えば、細胞外ドメイン中に存在するものの間に保存されるアミノ酸残基は、変質に特に従順でないと予測される。さらに、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドとＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡファミリーの他のメンバーとの間に保存される追加のアミノ酸残基は、変更に適切ではない可能性が高い。

【0142】

〔００１６９〕
したがって、本発明の別の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含有するＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする核酸分子に関する。かかるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、配列番号２、４、もしくは５とはアミノ酸配列において異なるが、生物学的活性を保持する。一実施形態において、単離核酸分子は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは、配列番号２、４、もしくは５と少なくとも約７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を含む。

【0143】

〔００１７０〕
配列番号２、４、もしくは５のポリペプチドと同一のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする単離核酸分子を、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が、コードされるポリペプチドに導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列に導入することによって作成することができる。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発等の標準の技術によって、変異を配列番号１もしくは３に導入することができる。好ましくは、保存アミノ酸置換が１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似した側鎖を
有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基に置き換えられる。あるいは、別の実施形態では、飽和変異誘発等によって、変異を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡコード配列の全てまたは一部分に沿って無作為に導入することができ、活性を保持する変異体を特定するために、結果として生じる変異体を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ生物学的活性についてスクリーニングすることができる。配列番号１もしくは３の変異誘発後、コードされるポリペプチドを組換えによって発現することができ、ポリペプチドの活性を決定することができる。

【0144】

〔００１７１〕
好ましい実施形態において、変異体ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを、天然ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーの活性に結合し、かつ／またはそれを調節する能力、細胞内もしくは細胞間シグナル伝達を調節する能力、Ｔリンパ球の活性化を調節する能力、および／または生物の免疫応答を調節する能力についてアッセイすることができる。

【0145】

〔００１７２〕
本発明のさらに別の態様は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ融合タンパク質をコードする単離核酸分子に関する。非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に結合されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする少なくとも第１のヌクレオチド配列を含むかかる核酸分子を、標準の組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。

【0146】

〔００１７３〕
上述のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、それに対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、ポリペプチドをコードする「センス」核酸に相補的、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡコード鎖全体に相補的であり得るか、またはその部分のみに相補的であり得る。一実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＰＤ−Ｌをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域（５’および３’非翻訳領域とも称される）に隣接する５’および３’配列を指す。本明細書に開示のヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡをコードするコード鎖配列を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好まし
くは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を包囲する領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸分子を、当分野で既知の手順を用いる化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、自然発生ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるか、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖、例えば、ホスホロチオエート誘導体の物理的安定性を増加させるよう設計される様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を化学的に合成することができ、かつアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸を生成するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン−、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、偽ウラシル、ケウオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸を、その中で核酸がアンチセンス配向（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下の項においてさらに説明される関心の標的核酸に対するアンチセンス配向である）でサブクローニングされた発現ベクターを用いて、生物学的に産生することができる。

【0147】

〔００１７４〕
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与されるか、またはそれらが、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、あるいはそれに結合し、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、ポリペプチドの発現を阻害するように、原位置で生成される。ハイブリダイゼーションは、安定した二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるものであり得るか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特定の相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位での直接注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を、選択された細胞を標的とするために修飾し、その後、全身投与することができる。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子が、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合させることによって、選択された細胞表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように、アンチセンス分子を修飾することができる。アンチセンス核酸分子を、本明細書に記載のベクターを用いて、細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。

【0148】

〔００１７５〕
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、αアノマー核酸分子である。αアノマー核酸分子は、通常のβユニットに反して、鎖が相互に対して平行に走る相補的ＲＮＡで、特定の二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含むこともできる。

【0149】

〔００１７６〕
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、ｍＲＮＡ等の一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子であり、それらは、それに対する相補的領域を有する。したがって、リボザイム（例えば、（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ
３３４：５８５−５９１に記載される）ハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡをコードする核酸への特異性を有するリボザイムを、本明細書に開示のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号１もしくは３）のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができ、その中で、活性部位のヌクレオチド配列は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡをコードするｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的である。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照されたい。あるいは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。

【0150】

〔００１７７〕
あるいは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの制御領域（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ遺伝子発現を阻害することができ、標的細胞内でのＰＤ−Ｌ３遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成する。概して、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６、およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５を参照されたい。

【0151】

〔００１７８〕
さらに別の実施形態では、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善するために、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子を、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができる。例えば、ペプチド核酸を生成するために、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾することができる（Ｈｙｒｕｐ，Ｂ．ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書において使用される、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、その中でデオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格に置き換えられ、かつ４つの天然核酸塩基のみが保持される核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物
を指す。ＰＮＡの中性骨格が、低イオン強度の条件下でのＤＮＡおよびＲＮＡへの特定のハイブリダイゼーションを可能にすると示されている。Ｈｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９６）（上記参照）およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４６７０−６７５に記載される標準の固相ペプチド合成プロトコルを用いて、ＰＮＡオリゴマーの合成を行うことができる。

【0152】

〔００１７９〕
ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子のＰＮＡを、治療的および診断的適用において使用することができる。例えば、ＰＮＡを、例えば、転写もしくは翻訳停止の誘導または複製の阻害による、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子作用物質として使用することができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子のＰＮＡを、遺伝子における単一塩基対変異の分析（例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる）において、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上記参照）と組み合わせて使用される場合に「人工制限酵素」として、またはＤＮＡ配列決定もしくはハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上記参照、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）上記参照）使用することもできる。

【0153】

〔００１８０〕
別の実施形態では、（例えば、それらの安定性または細胞取り込みを強化するために）親油基もしくは他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡの形成によって、またはリポソームの使用もしくは当分野で既知の他の薬物送達技術によって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのＰＮＡを修飾することができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得るＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成することができる。かかるキメラにより、ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供しながら、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することが可能になる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを、塩基の積み重ね、核酸塩基間の結合数、および配向の観点から選択される適切な長さのリンカーを用いて結合することができる（Ｈｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上記参照）。Ｈｙｒｕｐ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９６）上記参照およびＦｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載されるように、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を行うことができる。例えば、標準のホスホラミダイトカップリング化学を用いてＤＮＡ鎖を固体支持体上で合成することができ、修飾ヌクレオシド類似体、例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトを、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間の架橋として使用することができる（Ｍａｇ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。ＰＮＡモノマーは、その後、段階的様式でカップリングされて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを用いてキメラ分子を産生する（Ｆｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）上記参照）。あるいは、キメラ分子を、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。

【0154】

〔００１８１〕
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするための）ペプチド等の他の付加基、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６、Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２、ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０９８１０
号を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／１０１３４号を参照のこと）にわたって輸送を促進する作用物質を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）で修飾することができる。この目的を達成するために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発型切断剤）に抱合される。

【0155】

〔００１８２〕
あるいは、細胞株または微生物内の内在性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ遺伝子の発現特性は、異種ＤＮＡ調節要素を安定した細胞株またはクローニングされた微生物のゲノムに挿入して、挿入された調節要素が内在性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子と作動可能に結合するようにすることによって改変することができる。例えば、通常「転写していない」内在性ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子、すなわち、通常発現されないか、または非常に低いレベルで細胞株もしくは微生物内で発現されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ遺伝子を、その細胞株または微生物内で通常発現される遺伝子産物の発現を促進することができる調節要素を挿入することによって活性化することができる。あるいは、転写していない内在性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子を、複数の細胞型にわたって機能する乱交雑調節要素の挿入によって活性化することができる。

【0156】

〔００１８３〕
異種調節要素を、当業者に周知であり、かつ、例えば、Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号、１９９１年５月１６日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０６６６７号に記載される標的化相同組換え等の技術を用いて、それが内在性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子に作動可能に結合されるように、安定した細胞株またはクローニング微生物に挿入ことができる。

【0157】

ＩＩ．単離ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドおよび抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体
〔００１８４〕 本発明の一態様は、単離ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド、およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体を産生する免疫原としての使用に好適なポリペプチドフラグメントに関する。一実施形態において、天然ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを、標準のタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織源から単離することができる。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現の代替法として、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質またはポリペプチドを、標準のペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。

【0158】

〔００１８５〕
「単離」もしくは「精製」ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、細胞物質、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドが由来する細胞もしくは組織源由来の他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成されるとき、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言い回しは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの調製物を含み、その中で、ポリペプチドは、それが単離もしくは組換えによって産生される細胞の細胞成分から分離される。一実施形態において、「を実質的に含まない細胞物質」という言い回しは、約３０％（乾燥重量）未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質（本明細書において、「夾雑タンパク質」とも称される）、より好ましくは、約２０％未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質、さらにより好ましくは、約１０％未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳ
ＴＡタンパク質、および最も好ましくは、約５％未満の非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質を有するＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの調製物を含む。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分が組換えによって産生されるとき、それはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、および最も好ましくは、約５％未満を占める。

【0159】

〔００１８６〕
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、その中でポリペプチドがポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの調製物を含む。一実施形態において、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質、より好ましくは、約２０％未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質、さらにより好ましくは、約１０％未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質、および最も好ましくは、約５％未満の化学的前駆体または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化学物質を有するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの調製物を含む。

【0160】

〔００１８７〕
本明細書において使用される、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの「生物学的に活性な部分」は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子と、非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの天然リガンドとの間の相互作用に関与するＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのフラグメントを含む。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的に活性な部分は、全長ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、かつ少なくとも１つのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの活性を呈する、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸配列に十分に同一であるか、またはそれ由来のアミノ酸配列、例えば、配列番号２、４、もしくは５に示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、少なくとも１つのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの活性、例えば、抗ＣＤ３へのＣＤ４Ｔ細胞増殖性応答の調節（抑制）、抗原特異的様式での同族ＣＤ４Ｔ細胞の増殖性応答の抑制、特定のサイトカイン等の発現への影響を有するドメインまたはモチーフを含む。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的に活性な部分は、例えば、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５またはそれ以上のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的に活性な部分を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ媒介性活性、例えば、免疫細胞活性化を調節する作用物質を開発するための標的として使用することができる。

【0161】

〔００１８８〕
一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的に活性な部分は、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む。本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの好ましい生物学的に活性な部分が、細胞外ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＩｇＶを含む）、およびシグナルペプチドドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの１つ以上を含有し得ることを理解されたい。さらに、その中でポリペプチドの他の領域が除去される他の生物学的に活性な部分を、組換え技術によって調製し、かつ天然ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの機能的活性のうちの１つ以上について評価することができる。

【0162】

〔００１８９〕
好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、配列番号２
、４、もしくは５に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、配列番号２、４、もしくは５と実質的に同一であり、配列番号２、４、もしくは５のポリペプチドの機能的活性を保持するが、上述の天然対立遺伝子変異または変異誘発のため、アミノ酸配列において異なる。

【0163】

〔００１９０〕
本発明の核酸およびポリペプチド配列はさらに、「問い合わせ配列」として使用され、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公開データベースに対して検索を行うことができる。かかる検索を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためにギャップドアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータを使用することができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。

【0164】

〔００１９１〕
本発明はまた、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書において使用される、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに作動可能に結合されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを含む。「ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド」が、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子に対応するポリペプチドを有するアミノ酸配列を指す一方で、「非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド」は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドに実質的に相同しないポリペプチド、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドとは異なり、かつ同一もしくは異なる生物に由来するポリペプチドに対応するポリペプチドを有するアミノ酸配列を指す。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質内で、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの全てもしくは一部分に相当し得る。好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの少なくとも２つのドメインを含む。融合タンパク質内で、「作動可能に結合される」という用語は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドおよび非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドが、インフレームで相互に融合されることを示すよう意図されている。非ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの溶解性、結合親和性、安定性、または結合価を変化させる部分に対応する。

【0165】

〔００１９２〕
例えば、一実施形態において、融合タンパク質は、その中でＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合される、ＧＳＴ−ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、組換えＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの精製を促進することができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端で異種シグナ
ル配列を含有するＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドである。ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの発現および／または分泌を、異種シグナル配列の使用を介して増加させることができる。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、その中でＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列がＩｇ分子の部分に融合される、Ｉｇ−ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質である。融合タンパク質のＩｇ部分は、免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＣガンマ１ドメインまたはＣガンマ４ドメイン（例えば、ヒトＩｇＣガンマｌまたはヒトＩｇＣガンマ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含むことができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｐｏｎらの米国特許第５，１１６，９６４号、同第５，５８０，７５６号、同第５，８４４，０９５号等を参照のこと）。結果として生じる融合タンパク質は、変化したＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ溶解性、結合親和性、安定性、および／または結合価（すなわち、１つの分子当たりの結合部位の数）を有し得、タンパク質精製の効率を増加させ得る。

【0166】

〔００１９３〕
特に好ましいＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ Ｉｇ融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）に結合されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン部分を含む。免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリン構造固有のエフェクター活性を現象させるか、または排除する遺伝的修飾を含有し得る。例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの細胞外部分をコードするＤＮＡを、例えば、国際特許第ＷＯ９７／２８２６７号において教示される部位特異的変異誘発によって修飾されるヒトＩｇＧガンマ１および／またはＩｇＧガンマ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合することができる。本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質を、薬学的組成物に組み込み、対象にインビボ投与することができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質を使用して、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ結合パートナーの生物学的利用能に影響を及ぼすことができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ融合タンパク質の使用は、免疫応答の調節から恩恵を受けるであろう状態または障害の治療に治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−融合タンパク質を、対象において抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体を産生し、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ結合タンパク質を精製し、かつスクリーニングアッセイにおいて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナーとの相互作用を阻害する分子を特定する免疫原として使用することができる。

【0167】

〔００１９４〕
好ましくは、本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡキメラまたは融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技術によって産生される。

【0168】

〔００１９５〕
本発明はまた、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニスト（模倣体）またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアンタゴニストのいずれかとして機能するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体に関する。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体を、変異誘発、例えば、離散点変異、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの切断によって生成することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのアゴニストは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの自然発生形態の生物学的活性と実質的に同一の活性、またはそのサブセットを保持することができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのアンタゴニストは、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ媒介性活性を競合的に調節することによって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの自然発生形態の活性のうちの１つ以上を阻害することができる。したがって、限定された機能を有する変異体による治療によって、特定の生物学的効果を誘発することができる。一実施形態において、ポリペプチドの自然
発生形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体での対象の治療は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの自然発生形態での治療と比較して、対象における副作用が少ない。

【0169】

〔００１９６〕
一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニスト（模倣体）またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアンタゴニストのいずれかとして機能するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドことたはアンタゴニスト活性について、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体、例えば、切断変異体の組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって特定することができる。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ変異体の変化に富んだライブラリは、核酸レベルでの組み合わせ変異誘発によって生成され、変化に富んだ遺伝子ライブラリによってコードされる。縮重組の可能性のあるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ配列が、個別のポリペプチドとして、またはあるいは、その中に縮重組のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ配列を含有する一組のより大きい融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ用）として発現可能であるように、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ変異体の変化に富んだライブラリを、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって産生することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ変異体のライブラリを産生するために使用することができる様々な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動ＤＮＡ合成機内で行い、その後、合成遺伝子を、適切な発現ベクターに連結することができる。縮重組の遺伝子の使用は、１つの混合物において、所望の組の可能性のあるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列をコードする配列全ての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６、Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。

【0170】

〔００１９７〕
さらに、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドコード配列のフラグメントのライブラリ加を使用して、スクリーニングおよびその後のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体の選択のために、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡフラグメントの変化に富んだ集団を生成することができる。一実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリを、ニッキングが１つの分子当たり約１回のみ発生する条件下で、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元して、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含む二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによって再編成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、かつ結果として生じるフラグメントライブラリを発現ベクターに連結させることによって生成することができる。この方法によって、種々の大きさののＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、および内部フラグメントをコードする発現ライブラリを得ることができる。

【0171】

〔００１９８〕
点変異または切断によって作製される組み合わせライブラリの遺伝子産物のスクリーニング、および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリのスクリーニングのためのいくつかの技術が当分野で既知である。かかる技術は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの組み合わせ変異誘発により生成される遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適応可能である。大きな遺伝子ライブラリをスクリーニングするために、高スループット分析に適した、最も広く使用される技術は、典型的には、遺伝子ライブラリ
を複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適切な細胞を結果として生じるベクターのライブラリで形質転換すること、および所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下で、組み合わせ遺伝子を発現することを含む。ライブラリにおける機能的変異体の頻度を強化する新しい技術である、再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ変異体を特定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５、Ｄｅｌａｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６（３）：３２７−３３１）。

【0172】

〔００１９９〕
自然発生アミノ酸のみから成るＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドに加えて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡペプチド模倣物も提供される。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬物として製薬業界において一般に使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」または「ペプチド模倣物」と称され（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ ｐ．３９２、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３０：１２２９）、通常、コンピュータ化分子モデリングモデルを用いて開発される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣体を使用して、同等の治療または予防効果をもたらすことができる。概して、ヒトまたはマウスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ等のパラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似したペプチド模倣物は、当分野で既知であり、かつ以下の参考文献：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ１９８３），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ｐｐ．４６３−４６８、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９（−−ＣＨ２−−Ｓ）、Ｈａｎｎ，Ｍ．Ｍ．（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．ＳｏＣ Ｐｅｒｋｉｎ．Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７−３１４（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）、Ａｌｍｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（−−ＣＯＣＨ２−−）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ，Ｃ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（−−ＣＯＣＨ２−−）、Ｓｚｅｌｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、欧州特許出願第ＥＰ４５６６５号（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）、Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）、およびＨｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．（１９８２）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載される方法によって、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、ならびに−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群から選択される結合に任意で置き換えられる１つ以上のペプチド結合を有する。特に好ましい非ペプチド結合は、−−ＣＨ２ＮＨ−−である。かかるペプチド模倣体は、例えば、より経済的な産生、より高い化学安定性、強化された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性等）、変化した特異性（例えば、広範囲の生物学的活性）、低減した抗原性等を含むポリペプチド
実施形態に勝る有意な利点を有し得る。ペプチド模倣物の標識化は、通常、直接的に、またはスペーサ（例えば、アミド基）を介して、定量的構造活性データおよび／または分子モデリングによって予測されるペプチド模倣物上の非干渉位置（複数を含む）への１つ以上の標識の共有結合を伴う。かかる非干渉位置は、概して、ペプチド模倣物が結合して治療効果をもたらす巨大分子（複数を含む）との直接接触しない位置である。ペプチド模倣物の誘導体化（例えば、標識化）は、ペプチド模倣物の所望の生物学的または薬理学的活性を大幅に妨害すべきではない。

【0173】

〔００２００〕
同一の種類のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）によるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の系統的置換を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。加えて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアミノ酸配列または実質的に同一の配列変異を含む拘束されたペプチドを、当分野で既知の方法（参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を添加することによって生成することができる。本明細書において特定されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドのアミノ酸配列は、当業者が、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡペプチド配列およびその配列変異体に対応するポリペプチドを産生することができるようにする。かかるポリペプチドを、高い頻度でより大きいポリペプチドの一部として、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって、原核または真核細胞宿主細胞中で産生することができる。あるいは、かかるペプチドを、化学的方法によって合成することができる。組換え宿主における異種ポリペプチドの発現、ポリペプチドの化学合成、およびインビトロ翻訳のための方法は、当分野で周知である。ある特定のアミノ末端および／もしくはカルボキシ末端修飾ならびに／またはコア配列へのペプチド拡張は、強化された安定性、増加した効力および／もしくは有効性、血清プロテアーゼへの耐性、望ましい薬物動態学的特性等の有利な物理的、化学的、生化学的、および薬理学的特性を提供することができる。ペプチドを治療的に使用して、例えば、患者における共刺激を変化させることによって、疾患を治療することができる。

【0174】

〔００２０１〕
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のために、標準の技術を用いて、単離ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、またはその部分もしくまたはフラグメントを、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに結合する抗体を生成する免疫原として使用することができる。全長ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを使用することができるか、またはあるいは、本発明は、免疫原としての使用のために、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの抗原ペプチドフラグメントを提供する。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの抗原ペプチドは、配列番号２、４、もしくは５に示されるアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、かつペプチドに対して産生される抗体が、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを有する特定の免疫複合体を形成するように、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは、少なくとも２０個のアミノ酸残基、および最も好ましくは、少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原ペプチドによって包含される好ましいエピトープは、ポリペプチドの細胞外ドメイン内に配置されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの領域、例えば、親水性領域、ならびに高抗原性を有する領域である。

【0175】

〔００２０２〕
ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ免疫原は、典型的には、好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）を免疫原で免疫することによって、抗体を調製するた
めに使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えによって発現されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは化学的に合成されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを含有し得る。調製物は、完全フロインドもしくは不完全アジュバント等のアジュバント、または類似した免疫刺激剤をさらに含み得る。免疫原性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ調製物での好適な対象の免疫化は、ポリクローナル抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体応答を誘導する。

【0176】

〔００２０３〕
したがって、本発明の別の態様は、抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体に関する。本明細書において使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ等の抗原に特異的に結合する（それと免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、抗体をペプシン等の酵素で処理することによって生成することができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の１つの種のみを含有する抗体分子の集団を指す。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドに対する単一結合親和性を示す。

【0177】

〔００２０４〕
ポリクローナル抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体を、上述のように、好適な対象をＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ免疫原、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質で免疫することによって、調製することができる。免疫された対象における抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体力価を、固定化ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の標準の技術によって長期にわたって監視することができる。所望される場合、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに対して指向される抗体分子を、哺乳動物（例えば、血液）から単離し、タンパク質Ａクロマトグラフィー等の周知の技術によってさらに精製し、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化後の適切な時点で、例えば、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体力価が最高である時点で、抗体産生細胞を対象から得て、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７によって最初に説明されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２９２７−３１、およびＹｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−７５も参照のこと）、近年のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）、またはトリオーマ技術等の標準の技術によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術が周知である（概して、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）；Ｌｅｍｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡潔に述べると、不死化細胞株（典型的には、骨髄腫）が、上述のように、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ免疫原で免
疫された哺乳動物由来のリンパ球（典型的には、脾細胞）に融合され、結果として生じるハイブリドーマ細胞の培養上清が、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定するためにスクリーニングされる。リンパ球および不死化細胞株を融合させるために使用される多くの周知のプロトコルのうちのいずれかを、抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡモノクローナル抗体生成の目的で適用することができる（例えば、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２、Ｇｅｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）（上記参照）、Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）（上記参照）、およびＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０）（上記参照）を参照のこと）。さらに、当業者であれば、同様に有用なかかる方法の多くの変形が存在することを理解する。典型的には、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同一の哺乳類種由来である。例えば、マウスハイブリドーマを、本発明の免疫原性調製物で免疫されたマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞株で融合させることによって作製することができる。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性があるマウス骨髄腫細胞株である。いくつかの骨髄腫細胞株、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株のうちのいずれかを、標準の技術に従って、融合パートナーとして使用することができる。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合される。融合に起因するハイブリドーマ細胞は、その後、融合していない骨髄腫細胞および非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いる選択される（融合していない脾細胞は、形質転換されないため、数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養上清をＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに結合する抗体についてスクリーニングすることによって検出される。

【0178】

〔００２０５〕
ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに結合する抗体を産生するための特定の方法を、当分野で既知の方法および実施例に記載の方法を用いて達成することができる。モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の代替として、モノクローナル抗ＰＤ−Ｌ３抗体を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを有する組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングすることによって特定かつ単離し、それによって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することができる。ファージディスプレイライブラリを生成およびスクリーニングするためのキットが市販されている。

【0179】

〔００２０６〕
上述のように、これらの抗体は、例えば、ＩｇＶドメインまたは他の特定のドメイン中のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの特定のエピトープに結合するものを特定し、かつ／またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質に対して高親和性および結合活性を有する抗体を選択するためにスクリーニングされる。加えて、これらの抗体は、インビトロおよびインビボでのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの特定の機能および免疫および免疫細胞への影響を調節するものを特定するためにスクリーニングされる。例えば、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生、ＣＤ２８共刺激、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、およびナイーブおよび記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖等を含む、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡによって負に制御される免疫機能への特定の抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体の調節作用がある場合、それを確認するために、アッセイを行うことができる。好ましい実施形態において、これらの抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体が、インビボで正反対に挙動する、すなわち、それらが免疫抑制性であるときに、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在が、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇによる抑制を強化する場合に、インビトロでの可能性のある治療的抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体を特定するためにアッセ
イを行う。本発明は、１３６アミノ酸細胞外ドメイン、例えば、アミノ酸１〜５０、５０〜１００、１００〜１３６に特異的に結合する抗ＶＩＳＴＡ抗体、ＩｇＶに特異的に結合する抗体、ストーク領域に特異的に結合する抗体、膜貫通領域に特異的に結合する抗体、および細胞質の領域ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体、ならびにそれらの使用を包含する。これらの特定の領域は、本出願において特定される。

【0180】

〔００２０７〕
さらに、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体等の組換え抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体は、本発明の範囲内である。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願第１８４，１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．の欧州特許出願第１７１，４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願第１７３，４９４号、ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらのＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願第１２５，０２３号、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３、Ｌｉｕ
ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９、Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、およびＢｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載の方法を用いて、当分野で既知の組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。

【0181】

〔００２０８〕
抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用して、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降等の標準の技術によって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを単離することができる。抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体は、細胞由来の天然ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの精製および宿主細胞内で発現される組換えによって産生されたＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの精製を促進することができる。さらに、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの量およびその発現のパターンを評価するために、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体を使用して、（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを検出することができる。抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体を診断的に使用して、例えば、所与の治療計画の有効性を決定するために、臨床試験手順の一環として、組織中のポリペプチド濃度を監視することができる。検出を、抗体を検出可能な物質に結合（すなわち、物理的に結合）させることによって促進することができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジンビオチンおよびアビジンビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ
、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例には、１２５１、１３１１、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。

【0182】

ＩＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
〔００２０９〕
本発明の別の態様は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド（またはその部分）をコードする核酸分子を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用される「ベクター」という用語は、それに結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの種類には、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」がある。ベクターの別の種類には、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターがある。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製の能力がある（例えば、複製の細菌起源を有する細菌性ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合される遺伝子の発現を指向することができる。かかるベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。概して、組換えＤＮＡ技術において実用的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」を同義に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）等のかかる他の発現ベクターの形態を含むよう意図されている。

【0183】

〔００２１０〕
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に結合される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で「作動可能に結合される」とは、関心のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、インビトロ転写翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される際の宿主細胞において）、制御配列（複数を含む）に結合されることを意味するよう意図されている。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むよう意図されている。かかる制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載されている。制御配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的制御配列）を含む。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要因に依存し得ることを理解する。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの変異体形態、融合タンパク質等）を産生することができる。

【0184】

〔００２１１〕
本発明の組換え発現ベクターを、原核または真核細胞におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの発現のために設計することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを、大腸菌等の細菌性細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、または哺乳類細胞において発現することができる。好適な
宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）（上記参照）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳することができる。精製された融合タンパク質を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性アッセイ（例えば、以下で詳細に説明される直接アッセイまたは競合アッセイ）において利用することができるか、または例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに特異的な抗体を生成することができる。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。あるいは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現することができる。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるポリペプチドの発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が含まれる。さらに別の実施形態では、本発明の核酸を、哺乳類発現ベクターを用いて、哺乳類細胞において発現する。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳類細胞で使用されるとき、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節要素によって提供される。例えば、一般に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来である。原核細胞および真核細胞の両方における他の好適な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照されたい。

【0185】

〔００２１２〕
別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型における核酸の発現を優先的に指向することができる（例えば、組織特異的調節要素を使用して核酸を発現する）。組織特異的調節要素は、当分野で既知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞受容体の特定のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ
Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターは、例えば、マウスホックス
プロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）によっても包含される。

【0186】

〔００２１３〕
本発明は、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングされる本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターをさらに提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で、制御配列に作動可能に結合される。様々な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指向する、アンチセンス配向でクローニングされる核酸分子に作動可能に結合される制御配列、例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的、もしくは細胞型特異的発現を指向する制御配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、その中でアンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下で産生される組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得、その活性を、ベクターが導入される細胞型で決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の制御についての考察に関して、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照されたい。

【0187】

〔００２１４〕
本発明の別の態様は、本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、例えば、組換え発現ベクター内のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、またはそれが宿主細胞のゲノムの特定の部位に相同的に組換えることを可能にする配列を含有するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子が導入される宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において同義に使用される。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫または潜在的子孫も指すことが理解される。変異または環境の影響のいずれかの理由から、ある特定の修飾が後世で発生するため、かかる子孫は、事実上、親細胞と同一でない場合もあるが、依然として、本明細書において使用される用語の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であり得る。ベクターＤＮＡを、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核または真核細胞に導入することができる。本明細書において使用される「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む、当技術分野で認識されている、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な技術を指すよう意図されている。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための好適な方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、および他の実験の手引きにおいて見出すことができる。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質への耐性）は、概して、関心の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート等の薬物に耐性を付与するマーカーを含む。培養中の原核または真核細胞宿主細胞等の本発明の宿主細胞を使用して、を使用して、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを産生する（すなわち、を発現する）ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いてＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドを産生するための方法をさらに提供する。一
実施形態において、本方法は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドが産生されるように、（その中にＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を好適な培地で培養することを含む。別の実施形態では、本方法はさらに、培地または宿主細胞からＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを単離することを含む。

【0188】

〔００２１５〕
本発明の宿主細胞を使用して、非ヒト遺伝子導入動物を産生することもできる。例えば、一実施形態において、本発明の宿主細胞は、その中でＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−コード配列が導入された受精卵母細胞または胚幹細胞である。ひいては、かかる宿主細胞を使用して、外因性ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ配列を、内在性ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ配列がその中で変化したそれらのゲノムまたは相同組換え動物に導入した、非ヒト遺伝子導入動物を作製することができる。かかる動物は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの機能および／または活性の研究、ならびにＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の調節因子の同定および／または評価に有用である。本明細書において使用される「遺伝子導入動物」は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ラットまたはマウス等の齧歯類であり、それらの動物の細胞のうちの１つ以上は、導入遺伝子を含む。遺伝子導入動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等が挙げられる。導入遺伝子は、遺伝子導入動物がそれから発達し、かつ成熟動物のゲノムに残存する細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、遺伝子導入動物の１つ以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を指向する外因性ＤＮＡである。本明細書において使用される「相同組換え動物」は、動物の発達の前に、内在性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子が、内在性遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞に導入される外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変化した、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウスである。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクションによって、レトロウイルス感染によって、および卵母細胞を偽妊娠した雌里親動物において発生させることにより、受精卵母細胞の雄前核に導入することによって、本発明の遺伝子導入動物を作製することができる。配列番号１もしくは４のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ配列を、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、サルもしくはラットＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子等のヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子の非ヒト相同体を、導入遺伝子として使用することができる。あるいは、別のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡファミリーメンバー等のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子相同体を、配列番号１もしくは３のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションに基づいて単離することができ（上の第Ｉ項においてさらに説明される）、かつ導入遺伝子として使用することができる。導入遺伝子の発現の効率を増加させるために、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子に包含され得る。組織特異的制御配列（複数を含む）を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ導入遺伝子に作動可能に結合させて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの発現を特定の細胞に指向することができる。胚操作およびマイクロインジェクションを介して遺伝子導入動物、特にマウス等の動物を生成するための方法は、当分野で定着しており、例えば、両方ともにＬｅｄｅｒらの米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号、Ｗａｇｎｅｒらの米国特許第４，８７３，１９１号、およびＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）において記載されている。類似の方法が、他の遺伝子導入動物の産生のために使用される。遺伝子導入創始動物を、そのゲノム中のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ導入遺伝子の存在および／または動物の組織もしくは細胞におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。ひいては、遺伝子導入創始動物を用いて、導入遺伝子を担持する追加の動物を繁殖させることができる。さらに、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチド
をコードする導入遺伝子を担持する遺伝子導入動物をさらに繁殖させて、他の導入遺伝子を担持する他の遺伝子導入動物にすることができる。

【0189】

〔００２１６〕
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入され、それによって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子を変化させる、例えば、機能的に撹乱する、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターが調製される。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴ遺伝子は、ヒトまたはマウス遺伝子（例えば、配列番号１もしくは３のｃＤＮＡ）であり得る。

【0190】

〔００２１７〕
別の実施形態では、導入遺伝子の制御された発現を可能にする選択された系を含有する遺伝子導入非ヒト動物を産生することができる。かかる系の一例には、バクテリオファージＰＩのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系がある。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６を参照されたい。リコンビナーゼ系の別の例には、サッカロミセス・セレビシエのＦＬＰリコンビナーゼ系がある（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたポリペプチドの両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要とされる。かかる動物は、「２つの」遺伝子導入動物の構築を介して、例えば、一方が、選択されたポリペプチドをコードする導入遺伝子を含有し、他方が、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する、２つの遺伝子導入動物を交配させることによって提供され得る。

【0191】

〔００２１８〕
本明細書に記載の非ヒト遺伝子導入動物のクローンを、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ならびにＰＣＴ国際公開第ＷＯ９７／０７６６８号および同第ＷＯ９７／０７６６９号に記載される方法に従って産生することもできる。手短に述べると、遺伝子導入動物由来の細胞、例えば、体細胞を単離および誘導して、成長周期から脱してＧＯ期に入らせることができる。その後、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用を介して、静止細胞が単離された同一の種の動物由来の除核卵母細胞に融合することができる。構築物された卵母細胞は、次に、桑実胚または胞胚期に進化するように培養され、その後、偽妊娠した雌里親動物に移される。この雌里親動物由来の子孫は、細胞、例えば、体細胞が単離される動物のクローンである。

【0192】

ＩＶ．薬学的組成物
〔００２１９〕 本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのフラグメント、および抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体（本明細書において、「活性化合物」または「調節剤」とも称される）を、投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には、核酸分子、ポリペプチド、または抗体、および担体、例えば、薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」という言い回しは、薬学的投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒、被覆物、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むよう意図されている。薬学的に活性な物質へのかかる媒体および作用物質の使用は、当分野で周知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物に適合する場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。

【0193】

〔００２２０〕
上述のように、かかる組成物は、所望の抗原、例えば、腫瘍抗原、またはＴｏｌｌ様の受容体アゴニスト、アルファおよびベータインターフェロン等の１型インターフェロン、ならびにアゴニストＣＤ４０抗体および抗体フラグメント、好ましくは、抗ヒトＣＤ４０アゴニスト抗体および抗体フラグメント等のＣＤ４０アゴニスト等の別の免疫調節化合物、またはＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４融合タンパク質等の他の免疫エンハンサーもしくは抑制因子およびそれに特異的な抗体をさらに含み得る。

【0194】

〔００２２１〕
いくつかの好ましい実施形態では、組成物またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに基づく治療は、抗原または他の免疫アゴニストをさらに含む。組成物または治療において存在するとき、抗原を、組み合わせの他の成分との併用で、抗原に対する免疫応答を発生させるのに効果的な量で投与することができる。例えば、抗原を、約１００μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。いくつかの実施形態において、抗原を、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。いくつかの実施形態において、抗原を、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与することができる。しかしながら、免疫応答を発生させるのに効果的な量を構成する特定の量の抗原は、例えば、投与される特定の抗原、投与される特定のアゴニスト、およびそれらの量；投与される特定のアゴニスト、およびその量；免疫系の状態；アゴニストおよび抗原の投与方法および順序；製剤が投与される種；ならびに所望の治療結果等のある特定の要因にある程度依存する。したがって、有効な量の抗原を構成する量を一般に説明するのは実用的ではない。しかしながら、当業者は、かかる要因を十分に考慮して、適切な量を容易に決定することができる。

【0195】

〔０１７６〕
抗原は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＮＫＴ細胞応答、γ／δＴ細胞応答、またはＴｈ１抗体応答のうちの１つ以上を含むＴｈ１免疫応答をもたらすことができる任意の物質であり得る。好適な抗原には、ペプチド；ポリペプチド；脂質；糖脂質；多糖類；炭水化物；ポリヌクレオチド；プリオン；生細菌または不活性化細菌、ウイルスまたは真菌類；および細菌性、ウイルス性、真菌性、原虫、腫瘍由来、または生物由来抗原、毒素、またはトキソイドが含まれるが、それらに限定されない。

【0196】

〔０１７７〕
さらに、ある特定の現在実験的な抗原、特に、強力な免疫応答をもたらさない組換えタンパク質、糖タンパク質、およびペプチド等の物質を、本発明のアジュバント組み合わせ物と関連して使用することができる。例示的な実験的サブユニット抗原は、アデノウイルス、ＡＩＤＳ、水疱瘡、サイトメガロウイルス、デング熱、猫白血病、家禽ペスト、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、豚コレラ、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、日本脳炎、麻疹、パラインフルエンザ、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、ロタウイルス、疣贅、および黄熱等のウイルス性疾患に関連した抗原を含む。

【0197】

〔０１７８〕
一実施形態において、抗原は、癌抗原または腫瘍抗原であり得る。癌抗原および腫瘍抗原という擁護は、同義に使用され、癌細胞によって差次的に発現される抗原を指す。したがって、癌細胞に対する免疫応答を差次的に標的化する癌抗原を開発することができる。したがって、癌抗原は、腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る。ある特定の癌抗原は、必ずしも発現されるわけではないが、正常細胞によってコードされる。これらの抗原のうちのいくつかは、正常細胞において、通常サイレント（すなわち、発現されない）と見なされ得、それらは、ある特定の分化段階でのみ発現され、かつ時間的に発現される（例えば、胚抗原および胎児性抗原）。他の癌抗原は、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ラス癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、変異体ｐ５３）等の変異体細胞遺伝子、または内部
欠失または染色体転座に起因する融合タンパク質によってコードされ得る。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルスによって担持される遺伝子等のウイルス遺伝子によってコードされ得る。

【0198】

〔０１７９〕
腫瘍抗原の例には、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＵＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、サイクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ならびにその抗原エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍ１１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ならびにその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、αフェトプロテイン、εカドヘリン、α、βカテニン、γカテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１０．ｓｕｐ．Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫様ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質等のウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、Ｉｍｐ−１、ＰＩＡ、ＥＢＶ−コードされた核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、およびＣＴ−７、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。

【0199】

〔０１８０〕
癌または腫瘍およびかかる腫瘍と関連している（が排他的ではない）特定の腫瘍抗原には、急性リンパ芽球性白血病（ｅｔｖ６、ａｍ１１、サイクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、神経膠腫（Ｅ−カドヘリン、αカテニン、βカテニン、γカテニン、ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸癌（ｐ５３、ｐ２１ｒａｓ）、結腸癌（ｐ２１ｒａｓ、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−ＣＯ１７−１ Ａ ＧＡ７３３、ＡＰＣ）、絨毛腫（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（サイクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞癌（αフェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ球様細胞由来の白血病（サイクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ５タンパク質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｃｄｃ２７、ＭＡＧＥ−３、ｐ２１ｒａｓ、ｇｐ１００．ｓｕｐ．Ｐｍｅｌ１１７）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー、ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽腔癌（Ｉｍｐ−１、ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ならびにその抗原エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部および食道の扁平上皮癌（ヒト乳頭腫ウイルス
タンパク質等のウイルス産物）、精巣癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ならびにＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）が含まれる。

【0200】

〔００２２２〕
本発明の薬学的組成物は、その目的とする投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注入用の水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の無菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化物質；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝液；および塩化ナトリウムまたはブドウ糖等の張度の調整用の作用物質。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチックで作製されるアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアル内に封入することができる。

【0201】

〔００２２３〕
注入用途に好適な薬学的組成物は、無菌水溶液（水溶性である）または分散液、および無菌注入溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、クレモホールＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流動性であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定しなければならず、細菌および真菌類等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチン等の被覆物の使用によって、分散時の所要の粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の阻止を、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等で達成することができる。多くの場合において、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、マンニトール等の多価アルコール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能な組成物の長期吸収を、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによって実現することができる。

【0202】

〔００２２４〕
上に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中で、活性化合物（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのフラグメント、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体、または抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせ等の調節剤）を所要の量組み込むことによって、無菌注入溶液を調製することができ、その後、必要に応じて、濾過による殺菌が続く。概して、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上に列挙される成分の所要の他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注入溶液の調製のための無菌粉末について、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分に加えて、先に無菌濾過されたその溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を産出する。

【0203】

〔００２２５〕
経口組成物は、概して、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらをゼラチンカプセルに封入することができるか、または錠剤に圧縮することができる。治療のための経口投
与の目的で、活性化合物を、賦形剤と組み込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。マウスウォッシュ用のための流動性担体を用いて、経口組成物を調製することもでき、流動性担体中の化合物は、経口適用され、滞留され、かつ喀出されるか、または嚥下される。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分または類似した性質の化合物のうちのいずれをも含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン等の結合剤；デンプンもしくは乳糖等の賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプン等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅ等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；蔗糖もしくはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、メチルサリチル酸、もしくはオレンジ香味料等の香味剤。

【0204】

〔００２２６〕
吸入による投与のために、化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器もしくは分配器、またはネブライザから、エアゾル噴霧の形態で送達される。

【0205】

〔００２２７〕
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段により得る。経粘膜または経皮投与のために、浸透されるバリアに適切な浸透剤が、製剤において使用される。かかる浸透剤は、概して、当分野で既知であり、例えば、経粘膜投与において、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与を、鼻内噴霧または坐剤の使用を介して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、概して、当分野で既知のように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに製剤化される。

【0206】

〔００２２８〕
化合物を、直腸送達のために、坐剤（例えば、ココアバター等の従来の坐剤基剤および他のグリセリドを有する）または停留浣腸剤の形態で調製することができる。一実施形態において、活性化合物は、化合物を身体からの迅速な排除から保護する、移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤等の担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製方法は、当業者には明らかである。物質をＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されるリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらを、当業者に既知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように調製することができる。

【0207】

〔００２２９〕
経口または非経口組成物を、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される投与単位形態とは、単位投与量として治療される対象に適した物理的に分離した単位を指し、それぞれの単位は、所要の薬学的担体に関連して所望の治療効果をもたらすよう計算された既定の量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の規格は、活性化合物の特有の特性および達成される特定の治療効果、ならびに個人の治療のためにかかる活性化合物を配合する分野固有の制限によって指示され、かつそれらに直接依存している。

【0208】

〔００２３０〕
かかる化合物の毒性および治療的有効性を、細胞培養物または実験的動物における標準
の薬学的処置によって決定することができる。細胞培養物アッセイおよび動物研究から入手されるデータを、ヒトでの使用に対する投与量の範囲を策定する際に使用することができる。かかる化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有しないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的に効果的な用量を、細胞培養物アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養物において決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の５０％の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて策定され得る。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿濃度を、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

【0209】

〔００２３１〕
本明細書で定義されるように、治療的に有効な量のタンパク質またはポリペプチド（すなわち、効果的な投与量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびさらにより好ましくは、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重に及ぶ。当業者であれば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、それらに限定されないある特定の要因が、対象を効果的に治療するのに必要とされる用量に影響を与え得ることを理解する。さらに、治療的に有効な量のタンパク質、ポリペプチド、もしくは抗体での対象の治療は、単回治療を含み得るか、または好ましくは、一連の治療を含み得る。

【0210】

〔００２３２〕
好ましい実施例において、対象は、１週間に１回、約１〜１０週間、好ましくは、２〜８週間、より好ましくは、約３〜７週間、およびさらにより好ましくは、約４、５、もしくは６週間、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の抗体、タンパク質、またはポリペプチドで治療される。治療に使用される抗体、タンパク質、またはポリペプチドの効果的な投与量が、特定の治療の間に増加し得るか、または減少し得ることも理解される。投与量の変化は、本明細書に記載される診断アッセイの結果に起因し得、かつそれから明らかになる。

【0211】

〔００２３３〕
本発明は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの発現または活性を調節する作用物質を包含する。作用物質は、例えば、小分子であり得る。例えば、かかる小分子は、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、１モル当たり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機および／またはガノメタリック化合物を含む）、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、１モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにかかる化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を含むが、それらに限定されない。小分子作用物質の適切な用量が、通常の技術を有する医師、獣医、または研究者の知識の範囲内のいくつかの要因に依存することが理解される。小分子の用量（複数を含む）は、例えば、同一性、寸法、および治療される対象または処理される試料の状態に応じて、さらには、該当する場合、組成物が投与される経路、および施術者が所望とする小分子の本発明の核酸またはポリペプチドへの影響に応じて変化する。

【0212】

〔００２３４〕
例示的な用量は、対象体重または試料重量の１キログラム当たりの小分子のミリグラムもしくはマイクログラム量（例えば、１キログラム当たり約１マイクログラム〜１キログラム当たり約５００ミリグラム、１キログラム当たり約１００マイクログラム〜１キログラム当たり約５ミリグラム、または１キログラム当たり約１マイクログラム〜１キログラム当たり約５０マイクログラム）を含む。小分子の適切な用量が、調節される発現または活性に関して、小分子の効力に依存することがさらに理解される。かかる適切な用量を、本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、これらの小分子のうちの１つ以上が動物（例えば、ヒト）に投与されるとき、医師、獣医、または研究者は、例えば、最初は比較的低い用量を処方し、その後、適切な応答が得られるまで、用量を増加させてもよい。加えて、任意の特定の動物対象における特定の用量レベルが、採用される特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、総合的な健康、性別、および食生活、投与回数、投与経路、排泄の速度、任意の薬物組み合わせ、ならびに調節される発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。

【0213】

〔００２３５〕
さらに、抗体（もしくはそのフラグメント）を、細胞毒素等の治療部分、治療薬、または放射性金属イオンに抱合することができる。細胞毒素または細胞毒性作用物質は、細胞に有害な任意の作用物質を含む。例には、タクソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。治療薬は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアンミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラ、ならびにアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含むが、それらに限定されない。

【0214】

〔００２３６〕
本発明の抱合体を、所与の生物学的応答を修飾するために使用することができ、薬物部分は、古典的な化学治療薬に制限されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるポリペプチドは、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子等のタンパク質；または例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＥＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）等の生物学的応答修飾剤、または他の成長因子を含み得る。かかる治療部分を抗体に抱合させる技術が周知である。

【0215】

〔００２３７〕
本発明の核酸分子を、ベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することがで
きる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈内注入、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができるか、または、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で産生することができる場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。薬学的組成物を、投与に関する説明書とともに、容器、パック、または分配器内に含めることができる。

【0216】

Ｖ．本発明の使用および方法
〔００２３８〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ分子、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド相同体、ならびに本明細書に記載の抗体および抗体フラグメントを、以下の方法のうちの１つ以上において使用することができる：ａ）スクリーニングアッセイ、ｂ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験の監視）、ならびにｃ）治療方法（例えば、治療的および予防的、例えば、免疫応答の上方調節または下方調節による）。本明細書に記載されるように、本発明のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドは、以下の活性のうちの１つ以上を有する：１）その天然結合パートナーへの結合および／またはその活性の調節、２）細胞内または細胞間シグナル伝達の調節、３）Ｔリンパ球の活性化の調節、４）生物、例えば、マウスまたはヒト等の哺乳類生物の免疫応答の調節。本発明の単離核酸分子を使用して、例えば、以下にさらに説明されるように、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを発現し（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡ（例えば、生体試料における）またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子における遺伝子変化を検出し、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を調節することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの不十分もしくは過剰な産生またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ阻害剤の産生を特徴とする状態または障害を治療することができる。加えて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを使用して、自然発生ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナー（複数を含む）に関してスクリーニングすること、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を調節する薬物または化合物に関してスクリーニングすること、ならびにＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの不十分もしくは過剰な産生、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ野生型ポリペプチドと比較して、異常な活性または望ましくない活性を減少させるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド形態の産生を特徴とする状態または障害（例えば、重症複合型免疫不全等の免疫系障害、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、リンパ球増殖性症候群、炎症性腸疾患、アレルギー、喘息、移植片対宿主疾患、および移植拒絶反応；細菌およびウイルス等の感染性病原体への免疫応答；ならびにリンパ腫および白血病等の免疫系の癌）を治療することができる。さらに、本発明の抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体を使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを検出および単離すること、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的利用能を制御すること、および例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用を調節することによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を調節することができる。

【0217】

Ａ．スクリーニングアッセイ：
〔００２３９〕 本発明は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに結合するか、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性への刺激効果または阻害効果を有するか、あるいはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用への刺激効果または阻害効果を有する
調節因子、すなわち、候補もしくは試験化合物または作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、もしくは他の薬物）を特定するための方法（本明細書において、「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。

【0218】

〔００２４０〕
一実施形態において、本発明は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質またはポリペプチドもしくはその生物学的に活性な部分に結合する、例えば、その天然結合パートナー（複数を含む）と相互作用するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの能力を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質またはポリペプチドもしくはその生物学的に活性な部分に結合するか、あるいはその活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。好ましい実施形態において、本発明は、本明細書に特定されるか、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との間の相互作用へのその影響に基づくもの等のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡによって負に制御される免疫機能への刺激効果または阻害効果を有する候補もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。これらのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ関連機能は、例として、Ｔ細胞によるサイトカイン産生（例えば、ＩＩ−２、ガンマインターフェロン）を阻害すること、中程度のＣＤ２８共刺激を抑制すること、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を阻害すること、の増殖未処理のおよび記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞を抑制すること、およびアポトーシスを誘導することなくＴＣＲ活性化を抑制することを含む。本発明の試験化合物を、以下を含む、当分野で既知の組み合わせライブラリ法における多数のアプローチのうちのいずれかを用いて得ることができる：生物学的ライブラリ、空間的にアドレス可能な平行固相または溶液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、１ビーズ１化合物ライブラリ法、および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法。生物学的ライブラリアプローチがペプチドライブラリに限定されているが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。

【0219】

〔００２４１〕
一実施形態において、アッセイは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を発現する細胞が試験化合物と接触され、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を調節する試験化合物の能力が決定される、細胞に基づくアッセイである。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を調節する試験化合物の能力の決定を、例えば、その天然結合パートナー（複数を含む）に結合し、かつ免疫細胞活性を調節するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの能力を監視することによって達成することができる。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または骨髄性細胞であり得る。（決定される）その対抗受容体に結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを調節する試験化合物の能力の決定を、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡと放射性同位体または酵素標識を結合させて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ対抗受容体を発現するＴ細胞に結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを調節する試験化合物の能力を監視することによって達成することができる。複合体中の標識化ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ化合物を検出するによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡへの化合物の結合を決定することができるように、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに結合する試験化合物の能力の決定を、例えば、化合物と放射性同位体または酵素標識を結合させることによって達成することができる。

【0220】

〔００２４２〕
相互作用物のうちのいずれも標識することなく、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡと相互作用する化合物の能力を決定することも、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを使用して、化合物またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのいずれも標識する
ことなく、化合物のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとの相互作用を検出することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書において使用される「マイクロフィジオメーター」（例えば、細胞センサ）は、光アドレス可能な電位差センサ（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物とＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとの間の相互作用の指標として使用することができる。

【0221】

〔００２３４〕
別の実施形態では、アッセイは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーを発現するＴ細胞を試験化合物と接触させること、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーの活性を調節する（例えば、刺激するか、または阻害する）試験化合物の能力を決定することを含む、細胞に基づくアッセイである。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーの活性を調節する試験化合物の能力の決定を、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合するか、またはそれと相互作用するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの能力を決定することによって達成することができる。

【0222】

〔００２４４〕
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合するか、またはそれと相互作用するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、または生物学的に活性なそのフラグメントの能力の決定を、直接結合を決定するための上述の方法のうちの１つによって達成することができる。好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合するか、またはそれと相互作用するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの能力の決定を、結合パートナーの活性を決定することによって達成することができる。例えば、結合パートナーの活性を、第２の細胞メッセンジャー（例えば、チロシンキナーゼまたはホスファターゼ活性）の誘導を検出すること、適切な基質の触媒／酵素的活性を検出すること、受容体遺伝子（検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に結合される標的応答性調節要素を含む）の誘導を検出すること、または標的制御された細胞応答を検出することによって決定することができる。例えば、天然ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合するか、またはそれと相互作用するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの能力の決定は、増殖アッセイにおいて免疫細胞共刺激または阻害を調節する化合物の能力を測定すること、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの部分を認識する抗体に結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの能力を妨害することによって達成することができる。一実施形態において、Ｔ細胞活性化を調節する化合物を、化合物のＴ細胞増殖またはサイトカイン産生を調節する能力を決定することによって特定することができる。好ましい実施形態において、Ｔ細胞活性化を調節する化合物を、２つ以上の抗原濃度で化合物のＴ細胞増殖またはサイトカイン産生を調節する能力を決定することによって特定することができる。

【0223】

〔００２４５〕
さらに別の実施形態では、本発明のアッセイは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分が試験化合物と接触され、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力が決定される、細胞を含まないアッセイである。本発明のアッセイにおいて使用される好ましいＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの生物学的に活性な部分は、非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子との相互作用に関与するフラグメント、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合する細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む。試験化合物とＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドとの結合を、上述のように、直接的または間接的にのいずれかで決定することができる。

【0224】

〔００２４６〕
別の実施形態では、アッセイは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分が試験化合物と接触され、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力が決定される、細胞を含まないアッセイである。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力の決定を、例えば、上述の直接結合を決定するための方法のうちの１つを用いて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーに結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの能力を決定することによって達成することができる。本発明の細胞を含まないアッセイは、ポリペプチド（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分、あるいはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡが結合する結合パートナー）の可溶性および／または膜結合形態の両方の使用に適している。膜結合がポリペプチドを形成する、細胞を含まないアッセイが使用される場合（例えば、細胞表面ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ）、ポリペプチドの膜結合形態が溶液中で維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。かかる可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ．ＲＴＭ．Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ．ＲＴＭ．Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル．ｄｂｄ．Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート等の非イオン洗剤が挙げられる。

【0225】

〔００２４７〕
上述の本発明のアッセイ方法のうちの２つ以上の実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはその結合パートナーのうちのいずれかを固定化して、それらのポリペプチドのうちの１つ、またはそれら両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、かつアッセイの自動化を適応させることが望ましくあり得る。試験化合物のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドへの結合、または候補化合物の存在下および不在下でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのその結合パートナーとの相互作用を、反応物を含有するのに好適な任意の容器内で達成することができる。かかる容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。一実施形態において、それらのポリペプチドのうちの１つ、またはそれら両方がマトリックスに結合されることを可能にするドメインを添加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／結合パートナー融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いで、それは、試験化合物あるいは試験化合物および非吸着結合パートナーポリペプチドまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドのいずれかと合わせられ、混合物は、複合体形成につながる条件下で（例えば、塩およびｐＨにおいて生理学的条件で）インキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して任意の非結合成分を除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定化し、複合体形成は、例えば、上述のように、直接的または間接的にのいずれかで決定される。あるいは、複合体をマトリックスから解離することができ、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合または活性のレベルが標準の技術を用いて決定される。マトリックス上でポリペプチドを固定化するための他の技術を、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用することもできる。代替実施形態では、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドの活性を調節する試験化合物の能力の決定を、例えば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ結合パートナーの細胞質ドメインと相互作用することにより、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの下流で機能する分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定することによって達成することができる。例えば
、第２のメッセンジャーのレベル、適切な標的上での相互作用分子の活性、または相互作用物質の適切な標的への結合を、先述のように決定することができる。

【0226】

〔００２４８〕
別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現の調節因子が、細胞が候補化合物と接触される方法において同定され、細胞内でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が決定される。候補化合物の存在下でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、候補化合物の不在下でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較される。次いで、変化が統計的に有意である場合、候補化合物を、この比較に基づいて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現の調節因子として特定することができる。

【0227】

〔００２４９〕
本発明のさらに別の態様では、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号、Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２、Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４、Ｂａｔｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４、Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６、およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において、「ベイトタンパク質」として使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ（「ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合タンパク質」、「ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナー」、または「ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−ｂｐ」）に結合するか、またはそれと相互作用する他のポリペプチドを同定することができ、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性に関与する。かかるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合タンパク質は、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達経路の下流要素として、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ標的によるシグナルの伝播にも関与する可能性が高い。あるいは、かかるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合ポリペプチドは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ阻害物質であり得る。２ハイブリッド法は、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成る大部分の転写因子のモジュール性質に基づいている。簡潔に述べると、アッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物において、未同定ポリペプチド（「プレイ」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリからのＤＮＡ配列は、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」ポリペプチドがインビボで相互作用して、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ依存性複合体を形成することができると、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインが近接にされる。この接近は、転写因子に応答して転写制御部位に作動可能に結合される受容体遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。受容体遺伝子の発現を検出することができ、機能的な転写因子を含有する細胞コロニーを単離かつ使用して、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。

【0228】

〔００２５０〕
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のアッセイのうちの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤を、細胞に基づくアッセイまたは細胞を含まないアッセイを用いて同定することができ、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの活性を調節する作用物質の能力を、例えば、細胞形質転換および／または腫瘍形成の動物モデル等の動物において、インビボで確認することができる。

【0229】

〔００２５１〕
本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイによって特定される新規の作用物質に関する。したがって、適切な動物モデルにおいて、本明細書に記載されるように特定される作用物質をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように同定される作用物質（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ調節剤、アンチセンスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ特異的抗体、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナー）を、動物モデルにおいて使用して、かかる作用物質での治療の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載されるように特定される作用物質を、動物モデルにおいて使用して、かかる作用物質の作用機構を決定することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の治療のための上述のスクリーニングアッセイによって同定される新規の作用物質の使用に関する。

【0230】

Ｂ．検出アッセイ
〔００２５２〕 本明細書で特定されるｃＤＮＡ配列の部分またはフラグメント（および対応する完全遺伝子配列）を、多数の方法において、ポリヌクレオチド試薬として使用することができる。例えば、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上でそれらのそれぞれの遺伝子をマッピングし、したがって、遺伝的疾患と関連する遺伝子領域を位置付けること、（ｉｉ）微量生体試料から個人を特定すること（組織型判定）、および（ｉｉｉ）生体試料の法医学的同定を支援することができる。これらの適用は、以下の項で説明される。

【0231】

１．染色体マッピング
〔００２５３〕 遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を使用して、染色体上で遺伝子の位置をマッピングことができる。このプロセスは、染色体マッピングと呼ばれている。したがって、本明細書に記載のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴヌクレオチド配列の部分またはフラグメントを使用して、染色体上でＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子の位置をマッピングすることができる。染色体へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連した遺伝子と相関させる重要な第１のステップである。簡潔に述べると、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、長さ１５−２５ｂｐ）を調製することによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子を染色体にマッピングすることができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ配列のコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の２つ以上のエクソンにまたがらないプライマーを予測することができ、したがって、増幅プロセスを複雑化する。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを産出する。体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合させることによって調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが成長かつ分裂すると、それらは、ランダムな順序でヒト染色体を次第に失うが、マウス染色体を保持する。特定の酵素を欠乏するという理由から、マウス細胞が成長することができないが、ヒト細胞は成長することができる培地を用いることによって、必要とされる酵素をコードする遺伝子を含有する１つのヒト染色体が保持される。種々の培地を用いることによって、ハイブリッド細胞株のパネルを確立することができる。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および一式のマウス染色体を含有し、個別の遺伝子の特定のヒト染色体への容易なマッピングを可能にする（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：９１９−９２４）。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドを、転座および欠失を有するヒト染色体を用いて産生することもできる。

【0232】

〔００２５４〕
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てる迅速な方法である。単一の温度循環器を用いて、１日につき３つ以上の配列を割り当てることができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計することにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて亜局在化を達成することができる。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列をその染色体にマッピングするために同様に使用することができる他のマッピング戦略には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６２２３−２７に記載される）、標識化された流動分類染色体での事前スクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリへのハイブリダイゼーションによる事前選択が含まれる。

【0233】

〔００２５５〕
さらに中期染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、１つのステップにおいて、正確な染色体位置を提供することができる。分裂が紡錘体を破壊するコルセミド等の化学物質によって中期でブロックされた細胞を用いて、染色体スプレッドを作製することができる。染色体をトリプシンで簡潔に処理し、その後、ギムザで染色することができる。染色体が個別に同定されるように、明帯および暗帯のパターンがそれぞれの染色体上で発現する。ＦＩＳＨ技術を、長さが５００個または６００個の塩基という短いＤＮＡ配列に使用することができる。しかしながら、１，０００個より多い塩基を有するクローンは、簡単な検出のために、十分なシグナル強度で、特有の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００個の塩基、およびより好ましくは、２，０００個の塩基が、適切な時間内に良好な結果を得るのに十分である。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８８）を参照されたい。染色体マッピングのための試薬を個別に使用して、その染色体上に単一の染色体もしくは単一の部位をマーキングすることができるか、または複数の部位および／もしくは複数の染色体をマーキングために、試薬のパネルを使用することができる。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際、マッピング目的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存される可能性がより高く、したがって、染色体マッピング中の交差ハイブリダイゼーションの可能性を増加させる。

【0234】

〔００２５６〕
いったん配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的位置を、遺伝子マップデータと相関させることができる。最終的には、数人の個人由来の遺伝子の完全配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型から変異を区別することができる。

【0235】

２．組織型判定
〔００２５７〕 本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列を使用して、微量の生体試料から個人を特定することもできる。さらに、本発明の配列を使用して、個人のゲノムの選択された部分の実際の塩基毎のＤＮＡ配列を決定する代替の技術を提供することができる。したがって、本明細書に記載のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴヌクレオチド配列を使用して、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製することができる。次いで、これらのプライマーを使用して、個人のＤＮＡを増幅し、その後、それを配列決定することができる。

【0236】

〔００２５８〕
この様式で調製される個人からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、それぞれの個人が、
対立遺伝子の相違の理由から、特有の一式のかかるＤＮＡ配列を有するため、特有の個人特定情報を提供することができる。本発明の配列を使用して、かかる特定情報配列を個人および組織から得ることができる。本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴヌクレオチド配列は、ヒトゲノム部分を特異的に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度発生し、非コード領域において大いに発生する。個々のヒト間の対立遺伝子変異が、５００個の塩基毎に約１回の頻度で発生すると推定される。本明細書に記載の配列のそれぞれを、ある程度、個人由来のＤＮＡを特定目的のために比較することができる基準として使用することができる。より多数の多型が非コード領域で発生するため、個人を区別するのにより少ない配列しか必要とされない。配列番号１もしくは４の非コード配列は、それぞれが１００個の塩基の非コード増幅配列を産出する恐らく１０〜１，０００個のプライマーのパネルにより個人確認を無理なく提供することができる。配列番号３もしくは６のコード配列等の予測されたコード配列が使用される場合、個人確認のためのより適切な数のプライマーは、５００〜２０００個であろう。

【0237】

〔００２５９〕
本明細書に記載のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴヌクレオチド配列由来の試薬のパネルが、個人についての特有の特定情報データベースを生成ために使用される場合、それらの同一の試薬を後に使用して、その個人由来の組織を特定することができる。特有の特定情報データベースを用いて、生きている個人または死んでいる個人の確認を、極小の組織試料から行うことができる。

【0238】

〔００２６０〕 ３．法生物学におけるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ配列の使用
ＤＮＡに基づく特定技術を法生物学において使用することもできる。本発明の配列を使用して、例えば、別の「識別マーカー」（すなわち、特定の個人に特有の別のＤＮＡ配列）によって、ＤＮＡに基づく法医学的同定の信頼性を強化することができる、ヒトゲノムにおいて特定の遺伝子座に標的化されるポリヌクレオチド試薬、例えば、ＰＣＲプライマーを提供することができる。上述のように、実際の塩基配列情報を、識別のために、制限酵素により生成されるフラグメントによって形成されるパターンの正確な代替案として使用することができる。多数の多型が非コード領域において発生するため、配列番号１もしくは３の非コード領域に標的化される配列は、この使用に特に適切であり、この技術を用いて個人を区別するのをより容易にする。ポリヌクレオチド試薬の例には、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴヌクレオチド配列またはその部分、例えば、少なくとも２０個の塩基、好ましくは、少なくとも３０個の塩基の長さを有する、配列番号１もしくは３の非コード領域由来のフラグメントが挙げられる。特定の組織、例えば、リンパ球を特定するために、さらに本明細書に記載のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴヌクレオチド配列を使用して、ポリヌクレオチド試薬、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術において使用することができる、例えば、標識化されたプローブまたは標識可能なプローブを提供することができる。これは、法医学者が出所不明の組織を提示される場合に、非常に有用であり得る。かかるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡプローブのパネルを使用して、種毎に、および／または臓器の種類毎に組織を特定することができる。類似の様式で、これらの試薬、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡプライマーまたはプローブを使用して、汚染について組織培養物をスクリーニングする（すなわち、培養物中の異なる種類の細胞の混合物の存在についてスクリーニングする）ことができる。

【0239】

Ｃ．予測医学
〔００２６１〕 本発明はまた、予後（予測）目的のために、診断アッセイ、予後アッセイ、および監視臨床試験が使用され、それによって、個人を予防的に治療する予測医学の分野に関する。したがって、本発明の一態様は、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、または組織）との関連で、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドおよび／または核酸発現、ならびにＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を決定し、それによって、個人が、
異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に関連した疾患または障害にかかっているか、または障害を発現する危険性があるかを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個人が、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、核酸発現または活性に関連した障害を発現する危険性があるかを決定するための予後（または予測）アッセイを提供する。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子における変異を、生体試料においてアッセイすることができる。かかるアッセイを、予後または予測目的ために使用し、それによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、核酸発現または活性を特徴とするか、あるいはそれに関連した障害の発現の前に、個人を予防的に治療することができる。

【0240】

〔００２６２〕
本発明の別の態様は、臨床試験における、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現または活性への作用物質（例えば、薬物、化合物）の影響の監視に関する。これらおよび他の作用物質は、以下の項でより詳細に説明される。

【0241】

１．診断アッセイ
〔００２６３〕 生体試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸の存在または不在を検出するための例示的な方法は、試験対象から生体試料を入手すること、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸の存在が、生体試料において検出されるように、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードするＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出することができる生体試料を化合物または作用物質と接触させることを含む。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出に好ましい作用物質は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることができる標識化核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、もしくは５００ヌクレオチド長であり、かつおよび十分なストリンジェントな条件下で、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド等の、配列番号１もしくは３に説明されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸またはその部分であり得る。本発明の診断アッセイでの使用に好適な他のプローブが、本明細書に記載される。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの検出に好ましい作用物質は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに結合することができる抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。無傷抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して、「標識化」という用語は、検出可能な物質を、プローブまたは抗体に結合（すなわち、物理的に結合）させることによるプローブまたは抗体の直接標識化、ならびに直接的に標識化される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識化を包含するよう意図されている。間接標識化の例には、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、およびＤＮＡプローブを蛍光標識されたストレプトアビジンで検出することができるように、ビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識化が挙げられる。「生体試料」という用語は、対象から単離される組織、細胞、および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および体液を含むよう意図される。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生体試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡ、ポリペプチド、またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ２ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの検出のためのインビトロ技術は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降、および免疫蛍光を含む。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。さらに、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの検出のための
インビボ技術は、対象に、標識化された抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象におけるその存在および位置を標準の画像法によって検出することができる放射性マーカーで標識化することができる。一実施形態において、生体試料は、試験対象由来のポリペプチド分子を含有する。あるいは、生体試料は、試験対象由来のｍＲＮＡ分子または試験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有することができる。好ましい生体試料は、従来の手段で対象から単離される血清試料である。別の実施形態では、本方法は、対照対象から対照生体試料を得ること、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が生体試料において検出されるように、対照試料をＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または作用物質と接触させること、および対照試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することをさらに含む。

【0242】

〔００２６４〕
本発明は、生体試料におけるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、キットは、生体試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはｍＲＮＡを検出することができる標識化化合物または作用物質、試料中のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの量を決定するための手段、および試料中のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの量を基準と比較するための手段を含むことができる。化合物または作用物質を好適な容器内に包装することができる。キットは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸を検出するキットの使用に関する説明書をさらに含むことができる。

【0243】

２．予後アッセイ
〔００２６５〕 さらに本明細書に記載の診断方法を利用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に関連した異常なまたは望ましくない疾患もしくは障害を有するか、あるいはそれを発現する危険性がある対象を特定することができる。本明細書において使用される「異常な」という用語は、野生型ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性から逸脱するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性を含む。異常な発現または活性は、増加もしくは減少した発現または活性、ならびに発現の野生型発生パターンまたは発現の細胞内パターンに従わない発現または活性を含む。例えば、異常なＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子における変異がＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子に過少発現または過剰発現させる場合、およびかかる変異が非機能的ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは野生型様式では機能しないポリペプチド、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーと相互作用しないポリペプチド、または非ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーと相互作用するポリペプチドをもたらす状況を含むよう意図されている。本明細書において使用される「望ましくない」という用語は、免疫細胞活性化等の生物学的応答に関与する望ましくない現象を含む。例えば、望ましくないという用語は、対象において所望されないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性を含む。

【0244】

〔００２６６〕
前述の診断アッセイまたは以下のアッセイ等の本明細書に記載のアッセイを利用して、自己免疫、アレルギー性、もしくは炎症性障害等の自己免疫障害、免疫不全障害、免疫系障害または癌等の、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド活性または核酸発現における誤制御に関連した障害を有するか、あるいはそれを発現する危険性がある対象を特定することができる。したがって、本発明は、試験試料が対象から得られ、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）が検出される、異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に
関連した疾患もしくは障害を同定するための方法を提供し、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸の存在が、異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、あるいはそれを発現する危険性がある対象の診断に用いられる。本明細書において使用される「試験試料」とは、関心の対象から得られる生体試料を指す。例えば、試験試料は、体液（例えば、脳脊髄液もしくは血清）、細胞試料、または組織であり得る。

【0245】

〔００２６７〕
さらに、本明細書に記載の予後アッセイを使用して、対象に、作用物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、もしくは他の薬物候補）を投与して、異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に関連した疾患もしくは障害を治療することができるかを決定することができる。例えば、かかる方法を使用して、対象を、自己免疫障害、免疫不全障害、免疫系の癌、またはアレルギー性もしくは炎症性障害に対する作用物質で効果的に治療することができるかを決定することができる。したがって、本発明は、対象を、試験試料が得られ、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸発現もしくは活性が検出される、異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に関連した障害に対する作用物質で効果的に治療することができるかを決定するための方法を提供する（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸発現もしくは活性の不在が、異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に関連した障害を治療する作用物質を投与され得る対象の診断に用いられる）。本発明の方法を使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子における遺伝子変化を検出し、それによって、変化した遺伝子を有する対象が、自己免疫障害、免疫不全障害、免疫系の癌、アレルギー性障害、または炎症性障害等のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド活性または核酸発現における誤制御を特徴とする障害の危険性があるかを決定することもできる。本明細書に記載の方法は、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子を伴う疾患もしくは疾病の症状または家族歴を呈する患者を診断する臨床環境において好都合に使用することができる、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予め包装された診断キットを利用することによって行うことができる。さらに、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡが発現される任意の細胞型または組織を、本明細書に記載の予後アッセイにおいて利用することができる。

【0246】

〔００２６８〕 ３．臨床試験中の効果の監視。
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの発現または活性への作用物質（例えば、薬物）の効果の監視（例えば、細胞増殖および／もしくは遊走の調節）を基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験においても適用することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子発現、ポリペプチドレベルを増加させるか、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を上方制御するための、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイによって決定された作用物質の有効性を、減少したＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子発現、ポリペプチドレベル、または下方制御されたＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を呈する対象の臨床試験において監視することができる。あるいは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子発現、ポリペプチドレベルを減少させるか、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を下方制御する、スクリーニングアッセイによって決定された作用物質の有効性を、増加したＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子発現、ポリペプチドレベル、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を呈する対象の臨床試験において監視することができる。上述のように、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡは、ＡＰＣ（マクロファージおよび骨髄樹状細胞）、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞を含む多くの造血細胞型上で発現され、より具体的には、ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３^’エフェクターＴ細胞およびＦｏｘｐ３^＋ｎＴｒｅｇの両方を含む）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびＧｒｌ^＋顆粒球上で発現され、およびＢ細胞およびＮＫ細胞上で低レベルで発現される。かかる臨床試験において
、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子、および好ましくは、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ関連障害に関与している他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現型の「読み出し」またはマーカーとして使用することができる。

【0247】

〔００２６９〕
例であって、制限するものではないが、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて特定される）を調節する作用物質（例えば、化合物、薬物、または小分子）での処置によって細胞内で調節されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを含む遺伝子を特定することができる。したがって、例えば、臨床試験において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ関連障害への作用物質の効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製して、それぞれ、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡおよびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ関連障害に関与した他の遺伝子の発現レベルについて分析することができる。遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子発現パターン）を、本明細書に記載されるように、ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、またはあるいは本明細書に記載される方法のうちの１つによって産生されるポリペプチドの量を測定することによって、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量化することができる。このようにして、遺伝子発現パターンは、作用物質への細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての機能を果たすことができる。したがって、この応答状態を、作用物質での個人の治療前および治療中の様々な時点で決定することができる。好ましい実施形態において、本発明は、作用物質（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって特定されるアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬物候補）での対象の治療の有効性を監視するための方法を提供し、本方法は、（ｉ）作用物質の投与前に対象から投与前試料を得るステップ、（ｉｉ）投与前試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出するステップ、（ｉｉｉ）対象から１つ以上の投与後試料を得るステップ、（ｉｖ）投与後試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現もしくは活性のレベルを検出するステップ、（ｖ）投与前試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現もしくは活性のレベルと、１つの投与後試料もしくは複数の投与後試料におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現もしくは活性のレベルと比較するステップ、および（ｖｉ）それに応じて対象への作用物質の投与を変更するステップを含む。例えば、作用物質の投与を増加させることは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現または活性を検出されたレベルよりも高いレベルに増加させる、すなわち、作用物質の有効性を増加させるのに望ましくあり得る。あるいは、作用物質の投与を減少させることは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現または活性を検出されたレベルよりも低いレベルに減少させる、すなわち、作用物質の有効性を減少させるのに望ましくあり得る。かかる実施形態に従って、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性を、観察可能な表現型応答の不在下でさえも、作用物質の有効性の指標として使用することができる。

【0248】

Ｄ．治療法
〔００２７０〕 本発明は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質の不十分もしくは過剰な産生、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ野生型タンパク質と比較して減少したか、あるいは異常な活性を有するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質形態の産生を特徴とする障害の危険性がある（またはかかりやすい）対象を治療する予防法および治療法の両方を提供する。さらに、本発明の抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体を使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質を検出および単離し、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質の生物学的利用能を制御し、かつ例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその対抗受容体との相互作用を調節することによって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を調節することができる。

【0249】

１．予防法
〔００２７１〕 一態様では、本発明は、対象において、主題のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または少なくとも１つのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を調節する作用物質を投与することによって、異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性に関連した疾患または状態を予防するための方法を提供する。異常なまたは望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性によって引き起こされるか、または助長される疾患または障害の危険性のある対象を、例えば、本明細書に記載の診断アッセイもしくは予後アッセイのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせによって特定することができる。予防薬の投与は、疾患または障害が予防されるか、またはあるいは、その進行を遅延させるように、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ異常の特徴を示す症状が顕在化する前に起こり得る。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ異常の種類、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニスト、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体）に応じて、作用物質を対象の治療に使用することができる。適切な作用物質を、本明細書に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。

【0250】

２．治療法
〔００２７２〕 本発明の重要な態様は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現もしくは活性またはその天然結合パートナーとの相互作用を調節する方法に関する。治療に関連して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡは、ＣＤ２８共刺激を阻害し、免疫細胞のＴＣＲ活性化を阻害し、活性化免疫細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖を阻害し、Ｔ細胞（ＩＬ−２、ガンマインターフェロン）によるサイトカイン産生を阻害し、かつ阻害シグナルを免疫細胞に伝送することを実証した。したがって、免疫応答を調節するために、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの活性および／または発現、ならびにＴ細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその結合パートナーとの間の相互作用を調節することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡが（Ｔ細胞上の）阻害性受容体に結合するため、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の上方制御は、免疫応答の下方制御をもたらすはずであり、一方で、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の下方制御は、免疫応答の上方制御をもたらすはずである。好ましい実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡは、阻害性受容体に結合する。上述のように、直観に反した方法で、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の抑制活性をインビトロで（ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下で）強化する、本出願者によって産生されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ特異的抗体（すなわち、これらの抗体は、サイトカイン産生、Ｔ細胞増殖、分化、または活性化、および前述の他の機能へのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの効果等のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ関連活性の抑制を強化する）は、インビボにおいて予想されるであろう挙動とは反対に挙動する、すなわち、これらの抗体は、インビボで免疫抑制であると見出された。

【0251】

〔００２７３〕
本発明の調節法は、細胞をＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド、または細胞と関連したＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド活性のうちの１つ以上を調節する作用物質、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現もしくは活性を調節し、かつ／またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナーとの相互作用を調節する作用物質と接触させることを含む。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド活性を調節する作用物質は、核酸またはポリペプチド、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの自然発生結合パートナー、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニストまたはアンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニストまたはアンタゴニストのペプチド模倣物、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡペプチド模倣物、または他の小分子等の本明細書に記載の作用物質であり得る。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳ
ＴＡの可溶型を使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナー（複数を含む）もしくはリガンドのうちのいずれかへの結合を妨害することもできる。

【0252】

〔００２７４〕
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現を調節する作用物質は、例えば、アンチセンス核酸分子、三重オリゴヌクレオチド、リボザイム、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの発現用の組換えベクターである。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド翻訳開始部位の周辺領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞培地に、典型的には２００μｇ／ｍＬ添加することができるか、または患者に投与して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの合成を阻止することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞に取り込まれ、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズして、翻訳を阻止する。あるいは、二本鎖ＤＮＡに結合して、三重構築物を形成して、ＤＮＡ巻戻しおよび転写を阻止するオリゴヌクレオチドを使用することができる。いずれかの結果として、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの合成が、ブロックされる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現が調節されるとき、好ましくは、かかる調節は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴ遺伝子ノックアウト以外の手段で発生する。

【0253】

〔００２７５〕
細胞中のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの量を制御するという理由に基づいて発現を調節する作用物質は、細胞中のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の総量も調節する。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを調節する作用物質は、１つ以上のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を刺激する。かかる刺激作用物質の例には、活性ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドおよび細胞に導入されたＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態では、本作用物質は、１つ以上のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を阻害する。かかる阻害作用物質の例には、アンチセンスＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ核酸分子、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ阻害剤、および主題のスクリーニングアッセイにおいて特定される化合物が挙げられる。さらに好ましい実施形態では、阻害作用物質は、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体および抗ＰＤ−Ｌ１もしくは抗ＰＤ−Ｌ２抗体の組み合わせである。これらの調節法を、（例えば、細胞を作用物質と接触させることによって）インビトロで、またはあるいは、作用物質を細胞と接触させることによって（例えば、対象に作用物質を投与することによって）インビボで行うことができる。したがって、本発明は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの上方調節または下方調節から恩恵を受けるであろう状態または障害、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸分子の望ましくない、不十分な、もしくは異常な発現または活性を特徴とする障害に苦しむ個人を治療する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、作用物質（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって特定される作用物質）、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性を調節する（例えば、を上方制御もしくは下方制御する）作用物質の組み合わせを投与することを含む。別の実施形態では、本方法は、減少した、異常な、または望ましくないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現または活性を補う治療として、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたは核酸分子を投与することを含む。

【0254】

〔００２７６〕
主題のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ結合剤で治療可能な疾患は、先に特定されており、種々の炎症性、自己免疫、癌、アレルギー性、および感染性障害を含む。特に好ましい適応症は、多発性硬化症である。

【0255】

〔００２７７〕
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の刺激は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡが異常に下方制御される状況、および／または増加したＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性が有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。同様に、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の阻害は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡが異常に上方制御される状況、および／または減少したＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ（すなわち、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアンタゴニスト）の下方調節に用いる例示的な作用物質には、例えば、アンチセンス核酸分子、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを認識かつブロックする抗体、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを認識かつブロックする抗体の組み合わせ、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ対抗受容体を認識かつブロックする抗体、ならびに免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその自然発生結合パートナー（複数を含む）との相互作用をブロックする化合物（例えば、可溶性の一価ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子、抗原提示細胞上の受容体に結合しないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の可溶型、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーの可溶型、および主題のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物）が含まれる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ（すなわち、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニスト）の上方調節に用いる例示的な作用物質には、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドをコードする核酸分子、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの多価形態、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現を増加させる化合物、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその自然発生結合パートナーとの相互作用を強化する化合物、およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを発現する細胞が含まれる。

【0256】

〔００２７８〕 ３．免疫応答の下方制御
〔００２７９〕 ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの阻害性機能を上方制御し、それによって、免疫応答を下方制御するための本発明の実施形態が多数存在する。下方制御は、すでに進行中の免疫応答を阻害もしくはブロックする形態であり得るか、または免疫応答の誘導を阻止することを含み得る。活性化免疫細胞の機能を、免疫細胞応答を下方制御することによって、もしくは免疫細胞内で特定のアネルギーを誘導することによって、またはそれら両方によって阻害することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡが阻害性受容体に結合する実施形態において、阻害性受容体に結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの形態、例えば、細胞表面上の多価ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを使用して、免疫応答を下方調節することができる。本発明の一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を刺激するために使用される活性化抗体は、二重特異性抗体である。例えば、かかる抗体は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合部位、および免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または骨髄性細胞上の細胞表面受容体を標的化する別の結合部位を含み得る。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合部位を含むことに加えて、かかる抗体は、分子を特定の細胞集団に標的化するために、Ｂ細胞抗原受容体、Ｔ細胞抗原受容体、またはＦｃ受容体に結合する結合部位をさらに含み得る。二重特異性抗体のためのこの第２の抗原の選択は、阻害ののために標的化される細胞集団の選択における柔軟性を提供する。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を促進するか、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナーとの相互作用を強化する作用物質（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性化抗体またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性化小分子）を、免疫細胞増殖および／またはエフェクター機能を阻害するそれらの能力、またはインビトロアッセイに添加されるときにアネルギーを誘導するそれらの能力によって特定することができる。例えば、細胞を、活性化受容体を介してシグナル変換を刺激する作用物質の存在下で培養することができる。いくつかの当技術分野で認識される細胞活性化の読み出しを採用して、例えば、活性化作用物質の存在下で、細胞増殖またはエフェクター機能（例えば、抗体産生、サイトカイン産生、食作用）を測定することができる。この活性化をブロックする試験作用物質の能力を、測定される増殖またはエフェクター機能の減少に影響を及ぼす作用物質の能力を測定することによって容易に決定することができる。一実施形態において、低抗原濃度で、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ免疫
細胞相互作用は、強力なＢ７−ＣＤ２８シグナルを阻害する。別の実施形態では、高抗原濃度で、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ免疫細胞相互作用は、サイトカイン産生を減少させるが、Ｔ細胞増殖を阻害しない場合もある。したがって、活性化をブロックする試験化合物の能力を、抗原の異なる濃度でサイトカイン産生および／または増殖を測定することによって決定することができる。

【0257】

〔００２８０〕
本発明の一実施形態において、特定の抗原に対する耐性は、抗原と、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニストとを共投与することによって誘導される。例えば、耐性を、特定のポリペプチドに誘導することができる。一実施形態において、免疫応答が望ましくないアレルゲンまたは外来ポリペプチドへの免疫応答を阻害することができる。例えば、第ＶＩＩＩ因子を受ける患者は、この凝固因子に対する抗体を高い頻度で生成する。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性、またはその天然結合パートナーとの相互作用を刺激する作用物質と、組換え第ＶＩＩＩ因子との共投与（または例えば、交差結合による、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの第ＶＩＩＩ因子への物理的結合）は、免疫応答の下方調節をもたらし得る。

【0258】

〔００２８１〕
一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニスト、および免疫細胞上の共刺激受容体の活性をブロックすることができる別の作用物質を使用して、免疫応答を下方調節することができる。例示的な分子は、他のＰＤリガンドのアゴニスト形態、ＣＴＬＡ−４の可溶型、抗Ｂ７−１抗体、抗Ｂ７−２抗体、またはそれらの組み合わせを含む。あるいは、２つの別個のペプチド（例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−１ポリペプチドのブロッキング形態を有するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド）、または抗体の組み合わせ（例えば、抗Ｂ７−２および／または抗Ｂ７−１モノクローナル抗体をブロックするＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに対する活性化抗体）を、単一の組成物として合わせることができるか、または別々に（同時に、もしくは連続的に）投与して、対象における免疫細胞媒介性免疫応答を下方制御することができる。さらに、Ｂ７−１および／またはＢ７−１活性を有する１つ以上のポリペプチドに加えて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチド活性を有する治療的に活性な量の１つ以上のペプチドを、他の下方調節試薬と併せて使用して、免疫応答に影響を与えることができる。他の免疫調節試薬の例には、共刺激シグナルをブロックする抗体（例えば、ＣＤ２８もしくはＩＣＯＳに対して）、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを活性化する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、もしくはサイトカインに対する）抗体、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−ＦｃもしくはＰＤ−１−Ｆｃ）、ならびに免疫抑制薬（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡ、もしくはＦＫ５０６）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドはまた、細胞の破壊によって免疫細胞機能をブロックする治療薬の作成において有用であり得る。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの部分を、毒素に結合させて、それが結合する細胞の破壊を誘発することができる細胞毒性薬を作製することができる。

【0259】

〔００２８２〕
細胞毒性薬を作製するために、本発明のポリペプチドを、当分野で既知の技術を用いて、毒素に結合させるか、または作動可能に付着させることができる。本発明のポリペプチドまたは抗体に抱合することができる多種多様の毒素が既知である。例には多数の有用な植物、真菌、もしくはさらには細菌由来の毒素が挙げられ、例としては、種々のＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖；サポリンもしくはゲロニン等のリボソーム不活性化タンパク質；アルファサルシン；アスペルギリン；レストリクトシン；および胎盤リボヌクレアーゼ等のリボヌクレアーゼ、血管新生、ジフテリア毒素、またはシュードモナス外毒素を含む。本発明との関連での使用に好ましい毒素部分は、炭水化物残基、脱グリコシル化Ａ鎖を修飾ま
たは除去するように処理された毒素Ａ鎖である（米国特許第５，７７６，４２７号）。

【0260】

〔００２８３〕
患者へのかかる細胞毒性薬（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡリシン（単独で、もしくはＰＤ−Ｌ１−リシンとの併用で））のうちの１つまたはそれらの組み合わせの注入は、特に、活性化免疫細胞がより大量のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナーを発現するという事実を踏まえて、免疫細胞の死亡をもたらし得る。例えば、ＰＤ−１が活性化リンパ球の表面上に誘導されるため、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドを使用して、Ｆｃ−Ｒ依存性機序によって、または細胞毒性薬（例えば、リシン、サポリン、もしくはカリケアマイシン）をＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドに抱合させることによる消失によって、これらの特定の細胞の除去を標的とすることができる。別の一実施形態において、毒素は、死亡ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ発現抗原提示細胞を標的とするために、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体に抱合することができる。さらなる実施形態では、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体毒素は、二重特異性抗体であり得る。かかる二重特異性抗体は、例えば、ある特定の種類の細胞、例えば、Ｂリンパ球、単球、樹枝状細胞、またはランゲルハンス細胞でのみ見出されるマーカーを用いた特定の細胞集団の標的化に有用である。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ免疫細胞相互作用を活性化する（したがって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの負のシグナル伝達機能を刺激する）ことによる免疫応答の下方制御は、例えば、組織、皮膚、および臓器移植術の状況における、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）もしくはアレルギーにおける、または全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症等の自己免疫疾患における免疫応答の下方調節に有用である。例えば、免疫細胞機能の妨害は、組織移植術における組織破壊の減少をもたらす。典型的には、組織移植片において、移植片の拒絶は、免疫細胞がそれを異物と認識することで開始され、その後、移植片を破壊する免疫反応が起こる。移植術の前、または移植術時の、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの活性または免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を促進する分子（ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドの可溶性多量体形態等）の単独投与または別の下方調節剤との併用投与は、共刺激シグナルの生成を阻害することができる。さらに、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の促進は、免疫細胞をアネルギー化するのにも十分であり得、それによって、対象における耐性を誘導する。

【0261】

〔００２８４〕
対象における十分な免疫抑制または耐性を達成するために、他の分子の共刺激機能をブロックすることも望ましくあり得る。例えば、移植術の前、または移植術時に、これらの抗原またはこれらの抗原に対するブロッキング抗体のそれぞれの活性を有するペプチドの組み合わせの可溶型を投与することにより（単一の組成物内で別々に、またはともに）、Ｂ７−１およびＢ７−２の機能をブロックすることが望ましくあり得る。あるいは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの阻害活性を促進し、かつＢ７−１および／またはＢ７−２の共刺激活性を阻害することが望ましくあり得る。本発明の下方調節法に関連して使用することができる他の下方調節剤は、例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４の可溶型を介して阻害シグナルを伝送する作用物質、ＣＴＬＡ４を介して阻害シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーに対するブロッキング抗体、もしくは他の受容体リガンド対の可溶型（例えば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの間の相互作用を破壊する作用物質（例えば、抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対する抗体、または免疫抑制薬を含む。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用の活性化は、自己免疫疾患の治療に有用である。多くの自己免疫障害は、自己組織に反応し、かつ疾患の病理学に関わるサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化を阻止することによって、疾患の症状を減少させるか、または排除することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの
その天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を促進する作用物質の投与は、疾患の長期緩和につながるであろう自己反応性免疫細胞の抗原特異的耐性を誘導し得る。さらに、Ｂ７分子の受容体−リガンド相互作用を破壊することにより免疫細胞の共刺激をブロックする作用物質と、共刺激受容体との共投与は、免疫細胞活性化を阻害して、疾患プロセスに関与し得る自己抗体またはサイトカインの産生を阻止するのに有用であり得る。自己免疫障害を予防または緩和する試薬の有効性を、いくつかの十分に特徴化されたヒト自己免疫疾患の動物モデルを用いて決定することができる。例には、マウス実験的自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫性コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、およびマウス実験的重症筋無力症が挙げられる（Ｐａｕｌ ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ．８４０−８５６を参照のこと）。

【0262】

〔００２８５〕
例えば、ＩｇＥ産生を阻害することによる免疫細胞活性化の阻害は、アレルギーおよびアレルギー反応の治療において、治療的に有用である。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を促進する作用物質を、アレルギー性対象に投与して、対象における免疫細胞媒介性アレルギー性応答を阻害することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用の刺激は、適切なＭＨＣ分子と併せてアレルゲンへの曝露を伴い得る。アレルギー反応は、アレルゲンの進入経路およびマスト細胞または好塩基球上でのＩｇＥの沈着のパターンに応じて、本来、全身性または局所であり得る。したがって、免疫細胞媒介性アレルギー性応答を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ免疫細胞相互作用を促進する作用物質の投与によって、局所的または全身的に阻害することができる。

【0263】

〔００２８６〕
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用の刺激を介する免疫細胞活性化の阻害も、免疫細胞の病原性感染（例えば、ウイルスまたは細菌）において治療的に重要であり得る。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、ウイルス複製は、免疫細胞活性化によって刺激される。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の刺激は、ウイルス複製の阻害をもたらし得、それによって、ＡＩＤＳの経過を改善する。

【0264】

〔００２８７〕
ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナーとの相互作用の刺激を介する免疫応答の下方制御も、自己組織の自己免疫発作の治療に有用であり得る。したがって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはその天然結合パートナーへのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合を増加させることによって、自己免疫発作によって引き起こされるか、または悪影響を及ぼされる状態（例えば、心疾患、心筋梗塞、またはアテローム性動脈硬化症）を改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）または改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）することができる。したがって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその対抗受容体との相互作用を刺激することによって、自己免疫障害等の自己免疫発作によって悪影響を及ぼされる状態（ならびに心疾患、心筋梗塞、およびアテローム性動脈硬化症等の状態）を調節することは、本発明の範囲内である。

【0265】

４．免疫応答の上方制御
〔００２８８〕 免疫応答の上方制御としてのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用の
阻害も、治療において有用である。免疫応答の上方制御は、既存の免疫応答を強化するか、または最初の免疫応答を誘発する形態であり得る。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の阻害を介する免疫応答の強化は、微生物、例えば、細菌、ウイルス、もしくは寄生虫感染の場合、または免疫抑制の場合に有用である。例えば、一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を阻害する作用物質、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに対する非活性化抗体（すなわち、ブロッキング抗体）、またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの可溶型は、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫のより迅速または完全な排除をもたらす抗体および細胞媒介性応答の上方制御が有益であろう状況において、治療的に有用である。これらの状態には、ヘルペスまたは帯状疱疹等のウイルス性皮膚疾患が含まれ、その場合、かかる作用物質を局所的に皮膚に送達することができる。加えて、インフルエンザ、風邪、および脳炎等の全身性ウイルス性疾患は、かかる作用物質の全身投与によって緩和され得る。ある特定の事例において、免疫応答をさらに増強するために、免疫応答を上方制御する他の作用物質、例えば、共刺激受容体を介してシグナルを変換するＢ７ファミリーメンバーの形態をさらに投与することが望ましくあり得る。

【0266】

〔００２８９〕
あるいは、免疫細胞を患者から除去すること、インビトロで免疫細胞をＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を阻害する作用物質と接触させること、およびインビトロで刺激された免疫細胞を患者に再導入することによって、感染患者における免疫応答を強化することができる。別の実施形態では、免疫応答を強化する方法は、患者から感染細胞、例えば、ウイルス感染細胞を単離すること、細胞がそれらの表面でＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の全てまたは一部を発現するように、それらをその天然結合パートナー（複数を含む）に結合できないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの形態をコードする核酸分子でトランスフェクトすること、およびトランスフェクト細胞を患者に再導入することを含む。トランスフェクト細胞は、阻害シグナルを予防し、それによって、インビボで免疫細胞を活性化することができる場合もある。

【0267】

〔００２９０〕
種々のポリペプチド、例えば、ポリペプチド由来の病原体に対するワクチンにおいて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を阻害する作用物質を予防的に使用することができる。病原体、例えば、ウイルスに対する免疫を、適切なアジュバントにおいて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を阻害する作用物質に加えて、ウイルスポリペプチドをワクチン接種することによって誘導することができる。あるいは、病原性抗原およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの免疫細胞との相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの形態の両方をコードする遺伝子を含むベクターを、ワクチン接種に使用することができる。核酸ワクチンを、様々な手段で、例えば、注入（例えば、筋肉内、皮内、または分子を皮膚に注入するために粒子加速器もしくは圧縮ガスを使用する遺伝子銃を用いたＤＮＡ被覆金粒子の表皮への微粒子銃注入（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：３７））によって投与することができる。あるいは、核酸ワクチンを非侵襲的手段で投与することができる。例えば、純粋なＤＮＡもしくは脂質製剤化ＤＮＡを、呼吸器系に送達するか、またはＤＮＡの経口送達によって、他の部分、例えば、パイエル板を標的化することができる（Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔ（１９９７）Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：９６１）。弱毒化微生物を、粘膜面への送達のために使用することができる（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９）。

【0268】

〔００２９１〕
別の実施形態では、ワクチン中の抗原は、自己抗原である。かかるワクチンは、生物に
おける耐性の調節において有用である。自己抗原およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその天然結合パートナーとの相互作用をブロックする作用物質での免疫化は、耐性を破壊する（すなわち、自己抗原の耐性を妨害する）ことができる。かかるワクチンは、ミョウバン等のアジュバントまたはサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、Ｂ７−１、もしくはＢ７−２）も含み得る。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を阻害する作用物質を、例えば、トランスフェクトされて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはブロッキング抗体ならびにＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドおよびベータ２マイクログロブリンを共発現する細胞によって、ＭＨＣクラスＩポリペプチドで投与し、Ｔ細胞の活性化をもたらし、感染から免疫を提供することができる。例えば、ワクチンが有用であるウイルス病原体には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリアおよび住血吸虫症が含まれる。

【0269】

〔００２９２〕
別の適用では、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用の阻害は、腫瘍免疫の治療において有用であり得る。腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、または癌腫）を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を阻害する核酸分子でトランスフェクトすることができる。これらの分子は、例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに対してアンチセンスであるか、または非活性化抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体をコードすることができる核酸分子であり得る。これらの分子は、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ抗体の可変領域であり得る。所望される場合、腫瘍細胞を、共刺激を活性化する他のポリペプチド（例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２）でトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、患者に戻され、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の阻害（例えば、局所的阻害）をもたらす。あるいは、遺伝子治療技術を使用して、インビボでのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的化することができる。

【0270】

〔００２９３〕
腫瘍細胞への免疫応答の刺激を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を阻害することによって、患者を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を阻害する作用物質で治療することによって達成することもできる。かかる作用物質の好ましい例には、例えば、アンチセンス核酸分子、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを認識かつブロックする抗体、および免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのその自然発生結合パートナー（複数を含む）との相互作用をブロックする化合物（例えば、可溶性一価ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子、抗原提示細胞上でＦｃ受容体に結合しないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子の可溶型、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合パートナー（複数を含む）の可溶型、および主題のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物）が挙げられる。加えて、ＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠乏するか、または十分な量のＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しそこなう腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドおよびベータ２マイクログロブリンポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩα鎖ポリペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩβ鎖ポリペプチドの全てまたは一部（例えば、細胞質ドメイン切断型部分）をコードする核酸でトランスフェクトすることができ、それによって、細胞表面上でＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩポリペプチドを発現する。ポリペプチドまたはアンチセンス核酸を阻害するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとの適切なＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの発現は、トランスフェクト腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘導する。任意で、不変鎖等のＭＨＣクラスＩＩ関連ポリペプチドの発現をブロックするアンチセンス構築物をコードする遺伝子を、ポリペプチドまたはアン
チセンス核酸を阻害するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡをコードするＤＮＡで同時トランスフェクトして、腫瘍関連抗原の提示を促進し、かつ腫瘍特異的免疫を誘導することもできる。Ｂ７−陰性マウス腫瘍細胞によるＢ７−１の発現が、マウスにおける腫瘍拒絶および腫瘍誘発に対する長期保護を伴うＴ細胞媒介性特異的免疫を誘導することが示されている（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：１０９３−１１０２、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：３６８−３７０、Ｂａｓｋａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５６８７−５６９０）。したがって、ヒト対象における免疫細胞媒介性免疫応答の誘導は、対象における腫瘍特異的耐性を克服するのに十分であり得る。別の実施形態では、既存の耐性が克服されるように、免疫応答を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用の阻害によって刺激することができる。例えば、対象が著しい免疫応答を開始することができない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原に対する免疫応答を、能動免疫化のプロセスにおける外来抗原への応答を高めるアジュバントとして使用することができる、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの活性またはその天然結合パートナーに結合するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの能力を阻害する作用物質を投与することによって誘導することができる。

【0271】

〔００２９４〕
一実施形態において、免疫細胞は、対象から得られ、かつＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を阻害する作用物質の存在下において、エクスビボで培養され、免疫細胞集団を増殖する。さらなる実施形態では、免疫細胞は、その後、対象に投与される。例えば、当分野で既知のように、免疫細胞に一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルを提供することによって、免疫細胞を刺激して、インビトロで増殖することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡポリペプチドまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性を阻害する作用物質の種々の形態を使用して、免疫細胞の増殖を共刺激することもできる。一実施形態において、免疫細胞は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２９４３６号に記載の方法に従ってエクスビボで培養される。共刺激分子は、可溶性であり得、細胞膜に付着されるか、またはビーズ等の固体表面に付着され得る。

【0272】

〔００２９５〕
さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを行う際、１つ以上の追加の作用物質を投与することによって免疫応答を上方制御することは、本発明の範囲内である。例えば、サイトカイン、アジュバント、または共刺激分子もしくはそれらのリガンドの刺激型等の免疫応答を刺激することで既知の他の作用物質を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用を阻害する作用物質と併せて使用することができる。

【0273】

Ｅ．Ｔ細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはその対抗受容体とのＰＤ
−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ相互作用の調節によって調節されるサイトカインの特定
〔００２９６〕 本明細書に記載のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ分子を使用して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶ１ＳＴＡとその天然結合パートナー（複数を含む）との相互作用の調節によって産生されるか、またはその産生が免疫細胞内でそれに応答して強化もしくは阻害されるサイトカインを特定することができる。免疫細胞を、一次活性化シグナルで最適以下にインビトロ刺激することができ、例えば、Ｔ細胞を、ホルボールエステル、抗ＣＤ３抗体、または好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原で刺激し、例えば、Ｂ７ファミリー抗原の刺激型によって、例えば、Ｂ７ポリペプチドをコードし、かつその表面上でペプチドを発現する核酸でトランスフェクトされた細胞によって、またはペプチドの可溶性刺激型によって共刺激シグナルを与えるこ
とができる。その後、細胞を、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡに対する抗体）と接触させることができる。培地に放出される既知のサイトカインを、ＥＬＩＳＡによって、またはサイトカインをブロックする抗体の免疫細胞増殖またはサイトカインによって誘導される他の細胞型の増殖を阻害する能力によって特定することができる。例えば、ＩＬ−４ ＥＬＩＳＡキットは、ＩＬ−７ブロッキング抗体として、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）から入手可能である。ＩＬ−９およびＩＬ−１２に対するブロッキング抗体は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）から入手可能である。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡとその結合パートナー（複数を含む）との相互作用の刺激もしくはブロックのサイトカインプロファイルへの影響を次いで決定することができる。上述のように、かつ実施例に示されるように、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡは、免疫細胞によるＩＬ−２およびガンマインターフェロンの発現を抑制するようである。

【0274】

〔００２９７〕
上述のインビトロ免疫細胞共刺激アッセイを、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性の調節によって調節することができる新規のサイトカインを特定するための方法において使用することもできる。例えば、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路の刺激が、ＩＬ−２分泌を強化するように見える場合、ＩＣＯＳ経路の刺激は、ＩＬ−１０分泌を強化するようである（Ｈｕｔｌｏｆｆｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６３）。共刺激時、例えば、免疫細胞増殖時に誘導される特定の活性が、ブロッキング抗体を既知のサイトカインに添加することによって阻害することができない場合、活性は、未知のサイトカインの作用に起因し得る。共刺激後、このサイトカインを、従来の方法で培地から精製することができ、その活性を、免疫細胞増殖を誘導するその能力によって測定することができる。

【0275】

〔００２９８〕
耐性の誘導の役割を果たし得るサイトカインを特定するために、上述のインビトロＴ細胞共刺激アッセイを使用することができる。この場合、Ｔ細胞は、一次活性化シグナルを与えられ、かつ選択されたサイトカインと接触するが、共刺激シグナルは与えられない。免疫細胞を洗浄し、静置させた後、その細胞は、一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルの両方に曝露される。免疫細胞が応答しない（例えば、サイトカインを増殖または産生しない）場合、それらは耐性化されており、サイトカインは、耐性の誘導を阻止しなかったこととなる。しかしながら、免疫細胞が応答する場合、耐性の誘導は、サイトカインによって阻止されている。耐性の誘導を阻止することができるこれらのサイトカインを、移植レシピエントまたは自己免疫疾患を有する対象における耐性を誘導するより効率的な手段として、Ｂリンパ球抗原をブロックする試薬と併せて、インビボでの妨害のために標的とすることができる。例えば、対象に、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ活性またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの結合パートナーとの相互作用を促進する作用物質に加えて、サイトカインブロッキング抗体を投与することができる。

【0276】

〔００２９９〕
したがって、要約すると、Ｔｒｅｇ細胞によって発現されるプログラム死リガンド（ＰＤＬ）ファミリーの新規の成員が現在同定されている。この新規のタンパク質は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡと命名されている。このＰＤ−Ｌファミリーの受容体は、単一のＩｇＶドメインを含有するＩ型膜貫通タンパク質である一方で、リガンドは、ＩｇＶおよびＩｇＣ細胞外ドメインの両方を発現するＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＤＬファミリーの他のメンバーと同様に、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞のαＣＤ３増殖をインビトロで共刺激する。加えて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現は、αＣＤ３活性化Ｔｒｅｇを増加させ、αＧＩＴＲの存在下で減少する。

【0277】

〔００３００〕
第２のＴＮＦ様のタンパク質が、αＣＤ３／αＧＩＴＲ刺激時に上方制御されると特定されている。このタンパク質は、Ｔｒｅｇ−ｓＴＮＦと命名されている。これらのタンパク質は、免疫の接触依存性およびパラクリン抑制に関与し得、したがって、免疫応答を調節する（例えば、阻害または刺激する）のに、かつＴｒｅｇシグナル伝達を伴う疾患および状態の治療において有用である。例えば、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質を、免疫細胞活性化を刺激または強化するための共刺激シグナルとして使用することができる。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡタンパク質およびＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ結合剤ならびにＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡアゴニストおよびアンタゴニストは、Ｔ細胞免疫の制御が所望される免疫状態の治療、例えば、Ｔ細胞活性化、分化、および増殖の調節、具体的には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、ならびにＴ細胞と骨髄由来のＡＰＣとの間の同族相互作用中のＴ細胞応答の調節において特に有用である。

【0278】

〔００３０１〕 本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、制限するものとして解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容、ならびに図および配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0279】

〔００３０２〕 以下の材料および方法を、以下の実施例において使用した：
材料および方法
発現プロファイリング
〔００３０３〕 Ｔｒｅｇ細胞の確立された発現プロファイルとの比較を促進するために、標準の成長および活性化条件を採用した（ＭｃＨｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．（２００２）上記参照）。簡潔に述べると、新鮮な単離Ｔｒｅｇ細胞（約９６％陽性）を、抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）を伴い、あるいは伴わずに、１０％胎児ウシ血清および抗ＣＤ３で予め被覆された２４ウェルプレート中の１００単位ＩＬ−２を補充した完全ＲＰＭＩ培地に、１０６／ｍＬで接種した（Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２）上記参照）。細胞を、３７℃で０〜１２時間培養し、ＲＮＡを精製し、その後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）マウスゲノムＡ４３０オリゴヌクレオチドアレイを用いて分析した。

【0280】

〔００３０４〕
静止または活性化ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞群からのデータを比較することにより、遺伝子発現パターンが、当分野で確立されたパターンに類似することが見出された（Ｇａｖｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２）上記参照、ＭｃＨｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．（２００２）上記参照）。ＧＩＲＴシグナル伝達によって制御される遺伝子を特定するために、遺伝子発現プロファイルを、抗ＧＩＴＲ処理を伴い、あるいは伴なう、異なる細胞集団間で比較した。以前に特徴付けられていないＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡおよびＴｒｅｇ−ｓＴＮＦを含む既知の遺伝子ならびに未知の遺伝子の一覧表を編集した。

【0281】

マウス
〔００３０５〕 Ｃ５７ＢＬ／６マウス、およびΟΤΙΙ ＣＤ４遺伝子導入マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＦｏｘＰ３−ＧＦＰ受容体マウスは、Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ｍ．、Ｄｏｏｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．、Ｆａｒｒ，Ａ．Ｇ．、およびＲｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．（２００５）．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｘｐ３．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２２，３２９−３４１に以前に記載されたようなものであり、寛大にも、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡによって提供された。ＰＤ−１ ＫＯマウスは、寛大にも、Ｄｒ．Ｔａｓｕｋｕ Ｈｏｎｊｏ（Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．、Ｎｏｓｅ，Ｍ．、Ｈｉａｉ，Ｈ．、Ｍｉｎａｔｏ，Ｎ．、およびＨｏｎｊｏ，Ｔ．（１９９９）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌｕｐｕｓ−ｌｉｋｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｂｙ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＤ−１ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ＩＴＩＭ ｍｏｔｉｆ−ｃａｒｒｙｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１，１４１−１５１、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．、Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．、Ｔａｎａｋａ，Ｙ．、Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．、Ｈａｒａ，Ｍ．、Ｍａｔｓｕｍｏｒｉ，Ａ．、Ｓａｓａｙａｍａ，Ｓ．、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ａ．、Ｈｉａｉ，Ｈ．、Ｍｉｎａｔｏ，Ｎ．、およびＨｏｎｊｏ，Ｔ．（２００１）．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｌａｔｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｉｎ ＰＤ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１，３１９−３２２）によって提供された。全ての動物を、Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの病原体を含まない施設で維持した。

【0282】

抗体、細胞株、および試薬：
〔００３０６〕 抗体αＣＤ３（２Ｃ１１）、αＣＤ２８（ＰＶ−１）、αＣＤ４（ＧＫ１．５）、αＣＤ８（５３−６．７）、αＣＤ１１ｂ（Ｍｌ／７０）、αＦ４／８０（ＢＭ８）、αＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、αＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、αＧｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、αＰＤ−Ｌ１（ＭＩＮ５）、αＰＤ−Ｌ２（ＴＹ２５）、αＢ７−Ｈ３（Ｍ３．２Ｄ７）、αＢ７−Ｈ４（１８８）を、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）、組換えマウスＩＦＮ□（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ヒトＬＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、可溶性ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、指示された濃度で使用した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）およびトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を、Ｓｉｇｍａから購入した。ＭＨＣＩＩ分子Ｉ−Ａｄおよび共刺激分子Ｂ７−２を発現するＣＨＯ細胞株は、親切にもＤｒ．Ａｒｌｅｎｅ Ｓｈａｒｐｅ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）から提供された。
ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの分子クローニング、レトロウイルス産生、および細胞のレトロウイルス形質導入
〔００３０７〕 全長ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを、精製マウスＣＤ４＋Ｔ細胞からクローニングした。全てのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＷＡｍｉｎｉキットを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞から単離した。ｃＤＮＡを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ ｃＤＮＡ合成キットを用いて生成した。全長ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを増幅し、レトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＥＣｏｒｌ−Ｘｈｏｌ部位（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．およびＲｅｎ，Ｒ．（１９９８）Ｂｃｒ−Ａｂｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｃｅｓｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｉｃｅ：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ ９２、３８２９−３８４０）にクローニングし、その中で、ＩＲＥＳ−ＧＦＰフラグメントは、ＲＦＰに置き換えられ、したがって、ＲＦＰのＮ末端に融合されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの融合タンパク質をもたらした。ヘルパーを含まないレトロウイルスを、エコトロピックパッケージングベクターｐＣＬ−Ｅｃｏ（ＩＭＧＥＮＥＸ ｃｏｒｐ．）とともに、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−ＲＦＰレトロウイルスベクターの一過性トランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生成した。マウスＴ細胞株ＥＬ４細胞または骨髄由来ＤＣのレトロウイルス形質導入を、８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、室温で４５分間の２０００ｒｐｍでのスピン感染によって実行した。

【0283】

ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の産生
〔００３０８〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（アミノ酸３２〜１９０）を増幅し、親ベクターＣＤＭ７ＢのＳｐｅｌ−ＢａｍＨＩ部位（Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ，Ｄ．、Ｄｏｕｔｈｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｖ．、およびＡｒｕｆｆｏ，Ａ．（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８８，１−７．．．）にクローニングした。このベクターは、ヒトＩｇＧ １の定常領域およびヒンジ領域の変異型を含有し、Ｆｃ受容体への結合を大幅に低下させた。結果として得られたベクターＣＤＭ７Ｂ−ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを、ＤＨＦＲ発現ベクターｐＳＶ−ｄｈｆｒ（Ｍｃｌｖｏｒ，Ｒ．Ｓ．およびＳｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．Ｃ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８，７０２５−７０３２）でＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６）に同時トランスフェクトした。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇを発現する安定したＣＨＯ細胞クローンを、ヌクレオチドを有しないＭＥＭアルファ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において選択した。０．５〜１μＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ Ｍ９９２９）でのさらなる増幅は、高レベルの可溶性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を発現するクローンを産出した。融合タンパク質を、標準のタンパク質Ｇカラム親和性クロマトグラフィーを用いて、培養上清からさらに精製した。

【0284】

ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の生成
〔００３０９〕 アルメニアンハムスターを、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−ＲＦＰを過剰発現するＥＬ４細胞で週に４回免疫し、その後、ＣＦＡ中で乳化されたＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質で追加免疫した。追加免疫の４週間後、ハムスターを、可溶性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質で再度追加免疫した。最後の追加免疫の４日後、ハムスター脾臓細胞を採取し、標準のハイブリドーマ融合技術（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．、Ｗｉｌｄｅ，Ｃ．Ｄ．、およびＫｏｈｌｅｒ，Ｇ．（１９７８）Ａ ｂｅｔｔｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２７６，２６９−２７０）を用いて、骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８１）に融合した。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ特異的抗体を分泌するハイブリドーマクローンを、希釈を制限した後に選択し、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー法の両方によってスクリーニングした。

【0285】

ＲＮＡおよびＲＴ−ＰＣＲ
〔００３１０〕 種々のマウス組織試料または精製造血細胞型由来の全てのＲＮＡを、ＴｒｉｚｏｌＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）方法を用いて会社の指示に従って収集した。ｃＤＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて調製した。同量の組織ｃＤＮＡ（１０ｎｇ）を、ＲＴ−ＰＣＲ反応のために使用して、全長ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲルに通過させた後に観察した。

【0286】

フローサイトメトリー
〔００３１１〕 フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣＡＮ上でＣｅｌｌＱｕｅｓｔ
ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて行った。

【0287】

細胞調製
〔００３１２〕 全てのＣＤ４＋Ｔ細胞を、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、未処理のマウスから単離した。適応があれば、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ナイーブ（ＣＤ４４低ＣＤ２５〜ＣＤ６２Ｌ高）および記憶（ＣＤ４４高ＣＤ２５〜ＣＤ６２Ｌ低）の集団にフロー分類した。インビトロ増殖アッセイについて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、３７℃で１０分間、５μＭのＣＦＳＥ（分子プローブ）で標識化し、刺激
する前に２回洗浄した。

【0288】

インビトロプレート結合Ｔ細胞活性化アッセイ
〔００３１３〕 精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（１ウェル当たり１００，０００個の細胞）を、抗ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）および指示された濃度比のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇのいずれかの存在下で、９６×平底ウェルプレート中で培養した。例えば、一連の滴定において、９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中で４℃で一晩混合された、２．５μｇ／ｍＬのαＣＤ３および１．２５μｇ／ｍＬ（２：１の比率）、２．５ｇ／ｍＬ（１：１の比率）、５μｇ／ｍＬ（１：２の比率）、もしくは１０μｇ／ｍＬ（１：４の比率）のＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照−Ｉｇタンパク質で被覆した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を添加する前に、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。複製培養物は、１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭのβ−ＭＥ、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補充した完全ＲＰＭＩ１６４０培地中に存在した。適応があれば、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの阻害効果を救助するために、１００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）または滴定量の□ＣＤ２８（クローンＰＶ−１、Ｂｉｏ Ｘ細胞）のいずれかを、□ＣＤ３とともに被覆した。培養物を、３日目にＧＦＳＥプロファイルについて、または示されるように時間的経過に従って分析した。

【0289】

骨髄由来ＤＣの培養、レトロウイルス形質導入、および遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激
〔００３１４〕 骨髄由来ＤＣを、Ｌｕｔｚ，Ｍ．Ｂ．、Ｋｕｋｕｔｓｃｈ，Ｎ．、Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ａ．Ｌ．、Ｒｏｓｓｎｅｒ，Ｓ．、Ｋｏｃｈ，Ｆ．、Ｒｏｍａｎｉ，Ｎ．、およびＳｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．（１９９９）（Ａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｌａｒｇｅ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ
ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３，７７−９２）、Ｓｏｎ，Ｙ．Ｉ．、Ｅｇａｗａ，Ｓ．、Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｔ．、Ｒｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｊｒ．、Ｋａｌｉｎｓｋｉ，Ｐ．、およびＫａｎｔｏ，Ｔ．（２００２）．（Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｕｌｋ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６２，１４５−１５７）に記載されるように、いくつかの修正を伴って生成した。簡潔に述べると、０日目に、骨髄細胞を、２７Ｇ針で洗い流すことによって、脛骨および大腿から単離した。赤血球溶解後、１〜２×１０６個の骨髄細胞を、６×ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ，Ｉｎｃ．）中に２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）を含有する１ｍＬの完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で再懸濁した。ＲＦＰまたはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−ＲＦＰレトロウイルスのいずれかを含有する２ｍＬの上清を、骨髄細胞に添加した。ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）も８μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。プレートを室温で４５分間、２０００ｒｐｍで回転させて、感染を実行した。次いで、細胞を、新鮮な培地を添加する前にさらに２時間培養した。＋１日目、＋３日目、＋５日目、および＋７日目に、同様の感染手順を繰り返した。緩く付着した細胞（９０％がＣＤ１１ｃ＋）を、＋１０日目に収集し、ＣＤ１１ｃ＋ＲＦＰ＋二重陽性細胞を分類して、遺伝子導入ＯＴ−ＩＩＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するために使用した。ＯＴ−ＩＩＴ細胞増殖アッセイについて、１００，０００個のＣＦＳＥ標識化ＯＴ−ＩＩＣＤ４＋Ｔ細胞を、滴定量の合成ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ）の存在下で、３０，０００個の分類されたＲＦＰ＋またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ−ＲＦＰ＋ＢＭＤＣを有する９６ウェル丸底プレート中で培養した。ＯＴ−ＩＩＴ細胞の増殖を、７２時間時点でＣＦＳＥプロファイルを試験することによって分析した。

【0290】

免疫化に応答したＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの発現研究
〔００３１５〕 遺伝子導入マウスＤＯ１１．１０を免疫するために、３００μｇのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ）をＣＦＡ（２００μＬ）中で乳化し、マウスの側腹部に皮下注入した。流入領域および非流入領域鼠径リンパ節を、指示された時点で採取した。単一細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーを用いてＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡおよび他の表面マーカーの発現について分析した。

【0291】

ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの阻害活性
〔００３１６〕 ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞抗原受容体遺伝子導入Ｔ細胞および抗原刺激を伴ってインビトロでＰＤ−Ｌ１を過剰発現する抗原提示細胞を用いて、ＰＤ−Ｌ１の阻害活性を明らかにした（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６３４−４３）。同様に、全長ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを発現する本明細書に開示のレンチベクターを、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）およびクラスＩＭＨＣを発現する細胞株に形質導入した。空ベクター形質導入抗原提示細胞またはＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡ形質導入抗原提示細胞によって示される抗原へのＴＥａ Ｔｇまたは２Ｃ遺伝子導入Ｔ細胞の応答を、確立された方法に従って決定する。

【0292】

〔００３１７〕 タンパク質発現。
リンパ球、単球、および樹枝状細胞サブセット、ならびに非造血組織における発現パターンを、本明細書に開示のウサギαＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ抗体と組み合わせて、標準のプロトコルを用いて、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によって決定する。

【0293】

〔００３１８〕 モノクローナル抗体産生。
ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを、マウスＢ細胞株Ａ２０で過剰発現させ、組換え細胞株を使用して、アルメニアンハムスターを免疫した。５回の細胞免疫化後、ハムスターを、ＣＦＡ中で乳化された精製ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質で追加免疫した。４週間後、最終追加免疫を可溶性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇで提供した。その後、ハムスター脾細胞のＳＰ２／０細胞との融合を、４日目に行った。ＥＬＩＳＡによってＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を認識し、かつＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを染色したが、マウスＴ細胞株ＥＬ４上で過剰発現されるＰＤ−Ｌ１は染色しなかった１６個の異なるクローンを特定した。それらのクローンのうちの１１個をうまくサブクローニングし、細胞および組織上の内在性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを染色し、かつＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ機能をブロックするそれらの能力の評価のために調製した。

【0294】

増殖アッセイ：
〔００３１９〕 インビトロＣＤ４Ｔ細胞増殖アッセイを、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ
モノクローナル抗体活性をスクリーニングするよう設計した。このアッセイにおいて、Ｔ細胞を、Ｔ細胞受容体を架橋するマイクロプレートウェル中の固定化抗ＣＤ３で刺激した。ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの細胞外ドメインから成るＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体の活性を、２つの異なる形状で検出した。第１に、モノクローナル抗体がαＣＤ３で共固定化されたとき、それは、添加された可溶性ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の存在下でのみ、Ｔ細胞増殖を強力に阻害した。この活性は、ウェル中の固定化モノクローナル抗体に結合するＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの能力に依存した。このアッセイ形態を用いて、高い、中程度の、または低い抑制活性を有したクローンを特定した。第２に、モノクローナル抗体を可溶性試薬としてアッセイに添加したとき、それは、固定化ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質と共同作用することによって、Ｔ細胞増殖に強力な抑制活性を発揮した。このアッセイ形態において、種々の抑制活性を有するクローンを同定した。

【0295】

実施例１：ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのクローニングおよび配列分析
〔００３２０〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡおよびＴｒｅｇ−ｓＴＮＦを、休止Ｔｒｅｇ、αＣＤ３で活性化したＴｒｅｇ、およびαＣＤ３／αＧＩＴＲで活性化したＴｒｅｇの包括的な転写プロファイリングによって特定した。Ｔｒｅｇ上でのＧＩＴＲの誘発がそれらの接触依存性抑制活性を消滅させることを示しているため、αＧＩＴＲをこの分析のために選択した（Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２）上記参照）。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡおよびＴｒｅｇ−ｓＴＮＦを、それらの特有の発現パターン（表１）に基づいて、ＡＦＦＩＭＥＴＲＩＸ（登録商標）ＤＮＡアレイ上で特定した。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡは、αＣＤ３活性化Ｔｒｅｇにおける発現の増加およびαＧＩＴＲの存在下での発現の減少を呈し、Ｔｒｅｇ−ｓＴＮＦは、発現におけるαＣＤ３／αＧＩＴＲ依存的増加を呈した。

【0296】

〔００３２１〕 精製ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、培養物中で一晩、なし、αＣＤ３、またはαＣＤ３／αＧＩＴＲで刺激し、ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ分析のために単離した。列記した発現は、アクチンに対する相対量である。

【0297】

【表1】

【0298】

〔００３２２〕 活性化対休止ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ｎＴｒｅｇのアフィメトリクス分析は、未知の機能を有するが、Ｉｇスーパーファミリーに対する配列相同性を有する遺伝子産物（ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ４６３２４２８Ｎ０５、または４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋ）の発現を明らかにした。

【0299】

〔００３２３〕 より具体的には、９３０ｂｐ遺伝子産物を、予測した寸法および配列と一致したＣＤ４＋Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリからクローニングした。コンピュータ上の配列分析および構造分析は、成熟時に、１５９個のアミノ酸の細胞外ドメイン、２２個のアミノ酸の膜貫通ドメイン、および９５個のアミノ酸の細胞質テールを有する、３０９個のアミノ酸の膜貫通タンパク質を予測する（図１Ａ）。アミノ酸配列アラインメントは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４等のＢ７ファミリーリガンドに相同であり、かつＢ７ファミリー受容体（すなわち、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ）にも相同である細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）−Ｖ様のドメインを明らかにする（図１Ｂ−Ｃ）。Ｂ７ファミリーリガンドと受容体との間のＩｇ−Ｖドメインの配列同一性は、概してあまり高くないが（４０％未満）、４６３２４２８Ｎ０５ＲｉｋのＩｇ−Ｖドメインは、Ｂ７ファミリーリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２との最も高い相同性を有する。配列アラインメントは、Ｂ７ファミリーリガンドの特徴を示す、鎖内ジスルフィド結合形成に重要ないくつかの高度に保存されたシステイン（図１Ｂ）も明らかにする（Ｓｉｃａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８，８４９−８６１）。

【0300】

〔００３２４〕 ４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋの細胞外ドメインは、Ｉｇ−Ｖドメインのみを含有し、Ｉｇ−Ｃドメインを欠失する（図１Ｂ〜Ｃ）。この特有の特性は、Ｂ７ファミリー受容体の特徴を示し、４６３２４２８Ｎ０５ＲｉｋをＩｇ−ＶおよびＩｇ−Ｃドメインの両方を含有する全ての他のＢ７ファミリーリガンドから区別する（Ｆｒｅｅｍａ
ｎ、Ｇ．Ｊ．（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５，１０２７５−１０２７６、Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５，１０４８３−１０４８８、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００８），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５，３０１１−３０１６、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，（２００１），Ｎａｔｕｒｅ
４１０，６０４−６０８、Ｓｔａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１），Ｎａｔｕｒｅ ４１０，６０８−６１）。一貫して、ＰｈｙＭＬアルゴリズム（系統発生最大尤度）を用いる系統発生分析は、４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋを、Ｂ７ファミリーリガンドよりもＢ７ファミリー受容体、具体的には、ＰＤ−１に近い進化距離で配置した（図２）（Ｇｕｉｎｄｏｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｇａｓｃｕｅｌ，Ｏ．（２００３）Ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ，ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｌａｒｇｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ．Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ ５２，６９６−７０４）。しかしながら、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの細胞質テールは、Ｂ７ファミリー受容体のシグネチャードメインである任意のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＴＩＭ、ＩＴＡＭ、またはＩＴＳＭ）を含有しない（Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００２）Ｂ７−ＣＤ２８ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２，１１６−１２６）。したがって、阻害性受容体ＰＤ−１とのその密接な進化的関係にもかかわらず、４６３２４２８Ｎ０５Ｒｉｋが、Ｂ７リガンドファミリーの新規の成員を表すと仮定される。これらの構造および系統発生学的特性に基づいて、この分子を、リガンドとして表されるＰＤ−１（ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ）と名付けた。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡも、７７％の配列同一性を共有するマウスオルソログとヒトオルソログとの間で高度に保存される（図１Ｄ）。

【0301】

〔００３２５〕 マウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡをコードする核酸配列は、本明細書において配列番号１として記述され、マウスＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質配列は、配列番号２として記述される。

【0302】

〔００３２６〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡのヒト相同体は、染色体１０（７２．９Ｍｂ）上に配置され、６個のエクソンから成り、それによって、３１１残基タンパク質をコードする４６８９個の塩基長の転写物を生成する。ヒト相同体ｍＲＮＡコード配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿０２２１５３において提供され、タンパク質配列は、ＮＰ＿０７１４３６と指定される。ヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡをコードする核酸配列は、本明細書において配列番号３と説明され、ヒトＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質配列は、配列番号４と説明される。マウスおよびヒト遺伝子は、７４％の相同性を共有し、タンパク質レベルにおいて６８％同一である。相同体を、染色体２０（２７．７Ｍｂ、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＢＣ０９８７２３）上で、ドブネズミ、ならびにトラフグおよびゼブラフィッシュにおいて同定した。特定の実施形態において、本発明のＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質は、配列番号５に説明される共通のアミノ酸配列を共有する。

【0303】

実施例２：ＲＴ−ＰＣＲ分析およびフローサイトメトリーによるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの発現研究
〔００３２７〕 図３の実験に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、マウス組織におけるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡのｍＲＮＡ発現パターンを決定した（図３Ａ）。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡは、大部分が、造血組織（脾臓、胸腺、骨髄）または白血球の十分な浸潤を伴う組織（すなわち、肺）上で発現される。弱い発現が、非造血組織（すなわち、心臓、腎臓、脳、および卵巣）においても検出された。いくつかの造血細胞型の分析は、腹腔マクロファージ、脾臓ＣＤ１１ｂ＋単球、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡの発現を明らかにするが、Ｂ細胞上においてはより低い発現レベルである（図３Ｂ）。この発現パターンは、大
部分は、ＧＮＦ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）遺伝子アレイデータベース（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，４４６５−４４７０）、ならびにＮＣＢＩ ＧＥＯ（遺伝子発現オムニバス）データベースとも一致している（図４Ａ〜Ｄ）。

【0304】

〔００３２８〕 タンパク質発現を研究するために、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ特異的ハムスター８Ｄ８および６Ｅ７モノクローナル抗体を産生した。特異性を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ過剰発現マウスＥＬ４Ｔ細胞上でのポジティブ染色法によって実証するが、ＰＤ−Ｌｌ過剰発現ＥＬ４細胞上ではネガティブ染色法で実証する（図５）。

【0305】

〔００３２９〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を産生した。ウサギ抗ＰＤ−ＵまたはＶＩＳＴＡ抗体を用いることによって、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡタンパク質は、リンパ器官に局在化され、脳組織において顕著に見出された。特定されたモノクローナル抗体のうち、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡクローン８Ｄ８の特異性をさらに評価した。この分析において、クローン８Ｄ８を、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ、およびｈ１ｇを含むＰＤ−Ｌ様のＩｇ融合タンパク質分子のパネルに対する結合について試験した。この分析の結果は、８Ｄ８ αＰＤＬ−３がＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡに高度に特異的であったことを示した。

【0306】

〔００３３０〕 具体的には、抗ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体クローン８Ｄ８を用いて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現を、フローサイトメトリーによって造血細胞上で分析した。Ｆｏｘｐ３ＧＦＰノックイン受容体マウスを使用して、ＣＤ４＋ｎＴｒｅｇ（３４）を区別した。末梢リンパ器官（脾臓およびリンパ節）において、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット（全てのＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＦｏｘｐ３未処理Ｔ細胞およびＦｏｘｐ３＋ｎＴｒｅｇ細胞、ならびに記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞を参照のこと）上で著しい発現が見られる一方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、著しく少ない量の表面ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡを発現する（図３Ｃ）。胸腺において、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性胸腺細胞上では陰性であり、ＣＤ４一重陽性細胞上では低く、ＣＤ８一重陽性細胞上では検出可能である。次に、高ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現とＣＤ１１ｂマーカーとの強力な相関関係を、Ｆ４／８０マクロファージおよび骨髄性ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの両方を含む脾細胞および腹腔細胞の両方において見ることができる（図３Ｄ〜Ｅ）。その一方で、Ｂ細胞およびＮＫ細胞は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現に対して大抵陰性である。わずかな割合のＧｒ−１＋顆粒球は、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡも発現する（図３Ｆ）。

【0307】

〔００３３１〕 差次的発現パターンは、異なるリンパ器官由来の細胞の同一の系列上に示される（図３Ｇ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ中間単球について、発現レベルは、腸間膜リンパ節＞末梢リンパ節および脾臓＞腹膜腔および血液のパターンに従う。このパターンは、ＣＤ１１ｂ高細胞ではあまり顕著ではない。このデータは、ある特定の細胞型上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現を、細胞成熟および／もしくは組織微環境によって制御することができることを示唆する。

【0308】

〔００３３２〕 新鮮に単離された細胞に加えて、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現を、活性化を伴うインビトロ培養時および活性化を伴わないインビトロ培養時に、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ高単球、およびＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上で分析した（図６）。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡおよび他のＢ７ファミリーリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４）の発現について分析する前に、脾臓細胞を、培地、または抗ＣＤ３（Ｔ細胞を活性化するため）、またはＩＦＮ□およびＬＰＳ（単球および
ＤＣを活性化するため）のいずれかと２４時間培養した。この比較は、これらの分子間の特徴的な発現パターンを明らかにした。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現は、活性化状態にかかわらず、インビトロ培養時に全ての細胞型上で喪失される。対照的に、ＰＤ−Ｌ１発現は、刺激時にＣＤ４＋Ｔ細胞上で、または培地単独での培養時にＣＤ１１ｂ高単球およびＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上で上方制御され、刺激に直面してさらに強化される。ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、およびＢ７−Ｈ４の発現は、使用した培養条件下では顕著ではない。インビトロでのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現の喪失は、他のＢ７ファミリーリガンドと比較すると特有であるが、組織微環境を模倣しそこなう最適ではない培養条件を反映し得る。

【0309】

〔００３３３〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現をインビボで制御する方法に対処するために、ＣＤ４ＴＣＲ遺伝子導入マウスＤＯ１１．１０を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化された同族抗原トリオボアルブミン（ＯＶＡ）で免疫した。免疫化後２４時間時点で、流入領域リンパ節由来の細胞を、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現について分析した（図７Ａ）。アジュバント単独ではなく、抗原（ＣＦＡ／ＯＶＡ）での免疫化は、Ｆ４／８０＋マクロファージおよびＣＤ１１ｃ＋ＤＣの混合集団を含有したＣＤ１１ｂ＋ＰＤ−Ｌ３またはＶ１ＳＴＡ＋骨髄性細胞集団を大幅に増加させた。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２とのさらなる比較は、かかる炎症性免疫応答中に、ＰＤ−Ｌ１が最も高い構成的発現レベルを有するが、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡが最も高度に上方制御されることを明らかにする（図７Ｂ）。全体として、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの骨髄性ＡＰＣ上での発現が、免疫応答を制御し、かつＴ細胞免疫を調整するその役割に寄与し得る免疫系によって強固に制御されることを強く示唆する。

【0310】

〔００３３４〕 そのＡＰＣ上で増加した発現とは対照的に、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ発現は、免疫化時のより遅れた時点で（すなわち、２４時間時点ではなく、４８時間時点で）活性化ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞上で減少する（図８）。この結果は、能動的免疫応答中に、ＣＤ４Ｔ細胞上でのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡインビボ発現を、その活性化状態およびサイトカイン微環境によって制御することができることを示唆する。

【0311】

実施例３：ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴシグナル伝達のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答への機能的影響
〔００３３５〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質を産生して、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答におけるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの制御的役割を試験した。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に融合されるＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの細胞外ドメインを含有する。マイクロプレート上での固定化の際に、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、停止した細胞分裂によって決定されるように、プレート結合された抗ＣＤ３刺激に応答して、バルク精製されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制したが、対照Ｉｇは制御しなかった（図９Ａ〜Ｂ）。ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ Ｉｇ融合タンパク質は、ＥＬＩＳＡによって決定されるように、抗ＣＤ３抗体のプラスチックウェルへの吸収に影響を与えず（データ示されず）、したがって、非特異的阻害効果の可能性を除外した。ＰＤ−１ ＫＯ ＣＤ４＋Ｔ細胞も抑制され（図９Ｃ）、ＰＤ−１が、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡの受容体ではないことを示す。ＰＤ−Ｌ１−ＩｇおよびＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの阻害効果も直接比較した（図１０）。滴定量のＩｇ融合タンパク質が、□ＣＤ３とともにマイクロプレートに吸収されて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するとき、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ融合タンパク質に類似した阻害性有効性を示した。

【0312】

〔００３３６〕 バルク精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞が種々のサブセットを含有するため、分類されたナイーブ（ＣＤ２５−ＣＤ４４低ＣＤ６２Ｌ高）および記憶（ＣＤ２５−ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低）ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットへのＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉ
ｇの影響を評価した（図１１）。記憶細胞上での有効性ははるかに低いが、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡが、両方のサブセットの増殖を抑制することができることが示される。

【0313】

〔００３３７〕 ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ媒介性抑制の機構をさらに理解するために、初期のＴＣＲ活性化マーカーおよびアポトーシスの発現を、Ｔ細胞活性化後にＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下または不在下で測定した。細胞増殖への負の影響と一致して、早期の活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ４４、およびＣＤ６２Ｌの発現における包括的な抑制が存在する（補足図１２Ａ）。その一方で、ＰＤ−Ｌ３またはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質は、アポトーシスを誘導しなかった。逆に、ＴＣＲ活性化の早期（２４時間）および後期（４８時間）の両方で、対照−ＩｇよりもＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下で、より少ないアポトーシス（アネキシンＶ＋７ＡＡＤ細胞の割合によって決定される）が見られた（図１２Ｂ）。例えば、２４時間時点で、全体の「非ゲート化」集団において、約２７％の細胞が、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの存在下でアポトーシスであったが、約３９％の対照細胞が、アポトーシスであった。生細胞Ｒ１ゲート内の細胞を試験する際、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇで処理したときに、約７２．６％の対照細胞がアポトーシスになった一方で、４３．５％の細胞のみがアポトーシスになったという理由から、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇが、活性化誘導細胞死（ＡＣＩＤ）を強力に阻害したことは明らかである。類似の結果が４８時間時点で見られた。したがって、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡは、早期のＴＣＲ活性化を抑制し、かつ細胞分裂を停止させて、アポトーシスに最小限に直接影響しか与えずに、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を負に制御するようである。この抑制機構は、Ｂ７−Ｈ４の抑制機構に類似している（Ｓｉｃａ，Ｇ．Ｌ．、Ｃｈｏｉ，Ｉ．Ｈ．、Ｚｈｕ，Ｇ、Ｔａｍａｄａ，Ｋ．、Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．、Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．、Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．Ｉ．、Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．、Ｂａｊｏｒａｔｈ，Ｊ．、およびＣｈｅｎ，Ｌ．（２００３）Ｂ７−Ｈ４，ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７ ｆａｍｉｌｙ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８，８４９−８６１）。

【0314】

〔００３３８〕 ２ステップアッセイを開発して、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇが予備活性化ＣＤ４Ｔ細胞を抑制することができるか、かつその抑制効果がどのくらい持続的であるかを決定した。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質の抑制効果が、活性化後２４時間時点でのその除去後に持続することが示される（図９Ｄ）。加えて、未処理および予備活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方ともに、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇによって抑制することができた（図９Ｄｉ、９Ｄｉｉｉ、および９Ｄｉｖ）。

【0315】

〔００３３９〕 次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞サイトカイン産生へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの影響を分析した。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、Ｔｈ１サイトカインＩＬ−２およびバルク精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞培養物由来のＩＦＮアルファの産生を抑制した（図１３Ａ〜Ｂ）。別個のナイーブ（ＣＤ２５〜ＣＤ４４低ＣＤ６２Ｌ高）および記憶（ＣＤ２５〜ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの影響をさらに試験した。記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋細胞コンパートメント内でのサイトカイン産生のための主な供給源であり、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡがこの産生を抑制することができることが示される（図１３Ｃ〜Ｄ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞由来のＩＦＮアルファ産生へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの類似した阻害効果も示された（図１３Ｅ）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡのこの阻害効果は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡが免疫応答を下方制御する阻害リガンドであるという仮定と一致
する。

【0316】

〔００３４０〕 次に、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの阻害効果を克服することができる因子を決定するように研究を設計した。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡがＩＬ−２産生を抑制し、かつＩＬ−２がＴ細胞生存および増殖に不可欠であることを前提に、我々は、ＩＬ−２がＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの阻害活性を回避し得ると仮定する。図１４Ａに示されるように、外因性ＩＬ−２は、細胞増殖へのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇの抑制効果を部分的に逆転したが、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、もしくはＩＬ−２３は、逆転しなかった。高レベルのＩＬ−２による不完全な救助は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴシグナル伝達が、単にＩＬ−２産生よりも広範のＴ細胞活性化経路を標的化することを示す。その一方で、抗ＣＤ２８アゴニスト抗体によって提供される強力な共刺激シグナルが、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ媒介抑制を完全に逆転した（図１４Ｂ）のに対して、中程度のレベルの共刺激は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴシグナル伝達によって依然として抑制される（図１４Ｃ）。この結果は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ媒介性免疫抑制が、炎症程度の低い状態下でより効果的であるが、強力な正の共刺激シグナルによって必然的に圧倒されることを示唆する。この点において、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡは、この特性をＰＤ−Ｌ１およびＢ７−Ｈ４等の他の抑制性Ｂ７ファミリーリガンドと共有する（Ｓｉｃａ ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８，８４９−８６１、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２，６３４−６４３）。

【0317】

〔００３４１〕 ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質に加えて、ＡＰＣ上で発現されるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡが、ＡＰＣとＴ細胞との間の同族相互作用中に、抗原特異的Ｔ細胞活性化を抑制することができることを確認することが必要である。この目的のために、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−ＲＦＰもしくはＲＦＰ制御タンパク質を、ＭＨＣＩＩおよびＢ７−２分子を安定的に発現する人工抗原提示細胞株（ＣＨＯ−ＡＰＣ）内でレトロウイルス形質導入を介して過剰発現させた（Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１），Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２，２６１−２６８）。ＣＨＯ内でＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡを発現させる際の１つの課題は、恐らくＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ表面局在化への支持を欠如する未知の環境のため、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの大部分が、細胞表面を局在化しそこなったことである（データ示されず）。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの細胞質テール上に存在する、制御のモードを示唆する明瞭なモチーフが存在しないが、我々は、テールがその細胞内局在化に貢献し得ることを推測する。したがって、テールのないＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ変異体を設計し、それがＣＨＯ細胞表面をうまく局在化することを見出した（データ示されず）。

【0318】

〔００３４２〕 Ｔ細胞応答を刺激するために、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡもしくはＣＨＯ−ＲＦＰ細胞を、抗原性ＯＶＡペプチドの存在下で、ＤＯ１１．１０ ＣＤ４＋Ｔ細胞とともにインキュベートした。図１５Ａ〜Ｃに示されるように、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡは、ＣＨＯ−ＲＦＰ細胞の増殖よりも少ないＤＯ１１．１０細胞の増殖を誘導した。この抑制効果は、より低いペプチド濃度においてより顕著であり、より強力な刺激シグナルが、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの抑制効果を克服するという考えと一致する。

【0319】

〔００３４３〕 加えて、天然ＡＰＣへの全長ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの阻害効果を確認した。インビトロで培養された骨髄由来樹枝状細胞（ＢＭＤＣ
）は、高レベルのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡを発現しない（図１６）。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−ＲＦＰもしくはＲＦＰを、１０日間の培養期間中に、レトロウイルス形質導入によってＢＭＤＣで発現した。形質導入された細胞を、ＲＦＰ発現に基づいて均一集団に分類した。形質導入されたＤＣ上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの発現レベルを、抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体で染色することによって推定し、新鮮に単離された腹腔マクロファージ上でのレベルに類似していることが見出され、したがって、生理学的発現範囲内である（図１６）。次いで、分類されたＢＭＤＣを使用して、ＯＶＡペプチドの存在下で、ＯＶＡ特異的遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＯＴＩＩ）を刺激した（図１５Ｄ）。その中で、ＢＭＤＣ上でのＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡの発現が、同族ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖性応答を抑制したことが示される。この結果は、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ−Ｉｇ融合タンパク質およびＣＨＯ−ＡＰＣ細胞を用いた先のデータと一致しており、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡがＴ細胞媒介性免疫応答を抑制することを示唆する。

【0320】

実施例４：多発性硬化症動物モデル（ＥＡＥ）における抗ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ抗体の評価
〔００３４４〕□ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡモノクローナル抗体が、インビボでＴ細胞応答を抑制するようであったため、□ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡを試験して、それがＴ細胞媒介性自己免疫疾患を阻害することができるかを評価した。実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて、炎症性疾患への□ＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体の機能的影響を決定した。ＥＡＥは、広く使用されているヒト自己免疫疾患多発性硬化症のマウスモデルである。ＥＡＥを、アジュバント中でのミエリン抗原での免疫化またはミエリン特異的Ｔ細胞の養子免疫伝達のいずれかによって誘導することができ、種々のエフェクターＴ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージの炎症性浸潤物、ならびに中枢神経系の脱髄をもたらす。

【0321】

〔００３４５〕 外来抗原として大量のモノクローナル抗体の流入によるアナフィラキシーの誘導を回避するために、αＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体を、受動的ＥＡＥモデルにおいて試験した。この養子免疫伝達ＥＡＥモデルにおいて、ドナーＳＪＬマウスを、ＣＦＡおよびＰＬＰペプチドで免疫した。１０日目に、全てのリンパ球を流入領域リンパ節から単離し、ＰＬＰペプチド、ＩＬ−２３（２０ｎｇ／ｍＬ）、および抗ＩＦＮｇ（１０μｇ／ｍＬ）で４日間インビトロ培養した。その後、拡張したＣＤ４Ｔ細胞を精製し、ナイーブレシピエントマウスに養子導入した。この分析は、αＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体が疾患発症を遅延させ、かつ疾患の重症度を低下させ、それによって、疾患の進行曲線を著しく変化させたことを示す（図１７）。加えて、それは、かなりの割合のマウスにおいて重症度を低下させ、生存率を約２２％から７５％を超えて大幅に増加させた。これは、ＥＡＥにおけるαＰＤＬ−Ｌ３モノクローナル抗体の活性がインビトロデータと一致していることを実証しており、種々の炎症性疾患における新規の免疫制御試薬としてのこの試薬の使用を実証する。

【0322】

〔００３４６〕 実施例５：ＣＮＳにおけるＶＩＳＴＡの発現
〔００３４７〕 ＣＮＳにおけるＶＩＳＴＡの発現ももたらされた。これらのアッセイは、疾患を有するマウスにおいて、ＶＩＳＴＡ発現がＣＤ１１ｂ＋細胞上で著しく低下し（７６％から３３％）（図２３）、ＶＩＳＴＡの喪失が強化された炎症に対して許容的であり得るという仮定に一致することを明らかにした。これは興味深く、極度に高いレベルのＶＩＳＴＡを発現する腫瘍において、本明細書の炎症性骨髄性細胞を、ＭＤＳＣと対比するときに機能的に重要である可能性が高い。ＥＡＥマウスが、Ｔ細胞活性化を強力に抑制し、疾患３２を和らげ得る、増加した数の骨髄由来の抑制因子細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ−６Ｃ高ＭＤＳＣ）を脾臓中に有することが報告されている。我々のデータは、ＶＩＳＴＡ
がＥＡＥにおいて骨髄性媒介性抑制の役割を果たし得るという仮定を強く支持する。

【0323】

〔００３４８〕 実施例６：ＥＡＥにおけるＴ細胞の運命および機能へのＶＩＳＴＡの影響
〔００３４９〕 我々は、ＥＡＥにおけるＴ細胞の運命および機能へのＶＩＳＴＡの影響をアッセイする実験も行った。我々は、ＶＩＳＴＡが、病原性脳炎誘発性Ｔ細胞の発生、クローン性Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞極性、寿命、およびＴｅｆｆからＴｒｅｇへの変換を変化させるかを評価することを望んだ。我々は、ＥＡＥにおけるＴ細胞の運命へのＶＩＳＴＡ遮断の影響を研究した。より高い疾患スコアに一致して、疾患経過終了時のＣＮＳの分析は、１３Ｆ３（□ＶＩＳＴＡ）処理群においてより著しいＩＬ１７Ａ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤（０．６６から１１％）を確認した（図２４）。

【0324】

〔００３５０〕 実施例７：ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ遺伝子導入およびノックアウトマウス
〔００３５１〕 胎児のレンチウイルス感染を用いて、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡを普遍的に発現する４匹の遺伝子導入マウスを産生した。これらのマウスは、ヒト伸長因子１プロモーターの制御下で、全長ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡを発現する。これらのマウスを、レンチウイルスベクターｐＷＰＴを用いて生成した。他のＰＤ−Ｌ１ファミリーの成員（Ａｐｐａｙ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：５９５４−８）と同様に、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡが、αＣＤ３Ｔ細胞増殖をインビトロで共刺激するように機能しながら、負の制御因子としてインビボで機能することが予期される。この点において、これらのマウスが自己免疫を自発的に発現することが予想され、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ遺伝子導入マウス（すなわち、体液性免疫応答、Ｔ細胞プライミング等）におけるインビボ免疫応答を評価して、全身性自己免疫疾患の発現を評価する。

【0325】

〔００３５２〕 ノックアウトマウスでは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡは、相同組換えによって不活性化される。全長ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ配列を含有するＢＡＣクローンを、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥ（商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡを標的とするベクターを、ネオマイシン遺伝子の上流にあるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ遺伝子の第２のエクソンの５’末端に配置される１．６ｋｂフラグメント、およびネオマイシン遺伝子の下流にあるＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴ遺伝子の第３のエクソンの３’末端に配置される５ｋｂフラグメントを挿入することによって生成した。Ｂ６由来の胚幹（ＥＳ）細胞を、ベクターを標的化するＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡで電気穿孔し、組換えクローンを選択する。次に、選択されたクローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入し、結果として生じるキメラ雄子孫をＦＬＰ有害マウスと交配させて、ネオマイシンカセットを除去する。子孫における標的化対立遺伝子の伝送を、ゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲによって決定する。第２および第３のエクソンは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡドメインを含有し、したがって、結果として生じるマウスは、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ分子の不活性化形態のみを有する。

【0326】

〔００３５３〕 抗原へのＴ細胞応答の評価、体液性免疫応答、顕性自己免疫（例えば、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患）、および誘発性自己免疫疾患（実験的自己免疫性脳脊髄炎）に対する増加した感受性を含む、ＰＤ−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ欠乏マウスの全体的な免疫能力を、他のＰＤ−Ｌ−／−マウスを用いて決定する（Ｃｈｅｎ（２００４）上記参照）。

【0327】

〔００３５４〕 実施例８：コラーゲン誘導関節炎動物モデルにおいて試験されたＰＤ
−Ｌ３もしくはＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ特異的抗体
〔００３５５〕 図１８の実験に示されるように、雄ＤＢＡ／１Ｊマウスを、それらのテールの根元で、ＣＦＡ（ヒト型結核菌３．５ｍｇ／ｍＬ）中の１００μｇニワトリＩＩ型コラーゲン（Ｃ−ＩＩ）を含有する１００μｇのエマルジョンで免疫し、免疫後２１日目にＩＰを１００μｇの水性Ｃ−ＩＩで追加免疫した。それぞれの治療群（ｎ＝６）のマウスは、示されるように、処置されていないマウス（ＮＴ−黒色の円）、３００μｇのハムスターＩｇＧを注入したマウス（Ｈａｍ Ｉｇ−黒色の四角形）、または３００μｇのモノクローナル抗体「７ｃ９」を注入したマウス（赤色の三角形）もしくは「１３Ｆ３」を注入したマウス（緑色の三角形）のいずれかであった。注入物を２日間毎に与えた。それぞれのマウスのそれぞれの手の関節の腫脹を、指示された日に０〜４のスケールでスコア化した。示される関節炎スコアは、それぞれの治療群におけるマウスの全ての手の合計スコアを群内のマウスの数で割ったスコアである。

【0328】

〔００３５６〕 実施例９：特定のＶＩＳＴＡモノクローナル抗体によるＶＩＳＴＡ遮断は、インビトロでのＴ細胞応答を強化する
〔００３５７〕 ＶＩＳＴＡ媒介性抑制を中和するＶＩＳＴＡ特異的モノクローナル抗体（１３Ｆ３）を特定した（図１９）。ＣＤ１１^高骨髄性ＡＰＣを未処理のマウスから精製し、１３Ｆ３の存在下または不在下でＯＴ−ＩＩ遺伝子導入ＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激した。その中和作用に一致して、１３Ｆ３は、ＣＤ１１^高骨髄性細胞によって刺激されたＴ細胞増殖を強化し、高レベルのＶＩＳＴＡを発現することを示した。

【0329】

〔００３５８〕 実施例１０：抗ＶＩＳＴＡは、抗腫瘍免疫を強化する
〔００３５９〕 Ｔ細胞活性化を強化する抗ＶＩＳＴＡの能力のため、我々は、抗ＶＩＳＴＡが免疫原性腫瘍への保護的免疫応答を強化するかを評価した。我々が豊富な経験を有するモデルは、膀胱癌腫、ＭＢ４９である。ＭＢ４９は、男性抗原を発現し、したがって、雌マウスにおいて軽度に免疫原性であるが、免疫介入がなければ、増殖し、雌マウスを死滅させる。□ＶＩＳＴＡ治療の有効性を試験するために、雌マウスに、ＭＢ４９腫瘍細胞を皮下に投与（皮下投与）し、□ＶＩＳＴＡで処置した。その数日後、マウスを安楽死させるまで腫瘍の寸法を測定した。図２０において容易に見ることができるように、抗ＶＩＳＴＡ治療は、腫瘍成長を大いに低下させる。これは、細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を強化する抗ＶＩＳＴＡの能力に起因すると考えられる。

【0330】

〔００３６０〕 実施例１１：４匹のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍退縮への□ＶＩＳＴＡの効果
〔００３６１〕 免疫原性膀胱癌腫瘍ＭＢ４９における実験は、モノクローナル抗体 １３Ｆ３を用いたＶＩＳＴＡの中和が、宿主を腫瘍成長から保護することを示している。データは、ＶＩＳＴＡが、ＭＤＳＣを非常に高度に発現するため、腫瘍の微環境においてかなりの負の免疫制御の役割を果たすことを示す。免疫原性（ＭＢ４９）および高度に非免疫原性（Ｂ１６）の腫瘍モデルの成長への抗マウスＶＩＳＴＡの効果を試験する研究はさらに、αＶＩＳＴＡ治療の有効性を確認し、作用機序を明らかにし、最適な用量およびタイミングを選択するための基準を提供する。それぞれの腫瘍モデルについての論理的根拠が以下に詳述される。

【0331】

【表2】

【0332】

〔００３６２〕 雌マウスにおけるＭＢ４９：我々は、このマウスモデルにおける有効性をすでに示した。このモデルのＭＤＳＣは、上昇したレベルのＶＩＳＴＡも発現する（図示されず）。このモデルにおいて、Ｈ−Ｙ抗原の存在のため、ＭＢ４９腫瘍は、適度に免疫原性である。抗ＶＩＳＴＡ治療が効果的であることが判明しているため、我々は、このモデルを「陽性」対照として使用して、抗ＶＩＳＴＡ治療の投与（１〜１００μｇのマウス；およびタイミング（腫瘍接種の日、または腫瘍の４、７、１０日後；治療的介入）を決定する。

【0333】

〔００３６３〕 雄マウスにおけるＭＢ４９：雌マウスに効果的な用量およびタイミングを用いて、（腫瘍の免疫原性がより低い）雄マウスにおける抗ＶＩＳＴＡ治療の有効性を決定する。

【0334】

〔００３６４〕 Ｂ１６黒色腫：抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体がこのモデルにおいて非常に効果的であることが示され、かつマウスモデルがヒトにおける成功を予測するのに有益な非免疫原性腫瘍を表す。投与計画およびタイミングは、ＭＢ４９モデルにおいて効果的であると示された投与計画およびタイミングに類似している。

【0335】

〔００３６５〕 ＩＤ８卵巣癌：ＶＩＳＴＡ発現がＭＤＳＣ上では非常に高度であることが示されたのはこのモデルにおいてである。ＩＤ８腫瘍を有するマウスを、腫瘍接種時、または接種後５日目、１５日目、２５日目にαＶＩＳＴＡで治療する。

【0336】

〔００３６６〕 方法。
Ｂ６ ＷＴマウスを使用して、上記の全てのマウス腫瘍モデルの寛解に最適な抗ＶＩＳＴＡ治療の用量およびタイミングを決定する。使用するモデルは、上の表に列記されている。

【0337】

〔００３６７〕 この用量およびタイミングアッセイの読み出しは、腫瘍成長動態である。ＭＢ４９およびＢ１６の研究について、全ての腫瘍研究を、皮内（ｉ．ｄ．）接種を介して行い、したがって腫瘍の大きさを容易に測定することができる。腫瘍の測定結果を、カリパスを用いて２〜３日毎に収集する。これらのモデルのそれぞれにおいて、抗ＶＩＳＴＡまたは対照抗体の影響を、腫瘍成長を遅延させるか、または腫瘍退縮を促進する能力について試験する。ルシフェラーゼ形質導入ＩＤ８を用いてＩＤ８の成長を行い、ＩＶＩＳ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて全身造影を行う。加えて、宿主生存も決定する。

【0338】

〔００３６８〕 腫瘍成長についてのデータを、平均腫瘍容積±標準誤差として表し、群の間の差異を、両側ＡＮＯＶＡによって分析する。０．０５未満の確率（ｐ）値を、統計的に有意であると見なす。生存データを、群の間の生存の差異の有意性を検証するために使用するウィルコクソン順位検定およびｌｏｇ順位検定を伴うカプラン・マイヤー法を
用いて分析する。Ｂ１６モデルにおいて、白斑を発現するマウスの頻度を決定する。

【0339】

〔００３６９〕 これらの方法を用いて、非免疫原性腫瘍モデルのうちのいくつかのうちの対照抗体で治療されるマウスと比較して、抗ＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体で治療されるマウスにおける遅延した腫瘍成長および／または腫瘍退縮を得る。抗ＶＩＳＴＡ治療が免疫原性腫瘍モデルにおける腫瘍成長を遅延させることはすでに示されている。これらの腫瘍モデルのそれぞれが、それら独自の特定の成長動態、および腫瘍成長を与え、かつ免疫を抑制する予想されるＶＩＳＴＡへの依存を有するとして、マウスに、腫瘍接種時または腫瘍接種後のいずれかの時点でモノクローナル抗体を投与する。さらに、少なくとも３つの異なる濃度のｕｍＶＩＳＴＡモノクローナル抗体を試験して、治療的有用性に最適な用量を決定する。

【0340】

〔００３７０〕 図２１Ａ〜Ｅに示されるように、ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体処置は、マウスを、Ａ．ＭＢ４９、Ｂ．ＭＣＡ１０５、もしくはＣ．ＥＧ７腫瘍細胞を皮下投与、またはＤ．Ｄ８−ルシフェラーゼ腫瘍細胞を腹腔内投与のいずれかで接種し、＋１日目から１日おきにＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体１３Ｆ３で処置した（３００μｇ）、これらの４つの全ての腫瘍モデルで腫瘍成長を低下させた。皮下腫瘍成長を監視した。ＩＤ８−ルシフェラーゼ腫瘍について、マウスを、３０日目にＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳを用いて撮像した。Ｅ．腫瘍を有するマウスにおける骨髄性白血球上でのＶＩＳＴＡ発現も決定した。流入領域リンパ節および腫瘍組織（腹水）を、ＶＩＳＴＡ発現について分析した。これらの所見は、ＶＩＳＴＡ上で発現されるＭＤＳＣが、保護抗腫瘍免疫の発達を妨害する主要な抑制分子であり、□ＶＩＳＴＡがこの抑制活性を解除して、免疫介入を可能にし、かつ腫瘍成長を遅延させることを示す。これらの所見は、自己免疫疾患における骨髄性細胞上のＶＩＳＴＡが、炎症の程度を制御する際に極めて重要な機能を果たすという結論も支持する。

【0341】

〔００３７１〕 実施例１２：自己免疫治療に有用なオリゴマーＶＩＳＴＡおよびＶＩＳＴＡ融合タンパク質の合成
〔００３７２〕 インビトロでの可溶性ＶＩＳＴＡ−Ｉｇは抑制性ではなく、細胞への結合を容易に検出することもできない。対照的に、プラスチックに結合されるこの分子は、大いに抑制性である。加えて、インビボでＶＩＳＴＡ−Ｉｇを用いた研究は、明白な活性を示さなかった（データ示されず）。これらの研究に関して、作成されたＶＩＳＴＡ−Ｉｇは、ＦｃＲ結合を妨げるＣＨ２−ＣＨ３ドメインにおける変異を有し、したがって、インビボでは細胞親和性ではない。最近の研究は、四量体ＰＤ−Ｌ１が、単量体ＰＤ−Ｌ１２６よりも１００倍高く（Ｋｄ６×１０−８Ｍ）ＰＤ−１に結合し、細胞への結合が容易に検出可能であったことを示している。四量体ＰＤ−Ｌ１をインビボで試験しなかったが、インビトロで、天然ＰＤ−Ｌ１で機能的抑制をブロックすることが示された。類似した方法を用いて、ＶＩＳＴＡ経路を標的化し、かつインビトロおよびインビボで強力な免疫抑制活性を誘発するオリゴマーを作製する。

【0342】

〔００３７３〕 かかるオリゴマーを、ＶＩＳＴＡまたはそのフラグメント、例えば、細胞外ドメインまたはその部分がオリゴマーの構成要素として使用される少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、もしくは２００アミノ酸長の単量体細胞外ドメインを用いて構築する。これらの方法において、本発明者は、確立したＭＨＣ四量体技術を利用する。これらの方法において、二価から七価に及ぶ結合価を有する一連のＶＩＳＴＡ複合体を生成するために、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン構築物またはフラグメントを、（上で同定された）様々なオリゴマー化ドメインのＮ末端に結合させる。

【0343】

〔００３７４〕 これによって、二量体、三量体、四量体、五量体、および七量体会合体の安定した形成を指向する高親和性コイルドコイルドメインに基づいて、一連の非共有
オリゴマーを作成する。これらのオリゴマー構築物を、宿主細胞、例えば、大腸菌において発現させる。大腸菌における発現が達成されたとき、次いで、発現したオリゴマーを再び折り畳み、標準の研究室プロトコルを用いて封入体から精製する。このアプローチは、生物学的および構造的分析のために、ＭＨＣ−ペプチド複合体および三量体ＧＩＴＲＬ６６を含む上質の物質を日常的に産生している。次いで、単離オリゴマータンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析的ゲル濾過、分析的超遠心分離、および質量分析によって評価する。これらの品質管理手段は、インビトロおよびインビボ研究のための均質で十分に特徴づけられた物質の利用能を確実にする。それぞれの個々のＶＩＳＴＡ複合体が、ＶＩＳＴＡ受容体に結合される細胞表面と生産的に相互作用するよう配置されるため、これらの構築物の並列構成は、結合価がオリゴマー状態に等しい分子をもたらす。上記の構築物は、オリゴマー状態の高度の安定性および均質性を有する（非共有コイルドコイルオリゴマー化ドメインは、９５℃の融解温度を呈する七量体配列を除いて、典型的には、１００℃を超える融解温度を呈する）。

【0344】

〔００３７５〕 加えて、細胞親和性または非細胞親和性のいずれかの二量体ＶＩＳＴＡ−Ｉｇを四量体化する。ＩｇＧ１ ＦｃとインフレームのＶＩＳＴＡのＦｃ融合構築物（野生型ＩｇＧ１および既存の非ＦｃＲ結合ＩｇＧ１の両方）を、酵素的ビオチン化のためにＮ末端ＢｉｒＡ部位で修飾し、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターにクローニングする。酵素的ビオチン化は、アビジン多量体化の際に、特定の単一残基修飾および配向を可能にする。このアプローチは、Ｂ７−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＴＩＭ−３を含む多数のＩｇ−融合タンパク質の生成のために使用されている。発現したタンパク質を、その後、インビトロで酵素的にビオチン化し、サイズ排除ＨＰＬＣによって精製し、ＰＥ−アビジンを用いて四量体化する。結果として生じる細胞親和性または非細胞親和性の四量体をインビボで評価する。

【0345】

〔００３７６〕 これらの改変された多量体ＶＩＳＴＡタンパク質は、自己免疫および他の状態を治療する際に有用であり、ＶＩＳＴＡ経路における介入および免疫抑制を治療的に正当化する。

【0346】

〔００３７７〕 実施例１３：免疫抑制を誘導するためのＶＩＳＴＡアデノウイルスベクター
〔００３７８〕 組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いた遺伝子導入は、遺伝子治療における大きな技術的発展をもたらしている。特に、ＰＤ−Ｌ１遺伝子、またはＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＤ４０−ＩｇのＡＡＶを介した遺伝子送達は、ループスおよび心臓移植の自己免疫疾患モデルにおける治療的有効性を達成している。これらの方法を使用して、全長ＶＩＳＴＡまたはオリゴマーＶＩＳＴＡ細胞外ドメインのいずれかを送達し、それらの治療効果を、ＥＡＥモデルにおいて評価する。全長マウスＶＩＳＴＡまたはオリゴマーＶＩＳＴＡ細胞外ドメインのいずれかを発現する組換えアデノウイルスベクターを、Ａｄｅｎｏ−ＸＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者の指示に従って作成する。簡潔に述べると、ＶＩＳＴＡを、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で、Ｅ１およびＥ３を欠失したｐＡｄＤＥＳＴ系発現ベクターにクローニングする。次いで、アデノウイルスを発現するＶＩＳＴＡおよび対照ｌａｃＺを、細胞溶解物から精製する。ＶＩＳＴＡの体系的過剰発現について、アデノウイルスを、免疫化を介する疾患誘導の前もしくは直後、または疾患発症後のいずれかの時点で、静脈内尾静脈注入（１×１０９プラーク形成単位［Ｐｆｕ］）によってマウスに投与する。対照マウスは、１００μｌのＰＢＳを受ける。疾患の発症および変化を、異なる疾患進行パターンを呈し、かつヒトＭＳ患者の臨床症状の２つのはっきりと異なる形態を表すＳＪＬマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方で監視する
〔００３７９〕 実施例１４：改変されたタンパク質およびアデノウイルスベクターでの機能的研究
〔００３８０〕 マウスに、改変されたＶＩＳＴＡおよび／またはアデノウイルスベクターも投与する（１匹のマウスにつき５〜１００μｇのタンパク質を週に３回）。投与後、Ｔ細胞増殖、分化、ならびにＥＡＥ発現を決定する。

【0347】

〔００３８１〕 実施例１５：ＶＩＳＴＡの構造的研究およびＶＩＳＴＡ機能分子決定因子の決定
〔００３８２〕 組織化されたシグナル伝達複合体の親和性、特異性、オリゴマー状態、ならびに形成および局在化は、免疫機能への重要な寄与因子である。受容体−リガンド細胞外ドメインの組織化が、非共有結合した細胞質シグナル伝達および足場分子の動員、組織化、および機能を直接制御するため、これらの特性の全てが、シグナル伝達および免疫制御に影響を与える。ＶＩＳＴＡの高分解能結晶構造を、細菌、昆虫、および哺乳類発現系、ならびにハイスループット結晶化および構造決定アプローチを含む技術を用いて決定する。結晶学的に観察されたジスルフィド結合パターンを実証するために、我々の公開されたΤＩΜ−３およびヒトＤｃＲ３５９の研究の支持に成功したアプローチを用いて、高分解能質量分析を活用する。これらの構造結果に基づいて、変化したオリゴマー特性を有する一連の変異体、ならびにＶＩＳＴＡ ＩｇＶドメインの任意の摂動領域の近くの変異体を設計する。これらの変異体タンパク質は、ＶＩＳＴＡ機能へのさらなる直接的な機構的洞察を提供し、本明細書で特定される自己免疫、アレルギー性、および炎症性疾患等の免疫抑制が所望される治療薬において有用であるはずである。これらの変異体、特に、オリゴマーを、インビトロ系で試験し、疾患の進行、疾患の寛解、または動物を自己免疫もしくは炎症状態の発現から保護することへの免疫抑制効果を評価するために、動物自己免疫および炎症性疾患モデルにおいて評価する。

【0348】

〔００３８３〕 これらのオリゴマーＶＩＳＴＡタンパク質は、自己免疫における免疫介入の標的として、ＶＩＳＴＡ経路および機能を活性化する。この介入は、免疫を抑制し、自己免疫性抑制が所望される自己免疫疾患および他の状態への治療的有用性を発揮する。これは、ＥＡＥおよびコラーゲン誘導関節炎動物モデル等の異なる自己免疫および炎症性モデルに、オリゴマー化ＶＩＳＴＡタンパク質を投与することによって達成される。加えて、上述のように、全長ＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡオリゴマーを過剰発現するアデノウイルスベクターが、インビボで構築および試験される。これらの研究は、ＶＩＳＴＡオリゴマーの免疫抑制効果を裏付ける。

【0349】

〔００３８４〕 実施例１６：条件付きの過剰発現ＶＩＳＴＡ遺伝子導入マウス株（ＶＩＳＴＡ遺伝子導入マウス株：Ｒ２６ＳｔｏｐＦＬ ＶＩＳＴＡ（ＶＩＳＴＡ））を用いた実験
〔００３８５〕 ｌｏｘＰに隣接したＳＴＯＰカセットに先導されるＶＩＳＴＡの全長ｃＤＮＡを含有する標的構築物は、普遍的に発現されるＲＯＳＡ２６遺伝子座に標的化されている。複数の正しく標的化されたＲ２６ＳｔｏｐＦＬ／−ＶＩＳＴＡ子マウスが産まれ、繁殖させてＣＭＶ−Ｃｒｅ欠失株６０にする。ＶＩＳＴＡ×ＣＭＶ−ｃｒｅにおける予備データは、ＧＦＰおよび高まったＶＩＳＴＡ発現を確認する。これらのマウスの免疫状態（抗原へのＴ細胞応答、抗体力価等）に関する研究は、抑制された表現型を確認する。ＶＩＳＴＡ株を、ＣＤ４−ｃｒｅ、ＣＤ１１ｃ−ｃｒｅ、およびＬｙｓ−Ｃｒｅと異種交配させて、ＶＩＳＴＡ発現の系統位置が抑制に影響を与えるかを決定する。Ｔ細胞の表現型および機能は、ＶＩＳＴＡの過剰発現がＴｒｅｇの生成をもたらすかも決定する。これらの研究において、ＯＶＡ−免疫ｃｒｅ×ＶＩＳＴＡ株由来のＴｒｅｇを、ＷＴ宿主に養子導入して、抗原免疫化が、過剰発現されたＶＩＳＴＡの存在下で、抗原特異的Ｔｒｅｇを誘導するかを確かめる。これは、ＶＩＳＴＡがＴｒｅｇ分化に影響を与えることを検証するはずである。

【0350】

〔００３８６〕 加えて、研究をＥＡＥモデルにおいて達成し、それによって、疾患発
現に対するＶＩＳＴＡタンパク質の異なる系列への影響（ＣＤ４−、ＣＤ１１ｃ−、Ｌｙｓ−ｃｒｅで異種交配することによる）を評価する。疾患を、ＶＩＳＴＡ変異体の系列限定過剰発現によって、またはＣＭＶ×ＶＩＳＴＡ変異体において抑制することができると想定して、疾患発現の時間的制御も、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２×ＶＩＳＴＡ□を使用している。タモキシフェンの投与を介して、疾患発症の前もしくは疾患発症時、または疾患のピーク時に、ＶＩＳＴＡの過剰発現を誘導して、ＶＩＳＴＡが、免疫の誘導および／またはエフェクター相に影響を与えることができるかを決定することができる。ＢＭキメラマウスを用いて、ＶＩＳＴＡの時間的に限定された過剰発現を、造血コンパートメントに限定することができる。時間窓の制御を理解するために、ＶＩＳＴＡを過剰発現させ、ＶＩＳＴＡを遺伝的にオンにし、その後、抗ＶＩＳＴＡ モノクローナル抗体の投与で血清学的にオフにする。これらの研究は、自己免疫疾患の発現および進行を制御するために、ＶＩＳＴＡがいつ、どこで作用しなければならないかを決定する。

【0351】

〔００３８７〕 実施例１７：抗ＶＩＳＴＡ抗体ＣＤ４０／ＴＬＲアゴニストワクチンの効果
〔００３８８〕 図２２に示されるように、ワクチン有効性への抗ＶＩＳＴＡ抗体の効果を分析する実験を行った。これらの結果は、抗ＶＩＳＴＡが、ＣＤ４０／ＴＬＲワクチンの治療的有効性を強化することを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１Ｘ１０５転移性Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞に皮下曝露した。４日後に、マウスに、抗ＶＩＳＴＡ（２００ｕｇを週に３回）を伴い、または伴わずに、１００μｇの腫瘍関連抗原△Ｖ、１００μｇのαＣＤ４０ ＦＧＫ４５（ＣＤ４０アゴニスト抗体）、および１００μｇのＳ−２７６０９（ＴＬＲ７アゴニスト）でワクチン投与した。腫瘍の成長をカリパス測定によって監視した。

【0352】

〔００３８９〕 本発明を説明したが、以下の特許請求の範囲が提供される。これらの特許請求の範囲は、本明細書に記載の全ての一般、および特定の特徴、ならびに言い回しとして、中に収まり得る範囲の全ての記述を網羅するよう意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A-1】

【図4A-2】

【図4A-3】

【図4B】

【図4C-1】

【図4C-2】

【図4C-3】

【図4D】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]