特許 6178241 血管新生障害の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6178241

(24)【登録日】2017年7月21日

(45)【発行日】2017年8月9日

(54)【発明の名称】血管新生障害の処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20170731BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20170731BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20170731BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   A61P35/04

   C07K16/18

【請求項の数】22

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2013-553604(P2013-553604)

(86)(22)【出願日】2012年2月10日

(65)【公表番号】特表2014-507435(P2014-507435A)

(43)【公表日】2014年3月27日

(86)【国際出願番号】US2012024697

(87)【国際公開番号】WO2012109567

(87)【国際公開日】20120816

【審査請求日】2015年2月10日

(31)【優先権主張番号】61/441,738

(32)【優先日】2011年2月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596171834

【氏名又は名称】ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100156845

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 威一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100112896

【弁理士】

【氏名又は名称】松井 宏記

(74)【代理人】

【識別番号】100124039

【弁理士】

【氏名又は名称】立花 顕治

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100179213

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 未知子

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(72)【発明者】

【氏名】タヴァズィ ソハイル

(72)【発明者】

【氏名】ホルバーグ ニルス

(72)【発明者】

【氏名】ピーエヌジー キム

【審査官】 井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第００／０６９４５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５３２７９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，２００１年，Vol.276,No.4，p.2880-2889

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／０４

Ｃ０７Ｋ １６／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌の治療が必要とされる被験体における癌の治療に使用される薬剤であり、ＩＧＦＢＰ２に結合し、ＩＧＦＢＰ２のＩＧＦ１への結合を阻害する薬剤であり、前記薬剤がモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、
前記癌が転移癌であり、
前記薬剤が、転移癌細胞による内皮細胞動員を阻害する、
薬剤。

【請求項2】

前記癌が乳癌である、請求項１に記載の薬剤。

【請求項3】

前記モノクローナル抗体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分である、請求項１又は２に記載の薬剤。

【請求項4】

前記モノクローナル抗体が１０^-7Ｍ以下のＫ_DでＩＧＦＢＰ２に結合する、請求項３に記載の薬剤。

【請求項5】

前記モノクローナル抗体がＩＧＦＢＰ３又はＩＧＦＢＰ４に結合しない、請求項３に記載の薬剤。

【請求項6】

前記被験体がヒトである、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。

【請求項7】

前記モノクローナル抗体が転移性ヒト癌細胞による内皮細胞動員を阻害する、請求項６に記載の薬剤。

【請求項8】

前記モノクローナル抗体が転移性ヒト乳癌細胞による内皮細胞動員を阻害する、請求項７に記載の薬剤。

【請求項9】

前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項６〜８のいずれかに記載の薬剤。

【請求項10】

前記モノクローナル抗体が第一の抗体のヒト化バージョンであり、当該第一の抗体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記モノクローナル抗体がＣＤＲグラフティングによって作成されている、請求項１又は２に記載の薬剤。

【請求項11】

癌の治療が必要とされる被験体における癌の治療に使用される医薬の製造のための、ＩＧＦＢＰ２に結合し、ＩＧＦＢＰ２のＩＧＦ１への結合を阻害する薬剤であり、前記薬剤がモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、前記癌が転移癌であり、前記薬剤が転移癌細胞による内皮細胞動員を阻害する、薬剤の使用。

【請求項12】

前記癌が乳癌である、請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

前記モノクローナル抗体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分である、請求項１１又は１２に記載の使用。

【請求項14】

前記モノクローナル抗体が１０^-7Ｍ以下のＫ_DでＩＧＦＢＰ２に結合する、請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

前記モノクローナル抗体がＩＧＦＢＰ３又はＩＧＦＢＰ４に結合しない、請求項１３に記載の使用。

【請求項16】

前記被験体がヒトである、請求項１３〜１６のいずれかに記載の使用。

【請求項17】

前記モノクローナル抗体が転移性ヒト癌細胞による内皮細胞動員を阻害する、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

前記モノクローナル抗体が転移性ヒト乳癌細胞による内皮細胞動員を阻害する、請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１６〜１８のいずれかに記載の使用。

【請求項20】

前記モノクローナル抗体が第一の抗体のヒト化バージョンであり、当該第一の抗体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記モノクローナル抗体がＣＤＲグラフティングによって作成されている、請求項１１又は１２に記載の使用。

【請求項21】

配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＩＧＦＢＰ２に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。

【請求項22】

ＩＧＦＢＰ２に結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であり、
前記モノクローナル抗体が第一の抗体のヒト化バージョンであり、当該第一の抗体が配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記モノクローナル抗体がＣＤＲグラフティングによって作成されている、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年２月１１日出願の米国特許仮出願第６１／４４１，７３８号の優先権を主張するものである。前記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
政府条項
本発明は、国防総省から助成された助成Ｗ８１ＸＷＨ−１０−１−０５３５の下で、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

【0002】

本発明は、血管新生障害の処置に関する。

【背景技術】

【0003】

血管新生は、新たな血管の成長および既存血管の再構築の過程である。これは、正常な成長および発達に不可欠であることはもちろん、他の生理過程、例えば創傷治癒、にも不可欠である。その一方で、血管新生は、様々な病理過程においても重要である。例えば、病的血管新生は、休眠状態から、退形成性、侵襲性および転移性を特徴とする悪性のものへの、腫瘍の移行における基本段階である。

【0004】

癌の転移進行は、厄介な臨床的課題である。技術の進歩により一部の早期新生物の検出および処置が可能になったが、上皮性悪性病変からの全死亡率は、過去４０年にわたって本質的に変わっていない（ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｓｒ／１９７５＿２００７／、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、２００７）。これは、癌タイプ内の分子の不均一性、歴史的に経験的に導き出されたわずかな効力の化学療法レジメン、および転移進行ではなく原発腫瘍成長の分子ドライバーへの長年の着眼をはじめとする、幾つかの要因に起因すると一般に考えられている。

【0005】

転移の有効な予防および処置には、この複雑な過程の基礎を成す、血管新生をはじめとする、分子および細胞事象の理解を要する（Ｔａｌｍａｄｇｅ，Ｊ．Ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０（１４）、５６４９（２０１０）；Ｓｌｅｅｍａｎ，Ｊ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４６（７）、１１７７（２０１０）；およびＨｕｒｓｔ，Ｄ． Ｒ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（１９）、７４９５（２００９））。ＶＥＧＦが原発腫瘍における腫瘍形成の促進因子として発見された（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２（６４２３）、８４１（１９９３））。臨床試験により、ＶＥＧＦ阻害は、化学療法と併用で、ステージＩＶ結腸直腸または肺癌を有する患者の生存を２〜３ヶ月延長できることが明らかになった（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｈ．ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０（２３）、２３３５（２００４）；Ｇｉａｎｔｏｎｉｏ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２５（１２）、１５３９（２００７）；およびＳａｎｄｌｅｒ，Ａ．ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５５（２４）、２５４２（２００６））。しかし、ＶＥＧＦ阻害は、アジュバント設定で（Ｂａｒｕｇｅｌ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ９（１２）、１８２９（２００９））および最近の前臨床転移モデルにおいて（Ｐａｅｚ−Ｒｉｂｅｓ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５（３）、２２０（２００９）およびＥｂｏｓ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １５（３）、２３２（２００９））転移予防に有益であると証明されなかった。転移性血管新生を促進する他の未知の因子による補償が、これらの転帰の根底にあるという説が出された一方で、多数の研究者が血管新生以外の経路による転移への取り組みを模索してきた。例えば、国際公開第２００９／０８２７４４号パンフレットには、乳癌の骨および肺への転移の際に過発現される遺伝子であって、血管新生に関係のない遺伝子が記載されている。他のものは、転移性血管新生を媒介する因子を同定するために努力をはらった。しかし、成功は限られていた。

【0006】

それ故、血管新生を調節するための、および癌をはじめとする病的血管新生を特徴とする障害を処置するための、薬剤および方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、少なくとも一部は、内皮動員を調節する、そしてその結果として血管新生を調節する、新規経路の予想外の発見に基づく。

【0008】

したがって、本発明の１つの態様は、内皮動員はもちろん血管新生の阻害を、それを必要とする被験体において行うための方法を特徴とする。この方法は、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫおよびＰＩＴＰＮＣ１から成る群より選択された第一のタンパク質の発現または活性を阻害する第一の薬剤を前記被験体に投与する段階を含む。１つの実施形態において、前記被験体は、血管新生障害、すなわち、病的血管新生を特徴とする障害、例えば癌、眼障害または炎症性障害、を有する。前記癌の例としては、転移癌が挙げられる。上述の方法は、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２およびＶＩＰＲから成る群より選択された第二のタンパク質の発現または活性を阻害する第二の薬剤を前記被験体に投与する段階をさらに含むことがある。上述の第一の薬剤または第二薬剤は、抗体（またはその抗原結合部分）、核酸、ポリペプチド、または小分子化合物であり得る。一例として、上記抗体は、下に示す配列番号９のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含有するモノクローナルである。

【0009】

第二の態様において、本発明は、転移癌の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法を特徴とする。この方法は、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫおよびＰＩＴＰＮＣ１から成る群より選択された第一のタンパク質の発現または活性を阻害する第一の薬剤であって、血管新生を阻害する第一の薬剤を前記被験体に投与する段階を含む。前記癌の例としては、乳癌が挙げられる。前記方法は、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２およびＶＩＰＲから成る群より選択された第二のタンパク質の発現または活性を阻害する第二の薬剤を前記被験体に投与する段階をさらに含むことがある。前記第一の薬剤または第二薬剤は、抗体（またはその抗原結合部分）、核酸、ポリペプチド、または小分子化合物であり得る。一例として、上記抗体は、下に示す配列番号９のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含有するモノクローナルである。

【0010】

第三の態様において、本発明は、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫおよびＰＩＴＰＮＣ１から成る群より選択されたタンパク質の発現を阻害できるＲＮＡｉ剤をコードしている配列を有する単離された核酸を特徴とする。１つの実施形態において、前記ＲＮＡｉ剤は、第一の鎖と第二の鎖を有する二本鎖構造を有し、該第一および第二の鎖の各々が、１９ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの間の長さであり；ならびに該第一の鎖は、下の表５に収載するとおりの配列番号１〜６のいずれか１つによってコードされている。

【0011】

第四の態様において、本発明は、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫおよびＰＩＴＰＮＣ１から成る群より選択されたタンパク質の発現または活性を阻害する薬剤であって、抗体（またはその抗原結合部分）、核酸、ポリペプチド、または小分子化合物であり得る薬剤を有する組成物を提供する。一例として、前記薬剤は、上述の単離された核酸である。別の例として、前記薬剤は、抗体、またはその抗原結合部分である。

【0012】

第五の態様において、本発明は、被験体における癌の転移能を診断するための方法を特徴とする。この方法は、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫおよびＰＩＴＰＮＣ１から成る群より選択された前記被験体の第一の遺伝子についての第一の発現レベルを得る段階、および該第一の発現レベルとその選択された第一の遺伝子についての第一の所定レベルとを比較する段階を含む。前記第一の発現レベルが前記第一の所定レベルより大きい場合、その被験体は、転移癌を有する、または転移癌を発現しやすいと判定される。前記第一の所定レベルは、癌のない対照被験体から得ることができる。一例として、前記方法は、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２およびＶＩＰＲから成る群より選択された前記被験体の第二の遺伝子についての第二の発現レベルを得る段階、および該第二の発現レベルと、その選択された第二の遺伝子についての第二の所定レベルとを比較する段階をさらに含む。前記第一の発現レベルおよび前記第二の発現レベルが、前記第一の所定レベルおよび前記第二の所定レベルよりそれぞれ大きい場合、その被験体は、転移癌を有する、または転移癌を発現しやすいと判定される。前記第二の所定レベルも、癌のない対照被験体から得ることができる。

【0013】

本発明は、内皮動員の阻害を、それを必要とする被験体において行うための方法も特徴とする。この方法は、ＧＡＳ６の発現または活性を増加させる第一の薬剤（すなわち、ＧＡＳ６の活性化剤）を前記被験体に投与する段階を含む。本発明は、ＧＡＳ６の発現または活性を増加させる薬剤を有する組成物をさらに特徴とする。一例として、上述の薬剤は、ＧＡＳ６活性を有する。別の例として、前記薬剤は、抗体（またはその抗原結合部分）、核酸、ポリペプチド、または小分子化合物である。１つの実施形態において、前記薬剤は、ＧＡＳ６の配列を有するポリペプチドである。

【0014】

さらにもう１つの態様において、本発明は、被験体における癌の転移能を診断するためのキットを特徴とする。このキットは、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫおよびＰＩＴＰＮＣ１から成る群より選択された第一の遺伝子の第一の発現産物（例えば、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ）に特異的に結合する第一の試薬を含む。前記キットは、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２およびＶＩＰＲから成る群より選択された第二の遺伝子の第二の発現産物に特異的に結合する第二の試薬をさらに含むことがある。

【0015】

さらなる態様において、本発明は、任意の体組織の転移癌コロニー形成を調節する遺伝子およびノンコーディングＲＮＡを同定する方法を特徴とする。この方法は、ａ）身体の任意の生組織への標識または非標識癌細胞の集団の移植、次いでｂ）転移コロニー形成が発生した後、前記組織からの前記標識癌細胞の単離の実施、そしてその後、ｃ）単離された標識癌細胞の前記身体の生組織への反復移植の実施という一連のラウンドを実施することにより、転移組織コロニー形成能が増加された哺乳動物癌細胞の集団を産生させる第一の段階を含む。上記の標識癌細胞の移植、単離そして反復移植の一連のラウンドを実施することにより、高い転移組織コロニー形成能を有する標識または非標識癌細胞の集団を産生させる。前記方法の第二段階は、前記高い転移組織コロニー形成能を有する癌細胞の集団に、１つ以上のｓｈＲＮＡ分子の集団を形質導入、トランスフェクトまたは別様に導入して、１つ以上の遺伝子またはノンコーディングＲＮＡの発現を低減させる１つ以上のｓｈＲＮＡ分子を発現する高い転移能を有する改変癌細胞の集団を産生させることを含む。次いで、１つ以上のｓｈＲＮＡ分子を発現する高い転移能を有する改変癌細胞のこの集団を、ａ）任意の生組織に移植し、そしてその後、ｂ）転移コロニー形成が発生した後、その生組織から単離する。次いで、その移植後に単離された改変癌細胞の集団における１つ以上のトランスフェクトされた、形質導入された、または別様に導入されたｓｈＲＮＡの存在、不在または存在量を、マイクロアレイ分析、ＤＮＡシークエンシング技術、ディープシークエンシング技術、またはクローニングのいずれかによって評定する。その単離された細胞の集団における任意の単一ｓｈＲＮＡのレベルの注射前のその提示に対する低減は、そのｓｈＲＮＡのターゲット遺伝子がその組織の転移コロニー形成に必要であることを示す。その単離された細胞の集団における任意の単一ｓｈＲＮＡのレベルの注射前のその提示に対する増加は、そのｓｈＲＮＡのターゲットがその組織の転移コロニー形成に拮抗することを示す。この方法の第二段階は、１つ以上のＲＮＡｉ分子、マイクロＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡの集団を形質導入、トランスフェクトまたは別様に導入することも含み得る。加えて、前記第二段階は、タンパク質コーディング遺伝子をコードしている１つ以上の配列の集団を形質導入、トランスフェクトまたは別様に導入することも含み得る。次いで、１つ以上のタンパク質コーディング遺伝子を発現する高い転移能を有する改変癌細胞の集団を、ａ）任意の生組織に移植し、そしてその後、ｂ）転移コロニー形成が発生した後、その生組織から単離する。次いで、その移植後に単離された改変癌細胞の集団における１つ以上のトランスフェクトされた、形質導入された、または別様に導入されたコーディング遺伝子の存在、不在または存在量を、マイクロアレイ分析、ＤＮＡシークエンシング技術、ディープシークエンシング技術、またはクローニングのいずれかによって評定する。その単離された細胞の集団における任意の単一遺伝子のレベルの注射前のその提示に対する増加は、その遺伝子がその組織の転移コロニー形成に必要とされるターゲット遺伝子に相当することを示す。その単離された細胞の集団における任意の単一遺伝子のレベルの注射前のその提示に対する減少は、その遺伝子がその組織の転移コロニー形成に拮抗するターゲット遺伝子に相当することを示す。

【0016】

さらなる態様において、本発明は、ＩＧＦ１へのＩＧＦＢＰ２結合を阻害することによりＩＧＦＢＰ２機能を中和するモノクローナル抗体（例えば、ヒト化もしくはヒトモノクローナル抗体）またはその抗原結合部分を特徴とする。この抗体は、転移性乳癌細胞などの癌細胞による内皮動員を阻害できる、または病的血管新生を阻害できる。この抗体はまた、ヒト乳癌などの癌細胞の腫瘍進行または腫瘍転移をインビボで阻害できる。一例として、前記モノクローナル抗体は、下に示す配列番号９のアミノ酸を含む重鎖可変領域と配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含有する。

【0017】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を下の説明で明らかにする。本発明の他の特徴、目的および利点は、この説明からおよび請求項から明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１ａ〜ｆは、内因性ｍｉＲ−１２６が転移コロニー形成を抑制することを示す図面および写真である。ａ、ｍｉＲ−１２６阻害に基づく低転移性乳癌細胞による肺転移の生物発光イメージング。ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピン（ｍｉＲ−Ｚｉｐ）または対照ヘアピンを発現する４×１０⁴ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。示されている代表マウスは、第４９日におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｍｉＲ−１２６ＫＤセット（上部）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／スクランブルセット（下部）に対応する。肺コロニー形成を生物発光イメージングによって定量した。ｎ＝５；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；第４９日における片側スチューデントｔ検定に基づくｐ値。肺を第４９日に抽出し、ヒトビメンチンについて免疫組織化学染色した（右）。ｂ、ｍｉＲ−１２６発現が阻害された低転移性乳癌細胞による全身転移の生物発光イメージング。ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する４×１０⁴ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を無胸腺ヌードマウスに心臓内経路により注射した。示されている代表マウスは、第３４日におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｍｉＲ−１２６ＫＤセット（上部）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／スクランブルセット（下部）に対応する。全身コロニー形成を生物発光により測定し、定量した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；第３４日における片側スチューデントｔ検定に基づくｐ値。ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｍｉＲ−１２６ＫＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／スクランブル細胞（上部）を心臓内注射したマウスにおいて転移巣の総数を計数した。骨および脳の転移結節の代表画像を示す（下部）。ｄ、ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する５×１０⁵ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を免疫不全マウスの乳房脂肪体に注射した。腫瘍体積を継時的に測定した。ｎ＝１５；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す；第３５日における片側スチューデントｔ検定に基づくｐ値。ｅ、（ａ）からの抽出肺をヒト−ビメンチンについて染色し、ＩｍａｇｅＪを用いる画像分析により各転移結節のサイズを測定した。ｆ、ドキシサイクリン誘導性ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２６カセットを発現する４×１０⁴Ｌｍ２細胞を第０日に尾静脈経由でＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに注射した。第３日に１つのマウス群の飲み水にドキシサイクリン（２ｍｇ／ｍＬ）およびスクロース（５％）を加え、その他には５％スクロースのみを加えた。第４８日に肺を除去し、ヒトビメンチンについて免疫組織化学染色した（右）。各肺における結節の総数を左に示す。

【図2】図２ａ〜２Ｊは、内因性ｍｉＲ−１２６非細胞が、転移性乳癌細胞による転移性血管新生を自律的に抑制することを示す図面および写真である。ａ、図１ａからの肺切片をヒトビメンチンおよびＭＥＣＡ−３２について、またはｂ、ビメンチンおよび静脈内注射したレクチンについて、組織学的に二重染色した。黒色で強調した転移結節の内側のビメンチン染色およびレクチン／ＭＥＣＡ−３２染色に基づいて各結節の境界を定めた（下方パネル）。次いで、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用することにより各結節内のレクチン／ＭＥＣＡ−３２染色について陽性の面積を決定し、所与の結節の面積あたりのレクチン／ＭＥＣＡ−３２染色剤によって覆われた面積（血管密度％）として表した。注射したＭＤＡ−ＭＢ−２３１対照とｍｉＲ−１２６ＫＤ細胞間の血管密度％の分布を累積分率プロットで示す。ｎ＝８／群（結果として、対照では合計１８の転移結節およびｍｉＲ−１２６ＫＤ細胞では合計６８の転移結節となる）、コルモゴロフ・スミルノフ検定に基づくｐ値。ｃ、ｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを発現する５×１０⁴ＬＭ２細胞をＨＵＶＥＣ単層上に播種し、接着を定量した。ＨＵＶＥＣ単層に接着した細胞の画像を得、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。ｄ、ｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを発現する５×１０⁵ＬＭ２細胞を、該細胞とＥＧＭ−２培地を２４時間インキュベートすることによって得た。２．５×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞を三重反復で播種し、調整培地で成長させ、播種の５日後に生細胞を計数した。ｎ＝３；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。ｅ、２×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞を、ｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを形質導入した１×１０⁴ＬＭ２細胞と混合し、ＨＵＶＥＣ細胞による管腔形成をアッセイした。各ウェルの画像を得、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用して各画像中の分岐点の数を定量した。ｎ＝３；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。スケールバーは、２５０μｍを表す。ｆ、２．５×１０⁴ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＬＭ２細胞を四重反復で播種した。次いで、ＩｍａｇｅＪを使用して得た画像中のトランスウェルインサートの基底側に移動した細胞の数を計数することにより、５×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞の癌細胞へのトランスウェル移動を評定した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて得た。ｇ、ｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを発現するＬＭ２細胞、ならびにｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＨＵＶＥＣ動員アッセイに付した。インサートの基底側の画像を得、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞を計数した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて得た。示されている代表画像は、ＬＭ２／ｍｉＲ−１２６ＯＥまたは対照セット（上部）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｍｉＲ−１２６ＫＤまたは対照セット（下部）に対応する。スケールバーは、１００μｍを表す。ｈ、ＣＮ３４親細胞およびＣＮ３４ ＬＭ１ａ細胞をＨＵＶＥＣ動員アッセイに付した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。ｉ、ｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを発現するＣＮ３４ ＬＭ１ａ細胞、ならびにｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現するＣＮ３４親細胞をＨＵＶＥＣ動員アッセイに付した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。代表画像を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。ｊ、ｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを過発現する５×１０⁵Ｌｍ２細胞、ならびにｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する５×１０⁵ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をマトリゲルと１：１で混合し、乳房脂肪体に注射した。同サイズの腫瘍を、ＭＥＣＡ−３２の免疫組織化学染色により血管密度について分析した。各腫瘍について５つの別個の視野を使った。閾値処理したＭＥＣＡ−３２染色によってカバーされる各視野の百分率を血管密度％として与える。定量を上部に示し、代表画像を下に示す。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。

【図3】図３ａ〜３ｆは、転移内皮動員を媒介するｍｉＲ−１２６調節ネットワークの系統的同定を示す図面および写真である。ａ、ｍｉＲ−１２６転移シグネチャは、ｍｉＲ−１２６ ＯＥによってダウンレギュレートされ、ｍｉＲ−１２６ ＫＤによって誘導された、転移細胞において過発現された遺伝子から成る。このヒートマップは、マイクロアレイおよびｑＰＣＲ分析に基づく分散正規化発現レベルを表す。カラーマップは、平均からの標準偏差の変化に対応する。ｂ〜ｄ、原発癌がｍｉＲ−１２６の８つの遺伝子シグネチャを過発現した患者（陽性）およびしなかった患者（陰性）の無転移生存を描写する（ｂ）ＵＣＳＦ乳癌コホート（１１７腫瘍）、（ｃ）ＮＫＩコホート（２９５腫瘍）および（ｄ）ＮＫＩ／ＭＳＫ／ＵＣＳＦ総合コホート（４９４腫瘍）についてのカプラン・マイヤー曲線。マンテル・コックスのログランク検定に基づくＰ値。ｅ、ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ＫＤヘアピンを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるｍｉＲ−１２６転移遺伝子のルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ。各ｍｉＲ−１２６調節遺伝子の３’ＵＴＲまたはコーディング配列（ＣＤＳ）の上流にルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物を様々な細胞系にトランスフェクトし、トランスフェクションの３０時間後にルシフェラーゼ活性をアッセイした。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて得た。ｆ、前記３’ＵＴＲ／ＣＤＳ構築物のｍｉＲ−１２６相補領域を突然変異させ、ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるこれらの構築物を用いてルシフェラーゼ・レポーター・アッセイを反復した（右）。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて得た。

【図4】図４ａ〜４ｅは、ＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫが転移コロニー形成および血管新生を促進したことを示す１セットの図面および写真である。ａ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＳＨＭＴ２をターゲットにするヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する２．５×１０⁴ＬＭ２細胞を四重反復で播種した。次いで、癌細胞への５×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞のトランスウェル移動を評定した。トランスウェルインサートを通って移動した細胞の画像を得、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。代表画像を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。ｂ、ステージＩＩＩ（ｎ＝２９）またはステージＩＶ（ｎ＝９）患者と比較したステージＩ／ＩＩ（ｎ＝５３）からのヒト乳腺腫瘍試料におけるＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫまたはＰＩＴＰＮＣ１の相対発現レベルを、ｑＰＣＲを使用してＯｒｉＧｅｎｅ ＴｉｓｓｕｅＳｃａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒアレイから定量した。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。ｃ〜ｅ、様々なｍｉＲ−１２６調節遺伝子の発現が阻害された肺転移性乳癌細胞による肺転移の生物発光イメージング。対照ヘアピンまたはＩＧＦＢＰ２（ｃ）、ＰＩＴＰＮＣ１（ｄ）およびＭＥＲＴＫ（ｅ）をターゲットにする独立した短鎖ヘアピンを発現する４×１０⁴ＬＭ２細胞を免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。肺コロニー形成を生物発光イメージングによって測定し、定量した。ｎ＝５；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；片側スチューデントｔ検定に基づくｐ値。

【図5】図５ａ〜５ｇは、ＩＧＦＢＰ２が、内皮細胞におけるＩＧＦ１／ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達を活性化することにより内皮動員を媒介することを示す図面および写真である。ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＬＭ２細胞を使用するＨＵＶＥＣ動員アッセイ（図２ｆ）からの調整培地中のＩＧＦＢＰ２レベルをＥＬＩＳＡによって定量した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。ｂ、ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する２．５×１０⁴ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ならびにｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを発現するＬＭ２細胞を、四重反復で播種した。次いで、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦＢＰ２ Ａｂまたは５０ｎｇ／ｍＬ対照ＩｇＧ Ａｂの存在下での５×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞の癌細胞へのトランスウェル動員を評定した。トランスウェルインサートの基底側の画像を得、ＩｍａｇｅＪを使用して移動した細胞の数を定量した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。スケールバーは、１００μｍを表す。ｃ、ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する２．５×１０⁴ＣＮ３４ Ｐａｒ細胞、ならびにｍｉＲ−１２６または対照ヘアピンを発現するＣＮ３４ Ｌｍ１ａ細胞を、四重反復で播種した。次いで、５０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦＢＰ２ Ａｂまたは５０ｎｇ／ｍＬ対照ＩｇＧ Ａｂの存在下での５×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞の癌細胞へのトランスウェル移動を評定した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。ｄ、ｅ、ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への、２０μｇ／ｍＬ ＩＧＦ−１遮断Ａｂ（ｄ）、４０μｇ／ｍＬ ＩＧＦ−２遮断Ａｂ（ｄ）、２０μｇ／ｍＬ ＩＧＦ１Ｒ遮断Ａｂ（ｅ）、５μｇ／ｍＬ ＩＧＦ２Ｒ遮断Ａｂ（ｅ）または対照ＩｇＧ（ｄ、ｅ）と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞のトランスウェル動員をアッセイした。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。ｆ、ＨＵＶＥＣ細胞および癌細胞を１時間、２０μｇ／ｍＬ ＩＧＦ１Ｒ遮断Ａｂまたは対照ＩｇＧＡｂで前処理した後、ＨＵＶＥＣ細胞の癌細胞へのトランスウェル動員を評定した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。ｇ、ウェルの底部で所与の量の組換えＩＧＦＢＰ２タンパク質とマトリゲル（１：１）を混合することにより、ＩＧＦＢＰ２勾配をシミュレートした。次いで、２０時間後にＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してトランスウェルインサートの基底側に移動した細胞の数を計数することにより、ＩＧＦＢＰ２勾配に沿った１．５×１０⁵ＨＵＶＥＣ細胞の走化性を評定した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。

【図6】図６ａ〜６ｅは、ＭＥＲＴＫがＧＡＳ６による動員を媒介することを示す図面および写真である。ａ、ＥＬＩＳＡによって判定した、ＰＩＴＰＮＣ１に対する、対照ヘアピンまたは２つの独立したヘアピンを発現するＬｍ２細胞からの調整培地中のＩＧＦＢＰ２レベル。ｂ、対照ヘアピンまたはｍｉＲ−１２６をターゲットにするヘアピンを発現する２．５×１０⁴ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を四重反復で播種した。次いで、１ｎｇ／ｍＬ ＧＡＳ６および／または１０μｇ／ｍＬ ＭｅｒＦｃの存在下での５×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞の癌細胞へのトランスウェル移動を、ＩｍａｇｅＪを使用して得た画像中の多孔質インサートの基底側に移動した細胞の数を計数することによって評定した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて得た。ｃ、ウェルの底部でｒｈＩＧＦＢＰ２（５２０ｎｇ）、Ｇａｓ６（５ｎｇ）およびＭｅｒＦｃ（１０ｕｇ）タンパク質をマトリゲルと（１：１）混合することにより、Ｇａｓ６および分泌ＭＥＲＴＫの存在下でのＩＧＦＢＰ２勾配をシミュレートした。次いで、２０時間後にＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してトランスウェルインサートの基底側に移動した細胞の数を計数することにより、前記勾配に沿った１．５×１０⁵ＨＵＶＥＣ細胞の走化性を評定した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。ｄ、肺切片をビメンチンおよびＭＥＣＡ−３２について二重染色した。黒色で強調した転移結節の内側のヒト−ビメンチン染色およびＭＥＣＡ−３２染色に基づいて各結節の境界を描いた（下方パネル）。次いで、ＩｍａｇｅＪを使用することにより各結節内のＭＥＣＡ−３２染色について陽性の面積を決定し、所与の結節の面積あたりのＭＥＣＡ−３２染色剤によって覆われた面積（血管密度％）として表した。ＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１、ＭＥＲＴＫをターゲットにするヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する注射ＬＭ細胞間の血管密度％の分布を累積分率プロットで示す。ｎ＝４；コルモゴロフ・スミルノフ検定に基づくｐ値。ｅ、ＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫとの相互作用による内皮動員および転移コロニー形成のｍｉＲ−１２６調節の概略図。

【図7】図７は、ｍｉＲ−Ｚｉｐ ｍｉＲＮＡ−アンチセンスｓｈＲＮＡ系がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるｍｉＲ−１２６発現を安定的に阻害したことを示す図である。ｍｉＲ−１２６をターゲットにするｍｉＲ−Ｚｉｐ構築物、またはいずれの公知マイクロＲＮＡもターゲットにしない前記構築物のスクランブルバージョン（ＳＹＳＴＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カリフォルニア州マウンテンビュー）のいずれかを発現するレンチウイルスをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に形質導入した。次いで、ｑＰＣＲを使用して成熟ｍｉＲ−１２６の発現レベルを試験した。

【図8】図８は、乳癌細胞発現ｍｉＲ−１２６が転移結節における灌流を調節することを示す１セットの写真および図面である。ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンまたは対照ヘアピンを発現する４×１０⁴ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。第５９日にＦＩＴＣ標識低分子量デキストラン（１０．０００ＭＷ）溶液を静脈内注射した。それらのデキストラン分子を１５分間、循環させた後、マウスを安楽死させ、肺を切除した。凍結切片を調製し、ヒトビメンチンについて染色して転移結節を局在定位し、ＩｍａｇｅＪを使用して一定閾値で結節内のＦＩＴＣシグナルを定量した。ｎ＝５；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。

【図9】図９ａ〜９ｂは、内因性ｍｉＲ−１２６が内皮の接着、増殖または管腔形成を抑制しなかったことを示す１セットの図面である。ａ、ｍｉＲ−１２６ ＫＤまたは対照ＫＤベクターを発現する５×１０⁴ＭＤＡ細胞をＨＵＶＥＣ単層上に播種し、接着を定量した。ＨＵＶＥＣ単層に接着した細胞の画像を得、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。ｂ、５×１０⁵ＭＤＡ ｍｉＲ−１２６ ＫＤまたはＭＤＡ対照ＫＤ細胞からの調整培地を、該細胞とＥＧＭ−２培地を２４時間インキュベートすることによって得た。２．５×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞を三重反復で播種し、調整培地で成長させ、播種の５日後に生細胞を計数した。ｎ＝３；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。ｃ、２×１０⁴ＨＵＶＥＣ細胞を１×１０⁴ＭＤＡ ｍｉＲ−１２６ ＫＤまたはＭＤＡ対照ＫＤ細胞と混合し、ＨＵＶＥＣ細胞による管腔形成をアッセイした。各ウェルの画像を得、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用して各画像中の分岐点の数を分析した。ｎ＝３；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。

【図10】図１０ａ〜１０ｃは、１セットの図面、ならびに内因性ｍｉＲ−１２６が血管新生を調節するが、ＣＤ４５陽性リンパ球およびＭａｃ−２陽性マクロファージ動員を調節しないことを示す図面である。ａ〜ｃ、対照ヘアピンまたはｍｉＲ−１２６をターゲットにするヘアピンを発現する５×１０⁵ＭＤＡ細胞をマトリゲルと１：１比で混合し、乳房脂肪体に注射した。屠殺する５分前にビオチン化レクチンを尾静脈に注射した。同サイズの腫瘍を切り取り、機能性血管を、注射したレクチンの染色によって検出し（ａ）、抗ＣＤ４５によってＣＤ４５⁺リンパ球を検出し（ｂ）、および抗Ｍａｃ−２によってＭａｃ−２⁺マクロファージを検出した。

【図11】図１１は、推定ｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子を同定する結果となった統合実験経路を示すベン図である。ｍｉＲ−１２６過発現で１．６倍より大きくダウンレギュレートされた遺伝子のトランスクリプトームのプロファイリングを、親ＭＤＡ細胞と比較して転移ＬＭ２細胞において１．４倍より大きくアップレギュレートされた遺伝子とオーバラップさせた。これは、２３個の可能性のあるｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子の同定をもたらした。ｑＰＣＲにより、これらの２３個の遺伝子のうちの８個は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系と初代ＣＮ３４細胞系の両方においてｍｉＲ−１２６によって変調された。これら８個の遺伝子を、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイによりｍｉＲ−１２６による直接調節について機能試験した。

【図12】図１２ａ〜１２ｂは、ｍｉＲ−１２６が、３’ＵＴＲ相互作用によりＩＧＦＢＰ２およびＭＥＲＴＫを、ならびにＣＤＳ相互作用によりＰＩＴＰＮＣ１およびＳＨＭＴ２を調節したことを示す図面である。ａ、ｂ、ｍｉＲ−１２６をターゲットにする短鎖ヘアピンおよび対照ＫＤヘアピンを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるｍｉＲ−１２６転移遺伝子セットのルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ。ＡＢＣＢ９、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＰＳＡＴ１、ＰＹＢＧ、ＳＨＭＴ２およびＶＩＰＲ１の３’ＵＴＲ（ａ）およびＣＤＳ（ｂ）の上流にルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物を様々な細胞系にトランスフェクトし、トランスフェクトの３０時間後にルシフェラーゼ活性をアッセイした。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて得た。

【図13】図１３ａ〜１３ｄは、独立したヘアピンが、ＬＭ２細胞におけるＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫの発現レベルをダウンレギュレートしたことを示す１セットの図面である。対照ヘアピンまたはＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１もしくはＭＥＲＴＫをターゲットにする短鎖ヘアピン構築物を発現するレンチウイルスをＬＭ２細胞に形質導入した。それらのターゲット遺伝子の発現レベルをｑＰＣＲによって分析した。

【図14】図１４は、ｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子の増殖分析を示す図面である。対照ヘアピンまたはＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１もしくはＭＥＲＴＫをターゲットにする短鎖ヘアピンを発現する２．５×１０⁴ＬＭ２細胞を三重反復で播種し、播種の５日後に生細胞を計数した。ｎ＝３；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。

【図15】図１５は、ＩＧＦＢＰ２がＨＵＶＥＣ移動を促進したことを示す図面である。ＨＵＶＥＣ細胞を所与の量の組換えヒトＩＧＦＢＰ２タンパク質および抗ＩＧＦ１Ｒ Ａｂ（１０μｇ／ｍＬ）で４０分間刺激し、トリプシン処理し、５×１０⁴細胞を多孔質トランスウェルインサートに播種した。それらの細胞を２４時間放置して移動させた後、膜を横断して移動した細胞の数を定量した。ｎ＝６；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；ｐ値は、スチューデントｔ検定を用いて得た。

【図16】図１６は、ＭＥＲＴＫのエクトドメインが切断され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞によって分泌されたことを示す、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解産物および調整培地中のＭＥＲＴＫのウエスタンブロット分析の写真である。

【図17】図１７は、ＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫが転移性血管新生を促進したことを示す１セットの写真および図面である。肺切片をヒトビメンチンおよび静脈内注射したレクチンについて組織学的に二重染色した。転移結節の内側のビメンチン染色およびレクチン染色に基づいて結節境界を定めた。ＩｍａｇｅＪを使用して、各結節内のレクチン染色について陽性の面積を決定した。血管密度％は、所与の結節の面積あたりのレクチン染色によってカバーされる面積を表す。対照ヘアピンまたはＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１もしくはＭＥＲＴＫをターゲットにする短鎖ヘアピンを発現する注射ＬＭ２細胞間の血管密度％の分布を累積分率プロットで示す。ｎ＝５。コルモゴロフ・スミルノフ検定に基づくｐ値。

【図18】図１８は、ＨＵＶＥＣ細胞における内因性ｍｉＲ−１２６発現が、他のＨＵＶＥＣ細胞の動員を抑制しなかったことを示す図面である。ｍｉＲ−１２６をターゲットにするａｎｔａｇｏｍｉＲまたは対照ａｎｔａｇｏｍｉＲをＨＵＶＥＣ細胞にトランスフェクトした後、ＨＵＶＥＣ動員アッセイに付した。インサートの基底側の画像を得、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞を計数した。ｎ＝４；エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。

【図19】図１９は、ｍｉＲ−１２６レベルが抑制されたＨＵＶＥＣ細胞における可能性のあるｍｉＲ−１２６ターゲットの発現を示す図面である。ｍｉＲ−１２６をターゲットにするａｎｔａｇｏｍｉＲまたは対照ａｎｔａｇｏｍｉＲをＨＵＶＥＣ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞における可能性のあるターゲットの相対発現を、ｑＰＣＲを使用して定量した。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；スチューデントｔ検定を用いて得たｐ値。

【図20】図２０は、ＩＧＦＢＰ２中和抗体の結合特性を特性づけするために用いた抗体捕捉ＥＬＩＳＡアッセイからのデータを示す１セットの図面である。この図は、組換えＩＧＦＢＰ２全ペプチドを接種した動物から産生されたハイブリドーマライブラリーの１つ（ｗｏ６６６３−１）からの上清が、ＩＧＦＢＰ２に高親和性で結合する抗体を含有することを示す。

【図21】図２１は、ＩＧＦＢＰ２中和抗体の結合特性を特性づけするために用いた抗体捕捉ＥＬＩＳＡアッセイからのデータを示す１セットの図面である。この図は、ハイブリドーマｗｏ６６６３−１からの上清が、ＩＧＦＢＰ２に結合して、ＩＧＦＢＰ２へのＩＧＦ１結合を中和する抗体を含有することを示す。ハイブリドーマｗｏ６６６３−１からの抗体がＩＧＦＢＰ２に特異的に結合し、他のＩＧＦＢＰファミリーメンバー（ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４）には結合しないことにも注目されたし。

【図22】図２２は、ハイブリドーマライブラリーｗｏ６６６３−１から単離した単一ハイブリドーマクローンから回収したＩＧＦＢＰ２中和モノクローナル抗体の結合特性を特性づけするために用いた抗体捕捉ＥＬＩＳＡアッセイからのデータを示す１セットの図面である。Ｍ１、Ｍ４、Ｍ６、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５およびＭ１６をはじめとする、前記ＩＧＦＢＰ２中和モノクローナル抗体のうちの幾つかは、ＩＧＦＢＰ２に高親和性で結合してＩＧＦ１へのその結合を中和することができた。

【図23】図２３は、生理濃度のモノクローナル抗体Ｍ１４を含有する組成物が、転移性乳癌細胞による内皮動員を阻害できることを示す図面である。上で説明した実験の場合と同様に、トランスウェル移動アッセイを用いて、転移細胞による内皮動員を定量した。高転移性ＬＭ２ヒト乳癌細胞をボイデンチャンバーの底部に配置し、そこで多孔質トランスウェルインサートを通してＨＵＶＥＣＳを動員するそれらの能力をアッセイした。少量の生理濃度のＭ１４の前記トランスウェルへの添加は、陰性対照（ＩｇＧおよびＭ５抗体）に対して、ＨＵＶＥＣ細胞の動員および移動（視野あたりの移動した細胞）を有意に阻害することができた（移動細胞の５０％低減）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。

【図24】図２４は、生理濃度のモノクローナル抗体Ｍ１４を含有する組成物が、マウスモデルにおいてインビボで乳癌腫瘍進行を阻害できることを示す図面である。ＰＢＳまたはモノクローナルＭ１４のいずれかで処置した動物における２０００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞による乳房腫瘍成長の生物発光イメージング。第１４日に腫瘍進行は、ＰＢＳ処置マウスと比較してＭ１４での処置により有意に阻害された（腫瘍進行の７から１１倍低減）。シグナルを第０日からのシグナルに正規化した。有意性は、両側スチューデントＴ検定に基づく。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本記載発明は、転移などの病的血管新生を特徴とする障害を処置するための試薬および方法を提供する。

【0020】

本明細書に開示するように、転移および転移性血管新生を系統的分析し、着目することが、転移癌の処置の可能性を有する治療的阻害のターゲットとしての、分泌ＩＧＦＢＰ２、トランスフェラーゼＰＩＴＰＮＣ１、キナーゼＭＥＲＴＫおよびｍｉＲ−１２６をはじめとする多数の分子の同定につながった。新たに発見した経路は、ＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫ−発現の点でヒト転移と相関する血管新生促進遺伝子−を協調させる。これらの遺伝子は、転移性内皮動員および血管新生の調節因子に相当する。例えば、ＩＧＦＢＰ２（転移細胞によって分泌されるタンパク質）は、内皮細胞上のＩＧＦＩ型受容体のＩＧＦ１媒介活性化を変調されることにより内皮を動員する。

【0021】

内皮動員は、新たな血管の産生または既存の血管の再構築、すなわち血管新生、のために、被験体体内で、内皮細胞またはそれらの前駆細胞が起動され、一定の部位または領域にホーミングする過程である。上述の新規経路によるこの過程の阻害を用いて、病的血管新生を阻害することができ、およびそれによって、転移などの病的血管新生を特徴とする障害を処置することができる。

【0022】

内皮動員および結果として生ずる血管形成の阻害を、それを必要とする被験体において行うために、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２およびＶＩＰＲから選択されたタンパク質の発現または活性を阻害する薬剤を該被験体に投与することができる。これらのタンパク質のアミノ酸配列を下に列挙する。前記薬剤は、核酸、ポリペプチド、抗体または小分子化合物であり得る。

【0023】

阻害剤（すなわち、阻害因子）または活性化剤（すなわち、活性化因子）は、核酸、ポリペプチド、抗体または小分子化合物であり得る。好ましくは、それは単離された薬剤であるが、被験体の細胞内の内因性分子（マイクロＲＮＡ）ではない。一例として、それは、ヒト細胞内の内因性であるマイクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ２０６、または／およびｍｉＲ−３３５、を除外する。別の例として、前記阻害剤または活性化剤は、転写レベル、ｍＲＮＡ安定性レベル、翻訳レベル、タンパク質安定性／分解レベル、タンパク質修飾レベルおよびタンパク質結合レベルで機能する。

【0024】

核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、これらに限定されないが、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、これに限定されないが、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ類似体を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成することができる。核酸分子は、一本鎖であることもあり、または二本鎖であることもある。「単離された核酸」は、その構造が、任意の天然に存在する核酸のものおよび天然に存在するゲノム核酸の任意の断片のものと同一でない核酸である。したがって、この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部分の配列を有するＤＮＡだが、その分子が天然に存在する生物のゲノムにおいて該分子の該部分に隣接している両方のコーディング配列が隣接していないＤＮＡ；（ｂ）結果として生ずる分子がいずれの天然に存在するベクターおよびゲノムＤＮＡとも同一でないような様式でベクターにまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれている核酸；（ｃ）単独の分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産された断片、または制限酵素断片；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードしている遺伝子、の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。

【0025】

用語「ＲＮＡ」、「ＲＮＡ分子」、および「リボ核酸分子」は、本明細書では交換可能に用いており、リボヌクレオチドのポリマーを指す。用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、天然に（例えば、それぞれ、ＤＮＡ複製またはＤＮＡの転写によって）合成されることがある。ＲＮＡは、翻訳後修飾されることがある。ＤＮＡおよびＲＮＡを化学合成することもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれ、ｓｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ）であることもあり、または多鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれ、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であることもある。

【0026】

核酸配列は、上述の遺伝子の１つ以上をターゲットにしてその発現または活性を阻害する低分子干渉ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ剤）をコードしていることがある。用語「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡ干渉を指示するのに十分なターゲットＲＮＡの配列相補性を有するＲＮＡ、またはその類似体を指す。例としては、ＲＮＡを作製するために使用することができるＤＮＡも挙げられる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ターゲット分子（例えば、ターゲット遺伝子、タンパク質またはＲＮＡ）をダウンレギュレートする配列特異的または選択的過程を指す。一般に、干渉ＲＮＡ（「ｉＲＮＡ」）は、特定のｍＲＮＡの触媒分解を生じさせるものであって、遺伝子発現を低下させるまたは阻害するために使用することもできる、二本鎖の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。

【0027】

用語「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」（「低分子干渉ＲＮＡ」としても公知）は、ＲＮＡ干渉を指示または媒介できる、長さが約１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは長さが約１５〜２５ヌクレオチドの間、さらに好ましくは長さが約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドのＲＮＡ剤、好ましくは二本鎖の薬剤、であって、それらの鎖が、例えば１、２または３つのオーバーハングヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むオーバーハング末端を場合により有するＲＮＡ剤を指す。天然に存在するｓｉＲＮＡは、より長いｄｓＲＮＡ分子（例えば、長さが＞２５ヌクレオチド）から細胞のＲＮＡｉ機構（例えば、ダイサーまたはその相同体）によって生成される。

【0028】

用語「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉を指示または媒介できる、長さが約１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは長さが約１５〜２５ヌクレオチドの間、さらに好ましくは長さが約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドのＲＮＡ剤、好ましくは一本鎖の薬剤を指す。天然に存在するｍｉＲＮＡは、ステム・ループ前駆体ＲＮＡ（すなわち、プレｍｉＲＮＡ）からダイサーによって生成される。本明細書において用いる場合の用語「ダイサー」は、ダイサーはもちろん、ｄｓＲＮＡ構造をｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ様またはｍｉＲＮＡ様分子にプロセッシングできる任意のダイサーオルソログまたはホモログも含む。天然に存在するマイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）は一過的様式で（例えば、発達中に）発現されることが判明していることに基づき、用語マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）を用語「小分子一過性ＲＮＡ」（または「ｓｔＲＮＡ」）と交換可能に用いる。

【0029】

本明細書において用いる場合の用語「ｓｈＲＮＡ」は、相補配列の第一および第二領域を含むステム・ループ構造を有するＲＮＡ剤であって、前記領域の相補性度および配向度が、該領域間で塩基対合が発生するのに十分なものであり、前記第一および第二領域が、ループ領域によって連結されており、前記ループが、前記ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠如の結果として生ずるものであるＲＮＡ剤を指す。

【0030】

したがって、ＲＮＡ分子の（例えば細胞内での）分解を特徴とするＲＮＡｉの利用も本発明の範囲内である。分解は、酵素的、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって触媒される。ＲＮＡｉを指示するためにターゲットＲＮＡ配列（例えば、上述の遺伝子の１つ以上）に対して十分相補的な配列を有するＲＮＡ剤は、該ＲＮＡ剤が、ターゲットＲＮＡ配列との少なくとも５０％の相同性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の相同性）を有し、したがって、それら２つが、互いに、ハイブリダイズしてＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）または過程によるターゲットＲＮＡの分解を誘発するのに十分相補的であることを意味する。「ＲＮＡｉを指示するのに十分にターゲットＲＮＡ配列に相補的な配列」を有するＲＮＡ剤は、該ＲＮＡ剤が、ＲＮＡｉ機構または過程によってターゲットＲＮＡの翻訳阻害を誘発するのに十分な配列を有することも意味する。ＲＮＡ剤は、ターゲットＤＮＡ配列をクロマチンサイレンシングさせるために、該ターゲットＤＮＡ配列によってコードされているターゲットＲＮＡに十分相補的な配列を有することもある。言い換えると、前記ＲＮＡ剤は、転写遺伝子サイレンシングを誘導するのに十分な、例えば、ターゲットＤＮＡ配列でのまたは付近での遺伝子発現を、例えば該ターゲットＤＮＡ配列でのまたは付近でのクロマチン構造変化を誘導することにより、下方変調するのに十分な、配列を有する。

【0031】

当該技術分野において公知の高分子、生体分解性微粒子またはマイクロカプセル送達装置を使用して、上述のポリヌクレオチドを送達することができる。前記ポリヌクレオチドの摂取を果たすためのもう１つの方法は、標準的な方法によって調製されたリポソームの使用である。前記ポリヌクレオチドをこれらの送達ビヒクルに単独で組み込むことができ、または組織特異的抗体と一緒に共組み込みすることができる。あるいは、静電力または共有結合力によってポリ−Ｌ−リシンに付いているプラスミドまたは他のベクターで構成されている分子コンジュゲートを調製することができる。ポリ−Ｌ−リシンは、ターゲット細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：４７９）。あるいは、当該技術分野において公知である組織特異的転写調節要素の使用により、組織特異的ターゲティングを果たすことができる。筋肉内、皮内または皮下部位への裸のＤＮＡの（すなわち、送達ビヒクルなしでの）送達は、インビボ発現を果たすためのもう１つの手段である。

【0032】

ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）分子を当該技術分野において周知の方法によって設計することができる。任意のＲＮＡを一意的に分解するために必要な配列特異性をもたらすのに十分な相同性を有するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｓＲＮＡ分子を、ＡＭＢＩＯＮ，Ｉｎｃ．およびＤＨＡＲＭＡＣＯＮ，Ｉｎｃ．のウェブサイト上で管理されているものをはじめとする（しかしこれに限定されない）当該技術分野において公知のプログラムを使用して設計することができる。当業者は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｓＲＮＡ配列の最適化のための幾つかの設計種の系統的試験を常例的に行うことができる。短鎖干渉核酸分子を設計する際の考慮事項としては、生物物理的、熱力学的および構造的考慮事項、センス鎖内の特定の位置での塩基優先性、および相同性が挙げられるが、これらに限定されない。これらの考慮事項は、当該技術分野において周知であり、上述のＲＮＡ分子を設計するための指針となる。

【0033】

一例として、前記ポリペプチドは抗体である。用語「抗体」は、免疫グロブリン分子またはその免疫グロブリン活性部分、すなわち抗原結合部位、を指す。例としては、少なくとも１つまたは２つの重（Ｈ）鎖可変領域（Ｖ_H）と、少なくとも１つまたは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（Ｖ_L）とを有する部分が挙げられるが、これに限定されない。前記Ｖ_HおよびＶ_L領域を、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより高度に保存される領域が散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる高可変性領域にさらに細分することができる。本明細書において用いる場合、用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている１つ以上のポリペプチドから成るタンパク質を指す。認知されているヒト免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。

【0034】

抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２またはＶＩＰＲ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって遂行され得ることは証明されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、Ｖ_L、Ｖ_H、Ｃ_LおよびＣ_H1ドメインから成る一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）₂断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）Ｖ_HおよびＣ_H1ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶ_LおよびＶ_Hドメインから成るＦｖ断片；（ｖ）Ｖ_Hドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわちＶ_LおよびＶ_H、は、別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を用いて、合成リンカーによりそれらを連結させることができ、それにより、それらを、Ｖ_L領域とＶ_H領域が対合して一価分子を形成している単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３参照）のようにすることができる。かかる一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されると解釈される。これらの抗体断片を当業者に公知の従来の技法を用いて得、それらの断片をインタクト抗体であるのと同じ手法で有用性についてスクリーニングする。

【0035】

上述のターゲットタンパク質の１つに特異的に結合する抗体を、当該技術分野において公知の方法を用いて作ることができる。この抗体は、ポリクローナル抗体であることもあり、またはモノクローナル抗体であることもある。かかる抗体の例としては、下の作業実施例において説明するものが挙げられる。１つの実施形態では、前記抗体を組換え生産することができ、例えば、ファージディスプレイによってまたはコンビナトリアル法によって生産することができる。もう１つの実施形態では、前記抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を生産するように遺伝子改変されたマウスにおいて作られた抗体）、ヒト化抗体、または非ヒト抗体、例えば、これらに限定されないが、齧歯動物（マウスもしくはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、これに限定されないが、サル）、ウサギもしくはラクダ抗体である。抗体のヒト化バージョンを産生させるための方法の例としては、ＣＤＲグラフティング（Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８））、鎖のシャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）；およびベニアリングまたはリサーフェイシング（欧州特許第５９２，１０６号、同第５１９，５９６号明細書）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４１５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））が挙げられるが、これらに限定されない。完全ヒト抗体を産生させる方法の例としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるマウスからの抗体の産生、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを産生およびスクリーニングするためのファージディスプレイ技術の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

【0036】

「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すと解釈される（例えば、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２またはＶＩＰＲを特異的に結合する単離された抗体は、かかる抗原以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない）。しかし、前記抗原を特異的に結合する単離された抗体は、他の種からの他の抗原、例えば、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＡＢＣＢ９、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２またはＶＩＰＲ分子、に対する交差反応性を有することがある。さらに、単離された抗体には、他の細胞材料および／または化学物質が実質的にないことがある。

【0037】

本明細書において用いる場合の用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を提示する。

【0038】

本明細書において用いる場合の用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むと解釈される。さらに、前記抗体が定常領域を含有する場合、その定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはインビボで体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含むことがある。しかし、本明細書において用いる場合の用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含まないと解釈される。

【0039】

用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一結合特異性を提示する抗体を指す。１つの実施形態において、前記ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と不死化細胞に融合している軽鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウス、から得たＢ細胞を含むハイブリドーマによって生産される。

【0040】

本明細書において用いる場合の用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、生成および単離されるすべてのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子の導入遺伝子を持つまたは導入染色体を持つ動物（例えば、マウス）から単離されたまたは該動物から調製されたハイブリドーマから単離された抗体（下でさらに説明する）、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから、単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、生成または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、一定の実施形態において、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列の導入遺伝子を持つ動物を使用するときには、インビボ体細胞突然変異誘発）を受けることがあり、したがって、該組換え抗体のＶ_HおよびＶ_L領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系Ｖ_HおよびＶ_L配列に由来し、関連付けられるが、天然にはインビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー中に存在しない。

【0041】

本明細書において用いる場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。

【0042】

句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原に特異的に結合する抗体」と交換可能に用いている。

【0043】

本明細書において用いる場合、ＩｇＧ抗体についての「高親和性」という用語は、ターゲット抗原に対して１０^-7Ｍ以下、好ましくは１０^-8Ｍ以下、さらに好ましくは１０^-9Ｍ以下、およびさらにいっそう好ましくは１０^-10Ｍ以下のＫ_Dを有する抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについては様々であり得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての「高親和性」結合は、１０^-7Ｍ以下、さらに好ましくは１０^-8Ｍ以下のＫ_Dを有する抗体を指す。

【0044】

一例として、ＩＧＦ１へのＩＧＦＢＰ２結合を阻害することによりＩＧＦＢＰ２機能を中和するモノクローナル抗体を含む組成物を記載する。１つの実施形態において、この抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、または非ヒト抗体、例えば、これらに限定されないが、齧歯動物（マウスもしくはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、これに限定されないが、サル）、ウサギまたはラクダ抗体であり得る。１つの実施形態では、このモノクローナルモノクローナル抗体の１つ以上のアミノ酸を置換して、その物理的特性を変更することができる。これらの特性としては、結合特異性、結合親和性、免疫原性、および抗体アイソタイプが挙げられるが、それらに限定されない。上記抗体の完全ヒトまたはヒト化バージョンを含有する医薬組成物を使用して、病的血管新生の障害を処置することができる。

【0045】

一例として、ＩＧＦ１がＩＧＦＢＰ２に結合するのを阻害するＩＧＦＢＰ２中和抗体を含む組成物は、インビボで乳癌腫瘍進行および腫瘍量を抑制する。この例では、上記抗体の投与は、ヒト癌のマウスモデルにおいてインビボでヒト乳癌の腫瘍量を低減させる。

【0046】

上記抗体の完全ヒトまたはヒト化バージョンを含有する医薬組成物を使用して、転移細胞による内皮動員を阻害することによりヒト患者における乳癌転移を障害することができる。もう１つの実施形態では、これらの抗体の完全ヒトまたはヒト化バージョンを含有する医薬組成物を使用して、他のタイプの血管腫瘍を処置することができる。この組成物で処置することができる典型的な血管新生化腫瘍としては、酸素および栄養の供給のために血管要素を必要とする固形腫瘍、特に癌腫が挙げられる。例示的固形腫瘍としては、肺、乳房、骨、卵巣、胃、膵臓、咽頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、子宮頚、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺の癌腫、扁平上皮癌腫、腺癌、小細胞癌腫、黒色腫、神経膠腫、膠芽腫、神経芽腫、カポジ肉腫および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0047】

もう１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、上述の経路に干渉する、したがって、内皮動員および血管新生を阻害する、上述のタンパク質の突然変異体型である。用語「突然変異体」は、天然に存在する突然変異体、ならびに化学的におよび／または組換えＤＮＡ法を用いて生成された突然変異体を包含する。上述の野生型ポリペプチドの１つについての突然変異体は、１つ以上のアミノ酸の変更、例えばトランケーション、伸長、置換、欠失または挿入、に起因し得る。前記変更は、修飾アミノ酸、例えば翻訳後修飾を含むもの、を有することもある。突然変異体の血管新生促進活性は、本明細書に記載するまたは当該技術分野において公知のアッセイを用いて測定して、あったとしても野生型ポリペプチドの活性より少なくとも約２０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％）実質的に低い。一例は、ＩＧＦ１−Ｒの細胞外ドメインを有するが、細胞内ドメインを欠くポリペプチドである。ＩＧＦ−１についての競合により、この突然変異体は、ドミナントネガティブ様式で上述の経路および血管新生促進活性を阻害することができる。

【0048】

上述の抗体またはポリペプチドのアミノ酸組成物は、それぞれの抗原またはターゲットに結合する能力（例えば、親和性）の破壊に伴ってまたはそれには関係なく変わることがあり、およびそれぞれの細胞応答を誘発することもあり、または阻害することもある。例えば、それらは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有することがある。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、例えば配列番号９または１０において、予測される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えることができる。あるいは、それらの配列のすべてまたは一部分に沿ってランダムに、例えば飽和突然変異誘発により、突然変異を導入することができ、得られた突然変異体を、それぞれの抗原に結合してそれぞれの細胞応答を誘発する能力についてスクリーニングして、その活性を保持する突然変異体を同定することができる。

【0049】

組成物
適する担体と上記薬剤の１つ以上とを含有する組成物は、本発明の範囲内である。前記組成物は、医薬的に許容され得る担体を含有する医薬組成物、飲食に許容され得る適する担体を含有する飲食用組成物、または化粧品的に許容され得る担体を含有する化粧品組成物であり得る。

【0050】

用語「医薬組成物」は、インビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に特に適している組成物を作る、不活性または活性の担体と活性薬剤の組み合わせを指す。「医薬的に許容され得る担体」は、被験体へのまたは対する投与後、望ましくない生理作用を生じさせない。医薬組成物中の担体は、活性成分と相溶性であり、それを安定させることが可能であり得るという意味でも、「許容され得」なければならない。１つ以上の可溶化剤を活性化合物の送達のための製薬用担体として用いることができる。医薬的に許容され得る担体の例としては、剤形として使用可能な組成物を実現するための生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤および希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃイエロー＃１０が挙げられる。

【0051】

病的血管新生を特徴とする障害を処置するために上記組成物を上記の形態のいずれかで使用することができる。有効量は、処置する被験体に治療効果を付与するために必要とされる活性化合物／薬剤の量を指す。有効用量は、当業者には認識されているように、処置する疾患のタイプ、投与経路、賦形剤使用量、および他の治療的処置との併用（ｃｏ−ｕｓａｇｅ）の可能性に依存して変わるであろう。

【0052】

本発明の医薬組成物を非経口、経口、経鼻、直腸内、局所または頬側投与することができる。本明細書において用いる場合の用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内（ｉｎｔｒｍｕｓｃｕｌａｒ）、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内または頭蓋内注射、ならびに任意の適する注入法を指す。

【0053】

滅菌注射用組成物は、非毒性で非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液であり得る。かかる溶液としては、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、および等張食塩液が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、固定油（例えば、合成モノまたはジグリセリド）が溶媒または懸濁化媒体として適便に用いられる。脂肪酸、例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体（しかしこれらに限定されない）は、注射剤の調製に有用であり、同様に、天然の医薬的に許容され得る油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油（しかしこれらに限定されない）、それらのポリオキシエチレン化バージョンも有用である。これらの油性溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロース（しかしこれに限定されない）、または類似の分散剤を含有することがある。医薬的に許容され得る固体、液体または他の剤形の製造に一般に使用される、他の一般に使用される界面活性剤、例えば、ＴｗｅｅｎもしくはＳｐａｎまたは他の類似の乳化剤もしくは生物学的利用能強化剤（しかしこれらに限定されない）も、調合のために使用することができる。

【0054】

経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンおよび水性懸濁液、分散液および溶液をはじめとする、任意の経口的に許容され得る剤形であり得る。錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム（しかしこれに限定されない）も典型的に添加される。カプセル形態での経口投与に有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。水性懸濁液またはエマルジョンを経口投与するときには、乳化または懸濁化剤と併せた油相に活性成分を懸濁または分散させることができる。必要に応じて、一定の甘味剤、着香剤または着色剤を添加することができる。

【0055】

本記載発明による局所投与用の医薬組成物は、溶液、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、ペースト、ゲル、スプレー剤、エアロゾルまたはオイルとして調合することができる。あるいは、局所製剤は、１つ以上の賦形剤または希釈剤を場合によっては含むことがある活性成分（単数または複数）を含浸させたパッチまたはドレッシングの形態であり得る。一部の好ましい実施形態において、前記局所製剤は、皮膚または他の罹患エリアへの活性薬剤（単数または複数）の吸収または浸透を増進するであろう材料を含む。前記局所組成物は、皮膚の障害、例えば、黒色腫および一定の炎症性障害の処置に有用である。

【0056】

局所組成物は、安全かつ有効な量の、皮膚への適用に適する、皮膚科学的に許容され得る担体を含有する。「化粧品的に許容され得る」または「皮膚科学的に許容され得る」組成物または成分は、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応およびこれらに類することを伴わない、ヒト皮膚に接触させる使用に適している組成物または成分を指す。前記担体により、活性薬剤および自由選択の成分を適切な濃度（単数または複数）で皮膚に送達することが可能になる。したがって、前記担体は、確実に活性材料を適切な濃度で選択ターゲット上に均一に塗布するまたは分布させるための希釈剤、分散剤、溶媒またはこれらに類するものとして作用することができる。前記担体は、固体であることもあり、半固体であることもあり、または液体であることもある。前記担体は、ローション、クリームもしくはゲルの形態であることがあり、特に、活性材料が沈殿しないようにするために十分な濃さおよび降伏点を有するものであり得る。前記担体は、不活性であることもあり、または皮膚科学的利点を有することもある。それは、本明細書に記載する活性成分と物理的におよび化学的に相溶性でなければならず、ならびにその組成物に関連した安定性、効力または他の使用上の利点を過度に損なわせてはならない。

【0057】

処置方法
本記載発明は、被験体における血管新生性障害または血管新生の障害を処置するための方法を提供する。

【0058】

用語「血管新生性障害」、「血管新生の障害」および「血管新生障害」は、本明細書では交換可能に用いており、病的血管新生を特徴とする障害を指す。病的血管新生を特徴とする障害は、異常または異所性血管新生が、単独でまたは他のものとの組み合わせで、該障害の因果関係、起因または症状に寄与する障害を指す。この障害の例としては、様々な癌（例えば、血管新生化腫瘍）、眼障害、炎症性障害などが挙げられる。

【0059】

本方法で処置することができる典型的な血管新生化腫瘍としては、酸素および栄養の供給のために血管要素を必要とする固形腫瘍、特に癌腫が挙げられる。例示的固形腫瘍としては、肺、乳房、骨、卵巣、胃、膵臓、咽頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、子宮頚、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺の癌腫、扁平上皮癌腫、腺癌、小細胞癌腫、黒色腫、神経膠腫、膠芽腫、神経芽腫、カポジ肉腫および肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

癌以外の多数の障害または病態も上記方法で処置することができる。例としては、関節炎、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、グレーブス病、血管再狭窄（血管形成術後の再狭窄を含む）、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障、慢性腎疾患、糖尿病性腎症、多発性嚢胞腎疾患、間質性肺疾患、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、自己免疫性肝炎、慢性炎症性肝疾患、肝硬変、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、酒さ、および基底細胞癌腫が挙げられる。

【0061】

他の処置ターゲットとしては、例えば、米国特許出願公開第２００９／００４２９７号、同第２００９／０１７５７９１号および同第２００７／０１６１５５３号明細書に記載されているもの、例えば、血管線維腫、アテローム斑、角膜移植片新生血管形成、血友病関節症、肥厚性瘢痕、オスラー・ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、様々な他の炎症性疾患および障害、ならびに子宮内膜症が挙げられる。

【0062】

「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。非ヒト動物の例としては、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、イヌ、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ネコおよびウサギ、ならびに非哺乳動物、例えば鳥類、両生類、爬虫類などが挙げられる。１つの実施形態において、被験体はヒトである。もう１つの実施形態において、被験体は、実験動物、または疾患モデルとして適する動物である。障害について処置すべき被験体を該障害についての標準的診断法によって同定することができる。

【0063】

場合により、前記被験体を、処置前に、当該技術分野において公知のまたは上で説明した方法により上述の遺伝子またはタンパク質の１つ以上についての突然変異、発現レベルまたは活性レベルについて検査することができる。前記被験体が、前記遺伝子の特定の突然変異を有する場合、または前記遺伝子発現または活性レベルが、例えば、該被験体からの試料におけるほうが正常な人からの試料におけるものより高い場合、該被験体は、処置の候補である。

【0064】

阻害または処置を確認するために、前記投与段階の前および／または後に、当該技術分野において公知の技術を用いて内皮動員または結果として生ずる血管新生の阻害を評価および／または検証することができる。例示的技術としては血管造影または動脈造影が挙げられ、血管および身体の器官の内部または内腔を可視化するための医療イメージング法は、一般に、放射性不透過性造影剤を血管に注射し、蛍光透視法などのＸ線に基づく技法を用いてイメージングすることにより行われ得る。

【0065】

「処置すること」または「処置」は、障害を有する被験体への、該障害、該障害の症状、該障害の二次的な疾病状態または該障害の素因を治癒する、緩和する、軽減する、治療する、それらの発症を遅延させる、それらを予防するまたは改善するための、化合物または薬剤の投与を指す。

【0066】

「有効量」または「治療有効量」は、処置する被験体において医学的に望ましい結果を生じさせることができる前記化合物または薬剤の量を指す。前記処置方法をインビボでまたはエクスビボで、単独でまたは他の薬物もしくは療法と共に行うことができる。治療有効量を１回以上の投与、適用または投薬で施すことができ、および治療有効量は、特定の製剤または投与経路に限定されないと解釈される。

【0067】

前記薬剤をインビボでまたはエクスビボで、単独で、または他の薬物もしくは療法と共に、すなわちカクテル療法で、投与することができる。本明細書において用いる場合、用語「共投与」または「共投与される」は、少なくとも２種の薬剤（単数または複数）または療法の被験体への投与を指す。例えば、腫瘍、特に血管新生化悪性腫瘍、の処置の場合、前記薬剤を単独で使用することができ、または例えば化学療法剤、放射線療法剤、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｐｉｃ）剤、抗血管新生剤、および／または免疫毒素もしくはコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）と併用することができる。

【0068】

一部の実施形態において、２種以上の薬剤／療法の共投与は、同時的である。他の実施形態では、第一の薬剤／療法を、第二の薬剤／療法の前に投与する。用いる様々な薬剤／療法の製剤および／または投与経路が様々であり得ることは、当業者には理解される。

【0069】

インビボアプローチでは、化合物または薬剤を被験体に投与する。一般に、前記化合物を医薬的に許容され得る担体（例えば、これに限定されないが、生理食塩水など）に懸濁させ、経口投与または静脈内注入により投与するか、皮下に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内にまたは肺内に注射するまたは埋め込む。

【0070】

必要な投薬量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の病気の性質；被験体のサイズ、体重、表面積、年齢および性別；投与される他の薬物；ならびに担当医の判断に依存する。適切な投薬量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。利用できる化合物の多様性、および様々な投与経路の異なる効率にかんがみて、必要投薬量の変動を予想することができる。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与より高い投薬量を必要とすると予想されよう。当該技術分野において十分理解されているような最適化のための標準的経験的常例手順を用いて、これらの投薬レベルの変動を調整することができる。適する送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子または埋め込み可能装置）内への化合物の封入は、送達の、特に経口送達についての、効率を増すことができる。

【0071】

診断
本記載発明は、診断キットおよび方法も提供する。癌細胞または腫瘍形成しやすい細胞を有する被験体を、該被験体からの試験試料中の上記遺伝子またはポリペプチドの１つ以上についての発現または活性に基づき、診断することができる。前記ポリペプチドおよび核酸を、癌細胞または腫瘍形成しやすい細胞の存在または不在を示すマーカーとして使用することができる。本記載発明の診断および予後アッセイは、前記ポリペプチドまたは核酸の発現レベルを評定するための方法を含む。

【0072】

試験試料中の前記ポリペプチドまたは核酸の存在、レベルまたは不在を、試験被験体から試験試料を得、その試験試料と該ポリペプチドまたは核酸を検出できる化合物または薬剤（例えば、ｍＲＮＡプローブ、ゲノムｃＤＮＡプローブまたはｃＤＮＡプローブ）と接触させることによって評価することができる。「試験試料」としては、被験体から単離された組織、細胞および生体液、ならびに被験体体内に存在する組織、細胞および流体を挙げることができる。前記遺伝子の発現レベルを多数の方法で測定することができ、それらの方法としては、該遺伝子によってコードされているｍＲＮＡの測定、該遺伝子によってコードされているポリペプチドの量の測定、または該遺伝子によってコードされているポリペプチドの活性の測定が挙げられるが、これらに限定されない。

【0073】

細胞中の前記遺伝子に対応するｍＲＮＡのレベルをインサイチュー形式およびインビトロ形式、両方によって判定することができる。試験試料から単離されたメッセンジャーＲＮＡを、サザンまたはノーザン分析、ＰＣＲ分析およびプローブアレイを含む（しかしこれらに限定されない）、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。例えば、ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの診断方法は、単離されたｍＲＮＡと、前記遺伝子によってコードされている該ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させることを伴う。前記プローブは、完全長核酸またはその一部分、例えば、長さが少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件下でｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。

【0074】

１つの形式では、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で遊走させ、そのゲルからそのｍＲＮＡをニトロセルロース膜などの膜に転写することにより、ｍＲＮＡ（またはそれから調製したｃＤＮＡ）を表面に固定化し、プローブと接触させる。もう１つの形式では、例えば遺伝子チップアレイで、プローブを表面に固定化し、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）をプローブと接触させる。当業者は、前記ｍＲＮＡレベルの検出に公知のｍＲＮＡ検出方法を適応させることができる。

【0075】

上述の遺伝子の１つ以上によってコードされている試料中のｍＲＮＡ（またはそれから調製したｃＤＮＡ）のレベルを、例えば、標準的なＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｂｕｓｔｉｎ Ｓ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９−９３、２０００）、定量的ＰＣＲ（Ｏｎｇ Ｙ．ら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．７：５９−６７、２００２）、リアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ Ｄ．、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：５０３−１２、２００２）およびインサイチューＰＣＲ（Ｔｈａｋｅｒ Ｖ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１５：３７９−４０２、１９９９）または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅、続いてそれらの増幅された分子について当該技術分野において公知の技法を用いる検出で、評価することができる。本明細書において用いる場合、「増幅プライマー」は、遺伝子の５’または３’領域（それぞれ、プラスおよびマイナス鎖、逆もまた然り）にアニールすることができる１対の核酸分子であって、それらの間に短い領域を含有するものである１対の核酸分子と定義する。適切な条件下で適切な試薬を用いると、かかるプライマーにより、該プライマーが隣接したヌクレオチド配列を有する核酸分子を増幅することができる。

【0076】

インサイチュー法については、細胞または組織試料を調製し、支持体、例えば、これに限定されないが、スライドガラス、に固定化し、その後、染色体上のゲノムＤＮＡにまたは対応するポリペプチドをコードしているｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触させることができる。

【0077】

もう１つの実施形態において、本記載発明の方法は、対照試料と、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または薬剤とを接触させること、および該対照試料中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と試験試料中のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在とを比較することをさらに含む。

【0078】

上記核酸ベースの診断方法は、被験体が、異所性遺伝子発現および異所性血管新生に関連した疾患、例えば癌、を有するかどうか、または該疾患の素因を有するかどうかを判定するための定性的および定量的情報をもたらすことができる。

【0079】

様々な方法を用いて、上述のポリペプチドの１つ以上についてのレベルを判定することができる。一般に、これらの方法は、前記ポリペプチドに選択的結合する薬剤、例えば抗体、と接触させて、試料中のポリペプチドのレベルを評価することを含む。抗体は、ポリクローナル抗体であってよいし、またはモノクローナル抗体であってよい。インタクト抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂）を使用することもできる。もう１つの実施形態において、前記抗体は、検出可能な標識を保有する。プローブまたは抗体に関しての用語「標識された」は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に物理的に連結させることによるプローブまたは抗体の直接標識はもちろん、検出可能物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識も包含すると解釈される。例えば、ウサギＦｃ領域を有する抗体は、該ウサギＦｃ領域に対する二次抗体であって、検出可能な物質とカップリングしている二次抗体を使用して、間接的に標識することができる。検出可能な物質の例をここで提供する。適切な検出可能な物質または標識としては、放射性同位体（例えば、これらに限定されないが、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、³Ｈ、もしくは³²Ｐ）、酵素（例えば、これらに限定されないが、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、もしくはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ））、蛍光部分またはタンパク質（例えば、これらに限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、もしくはＢＦＰ）、または発光部分（例えば、これに限定されないが、カリフォルニア州パロアルトのＱｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0080】

前記検出方法を用いて、生体試料中の上述のポリペプチドの１つ以上をインビトロではもちろんインビボでも検出することができる。前記ポリペプチドのインビトロ検出法としては、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫蛍光法、ＥＩＡ、ＲＩＡ、およびウエスタンブロット分析が挙げられる。前記ポリペプチドのインビボ検出法としては、標識抗体の被験体への導入が挙げられる。例えば、上で説明したような検出可能な物質で抗体を標識することができる。被験体におけるその検出可能物質の存在および位置を、標準的イメージング法によって検出することができる。

【0081】

本明細書に記載する診断方法により、上述のポリペプチドの１つ以上についての異所発現または活性に関連した疾患または障害を有する被験体または発現するリスクのある被験体を同定することができる。ここに記載するような、かかる疾患または障害の例としては、上で説明したものが挙げられる。

【0082】

本明細書に記載する予後アッセイを用いて、被験体が、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の候補薬）を投与して癌などの障害を治療するのに適しているかどうかを判定することができる。例えば、かかるアッセイを用いて、被験体に細胞傷害性薬物を投与して障害を処置することができるかどうかを判定することができる。

【0083】

上記アッセイの実施から得られる情報は、個体の健康状態に影響を及ぼす疾患および他の有害な状態の予後判定、該疾患および状態の進行の同定、ならびに該疾患および状態の臨床管理に有用である。一部の実施形態において、上述の診断アッセイは、異常な病的血管新生を特徴とする悪性病変（癌）の予後判定、該悪性病変の進行の同定、および該悪性病変の管理に有用な情報をもたらす。より具体的には、前記情報は、罹患した哺乳動物、例えばヒト、の身体からかかる悪性病変を根絶するための化学療法または他の処置レジメを計画する際に臨床家の助けになる。

【実施例1】

【0084】

方法および材料
本実施例は、実施例２〜８において使用する一般的な方法および材料を説明するものである。

【0085】

細胞培養
すべての細胞系を、Ｔａｖａｚｏｉｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４５１（７１７５）、１４７（２００８）に記載されているとおりに増殖させた。２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ培地で培養し；Ｈ２９細胞は、１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ ドキシサイクリン、２μｇ／ｍＬ ピューロマイシンおよび０．３ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補足したＤＭＥＭ培地で培養し；ならびにＨＵＶＥＣ細胞は、ＥＧＭ−２培地（ＣＣ−３１６２、Ｌｏｎｚａ、スイス国バーゼル）で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＣＮ３４乳癌細胞系ならびにその転移誘導体ＬＭ２、ＢｏＭ２およびＬｍ１ａは、Ｍｉｎｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４３６（７０５０）、５１８（２００５）に記載されている。

【0086】

動物研究
すべての動物実験は、Ｔｈｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコルに従って行った。同齢の雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（週齢６〜８週）を、同所性乳房脂肪体腫瘍開始アッセイ（Ｍｉｎｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４３６（７０５０）、５１８（２００５）と肺転移アッセイ（Ｔａｖａｚｏｉｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４５１（７１７５）、１４７（２００８））の両方に使用した。８週齢同齢雌無胸腺マウスを全身転移アッセイ（Ｋａｎｇ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３（６）、５３７（２００３）およびＹｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０３（２）、１９７（１９９９））に使用した。

【0087】

ｐＴｒｉｐｚベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アラバマ州ハンツヴィル）を含有するｔｅｔ−ＯＮにプレｍｉＲ−１２６をクローニングすることにより、誘導性ｍｉＲ−１２６発現を実現した。第３日に、５％スクロースを含有する飲み水に２ｍｇ／ｍＬ ドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。対照マウスには、５％スクロースを有する飲み水を与えた。

【0088】

レンチウイルス、レトロウイルス、ノックダウンおよび過発現細胞の産生
レンチウイルスの産生のために、１×１０⁶２９３Ｔ細胞を１０ｃｍプレートに播種し、２４時間インキュベートした。その後、４０μＬのＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）−２９３トランスフェクション試薬（ＭＩＲ２７００、ＭＩＲＵＳ ＢＩＯ ＬＬＣ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、１２マイクログラムのベクターＫ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ）、６μｇのベクターＡ（Ｅｎｖ）および１２μｇの適切なｓｈＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。１６時間後、培地を、１０％ＦＢＳを補足した新たな抗生物質不含ＤＭＥＭと交換した。さらに２４時間後、５分間、１，５００ｇでの回転によりウイルスを回収し、その後、０．４５μｍフィルターによって濾過した。レトロウイルスの産生のために、Ｈ２９細胞を１０ｃｍプレートに播種し、放置して集密度９０％まで成長させた。その後、６０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００トランスフェクション試薬（カリフォルニア州カールズバッドのＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳによる１１６６８−０１９、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用して、１０マイクログラムの適切なプラスミドをＨ２９細胞にトランスフェクトした。１６時間後、培地を、１０％ＦＢＳを補足した新たな抗生物質不含ＤＭＥＭと交換した。さらに４８時間後、５分間、１，５００ｇでの回転によりウイルスを回収し、０．４５μｍフィルターによって濾過した。２ミリリットルの適切なウイルスを使用して、１０μｇ／ｍＬのポリブレン（ＴＲ−１００３−Ｇ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ビルリカ、Ａ）の存在下で５０Ｋ癌細胞に形質導入した。２４時間後、培地を、１０％ＦＢＳと選択のために２μｇ／ｍＬ ピューロマイシン（レンチウイルス）または１０μｇ／ｍＬ ブラスチシジンとを補足したＤＭＥＭに交換した。さらに７２時間後、細胞を洗浄し、放置してＤ１０Ｆで成長させ、ｑＰＣＲによって対象となる遺伝子のノックダウンについて試験した。

【0089】

内皮動員
動員アッセイ開始のおおよそ２４時間前に癌細胞（２５，０００個）を２４ウェルプレートに播種した。０．２％ＦＢＳを補足したＥＧＭ−２培地で２４時間、ＨＵＶＥＣ細胞を血清飢餓させた。その後、ＨＵＶＥＣ細胞を、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＥＲ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ色素（Ｃ３４５５２、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）で４５分間標識し、２％ＦＢＳを補足したＥＧＭ−２培地で３０分間レスキューした。その間に、癌細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍＬの０．２％ＦＢＳ ＥＧＭ−２培地を各ウェルに添加した。その後、各ウェルに３．０μｍ ＨＴＳ ＦＬＵＲＯＢＬＯＣＫインサート（３５１１５１、ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ、カリフォルニア州サンホゼ）を取り付けた。抗体実験のために、その後、適切な濃度の各抗体を各ウェルに添加した：５０ｎｇ／ｍＬ 抗ＩＧＦＢＰ２（ＡＦ６７４、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、ミネソタ州ミネアポリス）、２０μｇ／ｍＬ 抗ＩＧＦ−１（ＡＦ−２９１−ＮＡ、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、４０μｇ／ｍＬ 抗ＩＧＦ−２（ＭＡＢ２９２、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、２０μｇ／ｍＬ 抗ＩＧＦ１Ｒ（ＭＡＢ３９１、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）、５μｇ／ｍＬ 抗ＩＧＦ２Ｒ（ＡＦ２４４７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＩｇＧ（ＡＢ−１０８−Ｃ、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）。抗体とのプレインキュベーションを必要とする内皮動員アッセイについては、その後、ＨＵＶＥＣ細胞または癌細胞のいずれかを２０μｇ／ｍＬ 抗ＩＧＦ１Ｒまたは対照ＩｇＧ抗体と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。その後、ＨＵＶＥＣ細胞を１時間、血清飢餓させた後、１ｍＬにつき１００ＫのＨＵＶＥＣで０．２％ＦＢＳ ＥＧＭ−２に再懸濁させた。その後、その再懸濁液（０．５ｍＬ）を各ＦＬＵＯＲＯＢＬＯＣＫインサートに添加し、動員アッセイを１６時間、進行させた。アッセイ完了後、ＦＬＵＯＲＯＢＬＯＣＫインサートを４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ封入剤（Ｈ−１０００、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、カリフォルニア州バーリンゲーム）でスライドにマウントした。各インサートについて３画像を撮り、ＩＭＡＧＥＪ（ＮＩＨ）を用いて画像を分析した。

【0090】

走化性アッセイ
所与の量のウシ血清アルブミン（Ａ２１５３、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｒｈＩＧＦＢＰ２（６７４−Ｂ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｒｈＧａｓ６（８８５−ＧＳ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＩＧＦ１Ｒ（ＭＡＢ３９１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＭｅｒＦｃ（８９１−ＭＲ−１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する、マトリゲル（２５０μＬ、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、＃３５６２３１）を、２４ウェルプレートの底部で３０分間放置して凝固させた後、０．２％ＦＢＳを含有する２５０μＬ ＨＵＶＥＣ培地を添加した。その後、３．０μｍ ＨＴＳ Ｆｌｕｒｏｂｌｏｃｋインサート（３５１１５１、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を各ウエルに配置した。ＨＵＶＥＣ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ色素（Ｃ３４５５２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した後、０．２％ＦＢＳ ＥＧＭ−２の１ｍＬにつき３００ＫのＨＵＶＥＣを再懸濁させた。その後、０．５ｍＬのその再懸濁液を各Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｃｋインサートに添加し、アッセイを２０時間、進行させた。その後、それらのインサートを１５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ封入剤（Ｈ−１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でスライドにマウントした。その後、各インサートの基底側の５視野を撮像し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して分析した。

【0091】

移動アッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を集密度９０％に成長させ、０．２％ＦＢＳを含有するＨＵＶＥＣ培地中の所与の濃度のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ａ２１５３）、ｒｈＩＧＦＢＰ２（６７４−Ｂ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＩＧＦ１Ｒ（ＭＡＢ３９１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で４０分間、３７℃で刺激した。その後、それらの細胞をトリプシン処理し、５０Ｋ細胞をＨＴＳ Ｆｌｕｒｏｂｌｏｃｋインサート（３５１１５１、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に添加した。５％ＣＯ₂で３７℃で２４時間後、それらのインサートを除去し、膜を切除し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。膜の基底側に移動したＨＵＶＥＣ細胞をＤＡＰＩで可視化し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して膜１枚につき５視野に関して計数した。

【0092】

内皮接着
ＨＵＶＥＣ細胞を６ｃｍプレートに播種し、放置して集密になるまで成長させた。０．２％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ培地中で３０分間、癌細胞を血清飢餓させ、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＥＲ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ色素（Ｃ７０２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４５分間標識し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ培地中で３０分間インキュベートした。その後、癌細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに再懸濁させて１０Ｋ細胞／ｍＬにした。その後、５ミリリットルのその再懸濁液をＨＵＶＥＣの各プレートに添加し、プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで穏やかに洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間、固定した。その後、各プレートを１ｍＬのＰＢＳで処理し、各プレートから６画像を撮った。その後、ＩＭＡＧＥＪを使用して、ＨＵＶＥＣ細胞に接着した癌細胞の数を定量した。

【0093】

内皮増殖
癌細胞（１×１０⁶）を１０ｃｍプレートに播種し、２４時間放置して成長させた。その後、癌細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、２％ＦＢＳを補足したＥＧＭ−２培地を各プレートに添加した。そのＥＧＭ−２調整培地を２４時間後に回収した。ＨＵＶＥＣ細胞（２５Ｋ）を６ウェルプレートに三重反復で播種し、１６時間放置して成長させた。その後、ＨＵＶＥＣ細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、３ｍＬのＥＧＭ−２調整培地を各ウェルに添加した。４８時間後、その調整培地を別の３ｍＬの調整培地で置換した。さらに４８時間後、細胞をトリプシン処理し、血球計数器を使用して計数した。

【0094】

管腔形成アッセイ
製造業者のプロトコル（３５４１４９、ＢＤ ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）ＡＮＧＩＯＧＥＮＥＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭ−Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｕｂｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に従って、管腔形成アッセイを行った。簡単に言うと、０．２％ＦＢＳを補足したＥＧＭ−２培地中で２４時間、ＨＵＶＥＣ細胞を血清飢餓させた。その後、ＨＵＶＥＣ細胞を、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＥＲ Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ色素（Ｃ３４５５２、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）で４５分間標識し、その後、２％ＦＢＳを補足したＥＧＭ−２培地で３０分間処理した。この間に、管腔形成アッセイプレート（これは、９６ウェル形式であった）を３７℃で３０分間インキュベートした。癌細胞およびＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン処理し、２％ＦＢＳを補足したＥＧＭ−２培地にそれぞれ４００Ｋ／ｍＬおよび８００Ｋ／ｍＬで再懸濁させた。その後、癌細胞懸濁液とＨＵＶＥＣ細胞懸濁液を１：１比で混合し、５０μＬの各混合物を管腔形成アッセイプレートの各ウェルに播種した。そのアッセイプレートを３７℃で１６時間インキュベートした。各ウェルの画像を撮り、ＭＥＴＡＭＯＲＰＨ分析ソフトウェア（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＥＶＩＣＥＳ，Ｉｎｃ．）を使用してそれらの画像を処理して、１画像あたりの分岐点の数を得た。

【0095】

ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ発現の分析
ＭＩＲＶＡＮＡキット（ＡＭ１５６０、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ、テキサス州オースティン）を使用して、様々な細胞系から全ＲＮＡを抽出した。ＴＡＱＭＡＮマイクロＲＮＡアッセイ（４４２７９７５−０００２２２８、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して、Ｔａｖａｚｏｉｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４５１（７１７５）、１４７（２００８）に記載されているように成熟ｍｉＲＮＡの発現レベルを定量した。ｍＲＮＡの定量のために、ｃＤＮＡ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（１８０８０−０５１、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用して４００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写した。その後、おおよそ４ｎｇの得られたｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーンＰＣＲ ＭＡＳＴＥＲ ＭＩＸ（４３０９１５５、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）および適切なプライマー（表１）と混合した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して定量的ｍＲＮＡ発現データを得た。Ｓｍａｄ４を正規化のための内因性対照として使用した。ＴＩＳＳＵＥＳＣＡＮ ｑＰＣＲ Ａｒｒａｙ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌｓ ２および３（ＢＣＲＴ１０２ ＆ ＢＣＲＴ１０３、ＯＲＩＧＥＮＥ、メリーランド州ロックヴィル）を使用して、様々な病期におけるヒト乳癌の発現分析を行った。

【0096】

【表1】

【0097】

ｍｉＲ−１２６ターゲット予測
次の３セットのマイクロアレイプロファイルを用いることにより、可能性のあるｍｉＲ−１２６ターゲットを同定した：ｍｉＲ−１２６を過発現するＬＭ２細胞に対するＬＭ２対照細胞（ＧＳＥ番号２３９０５）、ならびにＭＤＡおよびＬＭ２細胞の２反復アレイ（ＧＳＥ番号２３９０４およびＭｉｎｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４３６（７０５０）、５１８（２００５））。これらのアレイで、次の基準を用いて、可能性のあるｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子を同定した：（１）ＬＭ２細胞においてｍｉＲ−１２６過発現により１．６倍より大きくダウンレギュレートされた遺伝子、および（２）２つのＬＭ２のうちの一方においてＭＤＡアレイに対して１．４倍より大きくアップレギュレートされた遺伝子。その後、可能性のあるすべてのターゲットをｑＰＣＲによって検証した。

【0098】

ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ
ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイは、Ｔａｖａｚｏｉｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４５１（７１７５）、１４７（２００８）に記載されているとおりに行った。簡単に言うと、ＡＢＣＢ９、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＰＳＡＴ１、ＰＹＧＢ、ＳＨＭＴ２およびＶＩＰＲ１の完全長３’ＵＴＲおよびＣＤＳをｐｓｉＣｈｅｃｋ２二重ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｃ８０２１、ＰＲＯＭＥＧＡ、ウィスコンシン州マディソン）にクローニングした。前記ＣＤＳおよび３’ＵＴＲの配列を下に列挙する。

【0099】

対照ヘアピンまたはｍｉＲ−１２６をターゲットにするヘアピンのいずれかを発現する
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にそれぞれの特異的レポーター構築物をトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後、細胞を溶解し、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｅ１９１０、ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用してウミシイタケルシフェラーゼ発現のホタルルシフェラーゼ発現に対する比を決定した。クローニングプライマー配列を下の表２に示す。

【0100】

【表2】

【0101】

遺伝子内の可能性のあるｍｉＲ−１２６部位を、相補ｍｉＲ−１２６配列５−ＴＴＡＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＧＡ−３へのアラインメントにより同定し、ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（２００５１４、ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して突然変異誘発を行った。ＵＣＳＣゲノムブラウザに基づき、ＭＥＲＴＫの３’ＵＴＲを位置５において（ＧＴＴからＣＡＣへ）突然変異させ、ＩＧＦＢＰ２の３’ＵＴＲを位置２４６において（ＧＧＴからＣＡＣへ）突然変異させ、ＰＩＴＰＮＣ１のＣＤＳを開始コドンからの位置７０９において（ＴＡＣからＧＴＡへ）突然変異させ、およびＳＨＭＴ２のＣＤＳを位置１１２６において（ＧＧＴからＣＡＣへ）突然変異させた。突然変異誘発プライマーを下の表３に示す。

【0102】

【表3】

【0103】

癌細胞増殖
対照ヘアピンまたはＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１もしくはＭＥＲＴＫをターゲットにする短鎖ヘアピンを発現するＬＭ２細胞（２．５×１０⁴）を６ウェルプレートに三重反復で播種し、播種の５日後に生細胞を計数した。

【0104】

組織学的検査
４％パラホルムアルデヒドを血管系におよび気管に灌流させる灌流固定により肺を準備した。切除後、肺を一晩、４％パラホルムアルデヒド中に置き、パラフィンに包埋した。固定の５分前に１００ｍｇのビオチン化レクチン（Ｂ−１１７５、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を尾静脈経由で循環に注射した。注射したビオチン化レクチンの検出のために、５マイクロメートル厚パラフィン切片をＭＥＣＡ−３２に対する一次抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ、アイオワ州）、ビメンチン（ＶＰ−Ｖ６８４、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）、およびＦＩＴＣ標識アビジン（Ｂ−１１７５、ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）で染色した。様々なＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ色素コンジュゲート二次抗体を使用して、一次抗体を検出した。ＺＥＩＳＳレーザー走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）を使用して蛍光を得た。転移結節の血管新生化を判定するために、ＩＭＡＧＥＪを使用してＭＥＣＡ−３２およびレクチンシグナルを定量し、その一方で、転移結節の抽出物をヒトビメンチンでの共染色によって判定した。血管に覆われた総面積を、バックグラウンド（１ピクセルの回転球半径）を引くことにより、および所定の閾値をカットオフとして用いることにより決定した。血管密度は、転移結節の全面積と比較した血管によって覆われた面積の百分率として得られる。２０００μｍ²より上の全面積を有するビメンチン染色について陽性の面積によって転移結節を定義した。

【0105】

乳房脂肪体腫瘍を切除し、２４時間、４％パラホルムアルデヒドに浸漬した。固定された組織をパラフィンに包埋し、１枚５μｍの厚さの切片にした。ＭＥＣＡ−３２に対する抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、Ｍａｃ−２に対する抗体（ＣＬ８９４２ＡＰ、Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）およびＣＤ４５に対する抗体（５５０５３９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して免疫検出を行った。様々なビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して一次抗体の検出を行った。その後、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してシグナルを増幅し、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）を使用して検出した。マウント前に、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。

【0106】

Ａｒｎｏｌｄら、２０１０ Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ ３（１−２）、５７（２０１０）に記載されているように、しかしわずかに変更して、デキストラン透過性を判定した。簡単に言うと、滅菌ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬ ローダミンＢ標識低分子量デキストラン（１×１０⁴ｋＤａ：Ｄ１８２４、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）の静脈内ボーラスを注入した。１５分後、マウスに麻酔し、肺をＯＣＴで灌流し、除去し、ドライアイスで凍結させた。１０マイクロメートル切片に切り、転移結節内のデキストラン透過性を−ビメンチン染色によって判定する場合−蛍光顕微鏡によって測定した。ＩＭＡＧＥＪを使用して、本閾値を用いてデキストラン透過性レベルを判定した。転移結節内の閾値面積の平均百分率として結果を提供する。

【0107】

ＥＬＩＳＡ
調整培地中のＩＧＢＦＰ２レベルを、ＩＧＦＢＰ２ ＥＬＩＳＡ（ＡＡＨＢＬＧ−１−２、ＲＡＹＢＩＯＴＥＣＨ、ジョージア州ノークロス（Ｎｏｒｇｒｏｓｓ））を用いて判定した。

【0108】

ウエスタンブロッティング
プロテアーゼ阻害因子を含有する１ｍＬ氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（ＲＯＣＨＥ、ドイツ国マンハイム）に細胞を溶解することにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から細胞溶解物を調製した。無血清培地中でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２４時間インキュベートすることにより調整培地を調製した。その後、その培地を回転濾過によって２０倍濃縮した。その後、４０μｇタンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ヒトＭＥＲＴＫに対するモノクローナル抗体（ＣＶＯ−３１１、ＣＡＶＥＯ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、コロラド州オーロラ）を使用してＭＥＲＴＫを検出した。

【0109】

無転移生存分析
統合分析により８つのｍｉＲ−１２６調節遺伝子を同定することで、これらの遺伝子の発現が全体としてヒト臨床的転移と相関するかどうかを判定した。ＵＣＳＦ４６、ＮＫＩ４７およびＭＳＫＣＣ１３からのシリーズの公開マイクロアレイデータを使用して、プローブレベル発現値を得た。多数のプローブによって表された遺伝子については、独立したデータセットにおいて十分なシグナル強度はもちろん、高い変動係数（情報価値が最も高い）も提示するプローブを使用した。８遺伝子の発現値のＺスコアの合計がその集団の平均より高かった場合、各乳癌をｍｉＲ−１２６シグネチャ陽性と分類した。ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭ ５ソフトウェア（ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して、カプラン・マイヤー無転移生存曲線を生成した。ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアを使用してマンテル・コックス・ログランク検定を用いて患者の生存曲線間の差についての統計学的有意性を判定した。

【0110】

血管密度分析
ｐｈｙｓｉｃｓ．ｃｓｂｓｊｕ．ｅｄｕ／ｓｔａｔｓ／ＫＳ−ｔｅｓｔ．ｈｔｍｌで公的に入手できるソフトウェアを使用して、コルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて、ＭＥＣＡ−３２染色とレクチン染色両方についての血管密度の差の有意性を判定した。

【実施例2】

【0111】

内因性Ｍｉｒ−１２６は全身転移コロニー形成を抑制した
本実施例では、ｍｉＲ−１２６機能喪失の設定で転移進行を分析するためのアッセイを行った。これにより、対照細胞とｍｉＲ−１２６ノックダウン（ＫＤ）細胞の間のインビボ転移事象を比較して、転移コロニー形成への内因性ｍｉＲ−１２６の影響を明らかにすることができる。

【0112】

ｍｉＲ−Ｚｉｐアンチセンス・ヘアピン・マイクロＲＮＡ阻害系を使用して、ｍｉＲ−１２６が安定的にノックダウンされた（９４％ノックダウン；図７）ＭＤＡ−２３１乳癌細胞系を産生させた。ｍｉＲ−１２６ ＫＤおよび対照ＫＤ細胞を免疫不全マウスに注射し、尾静脈コロニー形成アッセイで転移コロニー形成能力について評価した。低転移性細胞におけるｍｉＲ−１２６サイレンシングは、定量的生物発光イメージング（図１ａ）によって評定して肺転移コロニー形成を４．２倍増加させ（Ｐ＝０．００７３）、肉眼的組織学的検査（図１ａ）で転移コロニー形成を劇的に増加させた。さらに、ＭＤＡ ｍｉＲ−１２６ ＫＤおよび対照ＫＤ細胞の心臓内注射は、ｍｉＲ−１２６ノックダウン設定での脳および骨などの多数の器官のコロニー形成増進（図１ｂ〜ｃ；Ｐ＝０．０２３２（ｂ）、Ｐ＝０．０１１９（ｃ））によって証明されるように、全身転移を抑制する内因性ｍｉＲ−１２６を明示した。

【0113】

次に、ｍｉＲ−１２６阻害に伴って観察される転移コロニー形成の劇的増加がどの程度、腫瘍成長に対するｍｉＲ−１２６の効果に起因するのかを検査するためのアッセイを行った。このために、ｍｉＲ−１２６ ＫＤおよび対照ＫＤ細胞を免疫不全マウスの乳房脂肪体に注射し、腫瘍体積をモニターした。ｍｉＲ−１２６阻害は、転移増進に対するｍｉＲ−１２６阻害の効果より小規模である腫瘍体積の増加（３９．４％）をもたらした（図１ｄ）−これは、転移に対するｍｉＲ−１２６の効果が単に腫瘍成長抑制に対するその効果の結果でないことを示す。

【0114】

転移コロニー形成に対するこのｍｉＲＮＡの役割をよりよく理解するために、すべての転移の数およびサイズを対照およびｍｉＲ−１２６ ＫＤマウスからの肺の画像分析によって定量した（図１ｅ）。これにより、対照肺に比べてｍｉＲ−１２６ ＫＤ肺における転移結節の合計数の実質的な増加が明らかになった（１３．６±３．２対４．９±１．８；Ｐ＝０．０３）。この増加は、小結節と大結節両方について示され（図１ｅ）、他の器官への転移数の増加を反映していた（図１ｃ）。重要なこととして、結節数の増加は、小さい結節サイズのほうが大きいものより顕著であった。これは、主として、樹立した転移の成長の増加ではなく転移の開始の増加と一致する。理論に縛られるものではないが、細胞が転移ニッシェにおいて転移を開始させるような転移開始有利性をｍｉＲ−１２６サイレンシングが細胞にもたらすならば、転移形成の初期相におけるその導入は、転移結節数を低減させるはずである。これを試験するために、条件付きｔｅｔ−ｏｎシステムを使用して、このｍｉＲＮＡのサイレンシングを提示する転移性乳癌細胞（ＬＭ２）において、ｍｉＲ−１２６発現を誘導した。これと一致して、ＬＭ２細胞が肺内で血管外遊出した後（第３日）のＬＭ２細胞のｍｉＲ−１２６発現の回復は、転移コロニー形成を有意に低減させた（図１ｆ）。例えば、この転移開始初期相でのこのニッシェにおけるｍｉＲ−１２６発現の回復は、第４９日に可視化される結節数を有意に低減させた。

【0115】

上述の発見により、ｍｉＲ−１２６サイレンシングが転移形成効率を向上させて多数の転移をもたらすことが実証された。したがって、これらの発見により、内因性ｍｉＲ−１２６が転移阻害および転移コロニー形成の抑制因子であることが明らかになった。

【実施例3】

【0116】

ｍｉＲ−１２６は乳癌細胞による転移性内皮動員を抑制する
上述の発見は、ｍｉＲ−１２６サイレンシングが、転移コロニー形成中に転移細胞および初期転移に利点をもたらすことができることを示唆している。この利点の基礎を考究しているとき、肺Ｈ＆Ｅ組織切片の顕微鏡可視化に基づき、ｍｉＲ−１２６ノックダウン転移が、より高い血管密度を提示することに気づいた。これを定量するために、ＭＤＡ−２３１乳癌細胞を標識するヒトビメンチン、および対照またはｍｉＲ−１２６ ＫＤ乳癌細胞のいずれかを注射したマウスの肺における転移結節内の内皮密度の定量を可能にする内皮マーカーＭＥＣＡ−３２について、共免疫染色を行った。画像分析および定量により、ｍｉＲ−１２６ ＫＤ細胞に由来する転移のほうが有意に高い内皮密度を有することが明らかになった（図２ａ；３５％増加；Ｐ＝０．０２）。

【0117】

ｍｉＲ−１２６ ＫＤ転移における増大した内皮密度が、機能性血管を表すかどうかを判定するために、マウスの循環に糖結合レクチンを注射した後、肺を抽出し、そしてその後、その注射したレクチンについて染色した。レクチン細胞化学検査により、ｍｉＲ−１２６ノックダウン転移が機能性血管の密度増加を提示することが明らかになった（図２ｂ；３３％増加；Ｐ＝０．００１）。

【0118】

最後に、静脈灌流およびその後の低分子量デキストラン（１×１０⁴ｋＤａ）の可視化によって、ｍｉＲ−１２６が転移への血行力学的灌流を調節するかどうかを判定しようと努めた。実際、ｍｉＲ−１２６ ＫＤ転移は、対照転移に比べて有意に増加した灌流を提示した（図８；Ｐ＝０．０２）。

【0119】

したがって、これらの独立した相補的な方法により、ｍｉＲ−１２６がインビボで機能的転移性血管新生および灌流を抑制することが明らかになる。これらの発見は、血管新生進行の選択的利点を転移にもたらすｍｉＲ−１２６サイレンシングと一致する。

【実施例4】

【0120】

ｍｉｒ−１２６はインビトロで癌内皮動員を抑制する
本実施例では、観察されたｍｉＲ−１２６依存性血管新生表現型について細胞的基礎を決定しようと努めた。

【0121】

様々な癌−内皮相互作用、例えば内皮接着、内皮増殖および管腔形成、を調節するｍｉＲ−１２６の能力を、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と共培養中のＬＭ２転移細胞（元々は低転移性ＭＤＡ−２３１集団に由来する；Ｍｉｎｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４３６（７０５０）、５１８（２００５））において分析した。ｍｉＲ−１２６のサイレンシングを提示するＬＭ２細胞のｍｉＲ−１２６発現の回復は、内皮細胞への転移細胞の接着（図２ｃ）、内皮細胞の増殖（図２ｄ）、および分岐点の自動定量によって評定して管腔形成（図２ｅ）を抑制しなかった。これと一致して、ＭＤＡ−２３１細胞におけるｍｉＲ−１２６の阻害は、これらの血管新生表現型をいずれも増さなかった（図９ａ〜ｃ）。

【0122】

転移細胞への内皮細胞の動員の調節におけるｍｉＲ−１２６の役割を調査した。ボイデンチャンバーの底部に配置した転移ＬＭ２細胞は、多孔質トランスウェルインサートを通してＨＵＶＥＣＳを強力に動員し、それらの低転移性親系統と比較して有意に強化された内皮動員能力を提示した（図２ｆ）。転移細胞による内皮動員は、ｍｉＲ−１２６過発現により強力に阻害（４７％低減）された（図２ｇ）。逆に、低転移性親ＭＤＡ−２３１集団におけるｍｉＲ−１２６のノックダウンは、内皮動員を有意に増加させた（１４６％増加；図２ｇ）。ＣＮ３４ＬＭ１ａ系統、すなわち、ＣＮ３４原発性悪性集団のインビボ選択によって以前に得られた高肺転移性誘導体（Ｔａｖａｚｏｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ ４５１（７１７５）、１４７（２００８））（転移性乳癌を有する患者の胸膜液から得られた独立した原発性悪性集団Ｇｕｐｔａら、Ｎａｔｕｒｅ ４４６（７１３７）、７６５（２００７））も、その低転移性親系統と比較して有意に強化された内皮動員能力を提示した（図２ｈ）。機能獲得実験および機能喪失実験の両方が、ｍｉＲ−１２６がＣＮ３４集団による内皮動員も有意に抑制することを明示した（図２ｉ）。これらの発見により、転移性乳癌集団の重要な特徴である強化された内皮動員能力が明らかになり、内因性ｍｉＲ−１２６がこの過程の主調節因子として同定される。

【0123】

次に、内因性ｍｉＲ−１２６が、乳癌細胞への内皮動員を乳癌細胞の位置に関係なく選択的に調節することができるかどうかを判定しようと努めた。かくて、対照ヘアピンを発現するまたはｍｉＲ−１２６を過発現する転移性乳癌細胞をマウスの乳房脂肪体に埋め込んだ。サイレンシングされたｍｉＲ−１２６発現を提示する転移細胞は、乳腺において低転移性細胞に比べて高い血管密度を提示した。乳房脂肪体内の転移細胞への内皮動員は、ｍｉＲ−１２６発現によって阻害された（図２ｊ）が、低転移性細胞におけるｍｉＲ−１２６ノックダウンは、それぞれｍｅｃａ−３２染色（図２ｊ）およびレクチン染色（図１０ａ）によって判定して、乳房脂肪体内で成長する乳腺腫瘍への内皮動員および該腫瘍内の機能性血管含有量を有意に増加させた。ｍｉＲ−１２６サイレンシングは、乳房腫瘍において白血球密度（図１０ｂ）およびマクロファージ密度（図１６ｃ）を増加させなかったので、この動員効果は、内皮細胞に対して選択的であった。

【0124】

上述の発見により、ｍｉＲ−１２６は、乳癌細胞への内皮動員を乳癌細胞の解剖学的位置に関係なく選択的に調節することが明らかになった。

【実施例5】

【0125】

ｍｉｒ−１２６レギュロンは内皮動員を促進する
本実施例では、内皮動員および転移コロニー形成を媒介するｍｉＲ−１２６の分子ターゲットを同定するために系統的検索を行った。具体的には、ｍｉＲ−１２６を過発現するＬＭ２細胞のトランスクリプトーム分析を行い、低転移性ＭＤＡ−２３１細胞および高転移性ＬＭ２細胞への全転写産物変化を比較した。

【0126】

理論に縛られるものではないが、転移の阻害におけるｍｉＲ−１２６の役割にかんがみて、ｍｉＲ−１２６の生物学的媒介因子は転移細胞において発現増加を提示する、およびそれらはこのｍｉＲＮＡによって抑制されると仮定した。１セットの２３遺伝子は、ｍｉＲ−１２６過発現により抑制される（＞１．６倍、図１１；表４）、および転移細胞において親ＭＤＡ−２３１系統に比べて（＞１．４倍）アップレギュレートされる（図１１）と確認された。

【0127】

これらの遺伝子のうち１４個は、ＭＤＡ−２３１対照およびｍｉＲ−１２６ ＫＤ細胞ならびにＬＭ２対照およびｍｉＲ−１２６過発現細胞の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって有意に変化することが確証された。このリストの信頼度をさらに増すために、独立したＣＮ３４系統の転移性誘導体を試験し、８遺伝子は、多数の転移性ＣＮ３４誘導体においてそれらの親系統より有意に増加した発現を提示すると確認された（図３ａ）。

【0128】

これら８遺伝子のヒト転移への寄与を、原発性ヒト乳癌におけるそれらの過発現が遠位転移のない生存と相関するかどうかを判定することによって確かめた。原発性乳癌がそれらの過発現を提示した患者は、癌がこれらの遺伝子の過発現を提示しなかった患者より、遠位転移を発現する可能性が有意に高く、短い無転移生存を経験した（図３ｂ〜ｄ）。この関連性は、ＵＣＳＦ（ｎ＝１１７；Ｐ＜０．０１６５）、ＮＫＩ（ｎ＝２９５；Ｐ＜０．０００５）およびＭＳＫ／ＮＫＩ／ＵＣＳＦ総合コホート（ｎ＝４９４；Ｐ＜０．０００４）において有意性を提示した。例えば、ｍｉＲ−１２６は、ヒト転移再発と正の強い相関関係がある１セットの８遺伝子の発現を抑制した。

【0129】

次に、ｍｉＲ−１２６の直接ターゲットを同定するためのアッセイを行った。このために、８個すべてのｍｉＲ−１２６調節遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）およびコーディング配列（ＣＤＳ）をクローニングし、それらを使用してルシフェラーゼ融合構築物を生成した。この全セットでのルシフェラーゼ・レポーター・アッセイにより、ｍｉＲ−１２６は、ＩＧＦＢＰ２およびＭＥＲＴＫの発現をそれらの３’−ＵＴＲとの相互作用により、ならびにＰＩＴＰＮＣ１およびＳＨＭＴ２の発現をそれらのコーディング領域との相互作用により調節することが明らかになった。ＭＤＡ−２３１細胞における内因性ｍｉＲ−１２６のノックダウンが、これらのルシフェラーゼ融合遺伝子の発現を増進したからである（図３ｅおよび図１２）。ＩＧＦＢＰ２およびＭＥＲＴＫの３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１２６相補配列の突然変異は、ルシフェラーゼ発現のｍｉＲ−１２６媒介調節を無効にし（図３ｆ）、その一方でＰＩＰＮＣ１およびＳＨＭＴ２のＣＤＳの突然変異は、ｍｉＲＮＡ媒介ターゲティングを無効にした（図３ｆ）。

【0130】

【表4】

【0131】

このように、結合タンパク質ＩＧＦ結合タンパク質２、受容体キナーゼＭＥＲＴＫ、ホスファチジルイノシトール輸送タンパク質ＰＩＴＰＮＣ１、およびヒドロキシメチルトランスフェラーゼ酵素ＳＨＭＴ２は、ヒト乳癌におけるｍｉＲ−１２６の１セットの直接ターゲットを構成する。

【実施例6】

【0132】

ＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫは内皮動員および転移を促進する
本実施例では、ｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子のいずれかが癌細胞による内皮細胞の動員を調節するかどうかを検査するためのアッセイを行った。これら４遺伝子のうち、独立した短鎖ヘアピンを使用するＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫまたはＰＩＴＰＮＣ１のノックダウンは、内皮細胞を動員する転移性ＬＭ２細胞の能力を有意に抑制した（図４ａおよび図１３）。重要なこととして、これらの遺伝子のノックダウンは、結果として細胞増殖の有意な減少をもたらさなかった（図１４）。

【0133】

ｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子の内皮動員に対する頑強な効果にかんがみて、これらの遺伝子の発現レベルが、ヒト癌の転移の傾向と個々に相関するどうかを検査した。かくて、ｃＤＮＡを入手できた９６ヒト乳癌細胞の完全独立セットにおいてこれらの各々の遺伝子の発現レベルをｑＰＣＲにより分析した。

【0134】

ステージＩＩＩおよびステージＩＶ乳癌を有する患者は、局所的転移性播種および遠位転移をそれぞれ提示し、総括して、ステージＩおよびＩＩ患者よりはるかに高い率で遠位再発を発現する者を含む。興味深いことに、ＩＧＦＢＰ２（Ｐ＜０．０００３）、ＭＥＲＴＫ（Ｐ＜０．００２）およびＰＩＴＰＮＣ１（Ｐ＜０．００４）の発現レベルは、ステージＩおよびＩＩ患者に比べてステージＩＩＩおよびＩＶ患者の原発癌において個々に有意に増加された（図４ｂ）。転移細胞による内皮動員にそれらが必要であること、ならびにｍｉＲ−１２６によるそれらの直接ターゲティングにかんがみて、ｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子のいずれかが転移コロニー形成に必要とされるかどうかを判定しようと努めた。

【0135】

重要なこととして、独立した短鎖ヘアピンを使用するＩＧＦＢＰ２のノックダウンは、肺への転移コロニー形成を有意に抑制することが判明した（ｓｈ₁：１０倍；ｓｈ₂：６．２５倍；図４ｃ）。加えて、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫのノックダウンも、転移コロニー形成を有意に阻害した（ＰＩＴＰＮＣ１ｓｈ₁：７．６９倍；ＰＩＴＰＮＣ１ｓｈ₂：４．５５倍、図４ｄ；ＭＥＲＴＫｓｈ₁：３．９１倍；ＭＥＲＴＫ１ｓｈ₂：３．０８倍、図４ｅ）。使用したｓｈＲＮＡ配列を下の表５に収載する。

【0136】

これらの発見により、ｍｉＲ−１２６直接ターゲット遺伝子ＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫは、それぞれ独立して内皮動員および転移コロニー形成に必要とされ、ならびに発現の点でヒト転移進行と個々に相関することが明らかになった。

【0137】

【表5】

【実施例7】

【0138】

ＩＧＦＢＰ２は内皮細胞のＩＧＦ１／ＩＧＦ１Ｒ活性化による動員を媒介する
ｍｉＲ−１２６ターゲットのうち、ＩＧＦＢＰ２は分泌因子であり、然るが故に、転移癌細胞と内皮細胞との細胞間情報伝達を媒介する態勢が整っている。したがって、転移細胞が増加されたレベルのＩＧＦＢＰ２を分泌するかどうかを検査した。実際、ＥＬＩＳＡ分析は、転移性ＬＭ２細胞が低転移性ＭＤＡ−２３１親系統より２．１倍高いレベルのこの因子を分泌することを明示することが判明した（図５ａ）。

【0139】

ＩＧＦＢＰファミリーのメンバーは、様々なインスリン様成長因子（ＩＧＦ）との相互作用によりそれらの効果を発揮し、ＩＧＦ受容体へのそれらの結合を変調させる（Ｂａｘｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．、Ｈｏｒｍ Ｒｅｓ ４２（４−５）、１４０（１９９４）およびＪｏｎｅｓ，Ｊ．Ｉ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ １６（１）、３（１９９５））。転移性内皮動員が分泌ＩＧＦＢＰ２によって媒介されるかどうかを判定するために、ＩＧＦへのＩＧＦＢＰ２結合をＩＧＦＢＰ２中和抗体とのインキュベーションによって阻害した。

【0140】

トランスウェル動員アッセイにおけるＩＧＦＢＰ２の抗体媒介阻害は、転移細胞内皮動員をｍｉＲ−１２６過発現で得られるものに匹敵するレベルに有意に阻害すること（図５ｂ）、およびまたｍｉＲ−１２６依存性動員を防止すること（図５ｂ）が判明した。したがって、ＩＧＦＢＰ２抗体による内皮動員の阻害はｍｉＲ−１２６過発現により妨げられるので、これらの効果はｍｉＲ−１２６／ＩＧＦＢＰ２経路に特異的であった（図５ｂ）。ＩＧＦＢＰ２の抗体媒介阻害は、独立したＣＮ３４悪性系統のＣＮＬＭ１Ａ誘導体による内皮動員も抑制し、結果として、ｍｉＲ−１２６依存性内皮細胞動員の統計的に有意な低減を生じさせた（図５ｃ）。これらの発見により、分泌ＩＧＦＢＰ２が、転移細胞によるｍｉＲ−１２６依存性内皮動員のための細胞間シグナル伝達媒介因子であることが明らかになった。

【0141】

ＩＧＦＢＰ２が細胞外間隙内でＩＧＦ１およびＩＧＦ２両方を結合してそれらのシグナル伝達活性を変調させることは公知である（Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｉ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ １６（１）、３（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（１１）、４５７１（１９９６）；Ｒａｊａｒａｍ，Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ １８（６）、８０１（１９９７）；およびＨｏｆｌｉｃｈ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４３４（３）、３２９（１９９８））。どのＩＧＦがｍｉＲ−１２６依存性内皮動員を媒介するかを判定するために、ＩＧＦ１に対する遮断抗体、ＩＧＦ２に対する遮断抗体、または免疫グロブリン対照で細胞を処理した。ＩＧＦ２ではなくＩＧＦ１の抗体媒介阻害は、ｍｉＲ−１２６ノックダウンの結果として生ずる内皮動員を有意に低減させた（図５ｄ）。

【0142】

次に、ｍｉＲ−１２６依存性内皮動員を媒介する受容体を決定しようと努めた。ＩＧＦ１型受容体（ＩＧＦ１Ｒ）のＩＧＦ１Ｒ遮断抗体とのインキュベーションによる阻害は、ｍｉＲ−１２６ノックダウンの結果として生ずる内皮動員を有意に低減させたが、ＩＧＦ２Ｒ中和は効果がなかった（図５ｅ）。これらの発見により、ｍｉＲ−１２６／ＩＧＦＢＰ２／ＩＧＦ１経路が内皮細胞上のＩＧＦ１Ｒを活性化することが実証された。

【0143】

ｍｉＲ−１２６依存性動員が−癌細胞上ではなく−内皮細胞上のＩＧＦ１Ｒによって媒介されることを確かめるために、内皮動員アッセイの前にＨＵＶＥＣ内皮または癌細胞をＩＧＦ１Ｒ抗体と共にプレインキュベートした。これにより、癌細胞とのプレインキュベーションによる動員に対する効果がなかったので、内皮細胞のＩＧＦ１Ｒ抗体プレインキュベーションのみがｍｉＲ−１２６媒介内皮動員を阻害することが明らかになった（図５ｆ）。

【0144】

上述の発見は、細胞外間隙内でＩＧＦ１を結合して内皮細胞上のＩＧＦ１受容体のＩＧＦ１依存性活性化を増進するｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子ＩＧＦＢＰ２の分泌の結果として生ずる転移性内皮動員と一致する。そしてまた内皮細胞上のＩＧＦ１Ｒ活性化増進が転移性乳癌細胞への内皮移動を刺激する。このモデルと一致して、組換えＩＧＦＢＰ２タンパク質は、用量に依存して、ＩＧＦ１Ｒ依存的様式での内皮走化性（図５ｇ）および移動（図１５）の促進に、十分なものであった。

【実施例8】

【0145】

ＭＥＲＴＫはＧＡＳ６による動員を媒介する
本実施例では、他のｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫが内皮動員を媒介するメカニズムを調査するためのアッセイを行った。

【0146】

ＩＧＦＢＰ２の、この表現型を媒介する分泌ｍｉＲ−１２６依存性因子としての同定にかんがみて、癌細胞からのこの因子の分泌の調節におけるＰＩＴＰＮＣ１またはＭＥＲＴＫの役割を調査した。独立したヘアピンを用いるＰＩＴＰＮＣ１のノックダウンは、乳癌細胞からのＩＧＦＢＰ２分泌を低減させることが判明した（図６ａ）−これは、一部はＩＧＦＢＰ２分泌の正の調節により媒介される、内皮動員のＰＩＴＰＮＣ１調節と一致する。しかし、ＭＥＲＴＫのノックダウンは、ＩＧＦＢＰ２分泌減少をもたらさなかった。これは、このｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子が動員を媒介するＩＧＦＢＰ２非依存性経路を示唆している。

【0147】

ＭＥＲＴＫ受容体が動員を媒介するメカニズムを決定するために、その可溶性リガンドＧＡＳ６の癌媒介内皮動員に対する影響を試験するためのアッセイを行った。共培養系への−ヒト血清中で見いだされる生理濃度（Ｂａｌｏｇｈ，Ｉ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２５（６）、１２８０（２００５））での−組換えＧＡＳ６の添加は、ｍｉＲ−１２６依存性動員を強く低減させた（図６ｂ）。これは、ＧＡＳ６が内皮動員の阻害因子として作用することを示唆している。ＭＥＲＴＫ受容体は、細胞外ドメインが切断された膜結合および可溶性両方の形態で存在し、それ故、一般に、デコイ受容体として作用して、それを発現する細胞上でのＭＥＲＴＫ受容体活性化を負に調節すると考えられている（Ｓａｔｈｅｒ，Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ（３）、１０２６（２００７））。可溶性ＭＥＲＴＫがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の調整培地において検出された（図１６）。理論に縛られるものではないが、癌細胞から放出される可溶性ＭＥＲＴＫは、ＧＡＳ６の結合および阻害による内皮動員を促進することができる。これと一致して、組換え可溶性形態のＭＥＲＴＫ細胞外ドメイン（ＭｅｒＦｃ）の付加は、癌細胞による内皮動員の血清ＧＡＳ６媒介阻害ばかりでなく外因性阻害も抑制した（図６ｂ）。重要なこととして、この効果は、ｍｉＲ−１２６依存性であった（図６ｂ）。これらの発見は、転移細胞からの分泌ＭＥＲＴＫが、ＧＡＳ６のデコイ受容体として作用し、その結果、内皮細胞動員に対するＧＡＳ６の抑制効果を低減させることを示唆している。３つのＧＡＳ６アイソフォームを下に列挙する。

【0148】

転移細胞によって発現される組換え形態のＩＧＦＢＰ２およびＭＥＲＴＫ、ならびにヒト血清中に存在するＧＡＳ６が、内皮走化性を調節するのに十分なものであるかどうかを判定するために、内皮細胞のこれらの因子への走化性移動を定量するためのトランスウェル走化性アッセイを行った。低い、生理的用量での組換えＧＡＳ６は、組換えＩＧＦＢＰ２への内皮走化性を阻害した（図６ｃ）。重要なこととして、組換え可溶性ＭＥＲＴＫエクトドメインは、内皮走化性に対するＧＡＳ６抑制効果を抑止した（図６ｃ）。内皮細胞とＧＡＳ６のプレインキュベーションは、内皮移動に影響を及ぼさなかった。これは、ＧＡＳ６が走化性移動を阻害することを示唆している。これらの発見は、ＩＧＦＢＰ２が、ＩＧＦ１型受容体による内皮細胞への陽性移動および走化性シグナルを媒介し、その一方で可溶性ＭＥＲＴＫ受容体が、ＧＡＳ６によって媒介される阻害性走化性シグナルに拮抗することを明示する。

【0149】

インビトロでの内皮動員およびインビボでの転移コロニー形成におけるＩＧＦＰＢ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫの役割にかんがみて、これらの遺伝子がインビボ内皮動員を調節するかどうかを検査するためのアッセイを行った。このために、対照およびノックダウン乳癌細胞を注射したマウスから肺を用いてＭＥＣＡ−３２染色を行って、転移血管密度によって測定してインビボで内皮動員を定量した。独立した短鎖ヘアピンを個々に使用するＩＧＦＰＢ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫの阻害は、転移内皮密度を有意に低減させた（図６ｄ；ｓｈＩＧＦＢＰ２についてはＰ＜０．０００１およびＰ＝０．００２、ｓｈＰＩＴＰＮＣ１についてはＰ＝０．０１およびＰ＝０．０２、ならびにｓｈＭＥＲＴＫについてはＰ＜０．０００１およびＰ＝０．００５）。加えて、レクチン灌流および細胞化学検査により、機能性転移血管含有量の有意な低減も明らかになった（図１７）。したがって、インビボでの転移性内皮動員にはｍｉＲ−１２６ターゲット遺伝子ＩＧＦＢＰ２、ＰＩＴＰＮＣ１およびＭＥＲＴＫが個々に必要とされる。

【0150】

インビトロでの癌細胞媒介内皮動員および組換えタンパク質媒介動員アッセイの両方ならびにインビボ分析を含む、上述の発見により、癌によって発現されるＩＧＦＢＰ２およびＭＥＲＴＫは、内皮細胞動員の媒介に必要かつ十分なものであり、転移癌細胞から発出する平行経路に依存することが実証された（図６ｅ）。

【実施例9】

【0151】

転移性血管新生を媒介するｍｉＲＮＡレギュロン
上記発見により、癌細胞において発現されるｍｉＲＮＡは、転移性内皮動員および血管灌流の複合過程を、ＩＧＦＢＰ２、ＭＥＲＴＫおよびＰＩＴＰＮＣ１（血管新生および転移遺伝子の新規セット）の協調的調節によって非細胞自律的に調節することができることが明らかになった。

【0152】

これらの転移性血管新生遺伝子の発現増加は、低転移性細胞に比べて強化された内皮動員能力を高転移性乳癌細胞に授けることが判明した。これらの遺伝子を過発現する転移細胞は、有効なコロニー形成に必要な血管をより容易に樹立することができる。転移性内皮動員にこれらの３つすべての遺伝子が必要であることを実証したが、それらのうちの１つ、すなわち分泌ＩＧＦＢＰ２は、この表現型の経細胞媒介因子（ｔｒａｎｓ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｄｉａｔｏｒ）である。

【0153】

加えて、転移細胞内皮動員の媒介因子としてＩＧＦ１シグナル伝達経路（癌細胞によって分泌されるＩＧＦＢＰ２によって変調され、ついには内皮細胞上のＩＧＦ１Ｒが活性化する）を発見し、癌細胞中のｍｉＲ−１２６をこの経路の調節因子として同定した。生物および細胞成長におけるＩＧＦ１およびＩＧＦ２の役割は報告されている（Ｌａｖｉｏｌａ，Ｌ．ら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ １３（７）、６６３（２００７）およびＶａｒｅｌａ−Ｎｉｅｔｏ，Ｉ．ら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ １３（７）、６８７（２００７））が、様々な組織におけるこれらの成長因子およびそれらの受容体の偏在的発現、ならびに正常な生理にそれらが必要とされることが、それらの治療的応用を制限している（Ｖａｒｅｌａ−Ｎｉｅｔｏ，Ｉ．ら、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ １３（７）、６８７（２００７））。

【0154】

ＩＧＦＢＰ２は、ＩＧＦＢＰファミリーの１６のメンバーのうちの１つである；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｃ．、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ １９（５）、４４５（１９９５）；Ｈｗａ，Ｖ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ ２０（６）、７６１（１９９９）；およびＦｉｒｔｈ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ ２３（６）、８２４（２００２）参照。ＩＧＦＢＰ２の転移の促進因子としての同定、転移性ヒト乳癌におけるその過発現、および転移細胞による内皮動員に対するその抗体媒介阻害の頑強な効果が、乳癌進行および癌血管新生におけるＩＧＦ経路の治療ターゲティングに特異的ハンドルをもたらす。

【0155】

ＩＧＦＢＰ２がこの過程の正の調節因子（ＩＧＦ１）のその活性化による内皮動員の正の調節因子と確認された一方で、ＭＥＲＴＫもまた、内皮走化性の負の調節因子（ＧＡＳ６）のその阻害による動員の促進因子と分かった。したがって、単一のｍｉＲＮＡが、現象の正と負両方の調節因子を変調させることにより、複雑な表現型を制御することができる。

【0156】

転移抑制因子ｍｉＲＮＡとしてのその同定の後、内皮細胞において発達の過程で発現されるｍｉＲ−１２６に対する遺伝子ターゲティングをマウスにおいて行った。ｍｉＲ−１２６欠失は、部分的胚致死、血管完全性の喪失、および出血につながることが判明した（Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １５（２）、２６１（２００８））。かくて、内皮で発現されるｍｉＲ−２１６は、マウスおよびゼブラフィッシュ系において正常な発達の血管新生の促進因子であることが判明した（Ｎｉｃｏｌｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４６４（７２９２）、１１９６（２０１０）およびＦｉｓｈ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １５（２）、２７２（２００８））。

【0157】

血管新生促進因子としてのその役割にかんがみて、ｍｉＲ−１２６はまた、本明細書に開示するような、例えば乳癌における、血管新生を抑制することができると予想された。ｍｉＲ−１２６は、少なくとも２つの異なる方法で作用し得ると予想された。一方では、本願に開示するような病的血管新生を抑制するような細胞タイプ特異的様式で作用する。本願に開示するように、ｍｉＲ−１２６は、転移への病的内皮移動を抑制した。もう一方では、発達している間、ｍｉＲ−１２６発現は血管完全性を維持する。実際、内皮ｍｉＲ−１２６は、乳癌細胞においてｍｉＲ−１２６によって有意に調節されない遺伝子であるＳｐｒｅｄ−１およびＰＩＫ３Ｒ２のターゲティングによって、発達の血管新生を調節することが証明された（Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １５（２）、２６１（２００８）およびＦｉｓｈ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ １５（２）、２７２（２００８））。表６参照。逆に、内皮細胞におけるｍｉＲ−１２６阻害は、内皮細胞による内皮動員を増進せず（図１８）、乳癌細胞においても同様であることが判明した。これと一致して、内皮細胞におけるｍｉＲ１２６阻害は、ＰＩＴＰＮＣ１、ＭＥＲＴＫまたはＩＧＦＢＰ２の発現を変更しなかったが、確定された内皮ｍｉＲ−１２６ターゲットＳＰＲＥＤ１およびＰＩＫ３Ｒ２の発現を増加した（図１９）。

【0158】

【表6】

【実施例10】

【0159】

任意の体組織の転移癌コロニー形成を調節する遺伝子またはノンコーディングＲＮＡの同定
本実施例は、体組織の転移癌コロニー形成を調節する遺伝子またはノンコーディングＲＮＡを同定するための２つのアプローチを記載するものである。
１． レンチ−ｍｉＲアプローチ
レンチ−ｍｉＲライブラリーの細胞への形質導入および動物への注射
レンチ−ｍｉＲライブラリー（ＳＹＳＴＥＭ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｃａｔ ＃ ＰＭＩＲＨＰＬＶＡＨＴ−１）をこのアプローチでは使用した。このライブラリーは、全ヒトゲノムを代表する前駆体マイクロＲＮＡを含有するレンチウイルスのプールから成る。ＳＷ６２０およびＬＳ１７４Ｔ細胞系の親集団（２×１０⁵細胞）に前記ライブラリーを１の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入して、個々の細胞が異なるマイクロＲＮＡを過発現する親細胞の不均一プールを得た。形質導入後、各マイクロＲＮＡ前駆体がおおよそ５０Ｘで提示された。形質導入の４日後、形質導入細胞の半分を取っておいて、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットを使用してゲノムＤＮＡを抽出した。これは、肝臓コロニー形成の選択圧前のゲノムＤＮＡの参照プールであった。その残りの半分の集団をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肝臓に注射した。注射の３〜５週間後、それらの肝臓において形成された腫瘍からゲノムＤＮＡを抽出した。形質導入および注射を両方の細胞系に反復して行った。

【0160】

肝臓コロニー形成を変調させるマイクロＲＮＡの同定
ライブラリー特異的Ｔ７促進因子含有プライマー（フォワードプライマー：５’−ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣ ＧＣＴＧ −３’；リバースプライマー：５’：ＧＡＴＧＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣ−３’）を使用する参照ゲノムＤＮＡおよび腫瘍ゲノムＤＮＡに対する線形範囲内のＰＣＲ増幅により、ゲノムＤＮＡからレンチ−ｍｉＲ由来のマイクロＲＮＡ前駆体を回収した。４００ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、１試料につき４回のＰＣＲ反応を行い、プールして、形質導入前駆体マイクロＲＮＡの妥当な提示を確保した。

【0161】

得られたＰＣＲアンプリコンは、異なる前駆体マイクロＲＮＡとＴ７促進因子配列の混成体であり、それらをインビトロ転写にテンプレートとして使用して、ビオチン化前駆体ライブラリーを得た。参照プールおよび腫瘍から得たビオチン化ライブラリーをＣｙ３およびＣｙ５でそれぞれ標識し、マイクロＲＮＡ配列を検出するために設計されたマイクロアレイ（Ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）にハイブリダイズさせた。ダイスワップ実験を行って、色素バイアスを制御した。

【0162】

参照プールと肝臓コロニー形成中の選択圧後のものとの各マイクロＲＮＡ前駆体の存在量の比を、マイクロアレイシグナルの正規化後に計算した。参照プールと比較して腫瘍集団において過剰提示されたマイクロＲＮＡを促進因子と見なし、過小提示されたマイクロＲＮＡを肝臓コロニー形成の抑制因子と見なした。
２． レンチプレックス（ｌｅｎｔｉｐｌｅｘ）アプローチ
レンチプレックスライブラリーの細胞への形質導入および動物への注射
レンチプレックス全ゲノムｓｈＲＮＡライブラリー（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｃａｔ ＃ ＳＨＰＨ０１）をこのアプローチで使用した。このライブラリーは、全ヒトゲノムをターゲットにするおおよそ１５０，０００のｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスのプールライブラリーであり、３〜５個の独立したｓｈＲＮＡが各ゲノムをターゲットにする。

【0163】

細胞系ＳＷ６２０、ＬＳ１７４ＴおよびＷｉＤＲの親集団（２×１０⁶細胞）に１のＭＯＩで前記ライブラリーを形質導入し、結果として、個々の細胞が単一ｓｈＲＮＡを発現する不均一集団のプールを得た。各ｓｈＲＮＡをおおよそ１００Ｘ表示で形質導入した。形質導入の４８時間後、形質導入細胞を４８時間、ピューロマイシンで選択して、非形質導入細胞を除去した。抗生物質選択後、後続の実験の前に１週間、残りの細胞を放置して回復させた。選択された細胞の半分を取っておいて、ゲノムＤＮＡを抽出した。これは、肝臓コロニー形成の選択圧前のゲノムＤＮＡの参照プールであった。その残りの半分の集団をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肝臓に注射した。注射の３〜５週間後、それらの肝臓において形成された腫瘍からゲノムＤＮＡを抽出した。形質導入および注射を３つすべての細胞系に反復して行った。

【0164】

全ゲノムプールｓｈＲＮＡスクリーニングによる肝臓コロニー形成を変調させる新規遺伝子の同定
ゲノムＤＮＡからｓｈＲＮＡライブラリー配列の複合プールを回収するために、ＰＣＲアプローチ、続いてＰＣＲアンプリコンのＳｏｌｅｘａディープシークエンシングを用いた。ウイルスベクターに特異的なプライマー（フォワードプライマー：５’−ＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴ−３’；リバースプライマー：５’−ＡＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴ−３’）を使用し、続いてＳｏｌｅｘａディープシークエンシングに必要とされる配列を有するプライマー（フォワードプライマー：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ
ＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣ−３’；リバースプライマー：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡ−３’）を使用して５００ｎｇのゲノムＤＮＡに対する初期ＰＣＲ増幅を行って、ｓｈＲＮＡ配列を含有するアンプリコンを得た。５ｕｇのゲノムＤＮＡと等価の１０のＰＣＲ反応をゲノムＤＮＡの各セットについて行い、シークエンシングのためにそれらの産物をプールして、ｓｈＲＮＡの妥当な提示を確保した。

【0165】

プールしたアンプリコンは、ゲノム全体のｓｈＲＮＡ配列の混成体に相当し、ディープシークエンシングを行って、腫瘍から増幅したプールと比較して参照プールにおける各ｓｈＲＮＡ種の提示を判定した。各ｓｈＲＮＡ種についての計数値を、得られた配列の合計数に対して正規化し、それらの遺伝子ターゲットを、Ｓｉｇｍａによって提供されているデータベースへのマッチングによって同定した。ｓｈＲＮＡが腫瘍プールにおいて過剰表示された遺伝子ターゲットを肝臓コロニー形成の抑制因子と見なし、逆もまた同じである。ｓｈＲＮＡサイレンシングの非特異的効果を説明するために、３以上の独立したｓｈＲＮＡ「ヒット」によって同定された遺伝子ターゲットのヒットのみを推定抑制因子または促進因子と見なした。

【実施例11】

【0166】

ＩＧＦＢＰ２機能を中和するモノクローナル抗体は転移性ヒト乳癌細胞による内皮動員を阻害した
本実施例は、ＩＧＦＢＰ２に結合してＩＧＦＢＰ２へのＩＧＦ１の相互作用（結合）を阻害することにより転移性乳癌細胞による内皮動員を阻害するモノクローナル抗体を実証する。ＩＧＦＢＰ２へのＩＧＦ１結合を遮断することにより、このモノクローナル抗体は、転移性ヒト乳癌細胞による内皮動員を阻害できる。ＩＧＦＢＰ２に対する中和抗体の産生に用いる方法は、当該技術分野において一般に公知のものである。
要するに、マウスを組換えＩＧＦＢＰ２全ペプチドで免疫してポリクローナル抗体応答を生じさせた。次に、その免疫処置マウスから単離したＢ細胞の骨髄腫細胞系への融合により、ハイブリドーマライブラリーを産生させた。その後、これらのハイブリドーマからの上清を単離して、抗体捕捉競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＩＧＦＢＰ２を高親和性で結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、同定した（図２０）。同定したら、抗体捕捉競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＩＧＦＢＰ２に対して高い親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングして、ＩＧＦＢＰ２がＩＧＦ１を結合するのを阻害できる抗体を産生するものを同定した（図２１）。ハイブリドーマライブラリーｗｏ６６６３−１は、ＩＧＦＢＰ２に結合してＩＧＦ１結合を中和する抗体であって、他のＩＧＦＢＰファミリーメンバーＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢＰ４には結合しない抗体を含有した（図２０および２１）。単一クローン（モノクローナル）ハイブリドーマ細胞を単離するために、ハイブリドーマライブラリーｗｏ６６６３−１に対する分離およびスクリーニングを行った。２０００個の単一ハイブリドーマクローン（モノクローナル）をこのライブラリーからスクリーニングして、高親和性でＩＧＦＢＰ２に結合してＩＧＦ１結合を中和するモノクローナル抗体を産生するものを同定した。図２２中の表は、上のスクリーニングからの幾つかのモノクローナル抗体であって、モノクローナル抗体ＩＧＦＢＰ２＿１４（Ｍ１４）（図２２中の断続線囲み枠）を含めて、その多くがＩＧＦＢＰ２への親和性を有し、ＩＧＦＢＰ２へのＩＧＦ１結合を阻害した（図２２）モノクローナル抗体についての抗体捕捉ＥＬＩＳＡ競合因子アッセイデータを収載するものである。その後、トランスウェル内皮動員アッセイを用いて、これらのＩＧＦＢＰ２中和モノクローナル抗体をスクリーニングして、転移細胞による内皮動員を阻害できるものを同定した。モノクローナル抗体ＩＧＦＢＰ２＿Ｍ１４（Ｍ１４）は、ヒト転移性乳癌細胞による内皮動員を阻害した：
内皮動員を阻害し得るモノクローナル抗体を同定するために、上記スクリーニングで産生されたＩＧＦＢＰ２中和モノクローナル抗体を、トランスウェルを用いるインビトロ内皮動員アッセイで試験した。高転移性ＬＭ２ヒト乳癌細胞をボイデンチャンバーの底部に配置し、そこで多孔質トランスウェルインサートを通ってＨＵＶＥＣＳを動員するそれらの能力をアッセイした。少量の生理濃度のＩＧＦＢＰ２中和抗体（Ｍ１、Ｍ４、Ｍ６、Ｍ９、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５およびＭ１６を含む（図２２から））をトランスウェルに生理濃度で個々に添加した。試験したすべての抗体のうち、Ｍ１４（図２２中の断続線囲み枠）は、陰性対照抗体ＩｇＧおよびＭ５に対してＨＵＶＥＣ細胞の動員（移動細胞／視野）を有意に阻害できた（移動細胞の５０％低減）（図２３）。これは、ヒト転移癌細胞によるヒト内皮細胞動員を阻害するモノクローナル抗体Ｍ１４の能力を実証する（図２３）。

【0167】

Ｍ１４をさらに特性づけするために、該抗体の重鎖および軽鎖可変領域をシークエンシングした。Ｍ１４の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方のアミノ酸配列を表７に提供する。

【0168】

【表7】

【実施例12】

【0169】

モノクローナルＭ１４はインビボでヒト乳癌の腫瘍進行を阻害した。

【0170】

本実施例は、ＩＧＦＢＰ２中和抗体Ｍ１４がヒト乳癌のマウスモデルにおいてインビボで腫瘍進行および腫瘍転移を阻害できることを実証するものである。

【0171】

モノクローナル抗体Ｍ１４が、インビボで腫瘍量を低減できるかどうかおよび腫瘍進行を阻害できるかどうかを試験するために、２０００個のルシフェラーゼ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を成長因子低減マトリゲルと１：１比で混合し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの乳房脂肪体の両側に注射した。注射後直ちにルシフェリンを注射し、癌細胞生物発光シグナルを定量して、腫瘍量の第０日ベースラインシグナルを確立した。その後、マウスを無作為に次の二群に分けた：ＰＢＳのみで処置した対照群、およびＭ１４モノクローナル抗体で処置したＭ１４群。ＰＢＳおよびＭ１４抗体（２５０マイクログラム）の腹腔内注射を第０日に直ちに各群のマウスにそれぞれ施して、その後は隔週に注射を施した。Ｍ１４処置マウスとＰＢＳ処置対照マウスの両方における腫瘍量を、ルシフェラーゼレポーターからの生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｎｓｅｎｃｅ）によって週２回追跡した。第１４日の時点で、腫瘍進行は、ＰＢＳ処置マウスと比較してＭ１４での処置により有意に阻害された（腫瘍進行の７から１１倍低減）（図２４）。

【0172】

好ましい実施形態の上記実施例および説明は、本請求項によって定義される本発明を限定するものではなく、例証するものと考えるべきである。本明細書に引用するすべての出版物は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。容易に理解されるだろうが、上で述べた特徴の非常に多数の変形および組み合わせを、本請求項に示す本発明から逸脱することなく用いることができる。かかる変形は、本発明の範囲からの逸脱とは見なされず、すべてのかかる変形は、以下の請求項の範囲内に含まれると解釈される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]