特許 6178238 糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6178238

(24)【登録日】2017年7月21日

(45)【発行日】2017年8月9日

(54)【発明の名称】糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/655 20060101AFI20170731BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 38/31 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20170731BHJP

   A61P 5/02 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 27/12 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170731BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/655ZNA

   C07K19/00

   A61K38/31

   A61K47/61

   A61P5/02

   A61P25/28

   A61P35/00

   A61P3/10

   A61P25/04

   A61P19/02

   A61P1/12

   A61P1/04

   A61P1/00

   A61P27/02

   A61P27/06

   A61P27/12

   A61P29/00

   A61P43/00 111

【請求項の数】30

【全頁数】149

(21)【出願番号】特願2013-531454(P2013-531454)

(86)(22)【出願日】2012年9月3日

(86)【国際出願番号】JP2012072380

(87)【国際公開番号】WO2013032011

(87)【国際公開日】20130307

【審査請求日】2015年8月7日

(31)【優先権主張番号】特願2011-192202(P2011-192202)

(32)【優先日】2011年9月4日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512088316

【氏名又は名称】株式会社糖鎖工学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(72)【発明者】

【氏名】落合 洋文

(72)【発明者】

【氏名】下田 泰治

(72)【発明者】

【氏名】深江 一博

(72)【発明者】

【氏名】前田 政敏

(72)【発明者】

【氏名】石井 一之

(72)【発明者】

【氏名】吉田 健太

(72)【発明者】

【氏名】手塚 克成

(72)【発明者】

【氏名】田鶴 圭亮

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１５６５１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１５３９６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平１１−５１４３６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 医学のあゆみ，１９８７年，Vol.141, No.12，p.907-909

【文献】 Trends in Glycoscience and Glycotechnology，１９９２年，Vol.4, No.18，p.336-344

【文献】 FEBS Lett.，１９８０年，Vol.109, No.1，p.55-58

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

糖鎖付加ポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４；
（Ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４において、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；および
（Ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４に対して、９０％以上の同一性を有するポリペプチド；
からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、
Ｎ個（ここでＮは、１以上２０以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含み、および／または、Ｍ個（ここでＭは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含み、
糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸を含んでおり、
前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸は、前記Ｎ個のアミノ酸のいずれか、または、前記Ｍ個のアミノ酸のいずれかに存在し、かつ、
ソマトスタチン受容体に対する親和性を有することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記Ｎ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項3】

請求項１における糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つアミノ酸が、前記Ｍ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項4】

請求項１に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸の配列が、Ｘ−Ｙ−で表され、
ここで、ＸはＬ個（ここでＬは１以上６以下の整数）の任意のアミノ酸の配列を意味し、また、Ｙは、
（１）Ｌｙｓ、
（２）Ａｒｇ−Ｌｙｓ、
（３）Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、
（４）Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（５）Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（６）Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（７）Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（８）Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（９）Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１０）Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１１）Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１２）Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１３）Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１４）Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、および
（１５）上記配列（２）〜（１４）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列
からなる群から選択される配列である
ことを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項5】

請求項４に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記Ｎ個のアミノ酸の配列を表すＸ−Ｙ−におけるＸを意味するＬ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項6】

請求項２に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸は、リンカーを介して当該Ｎ末端側に連結していることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項7】

糖鎖付加ポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８；
（Ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８において、１若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
（Ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８に対して、９０％以上の同一性を有するポリペプチド；
（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかにおいて、Ｊ個（ここでＪは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含むポリペプチド；および
（Ｆ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかにおいて、Ｋ個（ここでＫは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含むポリペプチド；
からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、
少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、
ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸は、
ＳＲＩＦ２８における１位に相当するアミノ酸、５位に相当するアミノ酸、９位に相当するアミノ酸、１２位に相当するアミノ酸、１３位に相当するアミノ酸、１４位に相当するアミノ酸、および、１９位に相当するアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸であるか、
前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側の前記Ｊ個のアミノ酸のいずれかに存在するか、または
前記（Ｆ）のポリペプチドのＣ末端側の前記Ｋ個のアミノ酸のいずれかに存在する、かつ、
ソマトスタチン受容体に対する親和性を有し、
ここで、前記糖鎖付加ポリペプチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性が保持された配列を含む
ことを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記ソマトスタチン受容体に対する親和性が、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５からなる群より選択される受容体の少なくとも２以上の受容体に対する親和性を有することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項9】

請求項８に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドが、少なくともＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４のいずれか１つに対して親和性を有することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項10】

請求項８に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４の両方に対して親和性を有することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項11】

請求項８に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５の全てに対して親和性を有することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリぺプチドは、ＳＲＩＦ２８と比較して、増大した血中安定性を有することを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか1項に記載の糖鎖付加ポリぺプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓであることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項14】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が４個以上の糖からなることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項16】

請求項１〜１５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖、３本鎖複合型糖鎖、または４本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項17】

請求項１〜１５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項18】

請求項１６または１７に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記２本鎖複合型糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖およびジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項19】

請求項１〜１４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が、下記式：

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

を示し、Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖であることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項20】

請求項１〜１６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖が、非還元末端に少なくとも１つのシアル酸を有しており、前記シアル酸のカルボキシ基が、炭素数１〜３０のアルキルアミノ基、ベンジル基、アミノ基、またはアミノエチルアミノ基により修飾されていることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項21】

請求項１〜２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドは、複数の糖鎖付加アミノ酸を有しており、
前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が、いずれも同一であることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項22】

請求項１〜２１のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドは、ＳＲＩＦ２８における１７位のＣｙｓと２８位のＣｙｓに相当するＣｙｓを有しており、
さらに、これらのＣｙｓは、相互にジスルフィド結合していることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項23】

請求項１〜２２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドのＣ末端は、アミド化されていることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項24】

請求項１〜２２のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端にアジド基が導入されていることを特徴とする、
糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項25】

請求項１〜２４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
前記糖鎖付加ポリペプチドが、標識されていることを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチド。

【請求項26】

（Ｉ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドおよび／または薬学的に許容されるその塩、および、
（ＩＩ）薬理学的に許容される担体
を含むことを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項27】

請求項２６に記載の医薬組成物であって、
前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖が、実質的に均一であることを特徴とする、
医薬組成物。

【請求項28】

請求項２６または２７に記載の医薬組成物であって、
ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防のために用いられることを特徴とする、医薬組成物。

【請求項29】

請求項１〜２５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドの有効量を非ヒト対象に投与することを特徴とする、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防方法。

【請求項30】

糖鎖付加ポリペプチドであって、
配列番号５〜１０、１４、１７〜２０、２７、２８、３１、３２、３５〜３７、８９、１０１、１０３、１０５、１０７、１１０、１１２、１１４、１２３〜１２９、１３３〜１３５、１３８、および１４１からなる群より選択される、
糖鎖付加ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖鎖付加ポリペプチド、当該ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ソマトスタチンは、中枢神経系および周辺組織の両方に存在する環式ペプチドである。ソマトスタチンは、最初に、哺乳類の視床下部から単離され、下垂体前葉から成長ホルモン分泌物の重要な阻害剤として同定された。このペプチドは、視床下部、膵臓、消化管等に広く分布しており、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現する。また、ソマトスタチンは、下垂体における成長ホルモン（ＧＨ）の分泌抑制、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）分泌抑制をはじめ、消化管でのガストリン、セレクチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制することで知られている。加えて、消化管運動を抑制する作用を有することも知られている。

【0003】

構造式：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号１）を有する天然のソマトスタチン（ソマトトロピン放出阻害因子（ＳＲＩＦ）としても知られる）が、最初に、Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎおよび共同研究者によって単離された。このソマトスタチンは受容体のファミリーと相互作用することによってその効果を発揮する。ソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）には、１から５までのサブタイプ（ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５）が存在し、なかでもＳＳＴＲ２はＧＨ分泌性ヒト下垂体アデノーマ、中枢神経系、下垂体前葉、網膜、副腎髄質、胃、十二指腸粘膜、小腸、結腸の各組織、および膵臓ランゲルハンス島のグルカゴン分泌性Ａ細胞に分布することが知られている。また、これらの各受容体は、各種の腫瘍においても発現することが知られており、例えば、機能性下垂体腺腫においてはＳＳＴＲ１とＳＳＴＲ５が発現しており、胃腸腫瘍においてはＳＳＴＲ２の他、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３が発現しており、褐色細胞腫ではＳＳＴＲ３が発現しており、前立腺癌においてはＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ５が発現しており、結腸直腸癌においては、ＳＳＴＲ５が発現していることが報告されている（非特許文献１）。また、ＳＳＴＲ４は、拮抗的に調節作用を持つレセプターとして機能すること、および、緑内障関連の疾患の治療において重要である可能性について報告されている（非特許文献２）。このように、ソマトスタチンおよびその類縁体は、ソマトスタチン関連疾患や様々な種類の腫瘍に対して潜在的に有用な治療薬である。

【0004】

一方で、天然に存在するソマトスタチンは、血中半減期が２〜３分と短いため、生物学的利用能が小さく、作用の持続時間が短いという二つの望ましくない性質を示すので、治療剤としての使用や応用は限られる。この理由により、効力、生体安定性、作用の持続時間、または成長ホルモン、インスリンもしくはグルカゴンの放出の抑制を考慮した選択性のいずれかが優れたソマトスタチン類縁体を見い出すために様々なソマトスタチン類縁体の開発がなされてきた。

【0005】

臨床的に利用できる最初に承認されたソマトスタチン類縁体としては、オクトレオチド（Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）（特許文献１および特許文献２）が報告されており、このオクトレオチドは、ソマトスタチン受容体のＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、およびＳＳＴＲ５に対して親和性を有することが知られている。
オクトレオチドは、ソマトスタチンの生物学的活性を示すのに重要な部分である４つのアミノ酸（Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）の配列を有し、その配列の両末端にジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成するＣｙｓを有し、さらにその両末端のＣｙｓの外側にＤ−ＰｈｅとＴｈｒ（ｏｌ）を有する８つのアミノ酸よりなる環状ペプチドとして開発されている。このオクトレオチドは、そのアミノ酸配列により、血中半減期を向上させることで作用の持続性を得ることができ、また、ソマトスタチンに比べ、成長ホルモン（ＧＨ）に対する選択性が高く、強力な作用を持つことが可能である。

【0006】

このようなオクトレオチドを含むソマトスタチン類縁体は、ホルモン分泌性およびホルモン依存性腫瘍を有する患者の治療に使用することができる。現在のところ、神経内分泌系腫瘍である転移性カルチノイド腫瘍に関連する症状（潮紅、下痢、心弁膜疾患および腹痛）ならびに血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）分泌腺腫に関連する症状（水様性下痢）は、オクトレオチドによって治療される。
例えば、カルチノイドおよびＶＩＰ産生腫瘍において、オクトレオチドはその活性因子の分泌および作用の両方を阻害する。したがって多量分泌性下痢を特徴とするＶＩＰ産生腫瘍では、ソマトスタチン類縁体は、ＶＩＰ分泌阻害により、また直接腸管分泌に影響を与えて、その下痢を低減させることができる。

【0007】

しかしながら、一方で多くの神経内分泌腫瘍は、オクトレオチドのようなソマトスタチン類縁体に対して耐性を有していることが報告されている（非特許文献３）。また、オクトレオチドは、先端巨大症の治療に使用されるが、先端巨大症患者の約３分の１には、効果がないことも報告されている。さらに、大半のカルチノイド腫瘍患者に対して、オクトレオチドは投与初期のみ効果を発揮し、投与期間が長引くとタキフィラキシー（速成耐性、速成寛容）が起こることが報告されている。さらに、初期のクッシング病患者の副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）産生抑制に対してオクトレオチドは効果を示さないことが報告されている。

【0008】

上記のような課題から、複数のソマトスタチン受容体を発現する腫瘍に対しては、天然のソマトスタチンのように高い親和性で複数の受容体サブタイプに結合するソマトスタチン類縁体の開発が望まれており、また、このようなソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチン類縁体は、これまでのソマトスタチン類縁体に治療効果がない患者や耐性を有する患者にも効果を有する可能性が示唆されている（非特許文献４）。
このように、天然に存在するソマトスタチンに類似した構造で、同様にソマトスタチン受容体に対して親和性を有し、かつ、ソマトスタチンに比べて血中半減期が延長したソマトスタチンアナログの開発が望まれていた。

【0009】

一方、糖鎖が生体内において様々な役割を担っていることが明らかになってきており、血中における半減期を延長するために、オクトレオチドに糖鎖を付加する方法も提案されている（例えば、特許文献３）。
しかしながら、その構造の複雑さや多様性によって研究が遅れており、糖鎖の種類や糖鎖を付加する位置が、必ずしも最適化されているとは言えず、これまでのソマトスタチン類似体の問題点を克服した糖鎖付加ポリペプチドについては報告されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許第４，３１０，５１８号

【特許文献2】米国特許第４，２３５，８８６号

【特許文献3】特開平０３−０１４５９９号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｃｕｒｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００４，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．６０８−６１３

【非特許文献2】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００３，Ｖｏｌ．４６，ｐｐ．５５８７−５５９６

【非特許文献3】Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１０，Ｖｏｌ．２４（１），ｐｐ．２４０−２４９

【非特許文献4】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８６，２００８，ｐｐ．６９−７４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明の課題は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有し、かつ、ソマトスタチンと比べて、血中安定性が向上した糖鎖付加ポリペプチドを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持し、かつ、血中安定性が向上した糖鎖付加ポリペプチドを見出した。
即ち、本発明は、
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４；（Ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；（Ｃ）ＳＲＩＦ１４の類縁体;（Ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４に対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）において、Ｎ個（ここでＮは、１以上２０以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含むポリペプチド；および、（Ｆ）（Ａ）〜（Ｄ）において、Ｍ個（ここでＭは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含むポリペプチド；からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有することを特徴とする糖鎖付加ポリペプチドに関する。

【0014】

ここで、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸が、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側の前記Ｎ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｆ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｆ）のポリペプチドのＣ末端側の前記Ｍ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、さらに、Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸の配列が、Ｘ−Ｙ−で表され、ここで、ＸはＬ個（ここでＬは１以上６以下の整数）の任意のアミノ酸の配列を意味し、また、Ｙは、（１）Ｌｙｓ、（２）Ａｒｇ−Ｌｙｓ、（３）Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、（４）Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（５）Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（６）Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（７）Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（８）Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（９）Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１０）Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１１）Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１２）Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１３）Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１４）Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、および（１５）上記配列（２）〜（１４）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列からなる群から選択される配列であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸の配列を表すＸ−Ｙ−におけるＸを意味するＬ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸は、リンカーを介して当該Ｎ末端側に連結していることを特徴とする。

【0015】

また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの別の実施態様においては、（Ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８；（Ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；（Ｃ）ＳＲＩＦ２８の類縁体;（Ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８に対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）において、Ｊ個（ここでＪは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含むポリペプチド；および（Ｆ）（Ａ）〜（Ｄ）において、Ｋ個（ここでＫは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含むポリペプチド；
からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸が、ＳＲＩＦ２８における１位に相当するアミノ酸、５位に相当するアミノ酸、９位に相当するアミノ酸、１２位に相当するアミノ酸、１３位に相当するアミノ酸、１４位に相当するアミノ酸、および、１９位に相当するアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側の前記Ｊ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｆ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｆ）のポリペプチドのＣ末端側の前記Ｋ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。

【0016】

また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記ソマトスタチン受容体に対する親和性が、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５からなる群より選択される受容体の少なくとも２以上の受容体に対する親和性を有することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、少なくともＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４のいずれか１つに対して親和性を有することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４の両方に対して親和性を有することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５の全てに対して親和性を有することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリぺプチドは、ＳＲＩＦ２８と比較して、増大した血中安定性を有することを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓであることを特徴とする。

【0017】

また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が４個以上の糖からなることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖、３本鎖複合型糖鎖、または４本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記２本鎖複合型糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、およびジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が、下記式：

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

を示し、Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖が、非還元末端に少なくとも１つのシアル酸を有しており、前記シアル酸のカルボキシ基が、炭素数１〜３０のアルキルアミノ基、ベンジル基、アミノ基、またはアミノエチルアミノ基により修飾されていることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、複数の糖鎖付加アミノ酸を有しており、前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が、いずれも同一であることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、ＳＲＩＦ２８における１７位のＣｙｓと２８位のＣｙｓに相当するＣｙｓを有しており、さらに、これらのＣｙｓは、相互にジスルフィド結合していることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドのＣ末端は、アミド化されていることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端に、アジド基が導入されていることを特徴とする。
また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、標識されていることを特徴とする。

【0018】

また、本発明の別の態様は、（Ｉ）上記に記載する糖鎖付加ポリペプチドおよび／または薬学的に許容されるその塩、および、（ＩＩ）薬理学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖が、実質的に均一であることを特徴とする。
また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防のために用いられることを特徴とする。
また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記ソマトスタチンに関連する疾患が、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、カルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、放射線障害、眼疾患、ドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、ならびに、結膜炎からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする。

【0019】

また、本発明の別の態様は、上記に記載の糖鎖付加ポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防方法に関する。
また、本発明の治療または予防方法の一実施態様においては、前記ソマトスタチンに関連する疾患が、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、カルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、放射線障害、眼疾患、ドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、ならびに、結膜炎からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする。

【発明の効果】

【0020】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有しており、また、ソマトスタチンと比べて向上した血中安定性を有する。また、本発明の糖鎖付加ポリぺプチドは、上記特徴を有することにより、ソマトスタチン関連疾患の治療に用いることができる。

【0021】

また、本発明の糖鎖付加ソマトスタチンに付加される糖鎖は、生体内で容易に分解されるので、その蓄積により生体に薬害を与えることはない。

【0022】

また、本発明の糖鎖付加ソマトスタチンに付加される糖鎖の一部または全部は、ヒトを含む哺乳類鳥類等の生体内に存在する糖鎖やその改変体であり、体内に投与しても副作用や抗原性を示す可能性が低い。アレルギー反応や、抗体産生が生じたり、それによって薬効が得られなくなったりする等の心配が少ない。

【0023】

さらに、本発明で用いられる糖鎖には、比較的短いものが多いので、複雑な製造工程を経ずに、均一な構造のものを得ることができる。従って、大規模かつ安定に医薬品レベルの高品質なソマトスタチン活性を有する糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１Ａ〜図１Ｄは、本発明の一実施の形態における糖鎖付加ポリペプチドについての各化合物名と、当該化合物名を有する糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列情報を示した図である。また、図１Ｅは、ＳＲＩＦ１４、ＳＲＩＦ２８、および本発明の一実施の形態における糖鎖付加ポリペプチドを、ソマトスタチン受容体発現細胞に処置した際の、ｃＡＭＰ産生抑制作用（アゴニスト活性）についてのＩＣ_５０の値を示すグラフである。

【図2】図２は、ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与または皮下投与した際の、各ポリペプチドの血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図２中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図3】図３は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図３中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図4】図４は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図４中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図5】図５は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図５中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図6】図６は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図６中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図7】図７は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図７中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図8】図８は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図８中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図9】図９は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図９中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図10】図１０は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１０中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図11】図１１は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１１中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図12】図１２は、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１２中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図13】図１３は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１３中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図14】図１４は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））−ＳＲＩＦ２８ラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１４中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図15】図１５は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１５中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図16】図１６は、ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１６中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図17】図１７は、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１７中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図18】図１８は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１８中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。

【図19】図１９は、本発明の一実施の形態における糖鎖付加ポリペプチドについて、ラット血漿を用いた血漿中安定性試験の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本明細書において「ソマトスタチン」とは、１４個のアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４、または、２８個のアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８を指す。
なお、本明細書において、ＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列におけるＮ末端のＳｅｒを１位とし、Ｃ末端のＣｙｓを２８位とする。ここで、ＳＲＩＦ１４は、ＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列における１５位から２８位のアミノ酸配列と完全一致している。なお、ＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列の１５位はＡｌａであるが、ＳＲＩＦ１４のアミノ酸配列（配列番号１）におけるＮ末端のＡｌａを、ＳＲＩＦ２８の１５位に対応させて、１５位とする。なお、ＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８は、１７位のＣｙｓと２８位のＣｙｓにおいてジスルフィド結合を有する。

【0026】

ＳＲＩＦ１４は下記のアミノ酸配列（配列番号１）を有する。なお、下記アミノ酸配列において、「Ａｌａ_１５」の１５は、１５位のＡｌａであることを意味する。
Ａｌａ_１５‐Ｇｌｙ_１６‐Ｃｙｓ_１７‐Ｌｙｓ_１８‐Ａｓｎ_１９‐Ｐｈｅ_２０‐Ｐｈｅ_２１‐Ｔｒｐ_２２‐Ｌｙｓ_２３‐Ｔｈｒ_２４‐Ｐｈｅ_２５‐Ｔｈｒ_２６‐Ｓｅｒ_２７‐Ｃｙｓ_２８

【0027】

ＳＲＩＦ２８は下記のアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
Ｓｅｒ_１‐Ａｌａ_２‐Ａｓｎ_３‐Ｓｅｒ_４‐Ａｓｎ_５‐Ｐｒｏ_６‐Ａｌａ_７‐Ｍｅｔ_８‐Ａｌａ_９‐Ｐｒｏ_１０‐Ａｒｇ_１１‐Ｇｌｕ_１２‐Ａｒｇ_１３‐Ｌｙｓ_１４‐Ａｌａ_１５‐Ｇｌｙ_１６‐Ｃｙｓ_１７‐Ｌｙｓ_１８‐Ａｓｎ_１９‐Ｐｈｅ_２０‐Ｐｈｅ_２１‐Ｔｒｐ_２２‐Ｌｙｓ_２３‐Ｔｈｒ_２４‐Ｐｈｅ_２５‐Ｔｈｒ_２６‐Ｓｅｒ_２７‐Ｃｙｓ_２８

【0028】

本明細書中において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体および誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体および誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；およびアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジンおよびα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。ソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチン類縁体のいくつかは、非天然アミノ酸を含むことが知られる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。

【0029】

本明細書中において、アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたという場合、置換等されるアミノ酸の個数は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を保持する限り特に限定されないが、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個程度であるかあるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたソマトスタチンペプチドの例としては、例えば、２２位のＴｒｐをＤ体のＴｒｐ（Ｄ−Ｔｒｐ）で置換したソマトスタチンペプチド、１９位のＡｓｎを欠失させたもの（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００１，４４，２２３８−２２４６）、２５位のＰｈｅをＴｙｒに置換したもの、８位のＭｅｔをＬｅｕに置換したもの（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８２，１０：１０４９−１０５１）等が挙げられる。

【0030】

本発明において、「ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８の類縁体」とは、ソマトスタチンと構造上類似したポリペプチドおよび／またはソマトスタチンと重複した構造を有するポリペプチド、例えば、ソマトスタチンのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたポリペプチド、ソマトスタチン改変体、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチンのフラグメント、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する伸長ソマトスタチンが挙げられる。

【0031】

本明細書中において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数および／または疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、ソマトスタチン受容体に対する親和性の明らかな低下または消失を生じない置換をいう。

【0032】

本明細書中において、「ソマトスタチン改変体」とは、ソマトスタチンの改変体であって、ソマトスタチンの天然に存在する変異体、またはソマトスタチンを人工的に改変した化合物を含み、そのような改変としては、例えば、ソマトスタチンの１または複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。

【0033】

本明細書中において、「ソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチンのフラグメント」とは、ソマトスタチンのＮ末端および／またはＣ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつソマトスタチン受容体に対する親和性を維持したペプチドである。

【0034】

本明細書中において、「ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する伸長ソマトスタチン」とは、ＳＲＩＦ２８またはＳＲＩＦ１４のＮ末端および／またはＣ末端に１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、かつソマトスタチン受容体に対する親和性を維持したペプチドである。

【0035】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または、これらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にさらにアミノ酸が付加されたポリペプチド；であって、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する糖鎖付加ポリペプチドを含む。
配列番号１または配列番号２と相同性を有するポリペプチドは、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する限り、好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性を有することができる。

【0036】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、上記のように、ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のＮ末端および／またはＣ末端に、さらにアミノ酸が付加されたポリペプチドも含む。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持する限り特に制限されないが、例えば、１以上２０個以下のアミノ酸を付加することができる。
ここで、ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、Ｘ−Ｙ−で表すことができる。なお、ＹはＳＲＩＦ１４のポリペプチドにおけるＮ末端アミノ酸に直接結合するアミノ酸であり、Ｙは、以下（１）〜（１５）のいずれかのアミノ酸配列からなる：
（１）Ｌｙｓ、
（２）Ａｒｇ−Ｌｙｓ、
（３）Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、
（４）Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（５）Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（６）Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（７）Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（８）Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（９）Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１０）Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１１）Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１２）Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１３）Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
（１４）Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、および、
（１５）上記配列（２）〜（１４）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列
また、Ｘは１以上６以下の任意のアミノ酸であって、１個、２個、３個、４個、５個または、６個の任意のアミノ酸を示す。好ましくは、Ｘは、糖鎖付加アミノ酸であり、より好ましくは糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓである。

【0037】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、ＳＲＩＦ２８のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持する限り特に制限されないが、例えば、１以上６個以下の任意のアミノ酸を付加することができ、１個、２個、３個、４個、５個または、６個の任意のアミノ酸を付加することができる。ＳＲＩＦ２８のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、好ましくは糖鎖付加アミノ酸であり、より好ましくは糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓである。また、１以上６個以下の任意のアミノ酸は、その全てを糖鎖付加アミノ酸とすることもできる。

【0038】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持する限り特に制限されないが、例えば、１以上６個以下の任意のアミノ酸を付加することができ、１個、２個、３個、４個、５個または、６個の任意のアミノ酸を付加することができる。ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸は、好ましくは糖鎖付加アミノ酸であり、より好ましくは糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓである。また、１以上６個以下の任意のアミノ酸は、その全てを糖鎖付加アミノ酸とすることもできる。

【0039】

本明細書中において、「ソマトスタチンのＮ末端側（ＳＲＩＦ２８の１位またはＳＲＩＦ１４の１５位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＳＲＩＦ２８においては、Ｎ末端である１位のＳｅｒに、さらに任意のアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸が付加したものいう。また、ＳＲＩＦ１４においては、Ｎ末端である１５位のＡｌａに、さらに任意のアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸が付加したものをいう。
同様に、「Ｃ末端側（ＳＲＩＦ２８またはＳＲＩＦ１４の２８位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＳＲＩＦ２８またはＳＲＩＦ１４の２８位のＣｙｓに、さらに任意のアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸が付加したもをのをいう。

【0040】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に、リンカーを介してアミノ酸をさらに付加することもできる。このようなリンカーとしては、例えば、アミノ酸とペプチド結合できるように、両末端にアミノ基およびカルボキシ基を有するアルキル鎖やポリエチレングリコール鎖等を挙げることができる。このようなリンカーとしては、例えば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−（式中、ｎは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは１〜１５の整数を示す。）や−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯ−（式中、ｍは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは１〜７の整数を示す。）等を挙げることができる。より具体的には、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_１１−ＣＯ−（Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ）や−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_３−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯ−（ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ）等を挙げることができる。また、リンカーを介して、糖鎖付加ポリペプチドに付加されるアミノ酸は、特に限定されないが、好ましくは糖鎖付加アミノ酸である。糖鎖付加アミノ酸としては、例えば、糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓを挙げることができる。

【0041】

また、本発明の一実施態様において、糖鎖付加ポリペプチドは、そのＮ末端に、アジド基を導入することもできる。糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端をアジ化すると、アジド‐アルキン［３＋２］環化付加反応やＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応などを利用して、様々な分子を選択的に導入できることから好ましい。糖鎖付加ポリペプチドをアジ化する方法は、特に制限されないが、例えば、固相合成中において樹脂上に合成された糖ペプチドのＮ末端へ、縮合剤を用いてアジド置換脂肪酸を縮合させることにより得ることができる。アジド置換脂肪酸としては、４−アジドブタン酸、５−アジド−ペンタン酸（５−Ａｚｉｄｏ−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、６−アジドヘキサン酸を挙げることができる。

【0042】

また、本発明の一実施態様において、糖鎖付加ポリペプチドは、そのＮ末端に、標識化合物を付加させることもできる。本発明に使用される標識化合物としては、以下に限定されないが、例えば、ビオチン、蛍光色素、金属イオンキレート剤等を挙げることができる。標識化合物は、糖ペプチドのＮ末端と直接結合させることもできるし、リンカーを介して糖ペプチドのＮ末端と結合とさせることもできる。例えば、標識化合物として、ビオチンを糖ペプチドのＮ末端に付加させることにより、アビジンとの強い結合を利用して、研究用試薬，臨床検査薬、またはミサイル療法への応用を可能とすることができる。
なお、本発明の糖鎖付加ポリペプチドへの標識化合物の付加は、従来当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、固相合成中における樹脂上の糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端に縮合剤を用いて標識化合物を縮合させることができる。

【0043】

本発明の「糖鎖付加ポリペプチド」は、少なくとも１個のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする。
本明細書中において、「糖鎖付加ポリペプチド」には、ソマトスタチンの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたポリペプチド、上記ソマトスタチン類縁体において少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたポリペプチド等が含まれ、それぞれ、さらに糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていても、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。これらのペプチドのＣ末端がアミド化されたペプチド（たとえば、Ａｌａ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ｌｙｓ‐Ａｓｎ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｔｒｐ‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ｃｙｓ−ＮＨ_２（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＳＲＩＦ１４ＮＨ_２や、Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ‐Ａｌａ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ｌｙｓ‐Ａｓｎ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｔｒｐ‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ｃｙｓ−ＮＨ_２（配列番号４）のアミノ酸配列を有するＳＲＩＦ２８ＮＨ_２の、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチドも、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。さらに、これらのペプチドの塩も、糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。

【0044】

本明細書中において、塩は、酸付加塩または塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸およびｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸である。塩基付加塩としては、水酸化アンモニウムまたはアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の無機塩基から誘導された塩が挙げられる。特に、薬学的に許容される塩が好ましい。

【0045】

本明細書中において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖たんぱく質）として存在するものと同一または類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒおよび糖鎖付加Ｔｈｒが好ましく、特に糖鎖付加Ａｓｎが好ましい。

【0046】

また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシ基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましい。

【0047】

なお、本発明の任意の糖鎖付加ポリペプチドについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位および糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ（リンカーを介さない）の場合と糖鎖付加Ｃｙｓ（リンカーを介する）の場合で、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの血中半減期に大きな違いはないと考えられる。

【0048】

糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ_２）_ａ−ＣＨ_２−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、Ｃ_１−１０ポリメチレン、−ＣＨ_２−Ｒ−（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）、−（ＣＯ）−（ＣＨ_２）_ａ−（ＣＯ）−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）等を挙げることができる。

【0049】

糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とソマトスタチン骨格上のアミノ酸がリンカーを介して結合している場合、リンカーが、糖鎖側の末端にアミノ酸を含むことも好ましい。アミノ酸の種類は特に限定されないが、好ましい例としてはＡｓｎを挙げることができる。

【0050】

なお、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチド」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法またはＢ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加ポリペプチドであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチド」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接またはリンカーを介して結合した糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加ポリペプチドにおいて、付加した糖鎖にさらに糖または糖鎖を付加することですでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加アミノ酸のアミノ基および／またはカルボキシ基に１または数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを１または複数のソマトスタチンフラグメントと連結させた糖鎖付加ポリペプチド；アミノ酸の結合した糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸にリンカーを介して結合した糖鎖付加ポリペプチド、なども最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。

【0051】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸の数は、血中安定性や成長ホルモン等の分泌抑制等の生理活性、最終的な糖鎖付加ポリペプチドに存在するアミノ酸の個数や糖鎖付加前後の糖鎖付加ポリペプチドの分子量、等により適宜調節すればよい。例えば、１〜１０個置換することが好ましく、１〜５個置換することがより好ましく、１〜３個置換することがさらに好ましい。簡便性の観点からは、１個の置換で所望の活性が得られるのであれば、１個の置換を選択することが好ましい。なお、本発明の一態様においては、２個以上置換することが好ましく、例えば、２〜５個置換することが好ましく、２〜３個置換することがより好ましい。一般に、ソマトスタチンの１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１個以上をさらに糖鎖付加アミノ酸で置換した場合、血中安定性は増大し、受容体に対する親和性は減少する傾向がある。しかしながら、一方で糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性は増大するため、減少したソマトスタチン活性を補償または増大させることが可能である。
また、糖鎖付加ポリペプチド中に複数の糖鎖を有する場合、糖鎖同士は糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列において、連続したアミノ酸に付加することもできるし、間隔をあけて、アミノ酸に付加することもできる。糖鎖を密に配置すると、急激な血漿中濃度の上昇がない点において好ましい。また、生物学的利用能の観点からは、糖鎖を付加する位置は、連続したアミノ酸に密に付加するよりも、間隔をとり複数の糖鎖を付加する方が好ましい。

【0052】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、特に、複数のソマトスタチン受容体への親和性の観点より適宜調節することができる。

【0053】

本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ポリペプチドのソマトスタチン受容体に対する親和性のうち、複数のＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の受容体に対して親和性を有するという観点からは、例えば、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側から１番目、２番目、３番目、６番目、１０番目、および、１４番目に付加されるアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。好ましくは、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側から３番目、６番目、１０番目、および、１４番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。
また、同様に、複数のＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の受容体に対して親和性を有するという観点からは、ＳＲＩＦ２８における、１位、５位、９位、１２位、１３位、１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。好ましくはＳＲＩＦ２８の１位、５位、９位、および、１２位に相当するアミノ酸を挙げることができる。
また、特に本発明の糖鎖付加ポリペプチドの２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する場合の例として、糖鎖付加ポリペプチドが複数のソマトスタチン受容体に対する親和性を有するという観点からは、例えばＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１０番目および１４番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目および１０番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より２番目および１４番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目および１５番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目、１５番目、および１６番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目、１０番目、および１４番目に付加されるアミノ酸の置換などを挙げることができる。好ましくは、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１０番目および１４番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目および１０番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目および１５番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目、１５番目、および１６番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目、１０番目、および１４番目に付加されるアミノ酸の置換などを挙げることができる。
また、同様に、２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する場合の例として、糖鎖付加ポリぺプチドが複数のソマトスタチン受容体に対する親和性を有するという観点からは、ＳＲＩＦ２８における、１位と５位に相当するアミノ酸；５位と９位に相当するアミノ酸；１位と１３位に相当するアミノ酸；１位に相当するアミノ酸と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸においてＮ末端側より１番目に付加されるアミノ酸；１位に相当するアミノ酸と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸においてＮ末端側より１番目および２番目に付加されるアミノ酸；１位、５位、および、９位に相当するアミノ酸の置換などを挙げることができ、好ましくは１位と５位に相当するアミノ酸の置換；５位と９位に相当するアミノ酸の置換；１位に相当するアミノ酸の置換と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸において１番目に付加されるアミノ酸；１位に相当するアミノ酸と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸においてＮ末端側より１番目および２番目に付加されるアミノ酸；１位、５位、および、９位に相当するアミノ酸の置換である。

【0054】

本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性という観点からは、例えば、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側から１番目、２番目、３番目、６番目、１０番目、１４番目に付加されるアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。好ましくは、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側より１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。より好ましくは、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１番目に付加されるアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側より１番目に付加されるアミノ酸である。
また、同様に、糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性という観点からは、例えば、ＳＲＩＦ２８における、１位、５位、９位、１２位、１３位、１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸であり、好ましくはＳＲＩＦ２８における１３位、１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸であり、特に好ましくはＳＲＩＦ２８における１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目に付加されるアミノ酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸である。特にＳＲＩＦ２８のＮ末端から遠い部位のアミノ酸の置換も好ましい。

【0055】

ここで、「特定のアミノ酸に相当するアミノ酸」とは、糖鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸の付加、欠失等がない限り、ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列に対応する同一の位置のアミノ酸をいう。また、糖鎖ポリペプチドのアミノ酸配列内において、アミノ酸の付加、欠失が存在する場合には、アミノ酸の付加、欠失によるアミノ酸配列上の移動を考慮した位置にあるアミノ酸をいう。例えば、１位から４位までにＳｅｒ_１‐Ａｌａ_２‐Ａｓｎ_３‐Ｓｅｒ_４‐の配列を有する糖鎖付加ポリペプチドにおいて、２位と３位のアミノ酸の間に１つのアミノ酸（Ｔｒｐ）が付加された場合（Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ｔｒｐ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐）、３位のアミノ酸（Ａｓｎ）に相当するアミノ酸とは、糖鎖付加ポリペプチドにおいて、Ｔｒｐの挿入によりＣ末端側に１つ移動したアミノ酸（Ａｓｎ）をいう。

【0056】

本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸で置換するアミノ酸は、ＳＲＩＦ２８における１７位、２１位、２２位、２３位、および、２８位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましく、特に、ＳＲＩＦ２８における１７位、２２位、２３位、および２８位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸から選択される１以上のアミノ酸であることがより好ましい。

【0057】

本発明の一態様において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている場合に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、上記のいずれの組み合わせも採用することができるがこれに限定されない。例えば、１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８の任意の部位から選択される組み合わせ；１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がソマトスタチンのＮ末端（ＳＲＩＦ２８における１位、または、ＳＲＩＦ１４における１５位）またはＣ末端にさらに付加された１若しくは数個のアミノ酸の任意の部位から選択される組み合わせ等もまた、本発明の好ましい一態様に含まれる。

【0058】

本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が生ずる部位は、例えば、ＳＲＩＦ２８における１７位、２２位、２３位、および２８位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましい。

【0059】

本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸並びにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。

【0060】

また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシ基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシ基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。

【0061】

本発明において、好ましい糖鎖は、ソマトスタチンに付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でソマトスタチンのアミノ酸と置換された場合）に、ソマトスタチンの血中安定性を増大させ、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を消失させない糖鎖である。本発明のある態様において、好ましい糖鎖は、ソマトスタチンに付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でソマトスタチンのアミノ酸と置換された場合）に、ソマトスタチンの複数の受容体に対する親和性を維持できる糖鎖であり、さらに好ましくは、ソマトスタチンの全ての受容体に対する親和性を維持できる糖鎖である。

【0062】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（または糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。

【0063】

生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）としてペプチド（またはタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。

【0064】

本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式

【化3】

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［式中、Ｒ^１およびＲ^２は、同一または異なって、

【化4】

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を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。

【0065】

尚、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいては、糖鎖が生体内で複合糖質として存在する糖鎖であっても、Ｏ−結合型およびＮ−結合型以外の方法でソマトスタチンペプチドに結合していてもよい。例えば、上述のとおり、糖鎖がリンカーを介してＣｙｓやＬｙｓに結合しているものも、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。

【0066】

本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上、１１個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。

【0067】

本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は、５〜１１個、９〜１１個または１１個の糖からなる糖鎖である。

【0068】

本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は、２本鎖の複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。

【化5】

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２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０〜３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、

【化6】

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モノシアロ糖鎖、

【化7】

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【化7A】

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アシアロ糖鎖、

【化8】

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ジグルクナック糖鎖、

【化9】

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ジマンノース糖鎖、

【化10】

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等が好ましく、より好ましくはジシアロ糖鎖である。

また、本発明の複合型糖鎖には、上記の２本鎖複合型糖鎖の他、３本鎖の複合型糖鎖（３分岐型複合型糖鎖）、４本鎖の複合型糖鎖（４分岐型複合型糖鎖）も含む。例えば、３本鎖、４本鎖の複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされる、トリシアロ糖鎖

【化-1】

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【化-2】

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下記構造式で表わされるテトラシアロ糖鎖

【化-3】

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を挙げることができる。また、３本鎖複合型糖鎖および４本鎖複合型糖鎖としては、これらのトリシアロ糖鎖またはテトラシアロ糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。
さらに、本発明の複合型糖鎖には、フコースが付いたものも含む。フコースが付いた複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされるフコース含有複合型糖鎖

【化-4】

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【化-5】

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【化-6】

[この文献は図面を表示できません]

【化-7】

[この文献は図面を表示できません]

【化-8】

[この文献は図面を表示できません]

を挙げることができる。また、これらのフコース含有複合型糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。
また、本明細書中において「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」、「２本鎖複合型糖鎖」、「３本鎖複合型糖鎖」、「４本鎖複合型糖鎖」、「フコース含有複合型糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖またはモノシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。
また、糖鎖の非還元末端にシアル酸を有する糖鎖の場合には、シアル酸のカルボキシ基が修飾された糖鎖を用いることもできる。シアル酸のカルボキシ基の修飾としては、カルボキシ基の負電荷を消失させる、または、正電荷へ変換できる基であることが好ましく、例えば、炭素数１〜３０のアルキルアミノ基、ベンジル基、アミノ基、アミノエチルアミノ基等を挙げることができる。これらの修飾基の導入により、シアル酸のカルボキシル基の負電荷を消失させる（ベンジル基、アミノ基等）、または、正電荷へ変換する（アミノエチルアミノ基等）ことで、糖鎖付加ポリペプチドの血中クリアランスや体内分布の制御を意図することができる。

【0069】

また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５〜９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース−５（Ｍ−５）

【化11】

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ハイマンノース−９（Ｍ−９）

【化12】

[この文献は図面を表示できません]

等を挙げることができる。

【0070】

本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類およびそれらの結合様式が同一の糖鎖）またはこれの非還元末端から１または複数の糖を失った糖鎖である、下記に記載の糖鎖を挙げることができる。

【0071】

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

【0072】

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

【0073】

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

【0074】

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

【0075】

本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチド中の糖鎖付加アミノ酸における糖鎖の構造は、実質的に同一とすることもでき、または、異なる糖鎖構造を有していてもよい。糖鎖付加ポリペプチド中の糖鎖の構造を実質的に同一とする際は、例えば、９０％以上同一、あるいは９９％以上同一であることが好ましく、糖鎖の構造が完全に同一であることが最も好ましい。なお、本明細書中において、糖ペプチドにおける糖鎖の構造が同一であるとは、２本以上の糖鎖が付加した糖鎖付加ポリペプチドにおいて、当該糖鎖同士を比較した場合に糖鎖を構成する糖の種類、結合順序、および結合様式が糖ペプチド内において同一であることをいう。また、本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの糖鎖は、均一であることが好ましい。本明細書において、糖鎖付加ポリペプチドにおいて糖鎖が均一とは、糖鎖付加ポリペプチド間において糖鎖を比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、および糖間の結合様式が糖ペプチド間で同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。特に、糖ペプチド間において糖鎖が均一である糖ペプチドを含む組成物等は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。

【0076】

本発明において、好ましい糖鎖付加ポリペプチドは、例えば、後述の実施例１〜６６において製造した糖鎖付加ポリペプチド（配列番号５〜３７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２３〜１２９、１３３〜１３５、１３８〜１４１、１４８、１５５、１６０）である。すなわち、以下のＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列：
Ｓｅｒ_１‐Ａｌａ_２‐Ａｓｎ_３‐Ｓｅｒ_４‐Ａｓｎ_５‐Ｐｒｏ_６‐Ａｌａ_７‐Ｍｅｔ_８‐Ａｌａ_９‐Ｐｒｏ_１０‐Ａｒｇ_１１‐Ｇｌｕ_１２‐Ａｒｇ_１３‐Ｌｙｓ_１４‐Ａｌａ_１５‐Ｇｌｙ_１６‐Ｃｙｓ_１７‐Ｌｙｓ_１８‐Ａｓｎ_１９‐Ｐｈｅ_２０‐Ｐｈｅ_２１‐Ｔｒｐ_２２‐Ｌｙｓ_２３‐Ｔｈｒ_２４‐Ｐｈｅ_２５‐Ｔｈｒ_２６‐Ｓｅｒ_２７‐Ｃｙｓ_２８（配列番号２）において：
（ａ１）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１）（配列番号５）；
（ａ２）５位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２）（配列番号６）；
（ａ３）９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３）（配列番号７）；
（ａ４）１２位のＧｌｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４）（配列番号８）；
（ａ５）１３位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５）（配列番号９）；
（ａ６）１４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６）（配列番号１０）；
（ａ７）１５位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例７）（配列番号１１）；
（ａ８）１６位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例８）（配列番号１２）；
（ａ９）１８位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例９）（配列番号１３）；
（ａ１０）１９位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１０）（配列番号１４）；
（ａ１１）２１位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１１）（配列番号１５）；
（ａ１２）２６位のＴｈｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１２）（配列番号１６）；
（ａ１３）２８位のＣｙｓのＣ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１３）（配列番号１７）；
（ａ１４）２８位のＣｙｓのＣ末端側にさらにＴｈｒ−ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１４）（配列番号１８）；
（ａ１５）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、２２位のＴｒｐがＤ体のＴｒｐに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１５）（配列番号１９）；
（ａ１６）９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、２２位のＴｒｐがＤ体のＴｒｐに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１６）（配列番号２０）；
（ａ１７）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２０）（配列番号２１）；
（ａ１８）１位のＳｅｒおよび５位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２１）（配列番号２２）；
（ａ１９）１位のＳｅｒおよび１３位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２２）（配列番号２３）；
（ａ２０）５位のＡｓｎおよび９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２３）（配列番号２４）；
（ａ２１）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが２つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２４）（配列番号２５）；
（ａ２２）１位のＳｅｒ、５位のＡｓｎ、および９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２５）（配列番号２６）；
（ａ２３）１位のＳｅｒがモノシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２６）（配列番号２７）；
（ａ２４）１位のＳｅｒがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２７）（配列番号２８）；
（ａ２５）１位のＳｅｒがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２８）（配列番号２９）；
（ａ２６）１位のＳｅｒがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが２つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２９）（配列番号３０）；
（ａ２７）５位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３０）（配列番号３１）；
（ａ２８）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３１）（配列番号３２）；
である。
（ａ２９）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、１９位のＡｓｎがＧｌｃＮＡｃ付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３２）（配列番号３３）；
（ａ３０）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、１９位のＡｓｎがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３３）（配列番号３４）；
（ａ３１）１位のＳｅｒのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３４）（配列番号８９）；
（ａ３２）１１位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３５）（配列番号９１）；
（ａ３３）２０位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３６）（配列番号９３）；
（ａ３４）２４位のＴｈｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３７）（配列番号９５）；
（ａ３５）２５位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３８）（配列番号９７）；
（ａ３６）２７位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３９）（配列番号９９）；
（ａ３７）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、２５位のＰｈｅがＴｙｒによって置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４１）（配列番号１０３）；
（ａ３８）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｃ末端がアミド化された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４２）（配列番号１０５）；
（ａ３９）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、当該ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓがビオチン化されている糖鎖付加ポリペプチド（実施例４４）（配列番号１１０）；
（ａ４０）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、糖がジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが、ＰＥＧリンカーを介してビオチン化されている糖鎖付加ポリペプチド（実施例４５）（配列番号１１２）；
（ａ４１）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、当該ジシアロ糖鎖付加ＣｙｓのＮ末端にアジド基が導入されている糖鎖付加ポリペプチド（実施例４６）（配列番号１１４）；
（ａ４２）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、１２位のＧｌｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓによって置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４７）（配列番号１１６）；
（ａ４３）１位のＳｅｒがジグルクナック糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５０）（配列番号１２３）；
（ａ４４）１位のＳｅｒがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５１）（配列番号１２４）；
（ａ４５）１９位のＡｓｎがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５２）（配列番号１２５）；
（ａ４６）１位のＳｅｒがＮ−アセチルグルコサミン付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５３）（配列番号１２６）；
（ａ４７）１９位のＡｓｎがＮ−アセチルグルコサミン付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５４）（配列番号１２７）；
（ａ４８）１位のＳｅｒがトリシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５５）（配列番号１２８）；
（ａ４９）１位のＳｅｒがテトラシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５６）（配列番号１２９）；
（ａ５０）１位のＳｅｒが、アミノエチルアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５７）（配列番号１３３）；
（ａ５１）１位のＳｅｒが、アミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５８）（配列番号１３４）；
（ａ５２）１位のＳｅｒが、ベンジル基により保護されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５９）（配列番号１３５）；
（ａ５３）１位のＳｅｒが、ヘキサデシルアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６０）（配列番号１３８）；
（ａ５４）１位のＳｅｒが、アミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６１）（配列番号１３９）；
（ａ５５）１位のＳｅｒが、ベンジル基により保護されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにベンジル基により保護されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６２）（配列番号１４０）；
（ａ５６）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎが付加されたＣｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６３）（配列番号１４１）；
（ａ５７）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換され、かつ、１９位のＡｓｎがジマンノース付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６４）（配列番号１４８）；
（ａ５８）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアミノエチルアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６５）（配列番号１５５）；
（ａ５９）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらに３つのジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６６）（配列番号１６０）；
である。
また、ＳＲＩＦ１４のアミノ酸配列：
Ａｌａ_１５‐Ｇｌｙ_１６‐Ｃｙｓ_１７‐Ｌｙｓ_１８‐Ａｓｎ_１９‐Ｐｈｅ_２０‐Ｐｈｅ_２１‐Ｔｒｐ_２２‐Ｌｙｓ_２３‐Ｔｈｒ_２４‐Ｐｈｅ_２５‐Ｔｈｒ_２６‐Ｓｅｒ_２７‐Ｃｙｓ_２８（配列番号１）において：
（ａ６０）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１７）（配列番号３５）；
（ａ６１）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１８）（配列番号３６）；
（ａ６２）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにＣ１２リンカーを介してジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１９）（配列番号３７）；
（ａ６３）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ-Ｌｙｓ−が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４０）（配列番号１０１）；
（ａ６４）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにＰＥＧリンカーを介してジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４３）（配列番号１０７）；
（ａ６５）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４８）（配列番号１１８）；
（ａ６６）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４９）（配列番号１２０）；
である。

【0077】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置および付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。

【0078】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加ポリペプチドの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ａ法）、およびソマトスタチンの任意のアミノ酸をＣｙｓで置換したペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ｂ法）を例示する。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加ポリペプチドを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加ポリペプチドおよびその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。

【0079】

また、これらのＡ法およびＢ法は、２つ以上を組み合わせて行うことも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法およびＢ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開第０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。

【0080】

糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ａ法）
糖鎖付加ポリペプチドは、例えば、以下に概略を示す糖鎖付加Ａｓｎを用いた固相合成によって製造することができる。
（１）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシ基を樹脂（レジン）へ結合させる。この場合、アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンとアミノ酸とが反応して結合が起こる。
（２）得られた反応物の脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とを、アミド化反応させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）および（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
ここで、（１）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用い、当該アスパラギン部分のカルボキシ基とレジンの水酸基とを反応させれば、Ｃ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するペプチドを得ることができる。
また、（２）の後、または、（３）と（４）を１回以上の任意の回数繰り返した後、（３）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いれば、任意の箇所に糖鎖を付加することができる。
また、（１）および（３）のいずれかの工程で、２回以上、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いれば、任意の２ヶ所以上に糖鎖が付加されたペプチドを得ることができる。
糖鎖付加アミノ酸を結合させた後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、その直後に工程（６）を行えば、Ｎ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するペプチドを得ることができる。

【0081】

樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、塩素で官能化された２−クロロトリチルクロリド樹脂（メルク社製）や、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、水酸基を有するＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴアルコール樹脂（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。また、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４−(４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ) −ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。Ｃ末端のアミノ酸が樹脂にあらかじめ結合したＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｉｔｙｌ ＮｏｖａＰＥＧ樹脂（メルク社製）等も用いることができる。
また、Ｃ末端をアミド化する場合には、例えば、アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）を用いることが好ましい。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。
樹脂と脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸との結合は、例えば、水酸基を有する樹脂や塩素で官能化された樹脂を使用するには、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂へエステル結合させる。また、アミノ基で官能化された樹脂を使用する場合には、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂にアミド結合により結合させる。
なお、２―クロロトリチルクロリド樹脂は、固相合成においてペプチド鎖を伸長する際、末端にあるＣｙｓのラセミ化を防止することができる点において、好ましい。

【0082】

アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
また、上記天然アミノ酸のＤ体を使用することもできる。

【0083】

脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。

【0084】

脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを挙げることができる。
また、脂溶性保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したものとして、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを挙げることができる。

【0085】

また、糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、固相合成の過程において、上記の脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。

【0086】

２−クロロトリチルクロリド樹脂を用いる場合、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等の塩基を用いることでエステル化を行うことができる。また、水酸基を有する樹脂を用いる場合、エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。

【0087】

エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、ジクロロメタン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。

【0088】

この時固相上の未反応の水酸基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。

【0089】

脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。

【0090】

遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とのアミド化反応は、活性化剤および溶媒の存在下行うのが好ましい。

【0091】

活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。

【0092】

活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。

【0093】

溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。

【0094】

樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。

【0095】

このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ａｓｎで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。また、このように精製された糖鎖付加ポリペプチドは、後述するように、脱保護されたＣｙｓ同士でのジスルフィド結合を形成させる。

【0096】

なお、本発明の一実施態様において、固相合成に用いる糖鎖付加Ａｓｎにおける糖鎖上の非還元末端にシアル酸を含む場合には、酸処理によりシアル酸が切断されるのを防ぐために、当該シアル酸のカルボキシ基を、保護基により保護していることが好ましい。保護基としては、例えば、ベンジル基、アリル基、ジフェニルメチル基等を挙げることができる。保護基の導入および保護基の脱離の方法は、公知の方法により行うことができる。また、保護基の脱離は、固相合成により製造された糖鎖付加ポリペプチドを樹脂から切断した後に行うことが好ましい。樹脂より切断後、糖鎖付加ポリペプチドにおいてジスルフィド結合を形成させることにより糖鎖付加ポリペプチドを環化させる場合には、保護基の脱離は、ジスルフィド結合の形成工程の前であってもよく、ジスルフィド結合の形成工程の後であってもよい。

【0097】

糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ｂ法）
糖鎖付加ポリペプチドは、まずペプチド鎖を合成し、後で合成したペプチド鎖へ糖鎖を付加する方法によっても製造することができる。具体的には、糖鎖を付加したい位置にＣｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞により合成する方法、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。ここで、ジスルフィド結合を形成する予定の位置にあるＣｙｓ等、糖鎖を付加しないＣｙｓに対しては、例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護しておく。また、糖鎖を付加せず、かつ、ジスルフィド結合の形成にも使用しないＣｙｓを糖鎖付加ポリペプチドに導入する場合には、糖鎖付加工程およびジスルフィド結合形成工程の間、Ｃｙｓを保護基により保護しておき、その後脱保護するようにしてＣｙｓを導入することができる。このような保護基としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）や４−メトキシベンジルを挙げることができる。
また、糖鎖付加ポリペプチド中のＣｙｓに、異なる糖鎖を付加する場合には、最初に糖鎖を導入するＣｙｓを無保護とし、次に異なる糖鎖を導入するＣｙｓを、ＳｔＢｕ等により保護しておくことで、異なる糖鎖を導入することができる。具体的には、固相合成等によりペプチドを合成する際、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓを無保護とし、かつ、第二の糖鎖を導入したいＣｙｓをＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ等を用いて、保護基を有するＣｙｓとする。その後、ＳｔＢｕ等の保護基を保持したまま、無保護のＣｙｓへ糖鎖を導入する。次に、ＳｔＢｕ基等を脱保護することで、無保護となったＣｙｓへ異なる糖鎖を導入することができる。なお、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓおよび第二の糖鎖を導入したいＣｙｓは、１つ又は複数個とすることができる。
なお、ＳｔＢｕ基の脱保護は、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン等の還元剤を用いて反応させることにより脱保護することができる。上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、５〜６０℃、更に好ましくは１０〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
異なる糖鎖を導入する際には、Ｃｙｓの脱保護工程における還元条件やＨＰＬＣ等の精製工程における酸性条件に対して、より安定な糖鎖から導入することが好ましい。特に、シアル酸含有糖鎖を導入する際には、シアル酸を有さない糖鎖又はシアル酸残基数が少ない糖鎖から、先に導入することが好ましい。
また、糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、例えば固相合成の過程において、脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、合成したポリペプチドの好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
次に、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体を上記で得た無保護のＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより、糖鎖を無保護のＣｙｓのチオール基と反応させ、ペプチドに結合させる。上記反応は、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合溶液中において、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、通常１０分〜２４時間、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。

【0098】

ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ａ−（ＣＯ）−ＣＨ_２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）で置換した化合物である。

【0099】

具体的には、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。
また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒と、上記の緩衝液との混合溶液中で反応を行うこともできる。このとき、有機溶媒の比率は、０〜９９％（ｖ／ｖ）の範囲で、上記緩衝液に添加することができる。緩衝液への溶解性が低い無保護のＣｙｓを含むペプチドは、このような有機溶媒を添加することにより反応溶液への溶解性を向上させることができ、好ましい。
また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒や、それらの混合溶液中で反応を行うこともできる。その際、塩基の存在下で行うのが好ましい。塩基としては、例えばＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６−コリジン等を挙げることができる。
また、グアニジン塩酸塩や尿素を緩衝溶液に加えた混合溶液中においても反応を行うことができる。なお、グアニジン塩酸塩や尿素は、最終濃度が１Ｍ〜８Ｍとなるように上記緩衝液に加えることができる。グアニジン塩酸塩や尿素の添加によっても、緩衝液への溶解性の低いペプチドの溶解性を向上させることができ、好ましい。
さらに、無保護のＣｙｓを含むペプチドが、ジスルフィド結合を介した２量体を形成することを防止するために、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）やジチオトレイトール（ＤＴＴ）を緩衝液に添加して反応させることもできる。ＴＣＥＰやＤＴＴは、最終濃度が１０μＭ〜１０ｍＭとなるように緩衝液に加えることができる。

【0100】

また、糖鎖を目的のＣｙｓへ結合させた後、Ａｃｍ等で保護されたＣｙｓの保護基を脱保護する。保護基がＡｃｍ基である場合は、水、メタノール、酢酸、またはこれらの混合溶液中において、ヨウ素、酢酸水銀（ＩＩ）、硝酸銀（Ｉ）、または、酢酸銀（Ｉ）等を用いて反応させることにより脱保護することができる。
上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、５〜６０℃、更に好ましくは１０〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分〜２４時間程度である。反応終了後は、ＤＴＴや塩酸等により処理した後、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。また、このように精製された糖鎖付加ポリペプチドは、後述するように、脱保護されたＣｙｓ同士でのジスルフィド結合を形成させる。

【0101】

また、上記Ａ法およびＢ法により作製された糖鎖付加ポリペプチドは、空気および／または酸素、ヨウ素、ＤＭＳＯ、酸化および還元されたグルタチオンの混合物、フェリシアン酸カリウム、エルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））、トリフルオロ酢酸タリウム（III）、ならびに、アルキルトリクロロシランスルホキシドなどを用いた当業者に周知の方法で、Ｃｙｓ同士のジスルフィド結合を形成することができる。
なお、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ間でのジスルフィド結合を形成させる際に、ジスルフィド結合することが望ましくない糖鎖付加ポリペプチド中のＣｙｓに対しては、保護基により保護しておく。このような保護基としては、Ａｃｍ、ｔＢｕ、４−メトキシベンジル、４−メチルベンジル等、酸化条件で安定な保護基を用いることができる。
また、Ｂ法において、ジスルフィド結合の形成は、糖鎖の導入の前に行うことも可能である。ただし、ジスルフィド結合させたいＣｙｓに保護基が導入されている場合には、脱保護の工程がジスルフィド結合形成の工程よりも先となる。

【0102】

（活性）
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有している。本明細書において、「ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する」とは、ソマトスタチン受容体であるＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、およびＳＳＴＲ５のうちの少なくとも１つに親和性を有することを意味する。

【0103】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、好ましくは２つ以上のソマトスタチン受容体に対する親和性を有し、より好ましくは３つ以上の受容体に対して親和性を有し、さらに好ましくは４つ以上の受容体に対して親和性を有し、最も好ましくは天然のソマトスタチン（ＳＲＩＦ２８およびＳＲＩＦ１４）と同様に、ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の５つ全ての受容体に親和性を有する。特に、少なくともＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４のいずれか一方の親和性と、その他のＳＳＴＲとの親和性を有していることが好ましい。
このように、本発明の糖鎖付加ポリペプチドが、ソマトスタチン受容体に対して親和性を有することで、ソマトスタチン受容体に対するソマトスタチン活性（アゴニスト活性）およびアンタゴニスト活性を有する。

【0104】

例えば、各ソマトスタチン受容体に対する親和性は、実施例６７−１および６７−２に示すような、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける競合的結合実験などを用いて測定することができる。
競合的結合実験による親和性の測定は、受容体に対して、標識リガンドと試験物質を競合的に結合させ、試験物質投与による標識リガンドの遊離を求めることより、試験物質の親和性（例えば、５０％阻害濃度：ＩＣ_５０値や、結合阻害定数：Ｋｉ値）を測定することができる。

【0105】

例えば、ソマトスタチン活性（アゴニスト活性）は、実施例６７−３および６７−４に示すような、ソマトスタチン受容体発現細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｃＡＭＰ産生抑制試験により評価することができる。
ｃＡＭＰ産生抑制試験は、ソマトスタチン受容体発現細胞に対して、糖鎖付加ポリペプチドまたは対照化合物となるＳＲＩＦ１４もしくはＳＲＩＦ２８を処置し、一定時間培養後に、細胞内に蓄積したｃＡＭＰ量を測定し、対照化合物と比較することで評価することができる。ｃＡＭＰ量の測定は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等、公知の手法により測定することができる。

【0106】

例えば、ソマトスタチン活性（アゴニスト活性）は、実施例８６および実施例８７に示すようなｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＨ産生抑制試験により評価することができる。
ＧＨ産生抑制試験は、例えば、下記のように実施することができる。非絶食下のラットへ糖鎖付加ポリペプチドを皮下投与する。ラットは全身麻酔下でＧＨ遊離促進剤を投与し、その後５分程度で採血を行う。採血した血液を血漿サンプルとし、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等、公知の手法によりＧＨ濃度を測定する。また、対照として糖鎖付加ポリペプチドを含まない生理食塩液を投与したラットより血漿サンプルを得ることで、測定されるＧＨ濃度の比較により、ソマトスタチン活性を評価することができる。

【0107】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、たとえ、その構造への糖鎖の付加により各受容体に対するある程度の親和性の減衰を招いたとしても、血中半減期が延長されるため、結果として、糖鎖が付加されていない天然に存在するソマトスタチン（以下、「非糖鎖付加ソマトスタチン」と呼ぶことがある。）と同等のソマトスタチン活性を維持することができ、好ましくは増大したソマトスタチン活性を有することができる。この血中半減期の延長を考慮すると、例えば、実施例６７−１および６７−２に記載の手法により測定した場合、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの各受容体に対するＫｉ値と、糖鎖を有さないＳＲＩＦ１４のＫｉ値との比は、１０００：１〜０．３：１の範囲内であることが好ましく、１００：１〜０．３：１の範囲内であることがより好ましく、１０：１〜０．３：１の範囲内であることがさらに好ましい。

【0108】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性は、好ましくは天然に存在するソマトスタチン（非糖鎖付加ソマトスタチン）と同等またはそれ以上である。血中安定性は当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、血漿中における安定性や、血中半減期、ＡＵＣ（薬物血漿中濃度−時間曲線下面積）等を指標に判断することができる。また、腎クリアランスや肝クリアランスの減少も血中安定性の増大に寄与する。

【0109】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、糖鎖を有さないＳＲＩＦ２８と比較して、血中半減期が増大しており、例えば実施例６８に示す実験手法により測定した場合、その半減期は、ＳＲＩＦ２８と比較して、４倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上増大している。

【0110】

また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、例えば実施例８５に示す実験手法により測定した場合、ＳＲＩＦ２８と比較して、好ましくは４倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上の血中安定性を有する。

【0111】

（医薬組成物）
次に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防に有効である。上述の通り、ソマトスタチンには種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、ソマトスタチンに関連する疾患には、例えば、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍（例えばカルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ）、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、放射線障害、眼疾患（例えばドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、結膜炎）等が含まれる。本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、上記疾患、特に先端巨大症、認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病合併症、下痢、消化管閉塞、イレウス、放射線障害、眼疾患、ならびに、各種腫瘍あるいは腸関連疾患、ホルモン産生過剰に伴う消化器症状の治療または予防に有効である。

【0112】

上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、注射剤等が挙げられる。

【0113】

医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加ポリペプチドの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加ポリペプチドを１〜７０重量％含有させるのが好ましい。

【0114】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、糖鎖付加ポリペプチドを薬学的に許容可能な塩として含むこともできるし、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有することもできる。また、異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、医薬組成物に含有させることのできるその他の成分としては、当業者に周知の薬学的に許容される担体等を挙げることができる。

【0115】

また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを使用する治療としては、たとえば放射線治療を含み得ることができ、また、身体全体にわたってＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５のいずれかを発現する細胞および組織の分布を測定するためのシンチグラフィーにおいても有用である。放射性スキャニングまたは磁気共鳴による体外画像化の使用は、体内での半定量的検出を可能にすることができる。

【0116】

放射性標識された糖鎖付加ポリペプチドは、例えばヒトの体内で、健常状態では実質的な量のＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５を含まない組織において、ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５のいずれかを発現する悪性腫瘍の治療的処置のために有用である。また、標識した糖鎖付加ポリペプチドを、シンチグラフィーのために、または、腫瘍を抑制するために有効な量を含有する組成物として投与することができる。このような標識の例は、ヨウ素（^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、インジウム（^１１１Ｉｎ）、炭素（^１１Ｃ）、フッ素（^１８Ｆ）、テクネチウム（^９９ｍＴｃ）、イットリウム（^９０Ｙ）などの異なる同位体、または蛍光標識である。標識は、当業者に周知の方法により実施することができ、糖鎖付加ポリペプチドへ含まれるか、直接的に結合されるか、または適当な化合物へ結合され、それが糖鎖付加ポリペプチドに結合されることが可能である。例えば、チロシンのヨード化には、クロラミン―Ｔを用いた方法等により標識することができる。

【0117】

本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、またはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。点眼剤の場合は、結膜嚢などの眼組織に適用する。吸入剤の場合には、気管支または肺に適用する。

【0118】

上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加ポリペプチドが０．１〜９００ｎｍｏｌ、好ましくは１〜１００ｎｍｏｌ、より好ましくは１〜１０ｎｍｏｌとなる投与量とすることができる。

【0119】

上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。

【0120】

本発明の糖鎖付加ポリペプチドに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加ポリペプチドおよび該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。

【0121】

さらに、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
本発明はまた、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防方法も提供する。

【0122】

なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

【0123】

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

【0124】

本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。

【0125】

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

【実施例】

【0126】

なお、本明細書中における糖鎖付加ポリペプチドの表記方法について下記に説明する。
例えば、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のポリペプチドの１位のＳｅｒ（Ｓ１）と５位のＡｓｎとが、両方ともジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ））によって、置換されていることを示す。
また、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のポリペプチドの１位のＳｅｒ（Ｓ１）が、ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ））によって、置換されており、さらに、２２位のＴｒｐが、Ｄ−Ｔｒｐに置換されていることを示す。
また、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４と示した場合には、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側に、糖鎖付加Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−が付加したことを示す。
また、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８や、３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のＣ末端である２８位のＣｙｓに、さらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加したもの（２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）、または、ＳＲＩＦ２８のＣ末端である２８位のＣｙｓに、さらに−Ｗ−ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ（Ｗは、２８位のＣｙｓに結合する任意のアミノ酸を示す）が付加したもの（３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）を示す。
また、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のポリペプチドのＮ末端に存在する１位のＳｅｒが、連続する２つのジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換されていることを示す。
なお、「ｄｉｓｉａｌｏ」はジシアロ糖鎖を意味し、「ｍｏｎｏｓｉａｌｏ」はモノシアロ糖鎖を意味し、「ａｓｉａｌｏ」はアシアロ糖鎖を意味し、「ｄｉＧｌｃＮＡｃ」はジグルクナック糖鎖を意味し、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチルグルコサミンを意味し、「ｄｉＭａｎ」はジマンノース糖鎖を意味し、「ｔｒｉｓｉａｌｏ」はトリシアロ糖鎖を意味し、「ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ」はテトラシアロ糖鎖を意味する。また、（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））と示した場合には、ジシアロ糖鎖のシアル酸のカルボキシ基が、アミノエチルアミノ基により保護されていることを意味する。「ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ」の代わりに、「Ｂｎ」、「ａｍｉｄｅ」、「ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ」と示されているものは、それぞれ糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基が、ベンジル基、アミノ基、ヘキサデシルアミノ基により修飾されていることを意味する。

【0127】

実施例１ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
１−１ チオールの糖鎖修飾反応
下記式（１）で表わされるペプチド１（配列番号３８）（ＡＰＣ社製）（６０．６ｍｇ、１８．３μｍｏｌ）と下記式（ａ）で表わされる化合物ａ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）（８５．８ｍｇ、３６．６μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５．５ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。

【化17】

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【化18】

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反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％酢酸（ＡｃＯＨ）水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（２）で表わされる糖ペプチド２（配列番号３９）（６０．５ｍｇ、１０．９μｍｏｌ、収率５９％）を得た。

【化19】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２２９Ｈ_３５８Ｎ_５０Ｏ_１０２Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８５８．３、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３９４．０、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１１５．４、found １８５８．１、１３９３．８、１１１５．２。

【0128】

１−２ Ａｃｍ基の脱保護
上記１−１に記載の方法で得られた糖ペプチド２（５１．２ｍｇ、９．１９μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１８．８ｍｇ、１１３μｍｏｌ）の水溶液（３．７ｍＬ）を添加し、室温で４０分間反応させた。２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、３．７ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（４３．６ｍｇ、２８２μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．９２ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（３）で表わされる糖ペプチド３（配列番号４０）（２９．２ｍｇ、５．３８μｍｏｌ、収率５８％）を得た。

【化20】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２２３Ｈ_３４８Ｎ_４８Ｏ_１００Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８１０．９、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３５８．４、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １０８６．９、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９０６．０、found １８１０．７、１３５８．３、１０８６．６、９０５．７。

【0129】

１−３ ジスルフィド結合の形成
上記１−２に記載の方法で得られた糖ペプチド３（２９．２ｍｇ、５．３８μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１０．８ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエントＡ：Ｂ＝７７：２３→６４：３６ １７分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号５）を含む画分を得た。

【化21】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（１７．２ｍｇ、３．１７μｍｏｌ、収率５９％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２２３Ｈ_３４６Ｎ_４８Ｏ_１００Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８１０．２、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３５７．９、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １０８６．５、found １８１０．０、１３５７．５、１０８６．４。

【0130】

実施例２ Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（５）で表わされる化合物（ペプチド５）（配列番号４１）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（６）で表わされる化合物（Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号６）を合成した。

【化22】

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【化23】

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【0131】

実施例３ Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（７）で表わされる化合物（ペプチド７）（配列番号４２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８）で表わされる化合物（Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号７）を合成した。

【化24】

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【化25】

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【0132】

実施例４ Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（９）で表わされる化合物（ペプチド９）（配列番号４３）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０）で表わされる化合物（Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号８）を合成した。

【化26】

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【化27】

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【0133】

実施例５ Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（１１）で表わされる化合物（ペプチド１１）（配列番号４４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１２）で表わされる化合物（Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号９）を合成した。

【化28】

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【化29】

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【0134】

実施例６ Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（１３）で表わされる化合物（ペプチド１３）（配列番号４５）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１４）で表わされる化合物（Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１０）を合成した。

【化30】

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【化31】

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【0135】

実施例７ Ａ１５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（１５）で表わされる化合物（ペプチド１５）（配列番号４６）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１６）で表わされる化合物（Ａ１５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１）を合成した。

【化32】

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【化33】

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【0136】

実施例８ Ｇ１６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（１７）で表わされる化合物（ペプチド１７）（配列番号４７）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１８）で表わされる化合物（Ｇ１６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２）を合成した。

【化34】

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【化35】

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【0137】

実施例９ Ｋ１８Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（１９）で表わされる化合物（ペプチド１９）（配列番号４８）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２０）で表わされる化合物（Ｋ１８Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３）を合成した。

【化36】

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【化37】

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【0138】

実施例１０ Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（２１）で表わされる化合物（ペプチド２１）（配列番号４９）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２２）で表わされる化合物（Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４）を合成した。

【化38】

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【化39】

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【0139】

実施例１１ Ｆ２１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（２３）で表わされる化合物（ペプチド２３）（配列番号５０）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２４）で表わされる化合物（Ｆ２１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１５）を合成した。

【化40】

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【化41】

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【0140】

実施例１２ Ｔ２６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（２５）で表わされる化合物（ペプチド２５）（配列番号５１）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２６）で表わされる化合物（Ｔ２６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１６）を合成した。

【化42】

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【化43】

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【0141】

実施例１３ ２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（２７）で表わされる化合物（ペプチド２７）（配列番号５２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２８）で表わされる化合物（２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１７）を合成した。

【化44】

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【化45】

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【0142】

実施例１４ ３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（２９）で表わされる化合物（ペプチド２９）（配列番号５３）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３０）で表わされる化合物（３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１８）を合成した。

【化46】

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【化47】

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【0143】

実施例１５ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（３１）で表わされる化合物（ペプチド３１）（配列番号５４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１９）を合成した。

【化48】

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【化49】

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【0144】

実施例１６ Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（３３）で表わされる化合物（ペプチド３３）（配列番号５５）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３４）で表わされる化合物（Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２０）を合成した。

【化50】

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【化51】

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【0145】

実施例１７ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４の合成
ペプチド１の代わりに下記式（３５）で表わされる化合物（ペプチド３５）（配列番号５６）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３６）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４）（配列番号３５）を合成した。

【化52】

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【化53】

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【0146】

実施例１８ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４の合成
ペプチド１の代わりに下記式（３７）で表わされる化合物（ペプチド３７）（配列番号５７）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３８）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４）（配列番号３６）を合成した。

【化54】

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【化55】

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【0147】

実施例１９ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４の合成
１９−１ ペプチドの合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（３９）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド３９（配列番号５８）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

【化56】

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Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ−１２−アミノドデカン酸およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順に縮合した。縮合後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、３時間室温で振盪した。これにより、アミノ酸側鎖の保護基（Ａｃｍ基以外）を脱離させるとともに、ペプチドと樹脂とを切り離した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝６０：４０→３６．２：６３．８ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４０）で表わされる化合物（ペプチド４０）（配列番号５９）（１１．２ｍｇ）を得た。

【化57】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_９７Ｈ_１４４Ｎ_２２Ｏ_２３Ｓ_３：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １０４２．３、［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ６９５．２、found １０４２．０、６９５．０。

【0148】

１９−２ チオールの糖鎖修飾反応
上記１９−１に記載の方法で得られたペプチド４０（６．８ｍｇ、３．３μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（１９．１ｍｇ、８．１５μｍｏｌ）を７Ｍグアニジン塩酸塩と３３０μＭ ＴＣＥＰを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９６ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→５０：５０ ２５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４１）で表わされる化合物（糖ペプチド４１）（配列番号６０）（７．１ｍｇ、１．６μｍｏｌ、収率５０％）を得た。

【化58】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１８３Ｈ_２８３Ｎ_２９Ｏ_８５Ｓ_３：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １４４９．５、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １０８７．４、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ８７０．１、found １４４９．３、１０８７．２、８７０．０。

【0149】

１９−３ Ａｃｍ基の脱保護
上記１９−２に記載の方法で得られた糖ペプチド４１（１０．３ｍｇ、２．３７μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（９．７ｍｇ、５８μｍｏｌ）の水溶液（０．９５ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９５ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（２２．３ｍｇ、１４５μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．９５ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→５０：５０ ２５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式４２で表わされる糖ペプチド４２（配列番号６１）（５．８ｍｇ、１．４μｍｏｌ、収率５９％）を得た。

【化59】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１７７Ｈ_２７３Ｎ_２７Ｏ_８３Ｓ_３：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １４０２．１、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １０５１．８、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ８４１．７、found １４０１．９、１０５１．７、８４１．５。

【0150】

１９−４ ジスルフィド結合の形成
上記１９−３に記載の方法で得られた糖ペプチド４２（５．８ｍｇ、１．４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、３．５ｍＬ）に溶解し、室温で３０時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７０：３０→５０：５０ ２５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式４３で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４）（配列番号３７）を含む画分を得た。

【化60】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→５０：５０ ２５分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４（３．６ｍｇ、０．８６μｍｏｌ、収率６１％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１７７Ｈ_２７１Ｎ_２７Ｏ_８３Ｓ_３：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １４０１．５、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １０５１．３、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ８４１．３、found １４０１．２、１０５１．２、８４１．１。

【0151】

実施例２０ Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
２０−１ ペプチドの合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護されたペプチドを樹脂上に合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、３時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７２：２８→６８．５：３１．５ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４４）で表わされるペプチド４４（配列番号６２）（３０．７ｍｇ）を得た。

【化61】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１４６Ｈ_２２４Ｎ_４４Ｏ_４１Ｓ_５：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１３８．３、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８５４．０、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ６８３．４、found １１３８．２、８５３．９、６８３．１。

【0152】

２０−２ チオールの糖鎖修飾反応
上記２０−１に記載の方法で得られたペプチド４４（４５．８ｍｇ、１３．４μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（１２５．８ｍｇ、５３．７μｍｏｌ、ペプチド４４に対して４．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、４．０ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８３：１７→７２：２８ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式４５で表わされる糖ペプチド４５（配列番号６３）（４４．５ｍｇ、５．６１μｍｏｌ、収率４２％）を得た。

【化62】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３１８Ｈ_５０２Ｎ_５８Ｏ_１６５Ｓ_５：［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １５８８．６、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １３２４．０、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １１３５．０、［Ｍ＋８Ｈ］^８＋ ９９３．３、［Ｍ＋９Ｈ］^９＋ ８８３．０、found １５８８．６、１３２４．０、１１３５．０、９９３．２、８８３．０。

【0153】

２０−３ Ａｃｍ基の脱保護
上記２０−２に記載の方法で得られた糖ペプチド４５（４４．５ｍｇ、５．６１μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１４．８ｍｇ、８８．７μｍｏｌ）の水溶液（２．２ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．２ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（３３．２ｍｇ、２１５μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（５６１μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８３：１７→７２：２８ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４６）で表わされる糖ペプチド４６（配列番号６４）（３４．４ｍｇ、４．４１μｍｏｌ、収率７９％）を得た。

【化63】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３１２Ｈ_４９２Ｎ_５６Ｏ_１６３Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １９５０．０、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １５６０．２、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １３００．３、found １９４９．８、１５６０．１、１３００．２。

【0154】

２０−４ ジスルフィド結合の形成
上記２０−３に記載の方法で得られた糖ペプチド４６（３４．４ｍｇ、４．４１μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、８．８ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７７：２３→６５：３５ １６分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４７）で表わされる化合物（Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２１）を含む画分を得た。

【化64】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８３：１７→７２：２８ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（２０．１ｍｇ、２．５８μｍｏｌ、収率５８％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３１２Ｈ_４９０Ｎ_５６Ｏ_１６３Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １９４９．５、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １５５９．８、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １３００．０、found １９４９．４、１５５９．７、１２９９．９。

【0155】

実施例２１ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド４４の代わりに下記式（４８）で表わされる化合物（ペプチド４８）（配列番号６５）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（４９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２２）を合成した。

【化65】

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【化66】

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【0156】

実施例２２ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド４４の代わりに下記式（５０）で表わされる化合物（ペプチド５０）（配列番号６６）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（５１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２３）を合成した。

【化67】

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【化68】

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【0157】

実施例２３ Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド４４の代わりに下記式（５２）で表わされる化合物（ペプチド５２）（配列番号６７）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（５３）で表わされる化合物（Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２４）を合成した。

【化69】

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【化70】

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【0158】

実施例２４ Ｓ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
２４−１ ペプチドの合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護されたペプチドを樹脂上に合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ５０ｘ２５０ｍｍ、流速：４３．７ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７３：２７→６５：３５ １４分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５４）で表わされるペプチド５４（配列番号６８）（４１．７ｍｇ）を得た。

【化71】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１４９Ｈ_２２９Ｎ_４５Ｏ_４２Ｓ_６：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１７２．７、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８７９．８、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ７０４．０、found １１７２．５、８７９．４、７０３．９。

【0159】

２４−２ チオールの糖鎖修飾反応
上記２４−１に記載の方法で得られたペプチド５４（１０．７ｍｇ、３．０４μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（３６．６ｍｇ、１５．６μｍｏｌ、ペプチド５４に対して５．２等量）を１０μＭ ＴＣＥＰを含む３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９１ｍＬ）に溶解し、室温で１００分間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→７０：３０ ５分、次いで Ａ：Ｂ＝７０：３０→６５：３５ １２分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５５）で表わされる糖ペプチド５５（配列番号６９）（１１．７ｍｇ、１．１４μｍｏｌ、収率３８％）を得た。

【化72】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_４０７Ｈ_６４６Ｎ_６６Ｏ_２２８Ｓ_６：［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ２０６１．８、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １７１８．４、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １４７３．０、［Ｍ＋８Ｈ］^８＋ １２８９．０、［Ｍ＋９Ｈ］^９＋ １１４５．９、［Ｍ＋１０Ｈ］^１０＋ １０３１．４、found ２０６１．８、１７１８．２、１４７２．９、１２８９．０、１１４５．８、１０３１．３。

【0160】

２４−３ Ａｃｍ基の脱保護
上記２４−２に記載の方法で得られた糖ペプチド５５（１１．７ｍｇ、１．１４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（４．７ｍｇ、２８μｍｏｌ）の水溶液（０．４６ｍＬ）を添加し、室温で２時間反応させた。２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．４６ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（１１．３ｍｇ、７３μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．１１ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→７０：３０ ５分、次いで７０：３０→５５：４５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５６）で表わされる糖ペプチド５６（配列番号７０）（７．４ｍｇ、０．７３μｍｏｌ、収率６４％）を得た。

【化73】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_４０１Ｈ_６３６Ｎ_６４Ｏ_２２６Ｓ_６：［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １６９４．７、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １４５２．７、［Ｍ＋８Ｈ］^８＋ １２７１．３、［Ｍ＋９Ｈ］^９＋ １１３０．１、［Ｍ＋１０Ｈ］^１０＋ １０１７．２、found １６９４．６、１４５２．５、１２７１．４、１１３０．０、１０１７．２。

【0161】

２４−４ ジスルフィド結合の形成
上記２４−３に記載の方法で得られた糖ペプチド５６（７．４ｍｇ、０．７３μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．８ｍＬ）に溶解し、室温で２５時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→７０：３０ ５分、次いで７０：３０→６９．３：３０．７ ５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製することで、下記式（５７）で表わされる化合物（Ｓ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２５）を含む画分を得た。

【化74】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（４．７ｍｇ、０．４６μｍｏｌ、収率６３％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_４０１Ｈ_６３４Ｎ_６４Ｏ_２２６Ｓ_６：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ３３８７．７、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ２５４１．０、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ２０３３．０、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １６９４．３、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １４５２．４、found ３３８７．６、２５４０．９、２０３２．７、１６９４．２、１４５２．３。

【0162】

実施例２５ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド５４の代わりに下記式（５８）で表わされるペプチド５８（配列番号７１）を用いたこと以外は、実施例２４と同様にして、下記式（５９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２６）を合成した。

【化75】

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【化76】

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【0163】

実施例２６ Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ａの代わりに下記式（ｂ）で表わされる化合物ｂ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（６０）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２７）を合成した。

【化77】

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【化78】

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最終生成物において、下記式ｂ１の糖鎖を有する糖鎖ポリぺプチドと、下記式ｂ２の糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチドの比は、４５：５５であった。なお、構造が同一のモノシアロ糖鎖誘導体を使用することにより、実質的に均一の糖鎖構造を有する糖鎖付加ポリペプチドが製造可能である。

【化79】

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【0164】

実施例２７ Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ａの代わりに下記式（ｃ）で表わされる化合物ｃ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（６１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２８）を合成した。

【化80】

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【化81】

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【0165】

実施例２８ Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
２８−１ チオールの糖鎖修飾反応
上記２０−１に記載の方法で得られたペプチド４４（２１．２ｍｇ、６．２１μｍｏｌ）と化合物ｃ（４４．５ｍｇ、２５．３μｍｏｌ、ペプチド４４に対して４．１等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．９ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７７：２３→６２：３８ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６２）で表わされる糖ペプチド６２（配列番号７２）（２４．０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、収率５７％）を得た。

【化82】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２７４Ｈ_４３４Ｎ_５４Ｏ_１３３Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １６９４．３、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １３５５．６、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １１２９．８、found １６９４．３、１３５５．６、１１３０．０。

【0166】

２８−２ Ａｃｍ基の脱保護
上記２８−１に記載の方法で得られた糖ペプチド６２（２４．０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（６．０ｍｇ、３６μｍｏｌ）の水溶液（１．４ｍＬ）を添加し、室温で３時間反応させた。５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．５７ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（１４．０ｍｇ、９０．８μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．３５ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６３）で表わされる糖ペプチド６３（配列番号７３）（２０．１ｍｇ、３．０３μｍｏｌ、収率８６％）を得た。

【化83】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２６８Ｈ_４２４Ｎ_５２Ｏ_１３１Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １６５８．７、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １３２７．２、found １６５８．８、１３２７．０。

【0167】

２８−３ ジスルフィド結合の形成
上記２８−２に記載の方法で得られた糖ペプチド６３（２０．１ｍｇ、３．０３μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、６．１ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７７：２３→６５：３５ １６分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６４）で表わされる化合物（Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号２９）を含む画分を得た。

【化84】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９２：８→８０：２０ １６分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（１１．０ｍｇ、１．６６μｍｏｌ、収率５５％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２６８Ｈ_４２２Ｎ_５２Ｏ_１３１Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １６５８．２、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １３２６．８、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １１０５．８、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ ９４８．０、［Ｍ＋８Ｈ］^８＋ ８２９．６、found １６５８．１、１３２６．７、１１０５．６、９４７．８、８２９．４。

【0168】

実施例２９ Ｓ１−３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
２９−１ チオールの糖鎖修飾反応
上記２４−１に記載の方法で得られたペプチド５４（２１．３ｍｇ、６．０６μｍｏｌ）と化合物ｃ（５３．４ｍｇ、３０．３μｍｏｌ、ペプチド５４に対して５．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→７０：３０ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６５）で表わされる糖ペプチド６５（配列番号７４）（３９．３ｍｇ、４．５９μｍｏｌ、収率７６％）を得た。

【化85】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３４１Ｈ_５４４Ｎ_６０Ｏ_１８０Ｓ_６：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ２１４０．２、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １７１２．３、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １４２７．１、found ２１４０．２、１７１２．４、１４２７．２。

【0169】

２９−２ Ａｃｍ基の脱保護
上記２９−１に記載の方法で得られた糖ペプチド６５（３９．３ｍｇ、４．５９μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１８．７ｍｇ、１１２μｍｏｌ）の水溶液（１．８ｍＬ）を添加し、室温で９０分間反応させた。２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（４３．４ｍｇ、２８．１μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．４６ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６８：３２ １８分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６６）で表わされる糖ペプチド６６（配列番号７５）（２７．６ｍｇ、３．２８μｍｏｌ、収率７１％）を得た。

【化86】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３３５Ｈ_５３４Ｎ_５８Ｏ_１７８Ｓ_６：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ２１０４．６、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １６８３．９、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １４０３．４、found ２１０４．６、１６８４．０、１４０３．３。

【0170】

２９−３ ジスルフィド結合の形成
上記２９−２に記載の方法で得られた糖ペプチド６６（２７．６ｍｇ、３．２８μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、８．２ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７２：２８→７０．５：２９．５ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６７）で表わされる化合物（Ｓ１−３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号３０）を含む画分を得た。

【化87】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９６：４→８２：１８ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１−３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（１４．５ｍｇ、１．７２μｍｏｌ、収率５２％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３３５Ｈ_５３２Ｎ_５８Ｏ_１７８Ｓ_６：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ２１０４．１、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １６８３．５、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １４０３．１、found ２１０３．７、１６８３．３、１４０３．０。

【0171】

実施例３０ Ｎ５Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
３０−１ 糖ペプチドの固相合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（７２．５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．６μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（６８）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド６８（配列番号７６）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

【化88】

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次に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、下記式（ｄ）で表わされる化合物ｄ（大塚化学株式会社製）（４１１．９ｍｇ、１５０．４μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ−ＤＭＦ（１／１、ｖ／ｖ、８７１μＬ）溶液、ＴＢＴＵ（６４．２ｍｇ、２００μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（５２．３μＬ、３００μｍｏｌ）を順次樹脂に添加し、室温で３時間振盪させて縮合させた。

【化89】

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ＤＭＦで洗浄後、この縮合操作を１回繰り返した。樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２０分間振盪しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄することで、保護された下記式（６９）で表わされる化合物（ペプチド６９）（配列番号７７）を樹脂上で合成した。

【化90】

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この樹脂に、ＨＯＢｔ／ＤＩＣを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順に縮合した。縮合後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。この粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル Ａ：Ｂ＝７０：３０］を用いて精製し、下記式（７０）で表わされる糖ペプチド７０（配列番号７８）（２９．１ｍｇ、５．２６μｍｏｌ）を得た。

【化91】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３５Ｈ_３５７Ｎ_４７Ｏ_１００Ｓ_３：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８４６．６、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３８５．２、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１０８．４、found １８４６．５、１３８５．１、１１０８．３。

【0172】

３０−２ ジスルフィド結合の形成
上記３０−１に記載の方法で得られた糖ペプチド７０（１２．２ｍｇ、２．２０μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、５．５ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→６６：３５ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７１）で表わされる糖ペプチド７１（配列番号７９）（８．３ｍｇ、１．５μｍｏｌ、収率６８％）を得た。

【化92】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３５Ｈ_３５５Ｎ_４７Ｏ_１００Ｓ_３：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８４６．５、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３８４．７、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１０８．０、found １８４６．５、１３８４．７、１１０８．１。

【0173】

３０−３ ベンジル基の脱保護
上記３０−２に記載の方法で得られた糖ペプチド７１（７．５ｍｇ、１．４μｍｏｌ）を５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（２０．６ｍＬ）に溶解させ、０℃で８０分間反応させた。２００ｍＭ酢酸水溶液（５．１ｍＬ）を加え、混合溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７３：２７→６６．３：３３．７ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７２）で表わされる化合物（Ｎ５Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号３１）を含む画分を得た。

【化93】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８０：２０→６０：４０ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｎ５Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（１．４ｍｇ、収率１９％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２２１Ｈ_３４３Ｎ_４７Ｏ_１００Ｓ_３：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １７８５．９、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３３９．６、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １０７１．９、found １７８５．７、１３３９．５、１０７１．８。

【0174】

実施例３１ Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
３１−１ 糖ペプチドの固相合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（７２．５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．６μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（７３）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド７３（配列番号８０）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

【化94】

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次に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、化合物ｄ（４２０．２ｍｇ、１５３．３μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ−ＤＭＦ（１／１、ｖ／ｖ、８７１μＬ）溶液、ＴＢＴＵ（６４．２ｍｇ、２００μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（５２．３μＬ、３００μｍｏｌ）を順次樹脂に添加し、室温で２時間振盪させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後、この縮合操作を１回繰り返した。樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２０分間振盪しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄することで、保護された下記式（７４）で表わされるペプチド７４（配列番号８１）を樹脂上で合成した。

【化95】

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ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。この粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル Ａ：Ｂ＝７１：２９］を用いて精製し、下記式（７５）で表わされる糖ペプチド７５（配列番号８２）（６５．７ｍｇ、１１．８μｍｏｌ）を得た。

【化96】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３６Ｈ_３５８Ｎ_４８Ｏ_１００Ｓ_３：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３９２．０、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１１３．８、found １３９１．９、１１１３．８。

【0175】

３１−２ ジスルフィド結合の形成
上記３１−１に記載の方法で得られた糖ペプチド７５（２０．３ｍｇ、３．６５μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、９．０ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７２：２８→６７：３３ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７６）で表わされる糖ペプチド７６（配列番号８３）（１７．０ｍｇ、３．０６μｍｏｌ、収率８４％）を得た。

【化97】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３６Ｈ_３５６Ｎ_４８Ｏ_１００Ｓ_３：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３９１．５、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１１３．４、found １３９１．３、１１１３．２。

【0176】

３１−３ ベンジル基の脱保護
上記３１−２に記載の方法で得られた糖ペプチド７６（７．０ｍｇ、１．３μｍｏｌ）を５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（１９．１ｍＬ）に溶解させ、０℃で１時間反応させた。２００ｍＭ酢酸水溶液（９．６ｍＬ）を加え、混合溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８５：１５→７７．５：２２．５ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７７）で表わされる化合物（Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号３２）（２．７ｍｇ、０．５０μｍｏｌ、収率４０％）を得た。

【化98】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２２２Ｈ_３４４Ｎ_４８Ｏ_１００Ｓ_３：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １７９４．９、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３４６．４、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １０７７．３、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ８９７．９、found １７９４．７、１３４６．２、１０７７．２、８９７．７。

【0177】

実施例３２ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８の合成
３２−１ ペプチドの合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護されたペプチドを樹脂上に合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７２：２８→６４：３６ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７８）で表わされるペプチド７８（配列番号８４）（２８．９ｍｇ）を得た。

【化99】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１４６Ｈ_２２６Ｎ_４２Ｏ_３９Ｓ_６：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１２９．７、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８４７．５、found １１２９．５、８４７．４。

【0178】

３２−２ チオールの糖鎖修飾とＳｔＢｕ基の脱保護
上記３２−１に記載の方法で得られたペプチド７８（１０．０ｍｇ、２．９５μｍｏｌ）と下記式（ｅ）で表わされる化合物ｅ（ブロモアセトアミド化した単糖：大塚化学株式会社製[0]）（２．０ｍｇ、５．９０μｍｏｌ、ペプチド７８に対して２．０等量）を２０μＭ ＴＣＥＰを含む３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．８９ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。

【化100】

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反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３．０ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（４５．５ｍｇ、２９５μｍｏｌ）を添加し、室温で３時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７９）で表わされる糖ペプチド７９（配列番号８５）（６．８ｍｇ、１．９μｍｏｌ、収率６４％）を得た。

【化101】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１５２Ｈ_２３４Ｎ_４４Ｏ_４５Ｓ_５［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１８７．０、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８９０．５、found １１８７．０、８９０．５。

【0179】

３２−３ チオールの糖鎖修飾反応
上記３２−２に記載の方法で得られたペプチド７９（６．８ｍｇ、１．９μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（２２．４ｍｇ、９．５６μｍｏｌ、ペプチド７９に対して５．０等量）を７．６ｍＭ ＤＴＴを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．０ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８５：１５→６５：３５ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８０）で表わされる糖ペプチド８０（配列番号８６）（３．４ｍｇ、０．５８μｍｏｌ、収率３１％）を得た。

【化102】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３８Ｈ_３７３Ｎ_５１Ｏ_１０７Ｓ_５：［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１６５．２、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９７１．２、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ ８３２．６、［Ｍ＋８Ｈ］^８＋ ７２８．６、found １１６５．２、９７１．１、８３２．６、７２８．６。

【0180】

３２−４ Ａｃｍ基の脱保護
上記３２−３に記載の方法で得られた糖ペプチド８０（３．８ｍｇ、０．６５μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（２．７ｍｇ、１６μｍｏｌ）の水溶液（２６２μＬ）を添加し、室温で１時間反応させた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、４２６μＬ）に溶解したＤＴＴ（１０．０ｍｇ、６４．８μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（６６μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→６０：４０ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８１）で表わされる糖ペプチド８１（配列番号８７）（２．５ｍｇ、０．４４μｍｏｌ、収率６７％）を得た。

【化103】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３２Ｈ_３６３Ｎ_４９Ｏ_１０５Ｓ_５：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８９４．０、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４２０．７、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１３６．８、found １８９３．８、１４２０．６、１１３６．７。

【0181】

３２−４ ジスルフィド結合の形成
上記３２−３に記載の方法で得られた糖ペプチド８１（２．５ｍｇ、０．４４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．１ｍＬ）に溶解し、室温で終夜反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７０：３０ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号３３）（１．５ｍｇ、０．２６μｍｏｌ、収率５９％）を得た。

【化104】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３２Ｈ_３６１Ｎ_４９Ｏ_１０５Ｓ_５：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８９３．３、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４２０．２、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１３６．４、found １８９３．５、１４２０．１、１１３６．３。

【0182】

実施例３３ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ｅの代わりに下記式（ｆ）で表わされる化合物ｆ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例３２と同様にして、下記式（８３）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号３４）を合成した。

【化105】

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【化106】

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【0183】

実施例３４ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（８４）で表わされる化合物（ペプチド８４）（配列番号８８）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８５）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号８９）を合成した。

【化107】

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【化108】

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【0184】

実施例３５ Ｒ１１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（８６）で表わされる化合物（ペプチド８６）（配列番号９０）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８７）で表わされる化合物（Ｒ１１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号９１）を合成した。

【化109】

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【化110】

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【0185】

実施例３６ Ｆ２０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（８８）で表わされる化合物（ペプチド８８）（配列番号９２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８９）で表わされる化合物（Ｆ２０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号９３）を合成した。

【化111】

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【化112】

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【0186】

実施例３７ Ｔ２４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（９０）で表わされる化合物（ペプチド９０）（配列番号９４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９１）で表わされる化合物（Ｔ２４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号９５）を合成した。

【化113】

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【化114】

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【0187】

実施例３８ Ｆ２５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（９２）で表わされる化合物（ペプチド９２）（配列番号９６）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９３）で表わされる化合物（Ｆ２５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号９７）を合成した。

【化115】

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【化116】

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【0188】

実施例３９ Ｓ２７Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（９４）で表わされる化合物（ペプチド９４）（配列番号９８）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９５）で表わされる化合物（Ｓ２７Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号９９）を合成した。

【化117】

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【化118】

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【0189】

実施例４０ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｋ−ＳＲＩＦ１４の合成
ペプチド１の代わりに下記式（９６）で表わされる化合物（ペプチド９６）（配列番号１００）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９７）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｋ−ＳＲＩＦ１４）（配列番号１０１）を合成した。

【化119】

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【化120】

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【0190】

実施例４１ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｆ２５Ｙ−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに下記式（９８）で表わされる化合物（ペプチド９８）（配列番号１０２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｆ２５Ｙ−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１０３）を合成した。

【化121】

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【化122】

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【0191】

実施例４２ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８−アミドの合成
ペプチド１の代わりに下記式（１００）で表わされる化合物（ペプチド１００）（配列番号１０４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８−アミド）（配列番号１０５）を合成した。

【化123】

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【化124】

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【0192】

実施例４３ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４の合成
４３−１ ペプチドの合成
上記１９−１に記載の方法で得られた、樹脂に結合している保護されたペプチド３９（配列番号５８）（５０μｍｏｌ）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）_２−ＣＯＯＨ（メルク社製）およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順に縮合した。Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、３時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG‐120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント Ａ：Ｂ＝７４：２６→６９：３１ １分、次いで６９：３１→６２：３８ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１０２）で表わされる化合物（ペプチド１０２）（配列番号１０６）（４３．１ｍｇ）を得た。

【化125】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_９４Ｈ_１３８Ｎ_２２Ｏ_２６Ｓ_３：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １０４５．２、［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ６９７．１、found １０４５．０、６９７．０。

【0193】

４３−２ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４の合成
ペプチド１の代わりに上記４３−１に記載の方法で得られたペプチド１０２を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０３）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４）（配列番号１０７）を合成した。

【化126】

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【0194】

実施例４４ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
４４−１ ペプチドの合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）を含むジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（１０４）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド１０４（配列番号１０８）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

【化127】

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Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、ビオチンを縮合させた。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。これにより、アミノ酸側鎖の保護基（Ａｃｍ基以外）を脱離させるとともに、ペプチドと樹脂とを切り離した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６１：３９ １８分 直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１０５）で表わされるペプチド１０５（配列番号１０９）を得た。

【化128】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１５３Ｈ_２３３Ｎ_４５Ｏ_４２Ｓ_５：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１７９．４、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８８４．８、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ７０８．０、found １１７９．２、８８４．４、７０７．９。

【0195】

４４−２ Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに上記４４−１に記載の方法で得られたペプチド１１４を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０６）で表わされる化合物（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１０）を合成した。

【化129】

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【0196】

実施例４５ Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
４５−１ ペプチドの合成
上記４４−１で得られた、樹脂に結合している保護されたペプチド１０４（配列番号１０８）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−（ＰＥＧ）_２−ＣＯＯＨ（メルク社製）およびビオチンを順に縮合した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６１：３９ ２２分 直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１０７）で表わされるペプチド１０７（配列番号１１１）を得た。

【化130】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１６２Ｈ_２５０Ｎ_４６Ｏ_４６Ｓ_５：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １２４７．１、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ９３５．６、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ７４８．７、found １２４６．９、９３５．４、７４８．６。

【0197】

４５−２ Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに上記４５−１に記載の方法で得られたペプチド１０７を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０８）で表わされる化合物（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１２）を合成した。

【化131】

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【0198】

実施例４６ Ａｚｉｄｏ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
４６−１ ペプチドの合成
上記４４−１で得られた、樹脂に結合している保護されたペプチド１０４（配列番号１０８）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、５−Ａｚｉｄｏ−ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄを縮合した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７０：３０→６０：４０ ２０分 直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１０９）で表わされるペプチド１０９（配列番号１１３）を得た。

【化132】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１４８Ｈ_２２６Ｎ_４６Ｏ_４１Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１４５．６、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８５９．５、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ６８７．８、found １１４５．５、８５９．２、６８７．５。

【0199】

４６−２ Ａｚｉｄｏ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりに上記４６−１に記載の方法で得られたペプチド１０９を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１１０）で表わされる化合物（Ａｚｉｄｏ−Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１４）を合成した。

【化133】

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【0200】

実施例４７ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド４４の代わりに下記式（１１１）で表わされる化合物（ペプチド１１１）（配列番号１１５）を合成して用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（１１２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１６）を合成した。

【化134】

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【化135】

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実施例４８ ２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４の合成
ペプチド４４の代わりに下記式（１１３）で表わされる化合物（ペプチド１１３）（配列番号１１７）を合成して用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（１１４）で表わされる化合物（２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４）（配列番号１１８）を合成した。

【化136】

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【化137】

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【0201】

実施例４９ ３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４の合成
ペプチド５４の代わりに下記式（１１５）で表わされる化合物（ペプチド１１５）（配列番号１１９）を合成して用いたこと以外は、実施例２４と同様にして、下記式（１１６）で表わされる化合物（３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４）（配列番号１２０）を合成した。

【化138】

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【化139】

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【0202】

実施例５０ Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８の合成
５０−１ チオールの糖鎖修飾反応
ペプチド１（配列番号３８）（ＡＰＣ社製）（２５．０ｍｇ、７．５６μｍｏｌ）と下記式（ｈ）で表わされる化合物ｈ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）（１５．６ｍｇ、１５．１μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．３ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。

【化140】

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（ｈ）
反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル Ａ：Ｂ＝７５：２５→６２：３８ １３分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１１７）で表わされる糖ペプチド１１７（配列番号１２１）（２５．６ｍｇ、６．０１μｍｏｌ、収率７９％）を得た。

【化141】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１９５Ｈ_３０４Ｎ_４８Ｏ_７６Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １５５６．０、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １１６７．３、found １５５５．７、１１６７．０。

【0203】

５０−２ Ａｃｍ基の脱保護
上記５０−１に記載の方法で得られた糖ペプチド１１７（２８．３ｍｇ、６．０７μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１２．５ｍｇ、７４．５μｍｏｌ）の水溶液（２．４ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．４ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（２８．８ｍｇ、１８７μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．６ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７３：２７→６０：４０ １３分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１１８）で表わされる糖ペプチド１１８（配列番号１２２）（１９．８ｍｇ、４．３８μｍｏｌ、収率７２％）を得た。

【化142】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１８９Ｈ_２９４Ｎ_４６Ｏ_７４Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １５０８．６、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １１３１．７、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ９０５．６、found １５０８．３、１１３１．５、９０５．４。

【0204】

５０−３ ジスルフィド結合の形成
上記５０−２に記載の方法で得られた糖ペプチド１１８（１９．８ｍｇ、４．３８μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）‐ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、８．８ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７３：２７→６０：４０ １３分 直線濃度勾配溶出］を用いて粗精製し、下記式（１１９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２３）を含む画分を得た。

【化143】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７８：２２ １２分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８（１１．９ｍｇ、２．６３μｍｏｌ、収率６０％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１８９Ｈ_２９２Ｎ_４６Ｏ_７４Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １５０８．０、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １１３１．２、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ９０５．２、found １５０７．７、１１３１．０、９０５．０。

【0205】

実施例５１ Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ｈの代わりに化合物ｆを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２０）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２４）を合成した。

【化144】

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【0206】

実施例５２ Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりにペプチド２１を用い、化合物ｈの代わりに化合物ｆを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２１）で表わされる化合物（Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２５）を合成した。

【化145】

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【0207】

実施例５３ Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ｈの代わりに化合物ｅを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２６）を合成した。

【化146】

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【0208】

実施例５４ Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８の合成
ペプチド１の代わりにペプチド２１を用い、化合物ｈの代わりに化合物ｅを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２３）で表わされる化合物（Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２７）を合成した。

【化147】

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【0209】

実施例５５ Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ａの代わりに下記式（ｉ）で表わされる化合物ｉ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１２４）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２８）を合成した。

【化148】

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（ｉ）

【化149】

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【0210】

実施例５６ Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ａの代わりに下記式（ｊ）で表わされる化合物ｊ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１２５）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２９）を合成した。

【化150】

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（ｊ）

【化151】

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【0211】

実施例５７ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８の合成
５７−１ ブロモアセトアミド化されたジシアロ糖鎖誘導体の合成
下記式（ｋ）で表わされる化合物ｋ（大塚化学株式会社製）（２０４．１ｍｇ、９２．１μｍｏｌ）に水（２ｍＬ）、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｎ−（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂａｍａｔｅ（０．２９ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌させた。凍結乾燥後、得られた凍結乾燥物にＤＭＦ（５ｍＬ）、ＨＡＴＵ（３４９ｍｇ、９２１μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１６１μＬ、９２１μｍｏｌ）を加え３７℃で１８時間反応させた。溶液にトルエン（５０ｍＬ）を加え析出した沈殿物をろ過で回収した。沈殿物をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ゲルろ過精製［カラム：Sephadex G-25、φ２０ｘ２００ｍｍ、流速：３０ｍＬ／ｈ］を用いて精製し、目的分画を回収し凍結乾燥することで、下記式（ｌ）で表される化合物ｌ（１５２．４ｍｇ、６０．８μｍｏｌ、収率６６％）を得た。

【化152】

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（ｋ）

【化153】

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（ｌ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_９８Ｈ_１６６Ｎ_１０Ｏ_６４：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ２５３０．０、found ２５２９．４。
化合物ｌ（１００ｍｇ、３９．８μｍｏｌ）と炭酸水素アンモニウム（３１．４ｍｇ、３９８μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解し室温で７日間反応させた。凍結乾燥後、得られた凍結乾燥物に対し、水（１ｍＬ）、ＤＣＣ（４１．０ｍｇ、１９９μｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したブロモ酢酸（２７．７ｍｇ、１９９μｍｏｌ）を順次加えた。氷冷下で１時間反応後、溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒 水：アセトニトリル＝８４：１６］を用いて精製し下記式（ｍ）で表される化合物ｍ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖誘導体：１００ｍｇ、３８．２μｍｏｌ、収率９６％）を得た。

【化154】

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（ｍ）
MALDI-MS：（m／z）（m／z）calcd for Ｃ_１００Ｈ_１６８ＢｒＮ_１１Ｏ_６４：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ２６４８．９、found ２６４８．５。

【0212】

５７−２ チオールの糖鎖修飾反応
上記５７−１に記載の方法で得られた化合物ｍ（１４．２ｍｇ、５．４０μｍｏｌ）とペプチド１（１５．０ｍｇ、４．５３μｍｏｌ）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．３ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％酢酸（ＡｃＯＨ）水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８６：１４→８２：１８ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２６）で表わされる糖ペプチド１２６（配列番号１３０）（１３．４ｍｇ、２．２９μｍｏｌ、収率５１％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２４３Ｈ_３８６Ｎ_５４Ｏ_１０４Ｓ_４：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４６５．１、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１７２．２、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９７７．０、found １４６４．９、１１７２．１、９７７．１。

【化155】

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【0213】

５７−３ Ｂｏｃ基の脱保護
上記５７−２に記載の方法で得られた糖ペプチド１２６（１３．４ｍｇ、２．２９μｍｏｌ）を９５％ＴＦＡ水溶液（４５８μＬ）に溶解させ、室温で５分間振盪した。５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．８、３３ｍＬ）を添加した後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７３：２７→６５：３５ １０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２７）で表わされる糖ペプチド１２７（配列番号１３１）（１２．７ｍｇ、９８μｍｏｌ、収率９８％）を得た。

【化156】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３３Ｈ_３７０Ｎ_５４Ｏ_１００Ｓ_４：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４１５．１、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１３２．２、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９４３．７、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ ８０９．０、found １４１４．９、１１３２．１、９４３．６、８０８．９。

【0214】

５７−４ Ａｃｍ基の脱保護
上記５７−３に記載の方法で得られた糖ペプチド１２７（１２．７ｍｇ、２．２５μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（９．２ｍｇ、５５μｍｏｌ）の水溶液（０．９ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。その後、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（２１．２ｍｇ、１３７μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（２２５μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７３：２７→６０：４０ １３分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２８）で表わされる糖ペプチド１２８（配列番号１３２）（５．２ｍｇ、０．９４μｍｏｌ、収率４２％）を得た。

【化157】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２２７Ｈ_３６０Ｎ_５２Ｏ_９８Ｓ_４：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３７９．５、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１０３．８、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９２０．０、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ ７８８．７、found １３７９．４、１１０３．７、９１９．９、７８８．６。

【0215】

５７−５ ジスルフィド結合の形成
上記５７−４に記載の方法で得られた糖ペプチド１２８（５．２ｍｇ、０．９４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．９ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７０：３０→６５：３５ １３分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３３）を含む画分を得た。

【化158】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９２：８→８５：１５ １４分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８（３．８ｍｇ、０．６９μｍｏｌ、収率７３％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２２７Ｈ_３５８Ｎ_５２Ｏ_９８Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １８３８．３、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １３７９．０、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１０３．４、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９１９．６、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ ７８８．４、found １８３８．０、１３７８．５、１１０３．２、９１９．５、７８８．２。

【0216】

実施例５８ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８の合成
５８−１ ブロモアセトアミド化されたジシアロ糖鎖誘導体の合成
化合物ｋ（大塚化学株式会社製）（１５２ｍｇ、６８．６μｍｏｌ）にＤＭＦ（１．９ｍＬ）、臭化リチウム（３５７ｍｇ、４．１２ｍｍｏｌ）、塩化フェナシル（２７３ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を順次加え、３７℃で反応させた。１０時間後、水（１９ｍＬ）を加え析出物をろ過で取り除いた。ろ液に２５％アンモニウム水（５ｍＬ）を加え室温で１８時間反応させた後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、８０ｍＬ）を加え中和した。溶液をＨＰＬＣ［カラム：YMC Hydrosphere C18（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒 ０．１％ＴＦＡ水：アセトニトリル＝９８：２→９２：８ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し凍結乾燥することで下記式（ｎ）で表される化合物ｎ（６０．９ｍｇ、２７．４μｍｏｌ、収率４０％）を得た。
MALDI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_８４Ｈ_１４０Ｎ_８Ｏ_６０：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ２２４３．８、found ２２４３．６。

【化159】

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（ｎ）
得られた中間体ｎ（３７．３ｍｇ、１６．８μｍｏｌ）と炭酸水素アンモニウム（１３．３ｍｇ、１６８μｍｏｌ）を水（０．３７ｍＬ）に溶解し室温で７日間反応させた。凍結乾燥後、得られた[0]凍結乾燥物に対し、水（０．３７ｍＬ）、ＤＣＣ（１７．３ｍｇ、８４μｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．３７ｍＬ）に溶解したブロモ酢酸（１１．７ｍｇ、８４μｍｏｌ）を順次加えた。氷冷下で１時間反応後の溶液をＨＰＬＣ［カラム：YMC Hydrosphere C18（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒 ０．１％ＴＦＡ水：アセトニトリル＝９８：２→９２：８、３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（ｏ）で表される化合物ｏ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖誘導体：２９．０ｍｇ、１２．４μｍｏｌ、収率７４％）を得た。

【化160】

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（ｏ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_８６Ｈ_１４２ＢｒＮ_９Ｏ_６０：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ２３６２．７、found ２３６２．５。

【0217】

５８−２ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ａの代わりに上記５８−１に記載の方法で得られた化合物ｏを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１３０）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３４）を合成した。

【化161】

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【0218】

実施例５９ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８の合成
５９−１ ブロモアセトアミド化されたベンジル保護基を持つジシアロ糖鎖の合成
化合物ａ（２８．９ｍｇ、１２．３μｍｏｌ）にＤＭＦ（０．５８ｍＬ）、臭化リチウム（２１．５ｍｇ、２４８μｍｏｌ）、臭化ベンジル（１４．６μＬ、１２２μｍｏｌ）を順次加え、３０℃で２０時間反応させた。臭化ベンジル（１４．６μＬ、１２２μｍｏｌ）をさらに添加して２０時間反応させた。反応液にトルエン（３０ｍＬ）を加え、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）の後、沈殿物を水（１００μＬ）に溶解してＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒 水：アセトニトリル＝９５：５→７０：３０ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（ｇ）で表される化合物ｇ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖：７．６ｍｇ、３．０μｍｏｌ、収率２４％）を得た。

【化162】

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（g）
MALDI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１００Ｈ_１５２ＢｒＮ_７Ｏ_６２：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ２５４４．８、found ２５４４．４。

【0219】

５９−２ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ａの代わりに化合物ｇを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１３１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３５）を合成した。

【化163】

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【0220】

実施例６０ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８の合成
６０−１ ブロモアセトアミド化されたジシアロ糖鎖誘導体の合成
化合物ｋ（大塚化学株式会社製）（１４０ｍｇ、６３．０μｍｏｌ）に水（１．５ｍＬ）、メタノール（１．５ｍＬ）、ヘキサデシルアミン（３００ｍｇ、１２６μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌させた。凍結乾燥後、得られた凍結乾燥物にＤＭＦ（５ｍＬ）、ＨＡＴＵ（２３９ｍｇ、６３０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１１０μＬ、６３０μｍｏｌ）を加え３７℃で反応させた。１８時間後、溶液にジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加え析出した沈殿物をろ過で回収した。この沈殿物をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒 水：アセトニトリル＝４０：６０→１０：９０、３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製することで下記式（ｐ）で表される化合物ｐ（７１．１ｍｇ、２６．６μｍｏｌ、収率４２％）を得た。

【化164】

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（ｐ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１１６Ｈ_２０４Ｎ_８Ｏ_６０：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ２６９２．３、found ２６９１．９。

【0221】

得られた化合物ｐ（７１．７ｍｇ、２６．６μｍｏｌ）と炭酸水素アンモニウム（２１．８ｍｇ、２６６μｍｏｌ）を水（０．７ｍＬ）、メタノール（０．７ｍＬ）に溶解し室温で反応させた。７日後、凍結乾燥して得られた凍結乾燥物に対し、水（０．７ｍＬ）、メタノール（０．７ｍＬ）、ＤＣＣ（２７．４ｍｇ、１３３μｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．７ｍＬ）に溶解したブロモ酢酸（１８．５ｍｇ、１３３μｍｏｌ）を順次加えた。氷冷下で１時間反応後、溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒 水：アセトニトリル＝４０：６０→１０：９０、３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し下記式（ｑ）で表される化合物ｑ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖：２４．９ｍｇ、８．９μｍｏｌ、収率３３％）を得た。

【化165】

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（ｑ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１１８Ｈ_２０６ＢｒＮ_９Ｏ_６０：［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ２８１１．２、found ２８１１．０。

【0222】

６０−２ チオールの糖鎖修飾反応
ペプチド１（１０．４ｍｇ、３．１４μｍｏｌ）を３０μＭ ＴＣＥＰを含む０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、６２μＬ）に溶解させた。この溶液に、上記６０−１に記載の方法で得られた化合物ｑ（７９．４ｍｇ、２８．５μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３．７ｍＬ）溶液を添加し、室温で２０分間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝５０：５０→２２：７８ １４分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１３２）で表わされる糖ペプチド１３２（配列番号１３６）（６．４ｍｇ、１．１μｍｏｌ、収率３５％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２６１Ｈ_４２４Ｎ_５２Ｏ_１００Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ２００７．２、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １５０５．７、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １２０４．７、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １００４．１、found ２００７．４、１５０５．５、１２０４．８、１００４．０。

【化166】

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【0223】

６０−３ Ａｃｍ基の脱保護
上記６０−２に記載の方法で得られた糖ペプチド１３２（６．４ｍｇ、１．１μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（３．８ｍｇ、２３μｍｏｌ）の水溶液（０．８ｍＬ）を添加し、室温で４０分間反応させた。その後、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３７７μＬ）に溶解したＤＴＴ（８．８ｍｇ、５７μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（１０６μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝４８：５２→３８：６２ ３分、次いで３８：６２→３０：７０ ８分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１３３）で表わされる糖ペプチド１３３（配列番号１３７）（３．２ｍｇ、０．５４μｍｏｌ、収率４９％）を得た。

【化167】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２５５Ｈ_４１４Ｎ_５０Ｏ_９８Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １９５９．９、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４７０．１、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１７６．３、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９８０．４、found １９５９．６、１４６９．９、１１７６．１、９８０．５。

【0224】

６０−３ ジスルフィド結合の形成
上記６０−２に記載の方法で得られた糖ペプチド１３３（３．２ｍｇ、０．５４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）‐ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．１ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝４８：５２→３８：６２ ３分、次いで３８：６２→３０：７０ ８分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１３４）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３８）（２．８ｍｇ、０．４８μｍｏｌ、収率８９％）を得た。

【化168】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２５５Ｈ_４１２Ｎ_５０Ｏ_９８Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １９５９．２、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４６９．６、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１７５．９、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９８０．１、found １９５８．９、１４６９．４、１１７５．７、９７９．９。

【0225】

実施例６１ Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ｃの代わりに化合物ｏを用いたこと以外は、実施例２８と同様にして、下記式（１３５）で表わされる化合物（Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３９）を合成した。

【化169】

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【0226】

実施例６２ Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ｃの代わりに化合物ｇを用いたこと以外は、実施例２８と同様にして、下記式（１３６）で表わされる化合物（Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４０）を合成した。

【化170】

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【0227】

実施例６３ Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））−ＳＲＩＦ２８の合成
化合物ａの代わりに下記式（ｒ）で表わされる化合物ｒ（ブロモアセチル化した糖鎖付加Ａｓｎ：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１３７）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４１）を合成した。

【化171】

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（ｒ）

【化172】

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【0228】

実施例６４ Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８の合成
６４−１ 糖ペプチドの固相合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（７２．５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．６μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて樹脂に結合した状態にある保護された下記式（１３８）で表わされるペプチド１３８（配列番号１４２）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

【化173】

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【0229】

次に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、化合物ｄ（１４１．０ｍｇ、５１．５μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ−ＤＭＦ（１／１、ｖ／ｖ、１．１ｍＬ）溶液、ＴＢＴＵ（２１．２ｍｇ、６６．０μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１７．２μＬ、９８．７μｍｏｌ）を順次樹脂に添加し、室温で４時間振盪させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後、この縮合操作を１回繰り返した。樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２０分間振盪しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄することで、下記式（１３９）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド１３９（配列番号１４３）を合成した。

【化174】

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ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。この粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル Ａ：Ｂ＝７０：３０］を用いて精製し、下記式（１４０）で表わされる糖ペプチド１４０（配列番号１４４）（５．８ｍｇ、１．１μｍｏｌ）を得た。

【化175】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２４１Ｈ_３６７Ｎ_４９Ｏ_１０１Ｓ_４：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４２４．８、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１４０．０、found １４２４．６、１１３９．９。

【0230】

６４−２ チオールの糖鎖修飾反応
上記６４−１に記載の方法で得られた糖ペプチド１４０（１０．８ｍｇ、１．９０μｍｏｌ）と化合物ｆ（５．３ｍｇ、５．１μｍｏｌ）を１４１μＭ ＴＣＥＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．８ｍＬ）に溶解し、室温で２４時間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル Ａ：Ｂ＝７５：２５→６０：４０ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４１）で表わされる糖ペプチド１４１（配列番号１４５）（４．９ｍｇ、０．７４μｍｏｌ、収率３９％）を得た。

【化176】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２７７Ｈ_４２６Ｎ_５２Ｏ_１２７Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ２２１６．０、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １６６２．２、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １３３０．０、found ２２１５．６、１６６１．９、１３３０．１。

【0231】

６４−３ Ａｃｍ基の脱保護
上記６４−２に記載の方法で得られた糖ペプチド１４１（４．９ｍｇ、０．７４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１．５ｍｇ、９．０μｍｏｌ）の水溶液（１４８μＬ）を添加し、室温で１．５時間反応させた。２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１４５μＬ）に溶解したＤＴＴ（３．５ｍｇ、２３μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（３７μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７４：２６→６４：３６ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４２）で表わされる糖ペプチド１４２（配列番号１４６）（３．７ｍｇ、０．５７μｍｏｌ、収率７７％）を得た。

【化177】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２７１Ｈ_４１６Ｎ_５０Ｏ_１２５Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ２１６８．６、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １６２６．７、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １３０１．５、found ２１６８．６、１６２６．４、１３０１．３。

【0232】

６４−４ ジスルフィド結合の形成
上記６４−３に記載の方法で得られた糖ペプチド１４２（３．７ｍｇ、０．５４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）‐ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．４ｍＬ）に溶解し、室温で３１時間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６０：４０ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４３）で表わされる糖ペプチド１４３（配列番号１４７）（２．９ｍｇ、０．４５μｍｏｌ、収率７８％）を得た。

【化178】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２７１Ｈ_４１４Ｎ_５０Ｏ_１２５Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ２１６７．９、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １６２６．２、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １３０１．１、found ２１６７．９、１６２６．０、１３０１．２。

【0233】

６４−５ ベンジル基の脱保護
上記６４−４に記載の方法で得られた糖ペプチド１４３（２．９ｍｇ、０．４５μｍｏｌ）を５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（１３．６ｍＬ）に溶解させ、０℃で１時間反応させた。２００ｍＭ酢酸水溶液（３．４ｍＬ）を加え、混合溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６０：４０ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式１４４で表わされる化合物（Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４８）を含む画分を得た。

【化179】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、流速：０．７ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→８５：１５ ２分、次いで８５：１５→６５：３５ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８（１．６ｍｇ、０．２５μｍｏｌ、収率５７％）を得た。
ESI-MS：calcd for Ｃ_２５７Ｈ_４０２Ｎ_５０Ｏ_１２５Ｓ_４：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ２１０７．８、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １５８１．１、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １２６５．１、found ２１０７．９、１５８０．９、１２６５．１。

【0234】

実施例６５ Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
６５−１ ペプチドの合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて樹脂に結合した状態にある保護された下記式（１４５）で表わされるペプチド１４５（配列番号１４９）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

【化180】

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樹脂の一部（５０μｍｏｌ）を取り、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７３：２７→６３：３７ ３０分 直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１４６）で表わされるペプチド１４６（配列番号１５０）（３０．４ｍｇ）を得た。

【化181】

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ESI-MS：（m／z）（m／z）calcd for Ｃ_１５０Ｈ_２３２Ｎ_４４Ｏ_４１Ｓ_６：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １１６７．７、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ８７６．０、found １１６７．５、８７５．９。

【0235】

６５−２ 糖鎖誘導体におけるＢｏｃ基の脱保護
化合物ｍ（５０．０ｍｇ、１９．０μｍｏｌ）を９５％ＴＦＡ水（２．５ｍＬ）に溶解させ、室温で振盪した。１０分後、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加え、析出した沈殿を遠心分離（１０，０００×ｇ１０分間）した。沈殿物を水に溶解して凍結乾燥することで、下記式（ｓ）で表される化合物ｓ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖：４６．０ｍｇ、１８．９μｍｏｌ、収率９９％）を得た。

【化182】

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（ｓ）
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_９０Ｈ_１５２ＢｒＮ_１１Ｏ_６０：［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ １２１５．１、［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ ８１０．４、found １２１４．９、８１０．３。

【0236】

６５−３ チオールの糖鎖修飾
上記６５−１に記載の方法で得られたペプチド１４６（２０．６ｍｇ、５．８９μｍｏｌ）と上記６５−２に記載の方法で得られた化合物ｓ（２８．６ｍｇ、１１．８μｍｏｌ）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に溶解し、室温で３０分反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７４：２６→６４：３６ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４７）で表わされる糖ペプチド１４７（配列番号１５１）（１７．１ｍｇ、２．９３μｍｏｌ、収率５０％）を得た。

【化183】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２４０Ｈ_３８３Ｎ_５５Ｏ_１０１Ｓ_６：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １９５０．１、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４６２．８、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１７０．５、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９７５．６、found １９４９．９、１４６２．６、１１７０．３、９７５．４。

【0237】

６５−４ ＳｔＢｕ基の脱保護
上記６５−３に記載の方法で得られた糖ペプチド１４７（１７．１ｍｇ、２．９３μｍｏｌ）に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３．４ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（５２．９ｍｇ、３４３μｍｏｌ）を添加し、室温で３時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９５：５→７５：２５ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４８）で表わされる糖ペプチド１４８（配列番号１５２）（８．６ｍｇ、１．５μｍｏｌ、収率５１％）を得た。

【化184】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_２３６Ｈ_３７５Ｎ_５５Ｏ_１０１Ｓ_５：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １９２０．７、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １４４０．８、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １１５２．８、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ９６０．９、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ ８２３．７、found １９２０．５、１４４０．６、１１５２．７、９６０．６、８２３．６。

【0238】

６５−５ チオールの糖鎖修飾反応
上記６５−４に記載の方法で得られたペプチド１４８（６．２ｍｇ、１．１μｍｏｌ）と化合物ａ（３．８ｍｇ、１．６μｍｏｌ）を１．６ｍＭ ＤＴＴを含む０．３６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３３９ｍＬ）に溶解し、室温で２．５時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４９）で表わされる糖ペプチド１４９（配列番号１５３）（６．４ｍｇ、０．８０μｍｏｌ、収率７３％）を得た。

【化185】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３２２Ｈ_５１４Ｎ_６２Ｏ_１６３Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ２００６．５、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １６０５．４、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １３３８．０、found ２００６．６、１６０５．３、１３３８．０。

【0239】

６５−６ Ａｃｍ基の脱保護
上記６５−５に記載の方法で得られた糖ペプチド１４９（８．２ｍｇ、１．０μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（２．１ｍｇ、１３μｍｏｌ）の水溶液（２２５μＬ）を添加し、室温で１時間反応させた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２０４μＬ）に溶解したＤＴＴ（４．８ｍｇ、３１μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（５１μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５０）で表わされる糖ペプチド１５０（配列番号１５４）（５．５ｍｇ、０．７０μｍｏｌ、収率７０％）を得た。

【化186】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_３１６Ｈ_５０４Ｎ_６０Ｏ_１６１Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １９７１．０、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １５７７．０、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １３１４．３、found １９７０．６、１５７６．８、１３１４．２。

【0240】

６５−７ ジスルフィド結合の形成
上記６５−６に記載の方法で得られた糖ペプチド１５０（５．４ｍｇ、０．６９μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．７ｍＬ）に溶解し、室温で終夜反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５ ３０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式１５１で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）（配列番号１５５）を含む画分を得た。

【化187】

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この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（３．１ｍｇ、０．４０μｍｏｌ、収率５８％）を得た。
ESI-MS：calcd for Ｃ_３１６Ｈ_５０２Ｎ_６０Ｏ_１６１Ｓ_５：［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ １９７０．５、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ １５７６．６、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ １３１４．０、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １１２６．４、［Ｍ＋８Ｈ］^８＋ ９８５．８、［Ｍ＋９Ｈ］^９＋ ８７６．３、found １９７０．３、１５７６．４、１３１３．９、１１２６．４、９８５．５、８７６．１。

【0241】

実施例６６ Ｓ１−４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の合成
６６−１ ペプチドの合成
固相合成用カラムに２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（１５２）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド１５２（配列番号１５６）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。

【化188】

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Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ５０ｘ２５０ｍｍ、流速：４３．７ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水 Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５ ２０分 直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１５３）で表わされるペプチド１５３（配列番号１５７）（１２７．２ｍｇ）を得た。

【化189】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_１５２Ｈ_２３４Ｎ_４６Ｏ_４３Ｓ_７：［Ｍ＋３Ｈ］^３＋ １２０７．１、［Ｍ＋４Ｈ］^４＋ ９０５．６、［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ７２４．６、found １２０６．９、９０５．１、７２４．５。

【0242】

６６−２ チオールの糖鎖修飾反応
上記６６−１に記載の方法で得られたペプチド１５３（３０．４ｍｇ、８．４０μｍｏｌ）と化合物ａ（１２８ｍｇ、５４．７μｍｏｌ）を３３ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．５ｍＬ）に溶解し、室温で終夜反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８２：１８→７１：２９ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５４）で表わされる糖ペプチド１５４（配列番号１５８）（３０．９ｍｇ、２．４４μｍｏｌ、収率２９％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_４９６Ｈ_７９０Ｎ_７４Ｏ_２９１Ｓ_７：［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ２１１２．７、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １８１１．１、found ２１１２．８、１８１１．０。

【化190】

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【0243】

６６−３ Ａｃｍ基の脱保護
上記６６−２に記載の方法で得られた糖ペプチド１５４（３０．９ｍｇ、２．４４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（５．０ｍｇ、３０μｍｏｌ）の水溶液（０．９８ｍＬ）を添加し、室温で２０分間反応させた。その後、２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９８ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（１１．８ｍｇ、７６．５μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（２４４μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水 Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント Ａ：Ｂ＝８２：１８→７０：３０ ２０分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５５）で表わされる糖ペプチド１５５（配列番号１５９）（２０．６ｍｇ、１．６４μｍｏｌ、収率６７％）を得た。

【化191】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_４９０Ｈ_７８０Ｎ_７２Ｏ_２８９Ｓ_７：［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ２５０６．６、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ２０８９．０、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １７９０．７、found ２５０６．５、２０８８．８、１７９０．４。

【0244】

６６−４ ジスルフィド結合の形成
上記６６−３に記載の方法で得られた糖ペプチド１５５（２０．６ｍｇ、１．６４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、２．１ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。その後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液 Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム‐アセトニトリル（１／９、ｖ／ｖ） グラジエント Ａ：Ｂ＝７５：２５→７２：２８ １５分 直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５６）で表わされるＳ１−４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８（配列番号１６０）（１１．６ｍｇ、０．９３μｍｏｌ、収率５７％）を得た。

【化192】

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ESI-MS：（m／z）calcd for Ｃ_４９０Ｈ_７７８Ｎ_７２Ｏ_２８９Ｓ_７：［Ｍ＋５Ｈ］^５＋ ２５０６．２、［Ｍ＋６Ｈ］^６＋ ２０８８．７、［Ｍ＋７Ｈ］^７＋ １７９０．５、found ２５０６．１、２０８８．６、１７９０．４。

【0245】

表１−１から表１−７に、実施例１〜６６に記載の方法で得られた糖鎖付加ＳＲＩＦペプチドのＭＳスペクトルデータ（ＥＳＩ−ＭＳ）を示す。分子質量は、ＭａｓｓＬｙｎｘバージョン４．１（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、多価タンパク質質量分析のデコンボリューションを行うことによって得た。

【0246】

【表1】

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【表2】

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【表3】

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【表4】

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【表5】

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【表6】

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【表7】

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【0247】

実施例６７−１ 受容体結合親和性の算出
下記の方法で競合的結合実験を行い、受容体結合親和性を算出した。
競合的結合実験に用いた試薬とその正式化学名は以下の通り。ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）。
競合的結合実験はリセルカバイオサイエンス社に委託し、実験およびデータ解析を行った。用いた受容体サブタイプおよび受容体膜標品を表２に示す。各結合実験に共通して、標識リガンドとして［^１２５Ｉ］Ｔｙｒ^１１−Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ１４（Ｔｙｒ１１−ＳＲＩＦ１４）を、非標識リガンドとしてＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ−１４（ＳＲＩＦ１４）を、バッファとして５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ ＢＳＡを含んだ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を使用した。試験物質は、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、または、１０００ｎＭの濃度で使用し、膜標品と混ぜ合わせて反応液とした。また、反応液に添加した標識リガンドおよび非標識リガンドの濃度を表２に示す。反応液のインキュベーション条件は、ＳＳＴＲ２では２５℃で４時間、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５では２５℃で２時間とした。実験回ごとに、陽性対照としてＳＲＩＦ１４を用いた。データ解析は、ＭａｔｈＩＱ^ＴＭ（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社、ＵＫ）を使用して非線形性最小二乗法で、結合阻害率の数値データを基に５０％阻害濃度（ＩＣ_５０値）を求めた。結合阻害定数（Ｋｉ値）はＣｈｅｎｇ，Ｙらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２２，３０９９−３１０８，１９７３）により算出した。

【表8】

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【0248】

結合実験を実施した化合物および結合実験の結果を表３Ａに示す。また、対照化合物としてオクトレオチド、ＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８を同様に評価した。なお、オクトレオチドについては最高濃度を１００ｎＭとしたため、ＳＳＴＲ１、およびＳＳＴＲ４においてＩＣ_５０値を算出できず、>１００ｎＭと表記した。
なお、図１Ａおよび図１Ｂは、表３Ａ中の化合物名に対応する糖鎖付加ペプチド（糖鎖付加体）の構造の一例を示す。

【0249】

【表9】

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【0250】

対照としたオクトレオチドはＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ５の各受容体に、またＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８は全てのＳＳＴＲに結合した。表３Ａに示すように、本発明に係る化合物は、全てのＳＳＴＲに強力に結合した。陽性対照のＳＲＩＦ１４のＳＳＴＲ１に対する結合親和性がＫｉ値で０．３６２ｎＭであったのに対し、本発明の糖鎖を１本または２本有する化合物は０．７０４〜１４７ｎＭであり、優れた結合親和性を示した。また、本発明の糖鎖を３本有する化合物（実施例２４、２５、２９の化合物）も、３．４９ｎＭ、１６．９ｎＭ、および、５７．３ｎＭを示し、優れた結合親和性を有していた。なお、その血中半減期の延長による生物学的利用能（バイオアベイラビリティ：ＢＡ）も大幅に増大するため、結合親和性のＫｉ値が多少高い場合であっても、生体内において受容体に対し有効に作用することができる。同様に、ＳＲＩＦ１４のＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ４に対する結合親和性がＫｉ値でそれぞれ０．００７５５ｎＭ、０．０４５０ｎＭ、０．２７３ｎＭであったのに対し、本発明の化合物はそれぞれ０．０１１９〜３．３３ｎＭ、０．０５３１〜３．７７ｎＭ、０．５６４〜４０．５ｎＭであり、いずれも優れた結合親和性を示した。また、ＳＲＩＦ１４のＳＳＴＲ５に対する結合親和性が０．３２６ｎＭであったのに対し、本発明の化合物は８．３３ｎＭまでの高い結合親和性を示した。
実施例１〜６、１０、１３〜１９、２６、２７、３０、および、３１の化合物は、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５のすべての受容体に対し結合親和性を有する糖鎖１本修飾体であることがわかった。また、同様に、実施例２０〜２３、および２８は、ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の全ての受容体に対する親和性を有する糖鎖２本修飾体であり、実施例２４、２５、および２９はＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の全ての受容体に対する親和性を有する糖鎖３本修飾体であることがわかった。

【0251】

実施例６７−２ 受容体結合親和性の算出−２
表３Ｂに示す各化合物について、実施例６７−１に記載の方法で競合的結合実験を行い、受容体結合親和性を算出した。また、対照化合物としてＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８を同様に評価した。結合実験の結果を表３Ｂに示す。
なお、図１Ｃおよび図１Ｄは、表３Ｂ中の化合物名に対応する糖鎖付加ペプチドの構造の一例を示す。

【表10】

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表３Ｂに示すように、対照となるＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８はＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の全ての受容体に結合した。ここで、実施例６７−１と試験実施回等は異なるため、ＳＲＩＦ１４の各受容体に対するＫｉ値は異なり、２．５から１３．２倍の高い数値となっている。実施例１、７、８、９、２６、２７、３２、３３、３４、３５、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５および６６の化合物は、ＳＳＴＲ１に対するＫｉ値は１．４６〜１００ｎＭ、同じくＳＳＴＲ２で０．０５３６〜６．５１ｎＭ、ＳＳＴＲ３で０．１６０〜７．４４ｎＭ、ＳＳＴＲ４で１．３９〜５９．０ｎＭ、ＳＳＴＲ５で０．３１０〜９５．０ｎＭであり、全ての受容体に対して高い結合親和性を示した。実施例１２の化合物は、ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ５に対するＫｉ値がＳＲＩＦ１４の２８０〜１６００倍であったが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ４に対しては１７．９、７．４４、２４．１ｎＭのＫｉ値であり、結合親和性を保持していると考えられた。実施例３８の化合物は、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３に対するＫｉ値がＳＲＩＦ１４の３１０〜５３００倍と著しく親和性が低下していたが、ＳＳＴＲ４およびＳＳＴＲ５対しては１１０、３３．０ｎＭのＫｉ値であり、結合親和性を保持していると考えられた。実施例４９の化合物は、ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ４に対するＫｉ値がＳＲＩＦ１４の１７０倍および４６倍以上であったが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ５に対してはそれぞれ、２７０ｎＭ、１４．０ｎＭ、２３．０ｎＭのＫｉ値であり、結合親和性を保持していると考えられた。

【0252】

実施例６７−３ 受容体発現細胞を用いたアゴニスト活性評価−１
ソマトスタチン受容体はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５はいずれもＧタンパク質のサブファミリーであるＧｉ／Ｇｏを介してアデニリルシクラーゼ活性を抑制し、細胞内ｃＡＭＰ濃度を低下させる。本実験系では、各ソマトスタチン受容体発現細胞を用い、試験物質のｃＡＭＰ産生抑制作用のＩＣ_５０値を算出し、アゴニスト活性を評価した。また、対照化合物としてＳＲＩＦ１４、ＳＲＩＦ２８を同様に評価した。
本実験に用いた試薬とその正式化学名は以下の通り。ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＢＭＸ（３-ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。
ＳＳＴＲ２〜ＳＳＴＲ５に対する評価は、以下の条件で実験を行った。バッファとして、０．３％ ＢＳＡ、０．５ｍＭ ＩＢＭＸを含んだＤＭＥＭを用い、表３Ｃに示す受容体発現細胞を１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。試験物質は０．００００１ｎＭ、０．０００１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、または１０００ｎＭの濃度で、１０μＭ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎと混ぜ合わせて処置し、室温で３０分反応させた。反応後、０．２Ｎ ＨＣｌで細胞を溶解し、細胞内に蓄積したｃＡＭＰ量をケイマン社ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（Cayman、582002）を用いて測定した。
ＳＳＴＲ１に対する評価はセレップ社に委託し、実験を行った。バッファとして、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５００μＭ ＩＢＭＸを含んだＨＢＳＳを用い、ＳＳＴＲ１受容体発現細胞を１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。試験物質は０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの濃度で、１μＭ ＮＫＨ４７７と混ぜ合わせて処置し、３７℃で２０分反応をさせた。反応後、細胞内に蓄積したｃＡＭＰ量をシスバイオ社ｃＡＭＰ ｄｙｎａｍｉｃ２ ｋｉｔ（cisbio、62AM4PE）を用いて測定した。

【表11】

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【0253】

糖鎖付加体として、実施例１、１８、２７、２８、５７および５８の化合物を用いた際の、アゴニスト活性評価試験の実験結果（ＩＣ_５０（ｎＭ））を表３Ｄおよび図１Ｅに示す。対照化合物のＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８のＩＣ_５０はＳＳＴＲ１に対し０．８３〜０．８９ｎＭ、また、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５に対してそれぞれ０．００７６〜０．０７３ｎＭ、０．０２９〜０．２１ｎＭ、０．０１５〜０．０７４ｎＭ、０．０６６〜０．１２ｎＭであった。糖鎖付加体である化合物の、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５に対するアゴニスト活性のＩＣ_５０は１．０〜２．４ｎＭ、０．０４１〜０．１０ｎＭ、０．１２〜０．３０ｎＭ、０．０３９〜０．０８５ｎＭ、０．０４３〜０．０８１ｎＭであり、ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の全ての受容体に対して優れたアゴニスト活性を示した。実施例６７−１および実施例６７−２に示した結果から、これらの化合物は受容体結合能をもっていることが明らかであり、これらの化合物は受容体に結合することによってアゴニスト活性を発揮することが明らかとなった。

【表12】

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【0254】

実施例６７−４ 受容体発現細胞を用いたアゴニスト活性評価−２
糖鎖付加体として、表３Ｅに記載の各化合物を用いて、実施例６７−３と同様にしてアゴニスト活性評価試験を実施した。実験結果を表３Ｅに示す。なお、表３Ｅ中、「−（ハイフン）」が記載されている欄は、未実施であることを示す。

【表13】

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【0255】

表３Ｅにおいて、糖鎖付加体である化合物の、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５に対するアゴニスト活性のＩＣ_５０はそれぞれ１．２〜２２ｎＭ、０．０１９〜１．４ｎＭ、０．０３９〜３．８ｎＭ、０．０３３〜１．６ｎＭ、０．０３１〜１．１ｎＭであり、ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５の受容体に対してアゴニスト活性を示した。実施例６７−１及び実施例６７−２に示した結果から、これらの化合物は受容体結合親和性を有しており、これらの化合物は受容体に結合することによってアゴニスト活性を発揮することが明らかとなった。

【0256】

実施例６８ ラットを用いた薬物動態試験１
本発明の糖鎖付加ポリペプチド（糖鎖付加体）が、非糖鎖付加のＳＲＩＦ２８と比較して薬物血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、血中半減期（ｔ_１／２）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、およびバイオアベイラビリティなど薬物動態プロファイルが改善されていることを確認するために、ラットを用いて静脈内投与および皮下投与による薬物動態解析を行った。

【0257】

６８−１ 投与液および試薬の調製
糖鎖付加体（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８）を日本薬局方生理食塩液（大塚製薬工場社製）に溶解して４０μＭ溶液を調製し、投与液とした。ＰＢＳ溶液は、Phosphate buffered saline（シグマ社製 P4417）１錠を超純水２００ｍＬに溶解し、調製した。ＥＤＴＡ−ＰＢＳは、ＥＤＴＡ−２Ｎａ（和光純薬工業社製）を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで溶解し、調製した。アプロチニン含有ＥＤＴＡ−ＰＢＳ液は、アプロチニン（和光純薬工業社製 010-11834）を０．１４２ｍｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡ−ＰＢＳで溶解して調製し、採取血液に対する抗凝固剤として用いた。

【0258】

６８−２ 血漿サンプルの調製
雄性のＳＤ系ラット（Crl:CD(SD)、日本チャールスリバー株式会社、６週齢、ｎ＝３、体重１６１．３〜２３９．３ｇ）の尾静脈もしくは背部皮下に、上記６８−１で調製した投与液を、非絶食下１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および２６Ｇ注射針（いずれもテルモ社製）を用いて投与した（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８として４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）。投与前、投与後２分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間後に、ラット頚部静脈より採血を行った。採取した血液０．２ｍＬを、上記６８−１で調製したアプロチニン含有ＥＤＴＡ−ＰＢＳ液０．２ｍＬと速やかに混和し、氷上で３０分以上放置した。遠心分離（１，８７０ｘｇ、４℃、１０分）後、上清を２５０μＬ採取し、血漿サンプルとした。ブランク血漿として、無処置のラット頚部静脈より採取した血液を同様に処理して得た血漿を用いた。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。なお、チップおよびチューブはビーエム機器社の低吸着性のものを使用した。

【0259】

６８−３ 血漿中濃度測定
上記６８−２で得られた血漿サンプルにおけるＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の血漿中濃度測定を、フェニックスファーマシューティカルズ社ソマトスタチンＥＩＡキット（Phoenix Pharmaceuticals Inc、EK-060-03）を用いて行った。血漿サンプルを、ＥＩＡキット付属アッセイバッファを用いて５倍、２０倍、１００倍、４００倍、１６００倍に希釈し、測定サンプルとした。検量線を作成するための標準液は、以下のように調製した。まず、上記６８−２で得られたブランク血漿を、ＥＩＡキット付属アッセイバッファを用いて血漿サンプルと同様に希釈し、標準液調製用のアッセイバッファとした（例えば、血漿サンプルを１００倍希釈する場合は、ＥＩＡキット付属アッセイバッファに１／１００量のブランク血漿を添加して標準液調製用アッセイバッファとした）。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８をＰＢＳ溶液で希釈して１００μＭ溶液を調製し、１００μＭ溶液から２μＭ溶液を調製した。得られた２μＭ Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８溶液を、標準液調製用アッセイバッファを用いて段階希釈し、２０ｎＭ、１０ｎＭ、２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０４ｎＭの標準液を調製した。得られた結果に、希釈率を掛け、さらに抗凝固剤処理としてのアプロチニン含有ＥＤＴＡ−ＰＢＳ液での希釈率２を掛けることにより、血漿中濃度を算出した。対照として、糖鎖付加体の代わりに非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いて同様の操作を行った。得られた血漿中のＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８濃度推移を図２に示す。

【0260】

６８−４ 薬物速度論的パラメータの算出
得られたＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８濃度推移からモーメント解析手法を用い、ＡＵＣを台形法により算出した。また、外挿法により静脈内投与時の予測初期濃度（Ｃ_０）、さらにｔ_１／２、ＭＲＴ、および皮下投与時の実測値より最高血漿中濃度（Ｃ_ｍａｘ）を求めた。得られた薬物速度論的パラメータを表４に示す。

【表14】

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図２および表４に示した結果から判明するように、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８は、非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８と比較してｔ_１／２およびＭＲＴが著しく延長し、また、ＡＵＣおよびＣ_ｍａｘの増加が認められた。これらのことは、糖鎖付加体とすることにより血液中の分解活性に対し抵抗性が増したためと考えられる。糖鎖付加体は、非糖鎖付加体に比べ生体中での安定性が向上することが明らかである。また、ＡＵＣおよびＣ_ｍａｘが増加したことの要因は、本発明に係るバイオアベイラビリティの向上のほかに、これら生体中での安定性向上も一因と考えられる。

【0261】

実施例６９ ラットを用いた薬物動態試験２
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。対照として、糖鎖付加体の代わりに非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いた。得られた血漿中の化合物濃度推移を図３に示す。

【0262】

実施例７０ ラットを用いた薬物動態試験３
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。対照として、糖鎖付加体の代わりに非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いた。得られた血漿中の化合物濃度推移を図４に示す。

【0263】

実施例７１ ラットを用いた薬物動態試験４
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図５に示す。

【0264】

実施例７２ ラットを用いた薬物動態試験５
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、およびＳ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図６に示す。

【0265】

実施例６９〜７２の薬物動態試験において得られた血漿中の化合物濃度推移から、実施例６８と同様に各化合物の薬物速度論的パラメータを算出した。また、得られたパラメータを用いて、バイオアベイラビリティを以下の数式により算出した。結果を表５Ａに示す。
ＢＡ（％）＝（ＡＵＣ_（ｓｃ）／Ｄｏｓe_（ｓｃ）） ／ （ＡＵＣ_（ｉｖ）／Ｄｏｓe_（ｉｖ））
ＡＵＣ_（ｓｃ）：皮下投与時のＡＵＣ（ｍｉｎ・ｎＭ）
Ｄｏｓe_（ｓｃ）：皮下投与における投与量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）
ＡＵＣ_（ｉｖ）：静脈内投与時のＡＵＣ（ｍｉｎ・ｎＭ）
Ｄｏｓe_（ｉｖ）：静脈内投与における投与量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）

【表15】

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【0266】

表５Ａに示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加体は、修飾糖鎖の本数が増えるにつれてそのバイオアベイラビリティが増加した。すなわち、非糖鎖付加体で５％であったものが、糖鎖を１本付加した糖鎖付加ポリペプチドでは３７〜６０％、平均で５０％に、２本の糖鎖を間隔ありで付加したものでは７７〜８５％、平均で８１％に、３本の糖鎖を間隔ありで付加したものでは９１％に増加していることが判明した。また、糖鎖を付加した間隔が密なものを比較すると、１本付加したものでは３７％、２本付加したものでは５５％、３本付加したものでは６９％に増加していることが判明した（実施例１、２０、および２４の化合物）。これらの結果により、本発明に係る糖鎖修飾によってバイオアベイラビリティが向上することが証明された。
皮下投与時のバイオアベイラビリティが増加する要因には、様々な薬物動態学的な変動因子が存在する。そのうちの一因として、化合物の血中安定性、あるいは血中への（投与部位からの）移行性が考えられる。表５Ａに示したように、皮下投与時の血中移行性を推察するための指標となる、皮下投与時のＡＵＣは、修飾糖鎖本数の増加に伴い増大する（１本：２２０９ｍｉｎ・ｎＭ、２本（間隔あり）：３４００ｍｉｎ・ｎＭ、３本（間隔あり）：４０１５ｍｉｎ・ｎＭ）ことが認められ、血中移行性の向上がバイオアベイラビリティの増加に寄与していることが推察された。
また、修飾糖鎖の本数が増えるにつれ、静脈内および皮下投与時のｔ_１／２およびＭＲＴの延長作用（たとえば、静脈内投与時のｔ_１／２、１本：１９．０ｍｉｎ、２本（間隔あり）：２７．２ｍｉｎ、３本（間隔あり）：３９．８ｍｉｎ）が認められ、血液中での安定性が向上していることが推察された。一方で、静脈内投与時のＡＵＣは、修飾糖鎖本数に比した増大とはなっておらず（１本：４４５３ｍｉｎ・ｎＭ、２本（間隔あり）：４１９８ｍｉｎ・ｎＭ、３本（間隔あり）：４４０２ｍｉｎ・ｎＭ）、化合物の修飾糖鎖本数増加による血中安定性増加のみがバイオアベイラビリティの増加に貢献しているものではないと考えられる。
皮下投与時のＣ_ｍａｘは、非糖鎖付加体に比べ修飾糖鎖本数が２本までは増加した（０本：４．４７ｎＭ、１本：３０．５ｎＭ、２本（間隔あり）：３５．６ｎＭ）が、３本（間隔あり）（２４．８ｎＭ）では逆に減少する結果となった。投与部位（本実施例では皮下投与）からの血中移行を考えた場合、ＡＵＣが増加する要因として、速やかな血液中への移行、あるいは緩やかでも持続的な血液中への移行の二つの様式が推測される。前者は、投与部位での分解を避けるメリットがあるが、安定性に問題がなければ、後者の様式がより血中移行性が高いと推察される。バイオアベイラビリティの高い糖鎖を３本修飾したものにおいてＣ_ｍａｘが減少していたことは、急激ではなく緩やかな、かつ持続的な血中移行性を示した結果であると考えられる。これらのことから、本発明に関わる修飾糖鎖本数の増加は、急激な血漿中濃度の上昇がなく、持続的な血中移行性（一般的には吸収遅延効果とも言ってよい）を示すと考えられる。

【0267】

表５Ａに示した結果から判明するように、修飾位置として、間隔をとった場合と密にした場合では、ｔ_１／２およびＭＲＴに著明な差はなかった（たとえば、静脈内投与時のｔ_１／２、２本（密）：２８．８ｍｉｎ、２本（間隔あり）：２７．２ｍｉｎ、３本（密）：３８．５ｍｉｎ、３本（間隔あり）：３９．８ｍｉｎ）。
また、ＡＵＣに関しては、静脈内投与時には糖鎖修飾が密である方が、ＡＵＣが増大した。すなわち、２本糖鎖の場合、間隔をとった化合物２１、化合物２２、化合物２３の４０２９〜４４６５ｍｉｎ・ｎＭに比べ、密にした化合物２０は７３０６ｍｉｎ・ｎＭであり、３本糖鎖の場合、間隔をとった化合物２５の４４０２ｍｉｎ・ｎＭに比べ、密にした化合物２４は５６６０ｍｉｎ・ｎＭである。
一方で、バイオアベイラビリティは、糖鎖修飾位置に間隔をとった方が密である方に比べ、向上した。すなわち、２本糖鎖の場合、密にした化合物２０の５５％に比べ、間隔をとった化合物２１、化合物２２、化合物２３は７７〜８５％（平均値８１％）であり、３本糖鎖の場合、密にした化合物２４の６９％に比べ、間隔をとった化合物２５は９１％である。これらのことから、本発明に関わる糖鎖修飾する位置としては、密に複数修飾するよりも、間隔をとり複数本修飾する方が、バイオアベイラビリティの向上に寄与するものと考えられる。

【0268】

実施例７３ ラットを用いた薬物動態試験７
糖鎖付加体として、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図７に示す。

【0269】

実施例７４ ラットを用いた薬物動態試験８
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図８に示す。

【0270】

実施例７５ ラットを用いた薬物動態試験９
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図９に示す。

【0271】

実施例７６ ラットを用いた薬物動態試験１０
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１０に示す。

【0272】

実施例７７ ラットを用いた薬物動態試験１１
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１１に示す。

【0273】

実施例７８ ラットを用いた薬物動態試験１２
糖鎖付加体としてＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１２に示す。

【0274】

実施例７９ ラットを用いた薬物動態試験１３
糖鎖付加体としてＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１３に示す。

【0275】

実施例８０ ラットを用いた薬物動態試験１４
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１４に示す。

【0276】

実施例８１ ラットを用いた薬物動態試験１５
糖鎖付加体としてＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１５に示す。

【0277】

実施例８２ ラットを用いた薬物動態試験１６
糖鎖付加体としてＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１６に示す。

【0278】

実施例８３ ラットを用いた薬物動態試験１７
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１７に示す。

【0279】

実施例８４ ラットを用いた薬物動態試験１８
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ）・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１８に示す。

【0280】

実施例７３〜８４の薬物動態試験７〜１８において得られた血漿中の化合物濃度推移から、実施例６８と同様にして、各化合物の薬物速度論的パラメータを算出した。得られた薬物速度論的パラメータを表５Ｂ〜表５Ｆに示す。

【表16】

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表５Ｂに示した結果から判明するように、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８は、静脈内投与において非糖鎖付加体のＳＲＩＦ２８に比較して、ｔ_１／２が１３〜１８倍延長し、ＡＵＣは８〜２３倍増加した。また、非糖鎖付加体のＳＲＩＦ１４に比較して、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４は、静脈内投与においてｔ_１／２が３３〜３８倍延長し、ＡＵＣは４４〜５５倍増加した。また、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ−ＳＲＩＦ１４は、非糖鎖付加体のＳＲＩＦ１４に比較して、ｔ_１／２が２２〜３３倍延長し、ＡＵＣは１４〜３０倍増加した。すなわち、実施例６８の場合と同様に、糖鎖修飾を行うことで血液中での安定性が向上した結果と考えられた。

【表17】

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【0281】

表５Ｃに示した結果から判明するように、修飾する糖鎖の大きさをＧｌｃＮＡｃ（単糖）、ｄｉＭａｎ（５糖）、ｄｉＧｌｃＮＡｃ（７糖）、ａｓｉａｌｏ（９糖）、ｍｏｎｏｓｉａｌｏ（１０糖）、ｄｉｓｉａｌｏ（１１糖）、ｔｒｉｓｉａｌｏ（１４糖）、ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ（１７糖）へと変更していった場合、修飾する糖鎖の大きさ依存的に皮下投与時のｔ_１／２、ＡＵＣ、バイオアベイラビィティがそれぞれ２〜１７倍、３〜１２０倍、２〜１１倍増加した。このことから、修飾する糖鎖の大きさを変更することによって、血中安定性を向上させるだけでなく、その増加率に変化を持たせられることが明らかとなった。また、これらの糖鎖のうちジマンノース糖鎖やアシアロ糖鎖などは、特定のタンパク質と相互作用することが知られているため、特定のタンパク質あるいは特定のタンパク質を有する臓器や細胞へのターゲッティングにも利用可能と考えられる。また、非還元末端のシアル酸の修飾として、たとえばカルボキシ基へのａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ、ａｍｉｄｅ、Ｂｎなどの導入により電荷を変更させた糖鎖を付加した、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において非糖鎖付加体と比較して、ｔ_１／２が１１〜１４倍延長し、ＡＵＣは７〜１２倍増加し、血中安定性が向上した。これらのことは、シアル酸のカルボキシ基が血中滞留性に大きな影響を与え、カルボキシ基の負電荷の消失（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ）、ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））、あるいは正電荷への変換（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））により、血中クリアランスや体内分布を制御できる可能性（利用法）を示している。

【表18】

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【0282】

表５Ｄに示した結果から判明するように、ＳＲＩＦ１４にｄｉｓｉａｌｏ糖鎖を１本修飾したＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、２本修飾した２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、３本修飾した３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４は静脈内投与において非糖鎖付加体に比較して、ｔ_１／２がそれぞれ３８、６３、７１倍延長し、またＡＵＣはそれぞれ５５、４２、３６倍増加した。同様に、ＳＲＩＦ２８にｄｉｓｉａｌｏ糖鎖を１本修飾したＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、２本修飾したＳ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、３本修飾したＳ１−３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、４本修飾したＳ１−４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において非糖鎖付加体に比較して、ｔ_１／２がそれぞれ１３、２１、３０、４８倍延長し、またＡＵＣはそれぞれ１１、１２、１２、１５倍増加した。ＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８どちらの場合においても、修飾するｄｉｓｉａｌｏ糖鎖の本数に従い、血中安定性が向上することが明らかとなった。

【表19】

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【0283】

表５Ｅに示した結果から判明するように、ＳＲＩＦ２８にａｓｉａｌｏ糖鎖を１本修飾したＳ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、２本修飾したＳ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、３本修飾したＳ１−３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において非糖鎖付加体に比較して、ｔ_１／２がそれぞれ１０、６、５倍延長し、またＡＵＣはそれぞれ１０、６、６倍増加した。修飾する糖鎖がａｓｉａｌｏ糖鎖の場合においても、血中安定性が向上することが明らかとなった。

【表20】

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【0284】

表５Ｆに示した結果から判明するように、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において、非糖鎖付加体に比較して、ｔ_１／２がそれぞれ６〜２１倍延長し、ＡＵＣはそれぞれ６〜１２倍増加した。すなわち、ＳＲＩＦ２８に糖鎖を修飾することによって、血中安定性が向上した。また、シアル酸糖鎖本数の増加に従い、静脈内投与および皮下投与ともｔ_１／２、ＡＵＣ，Ｃmax，ＢＡが増加した。一方で、シアル酸のカルボキシ基の負電荷を消失した場合（２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））、２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ）））、あるいは正電荷を隣接に追加した場合（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ））には皮下投与時のｔ_１／２が延長したにも関わらず、ＡＵＣやＣmaxは増加しなかった．シアル酸のカルボキシ基が血中滞留性あるいは血中移行に大きな影響を与えることから、糖鎖末端の電荷への変換により、血中クリアランスや体内分布を制御できる可能性（利用法）を示している。

【0285】

実施例８５ ラット血漿を用いた血漿中安定性試験
８５−１ 処置液、試薬およびラット血漿の調製
糖鎖付加体および非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８をＰＢＳ溶液に溶解して２μＭ溶液を調製し、処置液とした。１０％ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製 208-02746）を１０ｖ／ｖ％となるように水で溶解し、調製した。ラット血漿は、Ｗｉｓｔａｒ系ラット（Crlj:Wistar、雄性、日本チャールスリバー株式会社、７週齢）からヘパリン加血漿（ヘパリン：日本薬局方ヘパリンナトリウム注射液（持田製薬））として調製した。

【0286】

８５−２ 血漿添加サンプルの調製
ラット血漿０．２７ｍＬ（ｎ＝３）に対し、上記８５−１で調製した糖鎖付加体処置液０．０３ｍＬを速やかに混和して血漿添加サンプルとし、３７℃恒温槽で保温した。混和後、０分と、１〜２４時間までに経時的に血漿添加サンプル０．０４ｍＬを採取し、１０％ＴＦＡ０．０１ｍＬと速やかに混和した。遠心分離（２０，０００ｘｇ、４℃、１０分）後、上清を０．０４ｍＬ採取し、血漿中安定性測定サンプルとした。サンプリング時間は０時間、１時間、２時間、４時間、あるいは０時間、４時間、８時間、２４時間とした。ブランク血漿として、処置液としてＰＢＳ溶液を用いたこと以外は同様に処理して得た血漿を用いた。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。実験回ごとに、陽性対照として非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いた。

【0287】

８５−３ サンプル中濃度測定および血漿中安定性インデックスの算出
実施例６８−３の血漿中濃度測定と同様の方法で、上記８５−２で得られた血漿中安定性測定サンプル中に残存する糖鎖付加体の濃度を測定した。混和後０分の糖鎖付加体濃度を１００％とし、時間経過後の残存率を百分率（％）で表し、以下の指数式（１）の消失速度定数から算出式（２）を用いて、半減期を算出した。その後、実験回ごとの非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８の半減期を１として、糖鎖付加体の血漿中安定性インデックス（ＰＳ ｉｎｄｅｘ）を算出した。結果を表６および図１９に示す。また、血漿中安定性インデックスが２０以上のものについては、>２０として表記した。なお、図１９では、血漿中安定性インデックスが２０を超えるものであっても、２０を上限として表記している。
残存率（％）＝１００・ｅ^{（ｋ・ｔ）} ・・・（１）
ｅ：自然対数の底
ｋ：消失速度定数
ｔ：時間（hour）
半減期（hour）＝０．６９３／ｋ ・・・（２）

【表21】

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【0288】

図１９に示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ＳＲＩＦ２８に比べ、血漿中安定性が増加した。すなわち、１位、５位、９位、１２位に１本糖鎖を付加したもの（実施例１、２、３、４の化合物）では、ＳＲＩＦ２８の４．５倍〜６．７倍であり、１３位に糖鎖を付加したもので１５．９倍（実施例５の化合物）、１４位に糖鎖を付加したもので１９．１倍（実施例６の化合物）、３０位に糖鎖を付加したもので１６．８倍（実施例１４の化合物）であった。また、１９位、Ｃ末端側にさらに糖鎖付加アミノ酸を１つ付加したものでは２０倍以上（実施例１０、１３の化合物）であった。糖鎖を付加する位置は、１位からＣ末側へ向かうにつれて、血漿中安定性が増すことが示された。

【0289】

実施例８６ ラットを用いたＧＨ産生抑制試験
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、実施例６７で示すように、ＳＳＴＲの各受容体に対する親和性を有していた。一方、各ＳＳＴＲに対する親和性が減衰したものも見られたが、このような場合においても実施例６８〜８５で示した血中半減期の延長やバイオアベイラビリティの増大などにより、生体内で受容体に対し薬理学的に有効に作用を示すことを証明するために、ラットを用いたインビボ試験として、成長ホルモン（ＧＨ）産生に対する本発明の糖鎖付加ポリペプチドの投与効果を評価する試験を実施した。血液中へのＧＨ産生量の増加は、ＧＨのパラクライン的作用を介し、各種臓器に対し細胞の増殖や分化系、生合成系の活性化あるいは抑制を引き起こし、生体反応に影響を及ぼすと考えられる。視床下部から放出されるソマトスタチンは下垂体前葉からの血中へのＧＨ分泌を抑制する。本実験系は、血中ＧＨ産生量を指標に、糖鎖付加体のＳＳＴＲに対する薬理作用、および、糖鎖付加体の投与後の血中残存を評価できる試験系として実施した。

【0290】

８６−１ 投与液および試薬の調製
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８および２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用い、日本薬局方生理食塩液（大塚製薬工場社製）に溶解して１〜１００μＭ溶液を調製し、投与液とした。また、ＧＨ遊離促進剤として、ＧＲＦ（ＧＨ放出ホルモン、Growth hormone releasing factor）を使用した。ＧＲＦは、ＧＲＦ注射液（注射用ＧＲＦ住友５０、Lot. 2006C、大日本住友製薬社製）を注射用水（Lot. 09H18C、扶桑薬品工業社製）１ｍＬで溶解後、２μｇ／ｍＬとなるように生理食塩液で２５倍希釈し、調製した。採血の際に、抗凝固剤として用いるヘパリンは、日本薬局方ヘパリンナトリウム注射液（Lot. B084、持田製薬社製）を原液のまま、使用した。

【0291】

８６−２ 血漿サンプルの調製
雄性のＳＤ系ラット（Crl:CD(SD)、日本チャールスリバー株式会社、６週齢、ｎ＝３、体重１４５．２〜１６３．９ｇ）の背部皮下に、上記８６−１で調製した投与液を、非絶食下１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および２６Ｇ注射針（いずれもテルモ社製）を用いて投与した。対照群として、糖鎖付加ポリペプチドを含まない生理食塩液を、同様に投与した（ベヒクル群）。その後、すなわち糖鎖付加体投与後５〜６分の間に、全身麻酔剤としてペントバルビツール酸ナトリウム（ソムノペンチル、Lot.0608101、共立製薬社製）を５０ｍｇ／ｋｇとなるように、注射筒および注射針を用い腹腔内に投与した。糖鎖付加体投与後１時間に、すなわち麻酔下で５０分以上経過した状態で、ＧＨ遊離促進剤としてＧＲＦを尾静脈に１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および注射針を用いて投与した。ＧＲＦ投与後５分に、ラット頚部静脈よりヘパリンを入れた注射筒および注射針を用い、採血を行った。採取した血液０．４ｍＬを氷上で２０分以上放置した後、遠心分離（１，８７０ｘｇ、４℃、１０分）し、上清を１００μＬ採取し、血漿サンプルとした。ブランク血漿として、無処置のラット頚部静脈より採取した血液を同様に処理して得た血漿を用いた。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。

【0292】

８６−３ 血漿中ＧＨ濃度の測定
上記８６−２で得られた血漿サンプルにおけるＧＨ濃度測定を、ＳＰＩ−Ｂｉｏ社ラットＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅＥＩＡキット（SPI-Bio、A05104）を用いて行った。血漿サンプルを、ＥＩＡキット付属アッセイバッファを用いて２０倍、１００倍、５００倍に希釈し、測定サンプルとした。検量線を作成するための標準液は、添付の説明書に従い蒸留水で４０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製した後、アッセイバッファを用いて段階希釈し、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、０．６３ｎｇ／ｍＬ、０．３１ｎｇ／ｍＬを調製した。得られた結果に、希釈率を掛けることにより、ＧＨ濃度を算出した。得られた血漿サンプル中ＧＨ濃度を表７に示す。

【表22】

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【0293】

表７に示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加体は、ラットにおけるＧＨ産生を抑制した。実施例１、実施例１０、実施例１３の糖鎖付加体は、実施例６７−１の手法により測定した場合、各受容体に対するＫｉ値と糖鎖を有さないＳＲＩＦ１４のＫｉ値との比が１００：１〜１．３：１の範囲内と示されている。また、実施例１の糖鎖付加体は、実施例６８〜７２の手法により測定した場合、血中半減期が１０倍以上増大していることが示されている。本実施例からは、糖鎖付加体が生体内でも薬理学的な作用を有効に発揮することが示された。
また、本発明の糖鎖付加体は、ＧＲＦ投与の１時間前に投与した場合であっても、ＧＨ産生抑制作用を有していた。
また、実施例１と、実施例１０および実施例１３の糖鎖付加体では、ラットＧＨ産生能に対する有効な投与量が１０倍程度異なることが示された。このことは、実施例６７−１の手法により測定した場合、それらの受容体親和性がＫｉ値で１０倍程度の差であることと類似する。糖鎖付加体の親和性が多少減衰した場合においても、薬理学的な活性を有することが示された。

【0294】

実施例８７ ラットを用いたＧＨ産生抑制試験２
実施例８６−１〜８６−３と同様にして、次に示す糖鎖付加体である化合物のラットＧＨ産生抑制試験を実施した。糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ２２−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用いた。得られた血漿サンプル中ＧＨ濃度を表８に示す。

【表23】

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【0295】

表８に示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ラットにおけるＧＨ産生を抑制した。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８は本試験系において、１ｎｍｏｌ／ｋｇからＧＨ産生を抑制し、３〜１０ｎｍｏｌ／ｋｇで８２〜９９％のＧＨ産生抑制効果を示した。これは実施例６７−１及び６７−２および実施例６８〜８５で示したように、ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５に対して親和性を持ち、血中滞留性が向上したためであると考えられる。
実施例６７−１及び６７−２において、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８と同等の親和性を示すＮ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｄ−Ｔｒｐ−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））−ＳＲＩＦ２８およびＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇで９５〜９９％のＧＨ産生抑制効果を示し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８と同等の効果を示した。

【0296】

実施例６８〜８５の手法に示す結果から、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８は、皮下投与時のＡＵＣがＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の３分の１から２分の１であり、またＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８は７分の１であった。一方、実施例６７−１及び６７−２に示す手法によって、これらはいずれもＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８よりも高い親和性を示した。そのため本実験系において、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））−ＳＲＩＦ２８は１０ｎｍｏｌ／ｋｇで７０〜９９％のＧＨ産生を抑制し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８と同等の効果を示したと考えられる。

【0297】

実施例６７−１及び６７−２に示す手法によって、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８よりも低い親和性を示した。一方、実施例６８〜８５の手法に示す結果から、皮下投与時のＡＵＣが、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の１．８倍から２．８倍と向上した化合物である。本実験系において、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８は、１０もしくは１００ｎｍｏｌ／ｋｇ投与によってＧＨ産生抑制活性を示した。これらの結果は、受容体親和性が低下した場合においても血中安定性が増大することで、ソマトスタチンの活性を補償または増大させることができたことを示す。

【0298】

実施例８８ 消化管閉塞モデルでの薬効試験
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、実施例８６および実施例８７で示すように、ラット生体内においてもアゴニストとして有効に作用することを証明した。次に、疾患モデルにおいても有効性を示すことを証明するために、ラット消化管閉塞モデルでの評価を実施した。イレウス等の消化管閉塞では、消化管の組織障害、また水や電解質などの吸収能低下により、腹部膨満感・嘔吐・腹痛などといった消化器症状を示す。その病態は、消化管内容物の通過障害や、消化液や生理活性物質の消化管内への放出によって引き起こされることが知られている。ソマトスタチンは、消化器系に発現するＳＳＴＲを介して各種消化液の分泌抑制、あるいは水・電解質の吸収促進により消化管内容物を減少させるといった作用を示し、症状改善に有効とされる。本実験系は、腸管閉塞後の空腸における腸液重量の変化を指標として、腸液の吸収促進あるいは分泌抑制作用を評価する試験系として実施した。また、組織障害時の指標として逸脱酵素であるアミラーゼ（膵臓）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ、肝臓）およびクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ、骨格筋、心筋等）の血液パラメータを測定した。

【0299】

実施例８８−１ 消化管閉塞モデルの作成
本試験は三菱化学メディエンス社に委託し、実施した。雄性のＳＤ系ラット（Crl:CD（SD）日本チャールスリバー株式会社、８週齢、ｎ＝５以上、体重２５１．１〜２７８．１ｇ）を１２時間以上絶食させた。２％イソフルラン及び笑気：酸素＝７：３吸入にて麻酔導入し、手術中はこれを維持した。腹部を正中切開し、十二指腸提筋から約１０ｃｍのところの空腸を縫合糸にて結紮した。その後、切開部を速やかに縫合し、化合物投与まで絶食とした。偽処置群は、空腸の結紮を行わず、腹部を正中切開した後に切開部を縫合する処置を行った。

【0300】

実施例８８−２ 化合物の調製および投与
糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８を用い、日本薬局方生理食塩液（大塚製薬工場社製）に溶解して４０μＭ溶液を調製し、投与液とした。消化管閉塞手術から１８時間後、１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および２５Ｇ注射針（いずれもテルモ社製）を用いて頸背部に皮下投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群として、糖鎖付加ポリペプチドを含まない生理食塩液を、同様に投与した。また、対照としてオクトレオチドを投与した。

【0301】

実施例８８−３ 腸液重量の測定
化合物投与１時間後に、吸入麻酔下にて腹部を正中切開し、腹部大静脈から血液を１．５ｍＬ採取した。そして、十二指腸提筋側の結紮空腸を摘出した。空腸表面の液体および血液をペーパータオルで除去し、空腸に付いた神経・血管・脂肪を切除した後に、長さ６ｃｍとなるように切り取り、湿重量を測定した。その後、３６度で２４時間乾燥させ、乾重量を測定した。腸液重量（ｍｇ）は、湿重量‐乾重量で算出した。得られた空腸の腸液重量を表９に示す。

【表24】

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【0302】

表９から明らかなように、ｖｅｈｉｃｌｅは、偽処置と比較して腸液重量が有意に増加し、結紮による消化管閉塞に伴い腸液の分泌亢進が生じていることが認められた。ソマトスタチンやオクトレオチドは、このような消化管閉塞モデルにおいて、腸液の腸管内への分泌抑制と腸組織側への腸液吸収促進作用を有することが示されており（Scand J Gastroenterol. 1995 May;30(5):464-9.）、本実験系においてもオクトレオチドはその作用が確認された。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８ではいずれもｖｅｈｉｃｌｅと比較して、腸液重量の増加が認められ、本発明における糖鎖付加体においても、腸液の分泌抑制、水・電解質の吸収促進といった有効性を示すことが明らかとなった。また、Ｓ１−２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８はＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８と比較して、実施例８３および８４において皮下投与時のＡＵＣが２分の１となっていたが、実施例６７−１においてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８よりもＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５に対する親和性が１．７〜２．９倍ほど高いことが明らかとなっている。このことは、血漿中濃度が低い場合であっても受容体親和性の向上により本モデルにおける薬効が類似していることの理由と考えられる。また同様に、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４はＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８の皮下投与時のＡＵＣを比較すると少し低いが、受容体親和性が０．７〜２．４倍ほど高いため、薬効が類似していることの理由と考えられる。

【0303】

実施例８８−４ 血液パラメータの測定
実施例８８−３で採取した血液を用いて、アミラーゼ濃度（ＩＵ／Ｌ）、ＬＤＨ濃度（ＩＵ／Ｌ）およびＣＰＫ濃度（ＩＵ／Ｌ）を自動分析装置７１７０（日立製作所）を用いて測定した。測定方法はそれぞれ、ＢＧ５Ｂ法、ＵＶ−ｒａｔｅ法およびＪＳＣＣ法を用いた。得られた結果を表１０に示す。

【表25】

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【0304】

表１０から明らかなように、ｖｅｈｉｃｌｅは偽処置と比較してアミラーゼ活性、ＬＤＨ活性が増加しており、消化管閉塞に伴い消化器系の組織障害が生じていることが推察された。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８およびＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較し、アミラーゼ活性は低値であった。一方、オクトレオチドでは、アミラーゼ活性はｖｅｈｉｃｌｅと同等であった。実施例６７−１及び６７−２から明らかなように、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４、およびＳ１−２Ｃ（ｓｉａｌｏ）−ＳＲＩＦ２８はＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５までの全ての受容体に結合親和性を有するのに対し、オクトレオチドはＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ５に対し特異的に親和性を有する化合物である。ラット膵臓においては、ＳＳＴＲ１〜ＳＳＴＲ５のすべての受容体が発現しているとの報告があることから（J Histochem Cytochem. 2004 Mar;52(3):391-400.）、糖鎖付加体はオクトレオチドとは異なった受容体に作用することによって、組織障害を軽減した可能性が考えられた。また、オクトレオチド、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）−Ｒ−Ｋ−ＳＲＩＦ１４では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較し、ＬＤＨ活性は低値であった。そのほか、各パラメータに対し、糖鎖付加体の投与によって悪化するものはなかった。

【図1A】

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【図1B】

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【図1C】

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【図1D】

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【図1E】

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【図2】

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【図3】

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【図4】

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【図5】

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【図6】

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【図7】

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【図8】

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【図9】

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【図10】

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【図11】

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【図12】

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【図13】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]