特許 6182008 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法及び定量試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6182008

(24)【登録日】2017年7月28日

(45)【発行日】2017年8月16日

(54)【発明の名称】高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法及び定量試薬

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/60 20060101AFI20170807BHJP

   G01N 33/92 20060101ALI20170807BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/60

   G01N33/92 A

【請求項の数】6

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2013-153294(P2013-153294)

(22)【出願日】2013年7月24日

(65)【公開番号】特開2015-23801(P2015-23801A)

(43)【公開日】2015年2月5日

【審査請求日】2016年5月25日

(73)【特許権者】

【識別番号】591125371

【氏名又は名称】デンカ生研株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001656

【氏名又は名称】特許業務法人谷川国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 謙亨

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 康樹

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０１１５６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０１１５５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０１１５５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００１−１０３９９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０９５６００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−３２５５８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 OKADA Masahiko et al.，Direct measurement of HDL cholesterol: method eliminating apolipoprotein E-rich particles，Journal of Clinical Laboratory Analysis，2001, Vol.15，p.223-229

【文献】 花王の界面活性剤カタログ，2009年11頁

【文献】 第45回日本動脈硬化学会総会・学術集会プログラム，2013年6月，1-P-56

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検試料に、ＨＤＬ又はＨＤＬ３以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に移行させる前工程を行い、該前工程後の被検試料に高密度リポタンパク質３と特異的に反応する２種以上の界面活性剤を反応させて高密度リポタンパク質３中のコレステロールを定量する方法であって、該界面活性剤の少なくとも１種がポリオキシエチレン多環フェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、かつ、２種以上の界面活性剤全体のＨＬＢが１３．８〜１４．０になるように２種以上の界面活性剤を組み合わせる、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法。

【請求項2】

前記ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルがポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルがポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２記載の方法。

【請求項4】

請求項１に記載の定量方法において使用する、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量試薬であって、該高密度リポタンパク質３と特異的に反応する２種以上の界面活性剤を含み、該界面活性剤の少なくとも１種がポリオキシエチレン多環フェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、かつ、２種以上の界面活性剤全体のＨＬＢが１３．８〜１４．０になるように２種以上の界面活性剤を組み合わせた、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量試薬。

【請求項5】

前記ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルがポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項４記載の試薬。

【請求項6】

前記ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルがポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項５記載の試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高密度リポタンパク質３（以下、「ＨＤＬ３」と呼ぶことがある）中のコレステロール（ＨＤＬ３中のコレステロールを以下、「ＨＤＬ３コレステロール」または「ＨＤＬ３−Ｃ」と呼ぶことがある）の定量方法及び定量試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロールは動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、そのためコレステロール逆転送系ともいわれている。冠動脈硬化などの動脈硬化疾患と負の相関があることが知られており、ＨＤＬが低値であることは脂質異常症の一つとして低値限界が設けられており、動脈硬化の指標として有用であることが知られている。

【0003】

ＨＤＬはアポタンパク質とリン脂質、コレステロール、中性脂肪から構成されている。ＨＤＬは比重がｄ＝１．０６３〜１．２１０であり、さらにｄ＝１．０６３〜１．１２５であるＨＤＬ２とｄ＝１．１２５〜１．２１０であるＨＤＬ３の２つの分画に分類される。リポ蛋白の分布曲線によりｄ＝１．１２５部分にノッチが認められ、ここから比重の重い部分をＨＤＬ３とされる。また、ＨＤＬ中のアポタンパク質のうちアポリポ蛋白Ｅ含有量差から、アポＥの含有量の多いＨＤＬをアポＥ−ｒｉｃｈ ＨＤＬとする亜分画の分け方も存在する。

【0004】

従来までのＨＤＬ蛋白全体だけではなく、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３それぞれの亜分画において異なった働きを示すことが知られている。臨床において、ＣＥＴＰ欠損によりＨＤＬがＬＤＬやＩＤＬに代謝されず、ＨＤＬコレステロール量が増加することが知られている。ＣＥＴＰ欠損により増加したＨＤＬはＨＤＬ２である。ＨＤＬ２には抗動脈硬化作用があると言われている。また、ＣＥＴＰ欠損によりアポＥ−ｒｉｃｈ ＨＤＬが上昇するとも言われており、アポＥ−ｒｉｃｈ ＨＤＬはコレステロール引き抜き能が強く抗血小板作用があり、ＨＤＬの中でもより善玉であるとも言われている。また、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性の低下によりＨＤＬ３がＨＤＬ２に変化せず、ＨＤＬ３が増加する。ＨＤＬ３の増加による冠動脈疾患の発症率の増加が示唆されている。これらの傾向からＨＤＬ亜分画それぞれを測定することは、動脈硬化疾患の有無や原因を判断する助けとなることが予想される。また、現在、これらＨＤＬ亜分画の働きを踏まえ、ＣＥＴＰの働きを阻害し、ＬＤＬコレステロール量を減少させ、ＨＤＬコレステロール量を増加させる治療薬の開発が各メーカーで進められている。

【0005】

ＨＤＬ亜分画の簡便な測定方法を確立することは詳細な働きの解明や、これらの治療の効果へと繋がる可能性がある。

【0006】

現在までにＨＤＬ亜分画の測定法として知られているものとしては、超遠心法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、ＨＤＬ３沈殿法（特許文献１）、ＮＭＲ法、などが知られている。

【0007】

超遠心は遠心によりリポ蛋白の比重の差を利用して画分する方法であり、作業に熟練が必要なこと、日数がかかること、また費用も高額となる欠点がある。岡崎らによるＨＰＬＣを用いたＨＤＬ２とＨＤＬ３とを分ける方法では、作業に時間を要し、特別な機器が必要である。ＨＤＬ３沈殿法は２価金属イオンおよびデキストラン硫酸を含む試薬によりＨＤＬ３以外を凝集させ、遠心により上清部分のＨＤＬ３を回収し自動分析装置で測定する方法である。やはり、作業に熟練が必要であること、また用手法であり検体の前処理操作が必要であることもあり、測定までにある程度の時間がかかるといった欠点があり、汎用的ではなかった。また、ＮＭＲ法は磁気共鳴によりリポ蛋白の粒子数を計測する方法であるが、特殊な機械が必要であり、一般的ではない。

【0008】

なお、ＨＤＬ亜画分の分析方法（特許文献２）が存在する。汎用自動分析装置により測定が可能であるが、界面活性剤を使用することによりＨＤＬ３以外のリポ蛋白を酵素の作用から阻害する方法を用いており、ＨＤＬ３反応中において、目的以外のリポ蛋白質が存在していることなり、測定への影響、もしくは、阻害しきれなかった場合は、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を測りこむ恐れがある。

【0009】

このような方法に変わり、簡便でかつコレステロール量をより選択的に定量できる試薬の発明が必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開２００９−２０７４６３号公報

【特許文献2】特開２００１−３４６５９８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の目的は、煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中のＨＤＬ３を定量する方法及び試薬を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＤＬ３と特異的に反応する界面活性剤を見出した。そして、被検試料にこのような界面活性剤を反応させ、コレステロールを定量することにより被検試料中のＨＤＬ３コレステロールが定量可能であることに想到し、これが可能であることを実験的に確認して本発明を完成した。

【0013】

すなわち、本発明は、被検試料に、ＨＤＬ又はＨＤＬ３以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に移行させる前工程を行い、該前工程後の被検試料に高密度リポタンパク質３と特異的に反応する２種以上の界面活性剤を反応させて、高密度リポタンパク質３中のコレステロールを定量する方法であって、該界面活性剤の少なくとも１種がポリオキシエチレン多環フェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、かつ、２種以上の界面活性剤全体のＨＬＢが１３．８〜１４．０になるように２種以上の界面活性剤を組み合わせる、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の定量方法において使用する、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量試薬であって、該高密度リポタンパク質３と特異的に反応する２種以上の界面活性剤を含み、該界面活性剤の少なくとも１種がポリオキシエチレン多環フェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種であり、かつ、２種以上の界面活性剤全体のＨＬＢが１３．８〜１４．０になるように２種以上の界面活性剤を組み合わせた、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量試薬を提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明により、被検試料中のＨＤＬ３コレステロールを、超遠心や前処理といった煩雑な作業を必要とせずに自動分析装置で特異的に定量することが可能となった。また、従来技術である被検体中ＨＤＬ総コレステロール定量法により得られた総ＨＤＬコレステロール量よりＨＤＬ３コレステロール量の差を算出することによりＨＤＬ２コレステロール量を定量することも可能となった。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本発明の実施例３において行った、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルを包含する、各種ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルのＨＬＢと、ＨＤＬ３／ＨＤＬ２反応比の関係を示す図である。

【図2】本発明の実施例５において行った、本発明で求めたＨＤＬ３コレステロールと沈殿法で求めたＨＤＬ３コレステロールの相関関係を示す図である。

【図3】本発明の実施例５において行った、本発明で求めたＨＤＬ３コレステロールと総ＨＤＬコレステロールから計算で求めたＨＤＬ２コレステロールと、沈殿法で求めたＨＤＬ３コレステロールと総コレステロールから計算で求めたＨＤＬ２コレステロールの相関関係を示す図である。

【図4】本発明の実施例６において行った、本発明で求めたＨＤＬ３コレステロールと超遠心法で求めたＨＤＬ３コレステロールの相関関係を示す図である。

【図5】本発明の実施例６において行った、本発明で求めたＨＤＬ３コレステロールと総ＨＤＬコレステロールから計算で求めたＨＤＬ２コレステロールと、超遠心法で求めたＨＤＬ２コレステロールの相関関係を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明の方法に供される被検試料としては、その試料中のＨＤＬ３コレステロールを定量しようとするものであれば特に限定されないが、好ましくは、血清若しくは血漿又はこれらの希釈物であり、特に血清又はその希釈物が好ましい。

【0017】

本発明中において界面活性剤に対して「反応する」という言葉を用いる場合は、界面活性剤がリポ蛋白質に対して、反応系外に導くために酵素が作用しやすくする、もしくはリポ蛋白に対して酵素が作用できないよう保護することを意味する。

【0018】

本発明の方法では、被検試料にＨＤＬ３と特異的に反応する（ＨＤＬ３以外のリポタンパク質とはほとんど反応しない）２種以上の界面活性剤を反応させる。ＨＤＬ３と特異的に反応する界面活性剤としては、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルから成る少なくとも１種である。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの内、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルが好ましく、さらにはポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルがより好ましい。

【0019】

より具体的には、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルとしてはＮｅｗｃｏｌ−６１０（商品名、日本乳化剤社製、以下、会社名は製造会社であり、会社名が併記されているものは全て商品名である）、Ｎｅｗｃｏｌ−７１０（日本乳化剤）、アデカトールＰＣ−１０（アデカ）、アデカトールＰＣ−１３（アデカ）、アデカトールＳＰ−１２（アデカ）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの内、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルとしてはエマルゲンＡ６０（花王）、エマルゲンＡ９０（花王）、ブラウノンＤＳＰ−１２．５（青木油脂）、ブラウノンＴＳＰ−１６（青木油脂）、ノイゲンＥＡ−１３７（第一工業製薬）、ノイゲンＥＡ−１５７（第一工業製薬）、ノイゲンＥＡ−１６７（第一工業製薬）が挙げられる。これらのうち、エマルゲンＡ６０（花王）、エマルゲンＡ９０（花王）、Ｎｅｗｃｏｌ−７１０（日本乳化剤）はポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルに分類される。これらの界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0020】

ＨＤＬ３と特異的に反応する界面活性剤のＨＬＢは１２．５〜１５が好ましく、さらには１３．５〜１４．５がより好ましい。１種の界面活性剤でＨＬＢが１２．５〜１５でも、ＨＬＢが１２．５〜１５でないものを含めて２種以上を界面活性剤全体のＨＬＢが１２．５〜１５に入るように組み合わせてもよい。

【0021】

ＨＤＬ３と特異的に反応する界面活性剤の濃度は終濃度で０．０２５〜５.０％（ｗ／ｖ）が好ましく、さらには０．２５〜２．５％（ｗ／ｖ）が好ましい。

【0022】

本発明の方法においては、上記界面活性剤の反応によりコレステロールを定量する。コレステロールの定量方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができ、下記実施例にも具体的に記載されている。例えば、リポ蛋白中のエステル型コレステロールにコレステロールエステラーゼを用いて加水分解し、遊離型コレステロールと脂肪酸が生じ、生じた遊離型コレステロールと元来リポ蛋白中に存在する遊離コレステロールとをコレステロールオキシダーゼを用いてコレステノンと過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下でキノン色素を形成させ定量する。キノン色素を発生させる化合物として、例えばＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン）、ＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（−２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム）又はＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ（−２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリンナトリウム二水和物）と４−アミノアンチピリンが挙げられるが、キノン色素を発生させることができる組み合わせであればこれらに限定されるものではない。後述する前工程でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合には、本発明の工程（ＨＤＬ３特異的界面活性剤を反応させる工程）では、前工程で用いたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼをそのまま用いることができ、新たに添加する必要はない。

【0023】

キノン色素を発生させる化合物の濃度は、例えば、ＴＯＯＳであれば濃度は０．５〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましく、４−アミノアンチピリンであれば０．１〜８．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、また、ペルオキシダーゼの濃度は０．４〜４０．０Ｕ／ｍＬが好ましい。

【0024】

反応液には通常の生化学反応に用いられる各種の緩衝液を使用することができ、ｐＨが５〜８の間であるのが好ましい。溶液としては、グッド、トリス、リン酸、グリシンの緩衝溶液が好ましく、グッド緩衝液であるビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシエチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルフォン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−１、４−ビス（２−エタンスルフォン酸）、１．５ナトリウム塩、一水和物（ＰＩＰＥＳ１．５Ｎａ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルフォン酸（ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）およびピペラジン−１、４−ビス（２−ヒドロキシー３−プロパンスルフォン酸）（ＰＯＰＳＯ）が好ましい。

【0025】

反応温度は２５〜４０℃程度が好ましく、さらに３５〜３８℃が好ましく、３７℃が最も好ましい。反応時間は特に限定されず、通常、２〜１０分程度である。

【0026】

本発明の方法は、被検試料に上記界面活性剤をそのまま反応させて行うことも可能であるが、ＨＤＬ又はＨＤＬ３中のコレステロール以外のコレステロールを反応系外に移行させる前工程を先に行い、この前工程後の試料に対して上記した本発明の方法を行うとＨＤＬ３コレステロールをより正確に定量することができるので好ましい。

【0027】

前記前工程は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と反応する界面活性剤又はＨＤＬ３以外のリポタンパク質と反応する界面活性剤の存在下で行うことが好ましい。

【0028】

ＨＤＬ以外又はＨＤＬ３以外のリポタンパク質に反応する界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンステアリルアミン等の非イオン界面活性剤；アミドエーテルサルフェート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；ヤシ油脂肪酸−アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチル−アミノ酢酸ベタイン、ラウリルベタイン等の両性界面活性剤；並びにラウリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン界面活性剤を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

【0029】

より具体的には、ＨＤＬ以外又はＨＤＬ３以外のリポタンパク質に反応する界面活性剤の例として、非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートであるノニオンＯＴ−２２１（日油）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物であるプルロニックＦ６８（アデカ）、プルロニックＦ８８（アデカ）、プルロニックＦ１２７（アデカ）、プルロニックＰ１０３（アデカ）、プルロニックＰ１２３（アデカ）、ポリオキシエチレンステアリルアミンであるナイミーンＳ２１０（日油）、エマルゲンＡ５００（花王）；陰イオンとしてはアミドエーテルサルフェートであるサンアミドＣＦ−１０（日油）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムであるレベノールＷＸ（花王）；両性界面活性剤としてはヤシ油脂肪酸−アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＤＦ−ＳＦ（日油）、アルキルジメチル−アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＦ（日油）、ラウリルベタインであるアンヒトール２４Ｂ（花王）；陽イオン界面活性剤としては、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであるコータミン２４Ｐ（花王）、が挙げられる。これらの界面活性剤は単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。

【0030】

前工程で用いる界面活性剤の濃度は、０．０１〜５.０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．０３〜３．０％（ｗ／ｖ）程度がより好ましい。

【0031】

前工程では、界面活性剤の反応を受けてコレステロールを反応系外に移行させる。ここで、「反応系外に移行させる」とは、コレステロール及びそのエステルを消去又は保護することにより、その後の工程において、コレステロール及びそのエステルが関与しないようにすることを意味する。

【0032】

ここで、「消去」とは、被検試料中のリポ蛋白のコレステロールを分解し、その後の工程において、コレステロール測定の反応に作用させないようにすることである。リポ蛋白コレステロールを消去するための方法としては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法が挙げられる。また、ペルオキシダーゼを用いて水素供与体と発生した過酸化水素を反応させ無色キノンに転化してもよいが、これらに限定されるものではない。コレステロールの消去の方法自体はこの分野において周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。

【0033】

「保護」とは、被検試料中のリポ蛋白をその後の工程においてコレステロール測定に反応しないように、保護を行うことである。リポ蛋白を保護するのには、各リポ蛋白をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼが作用しないように特異的に保護する界面活性剤を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0034】

前工程で発生した過酸化水素をカタラーゼで分解する前工程を用いる場合は、カタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムを使用し、第２工程の反応液中へ添加する。この場合のアジ化ナトリウムの濃度は、通常、０．１ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／Ｌ程度である。

【0035】

本願発明者らは、さらに、ホスフォリパーゼ及び／又はスフィンゴミエリナーゼがリポタンパク質に作用するが、ＨＤＬ３にはほとんど作用しないことを見出した。従って、上記した界面活性剤に加え、ホスフォリパーゼ及び／又はスフィンゴミエリナーゼ（以下、両者を総称して「ホスフォリパーゼ等」と呼ぶことがある）を共存させることにより、ＨＤＬ３コレステロールをさらに正確に定量できるので好ましい。

【0036】

ホスフォリパーゼとしては、少なくともホスファチジルコリンに作用するものであればよく、ホスフォリパーゼＡ、ホスフォリパーゼＣ及びホスフォリパーゼＤが好ましく、特にホスフォリパーゼＣ及びホスフォリパーゼＤが好ましい。スフィンゴミエリナーゼとしては、少なくともスフィンゴミエリンに作用するものであればよい。ホスフォリパーゼ等は市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。ホスフォリパーゼ等は単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。

【0037】

ホスフォリパーゼ等の終濃度（２種類以上のものが用いられる場合にはその合計濃度、以下同じ）は０．１〜１００Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．２〜５０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。

【0038】

なお、前工程に界面活性剤を共存させる場合でも、反応条件（反応温度、時間、緩衝液等）は上記の通りである。

【0039】

前工程は、コレステロールを反応系外に移行させるための酵素系や界面活性剤を同時に添加しておくことにより、酵素による反応工程及び界面活性剤による反応工程を単一の工程として同時に行うこともできる。なお、第１工程と第２工程では異なる界面活性剤を用いる。

【0040】

前工程において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合、コレステロールエステラーゼの濃度は０．１〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．２〜３．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。コレステロールオキシダーゼの濃度は０．０５〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．１〜１．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。なお、コレステロールエステラーゼは、エステル型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ）や東洋紡社製のコレステロールエステラーゼ（ＣＯＥ−３１１、ＣＯＥ−３１２）などの市販品を用いることができる。また、コレステロールオキシダーゼは、遊離型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールオキシダーゼ（ＣＯＮＩＩ）や東洋紡社製のコレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３１１、ＣＯＯ−３２１、ＣＯＯ−３３１）などの市販品を用いることができる。

【0041】

前工程において、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼの濃度は２．０〜５．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、さらに３．０〜４．０Ｕ/ｍL程度が好ましい。また、無色キノンに転化する化合物を用いる場合、その濃度は０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましい。

【0042】

前工程の他の条件（反応温度、反応時間、緩衝液等）は、上記した本発明の方法と同様であってよい。

【0043】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0044】

参考例１
ＨＤＬ２分画とＨＤＬ３分画は、以下の様にして画分した。ＨＤＬを含む被検試料、すなわち、血清に塩化ナトリウム及び臭化ナトリウムを用いた溶液を用いて、超遠心によりＨＤＬ２とＨＤＬ３との境目の比重（１．１２５）で別れるように画分し、それぞれの画分を回収した。

【0045】

超遠心を用いてＣＭ〜ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ２分画、ＨＤＬ３分画を画分し、下記試薬Ａを反応させ、さらに、下記試薬Ｂを添加し、測定を行った。測定は、各分画２μＬに試薬Ａを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｂを５０μＬ添加しさらに５分加温反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定した。

【0046】

試薬Ａ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ６．６） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ １．５ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＦ８８ ０．０５ｗ／ｖ％
カタラーゼ ６００Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ０．８Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ ２．０Ｕ／ｍＬ
スフィンゴミエリナーゼ ０．５Ｕ／ｍＬ

【0047】

試薬Ｂ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１％
各種界面活性剤※ ２．０ｗ／ｖ％
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．５Ｕ／ｍＬ
※２種類以上を組み合わせている場合は合わせて２．０ｗ／ｖ％

【0048】

試薬Ｂが添加されてから、単位時間経過後の各分画における吸光度変化量を表１に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが確認できる。

【0049】

【表1】

【0050】

参考例２
超遠心を用いてＣＭ〜ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ２分画、ＨＤＬ３分画を画分し、下記試薬Ｃを反応させ、さらに、下記試薬Ｄを添加し、測定を行った。測定は、各分画２μＬに試薬Ｃを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｄを５０μＬ添加しさらに５分加温反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定した。

【0051】

試薬Ｃ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ６．６） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ ０．５６ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＯＴ−２２１ ０．０１ｗ／ｖ％
カタラーゼ ６００Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ０．８Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ ２．８Ｕ／ｍＬ

【0052】

試薬Ｄ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１％
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（ＨＬＢ：１３．８） ２．０ｗ／ｖ％
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．５Ｕ／ｍＬ

【0053】

試薬Ｄが添加されてから、単位時間経過後の各分画における吸光度変化量を表２に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが確認できる。

【0054】

【表2】

【0055】

実施例３
超遠心を用いてＣＭ〜ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ２分画、ＨＤＬ３分画を画分し、下記試薬Ｅを反応させ、さらに、下記試薬Ｆを添加し、測定を行った。測定は、各分画２μＬに試薬Ｅを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｆを５０μＬ添加しさらに５分加温反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定した。

【0056】

試薬Ｅ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ６．６） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＴＯＯＳ １．５ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＦ８８ ０．０５ｗ／ｖ％
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ０．３Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ ２．０Ｕ／ｍＬ
スフィンゴミエリナーゼ ０．５Ｕ／ｍＬ

【0057】

試薬Ｆ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１％
各種界面活性剤※ ２．０ｗ／ｖ％
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３０Ｕ／ｍＬ
※２種類以上を組み合わせている場合は合わせて２．０ｗ／ｖ％

【0058】

試薬Ｆが添加されてから、単位時間経過後の各分画における吸光度変化量を表３に、ＨＤＬ３／ＨＤＬ２反応比を図１に示す。ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルを包含するポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの、ＨＬＢが１２〜１５、特に１３．５〜１４．５でＨＤＬ３／ＨＤＬ２反応比が高いことが分かる。

【0059】

【表3】

【0060】

参考例４
超遠心を用いてＣＭ〜ＶＬＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ２分画、ＨＤＬ３分画を画分し、上記試薬Ｅを反応させ、さらに、下記試薬Ｇを添加し、測定を行った。測定は、各分画２μＬに試薬Ｅを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｇを５０μＬ添加しさらに５分加温反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定した。

【0061】

試薬Ｇ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１％
界面活性剤※ ０．０１〜２０．０ｗ／ｖ％（終濃度０．００２５〜５．０ｗ／ｖ％）
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３０Ｕ／ｍＬ
※２種類以上を組み合わせている場合は合計の濃度

【0062】

試薬Ｇが添加されてから、単位時間経過後の各分画における吸光度変化量を表４に示す。ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルを含むポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの終濃度が０．０２５〜５．０ｗ／ｖ％、特に０．２５〜２．５ｗ／ｖ％でＨＤＬ３が特異的に反応していることがわかる。

【0063】

【表4】

【0064】

参考例５
ヒト血清試料に、上記試薬Ａを反応させ、さらに、下記試薬Ｈを添加し、測定を行った。測定は、血清２μＬに試薬Ａを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｈを５０μＬ添加しさらに単位時間加温反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定してＨＤＬ３コレステロールとし、また、別に測定した総ＨＤＬコレステロールをもとに計算によりＨＤＬ２コレステロールを求めた。

【0065】

試薬Ｈ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．１％
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（ＨＬＢ：１３．６） ２．０ｗ／ｖ％
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．５Ｕ／ｍＬ

【0066】

試薬Ａと試薬Ｈで求めたＨＤＬ３コレステロールと、沈殿法（特許文献１）で求めたＨＤＬ３コレステロールとの相関を図２に、試薬Ａと試薬Ｈで求めたＨＤＬ３コレステロールと総ＨＤＬコレステロールから計算により求めたＨＤＬ２コレステロールと、沈殿法で求めたＨＤＬ３コレステロールと総ＨＤＬコレステロールから計算により求めたＨＤＬ２コレステロールとの相関を図３に示す。ＨＤＬ３でも、ＨＤＬ２でも、本発明と沈殿法に強い相関関係があることが確認できる。

【0067】

参考例６
ヒト血清試料に、下記試薬Ｉを反応させ、さらに、上記試薬Ｈを添加し、測定を行った。測定は、血清２μＬに試薬Ｉを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｅを５０μＬ添加しさらに単位時間加温反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度を測定してＨＤＬ３コレステロールとし、また、別に測定した総ＨＤＬコレステロールをもとに計算によりＨＤＬ２コレステロールを求めた。

【0068】

試薬Ｉ
ＢＥＳ緩衝液 （ｐＨ６．６） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ ０．５６ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニオンＯＴ−２２１ ０．０１ｗ／ｖ％
カタラーゼ ６００Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ ０．８Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ ２．０Ｕ／ｍＬ
スフィンゴミエリナーゼ ０．５Ｕ／ｍＬ

【0069】

試薬Ｉと試薬Ｈで求めたＨＤＬ３コレステロールと、超遠心法で求めたＨＤＬ３コレステロールとの相関を図４に、試薬Ｉと試薬Ｈで求めたＨＤＬ３コレステロールと総ＨＤＬコレステロールから計算により求めたＨＤＬ２コレステロールと、超遠心法で求めたＨＤＬ２コレステロールとの相関を図５に示す。ＨＤＬ３でも、ＨＤＬ２でも、本発明と超遠心法に強い相関関係があることが確認できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】