特許 6178520 新規な抗ＨＰＶ医薬製剤の用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6178520

(24)【登録日】2017年7月21日

(45)【発行日】2017年8月9日

(54)【発明の名称】新規な抗ＨＰＶ医薬製剤の用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/167 20060101AFI20170731BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20170731BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20170731BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/167ZMD

   A61P31/20

   A61K9/20

   A61K9/48

   A61K9/12

   A61K9/06

   A61K9/08

   A61K9/70

   A61K9/16

   A61K9/10

【請求項の数】2

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2016-553692(P2016-553692)

(86)(22)【出願日】2014年7月14日

(65)【公表番号】特表2016-540044(P2016-540044A)

(43)【公表日】2016年12月22日

(86)【国際出願番号】CN2014082148

(87)【国際公開番号】WO2015070630

(87)【国際公開日】20150521

【審査請求日】2016年5月18日

(31)【優先権主張番号】201310589439.8

(32)【優先日】2013年11月18日

(33)【優先権主張国】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】516143710

【氏名又は名称】中国医学科学院生物医学工程研究所

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100105050

【弁理士】

【氏名又は名称】鷲田 公一

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼天▲軍▼

(72)【発明者】

【氏名】孟▲帥▼

(72)【発明者】

【氏名】▲趙▼力▲揮▼

(72)【発明者】

【氏名】洪▲閣▼

【審査官】 馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１４６４３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５０２９８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０１／０８０９０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１２−１６７１０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Chemical Biology & Drug Design，Zrinka Rajic et al.，２００９年 ２月 ５日，Volume 73, Issue 3，p.328-338

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／１６７

Ａ６１Ｋ ９／０６

Ａ６１Ｋ ９／０８

Ａ６１Ｋ ９／１０

Ａ６１Ｋ ９／１２

Ａ６１Ｋ ９／１６

Ａ６１Ｋ ９／２０

Ａ６１Ｋ ９／４８

Ａ６１Ｋ ９／７０

Ａ６１Ｐ ３１／２０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ

／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式に示される化合物であるパラセタモールの抗ヒトパピローマウイルス薬の調製における使用であって、
前記パラセタモールの量が、ヒトパピローマウイルスの増殖を阻害するが、細胞毒性を発揮しない量であることを特徴とする、使用。

【化1】

【請求項2】

前記抗ヒトパピローマウイルス薬は医薬製剤であって、該医薬製剤の全重量に対して前記パラセタモールが０．１−４０％となるように薬学的に許容可能な薬物担体を添加し、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁液、エアロゾル剤、経口液、軟膏剤、ゲル剤、パッチ剤、注射剤及び放出制御製剤から選ばれる臨床的に許容可能な剤型に調製することを特徴とし、
前記医薬製剤は、単位量あたりにパラセタモールを１−５００ｍｇ含み、前記単位量が一日に服用する医薬製剤の全量であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は医薬技術分野に属し、具体的にはパラセタモール及びパラセタモールを含有する医薬製剤の抗ＨＰＶにおける使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はヒト間での伝染性を有する球状ＤＮＡウイルス（非特許文献１）である。今まで、科学者は１３０種類余りのＨＰＶ亜型を分離しており、亜型によって臨床症状が異なり、一般的にはＨＰＶ感染は性器、肛門、口腔咽頭、食道粘膜の扁平上皮細胞増殖を引き起こし、疾病として尋常性疣贅、扁平疣贅、足底疣贅等が発生し、深刻なＨＰＶ感染の場合は外陰部癌、陰茎癌、肛門癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、直腸癌、口腔癌、へんとう腺癌等の悪性腫瘍を引き起こす可能性もある。

【0003】

１９９５年に国際癌研究機関（ＩＡＲＣ）による疫学的研究データから明らかなように、高リスクのＨＰＶ１６とＨＰＶ１８は女性子宮頸癌を引き起こす要因であり、高い伝染性を有する（非特許文献２）。中国では、ほぼ全ての子宮頸癌はＨＰＶ感染に関わる（非特許文献３）。

【0004】

統計によると、世界中の性病のうち、ＨＰＶ感染による生殖器疣贅は１５−２０％を占める。２００３−２００４年に米国で行われている国家健康栄養研究課題のＨＰＶ流行状況の調査結果により、１４−５９歳の女性生殖管の全ＨＰＶ感染率は２６．８％である（非特許文献４〜５）。

【0005】

現在、ＨＰＶ臨床症状の治療方法は以下を含む：
（１）レーザ、マイクロ波、手術切除（婦人科のＬＥＥＰナイフ等）、光線力学的療法等の理学療法：裸眼で見られる瘤と潜在性感染を除去することを目的にし、主にウイルスによる腫瘍に対して治療を施すが、ソースからウイルスを殺滅することができない。

【0006】

（２）薬物治療：現在、該ウイルスに対する特効抗ウイルス薬がなく、臨床上、一般的に細胞傷害性薬物を使用して補助的に治療し、０．５％ポドフィロトキシンチンキ、５０％トリクロロ酢酸、フルオロウラシル軟膏等を含む。そのうち、ポドフィリン等は一定の腐食性を有するため、周囲の正常組織をよく保護しなければ、周囲正常組織の移植が発生しやすく、且つ上記薬物は毒性が大きいが、ＨＰＶを完治することができ、再発率が非常に高い。

【0007】

（３）免疫療法：再発を減少させるとともに病巣を迅速に除去することができ、インターフェロン、インターロイキン、チモシン、伝達因子、ＢＣＧ、イソトレチノイン、自家ワクチン等を含み、価格が高く、安定性が悪く、治療プロセスが複雑であるという欠点がある。

【0008】

（４）治療用ワクチン：予防性抗ＨＰＶワクチンとしてＭｅｒｃｋ社製のＧａｒｄａｓｉｌとグラクソ・スミスクライン社製のＣｅｒｖａｒｉｘがあるが、従来の抗ＨＰＶワクチンにも、一部のウイルス亜型に対してしか効果がなく、価格が高く、標的集団が小さく（１３−２６歳の女性）且つ免疫有効期間が短い（有効期間３−５年間）等の欠点が存在し、これら欠点により従来ワクチンを効果的に普及させることに影響を及ぼす（非特許文献６）。

【0009】

パラセタモールは一般的な解熱・鎮痛薬であり、風邪による発熱、関節痛、神経痛、片頭痛、癌による痛み及び手術後の鎮痛等に用いられる。本研究グループは抗ウイルス薬をスクリーニングする過程においてパラセタモールが高い抗ＨＰＶ１６活性を有することを見出した。該研究結果に基づき、パラセタモールを含む一連の医薬製剤を製造して、ＨＰＶ１６治療に用いる。従来の治療方法に比べて、本発明の提供するパラセタモールを含有する医薬製剤は、製造方法がシンプル、生産コストが低く、抗ＨＰＶ効果が顕著である等の利点を有する。従って、一日も早くＨＰＶを治療するための臨床用薬物として開発することは、実用的に重大な意義がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｗｏｏｄｍａｎ ＣＢ,Ｃｏｌｌｉｎｓ ＳＩ,Ｙｏｕｎｇ ＬＳ．Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ＨＰＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ ｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ,２００７、７（１）： １１−２２．

【非特許文献2】ＩＡＲＣ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ Ｒｉｓｋｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎｓ． Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］． ＩＡＲＣ Ｍｏｎｏｇｒ Ｅｖａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ Ｒｉｓｋｓ Ｈｕｍ,１９９５,６４： １−３７８．

【非特許文献3】喬友林．中国女性のヒトパピローマウイルス感染と子宮頸癌についての疫学的研究現状及びそのワクチンの予防将来性［Ｊ］．中華流行病学雑誌、２００７、２８（１０）：９３７−９４０．

【非特許文献4】王奔、熊正愛．ＨＰＶ予防性ワクチンの現状及び研究発展［Ｊ］．広東医学、２０１１,３２（４）：５３０−５３２．

【非特許文献5】何礼霞、何俊勇、蒲建ロ等．于ＨＰＶ感染に対する認知現状［Ｊ］．西部医学、２０１２,２４（８）：１６４３−１６４４．

【非特許文献6】万磊、万建平、張燕玲等．子宮頸癌若年化トレンドの臨床分析［Ｊ］．中国腫瘍臨床、２００４,３１（１０）：５４７−５４９．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の第一目的は、パラセタモールの抗ＨＰＶ薬としての使用を提供することである。

【0012】

本発明の第二目的は、有効量のパラセタモールを含む医薬製剤の抗ＨＰＶ薬としての使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の技術的解決手段の概要は以下のとおりである。

【0014】

本発明のパラセタモール及びパラセタモール医薬製剤は、ＨＰＶ感染によって引き起こされる臨床症状、特に尋常性疣贅、扁平疣贅、足底疣贅、外陰部癌、陰茎癌、肛門癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、直腸癌、口腔癌、へんとう腺癌等を予防して治療することができる。

【0015】

本発明の前記新規な抗ＨＰＶ医薬製剤は、パラセタモール単独又はパラセタモールとほかの薬物との組み合わせに、該医薬製剤の全重量に対して前記パラセタモールが０．１−４０％となるように薬学的に許容可能な薬物担体を添加し、臨床的に許容可能な任意の剤型、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、エアロゾル剤、経口液、軟膏剤、ゲル剤、パッチ剤、注射剤、輸液剤、凍結乾燥粉末注射剤及び制御放出製剤を製造する。

【0016】

本発明の前記パラセタモールは下記式に示される化合物である。

【化1】

【0017】

前記薬学的に許容可能な担体としては、一般的な希釈剤（例えば注射用水、微結晶性セルロース等の少なくとも１種）、充填剤（例えばマンニトール、蔗糖、乳糖、ポリエチレングリコール、ツイーン８０、ソルビトール、メントール、流動パラフィン、ワセリン、ステアリン酸、ステアリン酸グリセリル、ラノリン、鉱物油、ＤＭＳＯ等の少なくとも１種）、接着剤（例えばカルボマー、アラビアガム、澱粉、セルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等の少なくとも１種）、崩壊剤（例えばカルボキシメチルスターチナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等の少なくとも１種）、潤滑剤（例えばタルカムパウダー、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、固体ポリエチレングリコール、レシチン、二酸化シリコン、シリカ粉末等の少なくとも１種）、湿潤剤（例えばプロピレングリコール、グリセリン、エタノール等の少なくとも１種）、安定剤（例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、エタノールアミン、重炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ニコチンアミド、ビタミンＣ等の少なくとも１種）、浸透圧調整剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース等の少なくとも１種）、ｐＨ調整剤（例えばトリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の少なくとも１種）、防腐剤（例えばクロロブタノール、パラベン、エチルパラベン、ベンジルジメチルドデシルアミニウムブロミド等少なくとも１種）が含まれる。上記添加剤は一般的な用量であってよく、普通の配合比率でパラセタモールと混合し、パラセタモールの使用量が確定した後、各薬用添加剤の配合比率は必要に応じて適当に調整してもよい。

【0018】

本発明の医薬製剤は単位量あたりにパラセタモールを１−５００ｍｇ含み、投与量が投与方法、患者の年齢、体重、疾患の種類や病気の程度等の複数の要因により調整することができ、更に病例の臨床症状に応じて適当に変化してもよい。一日投与量は一般的に１−５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０−４０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは２０−３０ｍｇ／ｋｇである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

実施例１ パラセタモールの調製
パラアミノフェノール１０ｇ、酢酸無水物９．５ｇ、ジクロロメタン１５０ｍＬを５００ｍＬの反応フラスコに投入し、室温で２ｈ撹拌し、次に加熱還流を４ｈ行う。冷却して、減圧蒸留して溶媒を除去する。４０ｍＬのエタノールで再結晶し、１３．３ｇの製品を得て、収率は９５．６％であった。

【0020】

実施例２ 錠剤（乾法）
パラセタモール１５０ｇに、ヒドロキシプロピルセルロース７５ｇ、カルボキシメチルスターチナトリウム７５ｇ、澱粉１８０ｇを添加して等量逓増法で均一に混合した後に乾法造粒を行い、ステアリン酸マグネシウム２０ｇを添加して均一に混合し、打錠する。

【0021】

実施例３ 錠剤（湿法）
パラセタモール３００ｇに、澱粉５００ｇ、ステアリン酸マグネシウム１００ｇ、カルボキシメチルセルロース２００ｇ、エタノール（体積百分率含有量７０％）２７００ｇ、微結晶性セルロース２５００ｇ、トウモロコシ澱粉３２００ｇを添加して、十分に撹拌して混合して湿式粒子にし、６０−７０℃で２−４時間乾燥させて打錠する。打錠して錠剤を製造するために賦形剤として使用される添加剤には硫酸マグネシウム、トウモロコシ澱粉、タルカムパウダーを含む。

【0022】

実施例４ 丸剤
パラセタモール１００ｇに、９００ｇのポリエチレングリコールを添加し、９０℃で加熱溶融して、原料と添加剤を十分に溶融して混合し、溶融物をポリジメチルシロキサン液体担体に滴下し、自然冷却して滴丸を形成し、各粒の滴丸におけるパラセタモールの含有量を１００−２００ｍｇにする。

【0023】

実施例５ カプセル剤
パラセタモール３００ｇに、ステアリン酸マグネシウム２０ｇ、カルボキシメチルセルロース２００ｇ、微結晶性セルロース４８０ｇを添加し、十分に撹拌して混合して湿式粒子にし、製造された湿式粒子を６０−７０℃で２−４時間直接乾燥させ、次に空のカプセルシェルに充填し、各粒のカプセルにおけるパラセタモールの含有量を２００ｍｇにする。

【0024】

実施例６ 顆粒剤
パラセタモール６００ｇに、ステアリン酸マグネシウム２０ｇ、カルボキシメチルセルロース１８０ｇ、微結晶性セルロース２００ｇを添加し、十分に撹拌して混合して１２−１４メッシュのふるいにかけて粒子を得た。６０−７０℃で２−４時間乾燥させ、顆粒剤１グラムにおけるパラセタモールの含有量を２００ｍｇにする。

【0025】

実施例７ 懸濁剤
パラセタモール２０ｇに、純水４２０ｇ、グリセリン３９０ｇ、ソルビトール７０ｇ及びプロピレングリコール１００ｇを添加し、水性担体に均一に分散されている懸濁液を得た。

【0026】

実施例８ エアロゾル剤
パラセタモール１ｇを、プロピレングリコールに溶解し、ビタミンＣ０．５ｇ、クロロブタノール０．２ｍＬを添加して、均一に混合して透明溶液にし、仕様に応じて圧縮窒素ガスとともに圧力容器内に投入する。

【0027】

実施例９ エアロゾル剤
パラセタモール５０ｇに、グリセリン２００ｇ、プロピレングリコール１００ｇ、ツイーン８０ １ｇ、メントール２ｇ及び純水１００ｇを添加し、均一に撹拌して、ノズル付き容器に装入して得た。

【0028】

実施例１０ 経口液
パラセタモール５０ｇに、純水７．４５ｋｇと食用糖２．５ｋｇを添加し、撹拌して溶解し、分包して滅菌して得た。

【0029】

実施例１１ 軟膏剤（油性基材）
ワセリン５００ｇと流動パラフィン４００ｇをそれぞれ加熱溶融し、熱いうちに濾過して、不純物を除去し、更に約１ｈかけて１５０℃に加熱して滅菌して水分を除去し、自然冷却し、パラセタモール１００ｇをすり鉢に投入し、適量の流動パラフィンを添加して糊状になるまですりつぶし、バッチ式でワセリンを添加して均一にすりつぶして得た。

【0030】

実施例１２ 軟膏剤（ｏ／ｗ型乳化剤基材）
ステアリン酸１００ｇ、ステアリン酸グリセリル７０ｇ、白色ワセリン７０ｇ及び流動パラフィン６０ｇをビーカーに投入し、水浴で８０℃程度に加熱し、撹拌して溶融し、ツイーン８０ ０．５ｇと蒸留水６００ｍＬを別の小ビーカーに投入し、水浴で約８０℃に加熱し、均一に撹拌する。同じ温度で、水相を微細流れとして油相に添加し、水浴において順方向で絶えずに撹拌してアイボリーホワイト半ソリッド状にし、更に室温で凝縮に近くなるまで撹拌する。パラセタモール１００ｇを軟膏板上とすり鉢内に投入し、バッチ式で添加してＯ／Ｗ型乳化剤基材を得て、均一にすりつぶして得た。

【0031】

実施例１３ ゲル剤
カルボマー９３４ １０ｇをバッチ式で適量の蒸留水に撒き、緩慢に膨潤し、グリセリン１００ｇを添加して撹拌し、透明なゲル基材にする。別にメントールをエタノールに溶解し、ホウ酸１０ｇ適量の水に溶解し、以上のものを混合して、均一に撹拌する。撹拌しながらパラセタモール１０ｇを投入し、トリエタノールアミンでＰＨを４．５−５．５に調整し、水を１０００ｍＬになるまで添加し、均一に撹拌して、分包して得た。

【0032】

実施例１４ パッチ剤
カルボマー４ｇ、プロピレングリコール、ツイーン−８０及び蒸留水を秤量して１０：２０：３：１２で６０℃に加熱して２０ｍｉｎ撹拌し、パラセタモール１ｇを添加して、均一に撹拌し、バッチ式で、期待される厚みにあるまで裏地にコーティングし、天日干しし又はベークして、製剤様式に応じて切断して得た。

【0033】

実施例１５ 制御放出錠剤
パラセタモール３００ｇに、ヒドロキシプロピルメチルセルロース７０ｇ、カルボキシメチルセルロース２５０ｇ、エタノール（体積百分率含有量７０％）３７０ｇ、ステアリン酸マグネシウム１０ｇ等を添加して十分に撹拌して混合して湿式粒子にし、６０−７０℃で２−４時間乾燥させて打錠する。

【0034】

実施例１６ 制御放出錠剤
パラセタモール６００ｇに、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２８０ｇ、ステアリン酸３０ｇ、乳糖８０ｇ、ステアリン酸マグネシウム１０ｇを添加して、十分に撹拌して混合して乾法造粒を行い、打錠して、各錠におけるパラセタモールの含有量を１００ｍｇにする。

【0035】

実施例１７ 注射剤
ビタミンＣ ３ｇを注射用水２８００ｍＬに添加して溶解し、３０℃−４０℃に加熱して、パラセタモール９０ｇ、ツイーン−８０ １８ｇを添加して、室温に冷却し、塩化ナトリウム２７ｇを添加して、５％のクエン酸ナトリウム溶液でｐＨを７．０〜７．５に調整し、注射用水で３０００ｍＬになるまで定容し、製剤様式に応じて３−５ｍＬあたりをアンプルに分包してシールし、１００℃で蒸気滅菌を３０ｍｉｎ行って得た。

【0036】

実施例１８ 注射剤
パラセタモール１０ｇ、グルコース５０ｇ及び注射用水９４０ｇを混合し、体積比１：１の塩酸水溶液を滴下して、ｐＨを４．０に調整し、活性炭１ｇを添加して、撹拌しながら３０分間沸騰させ、濾過して活性炭を除去し、更に０．２２μｍ濾過膜で濾過して殺菌し、澄んだ無菌液を得てポッティングし、１１５℃で高圧蒸気殺菌を３０分間行って得た。

【0037】

実施例１９ 凍結乾燥粉末注射剤
パラセタモール４５ｇ、マンニトール４０ｇを、注射用水９１０ｇに添加し、撹拌して溶解し、体積比１：１の塩酸水溶液を滴下し、ｐＨを６．２に調整し、更に５ｇの注射剤用活性炭を添加し、室温下で２０分間撹拌し、濾過して活性炭を除去して、更に０．２２μｍ濾過膜で濾過除菌し、澄んだ無菌液を得て、５ｍＬのチューブ状ボトルに、それぞれ３ｍＬ充填し、真空凍結乾燥器に入れて凍結乾燥させて得た。

【0038】

実施例２０ 輸液剤
１０ｇパラセタモールを、ポリエチレングリコール４ｇ、レシチン３ｇ、酢酸ナトリウム６ｇ、亜硫酸ナトリウム６ｇ及び塩化ナトリウム９００ｇに添加し、注射用水に溶解して濾過し、充填してシールして滅菌し、包装して得た。

【0039】

実施例２１ 輸液剤
パラセタモール１０ｇを、ポリエチレングリコール４ｇ、レシチン４ｇ、酢酸ナトリウム４ｇ、亜硫酸ナトリウム８ｇ及びグルコース５ｋｇに添加して、注射用水に溶解し、濾過して充填してシールし、滅菌して包装して得た。
単位量あたりにパラセタモールが５０ｍｇ含まれ、筋肉内投与しても静脈内投与してもよく、使用量について一日に１−２回、一回に１−２個の単位量である。

【0040】

実施例２２
実施例１−２１で得たパラセタモールとパラセタモール医薬製剤のインビトロ抗ウイルス評価は下記ステップを含む：
（１）細胞毒性テスト：一般的な培養方法で培養した成長対数期のヒト子宮頸癌Ｃａｓｋｉ細胞（ＨＰＶ１６陽性）を、トリプシンで消化し、接着細胞を脱落し、１０％胎仔ウシ血清を含む液体培地で懸濁液を調製し、９６ウェル板に、１Ｘ１０^５個細胞／孔で接種して培養し、ＣＯ_２インキュベーターに入れて２４ｈインキュベートして細胞を接着する。標示量で実施例１−２１で製造したパラセタモール又はパラセタモール医薬製剤を細胞培養用ＤＭＳＯに溶解し、更に液体培地で希釈して濃度が順次２５、５０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬであるように逓増している一連の薬物培養液を調製する。培養液を捨てて、投与群に倍数関係で調製した薬物培養液を１００μＬ添加し、対照群では薬物溶液の代わりとして培養液を使用し、各濃度では４つの副孔とし、ＣＯ_２インキュベーターにおいて７２ｈインキュベートする。ＭＴＴ法を使用してＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法で半数有毒濃度（ＴＣ_５０）と最大無毒濃度（ＴＣ_０）を算出した。

【0041】

（２）Ｃａｓｋｉ細胞をモデルとするパラセタモールとパラセタモール医薬製剤の薬効評価：パラセタモール又はパラセタモール医薬製剤の標示量に応じて、液体培地で最大無毒濃度の薬物培養液を調製し、該薬物培養液で細胞を処理して４８時間培養後に培養を停止し、細胞内の全ＲＮＡを抽出し、０１ｉｇｏ（ｄＴ）_１５をプライマーとして逆転写し、最後にｃＤＮＡをテンプレート、Ｅ６、Ｅ７を目的遺伝子、β−ａｃｔｉｎを参照遺伝子として、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法でパラセタモール又はアセチルアミノフェノール医薬製剤がＣａｓｋｉ細胞に作用した後、ＨＰＶ１６のＥ６とＥ７ｍＲＮＡの遺伝子発現レベルでの変化を測定し、それによるＨＰＶ１６ウイルスへの阻害活性（実験結果は表１に示される）を判断する。

【0042】

【表1】