特許 6176392 自己切断カセットを含むタンパク質精製方法及びこれの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6176392

(24)【登録日】2017年7月21日

(45)【発行日】2017年8月9日

(54)【発明の名称】自己切断カセットを含むタンパク質精製方法及びこれの用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20170731BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20170731BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20170731BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170731BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170731BHJP

   C12N 9/52 20060101ALI20170731BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20170731BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20170731BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C07K16/00

   C07K14/00

   C12N15/00 A

   C12N1/21

   C12N9/52

   C07K7/06

   C12P21/02 C

   A61P35/00

   A61K39/395 L

   A61K47/68

【請求項の数】30

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2016-510621(P2016-510621)

(86)(22)【出願日】2014年4月25日

(65)【公表番号】特表2016-519118(P2016-519118A)

(43)【公表日】2016年6月30日

(86)【国際出願番号】KR2014003639

(87)【国際公開番号】WO2014175690

(87)【国際公開日】20141030

【審査請求日】2015年12月16日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0046322

(32)【優先日】2013年4月25日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517224746

【氏名又は名称】アブトラス カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡｂＴＬＡＳ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100185915

【弁理士】

【氏名又は名称】長山 弘典

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(72)【発明者】

【氏名】ソン， ビョン ドー

(72)【発明者】

【氏名】ユン， ジー スン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ， ヒョ ジュン

(72)【発明者】

【氏名】キム， ヘ イン

(72)【発明者】

【氏名】リー， ユン−ソク

【審査官】 伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０３２１１８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０５１９７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１６−５１１２７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Protein Expression and Purification，2004, Vol.37, pp.253-263

【文献】 Biotechnology Letters，2010, Vol.32, pp.1-10

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）目的タンパク質と、
（ｉｉ）下記の配列式Ｉのペプチドと、
（ｉｉｉ）ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）切断機能ドメインと、
（ｉｖ）タグと、を含む、自己切断融合タンパク質として、前記（ｉ）乃至（ｉｖ）は、融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシル末端順序で存在することであり、前記（ｉｉ）下記配列式Ｉのペプチドと前記（ｉｉｉ）ソルターゼＡ切断機能ドメインとの間にペプチドリンカーを更に含み、前記ペプチドリンカーは、Ｓａ（ＳＧ４）ｎ（ＧＧＳＳＲＳＳ）ＧｂＳｃのアミノ酸配列からなるもので、前記Ｓａ（ＳＧ４）ｎ（ＧＧＳＳＲＳＳ）ＧｂＳｃのアミノ酸配列でＳはセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、Ｒはアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）であり、ａは０乃至５、ｂは０乃至５、ｃは０乃至５、ｎは０乃至１０である自己切断融合タンパク質：
［配列式Ｉ］
Ｌ−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｇ，
前記配列式Ｉで，Ｌはロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）であり、Ｐはプロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）であり、Ｘは任意のアミノ酸で、Ｔはトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）である。

【請求項2】

前記Ｘは、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ、Ｅ）であることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項3】

前記ペプチドリンカーは、１９乃至４０個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項4】

前記ペプチドリンカーは、１９乃至２５個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項5】

前記ペプチドリンカーは、配列番号７のアミノ酸配列で構成されることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項6】

前記ソルターゼＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来ソルターゼＡであることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項7】

前記ソルターゼＡは、配列番号８のアミノ酸配列で構成されることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項8】

前記タグは、ポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）、ＧＳＴタグ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔａｇ）、ＨＡタグ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｔａｇ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇ）、キチン結合タンパク質タグ（Ｃｈｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇ）及び蛍光タグからなる群の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項9】

前記タグは、ポリヒスチジンタグであることを特徴とする請求項８に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項10】

前記ポリヒスチジンタグは、連続したヒスチジンが６乃至１２個であるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項９に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項11】

前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素及び抗体からなる群で選択されることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項12】

前記目的タンパク質は、抗体の軽鎖または、重鎖の全部または一部であることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項13】

前記目的タンパク質は、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）または重鎖可変領域（ＶＨ）であることを特徴とする請求項１２に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項14】

前記自己切断融合タンパク質は、配列番号１７または１８のアミノ酸配列で構成されることを特徴とする請求項１に記載の自己切断融合タンパク質。

【請求項15】

請求項１から請求項１４のいずれかに記載の自己切断融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項17】

請求項１６に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。

【請求項18】

前記細胞は、真核細胞または原核細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の形質転換された細胞。

【請求項19】

前記細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１８に記載の形質転換された細胞。

【請求項20】

前記大腸菌は、Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする請求項１９に記載の形質転換された細胞。

【請求項21】

（１）請求項１７に記載の細胞を培養して細胞溶解物を得る工程と、
（２）細胞溶解物から目的タンパク質を精製する工程と、を含む、目的タンパク質の精製方法。

【請求項22】

前記目的タンパク質を精製する工程（２）は、
（ａ）細胞溶解物を融合タンパク質に存在するタグと結合するコラムに注入する工程と、（ｂ）コラムを洗浄する工程と、
（ｃ）カルシウム及びトリグリシンからなる群中で選択された一つ以上を含む切断−バッファーで平衡化させて切断反応させる工程と、
（ｄ）コラムから切断−バッファーを収得してタグが除去された目的タンパク質を収得する工程と、を含むことを特徴とする請求項２１に記載の目的タンパク質の精製方法。

【請求項23】

前記工程（ｃ）で，切断−バッファーは、少なくともトリグリシンを含むことを特徴とする請求項２２に記載の目的タンパク質の精製方法。

【請求項24】

前記工程（ｃ）で，切断−バッファーは、カルシウム０．１乃至１０ｍＭ及びトリグリシン０．１乃至１０ｍＭを含むことを特徴とする請求項２２に記載の目的タンパク質の精製方法。

【請求項25】

前記工程（ｃ）で，切断−バッファーは、カルシウム０．２乃至５ｍＭ及びトリグリシン０．２乃至５ｍＭを含むことを特徴とする請求項２４に記載の目的タンパク質の精製方法。

【請求項26】

（１）請求項１に記載の融合タンパク質とトリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）をカルシウムを含む切断−バッファー内で反応させて、目的タンパク質にトリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）を接合させる工程と、
（２）切断−バッファーを収得して、タグが除去された目的タンパク質とトリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）接合体を収得する工程と、を含む、治療用抗体−薬物結合体の製造方法。

【請求項27】

前記工程（１）で、切断−バッファーは、カルシウム０．１乃至１０ｍＭを含むことを特徴とする請求項２６に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。

【請求項28】

前記工程（１）で、切断−バッファーは、トリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）５００ｎＭ乃至１ｍＭを含むことを特徴とする請求項２６に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。

【請求項29】

前記工程（１）で、接合させる時間は、３乃至１６時間であることを特徴とする請求項２６に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。

【請求項30】

前記目的タンパク質は、癌細胞表面抗原に対する抗体であることを特徴とする請求項２６に記載の治療用抗体−薬物結合体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アミノ末端から目的タンパク質、ＬＰＸＴＧのアミノ酸配列からなるペプチド、ソルターゼＡ切断機能ドメイン及びタグの順序で含む自己切断融合タンパク質、これをコードする核酸、本発明の核酸を含む発現ベクター、及び本発明の発現ベクターで形質転換された細胞に関する。また、本発明は、前記形質転換された細胞を培養して、溶解及び精製する工程を含む目的タンパク質の精製方法及び前記方法を利用した治療用抗体−薬物結合体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

最近遺伝子工学及び生物学の発展により特定タンパク質を大量生産または収得して、各種産業及び疾病の治療などに使おうとする試みが盛んに行われている。これにより、所望のタンパク質を収得するためのタンパク質の組合せ技術、大量生産技術及び精製技術などが重点的に開発されている。

【0003】

多くの場合、人々が必要とする目的タンパク質は、これを発現するベクターで形質転換された細胞を培養して所望のタンパク質を発現させて生産されることができる。場合によっては、このようなタンパク質は、真核細胞、原核細胞などで発現され、特別な場合には形質転換された植物や形質転換された動物で発現されることができる。例えば、乳を分泌する形質転換された動物で発現されて、形質転換動物の乳を介して目的タンパク質を収得するなどの方法などが試みられている。この場合、細胞培養物または乳から所望のタンパク質を分離精製することができる。

【0004】

別途の分泌を介した目的タンパク質収得方法を持たない動・植物や微生物でタンパク質を発現させる場合には、まず貯蔵器官や細胞内部からタンパク質を抽出する過程が必要になる。このような形質転換細胞から目的タンパク質を収得する作業は容易ではない。そこで、収得を容易にするために、目的タンパク質を天然型でないタグ（ｔａｇ）を含む形態で組換える方法が多く使われている。

【0005】

精製のためにタグ（ｔａｇ）を利用する方法は、様々なタンパク質精製技術のうち非常に高い効率性を示す方法の一つで、この時使われるタグは大きくペプチドタグとタンパク質タグに分かれる。ペプチドタグは、短いアミノ酸からなうもので、代表的にはヒスタグ（ｈｉｓ−ｔａｇ、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ）があって、特にヘキサヒスチジンタグ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ、Ｈｉｓ６−ｔａｇ）が多く使われる。ヒスチジンペプチドは、ニッケルと特異的な化学的親和力を有していて、該当タグを含む融合タンパク質は、ニッケルを含むコラムによって高純度で精製されることができる。タンパク質タグは、特定成分に結合するタンパク質のドメインが持つ特徴などを利用するために、該当ドメインなどを含むタグである。代表的にはＧＳＴ−タグ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｔａｇ）がある。ＧＳＴタグはＧＳＴの基質であるグルタチオン固定媒介体にするコラムによって高純度で精製されることができる。

【0006】

前記のようなタンパク質精製のために、目的タンパク質に融合発現されたタグは、目的タンパク質自体の構造や機能を妨害できる危険が存在して、このようなタグを切り出した目的タンパク質を収得するための方法が考案されている。ただし、既存の方法はまずタグを含むタンパク質を収得した後、タグを切る過程、及び再び目的タンパク質だけを精製する過程が必要であった。このような過程の間、目的タンパク質は消失された、最終収得されるタンパク質の量が減って、該当過程のための費用及び時間も掛かり過ぎた。これにタグを利用したタンパク質精製方法の長所は残して、かつタグを切る過程での目的タンパク質の消失を最小化して、迅速にタンパク質を精製できる方法が必要であった。

【0007】

このような背景下、自己切断の機能を持つソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）タンパク質の切断機能ドメインと該当ドメインによって認識される切断部位配列を利用したタンパク質精製方法が開発された（Ｍａｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００４，３７（１）：２５３−６３）。ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ、６０−２０６ Ａ．Ａ．）は酵素であって、カルシウムとトリグリシンが存在する環境で切断部位配列（ＬＰＸＴＧ、Ｘは任意のアミノ酸）部位を認識してトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）とグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｇ）の間を切る触媒反応を起こす。既存のソルターゼＡを利用したタンパク質精製方法は、タグ−ｓｏｒｔａｓｅ Ａ（６０〜２０６Ａ．Ａ．）−ＬＰＸＴＧ−目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを製造して、宿主細胞でタンパク質を発現させた後、宿主細胞粉砕物をタグ結合コラムに結合させる工程、不純物除去する工程、カルシウム及び／またはトリグリシンを含む溶液を注入して反応させる工程、タンパク質を収得する工程によって、ただ一回のコラム使用で一度にタンパク質精製とタグ除去ができる方法である。しかし、このようなソルターゼＡ切断機能ドメインを利用した既存の方法は、目的タンパク質により、精製効率が低い問題点があった。
そこで、本発明では、ソルターゼＡ切断機能ドメインを結合させる方向構成及びソルターゼＡと切断配列との間にリンカー適用を介して既存の方法より優秀なタンパク質収得率を得ることができることを確認して、本発明を完成した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｍａｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００４，３７（１）：２５３−６３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の目的は、アミノ末端から目的タンパク質、ＬＰＸＴＧのアミノ酸配列からなるペプチド、ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）切断機能ドメイン及びタグの順序で含む自己切断融合タンパク質を提供するところにある。

【0010】

本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸及び前記核酸を含む発現ベクターを提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供するところにある。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】目的タンパク質がカルボキシル末端に存在する既存融合タンパク質に対する構造図（Ｉ）、目的タンパク質がアミノ末端に存在し、リンカーの長さを多様にした本発明融合タンパク質の構造図（ＩＩ〜ＩＶ）である。

【図2】ペプチドリンカーの最適化のために可溶性リンカーを追加（Ｉ）したり、螺旋形リンカーを追加（ＩＩ）した融合タンパク質の構造図である。

【図3】ペプチドリンカーの最適化のために電荷性リンカー（ＣＨリンカーまたはＡＨリンカー）を追加した融合タンパク質の構造図である。

【図4】リンカーの長さ、リンカーの追加の有無、タグを異なるようにした融合タンパク質の構造図である。

【図5】既存ソルターゼＡ自己切断カセットを利用した精製方法を図式化した図である。

【図6】発現ベクターを多種類にした時融合タンパク質の発現を確認するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシーブルー染色した図である。

【図7】既存ソルターゼＡ自己切断カセットを利用した精製方法を利用した時、タンパク質の発現（Ａ）及び切断された目的タンパク質（ａｎｔｉ−Ｍｙｃ）の精製の有無（Ｂの５、６ｌａｎｅ）を確認した図である。

【図8】本発明のソルターゼＡ自己切断カセットを利用した精製方法を図式化した図である。

【図9】本発明のソルターゼＡ自己切断カセットを含んでリンカーの長さを多様に（７、１８、２０Ａ．Ａ．）した発現ベクターを多様な大腸菌宿主細胞（Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）、及びＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換して融合タンパク質の発現程度を確認した図である。

【図10】多様なリンカーを持つ本発明の発現ベクターで形質転換された細胞をＬＢ（Ｌ）、ＳＢ（Ｓ）、２ｘＹＴ（Ｙ）培地で培養して発現（ＬＳ，ｌａｏｄｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ）、結合（ＦＴ，ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ、ＢＰ、ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び精製（ＣＰ、ｃｌｅａｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）程度を確認した図である。

【図11】切断−バッファーを最適化するためにカルシウム及びトリグリシンの有無及び濃度を多様にして切断タンパク質の収得率を比較した図である。

【図12】螺旋形リンカーを追加した場合に融合タンパク質の発現及び結合程度を確認した図である。

【図13】ソルターゼＡ切断機能ドメインとタグとの間に７Ａ．Ａ．可撓性リンカーを追加した場合（２−１または２−２）と、そうでない場合（１）の融合タンパク質の発現及び結合程度を確認した図である。

【図14】電荷性リンカー（ＣＨリンカーまたはＡＨリンカー）を追加した融合タンパク質の発現、結合及び精製程度を確認した図である。

【図15】既存ソルターゼＡ切断カセットを含む融合タンパク質、すなわち目的タンパク質をカルボキシル末端に含む融合タンパク質（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）と本発明のソルターゼＡ切断カセットを含む融合タンパク質、すなわち目的タンパク質をアミノ末端に含む融合タンパク質（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）の発現、結合及び精製程度を確認した図である。

【図16】目的タンパク質に薬物を接合させるための最適条件確立のために、トリグリシン−ビオチン結合体の濃度（Ａ）及び反応時間（Ｂ）を分析した図である。

【図17】「抗体−リンカー−ソルターゼ」が含まれた自己切断カセットを含む融合タンパク質とトリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）の接合反応を切断バッファー内で行って治療用抗体−薬物結合体（ＡＤＣ、ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を製造することに関する図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

【0013】

本発明では、前記目的を達成するための一つの様態として、目的タンパク質、ＬＰＸＴＧのアミノ酸配列からなるペプチド、ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）切断機能ドメイン及びタグを含む自己切断融合タンパク質を提供する。

【0014】

具体的には、本発明の自己切断融合タンパク質は、
（ｉ）目的タンパク質と、
（ｉｉ）下記の配列式Ｉのペプチドと、
［配列式Ｉ］
Ｌ−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｇ；
（ｉｉｉ）ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）切断機能ドメインと、
（ｉｖ）タグと、を含み、前記（ｉ）乃至（ｉｖ）は、融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシル末端順序で存在して、前記配列式ＩでＬはロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）であり、Ｐはプロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）であり、Ｘは任意のアミノ酸で、Ｔはトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）であり、Ｇはグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）である。

【0015】

既存ソルターゼＡ切断機能ドメインを含む自己切断融合タンパク質は、目的タンパク質をカルボキシル末端に含んでいたが、目的タンパク質により精製収率が非常に低い場合があった。本発明は、目的タンパク質をソルターゼＡのアミノ末端に位置させることによって、融合タンパク質のコラム結合及び切断効率が顕著に向上して、目的タンパク質の精製収率が大幅に増加することを確認した（図１５）。

【0016】

本発明の自己切断融合タンパク質は、好ましくはＬＰＸＴＧアミノ酸配列からなるペプチドとソルターゼＡ切断機能ドメインとの間に追加でペプチドリンカーを含むものであってもよい。

【0017】

本発明で「目的タンパク質」とは、特定目的によって高純度または大量で収得する必要がある任意のタンパク質をいい、これには天然型タンパク質、変移体タンパク質、または新規組換えタンパク質などが制限なしに含まれる。目的タンパク質は、産業的、医療的、学問的な理由などから高純度でまたは大量収得が求められるタンパク質であり、好ましくは医薬用または研究用の組換えタンパク質であり、より好ましくは高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素及び抗体からなる群で選択される。さらに好ましくは目的タンパク質は、抗体の軽鎖または、重鎖の全部または一部であり、最も好ましくは抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）または重鎖可変領域（ＶＨ）である。

【0018】

本発明で「ＬＰＸＴＧのアミノ酸配列からなるペプチド」とは、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）−プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）−任意のアミノ酸−トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）−グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）のアミノ酸配列からなるペプチドを意味して、これはタンパク質切断機能を持つソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）の認識配列である。すなわち、ソルターゼＡは、ＬＰＸＴＧ配列を認識して、トレオニンとグリシンとの間を切断して、これによりＬＰＸＴを含む部分とＧを含む部分に分けられることになる。本発明でＬＰＸＴＧのアミノ酸配列からなるペプチドで、Ｘは任意このアミノ酸であり、例えば前記Ｘは、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ、Ｅ）であってもよい。

【0019】

本発明で「ソルターゼＡ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ、Ｓｒｔ Ａ）」とは、グラム陽性菌の細胞壁に表面タンパク質を付着させる機能を有するタンパク質で、ＬＰＸＴＧ配列のトレオニンとグリシンとの間を切断して、これによってできたトレオニンの遊離カルボキシル基と細胞壁のペプチドグリカンのペンタグリシンなどの遊離アミノ基を結合させる役割をすると知られている。

【0020】

基本的にＬＰＸＴＧ配列を認識して切断する機能を持つペプチダーゼ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）である。本発明でソルターゼＡ、Ｓｏｒａｔａｓｅ ＡまたはＳｒｔ Ａなどは、全タンパク質だけでなく、ソルターゼＡの切断機能ドメインと混用されることができる。本発明では、任意のソルターゼＡ切断機能ドメインを使うことができる。好ましくは該当ソルターゼＡは、バクテリア由来であり、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来であり、より好ましくはソルターゼＡ切断機能ドメインは配列番号８のアミノ酸配列で構成される。

【0021】

本発明で「タグ（ｔａｇ）」とは、組換えタンパク質でタンパク質を標識または収得するための目的で挿入される一定のアミノ酸配列、ペプチド、さらにはタンパク質ドメインなどであり、タグを利用したタンパク質精製方法は、タンパク質精製技術のうち非常に高効率性を示す方法の一つで、この時使われるタグは大きくペプチドタグとタンパク質タグに分かれる。本発明でタグは、例えば、ポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）、ＧＳＴタグ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔａｇ）、ＨＡタグ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｔａｇ）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質タグ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇ）、キチン結合タンパク質タグ（Ｃｈｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇ）及び蛍光タグからなる群の中から選択されるが、制限されることなく、好ましくはポリヒスチジンペプチドタグであり、さらに好ましくは連続したヒスチジンが６乃至１２個であるペプチドタグであり、最も好ましくはヒスチジンが１０個であるポリヒスチジンペプチドタグである。

【0022】

前記タグは、それと連結されている全融合タンパク質をタグと結合するコラムに付着させる役割をする。これによって、究極的に融合タンパク質に含まれている目的タンパク質を収得することができる。

【0023】

本発明で「自己切断融合タンパク質」とは、ある融合タンパク質内に切断機能を持つドメインとそのドメインが認識して切断する認識配列が同時に含まれて、一定の条件になれば切断機能ドメインが活性化されて同じタンパク質内の認識配列を認識して切断するタンパク質を意味する。本発明では、ソルターゼＡ由来の切断機能ドメインと該当ドメインが認識するＬＰＸＴＧを含む融合タンパク質であってもよく、その他にも別の構成を追加で含んでもよい。

【0024】

本発明で「自己切断カセット」とは、切断機能を持つドメインとそのドメインが認識して切断する認識配列を含むドメインセットを意味して、好ましくはソルターゼＡ由来の切断機能ドメインと該当ドメインが認識するＬＰＸＴＧを含むドメインセットであってもよい。

【0025】

本発明で「ペプチドリンカー」とは、融合タンパク質内でドメインとドメインとの間に物理化学的距離を置いたり、あるいは連結のために使われるペプチドである。本発明の融合タンパク質は、ソルターゼＡとＬＰＸＴＧペプチドとの間にリンカーを含んでもよい。これには、天然リンカー、可撓性リンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）、螺旋形リンカー（ｈｅｌｉｃａｌ ｌｉｎｋｅｒ）、電荷性リンカー（正電荷または負電荷性リンカー）、またはｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌリンカーなどが使われる。本発明で可撓性リンカーは、一般に（ＧａＳｂ）ｎの形態を含んでいて（ａ＝１〜１０、ｂ＝１〜１０、ｎ＝１〜１０）、特に（Ｇ４Ｓ）配列を含むものであってもよい。

【0026】

本発明でアミノ酸配列のアミノ酸は、当業界で慣用的に使われるアミノ酸一文字略語で表記する。可撓性リンカーは、基本的にリンカーに存在するアミノ酸同士互いに反発したり集積する性質がなく、柔軟な動きを見せることができる。本発明で螺旋形リンカーは、Ａ（ＥＡＡＫ）ｍＡ（ｍは２〜５）の一般式を含み、５０Ａ．Ａ．である（Ｈ４）２リンカー（ＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬ、配列番号１）であってもよい。本発明で電荷性リンカーは、正電荷または陰電荷を持つリンカーであってもよく、正電荷リンカーは、ＣＨリンカー（ＴＲＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤＶＣＧＲＬＶＱＹＲＧ、配列番号２）であって、陰電荷リンカーはＡＨリンカー（ＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬ、配列番号３）であってもよい。

【0027】

Ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌリンカーは、螺旋形三次元構造を持つと共に、他のｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌドメインまたはリンカーと結合できる能力を持つリンカーで、配列番号９乃至１６または、配列番号４８乃至５５中いずれか一つであってもよい。

【0028】

好ましくは、本発明でペプチドリンカーは可撓性リンカーであってもよく、Ｓｃ（ＳＧ４）ｌ（ＧＧＳＳＲＳＳ）ＧｄＳｅ形態（配列番号４）を持ってもよい。前記Ｓｃ（ＳＧ４）ｌ（ＧＧＳＳＲＳＳ）ＧｄＳｅでｃは０乃至５で、ｄは０乃至５で、ｅは０乃至５で、ｌは０乃至１０である。本発明でペプチドリンカーの長さは重要ではなく、活性部位との接近性のために目的タンパク質によりリンカーの長さは変わるが、好ましくは１９乃至４０個のアミノ酸からなり、さらに好ましくは１９乃至２５個のアミノ酸からなる。最も好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列で構成されたペプチドリンカーである。

【0029】

本発明の具体的な一実施例では、目的タンパク質が抗体可変領域の場合、目的タンパク質の収得率にリンカーが及ぼす影響を確認するために、リンカーの長さ、リンカーの個数及び種類に変化を与えてリンカー最適化を実験した。

【0030】

リンカーの長さを７Ａ．Ａ．（配列番号５）、１８Ａ．Ａ．（配列番号６）及び２０Ａ．Ａ．（配列番号７）と異なるようにして目的タンパク質の収得率を比較した結果（実施例５−１、図９及び図１０）、リンカーが２０Ａ．Ａ．である場合に目的タンパク質収得率が増加するのを確認した。

【0031】

一方、ＬＰＸＴＧ認識配列とソルターゼＡ切断機能ドメインとの間にあるリンカーに加えてソルターゼＡ切断機能ドメインとタグとの間にリンカーを追加してドメインの間の妨害（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を減少させること（図２）が目的タンパク質の収得率に及ぼす影響を比較した（実施例５−２）。具体的には、（１）目的タンパク質（ＶＨ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ−ヒスタグの構造を持つ融合タンパク質を発現するベクターで形質転換した場合と、（２）目的タンパク質（ＶＨ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ−リンカー（７Ａ．Ａ．）−ヒスタグの構造を持つ融合タンパク質を発現するベクターで形質転換した場合を比較した（図１３）。（１）の場合にはコラムに結合するのを確認できるが（Ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、（２）のコラムに結合したタンパク質はほとんど確認できなかった。すなわち、Ｓｏｒｔａｓｅ ＡのＣ末端にリンカーを追加するのは、融合タンパク質のコラム結合を増加させることができなかった。

【0032】

リンカーの種類に関して前述した、螺旋形リンカー、電荷性リンカーをソルターゼＡ切断機能ドメインとタグとの間に挿入して、目的タンパク質の収得率に及ぼす影響を確認した（実施例５−３、図１２及び図１４）。具体的には、螺旋形リンカーをＬＰＸＴＧ認識配列とソルターゼＡ切断機能ドメインとの間にある可撓性リンカー（２０Ａ．Ａ．）は残存させたまま追加でソルターゼＡ切断機能ドメインとタグとの間に挿入した場合に融合タンパク質がコラムにほとんど結合されないことを確認することができた（図１２）。

【0033】

また、電荷性リンカー、正電荷性リンカー（ＣＨリンカー、配列番号２）または負電荷性リンカー（ＡＨリンカー、配列番号３）をＬＰＸＴＧ認識配列とソルターゼＡ切断機能ドメインとの間にある可撓性リンカー（２０Ａ．Ａ．）は残存させたまま追加でソルターゼＡ切断機能ドメインとタグとの間に挿入した場合にもコラムにほとんど結合されず切断タンパク質がほとんど発見されなかった（図１４）。

【0034】

本発明の自己切断融合タンパク質は、配列番号１７または１８のアミノ酸配列で構成されたものであってもよい。これは、目的タンパク質で抗体可変領域を含み、ＬＰＥＴＧ認識配列、ペプチドリンカー、ソルターゼＡ切断機能ドメイン（６０〜２０６Ａ．Ａ．）とコラム結合用タグ（Ｈｉｓ９）をアミノ末端から順次含むものである。

【0035】

本発明ではもう一つの様態として、本発明の自己切断融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７または１８のアミノ酸配列を暗号化するヌクレオチド配列であてもよく、好ましくは、配列番号５６または５７のヌクレオチド配列であってもよい。

【0036】

もう一つの様態として、本発明は前記核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明で「発現ベクター」とは、特定原核または、真核宿主細胞内で特定遺伝子を発現させるためにプロモーターなどが動作可能になるように連結されたベクターを意味する。これは、宿主細胞によりベクターのバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）が変わり、本発明では大腸菌で発現可能なベクターであり、より好ましくはｐＥＴ２１ｂ、ｐＬＩＣ、ｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）であってもよい。

【0037】

もう一つの様態として、本発明は本発明の発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
形質転換の目的となる細胞をいわゆる宿主細胞ともいい、これには真核細胞または原核細胞を問わない。本発明で細胞は、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよく、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）またはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の大腸菌菌株であってもよい。

【0038】

本発明の具体的な実施例によると、本発明の発現ベクターをＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主細胞として形質転換して発現する様子を比較した（図９）。図９で確認できるようにＯｒｉｇａｍｉ２とＢＬ２１との間に発現様子には大きな違いはない。

【0039】

もう一つの様態として、本発明は本発明の細胞を培養して細胞溶解物（Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）を収得る工程と、細胞溶解物から目的タンパク質を精製する工程と、を含む、目的タンパク質の精製方法を提供する。

【0040】

また、好ましくは前記細胞溶解物から目的タンパク質を精製する工程は、細胞溶解物を融合タンパク質に存在するタグと結合するコラムに注入する工程と、コラムを洗浄する工程と、カルシウム及びトリグリシンからなる群中で選択された一つ以上を含む切断−バッファーで平衡化させて切断反応させる工程と、コラムから切断−バッファーを収得してタグが除去された目的タンパク質を収得する工程と、を含んでもよい。

【0041】

本発明で「コラム」とは、特定成分、タンパク質、化合物を含む混合物溶液を注入して内部を通過する間、特定成分、タンパク質、化合物を分離及び／または精製する機能をする機構であって、本発明では特に融合タンパク質に含まれた特定タグと結合する特性を持つ化合物、成分、タンパク質などがコラム内に固定されて、タグを有しているタンパク質をコラム内に付着させて分離・精製する機能をする。融合タンパク質に含まれたタグがヒスタグ（ヒスチジンを含むタグ）の場合には、ニッケルに結合する特性を利用したＮｉ−ＮＴＡコラムが使われ、融合タンパク質に含まれたタグがＧＳＴである場合にはグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を固定したコラムが使われる。

【0042】

本発明で「切断−バッファー」とは、切断機能ドメインを活性化させるバッファーを意味して、特にソルターゼＡを活性化させるバッファーを意味する。切断−バッファーは、カルシウム及び／またはトリグリシンを含み、好ましくは少なくともトリグリシンを含む。また、切断−バッファーは、好ましくはカルシウム０．１乃至１０ｍＭ及びトリグリシン０．１乃至１０ｍＭを含み、さらに好ましくはカルシウム０．２乃至５ｍＭ及びトリグリシン０．２乃至５ｍＭを含む。

【0043】

本発明の具体的な一実施例では、切断反応の最適条件を確認するために、カルシウムまたはトリグリシンの有無と濃度条件を異なるようにして切断タンパク質収得率を確認した。カルシウムとトリグリシン中一つの濃度を５ｍＭに固定して、残りの一つを０、０．２、１、５ｍＭの濃度で混合した切断−バッファーによる切断タンパク質収得率を両方ともを入れなかった陰性対照群と比較した。陰性対照群では、切断タンパク質を全く観察できず（約１５ｋＤａ）、二つのうち一つでも入った場合には切断タンパク質を観察できて、一定量のトリグリシンを含んでカルシウムの濃度を調節した場合には収得される切断タンパク質の量が差が殆どないのに対して、一定量のカルシウムを含んでトリグリシンの濃度を調節した場合にはトリグリシンを含まない場合に切断タンパク質が少なく収得されるのを確認した。切断−バッファーに含まれたトリグリシンがソルターゼの切断機能に重要な役割をすることを確認した。

【0044】

本発明で「治療用抗体−薬物結合体（ＡＤＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とは、薬物、抗体そして抗体と薬物を連結するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含む三つの構成要素で構成されていて、治療用抗体−薬物結合体技術は、癌細胞の表面に発現した特定抗原に特異的に結合する抗体を使って薬物を腫瘍細胞に伝達する方法である。

【0045】

本発明を利用して、このような治療用抗体−薬物結合体を製造することができる。具体的には、アミノ末端に「抗体−リンカー−ソルターゼ」が含まれた自己切断カセットを構築して、ソルターゼＡが切断配列（ＬＰＸＴＧ）を認識して切断機能を行うためには、カルシウム及び／またはトリグリシンがなければならないが、この切断を誘導する誘導体トリグリシンのＣ−末端に薬物を連結して反応させる。トリグリシンＣ−末端に薬物を連結した「トリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）」を製造または合成した後、構築された「抗体−リンカー−ソルターゼ」が含まれた自己切断カセットの切断反応に利用すれば、最適化された切断反応によって「抗体−リンカー−薬物（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅｒ−ＬＰＥＴＧＧＧ−ｄｒｕｇ）」の形態で製造されることができる。

【0046】

具体的に、本発明の治療用抗体−薬物結合体に使われることができる薬物は、細胞毒性または細胞増殖抑制効果を持つ任意の化合物、部分または、基を含み、
（ｉ）マイクロチュールリン抑制剤、類似分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、またはＤＮＡインターカレータとして機能できる化学療法剤、
（ｉｉ）酵素的に機能できるタンパク質毒素、
（ｉｉｉ）特定癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の発現を抑制させることができるマイクロＲＮＡ （ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び
（ｉｖ）放射線同位元素などが含まれる。

【0047】

このような薬物にはマイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５（細胞毒性化合物）、カリケアミシン及び他のエネディイン抗生剤、タキサン、アントラシクリン、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンデシン、ピンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、ダウノマイシン及びその立体異性体、同配体、同族体または誘導体、その他挿入剤である酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生剤、及び毒素（細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的活性毒素または小分子毒素）及びシスプラチン、ＣＰＴ−１１、ドキソルビシン、パクリタキセル及びトセタキセルなどの各種抗腫瘍または抗癌剤などが含まれるか、これらに限定されない。

【0048】

本発明の具体的な一実施例では、治療用抗体−薬物結合体の製造のための切断反応の最適条件を確認するために、トリグリシン−ビオチンの有無と濃度条件を異なるようにして切断タンパク質収得率を確認した。トリグリシン−ビオチンの濃度を０、１０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭの濃度で混合して切断−バッファーによる目的タンパク質収得率を陰性対照群と比較した。陰性対照群では目的タンパク質とビオチンの接合を全く観察できず（約４５ｋＤａ）、５００μＭ及び１ｍＭの濃度で多量の接合反応を観察することができた。前記確立されたトリグリシン−ビオチンの濃度を利用して、切断反応の最適反応時間条件を確認した。反応時間を０．３０分、１、２、３、４、６時間及び１６時間で反応させた後、目的タンパク質とビオチン接合体の収得率を陰性対照群と比較した。４乃至１６時間反応させた接合反応で多量のトリグリシン−ビオチンを観察することができた。

【0049】

また、前記工程（１）で、切断−バッファーは、カルシウム０．１乃至１０ｍＭを含むことが好ましく、トリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）５００ｎＭ乃至１ｍＭを含んで反応させることが好ましいが、これに限定されない。目的タンパク質とトリグリシン−薬物（ＧＧＧ−ｄｒｕｇ）を接合させる時間は、４乃至１６時間が好ましいか、これに限定されない。
目的タンパク質は、癌細胞表面抗原に対する抗体であることが好ましいが、これに限定されない。

【実施例】

【0050】

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

【0051】

実施例１：発現ベクターの製造
１−１：ＰＣＲ反応液及び条件
本発明で利用する各種遺伝子を収得してベクターを製造するためのＰＣＲ反応液の組成とＰＣＲ実行条件は下記のとおりである。
先に、ＰＣＲ反応液は２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ ５ｕｌ、５Ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液１０ｕｌ、１００μＭ正・逆方向プライマー各々１ｕｌずつ、１００ｎｇ／ｕＬの鋳型ＤＮＡ １ｕｌ、２．５Ｕ／ｕＬ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ重合酵素０．５ｕｌ及び蒸溜水３１．５ｕｌを含み、計５０ｕｌで製造した。
前記製造したＰＣＲ反応液を９８℃で１０秒、６８℃で１分のサイクルを２９回繰り返すｔｗｏ−ｓｔｅｐ ＰＣＲを進めた。ＰＣＲ完了したサンプルは４℃に保管した。

【0052】

１−２：ＢＡＰ−ｓｏｒｔａｓｅ−ＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）製造
先に、プライマー１＿ｓｆｉ（５’−ｃｃｇｔｇ ｇｃｃ ｃａｇ ｇｃｇ ｇｃｃ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ−３’：配列番号１９）または、プライマー１（５’−ＡＴＧＴ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ−３’：配列番号２０）、及びプライマー２（５’−ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＴＣ ＧＴＧ ＣＣＡ ＣＴＣ ＧＡＴ ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＴＣ ＧＴＴ−３’：配列番号２１）を利用してＢＡＰ（ｂｉｏｔｉｎ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0053】

プライマー３（５’−ＡＴＣ ＧＡＧ ＴＧＧ ＣＡＣ ＧＡＡ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＡＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＣＣＧ−３’：配列番号２２）及びプライマー４（５’−ＧＣＣ ＧＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＡＡ−３’：配列番号２３）を利用して黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来ＳｒｔＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ１６２６８７）の６０乃至２０６番目アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0054】

プライマー５（５’−ＣＡＧ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＣＣ ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＡＧＣ−３’：配列番号２４）、プライマー６（５’−ＡＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＧＴ ＡＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＴＧＴ−３’：配列番号２５）及び鋳型標的（ＶＬ）を利用してＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）をコードする２次ＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0055】

その後、前記三つのＰＣＲ産物を共に混合した後、プライマー１＿ｓｆｉまたはプライマー１及びプライマー７（５’−ｔａａｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｃｃ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＴＴ ＡＡＣＴＴ−３’：配列番号２６）を使ってＳｒｔＡｃ−ＬＰＥＴＧ及び標的（ｔａｒｇｅｔ）をコードする配列の間にＨｉｎｄＩＩＩｓｉｔｅがある融合タンパク質であるＢＡＰ−ＳｒｔＡ−ｋＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0056】

結果として出てきたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断して、目的タンパク質をｃｙｔｏｐｌａｓｍで発現誘導するｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションして、ＳｆｉＩで切断後、融合タンパク質であるＢＡＰ−ｓｏｒｔａｓｅ−ＬＰＥＴＧ−ｔａｒｇｅｔ−ｍｙｃ（図１のＩ）をｐｅｒｉｐｌａｓｍで発現誘導するベクターであるｐＣｏｍ３ｘでライゲーションした。

【0057】

１−３：Ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ｋＬＰＥＴＧ−リンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９製造
プライマー８（５’−ＡＴＧ ＴＣＡ ＴＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＣＡ ＧＡＧＴ−３’：配列番号２７）及びプライマー９（５’−ｇｇａａｃｃａｃｃｇｃｃｇｇｔｃｔｃｇｇｇａａｇ ＡＡＧ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＡＡＴ ＴＡＡＣ−３’：配列番号２８）を利用して、リンカー（７Ａ．Ａ．）（ＧＧＳＳＲＳＳ：配列番号５）が連結されたｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（７Ａ．Ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0058】

プライマー８及びプライマー１０（５’−ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＣＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＧＡ ＧＣＣ ＧＧＴ ＣＴＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴ−３’：配列番号２９）及び前記ＰＣＲ産物であるｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（７Ａ．Ａ．）を利用してリンカー（１８Ａ．Ａ．）（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳ：配列番号６）が連結されたｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（１８Ａ．Ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0059】

プライマー１１（５’−ｇａｇ ａｃｃ ｇｇｃ ｇｇｔ ｇｇｔ ｔｃｃ ｔｃｔ ａｇａ ｔｃｔ ｔｃｃ ｃａｇ ｇｃｔ ａａｇ ｃｃｇ ｃａｇ ａｔｔ−３’：配列番号３０）及びプライマー１２（５’−ｔａａｔ ＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ｔｔａ ａｔｇａｔｇｇｔｇ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧＧＣ−３’：配列番号３１）を利用してリンカー（７Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0060】

プライマー１３（５’−ｇｔｇｇｔｔｃｃｔｃｔａｇａｔｃｔｔｃｃ ＴＣＧ ＡＡＧ ＧＴＣ ＧＣＧ ＧＧＡ ＴＡＴ ＡＴＴ−３’：配列番号３２）及びプライマー１４（５’−ｔａａｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｔａ ａｔｇａｔｇｇｔｇ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＣ−３’：配列番号３３）を利用してリンカー（１８Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0061】

プライマー１５（５’−ＧＧＴ ＴＣＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ｃａｇ ｇｃｔ ａａｇ ｃｃｇ ｃａｇ ａｔｔ−３’：配列番号３４）及びプライマー１４を利用してリンカー（２０Ａ．Ａ．）（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＧＳ：配列番号７）が連結されたリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0062】

プライマー１５、プライマー１６（５’−ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＣＧ ＡＧＡ ＧＣＴ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＡＡ ＧＡ−３’：配列番号３５）及びプライマー１７（５’−ＴＡＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＣＧ ＡＧＡ ＧＣＴ ＡＣＧ ＧＣＴ−３’：配列番号３６）を利用してリンカー（２０Ａ．Ａ．）（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＧＳ：配列番号７）がＮ末端に連結されてリンカー（７Ａ．Ａ．）（ＧＧＳＳＲＳＳ：配列番号５）がＣ末端に連結されたリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）−リンカー（７Ａ．Ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0063】

プライマー１５、プライマー１８（５’−ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＴＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＣＧＣ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＣＧＣ ＴＴＣ ＣＡＡ ＣＧＣ ＴＴＴ Ｃ−３’：配列番号３７）及びプライマー１９（５’−ＴＡＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＡ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＧ ＣＴＣ ＣＡＧ Ｔ−３’：配列番号３８）を利用してリンカー（２０Ａ．Ａ．）（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＧＳ：配列番号１１）がＮ末端に連結されて（Ｈ４）２Ｌリンカー（５０Ａ．Ａ．）（配列番号１）がＣ末端に連結されたリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）−（Ｈ４）２Ｌリンカー（５０Ａ．Ａ．）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅した。

【0064】

プライマー１５及びプライマー２０（５’−ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＧ ＴＣＴ ＴＧＡ ＣＣＴ ＣＧＧ ＴＡＧ ＣＧＡ ＣＡＡ ＡＧＡ ＴＣＴＴ−３’：配列番号３９）を利用してＰＣＲでリンカー（２０Ａ．Ａ．）（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＧＳ：配列番号７）がＮ末端に連結されてＣＨリンカー（３２ Ａ．Ａ．）のＮ末端のＴＲＡ−をコードするＤＮＡ配列を増幅してプライマー２１（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＧＣ ＧＧＡ ＣＡＴ Ｇ−３’：配列番号４０）、プライマー２２（５’−ＧＣＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＡＣ ＧＴＣ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＧＧ−３’：配列番号４１）及びプライマー２３（５’− ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＣＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ−３’：配列番号４２）及びプライマー２４（５’− ＴＡＡ Ｔ ＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＣＧＧＴＡ ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＣ−３’：配列番号４３）を利用してＣＨリンカーの部分を増幅してリンカー（２０Ａ．Ａ．）（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＧＳ：配列番号７）がＮ末端に連結されてＣＨＬリンカー（３２Ａ．Ａ．）（ＴＲＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤＶＣＧＲＬＶＱＹＲＧ：配列番号２）がＣ末端に連結されたリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）−ＣＨＬリンカー（３２Ａ．Ａ．）をコードするＤＮＡ配列をプライマー１５、２４及び前記ＰＣＲ産物（リンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）−ＣＨＬ（ＴＲＡ−））及びＣＨＬリンカー（３２Ａ．Ａ．）（ＴＲＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤＶＣＧＲＬＶＱＹＲＧ：配列番号２）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0065】

プライマー１５及びプライマー２５（５’−ＣＧＧ ＡＴＣ ＡＣＣ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＡＣ ＡＡＡ ＧＡＴ ＣＴＴ−３’：配列番号４４）を利用してリンカー（２０Ａ．Ａ．）（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＧＳ：配列番号１１）がＮ末端に連結されてＡＨリンカー（４５Ａ．Ａ．）のＮ末端のＫＥＱ−をコードするＤＮＡ配列を増幅してプライマー２６（５’−ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＡＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＴＴＣ−３’：配列番号４５）及びプライマー２７（５’− ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＴＧ ＴＧＣ ＡＴＣ ＡＴ−３’：配列番号４６）を利用してｐＩＧ２０ ｖｅｃｔｏｒをｔｅｍｐｌａｔｅで使ってＡＨリンカーを増幅した。ＡＨリンカー（４５Ａ．Ａ．）（ＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮ ＬＬＡＥＡＫＫＬ：配列番号３）がＣ末端に連結されたリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）−ＡＨＬリンカー（４５Ａ．Ａ．）をコードするＤＮＡ配列をプライマー１５、プライマー２８（５’−ＴＡＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＧＧ−３’：配列番号４７）及び前記ＰＣＲ産物（リンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ（６０−２０６）−ＡＨＬ（ＫＥＱ−））及びＡＨＬリンカー（４５Ａ．Ａ．）（ＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬ：配列番号３）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0066】

最後に、ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（７Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９（図１のＩＩ）をプライマー８、プライマー１２及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（７Ａ．Ａ．）及びリンカー（７Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0067】

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（１８Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９（図１のＩＩＩ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１４及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（１８Ａ．Ａ．）及びリンカー（１８Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0068】

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９（図１のＩＶ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１４及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）及びリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ）の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0069】

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−リンカー（７Ａ．Ａ．）−Ｈ９（図２のＩ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１７及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）及びリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ−リンカー（７Ａ．Ａ．））の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0070】

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−（Ｈ４）２Ｌリンカー（５０Ａ．Ａ．）−Ｈ９（図２のＩＩ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー１９及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）及びリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ−（Ｈ４）２Ｌリンカー（５０Ａ．Ａ．））の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0071】

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−ＣＨＬリンカー（３２Ａ．Ａ．）−Ｈ９（図３のＩ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー２４及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）及びリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ−ＣＨＬリンカー（３２Ａ．Ａ．））の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0072】

ｔａｒｇｅｔ（ＶＬ）−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−ＡＨＬリンカー（４５Ａ．Ａ．）−Ｈ９（図３のＩＩ）をコードする遺伝子をプライマー８、プライマー２８及び前記ＰＣＲ産物（ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）及びリンカー（２０Ａ．Ａ．）−ＳｒｔＡ−ＡＨＬリンカー（４５Ａ．Ａ．））の混合物を利用してｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲで増幅した。

【0073】

結果として出てきたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで切断して、融合タンパク質であるｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｒ９、ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ６、またはｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９を発現するベクターであるｐＥＴ２３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）でライゲーションした。

【0074】

融合タンパク質であるｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｒ９、ｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ６、またはｔａｒｇｅｔ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９は標的及びＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｒ９、ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ６、またはＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９をコードする配列の間にＨｉｎｄＩＩＩｓｉｔｅがある。その後、発現のために、すべての遺伝子作製物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ｐＥＴ２３ａ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｒ９、ｐＥＴ２３ａ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ６、またはｐＥＴ２３ａ−ＬＰＥＴＧ−他のリンカー−Ｓｏｒｔａｓｅ−Ｈ９にライゲーションした。

【0075】

実施例２：水溶性発現確認
すべての発現実験は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）を利用して行った。１００ｍｇ／ｌのアンピシリン及び０．５％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むｄＹＴ培地（３０ｍｌ）に単一バクテリアコロニーを接種して、３７℃で夜中培養した。ＬＢ、ＳＢ、またはｄＹＴ ｍｅｄｉｕｍ（１００ｍｇ／ｌのアンピシリン、５０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４）０．３ｌに前培養（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）を接種して３７℃で培養した（バッフルがある１ｌフラスコ、１ｌ ｆｌａｓｋ ｗｉｔｈ ｂａｆｆｌｅｓ、２００ｒｐｍ）。ＯＤ６００値が０．６である時ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるべく添加して発現を誘導した。培養を１８時間１８℃に維持した。細胞を遠心分離で収集して（１０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、３０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌで懸濁して、超音波（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）で破砕した。組抽出を遠心分離して（１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）、上澄み液を０．２ｍｍフィルターでろ過して、下記実施例３のＮｉ ＦＦクロマトグラフィーに直接適用した。

【0076】

実施例３：Ｎｉ−ＮＴＡ精製
溶解物の上澄み液を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ（ＧＥ）コラムにロードして、２０倍コラム体積のバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、及び５ｍＭ ＢＭＥ）で洗浄後、５倍コラム体積のバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。洗浄後、タンパク質−結合レジンのａｌｉｑｕｏｔｅを切断バッファー（５ｍＭ ＣａＣｌ_２及び５ｍＭ ｔｒｉ−Ｇｌｙを含むバッファーＢ）で平衡化させた後、２５℃で１時間反応させた。

【0077】

該当過程は、図５及び図８に示した図式図のように進行される。図５は、図１のＩの既存Ｃ末端にＳｏｒｔａｓｅ Ａを結合させた融合タンパク質を精製する過程を示し、図８は、本発明のＮ末端にＳｏｒｔａｓｅ Ａを結合させた融合タンパク質を精製する過程を示す。
タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシーブルー染色法で分析した。また、一部サンプルに対して発現及び精製の有無をウェスタンブロッティングで確認した。

【0078】

実施例４：Ｓｏｒｔａｓｅ融合タンパク質発現及び精製確認
前記融合タンパク質の構造面で目的タンパク質を基準として全体融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に目的タンパク質が連結された場合、精製効率の変化を確認した。

【0079】

図１のＩに該当する融合タンパク質をｐＥＴ２１ｂ、ｐＥＴ２３ａ、及びｐＬＩＣに挿入して得た発現ベクターで形質転換した宿主細胞（大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ）から、前記実施例２によって収得した細胞溶解物で発現の有無を確認した。これを実施例３を介してＮｉ−ＮＴＡ（ＧＥ）コラムに結合させて精製を行って、コラムに結合した状態にあるタンパク質を確認した。

【0080】

前記発現及び精製は、クマシーブルー染色と目的タンパク質に結合されているＭｙｃタグを利用してウェスタンブロッティングを介して確認した。

【0081】

図６から分かるように、融合タンパク質はベクターを問わずよく発現して、図７から分かるようにＣ末端に目的タンパク質を含む融合タンパク質はコラムに結合できず、また精製活性もほとんど確認できなかった（図７のＢの５、６ｌａｎｅ）。

【0082】

目的タンパク質の位置が精製効率に及ぼす影響を確認するために、目的タンパク質の位置がＮ末端とＣ末端とで異なる場合に、融合タンパク質精製効率を比較した。これは実施例２及び実施例３に係る実験を介して確認した。

【0083】

図１５で確認できるように、Ｃ末端に目的タンパク質が位置する場合には、切断されたタンパク質が発見されなかった（Ｃｌｅａｖｅｄ）。それに比べて、Ｎ末端に目的タンパク質が位置する場合には、切断されたタンパク質が非常に高純度で存在するのを確認することができた。これは各場合にＬＳ ｌａｎｅ及びＦＴ ｌａｎｅ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｎｅ）の比較とコラムに残存するタンパク質（ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を介して確認できるように、Ｃ末端に目的タンパク質が位置する場合には、融合タンパク質がコラムにほとんど結合をできないことに比べて、Ｎ末端に目的タンパク質が位置する場合には、融合タンパク質の結合率が非常に高くて結合されたタンパク質はほぼ切断されるのを確認することができる。

【0084】

実施例５：リンカー最適化実験
５−１：リンカーの長さ最適化
図１のＩＩ乃至ＩＶに該当する融合タンパク質を発現するベクターをＯｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、これをＬＢ、ＳＢまたはｄＹＴ培地で培養して前記実施例２の方法を介して収得した細胞溶解物で発現の有無を確認した。これを実施例３に開示された通り、Ｎｉ＿ＮＴＡ（ＧＥ）コラムに結合させて精製を行って、コラムに結合した状態にあるタンパク質を確認した。

【0085】

前記発現及び精製は、クマシーブルー染色と目的タンパク質は、ＶＨの場合にはＨＡタグ抗体、ＶＬの場合にはｍｙｃタグ抗体を利用したウェスタンブロッティングを介して確認した。

【0086】

図９で確認できるように宿主細胞（Ｏｒｉｇａｍｉ２またはＢＬ２１）間に差を見せずよく発現するのを確認した。

【0087】

また、図１０で確認できるように、細胞を培養する培養液間に大きい差を見せず融合タンパク質がよく発現するのを見ることができる（ＬＳ ｌａｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｌａｎｅ、３３ｋＤａ位置）。また、コラムに結合されたタンパク質はほぼ全部が切断された（すべてのＢＰ ｌａｎｅ（ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｎｅ）に３３ｋＤａバンドなし）。

【0088】

一方、リンカーの長さを異なるようにしたところ、７Ａ．Ａ．リンカー（ＧＧＳＳＲＳＳ、配列番号５）、及び１８Ａ．Ａ．リンカー（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳ、配列番号６）ではタグが除去されたタンパク質（ＣＰ ｌａｎｅ、ｃｌｅａｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｎｅ、１５ｋＤａ位置）が僅かに存在するのを確認することができる。その反面、２０Ａ．Ａ．リンカー（ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＧＳ、配列番号７）でタグが除去されたタンパク質が高純度で多量収得されるのを確認することができる。

【0089】

２０Ａ．Ａ．リンカーを含むタンパク質が７Ａ．Ａ．または１８Ａ．Ａ．リンカーを含むタンパク質より目的タンパク質の収得率が顕著に高い原因として、先に発現量を比較しすると（ＬＳ ｌａｎｅ）、７Ａ．Ａ．リンカーを含む場合に比べては融合タンパク質が過発現する程度が高いと確認されるが、１８Ａ．Ａ．リンカーを含む場合は発現自体は２０Ａ．Ａ．リンカーを含む場合とほとんど差がなく過発現が起きるのを確認することができる。それに対して、各場合にＬＳ ｌａｎｅ及びＦＴ ｌａｎｅ（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｎｅ）を比較すると分かるように、２０Ａ．Ａ．の場合のみに厚く過発現した融合タンパク質（約３３ｋＤａ）のバンドがコラムを通りながらＦＴ ｌａｎｅでは消えることから、融合タンパク質がコラムに付着する比率が顕著に高いのを確認することができた。これは、コラムに残ったタグを含む除去されたタンパク質の部分（ＢＰ ｌａｎｅ、Ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｎｅ、２０ｋＤａ位置）が２０Ａ．Ａ．で顕著に高いことからも確認することができた。

【0090】

これにより、リンカー２０Ａ．Ａ．が自己切断部位とＳｏｒｔａｓｅとの間に挿入される構造が目的タンパク質の収得率を顕著に高めることを確認した。

【0091】

５−２：リンカーの追加による収得率変化の有無
リンカーがＳｏｒｔａｓｅ ＡドメインのＮ末端の部分の他にもＣ末端の部分にも存在する場合、収得率に変化があるかを確認するために、Ｓｏｒｔａｓｅ ＡドメインとＨｉｓタグとの間にリンカーを追加で挿入した融合タンパク質を利用して比較した。

【0092】

図１３では（１）目的タンパク質（ＶＨ）−ＨＡ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ−Ｈｉｓ６の構造を持つ融合タンパク質を発現するベクターで形質転換した場合と（２）目的タンパク質（ＶＨ）−ＨＡ−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ−リンカー（７Ａ．Ａ．）−Ｈｉｓ６の構造を持つ融合タンパク質を発現するベクターで形質転換した場合を比較した。

【0093】

（１）と（２）の差は、Ｓｏｔａｓｅ Ａ後にリンカー（７Ａ．Ａ．、ＧＧＳＳＲＳＳ）の有無の差である。二つの融合タンパク質の発現、及びコラム結合程度は、クマシーブルー染色を介して確認した。

【0094】

図１３で確認できるように、１または２の場合にいずれも融合タンパク質の部分（３３ｋＤａ）に強いバンドができるのを確認することができた。しかし１の場合には、僅かながらコラムに結合するのが確認できるが（Ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、比較される２のコラムに結合したタンパク質は殆ど確認することができなかった。すなわち、Ｓｏｒｔａｓｅ ＡのＣ末端にリンカー（７Ａ．Ａ．）を追加するのは、融合タンパク質のコラム結合の妨げになった。

【0095】

５−３：リンカーの交換
前記多数のグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）とセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）と、一つのアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）からなるリンカーをドメイン間に干渉を減らすことができる多くの種類のリンカーに交換して、これによるコラム結合率または収得率を確認した。

【0096】

先に、螺旋形リンカー（ｈｅｌｉｃａｌ ｌｉｎｋｅｒ）に交換した。螺旋形リンカーはＡ（ＥＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２−５）の一般式を持つのを使って、特にｎが４である（Ｈ４）２リンカー（ＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥ、５０Ａ．Ａ．、配列番号１）を利用して図２のＩ及びＩＩの構造を持つ融合タンパク質を発現して結合率を確認した。

【0097】

図１２から分かるように、該当融合タンパク質は過発現は起きたが、コラムにほとんど結合しないことを確認することができる。このことから該当融合タンパク質に使われた螺旋形リンカーは結合率を増加させる効果を持つことができないと確認された。

【0098】

次に、正電荷性リンカー（ＣＨＬ、ＴＲＡＲＬＳＫＥＬＱＡＡＱＡＲＬＧＡＤＭＥＤＶＣＧＲＬ ＶＱＹＲＧ、配列番号２）または負電荷性リンカー（ＡＨＬ、ＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥ ＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬ、配列番号３）に交換した。これらを利用した融合タンパク質の構造は、図３のＩ及びＩＩに図式化されている。二つの融合タンパク質の結合率及び収得率を確認した。

【0099】

図１４から分かるように、該当二つの融合タンパク質のうち正電荷性リンカーを含む場合には（ＣＨＬ、図１４のＡ）、発現が非常に僅かになり、コラムに結合するタンパク質は殆どなかった。反面、負電荷性リンカーを含む場合には（ＡＨＬ、図１４のＢ）、ある程度過発現になり、コラムにも一定量結合すると見られるが、切断されたタンパク質（Ｃｌｅａｖａｇｅ）が殆どないことを確認した。これらのことから、該当融合タンパク質に使われた電荷性リンカーは、結合率または収得率を増加させる十分な効果を持つことができないと確認された。

【0100】

実施例６：切断反応最適条件化
ソルターゼＡが切断配列（ＬＰＸＴＧ）を認識して切断機能をするためには、カルシウム及び／またはトリグリシン（ｔｒｉｇｌｙｃｉｎｅ）がなければならないと知られている。本発明では、切断反応の最適条件を確認するために、カルシウムまたはトリグリシンの有無と濃度条件を異なるようにして切断タンパク質収得率を確認した。

【0101】

具体的には、カルシウムとトリグリシンジュンの中一方の濃度を５ｍＭに固定して、他方濃度を０、０．２、１、５ｍＭの濃度で混合した切断−バッファーによる切断タンパク質収得率を両方とも入れなかった陰性対照群と比較した。

【0102】

図１１で確認できるように、陰性対照群では、切断タンパク質を全く観察できず（約１５ｋＤａ）、二つのうち一つでも入った場合には、切断タンパク質を観察することができた。但し、トリグリシン５ｍＭを含みカルシウムの濃度を０乃至５ｍＭに調節した場合には収得される切断タンパク質の量が差が殆どないことに比べて、カルシウム５ｍＭを含みトリグリシンの濃度を０乃至５ｍＭに調節した場合には、トリグリシンを含まなかった場合に切断タンパク質が少なく収得されるのを確認することができる（図１１のＢ）。しかし、トリグリシンが入った場合には収得される切断タンパク質量の差が殆どなかった。

【0103】

これはまさに、切断−バッファーに含まれたトリグリシンがソルターゼの切断機能に重要な役割をすることを意味して、濃度差は大きい意味を持たないことを意味する。

【0104】

実施例７：治療用抗体−薬物結合体製造の最適化
７−１：濃度最適化
本実施例では、効率的な薬物の接合に必要なトリグリシンの最適濃度条件を確立した。薬物としてはトリグリシンが融合したビオチンを使って、その濃度をそれぞれ０、１０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭで反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ_２）と混合して反応させた後、目的タンパク質とビオチンの接合を陰性対照群と比較した。陰性対照群は、三つの条件（１：５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０／２：５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０＋５００μＭトリグリシン−ビオチン／３：反応バッファー）を使った。目的タンパク質−ビオチンの接合反応は、ウェスタンブロットを利用して目的タンパク質に結合されているＭｙｃタグを利用して目的タンパク質の総濃度を確認して、ストレプトアビジンを利用して目的タンパク質とビオチンの接合反応度を確認した。

【0105】

その結果、三つ条件の陰性対照群では、目的タンパク質とビオチンの接合（約４５ｋＤａ）が全く観察されず、５００μＭ及び１ｍＭのトリグリシン−ビオチンの濃度で飽和された接合反応が観察できて、１００μＭのトリグリシン−ビオチンの濃度で多量の接合反応を観察することができたが、５００μＭ及び１ｍＭの濃度でよりは反応度が低いことを確認することができた（図１６Ａ）。

【0106】

７−２：反応時間最適化
前記実施例７−１で確立されたトリグリシン−ビオチンの濃度を利用して、最適反応時間条件を分析した。目的タンパク質の濃度は、５００μＭ及び１ｍＭの二つの濃度に固定して、時間を０、３０分、１、２、３、４、６時間及び１６時間で反応させた後、目的タンパク質とビオチンの接合を陰性対照群と比較した。

【0107】

実施例７−１のようにウェスタンブロットで分析した結果、陰性対照群では目的タンパク質とビオチンの接合が観察されず、５００μＭトリグリシン−ビオチンの濃度では４〜６時間で多量の接合反応が観察されて１６時間接合反応で最も良い効率を示した。また、１ｍＭトリグリシン−ビオチンの濃度では、４〜６時間及び１６時間接合反応でいずれも優秀な接合効率を確認することができた（図１６Ｂ）。

【0108】

前記結果をまとめると、目的タンパク質−ＬＰＥＴＧ−リンカー（２０Ａ．Ａ．）−Ｓｏｒｔａｓｅ−タグの構造を持つ融合タンパク質が優秀なコラム結合力及び優秀なＳｏｒｔａｓｅ Ａ自己切断活性で非常に高収得率を持つことが分かり、これを利用した治療用抗体−薬物結合体を製造したことが分かる。

【産業上の利用可能性】

【0109】

本発明は、ソルターゼＡ切断機能ドメインとこれの認識配列であるＬＰＸＴＧのアミノ酸配列で構成されるペプチドからなる自己切断カセットを含む自己切断融合タンパク質に関し、目的タンパク質の精製及びタグ除去過程を別々の過程でなく一度の精製過程で完了できる点で非常に有用である。特に、目的タンパク質の位置がアミノ末端に存在することによって融合タンパク質のコラム結合能力と自己切断能力を高めた点、タグが除去された目的タンパク質を高純度で得ることができる点、切断−バッファーを介して精製及びタグ除去過程が一度の過程で完了されて、精製に必要な時間及び努力が画期的に減少される点、及び一度の工程からなるため、収得タンパク質の損失が減少する点で、高純度及び大量のタンパク質が必要な様々な分野で広く利用できる。特に、治療用抗体−薬物結合体製造に有用である。

【0110】

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]