特許 6181043 抗神経成長因子抗体ならびにそれを調製および使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6181043

(24)【登録日】2017年7月28日

(45)【発行日】2017年8月16日

(54)【発明の名称】抗神経成長因子抗体ならびにそれを調製および使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170807BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20170807BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20170807BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170807BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20170807BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170807BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20170807BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170807BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170807BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20170807BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20170807BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20170807BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20170807BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20170807BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/22

   C07K16/46

   A61K39/395 N

   A61P25/04

   A61P43/00 171

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   A61P35/00

   !C12P21/08

   !C12N1/15

   !C12N1/19

   !C12N1/21

   !C12N5/10

【請求項の数】8

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2014-509819(P2014-509819)

(86)(22)【出願日】2012年5月8日

(65)【公表番号】特表2014-519318(P2014-519318A)

(43)【公表日】2014年8月14日

(86)【国際出願番号】GB2012051004

(87)【国際公開番号】WO2012153123

(87)【国際公開日】20121115

【審査請求日】2015年4月27日

(31)【優先権主張番号】61/483,491

(32)【優先日】2011年5月6日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/531,439

(32)【優先日】2011年9月6日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516170808

【氏名又は名称】ネックスヴェット オーストラリア プロプライエタリー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100154988

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 真知

(72)【発明者】

【氏名】ゲアリング ディヴィッド

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５００２７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０２７４８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０２４６５０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１０９６６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１０９１０８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウマ神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合することができ、ｐ７５またはＴｒｋＡウマＮＧＦ受容体に結合するウマＮＧＦの能力を阻害する抗体またはその抗原結合性断片であって、
ＲＡＳＥＤＩＹＮＡＬＡ（配列番号：１の残基２４−３４）を含むＣＤＲ１配列、ＮＴＤＴＬＨＴ（配列番号：１の残基５０−５６）を含むＣＤＲ２配列、及び、ＱＨＹＦＨＹＰＲＴ（配列番号：１の残基８９−９７）を含むＣＤＲ３配列、
配列番号１０のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ１フレームワーク領域、
配列番号１１のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ２フレームワーク領域、
配列番号１２のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ３フレームワーク領域、および
配列番号１３のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ４フレームワーク領域
を含む軽鎖可変領域
ならびに
ＧＦＳＬＴＮＮＮＶＮ（配列番号：２の残基２６−３５）を含むＣＤＲ１配列、ＧＶＷＡＧＧＡＴＤＹＮＳＡＬＫ（配列番号：２の残基５０−６４）を含むＣＤＲ２配列、及び、ＤＧＧＹＳＳＳＴＬＹＡＭＤＡ（配列番号：２の残基９８−１１１を含む）ＣＤＲ３配列、
配列番号１４のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ１フレームワーク領域、
配列番号１５のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ２フレームワーク領域、
配列番号１６のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ３フレームワーク領域、および
配列番号１７のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ４フレームワーク領域
を含む重鎖可変領域
を含み、
抗体またはその抗原結合性断片が、フレームワーク領域内のいずれの位置においても、ウマにおける当該位置において外来性であるようなアミノ酸を含まない、抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項2】

軽鎖可変領域が、
配列番号１０のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ１フレームワーク領域、
配列番号１１のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ２フレームワーク領域、
配列番号１２のアミノ酸配列からなるまたはそれを含み、さらにアミノ酸置換Ｓ２９Ｖを含むＦＲ３フレームワーク領域、および
配列番号１３のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ４フレームワーク領域
を含み、
重鎖可変領域が、
配列番号１４のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ１フレームワーク領域、
配列番号１５のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ２フレームワーク領域、
配列番号１６のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ３フレームワーク領域、および
配列番号１７のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ４フレームワーク領域
を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項3】

重鎖定常ドメインが下流エフェクター機能を媒介しないように、選択され、またはアミノ酸置換もしくは欠失により修飾されている重鎖定常ドメインを含む、請求項１または請求項２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項4】

重鎖がウマアイソタイプＨＣ２またはＨＣ６のものである、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。

【請求項6】

ウマにおける疼痛の治療用、または、疼痛に関連する状態の治療用、または、ウマにおけるＮＧＦにより増殖するように誘導される腫瘍およびそれに関連する状態の治療用の医薬の調製における、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。

【請求項7】

請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性断片およびそれの使用説明書を含む、ウマにおける疼痛の治療用、または疼痛に関連する状態の治療用、または、ウマにおけるＮＧＦにより増殖するように誘導される腫瘍およびそれに関連する状態の治療用のキット。

【請求項8】

ウマにおける疼痛の治療、または、疼痛に関連する状態の治療、または、ウマにおけるＮＧＦにより増殖するように誘導される腫瘍およびそれに関連する状態の治療で使用するための請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウマ神経成長因子のアンタゴニストとして作用する抗体およびその断片に関する。本発明は、それを調製する方法、疼痛などの神経成長因子に関連する状態、ウマにおける疼痛の発生をもたらす疼痛関連障害および状態を治療するうえでのこれらの抗体および断片の治療的使用に及ぶ。

【背景技術】

【0002】

神経成長因子（ＮＧＦ）は、アルファ、ベータおよびガンマポリペプチド鎖からなる天然に存在する分泌タンパク質である。ＮＧＦは、ニューロトロフィンファミリーのメンバーであり、多くの異なる役割に関与している。ＮＧＦは、感覚および交感神経ニューロンの生存および分化を促進し、２つの膜結合受容体である、低親和性ＮＧＦ受容体ｐ７５ならびに貫膜チロシンキナーゼおよび高親和性ＮＧＦ受容体ＴｒｋＡを介してシグナルを伝達する。ＴｒｋＡまたはｐ７５へのＮＧＦの結合は、感覚ニューロンにおける神経ペプチドの上方制御をもたらす。

【0003】

ヒトにおける疼痛および疼痛感受性を治療するためのＮＧＦアンタゴニストの使用が記載された（Cattaneo A., Curr. Op. Mol. Ther. 2010 12(1):94-106）。例えば、国際特許出願番号ＷＯ２００６／１３１９５１は、ラットアルファＤ１１（αＤ１１）モノクローナル抗体のヒト化型を記載している。αＤ１１抗体は、マウスＮＧＦに対する結合特異性を有するが、ＮＧＦのヒトおよびラット型と結合することも公知である。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応がげっ歯類由来抗体に対して開始されることに起因する中和抗体の産生を最小限にするために、アルファＤ１１（αＤ１１）ラット由来モノクローナル抗体のヒト化が、ヒトへの投与前に必要である。さらに、マウス定常ドメインのヒト定常ドメインによる置き換えにより、下流エフェクター機能を選択することが可能となる。
ウマにおける疼痛管理は、現在のところ、局所および全身麻酔薬、オピオイド鎮痛薬、α２アゴニスト、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）ならびにステロイドを含むいくつかのクラスの鎮痛薬の投与により行われている。これらのそれぞれは、頻繁に投与する必要があり、有効性および安全性の限界も有する。したがって、癌性疼痛または関節炎を有するウマのような慢性疼痛に苦しむウマに対する低頻度の投与で長時間持続し、有効であるような形の疼痛の軽減の必要がある。

【0004】

ＮＧＦは、ウマ組織において発現することが公知であるが、ウマＮＧＦに対するアンタゴニストは記載されておらず、疼痛を予防または緩和するためにウマにおけるＮＧＦ媒介性シグナル伝達を阻害することが用いられてもいない。他の種において抗ＮＧＦアンタゴニストとして作用する公知の抗体をウマに使用することは、それに対する中和抗体の産生のため、実行可能でないと思われる。さらに、ウマ由来の定常ドメインとアルファＤ１１などの公知の抗ＮＧＦ抗体に由来する可変ドメインを含むキメラ抗体を製造した場合、ウマＮＧＦに結合することが保証されない可能性がある。さらに、そのような抗体は、ウマに存在し得るが、抗体が最初に誘導された種に存在しない他の標的エピトープとの交差反応性を示す可能性がある。さらに、それに対する中和抗体の産生は、抗体の長期投与を制限するものとなり得る。これは、慢性疼痛に関連する状態または癌性状態を治療する場合に特に重要な要件である。同様に、ＣＤＲ移植または関連技術を用いて抗ＮＧＦ抗体のウマ化型を製造した場合にも、中和抗体の産生がもたらされる可能性があり、抗原結合親和性およびアビディティの低下がさらに示される可能性がある。したがって、ウマＮＧＦのアンタゴニストとして作用し、高レベルの結合親和性およびアビディティを保持していると同時にそれに対する中和抗体の産生を回避する、ウマにおける疼痛管理に用いる結合性メンバーの本格的な必要性がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

広範な努力の後に、本発明者は、驚くべきことにウマＮＧＦに特異的に結合するウマ化抗体およびそれに由来する結合性断片を製造した。全く予期しないことに、ウマＮＧＦへの本発明の抗体および結合性断片の結合により、高親和性ＴｒｋＡ受容体またはｐ７５受容体に対するウマＮＧＦの結合が阻害されることによってウマＮＧＦの生物学的活性が奪われることを本明細書で示す。これにより、ひいては、感覚ニューロンにおける神経ペプチドの上方制御が妨げられ、疼痛の感覚が減少または除去されるという効果が結果として得られる。抗体は、実質的に免疫原性でない、すなわち、ウマ対象に投与した場合に中和抗体がそれらに対して誘導されないように、組換えＤＮＡ法を用いて製造した。例えば、ＣＤＲ移植などの標準的な方法を用いて抗体を製造しなかったので、そのような所見は、全く意外であり、予期されないことである。

【0006】

本発明の第１の態様によれば、ウマに用いるのに適する抗体を調製する方法であって、
−ウマに存在する標的抗原に対する結合特異性を有する、ウマ以外の種のドナー抗体を提供するステップと、
−ドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列の各アミノ酸残基を１つまたは複数のウマ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列における対応する位置に存在する各アミノ酸残基と比較して、１つまたは複数のウマ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸残基と異なるドナー抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基を特定するステップと
−ドナー抗体における１つまたは複数の特定されたアミノ酸残基を１つまたは複数のウマ抗体における対応する位置に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基で置換するステップと
を含むまたは本質的にそれらのステップからなる方法を提供する。

【0007】

発明者は、修飾された抗体が、フレームワーク領域内のいずれの位置においても、ウマにおける当該位置において外来性であるようなアミノ酸を含まないような方法でウマに用いるドナー抗体を修飾する方法を特定した。したがって、修飾抗体は、標的抗原に対するドナー抗体の特異性および親和性を保持しているが、重要なことに潜在的に外来性であるエピトープが形成されないように修飾されている。したがって、修飾抗体は、ウマにおいて外来性とみなされず、したがって、特に長期投与後の抗体の有効性の中和をもたらす可能性があるウマにおける免疫応答を誘導しない。
特定の実施形態において、１つまたは複数の特定されたアミノ酸残基を置換するステップは、１つまたは複数の特定されたアミノ酸残基を、１つまたは複数の置換されるアミノ酸残基との最高の相同性を有する対応する位置に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基で置換するステップを含む。
特定の実施形態において、該方法は、ドナー抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインをウマ抗体に由来する重鎖および／または軽鎖の定常ドメインで置き換えるステップをさらに含む。一般的に、重鎖の定常ドメインをＨＣ２型ウマ定常ドメインで置き換える。
特定の実施形態において、標的抗原は、神経成長因子（ＮＧＦ）である。
本発明の第１の態様の方法は、ＣＤＲ移植を含まない。本発明の第１の態様の方法により調製される抗体は、ドナー抗体のＣＤＲ、本発明の第１の態様の方法により調製されるウマ化フレームワーク領域およびウマ定常ドメインを含む。
本発明は、以下で述べるような本発明の第１の態様により調製される抗体に及ぶ。

【0008】

したがって、本発明のさらなる態様によれば、ウマ神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合するウマ化抗体またはその結合性断片を提供する。一般的に、ウマ化抗体またはその結合性断片は、それに結合するとき、ＮＧＦの生物学的機能を中和する。すなわち、ＮＧＦへのウマ化抗体またはその結合性断片の結合により、ＴｒｋＡ受容体またはｐ７５受容体に結合するＮＧＦの能力が奪われる。特定の実施形態において、ウマ化抗体またはその結合性断片は、１×１０^-8以下の結合親和性Ｋ_DでＮＧＦに結合する。一般的に、ウマ化抗体は、ウマにおいて免疫原性でない。

【0009】

特定の実施形態において、ウマ化抗体は、本発明の第１の態様の抗体を調製する方法により調製する。
本発明のさらなるまたは関連態様において、ウマ神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合することができ、抗体または抗体結合性断片が配列番号１またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる、中和抗体またはその抗原結合性断片を提供する。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0010】

いくつかの実施形態において、中和抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ウマ化抗体、すなわち、ウマ対象に投与された場合にそれに対する中和抗体が産生されないように脱免疫化（de-immunised）されたアミノ酸配列を有する抗体である。特定の実施形態において、ウマ化抗体は、本発明の第１の態様の抗体を調製する方法により調製する。一般的に、抗体の重鎖定常ドメインは、該定常ドメインが下流エフェクター機能を媒介しないように、選択するか、またはアミノ酸置換もしくは欠失により修飾する。一般的に前記重鎖は、ウマＨＣ２またはＨＣ６重鎖である。これらのアイソタイプは、エフェクター機能を欠いていることが示された（Lewis et al, Mol Immunol. 2008 Feb; 45(3); 818-827）。さらにより一般的には、前記重鎖は、ウマＨＣ２重鎖である。このアイソタイプは、本発明者らによりプロテインＡに結合させることによって精製できることが示された。
特定の実施形態において、抗体または抗体結合性断片は、配列番号４またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0011】

さらなるまたは関連態様において、ウマ神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合することができ、抗体または抗体結合性断片が配列番号２のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖（heavy）可変領域を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる、中和抗体またはその抗原結合性断片を提供する。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0012】

一般的に、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインを含むさらなるアミノ酸配列に結合している。特定の実施形態において、免疫グロブリン定常ドメインは、本発明のウマ化抗体の完全な重鎖を形成するためにサブクラスＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の抗体に由来する。７つの異なるウマ免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）重鎖定常ドメインは、公知である。一般的に、前記定常ドメインは、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ならびに前記ＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間に位置する適切なリンカー（または「ヒンジ」）を含む。一般的に、本発明の抗ウマＮＧＦ抗体は、定常ドメインに結合した重鎖可変ドメインを含み、該定常ドメインは、例えば、補体結合、ＡＤＣＣ、Ｆｃ受容体結合または同類のものなどの下流エフェクター機能を媒介しない。そのような重鎖は、ＨＣ２またはＨＣ６アイソタイプを有する重鎖を含み得、配列番号５、６または７のアミノ酸配列を有し得る。より一般的には、前記重鎖はウマＨＣ２重鎖である。

【0013】

特定の実施形態において、抗体または抗体結合性断片は、ウマ定常ドメインＩｇＧ２（ＨＣ２）に関連する配列番号６もしくはウマ定常ドメインＩｇＧ６（ＨＣ６）に関連する配列番号７のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％のアミノ酸同一性を有する配列を含む重鎖を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。
特定のさらなる実施形態において、抗体または結合性断片は、当該残基のグリコシル化を防ぐために定常ドメインにおける少なくとも１つの残基を置換または欠失させた重鎖を含み得る。定常ドメインの残基の脱グリコシル化により、細胞上に備わったＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する定常ドメイン（Ｆｃドメイン）の結合が妨げられることによって下流エフェクター機能が制限され得る。したがって、特定のさらなる実施形態において、抗体または抗体結合性断片は、配列番号８（ＩｇＧ２（ＨＣ２）の脱グリコシル化異形）もしくは配列番号９（ＩｇＧ６（ＨＣ６の脱グリコシル化異形）のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0014】

さらなるまたは関連態様において、本発明は、ウマ神経成長因子（ＮＧＦ）に特異的に結合することができ、抗体または抗体結合性断片が軽鎖および重鎖を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる、中和抗体またはその抗原結合性断片におよび、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号２のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列と同じまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0015】

特定の実施形態において、抗体または結合性メンバーは、配列番号４のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％、より好ましくは９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる軽鎖を含む。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。
特定の実施形態において、抗体または結合性メンバーは、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる重鎖を含む。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0016】

一般的に、抗体の重鎖定常ドメインは、該定常ドメインが下流エフェクター機能を媒介しないように選択するか、またはアミノ酸置換もしくは欠失により修飾する。一般的に、前記重鎖は、ウマＨＣ２またはＨＣ６重鎖である。より一般的には、前記重鎖は、ウマＨＣ２重鎖である。特定の実施形態において、抗体または結合性メンバーは、配列番号５もしくは配列番号６のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる重鎖を含む。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。配列番号５および配列番号６は、エフェクター機能を欠いていることが示されたが、プロテインＡカラムを用いて精製することができる、ＨＣ２重鎖を含む。これは、ＨＣ２重鎖を有する抗体を製造に際して大規模に精製することを可能にするものであり、したがって、利点である。

【0017】

特定の実施形態において、抗体は、少なくとも１つのリポーター分子にコンジュゲートさせることができる。
特定のさらなる実施形態において、定常ドメインにおける少なくとも１つの残基は、当残基のグリコシル化を防ぐために、置換または欠失させることができる。したがって、特定のさらなる実施形態において、抗体または抗体結合性断片は、配列番号８もしくは配列番号９のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む重鎖を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0018】

発明者は、ウマ化重および軽鎖可変ドメインを形成するために相補性決定領域（ＣＤＲ）と組み合わせることができる一連のフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに定義した。ウマ重および軽鎖ドメインのそれぞれは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と呼ばれる４つのフレームワーク領域を有する。
抗体分子は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域ならびに関連挿入フレームワーク領域を含む重鎖可変ドメインを含み得る。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲは、ＨＣＤＲとして公知であり、これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる以下の位置に見いだされる：ＨＣＤＲ１−Ｋａｂａｔ残基３１〜３５、ＨＣＤＲ２−Ｋａｂａｔ残基５０〜６５、ＨＣＤＲ３−Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２（Kabat EA et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5^th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services）。

【0019】

さらに、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域ならびに関連挿入フレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む。軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲは、ＬＣＤＲとして公知であり、これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる以下の位置に見いだされる：ＬＣＤＲ１−Ｋａｂａｔ残基２４〜３４、ＬＣＤＲ２−Ｋａｂａｔ残基５０〜５６、ＬＣＤＲ３−Ｋａｂａｔ残基８９〜９７。
軽または重鎖可変ドメインは、以下の配列でＣＤＲが介在している４つのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。

【0020】

さらなるまたは関連態様において、本発明は、抗ＮＧＦ抗体またはそのＮＧＦ抗原結合性断片に及び、抗体または抗体結合性断片は、
配列番号１０のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ１フレームワーク領域、
配列番号１１のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ２フレームワーク領域、
配列番号１２のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ３フレームワーク領域、および
配列番号１３のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ４フレームワーク領域
の少なくとも１つを含む軽鎖可変領域
ならびに／あるいは
配列番号１４のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ１フレームワーク領域、
配列番号１５のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ２フレームワーク領域、
配列番号１６のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ３フレームワーク領域、および
配列番号１７のアミノ酸配列からなるまたはそれを含むＦＲ４フレームワーク領域
の少なくとも１つを含む重鎖可変領域
を含む。

【0021】

一般的に、軽および重鎖ＣＤＲは、ＮＧＦ、好ましくはウマＮＧＦに対する結合特異性を有する抗体に由来する。
一般的に、本発明のウマ化抗ウマＮＧＦ抗体の製造には、軽または重鎖可変ドメインのフレームワーク領域に復帰突然変異を導入する必要はない。
特定の実施形態において、上述の前記少なくとも１つのフレームワーク領域を含む軽鎖可変ドメインは、ウマ由来の軽鎖定常ドメイン、一般的に軽鎖カッパ定常ドメインに結合しているが、ラムダ軽鎖に結合していてもよい。特定の実施形態において、前記軽鎖は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＦＲ１領域、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＦＲ２領域、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＦＲ３領域および配列番号１３のアミノ酸配列を有するＦＲ４領域または前述のものとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは約１０アミノ酸の長さにわたる。

【0022】

特定のさらなる実施形態において、上述のフレームワーク領域の少なくとも１つを含む重鎖可変領域は、ウマ由来の重鎖定常ドメインに結合している。特定の実施形態において、定常ドメインのアミノ酸配列は、定常ドメインが脱グリコシル化されるように、翻訳後修飾を欠き、またはＮ結合グリコシル化もしくはＯ結合グリコシル化を受け得る任意もしくはすべての残基を除去するために修飾することができる。特定の実施形態において、重鎖は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＦＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＦＲ２領域、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＦＲ３領域および配列番号１７のアミノ酸配列を有するＦＲ４領域または前述のものとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは約１０アミノ酸の長さにわたる。

【0023】

特定のさらなる実施形態において、修飾は、本明細書で述べたフレームワーク領域に対して行うことができる。すなわち、発明者は、各フレームワーク領域におけるいくつかの残基について、所定の位置のえり抜きのアミノ酸が存在することを確認した。重要なことに、これらのフレームワーク領域の修飾は、相補性決定領域の立体配座の変化をもたらさない。その理由は、これにより、得られる抗体の結合特異性および／または親和性が変化する可能性があるためである。特定の実施形態において、本発明は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸残基への２以上のアミノ酸置換の導入に及ぶ。

【0024】

したがって、特定のさらなる実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸置換（アミノ酸をそれらの１文字コードによって表す）の１つまたは複数により修飾された配列番号１０のアミノ酸配列を含むＦＲ１領域を有する軽鎖可変ドメインを含む、抗体またはその抗原結合性断片のようなポリペプチドに及ぶ：２位におけるアミノ酸残基Ｉ（Ｉ２）がアミノ酸残基Ｖにより置き換えられ、Ｓ７がＴであり、Ａ９がＥであり、Ｌ１１がＶであり、Ｓ１２がＴまたはＡであり、Ａ１３がＶであり、Ｓ１４がＴであり、Ｅ１７がＱであり、Ｔ１８がＲであり、Ｔ２０がＥであり、Ｉ２１がＩ、Ｌ、ＭまたはＶであり、Ｅ２２がＫである。さらに、１つまたは複数の以下の置換をさらに行うことができる：Ｄ１がＧ、ＫまたはＶであり、Ｉ２がＦ、Ｎ、ＳまたはＴであり、Ｖ３がＡ、Ｇ、ＩまたはＭであり、Ｍ４がＬ、ＱまたはＶであり、Ｔ５がＡまたはＩであり、Ｓ７がＦであり、Ａ９がＤ、ＰまたはＳであり、Ｓ１０がＦ、ＬまたはＴであり、Ｌ１１がＳであり、Ｓ１２がＥまたはＶであり、Ａ１３がＬ、ＱまたはＴであり、Ｓ１４がＡまたはＰであり、Ｌ１５がＰまたはＲであり、Ｇ１６がＲであり、Ｔ１８がＳ、ＧまたはＫであり、Ｖ１９がＡであり、Ｔ２０がＤまたはＶであり、Ｉ２１がＴであり、Ｅ２２がＬ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴである。

【0025】

特定のさらなる実施形態において、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ２領域は、以下のアミノ酸置換の１つまたは複数により修飾することができる：Ｋ５がＲであり、Ｑ８がＥであり、Ｓ９がＡであり、Ｋ１１がＲまたはＥであり、Ｌ１２がＲである。
さらに、１つまたは複数の以下の置換をさらにもたらすことができる：Ｙ２がＦまたはＨであり、Ｑ３がＲまたはＳであり、Ｑ４がＨ、Ｋ、ＲまたはＶであり、Ｋ５がＶであり、Ｐ６がＩ、ＬまたはＳであり、Ｓ９がＰ、Ｒ、ＶまたはＴであり、Ｐ１０がＬであり、Ｋ１１がＩまたはＬであり、Ｌ１２がＡ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、ＱまたはＷであり、Ｌ１３がＦ、Ｉ、ＭまたはＶであり、Ｉ１４がＦ、Ｔ、ＭまたはＶであり、Ｙ１５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶである。

【0026】

特定のさらなる実施形態において、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ３領域は、以下のアミノ酸置換の１つまたは複数により修飾することができる：Ｓ４がＤであり、Ｆ６がＹであり、Ｄ１４がＥであり、Ｙ１５がＦであり、Ｓ１６がＴであり、Ｎ２０がＳであり、Ｓ２４がＡであり、Ｓ２９がＩ、ＳまたはＴであり、Ｆ３１がＹである。さらに、１つまたは複数の以下の置換をさらにもたらすことができる：Ｇ１がＤまたはＦであり、Ｖ２がＡまたはＦであり、Ｐ３がＬまたはＳであり、Ｓ４がＡ、Ｅ、ＧまたはＬであり、Ｆ６がＬであり、Ｓ７がＣ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、ＲまたはＴであり、Ｇ８がＡであり、Ｓ９がＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、ＴまたはＷであり、Ｇ１０がＡ、ＲまたはＶであり、Ｓ１１がＡ、Ｆ、ＴまたはＹであり、Ｇ１２がＥまたはＴであり、Ｔ１３がＡ、ＳまたはＷであり、Ｓ１６がＡまたはＶであり、Ｌ１７がＦまたはＰであり、Ｔ１８がＡ、Ｉ、ＳまたはＶであり、Ｉ１９がＶであり、Ｎ２０がＤ、ＧまたはＴであり、Ｓ２１がＤ、Ｅ、Ｐ、ＲまたはＴであり、Ｑ２３がＥまたはＲであり、Ｓ２４がＥまたはＴであり、Ｅ２５がＡ、Ｄ、ＧまたはＴであり、Ｄ２６がＮであり、Ｖ２７がＡ、Ｌ、Ｅ、ＧまたはＳであり、Ａ２８がＧであり、Ｓ２９がＤ、Ｅ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、ＮまたはＶであり、Ｙ３０がＣであり、Ｆ３１がＨ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷである。

【0027】

特定のさらなる実施形態において、配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＦＲ４領域は、以下のアミノ酸置換により修飾することができる：Ｌ９がＩである。さらに、１つまたは複数の以下の置換をさらにもたらすことができる：Ｆ１がＩまたはＬであり、Ｑ３がＬであり、Ｔ５がＳであり、Ｋ６がＭ、ＮまたはＲであり、Ｌ７がＭまたはＶであり、Ｅ８がＡ、ＤまたはＫであり、Ｌ９がＦ、ＭまたはＶであり、Ｋ１０がＡ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＶである。
特定のさらなる実施形態において、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ１領域は、以下のアミノ酸置換により修飾することができる：Ｎ１３がＫであり得る。さらに、１つまたは複数の以下の置換をさらにもたらすことができる：Ｋ５がＱであり得、Ｇ１０がＤであり得、Ｌ１１がＱであり得、Ｖ１２がＭであり得、Ｎ１３がＭまたはＲであり得、Ｐ１４がＩまたはＳであり得、Ｓ１５がＡまたはＧであり得、Ｑ１６がＥであり得、Ｔ１７がＡであり得、Ｓ１９がＴであり得、Ｔ２１がＳまたはＶであり得、Ｔ２３がＡ、ＦまたはＳであり得、Ｖ２４がＩであり得、Ｓ２５がＴであり得、Ｇ２６がＡであり得、Ｆ２７がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、ＱまたはＳであり得、Ｓ２８がＤ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、ＮまたはＰであり得、Ｌ２９がＤ、Ｓ、ＴまたはＶであり得、Ｔ３０がＥ、Ｉ、ＮまたはＲであり得る。

【0028】

特定のさらなる実施形態において、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ２領域は、以下のアミノ酸置換により修飾することができる：Ｗ１２がＦである。さらに、１つまたは複数の以下の置換をさらにもたらすことができる：Ｖ２がＬであり得、Ａ５がＰ、ＳまたはＶであり得、Ｋ８がＷであり得、Ｇ９がＲであり得、Ｌ１０がＰまたはＷであり得、Ｗ１２がＥ、Ｈ、Ｒ、ＶまたはＹであり得、Ｇ１４がＡ、ＤまたはＳであり得る。

【0029】

特定のさらなる実施形態において、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ３領域は、以下のアミノ酸置換の１つまたは複数により修飾することができる：Ｔ３がＳであり、Ｒ６がＫであり、Ｆ１４がＹであり、Ｑ１６がＴであり、Ｍ１７がＬであり、Ｒ３２がＧである。さらに、Ａ２がＣ、Ｇ、Ｉ、ＴまたはＶであり得、Ｔ３がＤ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＲであり得、Ｉ４がＶであり、Ｔ５がＩ、ＬまたはＳであり、Ｒ６がＥまたはＳであり、Ｄ７がＥまたはＮであり、Ｔ８がＡ、Ｅ、Ｉ、Ｐ、ＳまたはＹであり、Ｓ９がＥ、Ｇ、ＫまたはＴであり、Ｋ１０がＥ、Ｌ、Ｎ、ＱまたはＲであり、Ｓ１１がＧ、Ｋ、ＮまたはＲであり、Ｑ１２がＥ、ＨまたはＲであり、Ｖ１３がＡ、Ｉ、Ｌ、ＦまたはＳであり、Ｆ１４がＬ、Ｒ、Ｓ、ＴまたはＶであり、Ｌ１５がＶであり、Ｑ１６がＩであり、Ｍ１７がＶであり、Ｎ１８がＤ、Ｋ、Ｒ、ＳまたはＴであり、Ｓ１９がＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、ＭまたはＴであり、Ｌ２０がＭまたはＶであり、Ｔ２１がＳであり、Ｓ２２がＤ、Ｅ、ＧまたはＲであり、Ｅ２３がＤまたはＧであり、Ｔ２５がＡであり、Ａ２６がＳであり、Ｖ２７がＤであり、Ｙ２９がＡ、Ｆ、ＩまたはＷであり、Ａ３１がＥ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＶであり、Ｒ３２がＡ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＫまたはＳである。

【0030】

特定のさらなる実施形態において、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＦＲ４領域は、以下のアミノ酸置換により修飾することができる：Ｑ３がＰである。
本発明の上述の態様の特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一般的に、抗体は、ウマ抗体である。
本発明の上述の態様の特定のさらなる実施形態において、本発明のウマ化ＮＧＦ中和抗体、またはそれに由来する結合性断片は、１×１０^-8以下の平衡解離定数（Ｋ_D）を有する結合親和性でウマＮＧＦ（神経成長因子）に特異的に結合する。さらに、該ウマ化抗体がウマに存在する他のエピトープに対して交差反応性でないこと、さらに、それらをウマに投与した場合に本発明の抗体に対する中和抗体が発生しないことが好ましい。さらに、抗体の定常ドメインが、補体結合および活性化、ＡＤＣＣならびにＦｃ受容体結合および活性化を含むが、これらに限定されない下流エフェクター機能を媒介しないことが好ましい。

【0031】

特定のさらなる実施形態において、重鎖の定常領域のアミノ酸配列の修飾は、本発明の抗体に対して行うことができる。前記修飾は、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換または欠失を含み得る。前記アミノ酸変化は、一般的に抗体の機能特性を修正するために行われる。例えば、アミノ酸修飾は、例えば、Ｆｃ受容体に結合する、補体を活性化する、またはＡＤＣＣを誘導する抗体の能力を妨げることによって、抗体の定常ドメインにより媒介される下流エフェクター機能を妨げるために行うことができる。さらに、修飾は、ウマに投与する場合の抗体の循環半減期を修正するために、重鎖定常ドメインのヒンジ領域に対して行うことができる。
一般的に、抗体の重鎖定常ドメインは、該定常ドメインが下流エフェクター機能を媒介しないように選択するか、またはアミノ酸置換もしくは欠失により修飾する。一般的に前記重鎖は、ウマＨＣ２またはＨＣ６重鎖である。さらにより一般的には、前記重鎖は、ウマＨＣ２重鎖である。
さらなるまたは関連態様において、本発明は、１つまたは複数のウマ可溶性タンパク質に特異的に結合する抗体またはその結合性断片に及び、抗体は、下流エフェクター機能を媒介せず、抗体は、プロテインＡへの結合により精製される。

【0032】

特定の実施形態において、ＣＳＦ、インターロイキン、成長因子およびニューロトロフィンからなる群から選択される。特定の実施形態において、１つまたは複数の可溶性タンパク質は、ニューロトロフィンである。特定の実施形態において、１つまたは複数の可溶性タンパク質は、ＮＧＦである。

【0033】

特定の実施形態において、抗体は、抗体が下流エフェクター機能を媒介しないように選択されたまたはアミノ酸置換もしくは欠失により修飾された重鎖を含む。
特定の実施形態において、抗体は、ＨＣ２アイソタイプを有する重鎖を含む。ＨＣ２アイソタイプを含む抗体は、エフェクター機能を欠き、プロテインＡカラムまたはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製できることが示された。
特定の実施形態において、抗体は、例えば、プロテインＡカラムまたはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いたプロテインＡへの結合による精製後に得られた抗体である。
特定の実施形態において、抗体は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号２のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５、９０、９５もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列と同じまたは実質的に相同であるアミノ酸配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。

【0034】

特定の実施形態において、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％、より好ましくは９５％、より好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有する配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる軽鎖を含む。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。
特定の実施形態において、抗体は、配列番号５もしくは配列番号６のアミノ酸配列またはそれとの少なくとも８５％の同一性、より好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む、それからなるまたは本質的にそれからなる重鎖を含む。特定の実施形態において、前記同一性は、少なくとも約１５アミノ酸、好ましくは約２０アミノ酸、より好ましくは約２５アミノ酸の長さにわたる。
特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。一般的に、抗体は、ウマ化抗体である。

【0035】

特定のさらなる実施形態において、本発明の抗体、またはそれに由来する結合性断片は、１×１０^-8以下の平衡解離定数（Ｋ_D）を有する結合親和性でウマＮＧＦ（神経成長因子）に特異的に結合する。さらに、抗体がウマに存在する他のエピトープに対して交差反応性でないこと、さらに、それらをウマに投与した場合に本発明の抗体に対する中和抗体が発生しないことが好ましい。
特定の実施形態において、抗体、またはその抗原結合性断片は、下流エフェクター機能を媒介しない。一般的に、抗体または結合性断片は、ウマ重鎖サブタイプＨＣ２を有する。
特定の実施形態において、ウマ化抗体は、本発明の第１の態様の抗体を調製する方法に従って調製する。
本発明は、ウマＮＧＦに結合し、ウマｐ７５およびＴｒｋＡ受容体に結合するその能力を奪う抗体断片に及ぶ。

【0036】

特定の実施形態において、本発明の抗体のいずれかの抗体結合性断片は、フレキシブルリンカーにより連結されて単鎖抗体を形成する本発明の重鎖および軽鎖配列を含み得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＶＨおよびＶＬドメインを含む。ＶＨおよびＶＬドメインは、結合して標的結合部位を形成する。これらの２つのドメインは、ペプチドリンカーによって共有結合により連結されている。ｓｃＦｖ分子は、軽鎖可変ドメインがＮ末端において必要である場合にはＶＬ−リンカー−ＶＨの形態を、またはＶＨドメインがＮ末端において必要である場合にはＶＨ−リンカー−ＶＬとしての形態を有し得る。したがって、特定のさらなる実施形態において、抗原結合性断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片である。特定のさらなる実施形態において、抗体結合性断片は、Ｆａｂ抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、Ｆ（ａｂ’）₂抗体断片、Ｆｖ抗体断片、ｓＦＶ抗体断片および同類のものからなるが、これらに限定されない群から選択される。

【0037】

特定のさらなる実施形態において、本発明は、併用療法用の異なる結合特異性を有する他の抗体と連結または結合した本発明の抗ＮＧＦ抗体または結合性断片を含む多重特異性または多価抗体を提供する。多重特異性抗体は、第１のＮＧＦエピトープに特異的な少なくとも１つの抗体または結合性断片およびウマＮＧＦ上に存在する他のエピトープまたは異なる抗体に特異的な少なくとも１つの結合部位を含む。多価抗体は、同じＮＧＦエピトープに対する結合特異性を有する抗体または抗体結合性断片を含む。したがって、特定の実施形態において、本発明は、本発明のウマ化抗体の４つ以上のＦｖ領域またはＦａｂ領域を含む抗体融合タンパク質に及ぶ。さらなる実施形態は、本明細書で述べる抗体に由来する１つまたは複数のＦａｂ領域ならびにウマＮＧＦに特異的な抗体の１つまたは複数のＦａｂまたはＦｖ領域を含む抗体融合タンパク質に及ぶ。特定のさらなる実施形態において、本発明は、本発明による抗体またはその結合性断片が第２の標的に対する結合特異性を有する第２の抗体またはその結合性断片に連結されていて、前記標的がウマＮＧＦでない、二重特異性抗体に及ぶ。好ましくは、前記第２の標的は、ｐ７５またはＴｒｋＡ受容体を介するＮＧＦ媒介性シグナル伝達を妨げることを促進する。そのような多価、二重特異性または多重特異性抗体は、当業者に周知であると思われる様々な組換え法により作製することができる。

【0038】

本発明のさらに他の態様において、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む抗ニューロトロフィン中和抗体を提供する。特定の実施形態において、ニューロトロフィンは、ウマ神経成長因子（ＮＧＦ）である。
本発明のさらに他の態様は、ウマにおける疼痛を治療、阻害または改善する方法であって、
−治療有効量の、ウマ化抗体である抗ウマＮＧＦ抗体またはその抗原結合性断片を提供するステップと、
−それを必要とするウマにそれを投与するステップと
を含む、方法を提供する。

【0039】

特定の実施形態において、ウマ化抗体は、配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれとの少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号２のアミノ酸配列もしくはそれとの少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
特定の実施形態において、ウマ化抗体は、配列番号４のアミノ酸配列もしくはそれとの少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ならびに／または配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９および前述のものとの少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、それからなるもしくは本質的にそれからなる重鎖を含む。
特定の実施形態において、ウマ化抗体またはその抗原結合性断片は、本発明の前述の態様によって提供されるもののいずれかである。

【0040】

特定の実施形態において、疼痛は、神経障害性疼痛である。特に、疼痛は、術後または外科手術後疼痛であり得る。術後疼痛は、ウマにおける整形外科手術、軟組織外科手術、卵巣子宮摘出処置および同類のものを含むが、これらに限定されない手術処置後に生じ得る。特定のさらなる実施形態において、疼痛は、癌および癌性状態に関連する慢性疼痛（腫瘍疼痛）である。特定のさらなる実施形態において、疼痛は、炎症、掻痒症、関節リウマチまたは変形性関節症に関連する、または起因する。特定のさらなる実施形態において、疼痛は、手掌足底疼痛（palmar foot pain）、蹄底挫傷（subsolar brusing）、蹄葉炎、蹄膿瘍、展示後外傷（post showing trauma）、レース後外傷（post race trauma）、舟状骨症候群および近位けい靭帯炎に関連する、または起因する。

【0041】

本発明のさらなる態様によれば、ウマ対象における関節炎の治療の方法であって、
−治療有効量の本発明による抗ウマＮＧＦ抗体またはその抗原結合性断片を提供するステップと、
−それを必要とするウマにそれを投与するステップと
を含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、抗体は、ウマ化抗体である。特定の実施形態において、ウマ化抗体は、配列番号１もしくは配列番号３のアミノ酸配列もしくはそれとの少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列もしくはそれとの少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0042】

特定の実施形態において、関節炎または関節炎状態は、免疫介在性多発性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症および関連状態からなる群から選択される状態を含む。
一般的に、関節炎または関節炎状態の治療は、関節炎状態に関連する、または起因する疼痛を改善すること、阻害すること、低減すること、抑制することまたはその発症を遅延させることを含む。
本発明のさらなる態様は、ウマ対象における神経成長因子（ＮＧＦ）に対する感受性の増大により引き起こされる、関連する、またはそれをもたらす状態の治療の方法であって、
−治療有効量の本発明による抗ウマＮＧＦ抗体またはその抗原結合性断片を提供するステップと、
−それを必要とするウマにそれを投与するステップと
を含む、方法を提供する。

【0043】

本発明のさらなる態様によれば、ウマにおけるＮＧＦにより増殖するように誘導される腫瘍およびそれに関連する状態の治療の方法であって、
−治療有効量の本発明による抗ウマＮＧＦ抗体またはその抗原結合性断片を提供するステップと、
−それを必要とするウマにそれを投与するステップと
を含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、腫瘍は、骨肉腫である。特定の実施形態において、腫瘍は、自己分泌型または傍分泌型ＮＧＦにより増殖するように誘導される。
特定の実施形態において、本発明の前述の方法は、本発明の抗ＮＧＦ抗体の有効性を増大させ、かつ／または補完し得る少なくとも１つのさらなる薬剤を同時投与するステップをさらに含む。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも１つの鎮痛薬、ＮＳＡＩＤ、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド、ヒアルロナンまたはヒアルロン酸とともに同時投与することができる。
適切な鎮痛薬の例は、ブトルファノール、ブプレノルフィン、フェンタニル、フルニキシンメグルミン、メルピジン、モルヒネ、ナルブフィンおよびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。適切なＮＳＡＩＤｓは、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、カルプロフェン、エトドラク、ケトプロフェン、メロキシカム、フィロコキシブ、ロベナコキシブ、デラコキシブなどを含むが、これらに限定されない。

【0044】

特定のさらなる実施形態において、少なくとも１つのさらなる薬剤は、抗生物質、抗真菌薬、抗原虫薬、抗ウイルス薬または同様な治療薬から選択される１つまたは複数の群であり得る治療上有効な薬剤であり得る。さらに、少なくとも１つのさらなる薬剤は、ＰＧＥ受容体アンタゴニストなどの炎症のメディエーター（単数または複数）の阻害薬、シクロスポリンなどの免疫抑制薬、抗炎症性グルココルチコイドであり得る。特定のさらなる態様において、少なくとも１つのさらなる薬剤は、高齢ウマにおいてますます優勢になり得る記憶喪失または関連状態などの認知機能不全または障害の治療に用いられる薬剤であり得る。さらに、少なくとも１つのさらなる薬剤は、例えば、高血圧、心筋虚血、うっ血性心不全などを治療するための抗高血圧薬または心血管機能不全の治療に用いられる他の化合物であり得る。さらに、少なくとも１つのさらなる薬剤は、利尿薬、血管拡張薬、ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩ変換酵素阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、フェニルブタゾン、ヒアルロン酸、多硫酸化グリコサミノグリカン、インターロイキン１受容体アンタゴニスト、ＩＲＡＰ、ジクロフェナクおよび疾患修飾性変形性関節症薬であり得る。

【0045】

特定の実施形態において、抗体または抗原結合性断片は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、特に０．０３ｍｇ／ｋｇ体重〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で前述の方法の一部としてウマに投与する。
様々なさらなる態様において、本発明は、本発明のいずれかの前述の態様による抗体またはその結合性断片を含む組成物に及ぶ。特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含む。
本発明のさらなる態様は、薬学的に有効な量の本発明による抗ウマＮＧＦウマ化抗体を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と一緒に含む、ウマにおける疼痛、または慢性疼痛をもたらす、もしくはそれによって引き起こされる状態を治療するための医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１つの鎮痛薬、ＮＳＡＩＤ、オピオイド、コルチコステロイドまたはステロイドをさらに含み得る。

【0046】

様々なさらなる態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体結合性断片をコードする単離核酸に及ぶ。
したがって、本発明のさらに他の態様は、本発明の前述の態様のいずれかによる抗体または抗原結合性断片をコードする単離核酸を提供する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗ウマＮＧＦウマ化抗体の軽鎖可変ドメインまたは配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体断片または配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖をコードする。
特定のさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗ウマＮＧＦウマ化抗体の重鎖可変ドメインまたは配列番号２のアミノ酸配列を有する抗体断片または配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖をコードする。

【0047】

特定の実施形態において、単離核酸は、それに作動可能に連結した１つまたは複数の調節配列をコードする核酸をさらに含む。
さらなる態様において、本発明の重および／または軽鎖可変ドメインあるいは重および／または軽鎖定常ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。特定の実施形態において、発現ベクターは、１つまたは複数の調節配列をさらに含む。特定の実施形態において、ベクターは、プラスミドまたはレトロウイルスベクターである。
さらに他の態様は、本発明の前述の態様の発現ベクターを組み込んだ宿主細胞を提供する。本発明のさらなる態様は、本発明の前述の態様のいずれかの抗体を産生する宿主細胞を提供する。

【0048】

本発明のさらに他の態様は、本発明の前述の態様の宿主細胞を培養して、細胞がウマ化抗ウマＮＧＦ中和抗体を発現することを可能にするステップを含む、ウマ化抗ウマＮＧＦ中和抗体を製造する方法を提供する。

【0049】

本発明のさらに他の態様は、適切な宿主細胞中で本発明の抗体の軽および／または重鎖を発現する本発明の前述の態様の１つまたは複数のポリヌクレオチド／核酸またはベクターを発現させるステップと、宿主細胞中で一緒に、または異なる宿主細胞中で別個に発現させることができる、発現ポリペプチドを回収するステップと、抗体を単離するステップとを含む、本発明による抗ウマＮＧＦウマ化抗体を製造する方法を提供する。
本発明のさらに他の態様は、ウマにおける疼痛を治療する、改善するまたは抑制する方法であって、本発明の前述の態様のいずれかによる有効量のポリヌクレオチドをウマに投与するステップを含む、方法を提供する。
本発明のさらに他の態様は、ウマにおける疼痛の治療、予防または改善に用いる本発明の前述の態様のいずれかによる抗体もしくは抗体結合性断片、または本発明の前述の態様による医薬組成物、または本発明の前述の態様による核酸、または本発明の前述の態様のいずれかによるベクターを提供する。

【0050】

特定の実施形態において、疼痛は、急性疼痛である。さらなる実施形態において、疼痛は、慢性疼痛である。さらに、疼痛は、術後疼痛、またはウマにおける整形外科手術、軟組織外科手術、卵巣子宮摘出処置および同類のものを含み得るが、これらに限定されない、いずれかの手術処置に起因する疼痛であり得る。特定のさらなる実施形態において、疼痛は、癌または癌性状態に関連する慢性疼痛である。特定のさらなる実施形態において、疼痛は、炎症、掻痒症、関節リウマチまたは変形性関節症に関連する、または起因する。疼痛は、手掌足底疼痛、蹄底挫傷、蹄葉炎、蹄膿瘍、展示後外傷、レース後外傷、舟状骨症候群および近位けい靭帯炎に関連する、または起因する。

【0051】

本発明のさらに他の態様は、治療または変形性関節症および／または関節リウマチに用いる本発明の前述の態様のいずれかによる抗体もしくは抗体結合性断片、または本発明の前述の態様による医薬組成物、または本発明の前述の態様による核酸、または本発明の前述の態様のいずれかによるそれを含むベクターを提供する。
本発明のさらに他の態様は、ウマにおけるＮＧＦにより増殖するように誘導された腫瘍およびそれに関連する状態、特に骨肉腫の治療に用いる本発明の前述の態様のいずれかによる抗体もしくは抗体結合性断片、または本発明の前述の態様による医薬組成物、または本発明の前述の態様のいずれかによる核酸もしくはそれを含むベクターを提供する。特定の実施形態において、腫瘍は、自己分泌型または傍分泌型ＮＧＦにより増殖するように誘導される。
本発明のさらに他の態様は、ウマにおける疼痛の治療または予防用の医薬の調製における本発明の前述の態様のいずれかによる抗体もしくは抗体結合性断片、または本発明の前述の態様による医薬組成物、または本発明の前述の態様による核酸、または本発明の前述の態様のいずれかによるそれを含むベクターの使用を提供する。

【0052】

疼痛は、急性または慢性疼痛であり得る。特定の実施形態において、疼痛は、慢性疼痛である。さらに、疼痛は、術後疼痛、またはウマにおける整形外科手術、軟組織外科手術および同類のものを含み得るが、これらに限定されない、いずれかの手術処置に起因する疼痛であり得る。特定のさらなる実施形態において、疼痛は、癌または癌性状態に関連する慢性疼痛である。特定のさらなる実施形態において、疼痛は、炎症、掻痒症、関節リウマチまたは変形性関節症に関連する、または起因し、さらに手掌足底疼痛、蹄底挫傷、蹄葉炎、蹄膿瘍、展示後外傷、レース後外傷、舟状骨症候群および近位けい靭帯炎に関連する、または起因する。
本発明のさらに他の態様は、ウマにおける関節リウマチまたは変形性関節症の治療、阻害、改善または予防用の医薬の調製における、本発明の前述の態様のいずれかによる抗体もしくは抗体結合性断片、または本発明の前述の態様による医薬組成物、または本発明の前述の態様による核酸、または本発明の前述の態様のいずれかによるそれを含むベクターの使用を提供する。

【0053】

本発明のさらに他の態様は、ウマにおけるＮＧＦにより増殖するように誘導された腫瘍およびそれに関連する状態、特に骨肉腫の治療用の医薬の調製における本発明の前述の態様のいずれかによる抗体もしくは抗体結合性断片、または本発明の前述の態様による医薬組成物、または本発明の前述の態様のいずれかによる核酸もしくはそれを含むベクターの使用を提供する。特定の実施形態において、腫瘍は、自己分泌型または傍分泌型ＮＧＦにより増殖するように誘導される。
さらに他の態様において、本発明による抗ウマＮＧＦ中和モノクローナル抗体またはその断片を産生する細胞系、またはその派生もしくは子孫細胞を提供する。

【0054】

本発明のさらに他の態様は、本発明の前述の態様のいずれかによる抗ウマＮＧＦ抗体およびそれの使用説明書を含む、ウマにおける疼痛の治療用、または疼痛に関連する状態の治療用、または変形性関節症、関節リウマチ、炎症、掻痒症、手掌足底疼痛、蹄底挫傷、蹄葉炎、蹄膿瘍、展示後外傷、レース後外傷、舟状骨症候群および近位けい靭帯炎に関連する疼痛の治療、改善もしくは阻害用キットを提供する。
本発明のさらに他の態様は、前記抗体の濃度を測定するのに用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの体液中の抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体の検出用の診断キットを提供する。キットは、本発明の抗体のいずれかまたはその結合性断片を含み得る。キットは、それの使用説明書を含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1】マウスおよびウマＮＧＦへの本発明により産生させたウマ化抗体の結合を示すグラフである。

【図2】重鎖に特異的な抗ウマポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより明らかにされた本発明のウマ化抗体のプロテインＡ精製を示すゲル（Ａ）およびＳＤＳ−Ｐａｇｅを用いたウマ化抗体の精製の結果を示すゲル（Ｂ）を示す図である。

【図3】ウマ化抗体によるＴＦ−１細胞のＮＧＦ誘導性増殖の抑制を示すグラフである。

【図4】抗原捕捉ウマ化抗体により誘導される補体沈着の欠如を示すグラフである。

【図5】ウマ化抗ＮＧＦの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。Ｋａｂａｔ番号付けにより同定された３つのＣＤＲ領域に下線が引かれている。特定の残基の上のアスタリスクは、ラットａＤ１１抗マウスＮＧＦモノクローナル抗体との配列の差異を示す。

【図6】ウマ化抗ＮＧＦの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。Ｋａｂａｔ番号付けにより同定された３つのＣＤＲ領域に下線が引かれている。特定の残基の上のアスタリスクは、ラットａＤ１１抗マウスＮＧＦモノクローナル抗体との配列の差異を示す。

【図7】ウマ化抗ＮＧＦ軽鎖可変ドメインウマカッパ軽鎖（ｅｑＮ−ｋＬＣ）抗体のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。可変ドメイン残基は、肉太字で示されている。

【図8】ウマ化抗ＮＧＦ重鎖可変ドメインウマＩｇＧ−２重鎖（ｅｑＮ−ＨＣ２（ＩｇＧ２））のアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。可変ドメイン残基は、肉太字で示されている。

【図9】ＨＣ６重鎖定常ドメインを有するウマ化抗ＮＧＦ重鎖可変ドメインウマＩｇＧ−６重鎖（ｅｑＮ−ＨＣ６（ＩｇＧ２））のアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。可変ドメイン残基は、肉太字で示されている。

【図10A】ウマ化抗ＮＧＦ ＭＡｂｓのＨＣ２およびＨＣ６アイソタイプ変異型のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィープロファイルの比較を示す図である。図１０ＡおよびＣに２型（ＨＣ２、図１０Ａ）および６型（ＨＣ６、図１０Ｃ）抗体のＣＨＯトランスフェクタント上清の負荷後のＵＶ吸光度（黒色線）および伝導度プロファイル（灰色線）を示す。図１０ＢおよびＤにカラムからの抗体の回収（定量的ＥＬＩＳＡにより測定）を示し、実質的にすべてのＨＣ２抗体がカラムに結合し、特異的溶出により回収された（図１０Ｂ）が、ＨＣ６抗体のいずれもカラムにより結合されなかった（図１０Ｄ）ことを示す。

【図10B】ウマ化抗ＮＧＦ ＭＡｂｓのＨＣ２およびＨＣ６アイソタイプ変異型のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィープロファイルの比較を示す図である。図１０ＡおよびＣに２型（ＨＣ２、図１０Ａ）および６型（ＨＣ６、図１０Ｃ）抗体のＣＨＯトランスフェクタント上清の負荷後のＵＶ吸光度（黒色線）および伝導度プロファイル（灰色線）を示す。図１０ＢおよびＤにカラムからの抗体の回収（定量的ＥＬＩＳＡにより測定）を示し、実質的にすべてのＨＣ２抗体がカラムに結合し、特異的溶出により回収された（図１０Ｂ）が、ＨＣ６抗体のいずれもカラムにより結合されなかった（図１０Ｄ）ことを示す。

【図10C】ウマ化抗ＮＧＦ ＭＡｂｓのＨＣ２およびＨＣ６アイソタイプ変異型のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィープロファイルの比較を示す図である。図１０ＡおよびＣに２型（ＨＣ２、図１０Ａ）および６型（ＨＣ６、図１０Ｃ）抗体のＣＨＯトランスフェクタント上清の負荷後のＵＶ吸光度（黒色線）および伝導度プロファイル（灰色線）を示す。図１０ＢおよびＤにカラムからの抗体の回収（定量的ＥＬＩＳＡにより測定）を示し、実質的にすべてのＨＣ２抗体がカラムに結合し、特異的溶出により回収された（図１０Ｂ）が、ＨＣ６抗体のいずれもカラムにより結合されなかった（図１０Ｄ）ことを示す。

【図10D】ウマ化抗ＮＧＦ ＭＡｂｓのＨＣ２およびＨＣ６アイソタイプ変異型のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィープロファイルの比較を示す図である。図１０ＡおよびＣに２型（ＨＣ２、図１０Ａ）および６型（ＨＣ６、図１０Ｃ）抗体のＣＨＯトランスフェクタント上清の負荷後のＵＶ吸光度（黒色線）および伝導度プロファイル（灰色線）を示す。図１０ＢおよびＤにカラムからの抗体の回収（定量的ＥＬＩＳＡにより測定）を示し、実質的にすべてのＨＣ２抗体がカラムに結合し、特異的溶出により回収された（図１０Ｂ）が、ＨＣ６抗体のいずれもカラムにより結合されなかった（図１０Ｄ）ことを示す。

【図11】本発明の方法に対応した方法により調製された抗イヌＮＧＦモノクローナル抗体がイヌにおける炎症性疼痛を低減することを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0056】

広範な実験の後に、発明者は、ラット抗マウスＮＧＦモノクローナル抗体（ＭＡｂ）αＤ１１アミノ酸配列を選び、これを用いて非免疫原性抗ＮＧＦ抗体を製造した。キメラまたはウマ化抗体であってよい、得られた抗体は、標準的ＣＤＲ移植技術を用いて製造されるものでなく、驚くべきことにウマＮＧＦに対する高親和性結合を示すことが示されている。さらに驚くべきことに、該抗体は、細胞ベース受容体ＴｒｋＡおよびｐ７５へのＮＧＦの結合を非常に特異的に阻害することによってウマＮＧＦの生物学的機能を中和することが示されている。さらに、意外にも、ウマに投与した場合、それに対する中和抗体が産生されないことも発見された。したがって、本発明の非免疫原性抗体は、ウマにおける慢性疼痛の長期緩和に適している。

【0057】

本発明者が用いた本発明の抗体の重および軽鎖可変ドメインを生成する方法は、本発明者の解析に基づいて、それを非改変の形でウマに投与した場合に抗体に対する中和抗体が発生することにつながり得る免疫原性エピトープの存在を低減すると同時に、ＣＤＲ領域の立体配座を保持し、したがって、結合特異性およびアビディティを維持する残基による軽および重鎖可変ドメインのフレームワーク領域内に存在する特異的ラット（ドナー）アミノ酸残基の置換をもたらす。具体的には、本発明の抗体を調製する方法（ＰＥＴｉｓａｔｉｏｎとして公知）は、ドナー抗体のフレームワーク領域の配列をウマ由来の抗体または抗体のプールの配列と比較することによってドナー（例えば、ラット）抗体のフレームワーク領域の配列を、ウマへの投与の適合性について評価するステップを含む。比較は、ドナー配列と標的配列の単一メンバーとの間であってもよいが、標的配列のプールとの比較が好ましいことは明らかである。その理由は、これにより、標的種における各Ｋａｂａｔ位置における天然選択肢の数が拡大されるからである。これにより、ドナーと標的との間の「一致」の可能性が増加するだけでなく、一致が存在しない場合には置き換えの選択肢も拡大される。結果として、ドナーとできる限り近い特性による置き換えを選択することができる。ドナー配列とウマ配列がＫａｂａｔ番号または対応する位置において異なる場合、ウマにおける当該位置において自然であることが公知であるアミノ酸残基により問題のアミノ酸残基を置換するようにドナー配列を修飾する。

【0058】

ドナー免疫グロブリンフレームワーク領域に存在するアミノ酸残基の置換が必要な場合、一般的にこれは、アミノ酸残基を、ウマにおけるＫａｂａｔ位置において自然であり、ドナー配列における置換されるアミノ酸とサイズ、電荷および疎水性ができる限り密接に関連するアミノ酸残基で置き換えるという保存的置換の原則を用いて行われる。その意図は、ドナー抗体の３次元構造に擾乱または分裂を全くもたらさない、または少なくとも最小限もたらすような置き換えを選択することである。特定の状況においては、明確な選択肢がなく、各選択が利点と不利な点を有する。最終的な決定には、様々な代替配列の３次元モデリングまたは発現が必要となり得る。しかし、一般的に、明快な優先度が得られる。この処置の結果として、ドナー配列の変更は、当該残基が標的において外来性であり、置き換えアミノ酸がそれが置き換えるものとできる限り密接に関連する場合にのみ行われる。したがって、外来エピトープの形成が回避されるが、全体的な３次元構造が保存され、結果として、親和性および特異性も保存される。

【0059】

軽および重鎖定常領域は、一般的にウマ（標的）由来抗体に由来する。重鎖定常ドメインは、それらが下流エフェクター機能を媒介しないように、選択するか、または修飾する。本発明により製造される抗体に対する中和抗体が全く産生されないか、または最小限産生されることが全く驚くべきことに見いだされたので、該抗体は、長い循環半減期および反復投与の選択肢という関連利点を有することが驚くべきことに見いだされた。さらに、フレームワーク残基の置換がＣＤＲ領域の３次元配座に影響を及ぼさないような方法で行われるので、結合特異性の変化はない。

【0060】

ハイブリッドマウス−ウマキメラ抗体は公知であるが、文献に記載された完全にウマ化されたモノクローナル抗体の例は、現在のところ存在しない。したがって、そのような抗体を製造することができ、治療上の有用性を有することが示されたことは、極めて予想外である。

【0061】

４つの主要なＩｇＧアイソタイプがヒトおよびマウスに存在し、命名法は同様であるが、それらは、プロテインＡおよびプロテインＧなどの細菌産物に対する親和性、補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）を活性化するそれらの能力および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）による標的細胞の殺滅を誘導するそれらの能力を含む挙動および機能が異なる。腫瘍学または感染対策におけるような、抗体をそれらの同族抗原を有する標的細胞を除去するためにデザインする場合、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性または「武装」定常ドメインを有するＩｇＧアイソタイプの選択が臨床上有益であると考えられる（例えば、ヒト医療用途ではヒトＩｇＧ１アイソタイプが上述の目的のために好ましい）。これに反して、免疫系の活性化は、炎症、疼痛または自己免疫の緩和におけるような他の状況では望ましくないと考えられ、したがって、最小限のＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を有するヒトＩｇＧアイソタイプが好ましい（例えば、そのようなヒト医療用途ではＩｇＧ４アイソタイプがしばしば好ましい）。いくつかの異なる免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）重鎖定常ドメインアイソタイプが単一カッパおよびラムダ定常ドメイン配列とともにウマ免疫系において記載された。７つのウマ重鎖定常ドメインＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６およびＩｇＧ７は、それにより媒介される機能活性に関して特徴付けられた。ＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性定常ドメインを有するＩｇＧ４アイソタイプの選択は、腫瘍学または感染対策におけるような、抗体を同族抗原を有する標的細胞を除去するためにデザインする場合には有益であると考えられ、例えば、ヒト医療用途ではヒトＩｇＧ１アイソタイプが好ましい。これに反して、免疫系の活性化は、炎症、疼痛または自己免疫の緩和におけるような他の状況では望ましくないと考えられ、したがって、最小限または「非武装」のＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を有するヒトＩｇＧアイソタイプが好ましく、例えば、ヒト医療用途ではＩｇＧ４アイソタイプが選択されると思われる。ウマＭＡｂアイソタイプは、より広いスペクトルの活性を有し、そのため、武装または非武装重鎖の選択は、同様な価値があると推測される。

【0062】

本発明の抗体は、ウマ由来の重および軽鎖定常ドメインを含む。さらに、相補性決定領域は、ラットαＤ１１抗マウスＮＧＦ抗体に由来する。αＤ１１抗体は、Ｃａｔｔａｎｅｏら（Cattaneo A,Rapposelli B, Calissano P. (1988) “Three distinct types of monoclonal antibodies after long-term immunization of rats with mouse nerve growth factor”. J Neurochem 50(4):1003-1010）によって最初に記載された。アルファＤ１１抗体は、その後Ｒｕｂｅｒｔｉら（Ruberti F. et al. (1993) “Cloning and Expression of an Anti-Nerve Growth Factor (NGF) Antibody for Studies Using the Neuroantibody Approach”. Cellular and Molecular Neurobiology. 13(5):559-568）によってクローニングされた。

【0063】

αＤ１１抗体由来のＣＤＲ領域は、抗体がウマに投与される場合にそれに対する中和抗体が産生されることを妨げると同時に、ＣＤＲ三次構造を、したがって結合特異性を保存すると本発明者により判断されたフレームワーク領域配列と組み合わされている。

【0064】

軽および重鎖可変領域のそれぞれは、ＦＲ１〜ＦＲ４と呼ばれる４つのフレームワーク領域を含む。これらのフレームワーク領域のそれぞれについて、本発明者は、各特定位置の好ましいアミノ残基（いわゆる好ましい残基）、およびさらに当位置に備えることもできる代替アミノ酸残基を特定した。下の表１〜８に軽および重鎖のそれぞれの４つのフレームワーク領域を示す。表に当該特定フレームワーク領域に対する、およびさらに完全重または軽鎖可変ドメインの長さにそった特定の残基の位置を同定するのに用いられるＫａｂａｔ番号付けシステムよるアミノ酸位置を示す。群１残基として示す残基または複数の残基は、好ましい残基であり、一方、群２残基は、代替残基である。しかし、これらは、当該特定位置に関連して群１に示す残基に対して一般的に好ましくないと思われる。アミノ酸残基は、１文字命名方式を用いて同定する。

【0065】

【表1】

【0066】

【表2】

【0067】

【表3】

【0068】

【表4】

【0069】

【表5】

【0070】

【表6】

【0071】

【表7】

【0072】

【表8】

【0073】

したがって、本発明のウマ化抗体は、例えば、第１の種に由来する完全可変領域および第２の種に由来する定常ドメインからなるキメラモノクローナル抗体と、または重および軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ドナー抗体に由来し、標的抗体に由来するフレーム領域（ＦＲ）および定常領域（ＣＲ）に導入されたアミノ酸残基を含む、ＣＤＲ移植ウマ化抗体と、またはウマ生殖系列配列と異なっている。

【0074】

ウマ化抗体がＣＤＲが由来する親（ドナー）抗体の結合特性を実質的に保持していることが好ましい。それは、ウマ化抗体が、ＣＤＲが由来するドナー抗体と同じまたは実質的に同じ抗原結合親和性およびアビディティを示すことを意味する。理想的には、ウマ化抗体の親和性は、標的エピトープに対するドナー抗体の親和性の１０％以上、好ましくは約３０％以上であり、最も好ましくは親和性は、親（ドナー）抗体の５０％以上である。抗原結合親和性を検定する方法は、当技術分野で周知であり、半最大結合アッセイ、競合アッセイおよびＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を含む。

【0075】

上文で定義したように、本発明は、本発明のウマ化抗体に由来する結合性メンバーまたは抗原結合性断片に及ぶ。そのような抗原結合性断片は、ウマＮＧＦに特異的に結合する能力を保持している抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって果たされ得ることが示された。特定の実施形態において、結合性メンバーまたは抗原結合性断片は、単離結合性メンバーであり得る。本発明の結合性メンバーまたは抗原結合性断片は、本発明の抗体の断片、例えば、重もしくは軽鎖のみなどの完全にウマ化された抗体分子の断片、あるいは、例えば、重および／または軽鎖の可変ドメインを含み得る。特定の実施形態において、結合性メンバーは、一般的に抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含み、からなりまたはから本質的になり得る。結合性メンバーのＶＨドメインも本発明の一部として提供する。ＶＨおよびＶＬドメインのそれぞれの中に３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）ならびに４つの関連フレームワーク領域（「ＦＲｓ」）が存在する。ＶＨドメインは、一般的に３つのＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）を含み、ＶＬドメインは、一般的に３つのＬＣＤＲ（軽鎖相補性領域）を含む。したがって、結合性メンバーは、順にＶＨ ＣＤＲ１（またはＨＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）領域ならびに複数の関連フレームワーク領域を含み得る。結合性メンバーは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに関連フレームワーク領域を含むＶＬドメインをさらにまたは代わりになるべきものとして含み得る。ＶＨまたはＶＬドメインは、一般的に、次の配列で３つの相補性決定領域が組み入れられている４つのフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。

【0076】

図５に本発明による抗ＮＧＦ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に下線が引かれている。さらに図６に本発明による抗ＮＧＦ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に下線が引かれている。

【0077】

図５および６において、軽鎖可変ドメイン（図５）および重鎖可変ドメイン（図６）の残基は、Ｋａｂａｔら（Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K. and Foeller, C.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391）によって考案された番号付けシステムに従って好都合に番号付けすることができる。Ｋａｂａｔの番号付けシステムは、抗体の重および軽鎖可変領域またはその抗原結合性部分における他のアミノ酸残基より可変性（すなわち、超可変性）であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを意味する。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般的に可変ドメインにおける残基（おおよそ軽鎖の残基１〜１０４および重鎖の残基１〜１１３）に言及する場合に用いられる。この番号付けシステムは、明確に述べる場合にのみ本明細書で用いる。これは、Ｋａｂａｔの残基表示が、本明細書に示した当該の配列に示された本発明の重および軽鎖可変領域のアミノ酸残基の直線的番号付け（linear numbering）に必ずしも直接的に対応するとは限らないためである。特に、実際の線状アミノ酸配列は、重または軽鎖の基本可変ドメイン構造の構造成分（フレームワーク領域であろうと相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと）の短縮またはそれへの挿入に対応する厳格なＫａｂａｔ番号付けより少数のまたは付加的なアミノ酸を含み得る。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けが適用された標準配列を有する抗体の配列における残基のアライメントによって所定の抗体について決定することができる。

【0078】

図６に重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。これは、配列番号２にも示されている。しかし、図６において、番号付けは、アミノ酸残基８０、８０Ａ、８０Ｂおよび８０Ｃを考慮するものであり、これらがＫａｂａｔ番号付け規定であるのに対して、配列番号２においては、直線的番号付けが連続的に続き、当残基８０、８０Ａ、８０Ｂおよび８０Ｃが８０、８１、８２および８３と順次示されている。同じことが図７におけるＫａｂａｔ残基１００、１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ、１００Ｄ、１００Ｅおよび１００Ｆに当てはまる。

【0079】

上文で述べたように、抗体結合性断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびｓｃＦｖ（単鎖可変断片）、またはペプチド模倣体由来のもの、二重特異性抗体もしくは関連多価誘導体を含むが、これらに限定されない群から選択することができる。
特定の実施形態において、抗体結合性断片は、ヘテロ四量体抗体のＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片である。特定の実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＶＨドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、ＣＬおよびＣＨ１ドメインは、ウマ免疫グロブリンのＣＬおよびＣＨ１ドメイン、特にＩｇＧ２（ＨＣ２）またはＩｇＧ６（ＨＣ６）ウマ由来定常ドメインのアミノ酸配列に基づいている。
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片の組換え産生に用いた技術は、当業者に周知であり、国際ＰＣＴ特許公開ＷＯ９２／２２３２４およびSawai et al., “Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors”, 1995, AJRI 34:26-34に開示されているものを含む。ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ断片）を製造するのに用いることができる技術の例は、その内容が参照により組み込まれる、Huston et al., “Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins”, Methods in Enzymology, vol. 203:46-88(1991)に開示されている。

【0080】

特定の実施形態において、抗体断片は、Ｍｏｒｉｍｏｔｏの方法（Morimoto et al., “Single-step purification of F(ab’)2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulins G1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW” Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)）に従ってタンパク質分解消化により全長抗体から得ることができる。抗体断片は、宿主細胞により直接産生させることもできる（Carter et al., “High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment” Bio/Technology 10:163-167(1992)）。

【0081】

ウマＮＧＦに対する結合特異性を有し、ウマＮＧＦ機能に拮抗するウマ化モノクローナル抗体を提供することに加えて、本発明はさらに、配列番号１に定義されているＶＬ（軽鎖可変）領域のアミノ酸配列および配列番号２に定義されているＶＨ（重鎖可変）領域のアミノ酸配列に基づく結合性ドメインの対を含む抗体以外の結合性メンバーに及ぶ。特に、本発明は、本発明の抗体のウマ化抗体のＶＬまたはＶＨ領域のいずれかに基づく単一結合性ドメインに及ぶ。
したがって、本発明の特定のさらなる実施形態において、本発明のヒト化抗体に由来する単一結合性ドメインを含む、それからなるまたは本質的にそれからなる結合性メンバーを提供する。特定の実施形態において、単一結合性ドメインは、配列番号２または配列番号４に定義されているＶＨ（重鎖可変ドメイン）のアミノ酸配列に由来する。そのような結合性ドメインは、ウマＮＧＦへの標的因子として用いることができる。

【0082】

特定の実施形態において、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞障害を変化させ得るＦｃ領域の修飾を含めることによる、さらなる工学技法を用いて、抗体を修飾することができる。さらに、特定の実施形態において、グリコシル化パターンの変化を有する抗体または抗体断片を製造することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体を改変して、抗体がグリコシル化される程度を増大または低下させる。ポリペプチドのグリコシル化は、一般的にＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。Ｘがプロリンを除くアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、可能なグリコシル化部位が生じる。Ｏ結合グリコシル化は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いることもできるが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖Ｎ−アセチルガラクトサミン（N-aceylgalactosamine）、ガラクトースまたはキシロースの１つの結合を意味する。本発明者は、脱グリコシル化ウマ定常ドメインを提供した。これらは、本明細書で配列番号８または配列番号９と定義されている。

【0083】

特定のさらなる実施形態において、本発明の抗ウマＮＧＦ抗体は、抗体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体と反応させることによりＰＥＧ化することができる。特定の実施形態において、抗体は、脱フコシル化されており、したがって、フコース残基を欠いている。

【0084】

特定の実施形態において、抗体の生物学的特性の修正は、（ａ）例えば、シートまたはらせんの立体配座のような、置換の部位のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクに影響を及ぼす置換を選択することによって達成することができる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従って以下のように分類することができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2^nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のように群に分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと他のクラスのメンバーとの交換を伴う。そのような置換残基も保存的置換部位または残りの（例えば、非保存的）部位に導入される可能性がある。

【0085】

様々なさらなる態様において、本発明は、パートナー分子に結合した本発明の抗ウマＮＧＦ抗体またはその抗原結合性部分を含むイムノコンジュゲートに及ぶ。特定の実施形態において、そのような抗体−パートナー分子コンジュゲートは、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカーまたはジスルフィドリンカーなどの化学的リンカーによりコンジュゲートされる。特定の実施形態において、結合パートナーは、エフェクター分子、標識、薬物または担体分子である。本発明の抗体をペプチジルおよび非ペプチジル結合パートナーの両方に結合させるための適切な技術は、当業者に周知である。適切な標識の例としては、放射性標識などの検出可能な標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチンなどの化学構成部分などがある。あるいは、標識は、機能的標識、例えば、リシン、またはプロドラッグを抗体結合部位において活性薬に変換することができるプロドラッグであり得る。

【0086】

様々なさらなる態様において、本発明は、本発明のウマ化抗体、抗体断片および結合性メンバーをコードするポリヌクレオチド、特に単離ポリヌクレオチドに及ぶ。本明細書で定義するように、「ポリヌクレオチド」は、一本および二本鎖ＲＮＡならびに一本および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡを制限なく含む、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチド、例えば、本発明のポリペプチドまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、その対立遺伝子変異体および／または中もしくは高緊縮性の条件下でそのようなヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むそれらの相補体を含む。

【0087】

本発明はさらに、本発明のウマＮＧＦ抗体に基づくドメイン抗体、ナノボディ（nanobody）、ユニボディ（unibody）、ヴァーサボディ（versabody）およびデュオカリン（duocalin）などの抗体模倣体に及ぶ。様々な抗体模倣技術が当業者に公知である。例えば、いわゆるドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ、ＵＫ）は、ヒト抗体の軽または重鎖の可変領域に対応する抗体の小機能性結合ユニットである。そのようなドメイン抗体の製造のための指示は、米国特許第６，２９１，１５８号、米国特許第６，５８２，９１５号および米国特許第６，５９３，０８１号に見いだすことができる。ナノボディは、ラクダ科の動物に見いだされる天然重鎖抗体の独特な構造および機能特性を含む抗体由来の治療用タンパク質である。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づくさらなる抗体断片技術である。ヒンジ領域の欠失により、伝統的なＩｇＧ４抗体のサイズのほぼ半分であり、１価結合性領域を有する分子が生ずる。ユニボディは、不活性であり、したがって、免疫応答を誘導しないというＩｇＧ４抗体の特性を保存している。

【0088】

さらなる結合性分子は、アフィボディ（affibody）分子（米国特許第５，８３１，０１２号）、ＤＡＲＰｉｎｓ（デザインされたアンキリン反復タンパク質）（国際ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０２／２０５６５）およびアンチカリン（anticalin）（米国特許第７，２５０，２９７号およびＷＯ９９／１６８７３）などである。ベラボディ（verabody）は、さらなる抗体模倣技術である。ヴァーサボディ（Ａｍｕｎｉｘ、米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２）は、タンパク質が一般的に示す疎水性コアを置き換える高ジスルフィド結合密度の足場を形成する１５％を超えるシステイン残基を有する３〜５ｋＤａの微小タンパク質と呼ばれる小タンパク質である。

【0089】

アビマー（avimer）は、他のタイプの抗体模倣体である。アビマーは、ヒト血清タンパク質のファミリーの組換えにより得られる。それらは、それぞれが特定の標的部位に結合するようにデザインされたモジュラー結合ドメインから構成されている単一タンパク質鎖である。アビマーは、単一タンパク質標的上の部位および／または複数のタンパク質標的上の部位に同時に結合することができる。多点結合またはアビディティとして公知である、この結合メカニズムは、細胞と分子が体内で相互作用する方法を模倣し、アンタゴニストおよびアゴニストの発生を支援し、複数の機能および強力な活性を有する薬物を生じさせる。アビマーライブラリーは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０４４０１１および例えば、ＵＳ２００５／００５３９７３に従って製造することができる。アビマーライブラリーはまた、Ａｖｉｄｉａ Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡにより市販されている。

【0090】

抗体の製造
本発明の抗体および結合性メンバーは、化学合成により完全にまたは部分的に製造することができる。例えば、本発明の抗体および結合性メンバーは、標準的液体ペプチド合成などの当業者に周知である技術により、または固相ペプチド合成法により調製することができる。あるいは、抗体および結合性メンバーは、液相ペプチド合成技術を用いて溶液中で、またはさらに固相、液相および溶液化学の組合せにより、調製することができる。
本発明はさらに、所望のペプチドまたはポリペプチドがコードされることができるように、適切な発現システムにおける本発明の抗体を構成する少なくとも１つのアミノ酸をコードする核酸の発現による本発明の抗体または結合性メンバーの製造に及ぶ。例えば、本発明の抗体を得るために、アミノ酸軽鎖をコードする核酸およびアミノ酸重鎖をコードする第２の核酸を発現させることができる。
したがって、本発明の特定のさらなる態様において、本発明の抗体または結合性メンバーを形成するアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。

【0091】

一般的に、本発明の抗体または結合性メンバーを形成するアミノ酸配列をコードする核酸は、単離もしくは精製された形態で、または１つもしくは複数の調節配列を除いて、それと自然に結合し得る物質が実質的にない形態で提供することができる。本発明の抗体または結合性メンバーを発現する核酸は、完全にまたは部分的に合成することができ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含み得るが、これらに限定されない。
本発明の抗体または結合性メンバーをコードする核酸配列は、Sambrook et al.“Molecular Cloning”, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001 (ISBN-0879695773)およびAusbel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4^th Edition, 1999 (ISBN-0471250929)に記載されているような当業者に周知である技術を用いて当業者により容易に調製することができる。前記技術は、（ｉ）核酸の試料を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成またはｃＤＮＡ配列の調製を含む。本発明の抗体または結合性メンバーをコードするＤＮＡは、コーディングＤＮＡを選び、発現させる部分の両側の適切な制限酵素認識部位を同定し、ＤＮＡから前記部分を切り取るステップを含む、当業者に公知の適切な方法で発生させ、用いることができる。次いで、切除部分を適切なプロモーターに作動可能に連結し、市販の発現システムなどの適切な発現システムで発現させることができる。あるいは、ＤＮＡの関連する部分を適切なＰＣＲプライマーを用いて増幅することができる。ＤＮＡ配列の修飾は、部位特異的突然変異誘発により行うことができる。

【0092】

本発明の抗体または結合性メンバーをコードする核酸配列は、上述のような少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形の構築物として提供することができる。構築物は、上述のような１つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞内に含めることができる。発現は、適切な核酸配列を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって好都合に達成することができる。発現後、抗体または抗体断片を適切な技術を用いて単離および／または精製し、適宜用いることができる。
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは、周知である。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳類細胞、酵母、昆虫およびバキュロウイルスシステムなどである。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で利用できる哺乳類細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ（HeLa）細胞、ベビーハムスター腎細胞およびＮＳ０マウスミエローマ細胞などである。一般的な好ましい細菌ホストは、大腸菌（E. coli）である。大腸菌などの原核細胞における抗体および抗体断片の発現は、当技術分野で十分に確立されている。培養真核細胞における発現も結合性メンバーの製造のための選択肢として当業者が利用できる。

【0093】

抗体の製造のための一般的技術は、当業者に周知であり、そのような方法は、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497、米国特許第４，３７６，１１０号、Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harborにおいて論じられている。組換え抗体分子の調製のための技術は、上述の参考文献に、また例えば、欧州特許第０，３６８，６８４号にも記載されている。
本発明の特定の実施形態において、抗体または結合性メンバーの重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入断片を含む組換え核酸を用いる。定義により、そのような核酸は、エンコード一本鎖核酸、前記コーディング核酸およびそれに対する相補性核酸からなる二本鎖核酸、これらの相補性（一本鎖）核酸自体を含む。

【0094】

さらに、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真性配列を有する酵素的にまたは化学的に合成された核酸またはその突然変異体であり得る。

【0095】

本発明の抗体は、組換え手段により、直接的にだけでなく、好ましくはシグナル配列であるか、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても製造することができる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識せず、処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列により置換される。

【0096】

「単離された」という用語は、本発明のウマ化抗体、またはそれに由来する結合性メンバー、またはそれをコードするポリペプチドに関して用いる場合、前記抗体、結合性メンバーまたは核酸（ポリヌクレオチド）が単離および／または精製された形で提供される状態、すなわち、それらが、それらの自然環境から分離、単離または精製され、実質的に純粋もしくは均一な形で、または核酸の場合、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸を含まないもしくは実質的に含まない形で提供される状態を意味する。したがって、そのような単離された抗体、結合性メンバーおよび単離された核酸は、それらが、それらの自然環境で、または調製がｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術による場合にはそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）でともに見いだされる他のポリペプチドもしくは核酸などの、それらが天然で会合している物質を含まないもしくは実質的に含まない。

【0097】

抗体、結合性メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントを用いて製剤化することができ、それでも実際的な目的のために単離された形で提供されるとみなされる。例えば、抗体および結合性メンバーは、イムノアッセイ用のマイクロタイタープレートを被覆するために用いる場合にはゼラチンもしくは他の担体と混合することができ、または診断もしくは治療に用いる場合には薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と混合される。抗体または結合性メンバーは、自然にまたは異種真核細胞の系によりグリコシル化され得る（例えば、ＣＨＯもしくはＮＳＯ細胞、またはそれらは、非グリコシル化（脱グリコシル化）され得る（例えば、原核細胞中の発現により産生される場合）。
抗ウマＮＧＦウマ化抗体分子を含む異種製剤も本発明の一部を構成する。例えば、そのような製剤は、全長重鎖およびＣ末端リシンを欠く重鎖を有し、様々な程度のグリコシル化および／またはピログルタミン酸残基を形成するためのＮ末端グルタミン酸の環化などの誘導体化アミノ酸を有する抗体の混合物であり得る。
医薬組成物
一般的に本発明の医薬組成物は、液体製剤、凍結乾燥製剤、液体として再構成される凍結乾燥製剤またはエアゾール製剤として製剤化される。特定の実施形態において、製剤中の抗体は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌまたは約５０ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。

【0098】

特定の実施形態において、製剤は、緩衝液をさらに含む。一般的に製剤のｐＨは、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５である。特定の実施形態において、緩衝液は、約４ｍＭ〜約６０ｍＭのヒスチジン緩衝液、約５ｍＭ〜約２５ｍＭのコハク酸緩衝液または約５ｍＭ〜２５ｍＭの酢酸緩衝液を含み得る。特定の実施形態において、緩衝液は、約１０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度、一般的に約１２５ｍＭの濃度の塩化ナトリウムおよび約５ｍＭ〜５０ｍＭ、一般的に２５ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態において、製剤は、０％〜約０．２％の濃度の界面活性剤をさらに含み得る。特定の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５およびそれらの組合せからなるが、これらに限定されない群から選択される。好ましい実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０であり、約１２５ｍＭの濃度の塩化ナトリウムおよび約２５ｍＭの濃度のクエン酸ナトリウムをさらに含み得る。

【0099】

投与
本発明の抗体または結合性メンバーは、単独で投与することができるが、好ましくは意図する投与経路によって選択される適切な薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を一般的に含む医薬組成物として投与する。適切な医薬担体の例としては、水、グリセロール、エタノールなどがある。
本発明のモノクローナル抗体または結合性メンバーは、治療を必要とするウマ患者に適切な経路により投与することができる。一般的に、組成物は、注射または注入により非経口的に投与することができる。好ましい非経口投与経路の例は、静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、洞内、皮下、経粘膜、吸入または経皮を含むが、これらに限定されない。投与経路は、局所および経腸、例えば、粘膜（肺を含む）、経口、鼻、直腸をさらに含み得る。

【0100】

組成物を注射用組成物として送達する実施形態において、例えば、静脈内、皮内または皮下適用において、有効成分は、発熱物質不含有であり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口で許容できる水溶液の形であり得る。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液または乳酸加リンゲル液などの等張性媒体を用いて適切な溶液を調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝化剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要に応じて含めることができる。
組成物はまた、血液を含む特定の組織に入れたマイロスフェア、リポソーム、他の微粒子系送達システムまたは徐放性製剤により投与することができる。

【0101】

上述の技術およびプロトコールならびに本発明に従って用いることができる他の技術およびプロトコールの例は、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7に見いだすことができる。
本発明の抗体および組成物は、一般的に「治療有効量」で対象に投与され、これは、組成物が投与される対象に対して便益を示すのに十分な量である。実際の投与量ならびに投与の速度および時間的経過は、治療される状態の性質および重症度、ならびに治療を受ける対象の年齢、性別および体重などの因子、ならびに投与経路に依存し、またそれらを十分に参考にして決定することができる。組成物の特性、例えば、その結合活性およびｉｎ ｖｉｖｏでの血漿中寿命、製剤中の抗体または結合性メンバーの濃度、ならびに送達の経路、部位および速度にさらなる十分な考慮を払うべきである。

【0102】

投与計画は、本発明の抗体または組成物の１回投与、あるいは抗体または組成物の複数回投与量を含み得る。抗体または抗体含有組成物はさらに、本発明の抗体または結合性メンバーが治療するために投与される状態の治療のために用いられる他の治療薬および医薬と連続してまたは別個に投与することができる。
対象に施行することができる投与計画の例は、１μｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日を含むが、これらに限定されない群から選択することができる。特定の実施形態において、用量は、抗体の１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの血漿濃度が得られるようなものである。しかし、投与される組成物の実際の量ならびに投与の速度および時間的経過は、治療される状態の性質および重症度に依存する。療法の処方、例えば、用量等に関する決定は、最終的に臨床獣医および他の獣医の責任の範囲内にあり、その裁量によるものであり、一般的に治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に公知の他の因子を考慮に入れる。

【0103】

定義
別途定義しない限り、本明細書で用いたすべての技術および科学用語は、本発明の分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。用語の意味および適用範囲は、明確であるべきであるが、多義性がある場合、本明細書に示す定義が辞書または外部定義に優先する。
本明細書を通して、文脈上他の状態が要求されない限り、用語「含む（comprise）」もしくは「包含する（include）」、または「含む（comprises）」もしくは「含むこと（comprising）」、「包含する（includes）」もしくは「包含すること（including）」などの変形形態は、記載された整数または整数の群の包含を意味するが、他の整数または整数の群の除外は意味しないと理解される。

【0104】

本明細書で用いているように、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの用語は、文脈上他の状態が明確に要求されない限り、単数形および複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「活性薬（an active agent）」または「薬理学的に活性な薬剤（a pharmacologically active agent）」への言及は、単一の活性薬ならびに組み合わされた２種以上の活性薬の混合物を含み、一方で「担体（a carrier）」への言及は、２種以上の担体の混合物ならびに単一の担体などを含む。さらに、文脈上他の状態が要求されない限り、単数形の用語は、複数状態を含むものとし、複数形の用語は、単数状態を含むものとする。

【0105】

本明細書で定義したように、「疼痛」という用語は、実際もしくは潜在的組織損傷に伴う、またはそのような損傷に関して表現される不愉快な感覚的および感情的経験を意味する。
術中または術後疼痛に関連して、米国動物福祉法（Animal Welfare Act 2002. AWA regulations, CFR, Title 9 (動物および動物製品(Animals and Animal Products)), Chapter 1 (農務省動植物防疫局(Animal and Plant Health Inspection Service, Department of Agriculture)). Subchapter A (動物福祉(Animal Welfare), Parts 1-4)は、有痛性処置を、当該処置が施された人間における軽度または瞬間的な疼痛または苦痛以上のもの、すなわち、注射または他の比較的重要でない処置によって引き起こされる疼痛を超える疼痛を引き起こすと合理的に予想されるような処置と定義している。したがって、ウマが有痛性外科処置を受ける場合、動物は術後鎮痛薬の投与を受けるべきである。
さらなる例において、ウマは、関節炎、例えば、多発性関節炎、関節リウマチ、炎症、掻痒症、変形性関節症または癌性もしくは悪性腫瘍状態などの関連症状の結果としての顕著または慢性疼痛を経験している可能性がある。

【0106】

「侵害受容」という用語は、侵害刺激の知覚を意味する。本明細書で定義したように、「神経障害性疼痛」（「神経痛」としても公知）は、神経からのシグナルに関連する問題によってもたらされる疼痛である。それは、体性感覚系を冒す病変または疾患の結果として生じ得る。神経障害性疼痛の原因が存在し、それは、自発的に起こる感覚異常と呼ばれる異常な感覚に関連し得る。あるいは、それは、通常疼痛を引き起こさないような接触または刺激によって疼痛が始まったり、悪化したりするときに生ずる異痛症に関連し得る。例えば、三叉神経痛がある場合には、顔面へのわずかな接触が疼痛を誘発することがあり、あるいは糖尿病性神経障害がある場合には、寝具の圧力が疼痛を誘発することがある。神経障害性疼痛は、通常疼痛を引き起こさないような接触または刺激によって疼痛が始まったり、悪化したりする異痛症にも起因し得る。例えば、対象が三叉神経痛を有する場合には、顔面へのわずかな接触が疼痛を誘発することがある。痛覚過敏に関連する神経障害性疼痛は、激しい痛みが、通常わずかな不快感をもたらすような刺激または接触に起因することを意味するが、錯感覚は、例えば、ピンや針などの疼痛を引き起こす部位と接触しているものが存在していないときでさえ不快感または苦痛な感覚が起こることを意味する。他の形の神経障害性疼痛は、皮膚におけるアレルギーまたは炎症反応に関連し得る掻痒症または痒みならびに組織損傷および修復過程に起因する炎症性疼痛を伴う。

【0107】

本明細書で定義したように、「ＮＧＦ中和抗体」という用語または類似の用語は、ＮＧＦの生物学的活性化またはシグナル伝達を中和することができる抗体を言う。拮抗抗体または遮断抗体と呼ばれることがある中和抗体は、特異的に、好ましくは選択的にＮＧＦに結合し、ＮＧＦの１つまたは複数の生物学的活性を阻害する。例えば、中和抗体は、細胞膜結合ＴｒｋＡまたはｐ７５受容体など、その標的リガンドへのＮＧＦの結合を阻害し得る。
本明細書で用いているように、「生物学的活性」という用語は、分子の１つまたは複数の固有の生物学的特性（ｉｎ ｖｉｖｏで認められるような天然に存在するか、または組換え手段によりもたらされるもしくは可能になるかにかかわりなく）を意味する。生物学的特性は、受容体結合および／または活性化、細胞シグナル伝達または細胞増殖の誘導、細胞成長の抑制、サイトカイン産生の誘導、アポトーシスの誘導および酵素活性を含むが、これらに限定されない。

【0108】

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語は、本明細書で用いているように、Ｋａｂａｔら（Kabat, E.A.,Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K. and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242）によって概説されたように天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性と特異性とを合わせて定めるアミノ酸配列を意味する。「フレームワーク領域（ＦＲ）」という用語は、本明細書で用いているように、ＣＤＲの間に介在しているアミノ酸配列を意味する。抗体のこれらの部分は、ＣＤＲを適切な配向に保持する役割を果たす（ＣＤＲが抗原に結合することを可能にする）。

【0109】

「定常領域（ＣＲ）」という用語は、本明細書で用いているように、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を意味する。本発明において、定常領域は、一般的にウマ定常領域、すなわち、対象のウマ化抗体の定常領域がウマ免疫グロブリンに由来することを意味する。重鎖定常領域は、ウマ重鎖アイソタイプから選択することができる。
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で用いているように、一般的に異なる種のものである、２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体を意味する。最も一般的には、キメラ抗体は、標的エピトープに特異的に結合するドナー種に由来する可変ドメインおよび抗体を投与すべき標的種から得られた抗体に由来する定常ドメインを含む。
「免疫原性」という用語は、本明細書で用いているように、受容者に投与したときに免疫応答（体液性または細胞性）を誘発する標的タンパク質または治療用部分の能力の尺度を意味する。本発明は、対象ウマ化抗体の免疫原性に関係する。好ましくは、本発明の抗体は、免疫原性を有さない、すなわち、ウマに投与したときにそれらに対して中和抗体が産生されず、さらに、抗体のＦｃ領域によってエフェクター機能が媒介されない。

【0110】

「同一性」または「配列同一性」という用語は、本明細書で用いているように、整列配列における特定のアミノ酸残基の位置において、アミノ酸残基が整列配列間で同じであることを意味する。「類似性」または「配列類似性」という用語は、本明細書で用いているように、整列配列における特定の位置において、アミノ酸残基が配列間で類似した種類のものであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシンまたはバリン残基に置換することができる。これは、保存的置換と呼ばれることがある。好ましくは、本発明のアミノ酸配列がそれに含まれているアミノ酸残基のいずれかの保存的置換により修飾される場合、これらの変化は、非修飾抗体と比較したとき、得られる抗体の結合特異性または機能的活性に影響を及ぼさない。

【0111】

本発明の（天然）ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する配列同一性は、配列を整列させ、最大の百分率の相同性を達成するために必要な場合にギャップを導入した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率に関するものである。ＮまたはＣ末端の伸長も挿入も、配列同一性または相同性を減少させると解釈しないものとする。２つ以上のアミノ酸配列のアライメントを実施し、それらの配列同一性または相同性を判定するための方法およびコンピュータプログラムは、当業者に周知である。例えば、２つのアミノ酸配列の同一性または類似性の百分率は、アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al. 1990）、ＦＡＳＴＡ（Pearson & Lipman 1988）またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith & Waterman 1981）を用いて容易に計算することができる。

【0112】

本明細書で用いているように、第２のアミノ酸残基との「最高相同性」を有するアミノ酸残基への言及は、第２のアミノ酸残基と共通の大部分の特性および性質を有するアミノ酸残基を意味する。アミノ酸残基が第２のアミノ酸残基との最高相同性を有するかどうかを判定する際に、一般的に、例えば、電荷、極性、疎水性、サイドアーム（side arm）の質量およびサイドアームの大きさなどであるが、これらに限定されない因子の評価を行うことができる。
「対応する位置」という用語は、本明細書で用いているように、２つの配列の間の最大の配列同一性を可能にするように２つの配列を整列させた場合に、第１の配列における指定されたアミノ酸残基に対応する位置における第２の配列に存在するアミノ酸残基が、第１の配列における位置と同じ位置である第２の配列における位置を指すものであることを意味する。対応する位置におけるアミノ酸残基は、同じＫａｂａｔ番号付けを有する。

【0113】

「本質的にそれからなる」または「本質的にそれからなること」という用語は、本明細書で用いているように、付加的な特徴または要素がウマＮＧＦに対する結合特異性を有する抗体または抗体断片の能力に実質的に影響を及ぼさないならば、ポリペプチドが、記載されているものを超える付加的な特徴または要素を有していてもよいことを意味する。すなわち、ポリペプチドを含む抗体または抗体断片は、ウマＮＧＦに結合し、ウマＮＧＦの機能活性に拮抗する抗体または抗体断片の能力を妨げない付加的な特徴または要素を有していてもよい。そのような修飾は、抗体の免疫原性を低減するためにアミノ酸配列に導入することができる。例えば、指定された配列から本質的になるポリペプチドは、配列のいずれかの末端または両末端に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の付加、欠失または置換アミノ酸を含んでいてもよく、ただし、これは、これらのアミノ酸が、ウマＮＧＦへの結合における抗体または抗体断片の役割を妨げない、阻害、遮断または妨害せず、その生物学的機能を奪わないという条件のもとである。同様に、本発明のウマＮＧＦ拮抗抗体に寄与するポリペプチド分子は、１つまたは複数の官能基で化学的に修飾されていてもよく、ただし、これは、そのような官能基が、ウマＮＧＦに結合し、その機能に拮抗する抗体または抗体断片の能力を妨げないという条件のもとである。
本明細書で用いているように、「有効量」または「治療有効量」という用語は、ｐ７５および／またはＴｒｋＡ受容体へのウマＮＧＦの結合を抑制するのに必要な本発明の薬剤、結合化合物、小分子、融合タンパク質またはペプチド模倣薬の量を意味する。

【0114】

「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、隣接する残基のアルファアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により１つが他に連結された線状の一連のアミノ酸残基を示すために本明細書において同義で用いる。アミノ酸残基は、通常天然「Ｌ」異性体の形である。しかし、「Ｄ」異性体の形における残基は、所望の機能特性がポリペプチドにより保持されている限り、Ｌ−アミノ酸残基に置換することができる。

【0115】

本明細書で定義したように、「抗体」は、対象の標的抗原、この場合には、組換えにより調製することができる、または免疫グロブリン遺伝子もしくは免疫グロブリン遺伝子の断片により遺伝的にコードされる、１つまたは複数のポリペプチドを有するウマ神経成長因子に特異的に結合する抗原結合性タンパク質を含む。「抗体」という用語は、モノクローナルおよびキメラ抗体、特にウマ化抗体を含み、ポリクローナル抗体またはあらゆるクラスもしくはサブタイプの抗体をさらに含む。「抗体」はさらに、ハイブリッド抗体、二重特異性抗体、ヘテロ抗体に、抗原結合性を保持するその機能的断片に及ぶ。
「に特異的に結合する」という語句は、タンパク質の異種集団に存在する特定のタンパク質または標的への結合を意味する。したがって、特定のイムノアッセイ条件で存在する場合、抗体は、特定のタンパク質、この場合、ウマＮＧＦに結合し、試料中に存在する他のタンパク質に有意な量で結合しない。

【0116】

本明細書で定義したように、「ウマ」は、馬と呼ばれることもある。ウマは、三命名法による名称エクウス・フェルス・カルバッルス（Equus ferus caballus）を有する亜種に属し、これらは、有蹄（有蹄類）哺乳動物である。ウマは、ウマ科の亜種であり、その中に分類される種を含み、公知の３００品種以上の馬に及ぶ。
例示の目的のために記載するものであって、本発明に対する制限であると解釈されることを意図するものでない以下の実施例に関して、本発明を述べることとする。

【実施例】

【0117】

（例１）
抗体の製造
それぞれ配列番号１および配列番号２のウマ化軽鎖および重鎖可変ドメインをＣ末端ウマ定常重鎖または定常軽鎖ドメインに結合させることによって全抗体配列を製造した。ウマ化αＤ１１ ＶＨドメインを２種のウマ重鎖定常ドメインＨＣ２（ＩｇＧ２）およびＨＣ６（ＩｇＧ６）と、ウマ化αＤ１１ ＶＬドメインをウマカッパ軽鎖定常ドメインと組み合わせた。全長成熟抗体鎖の配列を配列番号４（カッパ定常ドメインを有する軽鎖）および６（ＨＣ２定常ドメインを有する重鎖）に示す。
コドンの最適選択および完全な化学遺伝子合成ならびに哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋へのクローニングにより、組み合わせたアミノ酸配列を哺乳類細胞中で発現可能な形に変換した。得られたｃＤＮＡｓをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、例２〜５に詳述するように上清を分析した。

【0118】

（例２）
マウスおよびウマＮＧＦへの抗体の結合の測定
ウマ化重および軽鎖ｃＤＮＡｓをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法でウマまたはマウスＮＧＦと反応させた。インキュベーションおよび洗浄ステップの後、結合ウマ抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヤギ抗ウマＩｇＧ特異的ポリクローナル抗体との反応性により検出し、ＴＭＢを用いて展開した。得られた生成物の光学濃度を４５０ｎｍで測定し、モック空ベクタートランスフェクト上清の生成物（図１で「モック」と表示）と比較した。結果を図１のグラフに示す。マウスＮＧＦへの結合をＨＣ２（ＩｇＧ２定常ドメイン）ウマ化抗体（ｅｑＮ−ＨＣ２＋ｅｑＮ−ｋＬＣ−１と呼ぶ）について示す。グラフの第２の部分に、ｅｑＮ−ｋＬＣ−１軽鎖およびｅｑＮ−ＨＣ２（ＩｇＧ２）定常鎖を含むｅｑＮ−ＨＣ２＋ｅｑＮ−ｋＬＣ−１抗体のウマＮＧＦへの結合を示す。

【0119】

（例３）
ウマ化抗体の精製
実施例２から得られた上清をプロテインＡカラムを用いて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ウマＩｇＧポリクローナル抗体ＨＲＰとの反応性について試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはまた、クーマシーブルーで染色して、重および軽鎖を検出した。抗ウマＩｇＧポリクローナル抗体製剤は、ウマ重鎖を主として認識する。結果を図２ＡおよびＢに示す。
結果は、抗ウマポリクローナル抗体ＨＲＰを用いて展開したウエスタンブロットにより示されているように、プロテインＡによる２型重鎖を有するウマ抗ＮＧＦの精製を示すものである。ピーク画分をクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。重および軽鎖のある程度の分解がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らかである。クーマシーブルー染色ゲル（図２Ｂ）は、重および軽鎖ならびに完全抗体（７０のＭＷ）の存在を示している。

【0120】

（例４）
ウマ化抗体によるＴＦ−１細胞のＮＧＦ誘導性増殖の阻害
実施例２のＣＨＯ細胞トランスフェクタント上清（「アンタゴニスト」）の連続希釈物を１．０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦの存在下でＴＦ−１細胞とともにインキュベートした。結果として起こった増殖をチミジンの取込みにより測定した。
結果を図３に示す。計算３〜８ｎｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ｅｑＮ−ｋＬＣ−１軽鎖およびｅｑＮ−ＨＣ２（ＩｇＧ２）定常鎖を含む抗体）で５０％阻害が認められた。

【0121】

（例５）
抗原捕捉ウマ化抗体により誘導される補体沈着
実施例２のプロテインＡ精製トランスフェクタント上清を０．１ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦで被覆したプレートとともにインキュベートして、抗体を捕捉した。プレートを洗浄し、抗体を捕捉するために０．１ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦで被覆した。プレートを洗浄し、次いで、ヒト血清とともにインキュベートし、抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体ＨＲＰの結合および上述のような展開により、結合補体Ｃ１ｑを測定した。抗原捕捉「ｅｑＮ−ＨＣ２＋ｅｑＮ−ｋＬＣ−１」へのＣ１ｑの結合を陽性対照としてのヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する抗ＮＧＦ ＭＡｂおよび陰性対照としてのＩｇＧ４変異体と比較した。

【0122】

補体結合法：
プレートを１００μｌ／ウエルの５μｇ／ｍｌマウスＮＧＦで被覆し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。被覆ウエルを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで希釈した組換えウマ抗ＮＧＦ ＩｇＧを含む細胞培養上清（１００μｌ／ウエル）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ゼラチンおよび０．５％ＢＳＡを含むベロナール緩衝生理食塩水で１／１００に希釈した１００μｌ／ウエルのヒト血清とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを１００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１／８００希釈のヒツジ抗Ｃ１ｑ−ＨＲＰ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）とともにインキュベートした。洗浄後、プレートを１００μｌ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加により展開した。１００μｌの２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄の添加により、展開を停止し、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
結果を図４のグラフに示す。これらの結果は、驚くべきことにウマ化ＨＣ２抗体（ｅｑＮ−ｋＬＣ−１軽鎖およびｅｑＮ−ＨＣ２重鎖（ＩｇＧ２定常ドメイン重鎖）を含む抗体）へのＣ１ｑの結合がないことを示すものである。したがって、この結果は、ＮＧＦが可溶性メディエーターであるので、重鎖定常ドメインＨＣ２型（ウマＩｇＧ２由来定常ドメイン）を有するウマ化抗体がＮＧＦへの拮抗に用いるのに適することを示すものである。
したがって、本発明の抗体がＨＣ２のウマ由来重鎖（ＩｇＧ２ウマ重鎖定常ドメインサブタイプ）を有する場合、ウマＮＧＦへの抗体の結合が補体活性化またはＡＤＣＣなどの他の下流エフェクター機能をもたらさないことが全く驚くべきことにここに実証されている。したがって、前記抗体は、膜結合ＴｒｋＡまたはｐ７５受容体へのウマＮＧＦの結合を妨げることによってウマＮＧＦの生物学的機能活性に拮抗するに際して、関連下流細胞内シグナル伝達カスケードを阻害する。さらに、ＮＧＦの発現が神経などの近くで頻繁に起こるとき、ＨＣ２（ＩｇＧ２）サブタイプのウマ由来重鎖を有する本発明のＮＧＦ拮抗または中和抗体は、より広い免疫応答をリクルートすることなく、ウマＮＧＦの生物学的活性を奪うことができる。そのような機能特性は、予想外であり、それにもかかわらず非常に望ましい。

【0123】

（例６）
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いるウマＩｇＧアイソタイプＨＣ２（ＨＣ６でない）の優先的精製
ウマ化αＤ１１のＨＣ２およびＨＣ６変異体のトランスフェクションにより得られたＣＨＯ細胞上清をプロテインＡアフィニティーカラム上に負荷し（図２により）、抗体を含む溶出画分をＥＬＩＳＡによりＮＧＦへの結合により定量した。図１０においてわかるように、ＨＣ２アイソタイプ（ＨＣ６アイソタイプでない）がプロテインＡクロマトグラフィーを用いて回収された。これらのデータから、ウマ抗ＮＧＦ免疫グロブリンのＨＣ２（ＨＣ６でない）アイソタイプの精製における有用なツールであり得ることが示唆される。

【0124】

（例７）
抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体−安全性および発熱
本発明の抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体をＣＨＯ細胞中で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーの組合せにより精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換する。抗体を０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重でウマに静脈内注射し、獣医による目視検査、体重、体温および血漿生化学の変化により毒性の徴候について評価する。これらまたは血漿生化学分析対象物に変化が認められると予想されない。

【0125】

（例８）
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体の血漿薬物動態−血清半減期および免疫原性
本発明の抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体をＣＨＯ細胞中で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーの組合せにより精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換する。抗体を０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でウマに静脈内注射し、血漿試料を次の２週間にわたって種々の時点に採取する。希釈血漿試料を、標的としてのＮＧＦおよび抗ウマポリクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ二次試薬を用いてＥＬＩＳＡにより抗ウマＮＧＦ抗体濃度について評価する。測定される血漿濃度は、組織分布（アルファ）相および数日の消失（ベータ）相を有する、２相性動態と一致する。
１００時間から３００時間までの間に抗ウマＮＧＦ抗体濃度の血漿中濃度の急激な低下がないことが予想される。これは、ウマ血液中に組換え抗ＮＧＦモノクローナル抗体に対する先在性の中和抗体が存在せず、また注入後にそのような中和抗体が発生しないことも示すものである。

【0126】

（例９）
抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体はｉｎ ｖｉｖｏでの変形性関節症による炎症性疼痛を低減する
変形性関節症ウマの群に０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重のこの患者の抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体または溶媒対照としてのリン酸緩衝生理食塩水を静脈内または関節内注射する（＝０日目）。ウマを視覚採点法により４〜１４日間にわたり跛行について評価する（例えば、スコア０、無跛行（完全な体重支持）；スコア１、軽度の跛行（完全な体重支持はないが、十分に歩行している）；スコア２、中等度の跛行（わずかに体重を支持し、十分な歩行はできない）；スコア３、重度の跛行（無体重支持））。観察は、どのウマがどの注射を受けるかについて盲検化する。
跛行は、溶媒対照と比較して抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体の投与を受けたウマにおいて注入後の時間にわたり減少すると予想され、これにより、抗ウマＮＧＦモノクローナル抗体が溶媒単独で認められるのと比べてウマにおける疼痛の低減に効果があることがわかる。

【0127】

（例１０）
ｉｎ ｖｉｖｏでの炎症性疼痛の低減における抗イヌＮＧＦモノクローナル抗体の効果を示す比較例
抗体療法：
本発明の抗体を調製する方法をイヌに用いるのに適するイヌ化抗体を製造するのに適用した。イヌ化αＤ１１ ＶＬドメインをイヌカッパ軽鎖定常ドメインと組み合わせ、イヌ化αＤ１１ ＶＨドメインをイヌ重鎖アイソタイプと組み合わせた。重および軽鎖を発現する発現ベクターに由来する抗イヌＮＧＦモノクローナル抗体をＣＨＯ細胞中で発現させ、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーの組合せにより精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換した。

【0128】

炎症のイヌモデル：
すべての実験は、施設内倫理委員会（ＣＲＬ、Ｉｒｅｌａｎｄ）の事前の承認を得て実施した。約２４時間後に始まり、イヌが一時的に跛行になることをもたらす、自己消散性炎症を発生させるために、ビーグル犬の１つの後肢の足蹠にカオリンを注射した（＝−１日目）。このモデルにおいて、カオリンに対する最初の炎症反応が減退したときに、イヌは約１〜２週間にわたって徐々に跛行状態が少なくなり、その後に完全に回復する。
３匹のイヌの群に２００μｇ／ｋｇ体重の抗イヌＮＧＦモノクローナル抗体または溶媒対照としてのリン酸緩衝生理食塩水を静脈内注射した（＝０日目）。イヌを視覚採点法により７日間にわたり跛行について評価した（スコア０、無跛行（完全な体重支持）；スコア１、軽度の跛行（完全な体重支持はないが、十分に歩行している）；スコア２、中等度の跛行（わずかに体重を支持し、十分な歩行はできない）；スコア３、重度の跛行（無体重支持））。観察は、どのウマがどの注射を受けるかについて盲検化した。

【0129】

結果を図１１に示す。跛行スコアは、溶媒対照と比較して抗ＮＧＦモノクローナル抗体の投与を受けたイヌにおいて注射後３日目までに低下したことから、抗ＮＧＦモノクローナル抗体が溶媒単独で認められたのと比べてイヌにおける疼痛の低減に効果があったことがわかる。活性の遅延は、約３０時間の遅い組織分布（アルファ）相を示した抗イヌＮＧＦモノクローナル抗体の血漿薬物動態および足蹠部位の比較的に不十分な血管分布と一致している。図１１に示す結果は、本発明の方法に対応する方法により調製された抗イヌＮＧＦ抗体がイヌにおける炎症性疼痛を低減し、跛行の必然的な減少が伴っていることを示している。

【0130】

本明細書で言及したすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記述した実施形態の様々な修正形態および変形形態は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記述したが、請求した本発明をそのような特定の実施形態に必要以上に限定すべきでないことを理解すべきである。実際、当業者に明らかである本発明を実施する記載された形態の様々な修正は、本発明の範囲内にあるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]