特許 6180114 Ｔ細胞受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6180114

(24)【登録日】2017年7月28日

(45)【発行日】2017年8月16日

(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170807BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20170807BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20170807BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170807BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20170807BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20170807BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170807BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170807BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170807BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170807BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   A61K35/12

   A61K35/76

   A61K48/00

   A61P31/12

   C07K14/725ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

【請求項の数】21

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2012-531494(P2012-531494)

(86)(22)【出願日】2010年9月28日

(65)【公表番号】特表2013-505734(P2013-505734A)

(43)【公表日】2013年2月21日

(86)【国際出願番号】GB2010001821

(87)【国際公開番号】WO2011039508

(87)【国際公開日】20110407

【審査請求日】2013年7月4日

【審判番号】不服2015-20072(P2015-20072/J1)

【審判請求日】2015年11月9日

(31)【優先権主張番号】0917090.3

(32)【優先日】2009年9月29日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】507299817

【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス ピーエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】シュタウス， ハンス

(72)【発明者】

【氏名】シュー， シャオ−アン

(72)【発明者】

【氏名】トップ， マックス

【合議体】

【審判長】 田村 明照

【審判官】 瀬下 浩一

【審判官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ，２００６年，Ｖｏｌ．２６， Ｎｏ．１，ｐｐ．２２−３２

【文献】 Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００８年，Ｖｏｌ．１５， Ｎｏ．８，ｐｐ．６２５−６３１

【文献】 Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ，２００７年，Ｖｏｌ．１５， Ｎｏ．１０，ｐｐ．１７４４−１７５０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N1/00-15/00

ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示された場合の、アミノ酸配列ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１）を持つエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の潜伏感染膜タンパク質２（ＬＭＰ−２）のペプチドに結合する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ここで、前記ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を含み、前記α鎖および前記β鎖は各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつ各ＣＤＲ３の配列は、
ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）
である、ＴＣＲ。

【請求項2】

前記α鎖は、下記アミノ酸配列：
ＣＤＲ１α−ＴＳＤＱＳＹＧ（配列番号４）
ＣＤＲ２α−ＱＧＳＹＤＥＱ（配列番号５）
ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）を持つ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
かつ前記β鎖は、下記アミノ酸配列：
ＣＤＲ１β−ＳＳＨＡＴ（配列番号６）
ＣＤＲ２β−ＦＮＹＥＡＱ（配列番号７）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）
を持つ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載のＴＣＲ。

【請求項3】

配列番号８として示されたアミノ酸配列または少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含む、請求項１〜２のいずれかに記載のＴＣＲ。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれかに記載のＴＣＲのα鎖およびβ鎖がＴ細胞に発現するとき、これらの鎖と内因性ＴＣＲのα鎖およびβ鎖との間の誤対合の頻度が低下するように、前記ＴＣＲのα鎖／β鎖のインターフェースに１つまたは複数の変異を含む、請求項１〜３の
いずれかに記載のＴＣＲ。

【請求項5】

前記α鎖およびβ鎖の定常領域ドメインは各々、前記α鎖と前記β鎖との間に追加のジスルフィド結合の形成を可能にする追加のシステイン残基を含む、請求項４に記載のＴＣＲ。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれかに記載のＴＣＲのα鎖をコードする、核酸。

【請求項7】

配列番号９の塩基１〜８１０または少なくとも９０％の配列同一性を有するその改変体を含む、請求項６に記載の核酸。

【請求項8】

請求項１〜５のいずれかに記載のＴＣＲのβ鎖をコードする核酸。

【請求項9】

配列番号９の塩基８８６〜１８１２または少なくとも９０％の配列同一性を有するその改変体を含む、請求項８に記載の核酸。

【請求項10】

ＴＣＲのβ鎖に結合したＴＣＲのα鎖をコードする、請求項６および８に記載の核酸。

【請求項11】

内部自己切断性配列により結合された前記ＴＣＲのα遺伝子およびβ遺伝子を含む、請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

配列番号９として示した配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその改変体を持つ、請求項１１に記載の核酸。

【請求項13】

請求項６〜１２のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項14】

請求項６〜１２のいずれかに記載の核酸を含む、細胞。

【請求項15】

Ｔ細胞または幹細胞である、請求項１４に記載の細胞。

【請求項16】

被験体から単離されたＴ細胞に由来する、請求項１５に記載の細胞。

【請求項17】

請求項１３に記載のベクターをインビトロまたはエキソビボで細胞に形質導入するステップを含む、請求項１４〜１６のいずれかに記載の細胞を産生するための方法。

【請求項18】

被験体のＥＢＶに関連する疾患を処置および／または予防するための組成物であって、請求項１４〜１６のいずれかに記載のＥＢＶ特異的Ｔ細胞を含む、組成物。

【請求項19】

ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫、ＥＢＶ陽性鼻咽腔癌またはＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を処置または予防するための、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

被験体のＥＢＶに関連する疾患の処置および／または予防に使用するための組成物であって、請求項１３に記載のベクターまたは請求項１４〜１６のいずれかに記載のＥＢＶ特異的Ｔ細胞を含む組成物。

【請求項21】

請求項１３に記載のベクターまたは請求項１４〜１６のいずれかに記載のＥＢＶ特異的Ｔ細胞を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）の抗原を認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に関する。本発明はさらに、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を産生するための、ＴＣＲの遺伝子移入の使用、およびＥＢＶ関連疾患を処置および／または予防するための、その使用に関する。

【背景技術】

【0002】

エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーであり、世界中で確認される。研究から、全成人の最大９５％が、このよく見られるウイルスに対する抗体を持っていることが示されており、これは、全成人の最大９５％が生涯のある時点で感染したことがあることを意味する。ＥＢＶは一般に、感染した大部分の人で生涯を通じて存在し続けるが、何らかの問題を引き起こすことは稀である。しかしながら、場合によっては、ＥＢＶは、癌、およびバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、鼻咽腔癌、ならびに固形臓器または造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）後の患者に起こり得るＢ細胞リンパ腫の一種、移植後リンパ増殖性疾患（ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）などの重篤な状態の発生と関連している。

【0003】

このため、ＥＢＶ関連疾患を処置および／または予防するための方法が求められている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明者らは、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を産生するＴＣＲ遺伝子治療の使用を含む、ＥＢＶ関連疾患を処置および／または予防する細胞療法を開発した。

【0005】

本発明者らは、ＥＢＶのＬＭＰ−２タンパク質に特異的なＴ細胞受容体を構築した。本発明者らはさらに、ＴＣＲのα遺伝子およびβ遺伝子を含むレトロウイルスベクターを構築し、ヒトＴ細胞への形質導入にこれを使用した。この細胞は、ＬＭＰ２特異的ＴＣＲを発現することが明らかになっており、機能的な抗原特異的活性を示す。

【0006】

したがって、第１の態様では、本発明は、エプスタインバーウイルスのＬＭＰ２タンパク質に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。

【0007】

ＴＣＲは、ＬＭＰ−２のエピトープＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１）を認識することができる。

【0008】

ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示された場合の、アミノ酸配列ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１）を持つペプチドに結合し得る。

【0009】

ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を持つ。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、下記ＣＤＲ３配列を持っていてもよい。

【0010】

ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）
または３つまでのアミノ酸変化を持つこれらの配列の改変体。

【0011】

α鎖のＣＤＲは、下記アミノ酸配列を持って（ｈａｖｉｎｇ）いてもよい。
ＣＤＲ１α−ＴＳＤＱＳＹＧ（配列番号４）
ＣＤＲ２α−ＱＧＳＹＤＥＱ（配列番号５）
ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）
または３つまでのアミノ酸変化を持つこれらの配列の改変体。

【0012】

β鎖のＣＤＲは、下記アミノ酸配列を持って（ｈａｖｉｎｇ）いてもよい。
ＣＤＲ１β−ＳＳＨＡＴ（配列番号６）
ＣＤＲ２β−ＦＮＹＥＡＱ（配列番号７）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）。

【0013】

または３つまでのアミノ酸変化を持つこれらの配列の改変体。

【0014】

本発明の第１の態様のＴＣＲは、配列番号８として示すアミノ酸配列、または少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含んでいてもよい。

【0015】

本発明の第１の態様のＴＣＲは、先行するいずれかの請求項に記載されたＴＣＲのα鎖およびβ鎖がＴ細胞に発現するとき、これらの鎖と内因性ＴＣＲのα鎖およびβ鎖との間の誤対合（ｍｉｓ−ｐａｉｒｉｎｇ）の頻度が低下するように、ＴＣＲのα鎖／β鎖のインターフェースに１つまたは複数の変異を含んでいてもよい。

【0016】

たとえば、本発明の第１の態様のＴＣＲでは、α鎖およびβ鎖の定常領域ドメインは各々、α鎖とβ鎖との間に追加のジスルフィド結合の形成を可能にする追加のシステイン残基を含んでいてもよい。

【0017】

第２の態様は、本発明の第１の態様によるＴＣＲの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を提供する。

【0018】

本発明の第２の態様の第１の実施形態は、本発明の第１の態様によるＴＣＲのα鎖をコードするヌクレオチド配列に関する。

【0019】

この第１の実施形態のヌクレオチド配列は、配列番号９として示すヌクレオチド配列の塩基１〜８１０、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含んでいてもよい。

【0020】

本発明の第２の態様の第２の実施形態は、本発明の第１の態様によるＴＣＲのβ鎖をコードするヌクレオチド配列に関する。

【0021】

この第２の実施形態のヌクレオチド配列は、配列番号９の塩基８８６〜１８１２、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含んでいてもよい。

【0022】

本発明の第２の態様の第３の実施形態は、ＴＣＲのβ鎖に結合したＴＣＲのα鎖をコードするヌクレオチド配列に関する。

【0023】

このヌクレオチド配列は、内部自己切断性配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により結合されたＴＣＲのα遺伝子およびβ遺伝子を含んでいてもよい。

【0024】

この第３の実施形態のヌクレオチド配列は、配列番号９として示す配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含んでいてもよい。

【0025】

第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ベクターは、たとえば、レトロウイルスベクターであってもよい。

【0026】

第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。細胞は、たとえば、Ｔ細胞でも、または幹細胞でもよい。細胞は、被験体から単離されたＴ細胞に由来してもよい。

【0027】

第５の態様では、本発明は、本発明の第４の態様による細胞を産生するための方法であって、本発明の第３の態様によるベクターをインビトロまたはエキソビボで細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。

【0028】

第６の態様では、本発明は、被験体のＥＢＶに関連する疾患を処置および／または予防するための方法であって、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を被験体に養子移入するステップを含み、ここで、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞が、ＴＣＲの遺伝子移入により作られる方法を提供する。

【0029】

Ｔ細胞は、ＥＢＶ特異的ＴＣＲをコードすることができる１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列（単数または複数）を含む。

【0030】

ＴＣＲは、本発明の第１の態様によるものであってもよい。

【0031】

本方法は、ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫、ＥＢＶ陽性鼻咽腔癌またはＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）などＥＢＶ関連疾患を処置または予防するために使用してもよい。

【0032】

本発明はまた、被験体のＥＢＶに関連する疾患の処置および／または予防に使用される、本発明の第３の態様によるベクター、または本発明の第４の態様による細胞を提供する。

【0033】

本発明はまた、本発明の第３の態様によるベクター、または本発明の第４の態様による細胞を含む医薬組成物を提供する。

【0034】

本発明はまた、被験体のＥＢＶに関連する疾患の処置および／または予防に使用される薬物の製造における、本発明の第１の態様によるＴＣＲ、本発明の第２の態様によるヌクレオチド配列、本発明の第３の態様によるベクター、または本発明の第４の態様による細胞の使用を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃａｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）分子によって提示された場合の、アミノ酸配列ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１）を持つエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の潜伏感染膜タンパク質２（ＬＭＰ−２）のペプチドに結合する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
（項目２）
α鎖およびβ鎖を含む、項目１に記載のＴＣＲであって、
前記α鎖および前記β鎖は各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつ各ＣＤＲ３の配列は、
ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）
または３つまでのアミノ酸変化を持つこれらの配列の改変体
である
項目１に記載のＴＣＲ。
（項目３）
前記α鎖は、下記アミノ酸配列：
ＣＤＲ１α−ＴＳＤＱＳＹＧ（配列番号４）
ＣＤＲ２α−ＱＧＳＹＤＥＱ（配列番号５）
ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）を持つ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
かつ前記β鎖は、下記アミノ酸配列：
ＣＤＲ１β−ＳＳＨＡＴ（配列番号６）
ＣＤＲ２β−ＦＮＹＥＡＱ（配列番号７）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）
または３つまでのアミノ酸変化を持つこれらの配列の改変体
を持つ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、項目２に記載のＴＣＲ。
（項目４）
配列番号８として示されたアミノ酸配列、または少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含む、先行するいずれかの項目に記載のＴＣＲ。
（項目５）
先行するいずれかの項目に記載されたＴＣＲのα鎖およびβ鎖がＴ細胞に発現するとき、これらの鎖と内因性ＴＣＲのα鎖およびβ鎖との間の誤対合の頻度が低下するように、前記ＴＣＲのα鎖／β鎖のインターフェースに１つまたは複数の変異を含む、先行するいずれかの項目に記載のＴＣＲ。
（項目６）
前記α鎖およびβ鎖の定常領域ドメインは各々、前記α鎖と前記β鎖との間に追加のジスルフィド結合の形成を可能にする追加のシステイン残基を含む、項目５に記載のＴＣＲ。
（項目７）
先行するいずれかの項目に記載のＴＣＲの前記α鎖をコードする、ヌクレオチド配列。
（項目８）
配列番号９の塩基１〜８１０または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含む、項目７に記載のヌクレオチド配列。
（項目９）
項目１〜６のいずれかに記載のＴＣＲの前記β鎖をコードするヌクレオチド配列。
（項目１０）
配列番号９の塩基８８６〜１８１２または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含む、項目９に記載のヌクレオチド配列。
（項目１１）
ＴＣＲのβ鎖に結合したＴＣＲのα鎖をコードする、項目７および９に記載のヌクレオチド配列。
（項目１２）
内部自己切断性配列により結合された前記ＴＣＲのα遺伝子およびβ遺伝子を含む、項目１１に記載のヌクレオチド配列。
（項目１３）
配列番号９として示した配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を持つ、項目１２に記載のヌクレオチド配列。
（項目１４）
項目７〜１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
（項目１５）
項目７〜１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む、細胞。
（項目１６）
Ｔ細胞または幹細胞である、項目１４または１５に記載の細胞。
（項目１７）
被験体から単離されたＴ細胞に由来する、項目１６に記載の細胞。
（項目１８）
項目１０に記載のベクターをインビトロまたはエキソビボで細胞に形質導入するステップを含む、項目１５〜１７のいずれかに記載の細胞を産生するための方法。
（項目１９）
被験体のＥＢＶに関連する疾患を処置および／または予防するための方法であって、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を前記被験体に養子移入するステップを含み、ここで、前記ＥＢＶ特異的Ｔ細胞がＴＣＲの遺伝子移入により作られる、方法。
（項目２０）
項目１５〜１７のいずれかに記載のＥＢＶ特異的Ｔ細胞を前記被験体に養子移入するステップを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫、ＥＢＶ陽性鼻咽腔癌またはＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を処置または予防するための、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
被験体のＥＢＶに関連する疾患の処置および／または予防に使用するための、項目１４に記載のベクターまたは項目１５〜１７のいずれかに記載の細胞。
（項目２３）
項目１４に記載のベクターまたは項目１５〜１７のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】図１は、レトロウイルスベクターコンストラクトｐＭＰ７１−ｐｐ６５（α−２Ａ−β）−Ｃｙｓ１の模式図を示す。

【図2】図２は、ｈｕＰＢＭＣのＥＢＶ−ｓＶβ−ＴＣＲ形質導入を示す。

【図3】図３は、ＥＢＶ−ｓＶβ−ＴＣＲ−Ｘ３−ＣＤ４−ｃｙｔｋを示す。

【図4】図４は、ＥＢＶ−ｓＶβ−ＴＣＲ−Ｘ３−ＣＤ８−ｃｙｔｋを示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

Ｔ細胞受容体
抗原プロセシングの過程で、抗原は細胞内で分解され、その後主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）分子により細胞表面に運ばれる。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面のこのペプチド：複合体を認識することができる。ＭＨＣ分子には２つの異なるクラス、すなわちＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩがあり、これらが、ペプチドを異なる細胞コンパートメントから細胞表面に送達する。

【0037】

Ｔ細胞受容体、すなわちＴＣＲは、ＭＨＣ分子に結合した抗原の認識を担うＴ細胞の表面上に見られる分子である。ＴＣＲヘテロ二量体は、Ｔ細胞の９５％でα鎖およびβ鎖からなるのに対し、Ｔ細胞の５％では、ＴＣＲは、ガンマ鎖およびデルタ鎖からなる。

【0038】

ＴＣＲが抗原およびＭＨＣと結合すると、関連酵素、補助受容体、および特殊なアクセサリー分子が介在する一連の生化学的イベントを介して、そのＴリンパ球が活性化される。

【0039】

ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｎ末端に１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン、１つのＩｇ定常（Ｃ）ドメイン、膜貫通／細胞膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質尾部を有する。

【0040】

ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインはどちらも、３つの超可変性または相補性決定領域（ＣＤＲ）を持つ。ＣＤＲ３は、プロセッシングされた抗原の認識を担う主要なＣＤＲであるのに対し、α鎖のＣＤＲ１は、抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが明らかになっており、β鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられる。

【0041】

ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２本の鎖間をつなげる短い結合配列からなる。本発明のＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含むように、α鎖およびβ鎖各々に追加のシステイン残基を有していてもよい（下記を参照）。

【0042】

こうした構造により、ＴＣＲは、哺乳動物の３つの異なる鎖（γ、δ、およびε）を有するＣＤ３、およびζ鎖のような他の分子と会合できる。これらのアクセサリー分子は、負電荷を帯びた膜貫通領域を持ち、ＴＣＲから細胞へのシグナルの伝播に非常に重要なものである。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと共に、いわゆるＴ細胞受容体複合体を形成する。

【0043】

Ｔ細胞複合体からのシグナルは、ＭＨＣ分子が特異的補助受容体により同時に結合することにより増強される。ヘルパーＴ細胞では、この補助受容体は、ＣＤ４（クラスＩＩ ＭＨＣに特異的）であり、一方、細胞傷害性Ｔ細胞では、この補助受容体は、ＣＤ８（クラスＩ ＭＨＣに特異的）である。補助受容体は、抗原に対するＴＣＲの特異性を確実なものにするのみならず、抗原提示細胞とＴ細胞との間の接触を長期化させ、活性化Ｔリンパ球のシグナル伝達に関与する細胞内に重要な分子（たとえば、ＬＣＫ）をリクルートする。

【0044】

したがって、「Ｔ細胞受容体」という用語は、ペプチドがＭＨＣ分子により提示されると、それを認識できる分子を意味する通常の意味で使用する。この分子は、α鎖およびβ鎖（または任意にγ鎖およびδ鎖）の２本鎖のヘテロ二量体でも、または一本鎖構造のＴＣＲコンストラクト（ｃｏｎｓｔｕｃｔ）でもよい。

【0045】

本発明はまた、こうしたＴ細胞受容体のα鎖またはβ鎖を提供する。

【0046】

本発明のＴＣＲは、２種以上の種に由来する配列（ｓｕｅｎｃｅｓ）を含むハイブリッドＴＣＲであってもよい。たとえば、驚くべきことに、ヒトＴ細胞では、ヒトＴＣＲよりマウスＴＣＲの方が効率的に発現することが確認されていることが明らかになった。したがって、ＴＣＲは、ヒト可変領域とマウス定常領域とを含んでもよい。このアプローチの欠点は、マウス定常配列が免疫応答を誘発し、移植したＴ細胞の拒絶に至る可能性があることである。しかしながら、患者にＴ細胞養子免疫療法を準備する際に移植前処置を用いれば、十分な免疫抑制が得られ、マウス配列を発現するＴ細胞の生着が可能である。

【0047】

ＣＤＲ配列
本発明の第１の態様のＴＣＲは、各々が３つの相補性決定領域を含む２本の鎖（αおよびβ）を含む。

【0048】

Ｔ細胞受容体の多様性はＣＤＲ３に集中しており、この領域は主に、抗原認識を担っている。本発明のＴＣＲのＣＤＲ３領域の配列は、
ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）
または３つまでのアミノ酸変化を持つこれらの配列の改変体である。

【0049】

α鎖は、下記アミノ酸配列：
ＣＤＲ１α−ＴＳＤＱＳＹＧ（配列番号４）
ＣＤＲ２α−ＱＧＳＹＤＥＱ（配列番号５）
ＣＤＲ３α−ＦＣＡＭＲＥＧＳＧＳＡＲＱＬＴＦＧＳＧＴＱＬＴＶＬＰＤ（配列番号２）
を持つＣＤＲを含んでいてもよい。

【0050】

β鎖は、下記アミノ酸配列：
ＣＤＲ１β−ＳＳＨＡＴ（配列番号６）
ＣＤＲ２β−ＦＮＹＥＡＱ（配列番号７）
ＣＤＲ３β−ＡＳＳＬＧＰＡＧＩＱＥＴＱＹＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬ（配列番号３）
を持つＣＤＲを含んでいてもよい。

【0051】

ＣＤＲは、所定の配列の置換、付加または欠失など１つまたは複数の「変化」を含んでいてもよい。ただし、ＴＣＲは、ｐｐ６５エピトープ：ＭＨＣ複合体への結合能を保持するものとする。変化は、あるアミノ酸と類似のアミノ酸との置換（保存的置換）を含んでもよい。類似のアミノ酸は、たとえば下記に示すようにグループとして関連した特性を有する側鎖部分を持つアミノ酸である。
（ｉ）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、ヒスチジン
（ｉｉ）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸
（ｉｉｉ）非荷電極性側鎖：アスパルギン（ａｓｐａｒｇｉｎｅ）、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシン
（ｉｖ）非極性側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステイン。

【0052】

どのようなアミノ酸変化も、ＭＨＣ分子への結合能を維持または強化すべきである。たとえば、ペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子のＭＨＣ分子に結合できる場合、ペプチドの２番目のアミノ酸（すなわちＮ末端から２番目のアミノ酸）は、ロイシンまたはメチオニンであることが好ましい。ただし、イソロイシン、バリン、アラニンおよびトレオニンも許容される。また、９または１０番目のアミノ酸がバリン、ロイシンまたはイソロイシンであることも好ましいが、アラニン、メチオニンおよびトレオニンも許容される。好ましいＭＨＣ結合モチーフまたは他のＨＬＡ対立遺伝子は、Ｃｅｌｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１，８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９４，１４２３頁〜１４３０頁に開示されている。

【0053】

本発明の第１の態様のＴＣＲは、下記アミノ酸配列（配列番号８）または少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含んでいてもよい。

【0054】

【化1】

青：定常配列。
赤：鎖間でジスルフィド結合するシステイン分子。
ピンク：２Ａ配列
黒：可変配列
下線 ＣＤＲ１、２および３領域。

【0055】

改変体配列は、アミノ酸の付加、欠失および／または挿入を含んでいてもよい。変異は、α鎖またはβ鎖の定常領域、リンカー、またはフレームワーク領域など１つまたは複数の領域に集中していても、あるいは、分子全体に分散していてもよい。

【0056】

同一性の比較は、目測で行っても、またはより一般的には、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行ってもよい。こうした市販されているコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の同一性％を計算することができる。

【0057】

同一性％は、連続する配列において計算してもよい。すなわち一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アライメントと呼ばれる。典型的には、こうしたギャップなしアライメントは、比較的少ない数の残基についてのみ行われる。

【0058】

これは非常に簡便で一貫性のある方法ではあるけれども、たとえば、１つの挿入または欠失があり、それ以外は同一な配列対では、それ以下のアミノ酸残基がアライメントから除外されるため、グローバルアライメントを行ったとき、相同性の割合が大きく低下する可能性があることを計算に入れることができない。したがって、大部分の配列比較法は、相同性スコア全体に過剰なペナルティーを与えることなく、考えられる挿入および欠失を計算に入れた最適なアライメントを得るように設計されている。これは、配列アライメントに「ギャップ」を挿入して局所的相同性を最大にしようとすることで達成される。

【0059】

しかしながら、より複雑なこれらの方法は、アライメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を設定するため、同数の同一のアミノ酸の場合、可能な限りギャップが少ない配列アライメントは、２つの比較配列間の関連性がより高いことを反映して、多くのギャップのある配列アライメントよりスコアが高くなる。ギャップの存在に対して比較的高いコストを与え、ギャップに続く各残基に比較的小さいペナルティーを与える「アファインギャップコスト」が通常使用される。これは、最も多く使われているギャップスコアリングシステムである。ギャップペナルティーが高いと、言うまでもなく、ギャップがより少ない最適化アライメントが得られる。大部分のアライメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することができる。しかしながら、こうしたソフトウェアを配列の比較に使用する際は、デフォルト値を使用することが好ましい。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、ギャップでは−１２、各伸長では−４である。

【0060】

従って、最大の同一性％を算出するには、最初にギャップペナルティーを考慮した最適なアライメントを作製する必要がある。こうしたアライメントを行うのに好適なコンピュータープログラムとして、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）がある。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ 同書−第１８章を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）、および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳソフトウェアパッケージがあるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはどちらも、オフラインおよびオンラインの検索に利用できる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ 同書，７−５８頁〜７−６０頁を参照されたい）。しかしながら、一部の用途では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。また、タンパク質とヌクレオチドとの配列の比較には、ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓも利用できる（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８および[e-mail]を参照されたい）。

【0061】

配列はまた、サイレント変異となって、機能的に等価な物質を与えるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含んでいてもよい。物質のその後の結合活性が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づき、人為的にアミノ酸置換を行ってもよい。たとえば、負電荷を帯びたアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正電荷を帯びたアミノ酸には、リジンおよびアルギニンがあり、親水性値が類似し、非荷電極性頭部基を持つアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンがある。

【0062】

保存的置換は、たとえば下記表にしたがって行ってもよい。２列目の同じブロック、および好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸は、相互に置換してもよい。

【0063】

【表1】

本発明はまた、相同置換（本明細書では、置換および置き換えはどちらも、すでに存在するアミノ酸残基と別の残基とを相互交換するという意味で使用する）、すなわち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性など、同種のものとの置換として起こり得る置換を包含する。また、非相同置換、すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、あるいは、オルニチン（以下、Ｚという）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂという）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏという）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの非天然型アミノ酸の付加を伴う置換が起こり得る。

【0064】

ＬＭＰ−２
本発明の第１の態様は、ＥＢＶ潜伏感染膜タンパク質２（ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）（ＬＭＰ−２）に特異的に結合するＴＣＲに関する。ＬＭＰ−２とは、エプスタインバーウイルスに関連する２つのウイルスタンパク質、ＬＭＰ−２ＡおよびＬＭＰ−２Ｂをいう。

【0065】

ＬＭＰ−２Ａ／ＬＭＰ−２Ｂは、チロシンキナーゼのシグナル伝達を遮断する働きをする膜貫通タンパク質である。ＬＭＰ−２Ａ／ＬＭＰ−２Ｂは、ウイルス溶解サイクルの活性化を阻害する働きをすると考えられる。

【0066】

ＬＭＰ−２Ａは、下記の配列を持つ。

【0067】

【化2】

ＬＭＰ−２Ｂは、下記の配列を持つ。

【0068】

【化3】

各配列では、本発明の第１の態様のＴ細胞受容体により認識されるペプチドＣＬＧＧＬＬＴＭＶを赤色で示す。

【0069】

ＴＣＲは、この配列の全部または一部を認識することができる。ＴＣＲは、この配列の一部と共に１つまたは複数の（たとえば、最大５つ）上流または下流のアミノ酸を認識してもよい。ＴＣＲは、以下の配列ＧＰＶＦＭＣＬＧＧＬＴＭＶＡＧＡＶＷの全部または一部を認識してもよい。

【0070】

主要組織適合遺伝子複合体（ＭＡＪＯＲ ＨＩＳＴＯＣＯＭＰＡＴＡＢＩＬＩＴＹ ＣＯＭＰＬＥＸ）（ＭＨＣ）分子
ＴＣＲは、ペプチド：ＭＨＣ複合体として上記ペプチドに結合する。

【0071】

ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩでも、またはクラスＩＩ分子でもよい。この複合体は、樹状細胞またはＢ細胞などの抗原提示細胞の表面上にあってもよいし、あるいは、たとえば、ビーズまたはプレートにコーティングすることで固定化されてもよい。

【0072】

ヒト白血球抗原系（ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ）は、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の名称であり、そのＨＬＡクラスＩ抗原（Ａ、ＢおよびＣ）、およびＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＤＰ、ＤＱおよびＤＲ）を含む。

【0073】

誤対合の抑制
本発明の第１の態様のＴＣＲは、Ｔ細胞に発現してその抗原特異性を変化させることができる。ＴＣＲを形質導入したＴ細胞には、少なくとも２つのＴＣＲのα鎖、および２つのＴＣＲのβ鎖が発現する。内因性ＴＣＲのα／β鎖は、自己寛容である受容体を形成するのに対し、導入されたＴＣＲのα／β鎖は、所定の標的抗原に対して定義された特異性を持つ受容体を形成する。

【0074】

しかしながら、内因性鎖と導入鎖との間で誤対合が起こり、自己抗原に対して予想外の特異性を示し、患者に移行すると、自己免疫障害を引き起こし得る新規な受容体を形成することがある。

【0075】

このため、内因性ＴＣＲ鎖と導入ＴＣＲ鎖との間の誤対合のリスクを低下させるいくつかの戦略が検討されてきた。望ましくない誤対合の抑制に現在利用されている戦略の１つが、ＴＣＲのα／βのインターフェースの変異である。

【0076】

たとえば、α鎖およびβ鎖の定常ドメインに追加のシステインを導入すると、追加のジスルフィド結合が形成され、導入した鎖の対合が強化される一方、野生型鎖との誤対合が減少し得る。

【0077】

したがって、本発明のＴＣＲは、α鎖およびβ鎖に追加のシステインを含み、それが２本の鎖間に追加のジスルフィド結合を形成し、全体で２つのジスルフィド結合を形成してもよい。

【0078】

上記の「ＣＤＲ配列」セクションに示すアミノ酸配列では、追加のシステインを赤で示す
ヌクレオチド配列
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のＴＣＲ受容体、または１つもしくは複数のＣＤＲ；α鎖もしくはβ鎖の可変配列；α鎖および／もしくはβ鎖などその一部をコードするヌクレオチド配列に関する。

【0079】

ヌクレオチド配列は、二本鎖でも、または一本鎖でもよく、ＲＮＡでも、またはＤＮＡでもよい。

【0080】

ヌクレオチド配列は、コドン最適化を行ってもよい。様々な細胞で、個々のコドンの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型に特有のｔＲＮＡの相対存在量のバイアスに対応する。配列のコドンを変化させて、対応するｔＲＮＡの相対存在量に適合するように調整することにより、発現を増加させることが可能である。

【0081】

ＨＩＶおよび他のレンチウイルスなど多くのウイルスは、多くの稀なコドンを使用する。これらを、通常使用される哺乳動物のコドンに対応するように変化させることにより、哺乳動物のプロデューサー細胞内でのパッケージング成分の発現の増加を達成することができる。哺乳動物細胞のほか、様々な他の生物のコドン使用頻度表は、当該技術分野において公知である。

【0082】

コドン最適化はまた、ｍＲＮＡ不安定化モチーフ、および潜在的スプライス部位の除去を含んでもよい。

【0083】

本発明の第２の態様のヌクレオチド配列は、下記配列（配列番号９）の全部または一部、または少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含んでいてもよい。

【0084】

【化4】

ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のＣＤＲをコードする上記の配列の一部（単数または複数）、または少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含んでいてもよく、これらの部分は、配列番号９の下記セクションである。
ＣＤＲ１α：１３９〜１５９
ＣＤＲ２α：２１１〜２３１
ＣＤＲ３α：３３１〜４１１
ＣＤＲ１β：１０２１〜１０３５
ＣＤＲ２β：１０８７〜１１０４
ＣＤＲ３β：１２１９〜１２９０
ヌクレオチド配列は、１つまたは複数の可変領域をコードする上記の配列の一部（単数または複数）、または少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含んでいてもよく、これらの部分は、下記である。
Ｖα：１〜４１１
Ｖβ：８８６〜１２９０
ヌクレオチド配列は、α鎖および／またはβ鎖をコードする上記の配列の一部（単数または複数）、または少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその改変体を含んでいてもよく、これらの部分は、下記である。
α−１〜８１０
β−８８６〜１８１２。

【0085】

改変体配列には、付加、欠失もしくは置換、または１つもしくは複数の塩基があってもよい。変異が付加（単数または複数）または欠失（単数または複数）である場合、変異が残りの配列の翻訳のフレームシフトを引き起こさないように、変異は３つずつで生じても、あるいはバランスが取れていてもよい（すなわち欠失ごとに付加がある）。

【0086】

変異の一部または全部は、タンパク質のコードの縮重により、コードされたタンパク質の配列に影響を与えないという意味（ｓｅｎｄ）で「サイレント」であってもよい。

【0087】

変異の一部または全部は、上述のような保存的アミノ酸置換を起こしてもよい。変異は、α鎖もしくはβ鎖の定常領域、リンカー、またはフレームワーク領域をコードする領域など１つまたは複数の領域に集中していても、あるいは、分子全体に分散していてもよい。

【0088】

改変体配列は、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ：ＭＨＣ複合体に結合する配列の全部または一部をコードする能力を保持すべきである。

【0089】

ベクター
本発明はまた、本発明の第２の態様によるヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

【0090】

「ベクター」という用語は、発現ベクター、すなわち、インビボまたはインビトロ／エキソビボでの発現が可能なコンストラクトを含む。

【0091】

ウイルスデリバリーシステムとして、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターがあるが、これに限定されるものではない。

【0092】

レトロウイルスは、溶解性ウイルスと異なる生活環を持つＲＮＡウイルスである。この点で、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製する感染性物質である。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは、逆転写酵素によりＤＮＡ形態に変換される。ＤＮＡコピーは、新しいＲＮＡゲノム、および感染性ウイルス粒子の構築に必要な、ウイルスによりコードされたタンパク質を産生する鋳型として働く。

【0093】

レトロウイルスは、たとえば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ：ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ：ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ：ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｕｒ ｖｉｒｕｓ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ：Ｆｕｊｉｎａｍｉ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ：Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ：ＦＢＲ ｍｕｒｉｎｅ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ：Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ：Ａｂｅｌｓｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ：Ａｖｉａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、およびレンチウイルスを含む他のすべてのレトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄｉａｅ）など多く存在する。

【0094】

レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３）で確認することができる。

【0095】

また、レンチウイルスは、レトロウイルスファミリーに属するものの、分裂細胞および非分裂細胞のどちらにも感染させることができる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．３０５３−３０５８）。

【0096】

このベクターは、本発明の第２の態様によるヌクレオチドをＴ細胞などの細胞に移入することができ、細胞にＥＢＶ特異的ＴＣＲを発現させ得る。ベクターは、理想的にはＴ細胞で高レベルの発現を維持することができ、導入されたＴＣＲは、プールが限定的なＣＤ３分子について内因性ＴＣＲと競合して勝ち得る必要がある。

【0097】

ベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。ベクターは、ＭＰ７１ベクター骨格をベースとしても、またはそれから誘導してもよい。ベクターは、全長または切断型のウッドチャック肝炎応答エレメント（ＷＰＲＥ：Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）を欠いていてもよい。

【0098】

ヒト細胞の効率的な感染には、ウイルス粒子は、アンホトロピックエンベロープまたはテナガザル白血病ウイルスエンベロープで包んでもよい。

【0099】

ＣＤ３分子の供給を増加させると、遺伝子組み換え細胞のＴＣＲ発現を増加させることができる。したがって、ベクターは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよび／またはＣＤ３ζの遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、ＣＤ３ζの遺伝子のみを含んでいてもよい。遺伝子は、２Ａ自己切断性配列などの自己切断性配列により結合してもよい。あるいは、ＣＤ３遺伝子をコードする１つまたは複数の別のベクターを用意して、ＴＣＲをコードするベクター（単数または複数）と共移入してもよい。

【0100】

細胞
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様によるヌクレオチド配列を含む細胞に関する。細胞には、本発明の第１の態様のＴ細胞受容体が発現し得る。

【0101】

細胞は、Ｔ細胞であってもよい。細胞は、被験体から単離されたＴ細胞に由来してもよい。Ｔ細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の集団など、被験体から単離された混合した細胞集団の一部であってもよい。ＰＢＬ集団中のＴ細胞は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いるなど当該技術分野において公知の方法により活性化することができる。

【0102】

Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞でも、またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞でもよい。細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の混合した集団中にあってもよい。たとえば、抗ＣＤ３抗体を任意に抗ＣＤ２８抗体と組み合わせてポリクローナル活性化を行うと、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が誘発されるけれども、ＣＤ４＋２５＋制御性Ｔ細胞の増殖も誘発されることもある。制御性Ｔ細胞へのＴＣＲの遺伝子移入は、制御性Ｔ細胞が遺伝組み換え細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の抗ウイルス活性を抑制することがあるため、望ましくない。したがって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団は、ＴＣＲの遺伝子移入の前に取り除いてもよい。

【0103】

本発明はまた、発明の第４の態様による細胞を産生するための方法であって、本発明の第３の態様によるベクターをインビトロまたはエキソビボで細胞にトランスフェクトまたは形質導入するステップを含む方法を提供する。

【0104】

細胞は、遺伝子組み換え細胞を養子移入する被験体から単離してもよい。これに関連して、細胞は、被験体由来のＴ細胞を分離することにより作製して、任意にＴ細胞を活性化し、エキソビボでＴＣＲの遺伝子移入を行い、その後、ＴＣＲを形質導入した細胞の養子移入により、被験体の免疫療法を行ってもよい。

【0105】

あるいは、細胞は、同種となるように別の被験体から単離してもよい。細胞は、ドナー被験体から単離してもよい。たとえば、被験体が同種造血幹細胞移植（Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ：ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を受けている場合、細胞は、ＨＳＣを提供するドナーに由来してもよい。被験体が固形臓器移植を受けている、または受けたことがある場合、細胞は、固形臓器を提供した被験体に由来してもよい。

【0106】

あるいは、細胞は、造血性幹細胞（ＨＳＣ）などの幹細胞であっても、または幹細胞に由来してもよい。幹細胞にはＣＤ３分子が発現しないため、ＨＳＣへの遺伝子移入は、細胞表面でのＴＣＲの発現を引き起こすものではない。しかしながら、幹細胞が胸腺に移動するリンパ球前駆細胞に分化すると、ＣＤ３発現が開始され、胸腺細胞内に導入されたＴＣＲの表面発現が引き起こされる。

【0107】

このアプローチの利点は、成熟Ｔ細胞が産生されると、導入されたＴＣＲ鎖の発現が、内因性ＴＣＲ遺伝子セグメントの再構成を抑制して機能的ＴＣＲのα遺伝子およびβ遺伝子を形成するため、導入されたＴＣＲのみが発現し、内因性ＴＣＲ鎖がほとんど、あるいは、まったく発現しないことにある。

【0108】

さらなる利点は、遺伝子組み換え幹細胞が、所望の抗原特異性を持つ成熟Ｔ細胞の持続的供給源であることにある。したがって、細胞は、分化時に、本発明の第１の態様のＴＣＲを発現するＴ細胞を産生する遺伝子組み換え幹細胞であってもよい。本発明はまた、幹細胞の分化を誘導することにより本発明の第１の態様のＴＣＲを発現するＴ細胞を産生するための方法であって、本発明の第２の態様によるヌクレオチド配列を含む方法を提供する。

【0109】

この幹細胞アプローチの欠点は、所望の特異性を持つＴＣＲが、胸腺でＴ細胞が発達する過程で欠失されたり、あるいは、末梢Ｔ細胞に発現すると耐性を誘導したりする場合があることである。もう１つの考えられる問題は、幹細胞における挿入変異誘発のリスクである。

【0110】

ＥＢＶ関連疾患
本発明はさらに、被験体のＥＢＶに関連する疾患を処置および／または予防するための方法であって、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を被験体に養子移入するステップを含む方法に関する。

【0111】

ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、ＬＭＰ−２タンパク質を認識することができる。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、エピトープＣＬＧＧＬＬＴＭＶを認識してもよい。

【0112】

「予防」という用語は、疾患の罹患を防ぐ、遅らせる、妨害する、または妨げるということを意図している。処置は、たとえば、ＥＢＶ感染を予防したり、またはその可能性を低下させたりし得る。

【0113】

本明細書で使用する「処置」とは、疾患の症状を回復、治癒または軽減させるか、あるいは、疾患の進行を抑制または阻止するため、疾患に罹った被験体のケアを行うことをいう。また、処置は、ウイルス感染した被験体を他の被験体に対して非感染性にする処置もいう。処置は、ＥＢＶのウイルス量を減少させてもよい。

【0114】

ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、ＬＭＰ−２抗原が発現している任意のＥＢＶ関連状態の処置に使用してもよい。

【0115】

たとえば、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫、ＥＢＶ陽性鼻咽腔癌、またはＥＢＶ陽性移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）の管理に使用してもよい。ＰＴＬＤは、固形臓器移植（腎臓、心臓、肺、肝臓）後、および同種ＨＳＣＴ後に起こる。

【0116】

バーキットリンパ腫は、赤道アフリカで最も多い小児期悪性腫瘍である。腫瘍は、顎に限局することを特徴とする。遺伝的研究から、赤道アフリカ（９５％を超える小児が３歳までにＥＢＶに感染している）では、大多数のバーキットリンパ腫がＥＢＶ感染リンパ球から生じることが明らかになっている。

【0117】

ホジキンリンパ腫は、疾患がリンパ節群からリンパ節群へと規則的に広がること、および疾患の進行に伴い全身性症状が発現することを特徴とする。いくつかの地域および患者群では、ホジキンリンパ腫の症例の最大５０％でＥＢＶ遺伝子材料が認められる。

【0118】

鼻咽腔癌は、中国南部で最も多い癌の１つである。鼻咽腔癌は、鼻咽頭に生じる。鼻咽頭は、咽頭、すなわち「のど」の最上部の領域であり、それに鼻腔および耳管を加えると上気道になる。

【0119】

移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）とは、臓器移植後の人に発生することがある状態の一分類をいう。ＰＴＬＤの症例の大部分にＥＢＶウイルスが関係していると考えられている。症候は、血流中のリンパ球の数の増加から、Ｂ細胞リンパ腫などの血液−細胞悪性腫瘍まで多岐にわたる場合がある。

【0120】

ＰＴＬＤは、エプスタインバーウイルスの感染後にＢ細胞リンパ球が制御不能に増殖する。

【0121】

移植拒絶反応の予防または処置において抗Ｔ細胞抗体を使用することによりＴ細胞が欠乏すると、移植後リンパ増殖性疾患を発症するリスクが一層高まる。

【0122】

ポリクローナルＰＴＬＤは、腫瘍塊を形成し、塊の影響による症状、たとえば、腸閉塞の症状を呈することがある。ＰＴＬＤのモノクローナル形態は、播種性悪性リンパ腫を形成する傾向がある。

【0123】

ＰＴＬＤは、免疫抑制剤の抑制または停止により自然に改善することがあり、抗ウイルス療法を併用して処置してもよい。

【0124】

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、骨髄または血液に由来する血液幹細胞の移植である。幹細胞移植は、多くの場合、血液、骨髄の疾患、またはある種の癌の人に行われる。

【0125】

現在、幹細胞増殖因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦが利用できれば、大部分の造血幹細胞移植の手順は、骨髄からではなく末梢血から採取された幹細胞を用いて行われる。末梢血幹細胞を採取すると、より大きな移植片が得られ、移植片の採取のためドナーに全身麻酔を施す必要がなくなり、その結果生着時間が短くなり、長期再発率が低下する可能性がある。

【0126】

造血幹細胞移植は依然として、多くの合併症を伴う恐れがあるリスクの高い手順である。造血幹細胞移植は伝統的に、生命を脅かす疾患のある患者に行われてきた。重度の障害を引き起こす自己免疫疾患および循環器疾患など非悪性および非造血系の適応症に実験的に使用されることもあるが、致死的な合併症のリスクが非常に高いため、広く受け入れられていないようである。

【0127】

ＨＳＣＴを受けた人の多くは、化学療法による長期的な処置で効果が得られないと考えられるか、またはすでに化学療法に耐性となっている多発性骨髄腫または白血病の患者である。ＨＳＣＴの候補として、幹細胞の異常を含む重症複合免疫不全症または先天性好中球減少症など先天的な障害がある小児例、さらに出生後幹細胞を失った再生不良性貧血の子供または成人が挙げられる。幹細胞の移植で処置される他の状態には、鎌状赤血球病、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、リンパ腫、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍およびホジキン病がある。最近になって、前段階の小用量の化学療法および放射線を必要とする骨髄非破壊的手順、すなわち、いわゆる「ミニ移植」手順が開発されている。これにより、高齢の患者、および本来ならば、従来の処置レジメンに耐えるのが困難であると考えられる他の患者にＨＳＣＴを行うことが可能になっている。

【0128】

さらに、高度の免疫抑制状態の（またはＴ細胞が除去された）減量強度前治療Ａｌｌｏ−ＨＳＣＴも開発されている。これらのアプローチは、併存疾患がより多い高齢の患者の移植の毒性を低下させる。

【0129】

同種ＨＳＣＴには、２名、すなわち（健常）ドナーと（患者）レシピエントとが関わる。同種ＨＳＣのドナーは、レシピエントに適合する組織型（ＨＬＡ）を持っていなければならない。マッチングは、（ＨＬＡ）遺伝子の３つまたはそれ以上の遺伝子座の多様性に基づき行われ、これらの遺伝子座の完全一致が好ましい。これらの決定的な対立遺伝子が十分に一致しても、レシピエントには、移植片対宿主病を緩和するため、免疫抑制薬療法が必要となる。同種移植のドナーは、血縁者（通常、ＨＬＡが厳密に一致した兄弟姉妹）でも、同系（患者の単一接合子または「一卵性」双生児−ほとんどの患者には一卵性双生児がいないため、必然的に極めて稀であるが、ＨＬＡが完全に一致する幹細胞の供給源となる）でも、または非血縁者（血縁者ではなく、ＨＬＡの一致の程度が非常に高いことが明らかになっているドナー）でもよい。同種ＨＳＣＴのレシピエントの約２５〜３０％には、ＨＬＡ同一の兄弟姉妹がある。また、同種移植は、幹細胞の供給源として臍帯血を用いても行われる。一般に、同種ＨＣＳＴは、すぐに現れる移植関連合併症が解決されるならば、健康な幹細胞をレシピエントの免疫系に移植することにより、治癒または長期寛解の可能性を高めると思われる。

【0130】

被験体は、ヒト被験者であってもよい。特に被験体は、移植レシピエントであってもよい。

【0131】

次に、本発明について実施例によってさらに説明する。実施例は、当業者が本発明を実施しやすくなることを意図するものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0132】

実施例１
ＥＢＶ特異的ＴＣＲ遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの構築
ＴＣＲ遺伝子治療の重要な課題は、Ｔリンパ球の高レベルの発現を持続できるベクターの選択である。プールが限定的なＣＤ３分子について、導入されたＴＣＲが内因性ＴＣＲと競合するには、高い発現レベルが必要とされる。さらに、ＴＣＲ遺伝子治療の要件には、（ｉ）エキソビボ操作を最低限にして最大３０％の導入効率、（ｉｉ）自己複製能を持つベクターの非存在、および（ｉｉｉ）記憶の発達を可能にする一定期間における安定なＴＣＲの発現がある。

【0133】

本研究では、遺伝子発現を高め、内因性ＴＣＲ鎖との誤対合を最小限に抑えるため、ＴＣＲ配列のコドン最適化を行い、かつα鎖およびβ鎖の各定常領域にシステインを追加したＭＰ７１ベクター骨格を使用した。ＭＰ７１ベクター骨格は、以前に記載されている（Ｈｉｌｄｉｇｎｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４０８３−４０８９）。ＭＰ７１ベクターのＬＴＲは骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ：Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｓａｃｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）に由来し、リーダー配列（ＬＳ：ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ：Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ）に由来する。リーダー配列は、臨床応用の際のベクターの安全性を高めるように設計した。ＡＴＧコドンをすべて除去して、起こり得るタンパク質／ペプチド生成のリスクを抑え、内因性レトロウイルス配列との相同組み換えの可能性を低下させた。ＭＰ７１に挿入された遺伝子の発現については、リーダー配列の３’末端の最小スプライス受容部位により増強させる。当初のＭＰ７１ベクターは、転写後レベルでの遺伝子発現を増強するため、全長ウッドチャック肝炎応答エレメント（ＷＰＲＥ）を含んでいた。ＡＴＧコドンを変異させた、切断型のＷＰＲＥを含むＭＰ７１ベクターは現在、ＨＩＶ患者を対象に、遺伝子組み換えＴ細胞を用いたドイツの臨床試験で使用されている。

【0134】

本発明者らはさらにＭＰ７１ベクターを改変し、ＷＰＲＥ配列をまったく含まない改変体を試験した。このベクターは、図１に示すように、内部自己切断型ブタテシオウイルス２Ａ配列により連結されたＥＢＶのＴＣＲのα遺伝子およびβ遺伝子を含む。ＴＣＲのα遺伝子およびβ遺伝子は、ＥＢＶのＬＭＰ−２特異的ＣＴＬクローンによる優勢なＴＣＲ使用に基づき合成した。ＴＣＲα−２Ａ−ＴＣＲβ産物のアミノ酸配列を配列番号８に、そのコード配列を配列番号９に示す。

【0135】

実施例２
ＴＣＲを形質導入した、ＥＢＶのＬＭＰ−２特異的ヒトＴ細胞の産生
ＥＢＶに特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を、所望のＴＣＲ遺伝子を有するレトロウイルスベクターを使用することによりヒトＴ細胞に形質導入した。簡単に説明すると、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、レトロウイルスのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を発現しているアンホトロピックなパッケージング細胞に、所定のＴＣＲ−レトロウイルスベクターをトランスフェクトした。レトロウイルスのトランスフェクション後、トランスフェクション培地をヒトＴ細胞培地に交換し、レトロウイルスの上清を回収した。次いで、所望のＴＣＲ遺伝子を発現しているウイルス粒子を含む、集めたレトロウイルスの上清を用いて、活性化ヒトＴ細胞に感染／形質導入する。２４時間後、導入されたＴＣＲ遺伝子は、形質導入したＴ細胞の表面に発現し、ＦＡＣＳ染色で検出することができる。

【0136】

レトロウイルスによりＬＭＰ−２特異的ＴＣＲを移入すると、ペプチド／ＭＨＣ四量体染色および抗Ｖβ１３抗体染色により測定されるように、レシピエントＴ細胞の表面にＴＣＲが発現される（図２）。

【0137】

実施例３
ＴＣＲを形質導入したＴ細胞の細胞内サイトカイン染色
機能的な抗原特異的活性を実証するため、本発明者らは、抗原特異的刺激および細胞内サイトカイン染色アッセイを行った。

【0138】

１ｍｇ／ｍｌでブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む２００ｍｌの培養基を用いて、ＴＣＲを形質導入したＴ細胞（２×１０^５）を、１００ｍＭの関係するペプチド（ｐＣＬＧ：ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ）、または無関係のペプチド（ｐＮＬＶ：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドでコートした２×１０^５個のＴ２刺激細胞とインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間のインキュベーション期間後、細胞を最初に表面ＣＤ８またはＣＤ４に対して染色し、次いで製造者の指示に従いＦｉｘ ＆ Ｐｅｒｍキット（Ｃａｌｔａｇ）を用いて固定し、透過処理し、細胞内ＩＦＮｇ、ＩＬ２およびＴＮＦａに対して染色した。サンプルをＬＳＲＩＩフローサイトメーターによって取得し、データは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。

【0139】

結果を図３および図４に示す。

【0140】

上記の明細書で言及した刊行物はすべて、参照によって本明細書に援用する。記載した本発明の方法およびシステムの様々な修正および変形が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者には明らかになるであろう。本発明について特定の好ましい実施形態と共に説明してきたが、特許請求の範囲に記載の本発明は、こうした特定の実施形態に不必要に限定されるものではないことを理解すべきである。実際、分子生物学または関連する分野の当業者に明らかな、本発明を実施するために記載した態様の様々な修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]