特許 6178477 肺炎球菌に対する免疫用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6178477

(24)【登録日】2017年7月21日

(45)【発行日】2017年8月9日

(54)【発明の名称】肺炎球菌に対する免疫用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/09 20060101AFI20170731BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20170731BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20170731BHJP

   C07K 14/315 20060101ALN20170731BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/09

   A61K39/39

   A61P27/16

   A61P31/04

   A61P37/04

   !C07K14/315ZNA

【請求項の数】19

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2016-176369(P2016-176369)

(22)【出願日】2016年9月9日

(62)【分割の表示】特願2013-542221(P2013-542221)の分割

【原出願日】2011年12月2日

(65)【公開番号】特開2016-210806(P2016-210806A)

(43)【公開日】2016年12月15日

【審査請求日】2016年10月11日

(31)【優先権主張番号】61/510,620

(32)【優先日】2011年7月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/419,635

(32)【優先日】2010年12月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506076695

【氏名又は名称】サノフィ パストゥール リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100073184

【弁理士】

【氏名又は名称】柳田 征史

(74)【代理人】

【識別番号】100090468

【弁理士】

【氏名又は名称】佐久間 剛

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ピチチェロ

(72)【発明者】

【氏名】マルティーナ オックス−オノレヘムヘン

【審査官】 井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５０８４１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０８４１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０１０１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０７１９８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology，２００２年，Vol.64，p.133-141

【文献】 THE ANNALS OF OTOLOGY,RHINOLOGY AND LARYNGOLOGY，１９９０年 ８月，V99 N8，P628-632

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／０９

Ａ６１Ｋ ３９／３９

Ａ６１Ｐ ２７／１６

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ａ６１Ｐ ３７／０４

Ｃ０７Ｋ １４／３１５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

肺炎球菌感染に起因する急性中耳炎の再発を、肺炎球菌急性中耳炎の再発を生じるリスクがある患者において予防又は治療するのに使用するための組成物であって、治療上有効量の、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢおよび無毒化ニューモリシンからなる群より選択される少なくとも１つの単離および実質的に精製された免疫原性ポリペプチドまたはそれらの免疫原性断片を含み、少なくとも１回経皮的に投与される、組成物。

【請求項2】

前記患者は、６ヶ月以内に３回以上、あるいは１２ヶ月以内に４回以上、急性中耳炎の発症を経験している、請求項１記載の組成物。

【請求項3】

前記患者は、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢおよび無毒化ニューモリシンからなる群より選択される少なくとも１つの肺炎球菌抗原またはそれらの免疫原性断片に対して免疫低応答性を示す、請求項１記載の組成物。

【請求項4】

前記患者は、肺炎球菌感染に起因する急性中耳炎の発症を経験し、適切な抗生物質療法の少なくとも４８時間後に細菌の除去および／又は症状の消失を達成できなかったものである、請求項１記載の組成物。

【請求項5】

前記患者は、肺炎球菌感染に起因する急性中耳炎の発症を経験し、該急性中耳炎のための抗生物質治療コースを完了して１４日以内に急性中耳炎の症状が再発したものである、請求項１記載の組成物。

【請求項6】

前記患者は急性中耳炎に罹患している、請求項１から５いずれか１項記載の組成物。

【請求項7】

組成物の投与が、抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起する、請求項１記載の組成物。

【請求項8】

組成物の投与が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２および／又はＩＬ−１７ａを産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起する、請求項７記載の組成物。

【請求項9】

組成物の投与が、前記少なくとも１つの単離および精製された免疫原性ポリペプチドを欠く組成物の投与と比較して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２および／又はＩＬ−１７ａを産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率を高める、請求項７記載の組成物。

【請求項10】

組成物の投与が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２および／又はＩＬ−１７ａサイトカインの産生を促進する、請求項１記載の組成物。

【請求項11】

アジュバントをさらに含む、請求項１記載の組成物。

【請求項12】

肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｃｐＡおよび無毒化ニューモリシンからなる群より選択される少なくとも１つの単離および精製された免疫原性ポリペプチド、またはそれらの免疫原性断片を含む、請求項１記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｃｐＡおよび無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片を含む、請求項１記載の組成物。

【請求項14】

前記無毒化ニューモリシンは、野生型配列の第６５番目、第２９３番目および第４２８番目の位置にアミノ酸置換を含む突然変異型ニューモリシンタンパク質である、請求項１２または１３記載の組成物。

【請求項15】

前記３箇所のアミノ酸置換は、Ｔ６５→Ｃ、Ｇ２９３→ＣおよびＣ４２８→Ａを含む、請求項１４記載の組成物。

【請求項16】

ＰｈｔＤポリペプチドが、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１２または１３記載の組成物。

【請求項17】

ＰｃｐＡポリペプチドが、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１２または１３記載の組成物。

【請求項18】

ワクチンである、請求項１から１７いずれか１項記載の組成物。

【請求項19】

肺炎球菌感染に起因する急性中耳炎の再発のリスクを、肺炎球菌急性中耳炎の再発を生じるリスクがある患者において低減するのに使用するための組成物であって、治療上有効量の、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢおよび無毒化ニューモリシンからなる群より選択される少なくとも１つの単離および実質的に精製された免疫原性ポリペプチドまたはそれらの免疫原性断片を含み、少なくとも１回経皮的に投与される組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本件出願は、２０１０年１２月３日出願の米国出願第６１／４１９，６３５号と、２０１１年７月２２日出願の米国出願第６１／５１０，６２０号とに基づく優先権を主張する。いずれの出願の内容も引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。

【技術分野】

【0002】

本件明細書の開示内容は免疫学の分野に関し、より具体的には、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関する。

【背景技術】

【0003】

中耳炎は一般的な小児疾患である。「中耳炎」という用語は、鼓膜炎、滲出性中耳炎（ＯＭＥ）、慢性化膿性中耳炎及び急性中耳炎（ＡＯＭ）を含む多数の臨床疾患を包含する（非特許文献１、本明細書末尾の文献（以下、「本件文献」という。）２４）。急性中耳炎（ＡＯＭ）は、上気道症候、痛み、発熱及び耳漏を伴う症候性疾患である。急性中耳炎は世界的に最も一般的な感染症であり、多くの国における小児への過剰な抗生物質消費と、開発途上国における難聴その他の併発疾患というかなりの重荷との原因である（非特許文献２−４、本件文献１−３）。

【0004】

急性中耳炎はとても一般的で、小児の約６０−７０％は３才になるまでの間に急性中耳炎を少なくとも１回は罹患する（非特許文献５及び６、本件文献４及び５）。小児のサブ集団は再発性中耳炎を罹患する。６ヶ月以内に３回以上か、１年以内に４回以上か急性中耳炎を罹患する者は中耳炎好発性とされ、小児全体の１０−３０％を占める（非特許文献５及び６、本件文献４及び５）。

【0005】

１種類以上の耳病原菌の鼻咽喉（ＮＰ）定着（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）は、急性中耳炎発症の必須の前提条件である。肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ （Ｓｐｎ））、無莢膜型インフルエンザ菌（ｎｏｎ−ｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ （ＮＴＨｉ））及びモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ Ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）が急性中耳炎の最も一般的な耳病原菌で、これら３種類の菌のうち、肺炎球菌（Ｓｐｎ）が優占的である（非特許文献７、本件文献６）。ＮＴＨｉの定着頻度と、急性中耳炎発症頻度とに直接的な関連があることは知られている（非特許文献８）。

【0006】

好発性急性中耳炎の現行の治療法は、抗生物質耐性が増強中の細菌が原因であるとの推測にもとづいて、より強い異なる抗生物質を用いる。６ヶ月に３回又は１２ヶ月に４回の頻度で再発するときは、鼓膜換気チューブ手術が、単独で、あるいは、アデノイド及び／又は扁桃腺切除術と同時に実施されることがしばしばある。

【0007】

予防策に関し、現在利用可能な肺炎球菌ワクチンは２つのタイプがある。第１タイプは、肺炎球菌感染の原因菌株のうち合計約９０％の莢膜タイプを占める、２３種類の莢膜多糖類を含む。しかし、２才未満の小児は多糖類抗原に対して強い免疫応答を惹起しないため、このワクチンは幼児では免疫原性があまり強くない（非特許文献９−１１）。このワクチンは中耳炎予防には推奨されない。

【0008】

結合型ワクチンは肺炎球菌ワクチンの第２の利用可能なタイプである。タンパク質担体に結合された血清型特異的莢膜多糖類抗原を含むこれらのワクチンは血清型特異的な保護を惹起する。現在利用可能なものは、７価及び１３価結合型ワクチンであり、７価は（血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆの莢膜由来の）７種類の多糖類抗原を含み、１３価結合型は（１、３、５、６Ａ、７Ｆ及び１９Ａの血清型の莢膜と、前記７価結合型によりカバーされる血清型の莢膜とに由来する）１３種類の多糖類抗原を含む。９価及び１１価の結合型ワクチンも開発されており、それぞれは、前記７価ワクチンの血清型に追加の血清型（すなわち、９価ワクチンでは血清型１及び５、１１価ワクチンでは血清型３及び７Ｆ）に特異的な多糖類を含む。

【0009】

しかし、結合型ワクチンには限界がある。例えば、かかるワクチンは血清型特異的な保護を惹起するので、開発途上地域で優占的な血清型を含む追加の肺炎球菌血清型に対する保護を得るためには、追加の血清型特異的多糖類を含まなければならず、製造がより困難になる（非特許文献１２及び１３）。前記７価結合型ワクチンの使用も、当該ワクチンに含まれる多糖類によってカバーされない莢膜型の菌株の定着及び疾患の増大をもたらしてきた（非特許文献１４―１６）。肺炎球菌性中耳炎について、利用可能な結合型ワクチンは、侵襲性疾患の場合と同程度には疾患に対する保護がうまくいかない。さらに、急性中耳炎再発はワクチン接種後もまだ起こりうる。例えば、急性中耳炎再発を特に起こしやすいサブ集団の小児は、結合型ワクチン免疫にもかかわらず、多数回の再発を罹患し、引き続き中耳炎好発性になる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Faden H. The microbiologic and immunologic basis for recurrent otitis media in children. Eur.J.Pediatr. 2001;160(7):407-13.

【非特許文献2】Pichichero ME. Recurrent and persistent otitis media. Pediatr.Infect.Dis.J. 2000;19(9):911-6.

【非特許文献3】Pichichero ME, Casey JR. Otitis media. Expert.Opin.Pharmacother. 2002;3(8):1073-90.

【非特許文献4】Vergison A, Dagan R, Arguedas A, Bonhoeffer J, Cohen R, Dhooge I et al. Otitis media and its consequences: beyond the earache. Lancet Infect.Dis. 2010;10(3):195-203.

【非特許文献5】Teele DW, Klein JO, Rosner B. Epidemiology of otitis media during the first seven years of life in children in greater Boston: a prospective, cohort study. J.Infect.Dis. 1989;160(1):83-94.

【非特許文献6】Poehling KA, Szilagyi PG, Grijalva CG, Martin SW, LaFleur B, Mitchel E et al. Reduction of frequent otitis media and pressure-equalizing tube insertions in children after introduction of pneumococcal conjugate vaccine. Pediatrics 2007;119(4):707-15.

【非特許文献7】Del Beccaro MA, Mendelman PM, Inglis AF, Richardson MA, Duncan NO, Clausen CR et al. Bacteriology of acute otitis media: a new perspective. J.Pediatr. 1992;120(1):81-4.

【非特許文献8】J. Infect Dis 170:862-866

【非特許文献9】Fedson, and Musher 2004, “Pneumococcal Polysaccharide Vaccine”, pp. 529-588

【非特許文献10】In Vaccines. S.A. Plotikin and W.A. Orenstein (eds.), W.B. Saunders and Co., Philadelphia, PA

【非特許文献11】Shapiro et. al., N. Engl. J. Med. 325:1453-1460 (1991)

【非特許文献12】Di Fabio et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 20:959-967 (2001)

【非特許文献13】Mulholland, Trop. Med. Int. Health 10:497-500 (2005)

【非特許文献14】Bogaert et al., Lancet Infect. Dis. 4:144-154 (2004)

【非特許文献15】Eskola et al., N. Engl. J. Med. 344-403-409 (2001)

【非特許文献16】Mbelle et al., J. Infect. Dis. 180:1171-1176 (1999)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

再発性肺炎球菌急性中耳炎を予防又は治療するための組成物及び方法にはなお需要がある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

罹患リスクのある患者における肺炎球菌感染を原因とする再発性急性中耳炎の予防又は治療方法が説明される。罹患リスクのある患者は、例えば、急性中耳炎の再発エピソードのある（例えば、中耳炎好発性の）乳幼児及び小児と、急性中耳炎治療に失敗したことのある者とを含む。例えば、肺炎球菌急性中耳炎発症のリスクがある患者における肺炎球菌感染を原因とする急性中耳炎再発を予防又は治療する方法であって、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される、少なくとも１種類の単離精製された免疫原性ポリペプチドを含む組成物の治療上有効量を前記患者に少なくとも１回投与することを含む、方法が提供される。一部の実施態様では、前記患者は急性中耳炎のエピソードを少なくとも１回経験している場合がある。一部の実施態様では、前記患者は、急性中耳炎のエピソードを６ヶ月以内に３回以上か、１２ヶ月以内に４回以上か経験している場合がある。一部の実施態様では、前記患者は急性中耳炎を罹患中の場合がある。

【0013】

これらの方法における、急性中耳炎の再発の予防又は治療に使用するための組成物も説明される。前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される、少なくとも１種類の免疫原性ポリペプチドを含む。

【0014】

本明細書に開示される主題は複数の利点を提供する。例えば本明細書に説明される方法は、抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞産生を惹起又は増強するのに用いられる場合がある。

【0015】

その他の特徴及び利点は、以下の発明の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明かであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児の循環血中の６種類の肺炎球菌抗原に対するＩＦＮ−γ産生ＣＤ４５ＲＡ弱陽性メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの百分率頻度を示すグラフ。棒グラフの縦軸は、抗原刺激後のＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する平均百分率値を表す。誤差棒はＳＥＭを表し、Ｐ値はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて算出された。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５。

【図1B】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児の循環血中の６種類の肺炎球菌抗原に対するＩＬ−４産生ＣＤ４５ＲＡ弱陽性メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの百分率頻度を示すグラフ。棒グラフの縦軸は、抗原刺激後のＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する平均百分率値を表す。誤差棒はＳＥＭを表し、Ｐ値はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて算出された。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５。

【図1C】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児の循環血中の６種類の肺炎球菌抗原に対するＩＬ−２産生ＣＤ４５ＲＡ弱陽性メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの百分率頻度を示すグラフ。棒グラフの縦軸は、抗原刺激後のＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する平均百分率値を表す。誤差棒はＳＥＭを表し、Ｐ値はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて算出された。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５。

【図1D】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児の循環血中の６種類の肺炎球菌抗原に対するＩＬ−１７ａ産生ＣＤ４５ＲＡ弱陽性メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの百分率頻度を示すグラフ。棒グラフの縦軸は、抗原刺激後のＣＤ６９^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する平均百分率値を表す。誤差棒はＳＥＭを表し、Ｐ値はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて算出された。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５。

【図2A】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児という２つのコホートの血清サンプル中の肺炎球菌タンパク質抗原（ＰｈｔＤ）に対するＩｇＧ応答の比較を示すグラフ。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。縦軸は幾何学的平均力価を表し、誤差棒は９５％信頼区間の上限である。

【図2B】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児という２つのコホートの血清サンプル中の肺炎球菌タンパク質抗原（ＬｙｔＢ）に対するＩｇＧ応答の比較を示すグラフ。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。縦軸は幾何学的平均力価を表し、誤差棒は９５％信頼区間の上限である。

【図2C】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児という２つのコホートの血清サンプル中の肺炎球菌タンパク質抗原（Ｐｌｙ）に対するＩｇＧ応答の比較を示すグラフ。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。縦軸は幾何学的平均力価を表し、誤差棒は９５％信頼区間の上限である。

【図2D】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児という２つのコホートの血清サンプル中の肺炎球菌タンパク質抗原（ＰｃｐＡ）に対するＩｇＧ応答の比較を示すグラフ。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。縦軸は幾何学的平均力価を表し、誤差棒は９５％信頼区間の上限である。

【図2E】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児という２つのコホートの血清サンプル中の肺炎球菌タンパク質抗原（ＰｈｔＥ）に対するＩｇＧ応答の比較を示すグラフ。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。縦軸は幾何学的平均力価を表し、誤差棒は９５％信頼区間の上限である。

【図3A】ＳＥＢに対するＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示すグラフ。耳炎非好発小児及び耳炎好発小児由来の末梢血単核細胞サンプルがＳＥＢで刺激され、ＣＤ４５ＲＡ弱陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるサイトカインＩＦＮ−γ産生が観察された。

【図3B】ＳＥＢに対するＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示すグラフ。耳炎非好発小児及び耳炎好発小児由来の末梢血単核細胞サンプルがＳＥＢで刺激され、ＣＤ４５ＲＡ弱陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるサイトカインＩＬ−４産生が観察された。

【図3C】ＳＥＢに対するＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示すグラフ。耳炎非好発小児及び耳炎好発小児由来の末梢血単核細胞サンプルがＳＥＢで刺激され、ＣＤ４５ＲＡ弱陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるサイトカインＩＬ−２産生が観察された。

【図3D】ＳＥＢに対するＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示すグラフ。耳炎非好発小児及び耳炎好発小児由来の末梢血単核細胞サンプルがＳＥＢで刺激され、ＣＤ４５ＲＡ弱陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるサイトカインＩＬ−１７ａ産生が観察された。

【図4A】耳炎好発小児３５名、急性中耳炎治療失敗小児２５名及び耳炎非好発小児３４名の急性期診察時の血清サンプル中のＰｈｔＤに対するＩｇＧ抗体の比較を示すグラフ。注：５種類のタンパク質に対する抗体濃度は全て終点力価である。線分はその両端のグループに有意差があることを示す。^＊＊＊はｐ値が０．０００１未満を示し、^＊＊はｐ値が０．００１未満を示し、^＊はｐ値が０．０５未満を示す。

【図4B】耳炎好発小児３５名、急性中耳炎治療失敗小児２５名及び耳炎非好発小児３４名の急性期診察時の血清サンプル中のＬｙｔＢに対するＩｇＧ抗体の比較を示すグラフ。注：５種類のタンパク質に対する抗体濃度は全て終点力価である。線分はその両端のグループに有意差があることを示す。^＊＊＊はｐ値が０．０００１未満を示し、^＊＊はｐ値が０．００１未満を示し、^＊はｐ値が０．０５未満を示す。

【図4C】耳炎好発小児３５名、急性中耳炎治療失敗小児２５名及び耳炎非好発小児３４名の急性期診察時の血清サンプル中のＰｃｐＡに対するＩｇＧ抗体の比較を示すグラフ。注：５種類のタンパク質に対する抗体濃度は全て終点力価である。線分はその両端のグループに有意差があることを示す。^＊＊＊はｐ値が０．０００１未満を示し、^＊＊はｐ値が０．００１未満を示し、^＊はｐ値が０．０５未満を示す。

【図4D】耳炎好発小児３５名、急性中耳炎治療失敗小児２５名及び耳炎非好発小児３４名の急性期診察時の血清サンプル中のＰｈｔＥに対するＩｇＧ抗体の比較を示すグラフ。注：５種類のタンパク質に対する抗体濃度は全て終点力価である。線分はその両端のグループに有意差があることを示す。^＊＊＊はｐ値が０．０００１未満を示し、^＊＊はｐ値が０．００１未満を示し、^＊はｐ値が０．０５未満を示す。

【図4E】耳炎好発小児３５名、急性中耳炎治療失敗小児２５名及び耳炎非好発小児３４名の急性期診察時の血清サンプル中のＰｌｙに対するＩｇＧ抗体の比較を示すグラフ。注：５種類のタンパク質に対する抗体濃度は全て終点力価である。線分はその両端のグループに有意差があることを示す。^＊＊＊はｐ値が０．０００１未満を示し、^＊＊はｐ値が０．００１未満を示し、^＊はｐ値が０．０５未満を示す。

【図5A】耳炎非好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｈｔＤに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎非好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０７、８８、６５、６１、５５及び４４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5B】耳炎非好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＬｙｔＢに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎非好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０７、８８、６５、６１、５５及び４４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5C】耳炎非好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｃｐＡに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎非好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０７、８８、６５、６１、５５及び４４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5D】耳炎非好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｈｔＥに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎非好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０７、８８、６５、６１、５５及び４４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5E】耳炎非好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｌｙＤ１に対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎非好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０７、８８、６５、６１、５５及び４４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5F】耳炎好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｈｔＤに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０、１０、９、１０、１０及び４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5G】耳炎好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＬｙｔＢに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０、１０、９、１０、１０及び４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5H】耳炎好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｃｐＡに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０、１０、９、１０、１０及び４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5I】耳炎好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｈｔＥに対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０、１０、９、１０、１０及び４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図5J】耳炎好発小児の月齢と、肺炎球菌タンパク質ＰｌｙＤ１に対するＩｇＧ抗体レベルとの比較を示すグラフ。耳炎好発小児の６、９、１２、１５、１８及び２４月の時点の血清サンプル数は、それぞれ、１０、１０、９、１０、１０及び４であった。ＬｙｔＢ（ｐ＜０．０７）以外のタンパク質に対する耳炎非好発小児ＩｇＧ血清抗体の経時的な相対的増大について有意差が認められるが、耳炎好発小児では有意差が認められなかった（ＰｈｔＤにつきｐ＝０．４０、ＬｙｔＢにつきｐ＝０．３９、ＰｃｐＡにつきｐ＝０．１１、ＰｈｔＥにつきｐ＝０．０９、Ｐｌｙにつきｐ＝０．４２）。

【図6A】抗原特異的メモリーＢ細胞の百分率頻度を示すグラフ。

【図6B】耳炎非好発小児及び耳炎好発小児の血清サンプル注の肺炎球菌抗原５種類に対するＩｇＧ応答の比較を示すグラフ。縦軸は幾何学的平均力価を表し誤差棒は９５％信頼区間の上限である。

【図6C】循環血中ＰｈｔＤ特異的メモリーＢ細胞の百分率頻度（横軸）と、血清中のＰｈｔＤ特異的ＩｇＧ濃度（縦軸）との相関を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0017】

罹患リスクのある患者（例えば小児）における肺炎球菌感染による急性中耳炎の再発を予防及び／又は治療するための方法が説明される。急性中耳炎の再発を予防及び／又は治療するために本方法で使用される組成物も説明される。前記組成物は、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化されたニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される肺炎球菌の少なくとも１種類の免疫原性ポリペプチドを含む。これらの方法及び組成物は以下にさらに説明される。

【0018】

提供される予防及び治療方法は、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化されたニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される肺炎球菌の少なくとも１種類の単離精製免疫原性ポリペプチドを含む組成物（例えば、医薬組成物）の治療上有効量を少なくとも１回肺炎球菌急性中耳炎再発（すなわち、急性中耳炎再発をもたらす症候性肺炎球菌感染）を発症するリスクのある患者に投与することを含む。

【0019】

罹患リスクのある患者集団は、例えば、生まれてから少なくとも１回、２回、３回、４回又は５回以上の急性中耳炎エピソードを有する乳児及び小児と、耳炎好発性の（すなわち、６ヶ月以内に３回以上の急性中耳炎エピソードを有するか、１年以内に４回以上のエピソードを有する）乳児及び小児と、急性中耳炎治療に失敗した乳児及び小児（すなわち、適切な抗生物質療法の少なくとも４８時間後に除菌及び／又は症状の解消を達成できない急性中耳炎を罹患している乳児及び小児か、抗生物質治療コースの完了から１４日以内に急性中耳炎の徴候及び症状が再発した乳児及び小児か）とを含む。罹患リスクのある患者集団は、例えば、再発性急性中耳炎の遺伝的傾向を有する乳児及び小児（Casselbrant ML et al JAMA 1999; 282:2125-2130）と、自宅以外の託児所に通う乳児及び小児と、個人保育所に通う乳児及び小児と、親／介護者の１人以上が喫煙者である乳児及び小児と、おしゃぶりを使う乳児及び小児と、母乳よりも粉ミルクで哺育される乳児及び小児と、生後６ヶ月以内に急性中耳炎感染を経験した乳児及び小児（Bentdal et al Int. J. Ped. Otorhinolaryngol. 2007; 71:1251-1259）とを含む。小児が成長するにつれて、耳管の解剖学的な変化のために急性中耳炎を発症しにくくなる。通常は、耳炎好発性の小児は３才ないし５才頃にその傾向性を「卒業」する（本件文献４０及び４８−５１）。一部の実施態様では、患者は肺炎球菌急性中耳炎を発症しているか、あるいは、発症するリスクを有する。

【0020】

本明細書の実施例に説明されるとおり、耳炎好発性の小児（すなわち、罹患リスクのある患者の集団）は、耳炎非好発性の小児と比べると、肺炎球菌抗原（例えば、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ、Ｐｌｙ）に対して免疫応答が弱い。例えば、耳炎好発性の小児は肺炎球菌抗原特異的な機能するメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞（例えば、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ又はＰｌｙに特異的な機能するメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞）が耳炎非好発性の小児と比べて欠如又は低減しており、肺炎球菌抗原（例えば、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ、Ｐｌｙ）に対する血清ＩｇＧレベルが低下している。しかし、これらの小児は、機能するメモリーＴ細胞全体か、ワクチン抗原に対するＢ細胞介在抗体応答の惹起かが欠損しているのではない。急性中耳炎治療失敗（ＡＯＭＴＦ）の小児は、耳炎好発性の小児と免疫学的に類似した挙動をしめす。罹患リスクのある患者は、例えばＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び／又はＰｌｙのような肺炎球菌抗体に対してかかる免疫学的低応答を示す者である。

【0021】

本明細書に用いられるところの、患者における急性中耳炎の再発予防とは、肺炎球菌急性中耳炎の再発罹患から患者を保護するために、該患者に本明細書に説明される組成物の治療上有効量を投与することを意味する意図である。

【0022】

本明細書で用いられるところの、急性中耳炎の再発（か、耳炎好発性患者又は再発性急性中耳炎患者か）の治療とは、病状（例えば急性中耳炎）又は疾患（例えば急性中耳炎）の徴候を治癒、平癒、軽減、緩和、変化、救済、向上、改善又は影響を与えることを目的として、肺炎球菌を原因とする急性中耳炎を現に罹患している患者か、肺炎球菌に曝露されてきて、過去に急性中耳炎を罹患した患者かに、本明細書に説明される組成物の治療上有効量を投与することを意味する意図である。

【0023】

治療上有効量とは、ある病状及び投与方法のために治療効果を与える量をさす。治療上有効量は、患者の特徴（年齢、体重、性別、病状、合併症、他の疾患等）に基づいて通常の技量を有する医療従事者によって決定できる。さらに治療上有効量は、当該組成物の投与経路によって影響されるであろう。

【0024】

一部の実施例では、前記組成物の投与は抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起又は増強する。産生が惹起又は増強される抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１７ａのサイトカイン産生細胞の場合がある。例えば、１つの実施態様では、前記組成物の投与は、ＩＦＮ−γを産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起又は増強する。本明細書で用いられるところの「抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起又は増強する」とは、抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の量又は百分率（％）が増大することを意味する意図である。細胞の数は、前記組成物の投与直前に存在した細胞の数と比較して、例えば、２５％、３０％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又はそれ以上増加する場合がある。

【0025】

１つの実施態様では前記組成物の投与は、抗原特異的抗体（例えばＩｇＧ）産生を惹起又は増強する。抗体産生を惹起又は増強することにより、抗原特異的ＩｇＧの総量の全濃度（力価）は、投与直前に存在した濃度（力価）と比較して、増大する。終点力価は、前記組成物の投与直前に存在した力価と比較して、例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％又はそれ以上増大する場合がある。１つの実施態様では抗原特異的ＩｇＧ力価は、前記組成物の投与直前に存在した力価と比較して、例えば、２倍、３倍又は４倍増大する。

【0026】

罹患リスクのある患者（例えば小児）における急性中耳炎再発のリスクを低減する方法であって、開示される免疫原性ポリペプチドの１種類以上を含む組成物を前記患者に投与することを含む、方法も開示される。かかる再発のリスクは、本明細書に説明される方法によって低減される場合がある。

【0027】

特定の実施態様では、罹患リスクのある患者（すなわち、少なくとも１回以上の急性中耳炎の再発エピソードのある患者）における耳炎好発症状を予防又は治療する方法が提供される。

【0028】

本件明細書の開示内容は、本明細書に説明される組成物を投与することによって、罹患リスクのある患者における免疫応答を惹起する方法も提供する。これは、前記患者の免疫システムに少なくとも１種類の免疫原性ポリペプチドを曝露する効果のある組成物の薬学的に許容可能な製剤を投与することによって達成される場合がある。

【0029】

本件明細書の開示内容は、例えばワクチン組成物のような組成物中に１種類以上の免疫原性肺炎球菌ポリペプチドを使用することも提供する。患者（例えばほ乳類）に投与されると、かかる組成物は、前記組成物に含まれる前記免疫原性ポリペプチド（すなわち抗原）に対して向けられる免疫応答を誘導又は増強する。この応答は、（例えばＢ細胞の刺激を介して）抗体の生成か、Ｔ細胞系応答（例えば細胞傷害性応答）かを含む場合がある。これらの応答は、保護又は中和する場合もそうでない場合もある。保護的又は中和的な免疫応答は、前記抗原に対応する（例えば、該抗原が由来した）感染生物にとっては有害で、患者にとっては（感染を低減又は予防することにより）有益なものである。本明細書に用いられるところの保護的又は中和的な抗体は、野生型肺炎球菌ポリペプチドに反応して、患者（例えば、ほ乳類）でテストされるとき、対応する肺炎球菌菌体又は対応する野生型肺炎球菌ポリペプチドの致死性を低減又は阻害する場合がある。患者に投与されると保護的又は中和的な免疫応答をもたらす免疫学的な組成物は、ワクチンと考えられる場合がある。本明細書に説明される組成物は、罹患リスクのある患者における急性中耳炎再発を予防又は治療する方法に用途が見出されるが、上記のとおり定義されるところの前記患者は、肺炎球菌に感染し、急性中耳炎再発を発症するリスクがある。前記組成物は、再発性急性中耳炎の予防又は治療方法にも用途が見出される。

【0030】

本明細書に説明される組成物は、例えば、経皮的（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ、例えば筋注、静注、腹腔内又は皮下）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、粘膜（例えば経鼻）又は局所的のような適切な経路により、当業者により適切に定められる量及び用法で投与される場合がある。例えば、１００ｎｇ−５００μｇ、１−２４０μｇ、１０−１００μｇ、５−５０μｇ又は１０−２５μｇの免疫原性ポリペプチドが１回投与量あたりに投与される場合がある。予防又は治療の目的のためには、ワクチンは１回又は複数回投与される場合がある。例えばワクチンは、１回、２回、３回又は４回投与される場合がある。１つの実施例では、１回以上の投与が、いわゆるプライムブーストプロトコールの一部として行われる場合がある。複数回投与のときには、各回の投与は、例えば、１週間、１ヶ月又は数ヶ月離して行われる場合がある。

【0031】

本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドは免疫原活性がある。「免疫原活性」という用語は、患者（例えば哺乳類）において免疫学的応答を惹起するポリペプチドの能力をさす。ポリペプチドに対する免疫学的応答は、該ポリペプチドに対する細胞免疫応答及び／又は抗体を介する免疫応答が動物体内で発生することである。通常は、免疫応答は、前記ポリペプチドの１つ以上のエピトープに向けられた抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞の産生という効果の１つ以上を含むが、これらに限られない。「エピトープ」という用語は、抗体が産生されるように特異的Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位をさす。免疫原活性は保護的な場合がある。「保護的免疫原活性」という用語は、肺炎球菌による感染を予防又は阻害する（例えば、急性中耳炎の再発を起こす肺炎球菌による感染を阻害する）患者の体内での免疫学的応答を惹起するポリペプチドの能力をさす。

【0032】

一部の実施態様では、２種類、３種類、４種類又はそれ以上の免疫原性ポリペプチドを含む多成分組成物が、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎再発に対して保護するために処方される場合がある。かかる組成物の好ましい実施態様は、免疫原性ポリペプチドのＰｈｔＤ及びＰｃｐＡを含む。さらに好ましい組成物は、免疫原性ポリペプチドのＰｈｔＤ、ＰｃｐＡ及び無毒化ニューモリシンを含む。本明細書に説明されるように用いられる一部の好ましい多成分組成物は、国際公開第２０１１／０７５８２３号パンフレット（２０１０年１２月２０日出願、発明の名称：免疫原性組成物）に説明される。

【0033】

多成分組成物の成分は、抗原干渉を回避して、いずれかの起こりうる相乗効果を最適化するために、混合可能で、かつ、適切な量比で併用されることが好ましい。例えば、各成分の量は、１回投与量あたり約５μｇないし約５００μｇか、１回投与量あたり５μｇないし約１０μｇか、１回投与量あたり２５μｇないし約５０μｇか、１回投与量あたり５０μｇないし約１００μｇかの範囲内の場合がある。前記範囲は、１回投与量あたり抗原成分ごとに約１０μｇないし５０μｇの場合が最も好ましい。

【0034】

免疫原性ポリペプチド
前記免疫原性ポリペプチドをコード化する核酸は、限定されないが、例えば、野生型又は突然変異型の肺炎球菌菌体から単離される場合があるが、代替的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることによるか、当業者に認識される代替的な標準的技術を用いることによって、適用可能なＤＮＡ遺伝子配列（例えばｐｃｐＡ又はｐｈｔＤ）を有する肺炎球菌株のＤＮＡから直接入手される場合もある。使用することが可能な菌株は、例えば、肺炎球菌ＴＩＧＲ４株及び１４４５３株を含む。好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは肺炎球菌１４４５３株から組換え技術により得られる。

【0035】

本明細書に説明されるポリペプチドは、標準的な分子生物学的技術及び発現システムを用いて製造できる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition by Sambrook et. al., Cold Spring Harbor Press, 2001を参照せよ）。例えば、免疫原性ポリペプチドをコード化する遺伝子断片が単離され、該免疫原性ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドが（例えば、ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ系ベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．， Ｉｐｓｗｉｃｈ， マサチューセッツ州）のような）いずれかの商業的に入手可能な発現ベクターか、（例えば、ＧＳＴ系融合ベクター（Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ニュージャージー州）のような発現／精製ベクターかにクローン化され、適切な原核生物、ウイルス又は真核生物の宿主中で発現される場合がある。その後精製は、従来技術の手法によって実行されるか、商業的な発現／精製システムの場合には、製造者の指示書に従って実行される。

【0036】

代替的には、本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドは、変異体を含めて、例えば、完全固相合成（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、部分固相法（ｐａｒｔｉａｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）、断片縮合又は液相合成のような商業的に自動化された手順を用いる化学合成を通じて得られる場合がある。

【0037】

免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドは、（シグナル配列を含む場合又は含まない場合の）完全長ＰｃｐＡアミノ酸配列と、その断片と、これらの変異体とを含む。本明細書に説明される組成物に使用するのに適切なＰｃｐＡポリペプチドは、数ある中でも例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ０４７５８、ＹＰ８１７３５３、ＡＡＫ７６１９４、ＮＰ３５９５３６、ＺＰ０１８３５０２２及びＺＰ０１８３３４１９のものと、本明細書に説明されるものと、以下の実施例中のものとを含む。１つの実施態様では、ＰｃｐＡは配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列を有する。

【0038】

肺炎球菌１４４５３株ゲノム中の完全長ＰｃｐＡのアミノ酸配列が配列番号１である。好ましいＰｃｐＡポリペプチドは、配列番号１、２又は３との同一性が５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％又はこれ以上）のアミノ酸配列を含む場合がある。好ましいポリペプチドは、例えば、配列番号１、２又は３の連続するアミノ酸の少なくとも８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は配列番号１、２又は３由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号１又は２の少なくとも１個のエピトープを保持するが、配列番号１又は２のＮ末端から１個以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個又はこれ以上）、及び／又は、配列番号１又は２のＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号１又は２のＮ末端からシグナル配列を欠失する。好ましいＰｃｐＡポリペプチドは配列番号３である。

【0039】

【化1】

【0040】

【化2】

【0041】

【化3】

【0042】

ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、天然の成熟ＰｃｐＡタンパク質に存在するのが典型的な塩素結合ドメインアンカー配列を任意的に欠失する。成熟ＰｃｐＡタンパク質の塩素結合ドメインアンカーの天然配列は、国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットに配列番号５２として開示される。より具体的には免疫原性ポリペプチドは、天然ＰｃｐＡに対して、１個以上のアミノ酸置換と、約６０ないし約９９％の配列同一性又は８０、８５、９０又は９５％の同一性の間のいずれかの同一性とを有する、天然ＰｃｐＡのＮ末端領域を含む。Ｎ末端領域は、１個以上の保存的アミノ酸置換を含む場合又は含まない場合と、シグナル配列を含む場合又は含まない場合とがある、配列番号１又は２（又は国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットの配列番号１、２、３、４１又は４５）のアミノ酸配列を含む場合がある。Ｎ末端領域は、（本出願の配列表に掲載される）配列番号１、２又は３か、国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットの配列番号１、２、３又は４１かに対して、約６０％ないし約９９％の配列同一性（８０％ないし９９％の間のいずれかの同一性）を有するアミノ酸配列を含む場合がある。

【0043】

配列番号１、２又は３の免疫原性断片は、例えば、配列番号１、２又は３の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０及び１９１個のアミノ酸残基か、５個と１９１個との間のいずれかの個数のアミノ酸残基かを含む場合がある。ＰｃｐＡの免疫原性断片の例は国際公開第２００８／０２２３０２号パンフレットに開示される。

【0044】

本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドの変異体は、１個以上の保存的アミノ酸置換を含む場合がある。免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドの変異体は、配列番号１、２又は３か、これらのいずれかの断片かに対して、約５０％ないし約９９％の配列同一性（又は５０％と９９％との間のいずれかの同一性）を有するアミノ酸配列を含む。変異体は、当業者に周知の方法を用いて、免疫原としての能力について選択される。

【0045】

本明細書に説明される組成物に相応しい免疫原性ＰｈｔＸポリペプチドは、例えば、（シグナル配列を含む場合又は含まない場合の）完全長ＰｈｔＤ又はＰｈｔＥアミノ酸配列と、これらの免疫原性断片と、これらの変異体と、これらの融合タンパク質とを含む。本明細書に説明される組成物に使用するのに相応しいＰｈｔＤポリペプチドは、数あるなかでも例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ０６７６０、ＹＰ８１６３７０及びＮＰ３５８５１を含む。肺炎球菌１４４５３株ゲノム中の完全長ＰｈｔＤアミノ酸配列は配列番号４で、ＴＩＧＲ４株由来のアミノ酸配列は配列番号５である。（肺炎球菌１４４５３株ゲノム由来の）ＰｈｔＤの好ましいポリペプチドは配列番号６である。本明細書に説明される組成物に使用するのに相応しいＰｈｔＥポリペプチドは、数あるなかでも例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ０６７６１、ＹＰ８１６３７１及びＮＰ３５８５０２を含む。肺炎球菌１４４５３株ゲノム中の完全長ＰｈｔＥアミノ酸配列は配列番号７である。（肺炎球菌１４４５３株ゲノム由来の）好ましいＰｈｔＥポリペプチドは配列番号８である。

【0046】

【化4】

【0047】

【化5】

【0048】

【化6】

【0049】

【化7】

【0050】

【化8】

【0051】

免疫原性ＰｈｔＸ（例えば、ＰｈｔＤ又はＰｈｔＥ）ポリペプチドは、シグナル配列が連結した完全長タンパク質と、シグナルペプチド（例えばＮ末端の約２０個のアミノ酸）が除去された成熟完全長タンパク質と、（天然又はそれ以外、例えば合成の）ＰｈｔＸの変異体と、ＰｈｔＸの免疫原性断片（例えば、天然成熟ＰｈｔＸタンパク質に存在する少なくとも１５個又は２０個の連続するアミノ酸を含む断片）とを含む場合がある。ＰｈｔＸポリペプチドの免疫原性断片及び変異体は、対応する完全長成熟アミノ酸配列に特異的な免疫応答を惹起できる。ＰｈｔＤの免疫原性断片の例は国際公開第２００９／０１２５８８号パンフレットに開示される。

【0052】

使用するのに好ましいＰｈｔＤポリペプチドは、配列番号４、５又は６との同一性が５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％又はこれ以上）有するアミノ酸配列を含む場合がある。使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号４、５又は６の連続するアミノ酸が少なくとも８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は配列番号４、５又は６由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４、５又は６のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個又はこれ以上）のアミノ酸、及び／又は、配列番号４、５又は６のＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号４、５又は６のＮ末端からシグナル配列を欠失する。好ましいＰｈｔＤポリペプチドは配列番号６である。

【0053】

使用するのに好ましいＰｈｔＥポリペプチドは、配列番号７又は配列番号８との同一性が５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％又はこれ以上）有するアミノ酸配列を含む場合がある。使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号７又は８の連続するアミノ酸が８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は、配列番号７又は配列番号８由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７又は８の少なくとも１個のエピトープを保持するが、配列番号７又は８のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個又はこれ以上）のアミノ酸、及び／又は、配列番号７又は８のＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号７のＮ末端からシグナル配列を欠失する。好ましいＰｈｔＥポリペプチドは配列番号８である。

【0054】

免疫原性ＬｙｔＢポリペプチドは、シグナル配列が連結する完全長タンパク質と、前記シグナル配列が除去された成熟完全長タンパク質と、（天然か、その他、例えば合成由来かの）ＬｙｔＢの変異体と、ＬｙｔＢの免疫原性断片（例えば、天然成熟ＬｙｔＢタンパク質に存在する少なくとも１５又は２０個の連続するアミノ酸を含む断片）とを含む。本明細書で説明される免疫原性ＬｙｔＢポリペプチドの免疫原性変異体及び断片は、対応する完全長成熟アミノ酸配列に特異的な免疫応答を惹起することができる場合がある。本明細書に説明される組成物に使用するのに相応しいＬｙｔＢポリペプチドは、数ある中でも例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ０９０７８、ＹＰ８１６３３５、ＡＢＪ５５４０８、ＡＡＫ１９１５６、ＮＰ３５８４６１及びＡＡＫ７５０８６のものを含む。

【0055】

使用するのに好ましいＬｙｔＢポリペプチドは、配列番号９、１０又は１１との同一性が５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％又はこれ以上）を含む場合がある。使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号９、１０又は１１の少なくとも、例えば、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０個又はこれ以上の連続するアミノ酸の断片を含む場合がある。好ましい断片は配列番号９、１０又は１１のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号９又は１０の少なくとも１個のエピトープを保持するが、配列番号９、１０又は１１のＮ末端から１個以上（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個又はこれ以上）のアミノ酸、及び／又は、配列番号９又は１０のＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号１０のＮ末端からシグナル配列を欠失する。好ましいＬｙｔＢポリペプチドは配列番号１１である。

【0056】

【化9】

【0057】

【化10】

【0058】

【化11】

【0059】

ニューモリシン（Ｐｌｙ）は、繊毛運動（ｃｉｌｉａｒｙ ｂｅａｔｉｎｇ）の阻害と、上皮細胞間のタイトジャンクションの破壊とを含む、肺炎球菌の発病機序の複数のステップに関与するとされる細胞傷害活性毒素である（Hirst et al. Clinical and Experimental Immunology (2004)）。数あるなかでも例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０４ＩＮ８、Ｐ０Ｃ２Ｊ９、Ｑ７ＺＡＫ５及びＡＢＯ２１３８１を含む複数のニューモリシンが知られており、（無毒化の後）本明細書に説明される組成物に使うのに相応しいであろう。１つの実施態様では、Ｐｌｙは配列番号１２のアミノ酸配列を有する。

【0060】

免疫原性ニューモリシンポリペプチドは、シグナル配列が連結する完全長タンパク質と、前記シグナル配列が除去された成熟完全長タンパク質と、（天然か、その他、例えば合成由来かの）ニューモリシンの変異体と、ニューモリシンの免疫原性断片（天然成熟ニューモリシンタンパク質に存在する少なくとも１５又は２０個の連続するアミノ酸を含む断片）を含む場合がある。免疫原性ニューモリシンポリペプチドの免疫原性変異体及び断片は、対応する完全長成熟アミノ酸配列に特異的免疫応答を惹起できる場合がある。免疫原性ニューモリシンポリペプチドは、典型的には無毒化される、すなわち、肺炎球菌によって産生され放出される成熟野生型ニューモリシンタンパク質と比較して毒性が欠失するか、減少する。免疫原性ニューモリシンポリペプチドは、例えば、（例えばホルムアルデヒド処理を用いて）化学的にか、（例えば突然変異型で組換え技術で製造されて）遺伝学的にかのやり方で無毒化される場合がある。免疫原性無毒化ニューモリシンの好ましい例は国際公開第２０１０／０７１９８６号パンフレットに開示される。１つの実施態様では、免疫原性無毒化ニューモリシンは配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する。

【0061】

好ましいニューモリシンポリペプチドは、配列番号１２又は配列番号１３との同一性が５０％以上（例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％又はこれ以上）有するアミノ酸配列を含む場合がある。好ましいニューモリシンポリペプチドは、配列番号１２又は１３の連続するアミノ酸の少なくとも８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は、配列番号１２又は配列番号１３由来のエピトープを含む場合がある。その他の好ましい断片は、配列番号１２又は１３の少なくとも１個のエピトープを保持するが、配列番号１２又は１３のＮ末端から１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個又はこれ以上）のアミノ酸、及び／又は、配列番号１２又は１３のＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は、配列番号１２のＮ末端からシグナル配列を欠失する。好ましい免疫原性無毒化ニューモリシンポリペプチドは配列番号１３である。

【0062】

【化12】

【0063】

【化13】

【0064】

本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドの変異体は、当業者に周知の方法を用いて免疫原としての能力について選択される。かかる変異体はアミノ酸修飾を含む場合がある。例えばアミノ酸配列修正は、置換、挿入又は欠失の変化を含む。置換、欠失、挿入又はこれらのいずれかの組合せが単一の変異体で併存することは、当該変異体が免疫原性ポリペプチドであるかぎりにおいて起こってもよい。挿入は、１個以上のアミノ酸残基が、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端に融合することと、配列内部へ挿入されることとを含む。挿入は、例えば１個ないし４個の残基のオーダーで、アミノ末端又はカルボキシル末端の融合よりも短い挿入が通常であろう。欠失はタンパク質配列からの１個以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。約２個から６個を超えない残基が前記タンパク質分子内のいずれか１箇所の部位で欠失されることが典型的である。これらの変異体は前記タンパク質をコード化するＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異生成によって前記変異体をコード化するＤＮＡを作出し、その後、該ＤＮＡを組換え細胞の培養中で発現させることによって調製されるのが通常である。既知配列を有するＤＮＡの予め定められた部位に置換突然変異を作成する技術は周知で、Ｍ１３プライマー突然変異生成法及びＰＣＲ突然変異生成法を含むが、これらに限られない。アミノ酸置換は１個の残基が典型的であるが、複数の異なる部位に同時に起こる場合もある。置換変異体は、少なくとも１個の残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入される変異体である。かかる置換は、以下の表に従って実行されるのが一般的で、保存的置換という。その他は当業者に周知である。

【0065】

本明細書で用いられるところのアミノ酸置換は、保存的な場合と非保存的な場合とがある。保存的アミノ酸置換は、その位置のアミノ酸残基の大きさ、極性、電荷、疎水性又は親水性に影響がほとんど又は全くなく、特に免疫原性を低下させることがないような別のアミノ酸残基でもとのアミノ酸残基を置換することを伴う場合がある。適切な保存的アミノ酸置換は以下の表１に示される。

【0066】

【表1】

【0067】

当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に提供されるポリペプチド及び／又は断片の適切な変異体を決定することができるであろう。

【0068】

類似体は、アミノ酸配列及び／又は配列以外の修飾で天然の肺炎球菌ポリペプチドと異なる場合がある。配列以外の修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化又は糖鎖付加での変化を含む。ポリペプチドの「修飾」は、構成するアミノ酸の１個以上で化学的又は酵素的に誘導体化されるポリペプチド（又は、例えばこれらの断片のようなこれらの類似体）を含む場合がある。かかる修飾は、例えば、アセチル化と、水酸化と、メチル化と、アミド化と、糖鎖又は脂質原子団、補因子等の付加と、これらの組合せとのような、例えば、側鎖修飾、骨格修飾及びＮ末端及びＣ末端修飾を含む場合がある。本明細書に説明される修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドの生物活性を保持する場合か、生物活性が増減する場合かがある。

【0069】

２本のポリペプチドの構造的類似性は、各配列のアミノ酸はそれでも適正な順番のままでなければならないが、各配列の長さに沿って同一アミノ酸の数を最適化し、一方又は両方の配列のギャップは同一アミノ酸の数を最適化するために該アライメントをとるうえで許容されるように、（例えば候補ポリペプチドと、例えば配列番号２のポリペプチドとの）２本のポリペプチドの残基のアライメントをとることによって決定できる。候補ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較されるポリペプチドである。候補ポリペプチドは、例えば微生物から単離されるか、組換え技術を用いて産生されるか、化学的又は酵素的に合成される場合がある。

【0070】

アミノ酸配列のペアワイズ比較解析は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ法のようなグローバルなアルゴリズムを用いて実行される場合がある。代替的には、Ｔａｔｉａｎａら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ， １７４ ２４７−２５０ （１９９９））により説明され、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ウェッブサイトで入手可能なＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムＢｌａｓｔｐプログラムのような局所的アライメントアルゴリズムを用いて比較される場合がある。ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ｏｐｅｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝１、ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、ｅｘｐｅｃｔ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ＝３及びｆｉｌｔｅｒ ｏｎを含むデフォルト値が、全てのＢＬＡＳＴ２検索パラメーターについて使用される場合がある。Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムは、使用可能な別の局所アライメントのツールである（１９８８）。

【0071】

２本のアミノ酸配列の比較では、構造的類似性は、百分率の「同一性」という場合があり、あるいは、百分率の「類似性」という場合がある。「同一性」は同一アミノ酸の存在をさす。「類似性」は同一アミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在もさす。本明細書に説明されるポリペプチド内のアミノ酸についての保存的置換は、該アミノ酸が属する表１に示されるクラスの他のメンバーから選択される場合がある。

【0072】

組成物
組成物（例えばワクチン組成物）は、アジュバントとともに、あるいは、アジュバントなしに投与される場合がある。一般にアジュバントは抗原の免疫原性を増強できる物質である。アジュバントは獲得免疫及び自然免疫（例えばｔｏｌｌ様受容体）の両方で役割を果たし、その全てが理解されているわけではないさまざまなやり方で機能する場合がある。

【0073】

天然及び合成の多くの物質がアジュバントとして機能することが示されてきた。例えば、アジュバントは、鉱物塩、スクアレン混合物、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁標品、ある種の乳剤、モノホスホリルリピドＡ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼン及び誘導体、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）、サイトカインアジュバント、ＭＦ５９アジュバント、脂質アジュバント、粘膜アジュバント、一部の細菌外毒素その他の構成要素、一部のオリゴヌクレオチド、ＰＬＧ等を含むがこれらに限られない。これらのアジュバントは本明細書に説明される組成物及び方法に用いられる場合がある。

【0074】

一部の実施態様では、前記組成物は、少なくともスクアレン、水溶性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル疎水性非イオン性界面活性剤、疎水性非イオン性界面活性剤、を含む水中油乳剤を含むアジュバントの存在下で投与され、前記水中油乳剤は転相温度過程により得ることができ、油滴の体積組成（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｏｌｕｍｅ）の９０％は２００ｎｍ未満の大きさで、任意的には１５０ｎｍ未満の大きさである。かかるアジュバントは、本明細書にその全体が取り込まれる、国際公開第２００７／００６９３９号パンフレット（熱逆転可能な乳剤を含むワクチン組成物）に説明される。前記組成物は、前記スクアレン水中油乳剤に加えて、あるいは、の代わりに製品Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０−６３−６）も含む。製品Ｅ６０２０は（引用によりその全体が本明細書に取り込まれる）米国特許出願公開第２００７／００８２８７５号明細書に説明される。

【0075】

一部の実施態様では、前記組成物は、ＴＬＲアゴニスト（例えばＴＬＲ４アゴニスト）を単独で、あるいは、アジュバントとの組合せで含む。例えば前記アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニスト（例えばＴＬＡ４）と、スクアレンと、水溶性溶媒と、ポリオキシエチレンアルキルエーテルに属する非イオン性親水性界面活性剤と、熱可逆性である非イオン性疎水性界面活性剤とを含む場合がある。かかるアジュバントの例は、本明細書にその全体が取り込まれる国際公開第２００７／０８０３０８号パンフレット（熱可逆性水中油乳剤）に説明される。１つの実施態様では、前記組成物は、ＣｐＧ及びアルミニウム塩アジュバント（例えばミョウバン）との組合せでアジュバント化される。

【0076】

アルミニウム塩アジュバント（又は化合物）は、本明細書に説明される実務に使用されるアジュバントに含まれる。有用なアルミニウム塩アジュバントの例は、水酸化アルミニウム（例えば、結晶オキシ水酸化アルミニウムＡｌＯ（ＯＨ）及び水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）_３）を含む。水酸化アルミニウムは、Ａｌ^３＋イオン及び水酸基（−ＯＨ）を含むアルミニウム化合物である。水酸化アルミニウムと他のアルミニウム化合物（例えば、ヒドロキシリン酸又はヒドロキシ硫酸）との混合物で、得られる混合物が水酸基を含むアルミニウム化合物であるときは有用な場合もある。特定の実施態様では、アルミニウムアジュバントはオキシ水酸化アルミニウム（例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））である。アルミニウム塩アジュバントを含む組成物は極端な温度、すなわち、氷点（０℃）以下又は高温（例えば７０℃以上）に曝露されるべきではないことは当業者に周知であるが、かかる曝露は、安定性と、吸着した抗原及びアジュバントの両方の免疫原性とに悪影響を与える場合があるからである。

【0077】

特定の実施態様では、前記アルミニウム化合物（水酸化アルミニウムアジュバント）はリン酸で処理される。

【0078】

好ましい実施態様では、リン酸は塩の形状で水酸化アルミニウムアジュバントに添加される。リン酸イオンは、リン酸二ナトリウム一ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含むバッファー溶液により提供されることが好ましい。

【0079】

本明細書に実例が示されるとおり、好ましい実務では、前記アルミニウム化合物（例えばオキシ水酸化アルミニウム）は（例えば、国際公開第２０１１／０７５８２２号パンフレット（２０１０年１２月２０日出願、発明の名称：免疫原性組成物及び関連方法）に説明されるプロセスにより）リン酸で処理される。このプロセスでは、オキシ水酸化アルミニウムの水性懸濁液（約２０ｍｇ／ｍＬ）がリン酸バッファー溶液（例えば約４００モル／Ｌ）と混合される。リン酸の好ましい最終濃度は約２ｍＭから２０ｍＭまでである。前記混合液はバッファー（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、生理食塩水を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ）で希釈されて、オキシ水酸化アルミニウム及びリン酸（ＰＯ_４）の懸濁液を調製する。前記バッファーは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ約７．４であることが好ましい。前記懸濁液は室温で約２４時間混合される。最終懸濁液中の元素アルミニウムの濃度は、約０．２８ｍｇ／ｍＬから１．６８ｍｇ／ｍＬまでの範囲内が好ましい。元素アルミニウムの濃度は約０．５６ｍｇ／ｍＬがより好ましい。

【0080】

免疫原性ペプチド（例えばＰｃｐＡ、ＰｈｔＤ）は、単剤又は合剤で、前記処理済みの水酸化アルミニウムに吸着される場合がある。

【0081】

前記組成物は、液状が好ましい場合があるが、（常法に基づく）凍結乾燥か、（国際公開第２００９／０１２６０１号パンフレット、抗原アジュバント組成物及び方法に説明されるとおり）泡沫乾燥かの場合がある。１つの実施態様による組成物は液状である。免疫投与量は０．５ないし１．０ｍＬの体積で処方される場合がある。液体製剤は、例えば溶液又は懸濁液を含む、投与に適するいずれかの形状の場合がある。したがって前記組成物は、液体培地（例えば生理食塩水又は水）を含む場合があり、緩衝剤が添加される場合がある。

【0082】

製剤（及び組成物）のｐＨは、約６．４ないし約８．４が好ましい場合がある。ｐＨが約７．４であることがより好ましい。前記組成物の代表的なｐＨ範囲は、５−１０、例えば、５−９、５−８、５．５−９、６−７．５又は６．５−７である。前記ｐＨは緩衝剤の利用により維持される場合がある。

【0083】

免疫原性組成物の医薬製剤は、当業者に周知の１種類以上の添加剤（例えば、希釈剤、粘稠剤、緩衝剤、保存料、界面活性剤、アジュバント剤、洗剤及び／又は免疫賦活剤）を任意的に含む場合もある。適当な添加剤は、当業者に知られるとおり、抗原及びアジュバントと適合性であろう。希釈剤の例は、デンプン、セルロース、誘導体、フェノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリンのような、結合剤、崩壊剤又は分散剤を含む。医薬製剤は、抗菌剤、抗炎症剤及び麻酔剤のような１種類以上の活性成分を含む場合もある。洗剤の例は、Ｔｗｅｅｎ８０のようなＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含む。前記組成物に含まれるのに好ましい添加剤は当業者に知られている。

【0084】

アジュバントを用いる免疫の１つの実施態様では、例えば、免疫原性のポリペプチド及び／又はそれらの断片は、多糖類コンジュゲートを形成するために細菌多糖類に共有結合により結合される場合がある。かかるコンジュゲートは、前記ポリペプチド及び／又はこれらの断片にコンジュゲートされる細菌多糖類に対して向けられるＴ細胞依存性免疫原性応答を惹起するための免疫原として有用な場合がある。

【0085】

免疫原性組成物は、該免疫原性組成物と、アジュバントか、従来技術又はその他の器具を用いて、ほ乳類に前記組成物を投与のための再構成を容易にする１種類以上の薬学的に許容できる希釈剤を含む、再構成溶液かとを含むキット形状で提供される場合がある。かかるキットは、前記組成物の液状を投与するための器具（例えば、皮下用シリンジ、マイクロニードルアレイ）と、使用説明書とを任意的に含むかもしれない。

【実施例】

【0086】

以上の開示内容は本主題の一部の実施態様を一般的に説明する。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得られる。これらの実施例は、例示の目的だけのために説明されるのであって、本開示内容の範囲の限定を意図するものではない。状況が示唆するか都合がよいかの場合には、形態の変更及び均等物の置換が意図される。具体的な用語が本明細書では用いられてきたが、かかる用語は説明の意味で意図されるのであって、限定の目的ではない。

【0087】

本開示内容及び実施例において利用されるが、明示的に説明されない、分子遺伝学、タンパク質生化学及び免疫学の方法は、科学文献に十分報告され、当業者の能力範囲内に含まれる。

【0088】

免疫応答
ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、例えば肺炎球菌のような細胞外病原体に対しては最も重要であると考えられる。ＭＨＣクラスＩＩ分子のコンテキストで抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）に装荷された抗原で刺激されると、未熟なＣＤ４^＋Ｔ細胞は、機能的に異なるＴヘルパー（Ｔｈ）のサブセットに分化する場合がある。異なるＴｈサブセットへのコミットメントは、抗原タイプ及び装荷、共刺激分子及びサイトカインシグナル伝達を含む、許容的環境でのＡＰＣｓとの複雑な相互作用に依存する（本件文献７−９）。例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子−ベータ（ＴＮＦ−β）産生を特徴とするＴｈ１細胞は、細胞内病原体を除去するために最重要である。細胞外病原体を除去するのに必須のＴｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＩＬ−２５を発現する。最近発見されたＴｈ１７細胞はＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＩＬ−２２を分泌する（本件文献１０）。

【0089】

メモリーＴ細胞応答は、エフェクター応答（線形モデル又は非対称分裂）の際に発生するか、病原体の消失後に縮小残存するエフェクタークロノタイプの大集団の生き残りかである（本件文献１１）。迅速なリコール反応及びサイトカイン大量産生を伴う免疫記憶は、流行性感染に対する迅速な保護を確保するための非常に効果的なメカニズムであり、呼吸器粘膜のような侵入部位での病原体の再遭遇に対する主要な防御として機能する（本件文献１２、１３）。強固なメモリーＴ及びＢ細胞応答は、自然な感染の過程と、ワクチン接種時との両方で発生し、メモリーリンパ球がリンパ系及び非リンパ系の部位に分布する（本件文献１４−１６）。いったん発生すると、メモリーＴ細胞は一定期間循環血中で検出できる。（本件文献１５、１７、１８）。肺炎球菌に対する免疫発生の現行の説は、ＣＤ４^＋Ｔｈ（ヘルパー）−メモリーサブセット（Ｔｈ−１、Ｔｈ−２及びＴｈ−１７）の主要な役割を画定するマウスでの研究から発展してきた（本件文献１９−２１）。動物モデルでは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞免疫は耳の病原体に対する保護で顕著な役割を果たしており、抗体非依存免疫も付与できる（本件文献２０、２２、２３）。しかし、急性中耳炎を罹患中のヒトでＴ−ヘルパーメモリーサブセットの保護的役割を支持するデータはない。

【0090】

獲得免疫応答における抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の中心的役割は、一方で抗体産生においてＢ細胞に援助を提供し、他方で免疫機能の自分自身のエフェクターとしてはたらくことである（本件文献７、９、２３、２７）。さらに、Ｔｈ細胞によって提供される定常的なサイトカイン環境中で抗原刺激に応答して、特異的Ｂ細胞は、クローン増殖、クラススイッチ及び体細胞超突然変異を行い、より親和性の高い抗体の選択につながる（本件文献２８、２９）。増幅されたＢ細胞は、一部はメモリーＢ細胞に分化する一方、抗体を大量に分泌する形質細胞に分化して、骨髄のようなニッチで生き続ける（本件文献２９、３０）。メモリーＢ細胞は抗原再刺激に迅速に応答でき、長期間ＣＤ４^＋Ｔ細胞からの定常的な援助で形質細胞のプール及び血清抗体レベルの維持に寄与するかもしれない（本件文献３１）。

【0091】

実施例１
肺炎球菌タンパク質抗原を用いて、小児での耳炎好発状態を評価するために、耳炎非好発及び耳炎好発小児のコホートの末梢血中の肺炎球菌特異的機能メモリーＣＤ４^＋Ｔｈ細胞サブセットが定量された。これらのコホートの小児の血清中での同一抗原に対するＢ細胞ＩｇＧ応答も計測された。

【0092】

患者は、米国国立衛生研究所により資金援助された５年間の急性中耳炎長期予後研究の参加者であった（本件文献２６）。急性中耳炎エピソードを６ヶ月間に３回か、１年間に４回か経験した小児は耳炎好発性と考えられ、エピソードの回数がそれ以下の者は耳炎非好発群に入れられた。参加した小児はニューヨーク州ロチェスターの中流郊外居住階層出身であった。急性中耳炎の既往歴のない生後６ヶ月の健康な小児が登録され、月齢６、９、１２、１５、１８、２４及び３０ヶ月の７回、血清と、鼻咽喉（ＮＰ）及び耳咽喉（ＯＰ）培養とが採取され、両方のコホートとも２才未満のさまざまな年齢の小児であった。中耳液は急性中耳炎エピソードの際に鼓室穿刺により採取された。肺炎球菌及びインフルエンザ菌鼻咽喉／耳咽喉定着の評価は鼻咽喉及び耳咽喉表面及び中耳液の培養の微生物学的テストにより定期的に得られた。採取された血液由来の末梢血単核細胞は単離され、使用時まで液体窒素中で凍結された。本研究に用いられたサンプルは、耳炎好発小児からは急性中耳炎診察時に採取され、耳炎非好発小児からはコロニー形成時（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）又は急性中耳炎診察時に採取された。小児は、適用可能なスケジュールに従って、利用可能な結合型ワクチンの年齢に適する投与量で肺炎球菌に対して免疫済みであった。

【0093】

抗原
使用される肺炎球菌タンパク質抗原は、ＰｈｔＤ（配列番号６）、ＰｈｔＥ（配列番号８）、ＬｙｔＢ（配列番号１１）、ＰｃｐＡ（配列番号３）及びニューモリシンの無毒化誘導体ＰｌｙＤ１（配列番号１３）である。対照実験として、ＰｓｐＡも使用される。各タンパク質は肺炎球菌血清型６Ｂ株式会社からクローン化され、大腸菌で可溶性タンパク質として組換え技術で発現され、イオン交換クロマトグラフィーの組合せで精製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及びＲＰ−ＨＬＰＣ法によりアッセイしたところ、各タンパク質は精製後９０％以上の純度であった。

【0094】

刺激に最適な投与量は、トリパンブルー染色及び／又はヨウ化プロピジウム染色後のフロー・サイトメトリー解析の使用によって決定された。

【0095】

Ｔ細胞刺激
肺炎球菌が鼻咽喉に定着しているか、肺炎球菌で急性中耳炎感染している耳炎好発性及び耳炎非好発性小児由来の末梢血単核細胞は前記６種類の肺炎球菌抗原で刺激され、無莢膜型インフルエンザ菌が鼻咽喉に定着しているか、無莢膜型インフルエンザ菌で急性中耳炎感染している小児は３種類の無莢膜型インフルエンザ菌抗原で刺激された。刺激前に、凍結末梢血単核細胞は３７℃のウオーターバスで急速解凍され、ゆっくりと完全培地（１０％のＦＢＳと、２ｍＭのＬ−グルタミンと、０．１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、非必須アミノ酸と、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンとが添加されたＲＰＭＩ１６４０）が添加された。それから、細胞は洗浄され、完全培地の入った２４穴プレート中で終夜静置された。末梢血単核細胞は過去の報告（本件文献３５、３６）から適応された標準的なプロトコールを用いて刺激された。簡潔には、細胞数が計測され、９６穴平底培養プレートに入れられ、１μｇ／ｍＬのさまざまなタンパク質抗原か、１μｇ／ｍＬのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）かのいずれかで刺激された。共刺激を提供し、抗原特異的応答を増強するために１μｇ／ｍＬ濃度の抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ４９ｄ抗体（それぞれクローンＬ２９３及びＬ２５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が前記細胞培養に添加された。抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ４９ｄ抗体はバックグランドレベルに影響のない共刺激のために広く用いられている（本件文献１８、３７）。その後細胞は抗原プロセシングのために、２時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下でインキュベーションされた。２時間後、ゴルジ輸送阻害剤（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）がサイトカインを細胞内に保持するために添加され、インキュベーションがさらに４時間継続された。

【0096】

サイトカインのプロファイリング
マルチパラメーターフロー・サイトメトリー法が、本研究のコホートにおける急性中耳炎又は鼻咽喉定着後の循環血中肺炎球菌タンパク質に対する特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を検出するために用いられた。細胞内サイトカイン染色アッセイ（ＩＣＣＳ）が抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセット（Ｔｈ−１、Ｔｈ−２及びＴｈ−１７）を評価するために用いられた。刺激後、細胞は９６穴Ｖ字底プレートに移され、ＦＡＣＳバッファー（５％ＦＢＳが添加されたＰＢＳ）で１回洗浄され、さまざまな細胞表面マーカーに対する抗体で染色された。使用された抗体は、抗ＣＤ４ＡＰＣ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ７５０（クローンＲＰＡ Ｔ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−テキサスレッド抗ＣＤ４５ＲＡ（クローンＭＥＭ５６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び抗ＣＣＲ７ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲート（クローンＴＧ８／ＣＣＲ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であった。細胞は固定及び透過化溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２０分間透過化され、その後１×透過化バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３回洗浄された。さまざまなサイトカイン特異的抗体のカクテルが刺激の結果細胞内に捕捉されたサイトカインを染色するのに用いられた。使用された抗体は、ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＩＦＮ−γ（クローンＢ２７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、パシフィックブルー結合抗ＩＬ１７Ａ（クローンＢＬ１６８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ａｌｅｃａ ｆｌｕｏｒ７００抗ＩＬ−２（クローンＭＱ１−１７Ｈ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ結合抗ＩＬ−４（クローン８Ｄ４−８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＦ４８８結合ＴＮＦ−α、抗ＣＤ３ Ｑｄｏｔ６０５（クローンＵＣＨＴ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰＥ−Ｃｙ５抗ＣＤ６９（クローンＦＮ５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。細胞内染色後、細胞はさらに３回１×透過化バッファーで洗浄され、ＦＡＣＳ用試験管に再懸濁する前にＦＡＣＳバッファーで１回最終洗浄された。１２種類の蛍光パラメーター検出用に装備された注文生産のＢＤ ＬＳＲＩＩフロー・サイトメーターが、各サンプルについて２−５×１０^５回のイベントを収集するために使用され、データはＦＬＯ ＪＯ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）ソフトウェアを用いて解析された。細胞の破片及びクランプを排除するために、細胞は最初に前方及び側方散乱特性に基づいてゲーティングされ、その後、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ弱陽性、そしてＣＤ６９^＋サイトカイン陽性細胞と順番にゲーティングされた。代替的には、細胞は確認のためにＴＮＦ−α対他のサイトカイン（ＴＮＦ−α Ｖｓ ｏｔｈｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）でもゲーティングされた。低頻度の応答細胞は過剰な戻しゲーティングによって確認された。過去に報告されたとおり、抗原特異的細胞の検出を補助するために、マルチパラメーター染色とともに抗ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ抗体が使われて無関係なバックグランドを避けるのを手助けする（本件文献３７）。全アッセイは標準化され、サイトカインのプロフィール検出についてマルチプレックスビーズアレイ（ＣＢＡ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と比較された。

【0097】

液性応答
サンプル中のＩｇＧ抗体レベルを計測するために、以前説明されたとおりＥＬＩＳＡ法が実行された（本件文献２６、３８）。簡潔には、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｌｏｎ）が、コーティングバッファー（重炭酸（ｐＨ９．４））中の０．２５μｇ／ｍＬの個々の抗原（ウェルあたり１００μＬ）でコーティングされ、終夜４℃でインキュベーションされた。洗浄後、前記プレートは３％の脱脂粉乳（ウェルあたり２００μＬ）で３７℃１時間ブロッキングされた。５回洗浄後、血清が初回希釈１：１００（３％脱脂粉乳入りのＰＢＳ）で前記ウェルに１００μＬ添加され、２倍ずつ連続希釈された。前記混合液は室温で１時間インキュベーションされ、その後、２次抗体として、ホースラディッシュペロキシダーゼ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、テキサス州）に結合されたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体が添加された。反応産物は、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌペロキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を用いて発色され、１．０モルリン酸の添加により反応が停止され、４５０ｎｍフィルターを用いる自動ＥＬＩＳＡリーダーによって読み取られた。抗体濃度に関する定量的結果を提供するために、未知サンプル中に存在する特異抗体レベルが内部参照血清（抗原特異的抗体レベルが高いヒト血清のプール）との比較により決定された。４種類のパラメーターのロジスティク−対数関数が、参照及びサンプルの曲線を作成するのに用いられた。このＥＬＩＳＡ法はＩＣＨガイダンスに従って完全に認証された。

【0098】

全てのデータはＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて統計学的に解析された。前記データについての両側検定Ｐ値がＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて算出された。

【0099】

結果
耳炎好発性グループの小児は耳炎非好発性の小児と年齢は類似していた。性別、託児所利用歴、家庭内受動喫煙曝露、８才未満の兄弟姉妹の数及び母乳哺育歴の分布は２つの研究グループ間で類似していた。

【0100】

耳炎非好発性及び耳炎好発性の小児の間でさまざまな肺炎球菌抗原特異的メモリーＴｈ細胞のサブセットの循環頻度が、これらの末梢血単核細胞を特異的抗原で刺激することにより比較された。そのために、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＩＬ−１７を産生するＣＤ４５ＲＡ弱陽性メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率が、最近活性化されたＣＤ６９^＋Ｔ細胞でゲーティングすることによって算出された。抗原特異的応答は、未刺激のまま放置されるか、非特異的抗原（キーホールリンペットヘモシアニン）で刺激されるかの対照実験の末梢血単核細胞で正規化された。

【0101】

結果の要約を示す図１は、急性中耳炎後（ｎ＝６）又は肺炎球菌の鼻咽喉定着後（ｎ＝９）の耳炎非好発性小児（ｎ＝１５）における刺激に用いられた全ての肺炎球菌抗原に対するＣＤ４５ＲＡ弱陽性メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞のさまざまなサブセットの検出可能な頻度を示す。これとは著しく対照的に、急性中耳炎後（ｎ＝１０）又は鼻咽喉定着後（ｎ＝３）の耳炎好発性小児（ｎ＝１３）は、循環する肺炎球菌特異的メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞が際だって欠乏した。特に、ＬｙｔＢ、ＰｈｔＥ及びＰｌｙに対してＩＦＮ−γを産生するメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞は完全に欠落し、著しく低レベルのＩＦＮ−γ（Ｐ＜０．０２）がＰＨｔＤ、ＰｃｐＡ及びＰｓｐＡに応答して産生された（図１Ａ）。耳炎好発性小児ではＰｈｔＤ及びＬｙｔＢに対してＩＬ−４を産生するメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の著しい減少（Ｐ＜０．０２）が観察された（図１Ｂ）。ＰｈｔＤ（Ｐ＜０．０５）、ＰｃｐＡ（Ｐ＜０．００５）、ＰｈｔＥ（Ｐ＜０．０５）Ｐｌｙ（Ｐ＜０．００５）及びＰｓｐＡ（０．０２）に対するＩＬ−２応答は耳炎好発性小児では著しく低く（図１Ｃ）、ＰｈｔＤ、ＰｃｐＡ及びＰｈｔＥ（＜０．０５）に応答する耳炎好発性小児ではＩＬ−１７ａ産生細胞の有意な減少がみられた（図１Ｄ）。

【0102】

抗原特異的メモリーＴｈ細胞の不在が抗原特異的Ｂ細胞応答不全の原因かもしれないため（本件文献９）、耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児での抗原特異的ＩｇＧ力価が評価された。それぞれの群での肺炎球菌抗原に対する血清ＩｇＧレベルが図２に示される。予想どおり、メモリーＴ細胞頻度の増大に伴って、ＰｈｔＤ（Ｐ＜０．０５）、ＬｙｔＢ（Ｐ＜０．０００５）、ＰｈｔＥ（ｐ＜０．０００５）、Ｐｌｙ（ｐ＜０．００５）に対するＩｇＧ力価は、耳炎好発性群と比較して耳炎非好発性群で有意に高かった（図２）。ＰｃｐＡ抗原に対するＩｇＧ力価も増大したが、差は有意ではなかった（図３）。

【0103】

乳幼児の免疫システムはＴ及びＢ細胞応答のコンテキストで完全に成熟しているわけではないので（本件文献３９、４０）、耳炎好発性小児ではメモリーＴ細胞応答不全が内在的なＴ又はＢ細胞不全の原因かどうかを評価するために、Ｂ細胞及びＴ細胞を介する応答が調べられた。抗原提示細胞の関与とは独立にＴ細胞応答を刺激するブドウ球菌エンテロトキシンＢ（本件文献４１）で末梢血単核細胞が刺激された。図３はＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＩＬ−１７ａを産生するＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率を示し、耳炎好発性小児及び耳炎非好発性小児で同じである。小児は全てＤＴａＰワクチンを接種されていたことから、耳炎好発性小児は一般的な免疫不全があるかどうか評価するために、ワクチン抗原のジフテリア、破傷風及び百日咳に対するＩｇＧ力価が測定された。ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳毒素、繊維状赤血球凝集素又はパータクチンに対するＩｇＧ抗体濃度は群間で有意な差は見られなかった（データは示されない）。

【0104】

要約すると、これらのデータは、耳炎非好発性小児と比較して耳炎好発性小児では、肺炎球菌抗原特異的なメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の機能が欠失又は低下していることを示す。この効果は研究された抗原に対するＩｇＧ応答の低下と関連した。前記データに示されるとおり、耳炎好発性小児は、抗原特異的ＣＤ４５ＲＡ弱陽性Ｔｈメモリーの機能による肺炎球菌に対する応答を生じさせることができず、肺炎球菌タンパク質抗原に対して弱い抗体応答しか惹起できなかった。しかしこれらの小児は、メモリーＴ細胞機能全体や、ワクチン接種された抗原に対するＢ細胞を介する抗体応答（例えばＩｇＧ）の惹起に不全があるわけではない。

【0105】

ＣＤ４^＋Ｔｈ細胞が肺炎球菌及び無莢膜型インフルエンザ菌を原因とする感染と戦うのを補助するという事実にもかかわらず、小児における肺炎球菌又は無莢膜型インフルエンザ菌を介する急性中耳炎と関連する特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ細胞の直接的な役割を証明する報告が過去に全くなかった。明らかに、小児におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞メモリーの発生が悪いことがその後のＢ細胞を介する抗体応答の低下の原因かもしれない。したがって免疫学的な記憶の欠落は、繰り返し耳が感染しやすくなる結果をもたらすのかもしれない。ここで発明者たちは、耳炎好発性小児は急性中耳炎及び／又は鼻咽喉定着後の循環血中のＴｈ細胞での耳の病原体（例えば肺炎球菌）特異的なメモリーが欠落／低減していることを証明する。これに対し耳炎非好発性小児では、急性中耳炎及び／又は耳の病原体の鼻咽喉定着後にメモリー抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞が発生する。

【0106】

急性中耳炎及び肺炎球菌の鼻咽喉定着後に耳炎好発性小児で一部の抗体が検出可能であるため、該耳炎好発性小児は短期的なＢ細胞応答は行うようである。しかし、Ｔ細胞記憶がない状態では、抗体レベルが下がった後にさらなる急性中耳炎に感染しやすくなる。したがって、根本的な免疫学的欠点は、耳炎好発性小児でのＴ細胞記憶形成にあると考えられる。耳炎好発性小児は抗原提示細胞のプロセッシングを必要としない抗原（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）には同様に反応し、ＤＴａＰワクチンの形態で抗原の非経口注射に対しても同様に反応したため、耳炎好発性小児の問題は、免疫学的には鼻粘膜に存在する抗原提示細胞による肺炎球菌及び無莢膜型インフルエンザ菌の実際のプロセッシング及び提示のさらに上流にあるかもしれない。

【0107】

過去の研究は、小児及び成人における（５−７日間の）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖応答における肺炎球菌又は無莢膜型インフルエンザ菌抗原の役割を証明してきた（本件文献４２、４３）。先行研究は、耳炎好発性小児のアデノイド及び扁桃腺から採取された細胞由来のＣＤ４^＋Ｔ細胞増殖を評価したところ、無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質Ｐ６に応答する増殖が認められなかった（本件文献４４）。このような性格の研究は抗原特異的Ｔ細胞増殖を評価するが、抗原特異的メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の存在について情報を与えることはできない。

【0108】

ＣＤ４^＋Ｔｈ−２細胞は宿主から細菌病原体の除去に有用な抗体応答の大半を促進するが、マウスモデルにおける最近の研究は、肺炎球菌鼻咽喉定着に対するＩＬ−１７ａを介する抗体非依存免疫がＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｈ−１７細胞）を産生することを示した（本件文献２０）。ここではヒトではじめて、耳炎非好発性小児の循環血中の肺炎球菌特異的ＩＬ−１７ａ産生メモリーＴｈ細胞は耳炎好発性小児より頻度が高いことが検出された。したがって、肺炎球菌特異的ＩＬ−１７ａ産生メモリーＴｈ細胞は耳炎好発状態から保護しているかもしれない。

【0109】

急性中耳炎の際の感染部位（中耳粘膜及び中耳液）での細胞表現型タイピングは、ＣＤ４５ＲＯ強陽性／ＣＤ４５ＲＡ弱陽性メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の大量の遊走と、ホーミングレセプターＬ−セレクチンの消失とを示唆する（本件文献４５）。他の研究は、急性中耳炎の際の中耳液における主としてメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の集積を明かにする（本件文献４５−４７）。アデノイドのような局所的２次リンパ器官は、細菌定着のような上部気道感染の際のＴ細胞プライミングの主要部位である。ひとたび抗原を装荷した抗原提示細胞が局所的２次リンパ器官（アデノイド）に移動すると、リンパ球の分化（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）が起こる。血液循環に入った後、前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞は（急性中耳炎の場合は）中耳粘膜及び／又は（鼻咽喉定着の際は）上部気道に最終的に移動する。

【0110】

理論に拘泥するわけではないが、免疫学的な成熟の遅延は、耳炎好発性小児で機能するＴ細胞の欠落の原因の可能性がある（本件文献４８）。小児は、成長するにつれて、耳管の解剖学的変化のために急性中耳炎に罹患しにくくなるが、成長とともに免疫システムの成熟も起こる。強固なＴ細胞記憶応答は３才ないし５才ごろに発生するのが典型的で（本件文献４０、４８−５１）、耳炎好発性小児はこの年齢の時間フレームの間に罹患傾向を「卒業」するのが通常である。

【0111】

ヒトでは、メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞は急性中耳炎との戦いで要の役割を果たすかもしれない。そこで、肺炎球菌特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞のメモリーは、もし発生するならば、再発性急性中耳炎の発症予防に役立つかもしれない。

【0112】

実施例２
本研究では、１）ＡＯＭエピソードが６ヶ月間に３回以上又は１２ヶ月間に４回以上の小児を含む耳炎好発性群と、２）適切な抗生物質療法の少なくとも４８時間後に細菌除去及び／又は徴候の消失を達成できなかった小児（本件文献７０、７１）と、１回の抗生物質治療コースを完了して１４日以内に急性中耳炎の徴候がぶり返した小児とを含む急性中耳炎治療失敗（ＡＯＭＴＦ）群と、３）急性中耳炎のエピソードが１回か２回しかなかった小児を含む耳炎非好発性群という、３群の急性中耳炎を罹患している生後６ヶ月ないし３６ヶ月の小児でのＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ及びＰｌｙに対する血清ＩｇＧ抗体の発生が比較された。

【0113】

採取分析されたサンプルは実施例に記載の予後研究の際に得られた。急性中耳炎の既往歴のない生後６ヶ月の健康な小児が登録され、生後３０ヶ月まで予後が追跡された。血清、鼻咽喉及び耳咽喉（ＯＰ）培養が、研究期間中生後６、９、１２、１５、１８、２４及び３０ヶ月の７回採取された。しかし、非常に少数の患者しか３０ヶ月の診察を受けに来なかったため、生後３０ヶ月のサンプルは本分析から除外された。本研究期間中、小児が急性中耳炎を罹患したら、血清、鼻咽喉及び耳咽喉培養が鼓室穿刺による中耳液（ＭＥＦ）とともに採取された。回復期サンプルは３週間後に採取された。これらの小児の過半数は急性中耳炎を発症しなかったので（約７０％）、第３群（耳炎非好発性小児）に含められた。一部の小児はその後耳炎好発性の定義に該当したので（約５％）、第１群に含められるか、急性中耳炎治療失敗となり（約５％）分析のための第２群に含められた。耳炎好発性及び急性中耳炎治療失敗のコホートのサイズを大きくするために、生後６ないし３６ヶ月の年齢範囲内にこれらの定義に該当するときはいつでも追加の小児が登録された。急性中耳炎罹患時に、鼻咽喉、耳咽喉及び中耳液の急性期サンプルが採取され、３週間後に回復期サンプルが採取された。

【0114】

急性中耳炎の診断を確認するために、米国小児科アカデミー急性中耳炎診断ガイドラインを用いて認定された耳鏡専門家の小児科医師（ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｏｔｏｓｃｏｐｉｓｔ ｐｅｄｉａｔｒｉｃｉａｎｓ）により診察された。鼓室穿刺術は中耳液に耳の病原体が存在することを確認するために実施された。中耳液、鼻咽喉及び耳咽喉サンプルはトリプチケースソイ培地と、５％ヒツジ血液が添加されたトリプチケースソイ寒天プレートと、チョコレート寒天プレートとに接種された。細菌は、ＣＬＳＩ標準培養手順に従って単離された。

【0115】

ＥＬＩＳＡアッセイ：実施例１に用いられた肺炎球菌タンパク質ＰｈｔＤ、ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＥ及びＰｌｙＤ１が本研究でも用いられた。タンパク質特異的抗体力価は、精製組換えタンパク質を使うＥＬＩＳＡ法により測定された。９６穴Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｌｏｎ４プレートが、重炭酸コーティングバッファー（ｐＨ９．４）中の各タンパク質０．５μｇ／ｍＬ（ウェルあたり１００μＬ）でコーティングされ、４℃で終夜インキュベーションされた。洗浄後、前記プレートは３％脱脂粉乳で３７℃１時間（ウェルあたり２００μＬ）ブロッキングされた。５回の洗浄後、１００μＬの血清が初回希釈１：１００（３％脱脂粉乳入りのＰＢＳ）で前記ウェルに添加され、２倍ずつ連続希釈された。前記混合液は室温で１時間インキュベーションされ、その後、２次抗体として、ホースラディッシュペロキシダーゼ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、テキサス州）に結合されたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体が添加された。反応産物は、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌペロキシダーゼ基質システム（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を用いて発色され、１．０モルリン酸の添加により反応が停止され、Ｓｏｆｔｍａｘ終点希釈プロトコールを用いて、Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）により４５０ｎｍで解析された。

【0116】

統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５で実施された。対応のない（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ｔ検定が、ＩｇＧ抗体解析のために３つの群の間の差を比較するために適用された。対応のある（ｐａｉｒｅｄ）ｔ検定は急性期対回復期の血清サンプルを比較するために適用された。一元配置分散分析（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）は経時的な抗体上昇を評価するのに用いられた。０．０５未満のＰ値が有意とされた。

【0117】

急性中耳炎罹患時の小児３群におけるＰｈｔＤ，ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＥ及びＰｌｙに対する特異的ＩｇＧ抗体力価
肺炎球菌のＰｈｔＤ，ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＥ及びＰｌｙタンパク質に対するＩｇＧ抗体力価が、耳炎好発性小児３５名、急性中耳炎治療失敗(ＡＯＭＴＦ)小児２５名及び耳炎非好発性群の１回目又は２回目の急性中耳炎罹患時の小児３４名の急性中耳炎急性期に測定された（図４）。

【0118】

耳炎好発性小児でのＰｈｔＤタンパク質に対するＩｇＧ力価は、耳炎非好発性小児より有意に低かった（ｐ＜０．０５）。急性中耳炎治療失敗小児でのＰｈｔＤに対するＩｇＧ抗体レベルも耳炎非好発性小児より低かったが、差は有意には至らなかった。耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児でのＬｙｔＢに対するＩｇＧ力価は耳炎非好発性小児より有意に低かった（両方の比較ともｐ＜０．００１）。耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児におけるＰｃｐＡタンパク質に対するＩｇＧの幾何学的平均力価（ＧＭＴｓ）は、耳炎非好発性小児よりほぼ３倍低かったが、抗体レベルのばらつきが大きかったため、小児の３つの群の間での差は統計学的に有意ではなかった。耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児におけるＰｈｔＥタンパク質に対するＩｇＧ力価は、耳炎非好発性小児より有意に低かった（ｐ＜０．００１）。ＰｌｙＤ１タンパク質に対するＩｇＧ力価は、耳炎非好発性小児と比較して、耳炎好発性小児（ｐ＝０．００６）及び急性中耳炎治療失敗小児（ｐ＝０．０２）では有意に低かった。

【0119】

小児３群における急性期及び回復期急性中耳炎の肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＥおよびＰｌｙに対する抗体レベル
耳炎好発性小児２２名、急性中耳炎治療失敗（ＡＯＭＴＦ）小児１３名及び耳炎非好発性小児２０名から急性期（急性中耳炎罹患時）及び回復期（３週間後）に１対の血清サンプルが得られた。小児の３群全てで、５種類のタンパク質に対するＩｇＧ抗体レベルのうち４種類は急性期対回復期で有意な上昇は認められなかった（例外は急性中耳炎治療失敗小児でのＰｈｔＥタンパク質で、ｐ＝０．０４と有意差が認められた。表１）。しかし急性期及び回復期の血清中の抗体レベルに大きな個別のばらつきが認められ、３群全ての小児の一部では１種類以上の抗原に対する抗体で２倍の上昇がみられた（表２）。

【0120】

耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児の抗体レベルと年齢
図５は、生後６−２４ヶ月の予後追跡中の耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児が急性中耳炎を罹患していない定期診察を受けたときのＰｈｔＤ、ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＥ及びＰｌｙに対するＩｇＧ抗体レベルを示す。示されたデータは、耳炎非好発性小児１５０名及び耳炎好発性小児１０名からのものである。耳炎非好発性小児では、ＬｙｔＢ（ｐ＝０．０７５）を除く全てのタンパク質でＩｇＧ抗体レベルは経時的に有意に上昇した（ｐ＜０．００１）。これに対し、耳炎好発性小児は、５種類のタンパク質のいずれについてもＩｇＧ抗体レベルの有意な経時的変化は認められなかった（ＰｈｔＤタンパク質につきｐ＝０．４０、ＫｙｔＢについてｐ＝０．３９、ＰｃｐＡについてｐ＝０．１１、ＰｈｔＥについてｐ＝０．０９、Ｐｌｙについてｐ＝０．４２）。

【0121】

これらのデータは、耳炎非好発性小児と比較して、耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児では、急性中耳炎罹患時の肺炎球菌タンパク質に対する抗体レベルが有意に低いことを示し、肺炎球菌への事前の曝露が血清抗体レベルに反映する獲得免疫応答を全く惹起しないか、あまり強固でない応答しか惹起しないかであることを示唆する。この知見は、免疫学的に、耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児は類似するが、耳炎非好発性小児と比較すると異なることを示唆する。また、研究された５種類の肺炎球菌抗原に対する血清抗体量は、耳炎非好発性小児より耳炎好発性小児では増加が有意に遅かった。耳炎好発性小児では鼻咽喉定着による自然な曝露の後の抗体獲得が遅いことは、耳の病原菌の曝露後の耳炎好発性小児での免疫応答不全の観察と矛盾しない。これらのデータは、急性中耳炎に対する血清抗体応答について、耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児は耳炎非好発性小児と違いがないことも示す。（本研究のとおり）少なくとも３才までの年齢範囲では、３群のいずれの小児の多数についても、急性中耳炎は免疫感作イベントではないようである。

【0122】

肺炎球菌に対して観察された抗原特異的免疫応答は、耳炎好発性小児についての他人の観察を確認及び敷衍し、一部の先行報告とは矛盾し、もっと新しいデータを提供する。Ｆｒｅｉｊｄら（本件文献７２）は、生後３０ヶ月の耳炎好発性小児１５名での血清型３、６Ａ及び２３に対する抗肺炎球菌多糖類抗体を同年代の対照小児及び成人と比較して記載した。彼らは、耳炎好発性小児では血清型６Ａ及び２３に対する抗体が有意に低いことを見つけた。Ｐｒｅｌｌｎｅｒら（本件文献７３）は、耳炎好発性小児１５名で血清型６Ａ、１９及び２３に対する抗肺炎球菌多糖類抗体を測定し、前記小児の６０％は検出可能な抗体がないことを見つけた。６才でも、耳炎好発性小児では６Ａ多糖類に対する抗体レベルは耳炎非好発性小児より低かった。Ｈｏｔｏｍｉら（本件文献７４）は、耳炎好発性小児３６名（平均生後１８ヶ月）と、耳炎非好発性小児２０名を無莢膜型インフルエンザ菌ＯＭＰ Ｐ６と、（前記２３価肺炎球菌ワクチンを抗原として用いて）肺炎球菌多糖類とに対する血清抗体応答について評価した。耳炎好発小児の５５％はＰ６に対する抗体応答が低く、４８％は肺炎球菌多糖類に対する応答が低かった。Ｙａｍａｎａｋａ及びＦａｄｅｎの１９９３年の研究（本件文献７５、７６）と、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（本件文献７７）とは、別の耳の病原体である無莢膜型インフルエンザ菌に対する血清及び／又は粘膜抗体レベルが耳炎好発性小児で同様に低下していることを見つけた。発明者の知る限り、これは耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児における肺炎球菌タンパク質に対する血清抗体応答の最初の報告である。

【0123】

急性中耳炎を発症する耳炎好発性小児における抗ＰｈｔＤ、ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、ＰｈｔＥ及びＰｌｙ抗体応答に関するこれらの観察は、これらの小児は、曝露が自然の鼻咽喉経路を通じて起こるときの肺炎球菌その他の耳の病原体に対する抗体応答に特異的な免疫学的欠陥があるという、耳炎好発状態に関する一般的になされる説明を支持する。

【0124】

実施例１で認められたとおり、耳炎好発性小児は、Ｔヘルパー細胞の機能と、肺炎球菌及び無莢膜型インフルエンザ菌抗原に対するＴメモリー細胞応答とに欠陥がある（未発表結果、本件文献８２）。ジフテリア、破傷風及び百日咳非経口ワクチンに対するこれらの小児の抗体応答は低下しないので、これらの知見は、オタフク風邪その他の小児ワクチン接種への血清抗体応答が耳炎好発性小児も正常であることを見つけたＰｅｌｌｎｅｒら（本件文献８３）及びＷｉｅｒｔｓｍａら（８４）の観察と矛盾しない。したがって、耳炎好発性小児での免疫機能不全は、耳の病原体への自然な曝露では起こるが、非経口ワクチン接種では起こらない。耳炎好発性小児で肺炎球菌結合型ワクチンへの適切な免疫応答が起こるとの観察はこの結論を支持する（本件文献８５、８６）。

【0125】

本研究の肺炎球菌タンパク質への急性期及び回復期の抗体レベルを比較すると、全体的な幾何学的平均力価は、耳炎好発性小児、急性中耳炎治療失敗小児又は耳炎非好発性小児で有意な上昇を示さなかった。これは、個々の小児の免疫応答のばらつきが大きいことが主な原因である。実際、小児の一部は回復期力価のほうがより高いが、他の小児はより低かったり、変わらなかったりした。これらの結果の原因は、急性中耳炎感染が起こる前の肺炎球菌の鼻咽喉での定着期間の長さの違いである可能性が一番高い。定着期間がより長い小児は急性中耳炎発症前に抗体応答のピークに達するであろうし、急性期ないし回復期の血清中の抗体レベルは一定か下降を示すであろう。他の小児は急性中耳炎発症前の鼻咽喉定着期間が短く、急性期ないし回復期の抗体レベルの上昇を示す。これらの結果は、無症状定着による自然なやり方で小児宿主にタンパク質が提示されるか、急性中耳炎感染かで、乳幼児での抗原性が異なることをたぶん反映して、抗原が違うと異なる抗体応答プロフィールを惹起することを示す。無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質に対する抗体応答が評価されるときにも同様な観察がなされ、他のグループも急性中耳炎イベントの前後での急性期ないし回復期の抗体レベルのこのばらつきを観察していた（本件文献８７−８９）。Ｓｏｉｎｉｎｅｎらは、生後２年間追跡調査した小児３２９名のコホートにおける鼻咽喉定着及び急性中耳炎に関連する肺炎球菌多糖類型１、６Ｂ、１１Ａ、１４、１９Ｆ及び２３Ｆに対する抗体の自然発生を研究した（本件文献９０）。抗体は少しだが有意な経時的増大が起こり、血清型１１Ａ及び１４はより低い年齢で免疫原性が高かった。彼らは、鼻咽喉定着又は急性中耳炎の後は抗体レベルは等しいことを見つけた。しかし、同じ小児を含む後の研究では、Ｓｏｉｎｉｎｅｎらは２倍を超える抗体上昇は急性中耳炎後では比較的頻度が低く、ばらつきは小児の年齢と肺炎球菌の血清型とに帰因できることを示す知見を記載した（本件文献８９）。

【0126】

対応する研究では、本研究と同じ５種類の肺炎球菌タンパク質と、３種類の無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質（タンパク質Ｄ、Ｐ６及びＯＭＰ２６）とに対する抗体が健康な小児におけて経時的にゆっくりと獲得されることが記録された（本件文献６９、８７）。本研究における耳炎好発性小児では、５種類の肺炎球菌タンパク質全てに対する抗体の年齢と相関する上昇が認められなかったか、有意に遅かった。

【0127】

結論として、これらの結果は耳炎好発性小児の免疫応答についてさらなる情報を提供する。耳炎好発性小児における肺炎球菌抗原に対する免疫低応答が観察された。急性中耳炎治療失敗小児が耳炎好発性小児と免疫学的に同様に挙動することも示された。ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン（例えばＰｌｙＤ１）のうち少なくとも１種類以上を含むワクチン組成物を（任意的にアジュバントを用いる）非経口的経路により投与することは、肺炎球菌への自然な曝露の後に記録される免疫低応答を軽減するために用いられる場合がある。

【0128】

実施例３
実施例１で言及された研究由来の耳炎好発性小児及び耳炎非好発性小児多数から得られた血清サンプル中の肺炎球菌抗原特異的メモリーＢ細胞の循環頻度が評価及び比較された。研究対象小児総数約３８７名中２２名の小児がここでは研究された。（十分な量の末梢血単核細胞サンプルの利用可能性にもとづいて）耳炎好発性小児１０名が本実施例の研究のために同定され、前記耳炎好発性小児と類似の年齢で急性中耳炎罹患回数１回又は２回の耳炎非好発性小児１２名が対照の役割を果たすためにランダムに選択された。前記小児の臨床的な特徴は表３に示される。

【0129】

抗原特異的（ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、Ｐｌｙ）ＩｇＧ分泌細胞と、全ＩｇＧ分泌細胞とが、メモリーＢ細胞が試験管内で刺激されて抗体分泌細胞（ＡＳＣ）に分化される（自家で標準化された）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより定量化された。簡潔には、完全培地単独か、１μｇ／ｍＬのヤマゴボウマイトゲンを含む完全培地かを１ｍＬ含む２４穴プレートの各ウェルに、解凍末梢血単核細胞１００万個が入れられた。細胞は分化のために３日間３７℃に保たれ、完全培地で洗浄され、細胞数が計測され、抗原（１０μｇ／ｍＬ）で終夜コーティングされた９６穴ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に分配された。形質細胞への分化はフロー・サイトメトリー法による分化細胞の評価で最適化された（データは示されない）。全ＩｇＧ分泌細胞の検出のために、ウェルはＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ヒトＩｇＧ（ＭＴ９１／１４５、Ｍａｂｔｅｃｈ）でプレコーティングされた。陰性対照のウェルは未処理のままか、同じ濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングされた。プレートは１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩを用いて３０分間３７℃でブロッキングされた。刺激された末梢血単核細胞は細胞数が計測され、対照ウェル及び抗原でコーティングされたウェルに分配される前に、５×１０^５個の細胞が新鮮な完全ＲＰＭＩ培地２００μＬに再懸濁された。その後プレートは３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ中で終夜インキュベーションされ、少なくとも５回ＰＢＳで洗浄された。次に、１μｇ／ｍＬのビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体（ＭＴ７８／１４５、Ｍａｂｔｅｃｈ）１００μＬが前記ウェルに添加され、１時間インキュベーションされた。洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼコンジュゲート（１：１０００）が前記ウェルに添加され、１時間３７℃でインキュベーションされた。基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｍａｂｔｅｃｈ）で発色される前に、プレートはＰＢＳで５回洗浄された。抗原特異的抗体産生細胞の頻度が低いため、発色したスポットは解剖顕微鏡を用いて手作業でカウントされた。抗原特異的なデータは、抗原特異的メモリーＢ細胞の百分率として表現され、以下の式にしたがって、末梢血単核細胞１００万個あたりで計算された。

【0130】

抗原特異的メモリーＢ細胞の百分率＝（特異的スポットの数／全Ｉｇスポットの数）×１００
これら２群の小児の血清中の抗原特異的ＩｇＧ力価は、プレートは０．５μｇ／ｍＬの抗原でコーティングされ、アフィニティー精製されたホースラディッシュペロキシダーゼ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、テキサス州）に結合されたヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体が２次抗体として用いられた。

【0131】

全てのデータはＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて統計学的に解析された。データについての両側検定Ｐ値はＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて計算された。

【0132】

結果の要約は図６（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示される。耳炎好発性小児及び耳炎非好発性小児由来サンプル中に存在する５種類の肺炎球菌抗原（ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＬｙｔＢ、ＰｃｐＡ、Ｐｌｙ）に特異的なメモリーＢ細胞の百分率は図６Ａに示される。耳炎非好発群とは際だって対照的に、急性中耳炎又は鼻咽喉定着の後の耳炎好発性小児は、循環肺炎球菌特異的メモリーＢ細胞が顕著に減少した（図６Ａ）。特に、抗原ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ及びＰｌｙＤ１に対する抗原特異的ＩｇＧを産生するメモリーＢ細胞の百分率の顕著な低減が観察された（Ｐ＜０．０２）。耳炎好発性小児はＬｙｔＢに特異的なメモリーＢ細胞の百分率も全体的な低減を示したが、差は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１）。耳炎好発性及び耳炎非好発性群由来のサンプル中のＰｘｐＡ特異的メモリーＢ細胞の百分率には統計学的に有意な差は見つからなかった（図６Ａ）。同様に、前記２つの群に存在するＩｇＧ分泌細胞の総数も差がなかった（データは示されない）。

【0133】

それぞれの群における肺炎球菌抗原に対する血清ＩｇＧレベルは図６Ｂに示される。耳炎好発性群の小児由来の血清と比較すると、ＰｈｔＤ、ＰｃｐＡ及びＰｈｔＥに対するＩｇＧ力価は耳炎非好発性群の小児由来の血清のほうが有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。Ｐｌｙレベルは低かったが、群間で統計学的に有意な差はなかった（図６Ｂ）。ＬｙｔＢ抗体力価は両方のコホートでテストされた全ての抗原のなかで最も低かった（図６Ｂ）。

【0134】

本研究では、急性中耳炎及び／又は鼻咽喉定着後の耳炎好発性小児の循環血中のメモリーＢ細胞の百分率の低下が認められた（図６Ａ）。抗原のナイーブなＢ細胞との遭遇の後、抗原特異的メモリーＢ細胞及び抗体分泌細胞は２次リンパ構造で発生し、血流を通じて骨髄、脾臓又は気道のような標的組織に移動する（本件文献１６）。血清抗体レベルはメモリーＢ細胞により維持されるので（本件文献３１）、発生した抗原特異的メモリーＢ細胞の百分率を分析することにより、耳炎好発性小児における抗体レベルが低いことのより正確な免疫学的な説明が提供される。メモリーＢ細胞の頻度が低いことと血清抗体レベルとの関連を確認するために、急性中耳炎又は鼻咽喉定着後の耳炎非好発性小児（ｎ＝１５）及び耳炎好発性小児（ｎ＝１３）の異なるコホート由来のサンプルを用いて肺炎球菌特異的抗体力価が測定され、実施例１に示された研究で得られた結果と同様に、耳炎好発性小児では有意に低いことがわかった（図６Ｂ）。全体として、耳炎非好発性小児で肺炎球菌抗原特異的力価の結果が高い傾向は、実施例１で評価されたコホートで認められた傾向と矛盾しないが、抗原特異的応答についての群間の統計学的有意差の関する正確な結果は一部の事例で異なる。例えば、本研究で評価される小児の小さな群はＰｌｙ特異的な抗体力価では差を示さなかった。細菌の定着及び／又は急性中耳炎後の特定のタンパク質抗原に対する抗体応答及びＢ細胞発生は、個々の小児の間でばらつきがあるかもしれないが、ワクチン接種でばらつきの程度が小さくなることが期待される。

【0135】

実施例１に示されるとおり、耳炎好発性小児は肺炎球菌抗原特異的メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞応答が不十分である（本件文献９６）。抗体及びメモリーＢ細胞は、急性中耳炎と、耳の病原体での鼻咽喉定着との後の耳炎好発性小児で検出可能であったため（図６Ａ−Ｂ）、本研究からの知見は上記実施例からの知見（すなわち、耳炎好発性小児は一部の抗体応答を発生する場合があること）を確認する。しかし、抗原特異的メモリーＢ細胞発生及び／又はメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞発生が起こらない以上、抗体レベルは減衰し、耳炎好発性小児は適切な血清抗体レベルを維持できないで急性中耳炎感染を繰り返しやすくなる。

【0136】

肺炎球菌多糖類結合型ワクチンは、抗多糖類抗体の保護レベルを増強するのに役立つが（本件文献８６）、血清型の多様性が菌株特異的な抗多糖類抗体の保護薬効の限界となる（９５）。しかし、耳炎好発性小児は結合型ワクチンに対する血清型特異的抗体を誘発できるという事実にもかかわらず、再発性感染がこの感染しやすい群では普通であり（本件文献８６）、血清型中和免疫は短期的で不完全であることを示す。

【0137】

興味深いことに、循環中のＰｈｔＤ特異的メモリーＢ細胞の百分率は血清ＰｈｔＤレベルと相関した（図６Ｃ）。ＰｃｐＡ及びＰｌｙＤ１に対する抗原特異的Ｂ細胞の百分率と血清抗体レベルとは差があることが観察された（図６Ａ−Ｂ）。

【0138】

結論として、本研究で評価される抗原に関して、耳炎好発性小児では抗体分泌細胞に分化できるメモリーＢ細胞の発生が有意に低い。この知見の臨床的関連性は明かである。抗原特異的メモリーＢ細胞は血清抗体維持用貯蔵庫として働き、抗原再遭遇に際して、前記メモリーＢ細胞は抗体分泌細胞に増殖して血清抗体レベルの上昇をもたらす。発明者らは、耳炎好発性小児はＩｇＧ分泌細胞全部が欠落しているのではないことを見いだした。さらに、発明者らのフロー・サイトメトリー結果は、ポリクローナル刺激に応答して、耳炎好発性小児はメモリーＢ細胞（ＣＤ１９^＋ＩｇＤ⁻）の抗体分泌形質細胞（ＣＤ２７^＋ＣＤ３８^＋ＣＤ１３８^＋）への転換メカニズムに機能不全があるわけではないことを示した（データは示されない）。

【0139】

これらのデータは、肺炎球菌抗原特異的応答は急性中耳炎又は鼻咽喉定着後の耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児の両方に見られることを示す。耳炎好発性小児では応答の低減が見られるが、それでも、自然な感染又は定着後のこれらの小児で応答が見られ、肺炎球菌への自然な曝露の後に認められる免疫低応答を軽減するため、上記のとおり（例えば実施例２）、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｘｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン（例えばＰｌｙＤ１）の少なくとも１種類以上を含むワクチン組成物を投与することを支持する。

【0140】

実施例の方法、タンパク質、組成物その他の特徴が説明されたが、本発明、開示内容又は出願の範囲を制限すること、あるいは、いかなる方法でも限定することは出願人の意図ではない。修正、改変及び変更は、当業者には容易に明かであろう。したがって、本開示内容は、本明細書に示され、説明される、具体的な詳細、代表的な装置及び実施例に限定されない。配列表が本明細書とともに提出され、本開示の一部とされる。

【0141】

以上に引用された全ての文献の内容は、引用により本明細書に取り込まれる。“ａ”及び“ｔｈｅ”のような単数形の本明細書での使用は、文脈がその反対であると示さないかぎり、対応する複数形の表示を排除しない。したがって例えば、ある請求項が“ａ Ｘ ｏｒ Ｙ”の使用を記載する場合、特記がなければ、２個以上のＸ又はＹの使用もカバーするものと解釈できる。用語（又は）が明細書の説明又は特許請求の範囲に用いられる範囲（例えば、Ａ又はＢ）で、「Ａか、Ｂか、両方か」を意味することを意図する。意図が「Ａか、Ｂかだけで、両方ではない」の状況では、「ＡかＢかだけで、両方ではない」という用語が用いられるであろう。したがって、本明細書における用語「又は」は、両立的に用いられ、排他的な意味ではない。

【0142】

他の実施態様
１．肺炎球菌性急性中耳炎の再発罹患のリスクのある患者における肺炎球菌感染を原因とする急性中耳炎の再発を予防又は治療するための方法であって、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも１種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む組成物の治療上有効量を前記患者に少なくとも１回投与することを含む、方法。
２．前記患者は急性中耳炎のエピソードを少なくとも１回経験している、実施態様１記載の方法。
３．前記患者は急性中耳炎のエピソードを、６ヶ月間に３回以上か、１２ヶ月間に４回以上か経験している、実施態様２記載の方法。
４．前記患者は、急性中耳炎を罹患しているか、あるいは、発症のリスクがある、実施態様１記載の方法。
５．前記患者は急性中耳炎を罹患している、実施態様４記載の方法。
６．前記組成物の投与は抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起又は増強する、実施態様１記載の方法。
７．組成物の投与は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１７ａを産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起又は増強する、実施態様６記載の方法。
８．ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１７ａを産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率は、前記組成物の投与直前に存在した抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率に対して増大する、実施態様７記載の方法。
９．投与はＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１７ａサイトカインの産生を刺激する、実施態様１記載の方法。
１０．前記組成物はアジュバントをさらに含む、実施態様１記載の方法。
１１．患者における肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎の再発を予防又は治療に使用するための、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシンからなる群より選択される少なくとも１種類の、単離および実質的に精製された免疫原性ポリペプチドを含む組成物。
１２．前記患者は急性中耳炎のエピソードを少なくとも１回過去に経験している、実施態様１１記載の組成物。
１３．前記患者は急性中耳炎のエピソードを、６ヶ月間に３回以上か、１２ヶ月間に４回以上か経験している、実施態様１１記載の組成物。
１４．前記患者は、急性中耳炎を罹患しているか、あるいは、発症のリスクがある、実施態様１１記載の組成物。
１５．前記患者は急性中耳炎を罹患している、実施態様１４記載の組成物。
１６．組成物の投与は抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起する、実施態様１１記載の組成物。
１７．組成物の投与は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１７ａを産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の産生を惹起する、実施態様１６記載の組成物。
１８．組成物の投与は、前記少なくとも１種類の単離および精製された免疫原性ポリペプチドを欠く組成物の投与と比較して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１７ａを産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率を高める、実施態様１６記載の組成物。
１９．投与は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１７ａサイトカインの産生を促進する、実施態様１１記載の組成物。
２０．組成物はさらにアジュバントを含む、実施態様１１記載の組成物。
２１．前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも２種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１記載の方法。
２２．前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも３種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１記載の方法。
２３．肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも４種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１記載の方法。
２４．肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも５種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１記載の方法。
２５．前記無毒化ニューモリシンは、野生型配列の第６５番目、第２９３番目及び第４２８番目の位置にアミノ酸置換を含む突然変異型ニューモリシンタンパク質である、実施態様１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２１、２２、２３及び２４のいずれか１項記載の方法。
２６．前記３箇所のアミノ酸置換は、Ｔ６５→Ｃ、Ｇ２９３→Ｃ及びＣ４２８→Ａを含む、実施態様２５記載の方法。
２７．前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも２種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１１記載の組成物。
２８．前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも３種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１１記載の組成物。
２９．前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも４種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１１記載の組成物。
３０．前記組成物は、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも５種類の、単離および精製された免疫原性ポリペプチドを含む、実施態様１１記載の組成物。
３１．前記無毒化ニューモリシンは、野生型配列の第６５番目、第２９３番目及び第４２８番目の位置にアミノ酸置換を含む突然変異型ニューモリシンタンパク質である、実施態様１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２７、２８、２９及び３０のいずれか１項記載の組成物。
３２．前記３箇所のアミノ酸置換は、Ｔ６５→Ｃ、Ｇ２９３→Ｃ及びＣ４２８→Ａを含む、実施態様３１記載の組成物。
３３．前記組成物はワクチンである、実施態様１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２７、２８、２９、３０、３１及び３２のいずれか１項記載の組成物。
３４．前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、適切な抗生物質療法の少なくとも４８時間後に細菌の除去及び／又は徴候の消失を達成できなかった、実施態様１記載の方法。
３５．前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、該急性中耳炎のための抗生物質治療コースを完了して１４日以内に急性中耳炎の徴候が再発した、実施態様１記載の方法。
３６．前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、適切な抗生物質療法の少なくとも４８時間後に細菌の除去及び／又は徴候の消失を達成できなかった、実施態様１０記載の組成物。
３７．前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、該急性中耳炎のための抗生物質治療コースを完了して１４日以内に急性中耳炎の徴候が再発した、実施態様１０記載の組成物。
３８．肺炎球菌急性中耳炎再発症のリスクがある患者における肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎の再発のリスクを低減する方法であって、肺炎球菌ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ、ＰｃｐＡ、ＬｙｔＢ及び無毒化ニューモリシン、またはそれらの免疫原性断片からなる群より選択される少なくとも１種類の、単離および実質的に精製された免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物の治療上有効量を前記患者に投与することを含む、方法。

【0143】

【表2】

【0144】

【表3】

【0145】

本件文献のリスト
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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図5J】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【配列表】

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