特許 6182019 高分子化造影剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6182019

(24)【登録日】2017年7月28日

(45)【発行日】2017年8月16日

(54)【発明の名称】高分子化造影剤

(51)【国際特許分類】

   C08G 65/48 20060101AFI20170807BHJP

   A61K 49/12 20060101ALI20170807BHJP

【ＦＩ】

   C08G65/48

   A61K49/12

【請求項の数】7

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2013-171303(P2013-171303)

(22)【出願日】2013年8月21日

(65)【公開番号】特開2015-40242(P2015-40242A)

(43)【公開日】2015年3月2日

【審査請求日】2016年8月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】510094724

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立循環器病研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(72)【発明者】

【氏名】山岡 哲二

(72)【発明者】

【氏名】馬原 淳

【審査官】 岸 智之

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０９−５００３６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０５７９６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０７５９７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０１７２５７６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０５９８３５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｇ ６５／４８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

Ａ６１Ｋ ４９／１２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）：

【化1】

【化2】

【化3】

に示される構造を有する、３以上の分岐を有する分岐型ポリエチレングリコール、を含む高分子化合物であって、
Ｒは同一または異なって、分岐型ポリエチレングリコールと結合する金属キレートを示し、；
ｎは同一または異なってもよく、合計で１００〜４５０の整数を示し；
ｍは１〜２８の整数を示す；
高分子化合物。

【請求項2】

金属キレートにおけるキレート化剤が、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＴＰＡ無水物、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰ−ＤＯ３Ａからなる群から選択される１または２以上のキレート化剤である、請求項１に記載の高分子化合物。

【請求項3】

金属がガドリニウムである、請求項１または請求項２の高分子化合物。

【請求項4】

Ｒが、下記式（ＩＶ）：

【化4】

で示される、請求項３の高分子化合物。

【請求項5】

分岐型ポリエチレングリコール骨格の分子量が２０，０００未満である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の高分子化合物。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか１項に記載の高分子化合物を含む、ＭＲＩ造影剤。

【請求項7】

細胞標識用である、請求項６に記載のＭＲＩ造影剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規高分子化合物、およびそれを利用した造影剤に関する。

【背景技術】

【0002】

現代医療において、画像診断の果たす役割は大きいが、中でも非破壊的、非侵襲的に生体の内部形態や内部機能を測定し、その結果を画像によって示すことのできる画像診断方法が重要になっている。

【0003】

このような画像診断方法には、Ｘ線診断方法、放射線核医学診断方法（ポジトロンＣＴ：ＰＥＴ、シングルフォトン：ＳＰＥＣＴ）、核磁気共鳴診断法（ＭＲＩ）、超音波ＵＳ等が挙げられる。中でも、ＭＲＩは、軟部組織の解像力に優れ、任意の方向での撮像が可能で、ＰＥＴのような大がかりなものでないという利点があるため、汎用性が高い。

【0004】

ＭＲＩとは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）現象を利用する方法であり、生体内に存在する原子、典型的には水分子中の水素原子（プロトン）、から得られるＭＲ信号を、画像化して用いる方法である。測定対象中に存在するプロトンのエネルギーレベルが、ＭＲＩ装置から照射された電磁波によって一旦高くなった後、元のエネルギーレベルに戻るまでの時間（緩和時間）又はその際の速度（緩和速度）の差、あるいは被験物中のプロトン密度の違いによって、画像上にコントラストとして現れる。

【0005】

このＭＲＩには、ＭＲＩ造影剤が用いられる場合がある。ＭＲＩ造影剤とは、ＭＲＩ等において、プロトンの緩和時間を短くする作用を有する物質を用いて、コントラストが小さい場合等に、より鮮明な画像を得るために用いられるものである。現在用いられているＭＲＩ造影剤としては、ガドリニウム等に代表される金属を中心としたキレート化合物（金属キレート）が挙げられる。市販されるＭＲＩ造影剤として、オムニスキャン（登録商標、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、第一製薬製），プロハンス（登録商標、Ｇｄ（ＨＰ−ＤＯ３Ａ）、エーザイ製）、マグネスコープ（登録商標、Ｇｄ−ＤＯＴＡ、栄研又は田辺製薬製）、マグネビスト（登録商標、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、シェーリング製）等の低分子化合物が挙げられる。

【0006】

また、血流情報をより正確に得るために、上記の低分子造影剤の血中半減期を延長させた、高分子結合型造影剤（特許文献１、非特許文献１〜３等参照）、癌をターゲットとした金属内包ミセル、コントラストを高めるために多量の金属キレートを結合させうるようにした、デンドリマー型の造影剤等が開発されている。

【0007】

例えば、下記非特許文献１の造影剤は、ポリグルタミン酸（ＰＧ）に結合させた、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＤＯＴＡが記載されている。非特許文献２、３では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−システイン複合体や、Ｇｄ−ＤＯ３Ａ等を結合させたものが記載されている。

【0008】

しかしながら、臨床で用いられる低分子造影剤は、細胞に導入した場合でも細胞膜から造影剤が漏出するため特異的に細胞を標識できない。また、デキストランやデンドリマーを主骨格にもつ高分子造影剤では、生体内からの速やかな体外排泄性が不十分であることや、他細胞への取り込みにより細胞特異性が低下するという問題が指摘されている。

【0009】

また、５ｎｍ程度の酸化鉄の会合体（６０ｎｍ程度のサイズ）から形成されるＳＰＩＯ（磁性粒子）も臨床において既に実用化されており、細胞標識剤としての研究も報告されている。しかし、細胞死に伴ってＳＰＩＯが体外排出されず組織に沈着してしまう現象や、クッパ−細胞によるＳＰＩＯの取り込み等が認められているため、ＳＰＩＯは特異的な細胞標識剤として使用することが難しい。

【0010】

細胞を標識するための造影剤には、特異的に細胞を標識でき、移植後ＭＲＩ画像において高いコントラストで標的細胞を識別し、細胞死に伴って生体内から速やかに体外へ代謝される事が望まれるが、未だこのような特性を併せもつ高分子造影剤は開発されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２００８／０５９８３５号公報

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．； （Ａｒｔｉｃｌｅ）； ２００４； １５（６）； １４０８−１４１５

【非特許文献2】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．； （Ａｒｔｉｃｌｅ）； ２００４； １５（６）； １４２４−１４３０

【非特許文献3】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｏｙｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ２４９ （１９９７） １８５−１９０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、特異的に細胞を標識でき、移植後ＭＲＩ画像において高いコントラストで標的細胞を識別し、細胞死に伴って生体内から速やかに体外へ代謝される特性を有する高分子造影剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、分岐構造のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を基礎骨格に用いた金属キレート複合体により、生体内からの速やかな代謝を実現でき、少量でも高い造影効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

【0015】

すなわち、本発明は、
（１）下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）：

【化1】

【化2】

【化3】

に示される構造を有する、３以上の分岐を有する分岐型ポリエチレングリコール、を含む高分子化合物であって、
Ｒは同一または異なって、分岐型ポリエチレングリコールと結合する金属キレートを示し、；
ｎは同一または異なっていてもよく、合計で１００〜４５０の整数を示し；
ｍは１〜２８の整数を示す；
高分子化合物、
（２）金属キレートにおけるキレート化剤が、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＴＰＡ無水物、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰ−ＤＯ３Ａからなる群から選択される１または２以上のキレート化剤である、（１）の高分子化合物、
（３）金属がガドリニウムである、（１）または（２）の高分子化合物、
（４）Ｒが、下記式（ＩＶ）：

【化4】

で示される、（３）の高分子化合物、
（５）分岐型ポリエチレングリコール骨格の分子量が２０，０００未満である、（１）〜（４）のいずれかの高分子化合物、
（６）（１）〜（５）のいずれかの高分子化合物を含む、ＭＲＩ造影剤、
（７）細胞標識用である、（６）のＭＲＩ造影剤、
を提供する。

【発明の効果】

【0016】

本発明の化合物は、ＭＲＩ造影剤に用いることが可能である。本発明の造影剤は、分岐構造を有するＰＥＧを主鎖骨格に用いることで生体内からの速やかな代謝を実現でき、また１分子中に複数の金属イオンを導入できるため少量でも高い造影効果を示す。さらに、同程度の分子量をもつ直鎖構造の高分子造影剤と比較して、分岐鎖の分子運動が抑制されるため、金属イオンによる高い緩和能を保持することができる。速やかな代謝性により、標識細胞が死滅した場合、造影剤は体内から速やかに排出されるため、この造影剤は生細胞を高感度で識別できる造影剤として機能できる。このような特性は、現在臨床応用が進められているｉＰＳ細胞や組織幹細胞の細胞移植治療における移植細胞追跡において適用でき、移植細胞の生存率や生着率といった移植時の評価や、遠隔期における移植細胞の治療効果の検証等、幹細胞治療におけるバリデーション技術の確立に極めて有効である。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ラット大腿筋へインジェクト後の尿中からのＧｄ排泄量のプロファイルを示す図である。

【図2】Ｇｄならびにフルオレセインで標識されたＰＥＧ造影剤のラット骨髄由来間葉系幹細胞への導入効果のＦＡＣＳ解析結果を示す図である。

【図3】ｒＭＳＣに対して、ソノポレーションによりＧｄで標識した８分岐構造のＰＥＧ造影剤を導入した細胞懸濁液のＭＲＩ画像である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は一態様において、分岐型ＰＥＧを基本骨格とした金属キレート複合体である、高分子化合物を提供する。より具体的に、本発明は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）に示される構造を有する、３以上の分岐を有する分岐型ＰＥＧ、を含む高分子化合物であって、Ｒは同一または異なって、アミド結合によって分岐型ＰＥＧと結合する金属キレートを示し；ｎは同一または異なってもよく、合計で１００〜４５０の整数を示し；ｍは１〜２８の整数を示す；高分子化合物を提供する。

【0019】

本発明の高分子化合物に用いられる分岐型ＰＥＧは、３以上の分岐を有するＰＥＧである。用いられる分岐型ＰＥＧの分子量、すなわち本発明の高分子化合物の分岐ＰＥＧ骨格の分子量は、約２０，０００未満であることが好ましい。分岐ＰＥＧの分子量の好ましい例としては、例えば約８，０００〜約１８，０００、約８，０００〜約１７，０００、約９，０００〜約１６，０００、約１２，０００〜約１６，０００、約１０，０００〜約１５，０００、約１４，０００〜約１６，０００等が挙げられる。最も好ましくは約１５，０００である。

【0020】

金属キレートに用いられる金属イオンとしては、各種の磁性金属が挙げられる。具体的には、ガドリニウム、セリウム、サマリウム、ユウロピウム、ジスプロシウム、ツリウム、イッテルビウムなどのランタノイド系元素のイオン、クロム、モリブデン、タングステンなどの６族元素のイオン、マンガンなどの７族元素のイオン、鉄、ルテニウム、オスミウムなどの８族元素のイオン、コバルト、ロジウムなどの９族元素のイオン、ニッケル、パラジウムなどの１０族元素のイオン、銅などの１１族元素のイオン、亜鉛、カドミウムなどの１２族元素のイオンなどが挙げられる。これらの中では、キレート化剤の原子と配位する数が最も多く、錯体の安定性が高いなどの点から、ガドリニウム（Ｇｄ）イオンを用いることが好ましい。

【0021】

金属キレートに用いられるキレート化剤（キレート配位子）としては、これらに限定されるというものではないが、公知のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ（ジエチレントリアミン五酢酸−ブチルメタクリレート）、ＤＴＰＡ無水物、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラアセテート）、ＤＯ３Ａ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリアセテート）、ＨＰ−ＤＯ３Ａ（２−ヒドロキシプロピル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリアセテート）等が挙げられる。なかでも、ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡが好ましい。

【0022】

本発明の高分子化合物に用いられる金属キレートは、上述の金属イオンおよびキレート剤から常法により製造できる。具体的には、金属イオンとキレート化剤を、例えば水溶液中で常温、常圧化、ｐＨ６〜６．５で、２４時間混合する等の方法により、製造することもできる。好ましいｐＨの範囲は、キレート化剤の種類にもよるが、一般に、キレート化が促進されという点で、上記のようなｐＨ値とすることが好ましい。オムニスキャン（登録商標、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、第一製薬製）、プロハンス（登録商標、Ｇｄ（ＨＰ−ＤＯ３Ａ）、エーザイ製）、マグネスコープ（登録商標、Ｇｄ−ＤＯＴＡ、栄研又は田辺製薬製）、マグネビスト（登録商標、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、シェーリング製）等の市販されているものを用いてもよい。最も好ましくは、金属キレートはＧｄ−ＤＯＴＡである。

【0023】

金属キレートと分枝ＰＥＧは、任意の結合を介して結合される。例えば、アミド結合、エステル結合、イソチオウレア結合、スルホンアミド結合、シッフベース結合、またカルバメート結合が挙げられるが、これらに限定されるというものではない。好ましくはアミド結合である。

【0024】

ｎは化合物内の合計で１００〜４５０の整数であり、本発明の化合物の好ましいｎの合計の例は、１８０〜４１０の整数、１８０〜３８０の整数、２００〜３６０の整数、２７０〜３６０の整数、２２４〜３４０の整数、３１５〜３６０の整数、などである。

【0025】

ｍは１〜２８の整数であり、好ましくは１〜１６の整数、より好ましくは１〜１２、さらに好ましくは１〜８の整数である。ＰＥＧの分岐は３分岐以上、好ましくは３〜１２分岐、より好ましくは４〜１０分岐であり、例えば４分岐または８分岐などである。

【0026】

本発明の高分子化合物は、例えば次のようにして製造することができる。下記式（Ｖ）で示される分岐型ＰＥＧは、当業者が容易に製造できるか、或いは市販されている。例えば、ｎの合計が２１６、ｍ＝４である化合物としては、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＨＧＥＯ−１００００（日本油脂株式会社製）が挙げられる。分岐型ＰＥＧと金属キレートの結合も当業者が常法により行うことができる。例えば分岐型ＰＥＧと金属キレートのＮＨＳエステルをＤＭＳＯ溶液に溶解して室温で攪拌、精製することにより、本発明の高分子化合物を得ることができる。あるいは、NHSエステルをもつ分岐型PEGに対してアミノ基導入した金属キレートを室温で撹拌、生成することによっても、本発明の高分子化合物を得ることができる。

【化5】

【0027】

本発明は、一態様において、本発明の高分子化合物を含むＭＲＩ造影剤を提供する。特に、本発明のＭＲＩ造影剤は細胞標識用ＭＲＩ造影剤に好適である。

【0028】

本発明のＭＲＩ造影剤中の、上記の高分子化合物の濃度は、０．１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは、０．５〜５重量％である。

【0029】

本発明のＭＲＩ造影剤は、上記の高分子化合物の他、水、アルコール、生理食塩水等の溶媒の他、マンニトール等の、注射剤等に一般に用いられる成分、あるいはＭＲＩ造影剤に一般に用いられている成分を更に含ませることができる。

【0030】

また、本発明のＭＲＩ造影剤としての性質に悪影響を及ぼさない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば薬学的に許容される担体として、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、可溶化剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化することができる。

【0031】

賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。

【0032】

本発明のＭＲＩ造影剤は、注射剤、カテーテル用液剤、経口用液剤、細胞処理液、組織処理液等の液剤の形態が好ましく、中でも、移植細胞を処理する場合の細胞処理液、組織処理液が好ましい。

【0033】

本発明のＭＲＩ造影剤は、上記の主成分である高分子化合物と、上記第２成分等の他の成分各々を、常温、常圧下で混合する等の方法によって、得ることができる。

【0034】

本発明のＭＲＩ造影剤は、主成分である金属キレート複合体が、細胞膜を通り抜け難い性質を有しており、細胞膜に近づくこと自体、少ないという性質を有している。また、本発明のＭＲＩ造影剤を細胞内に導入した場合、細胞分裂後も、細胞群のほぼ全体に亘って、ＭＲＩ造影剤の存在が観察された。このことによって、例えば、再生治療等において、移植細胞の増殖の様子を観察することが可能となる。

【0035】

本発明のＭＲＩ造影剤を、筋肉、血管、臓器その他の組織に投与する場合の投与方法は、特に限定されるものではないが、経口投与、カテーテル投与、静注等の静脈投与、筋肉内投与、経皮投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、直腸内投与、粘膜投与、吸入等が挙げられる。なかでも、静注等の静脈投与が好ましい。マウス等の実験動物が測定対象の場合には、尾静脈注射等の方法も挙げられる。

【0036】

本発明のＭＲＩ造影剤を、対象細胞に投与する方法としては、特に限定されるものではないが、細胞処理液、組織処理液等の溶液に細胞を浸積して電気刺激を与えるエレクトロポレーションのほか、マイクロインジェクション、細胞膜融合性リポソームを用いる方法、超音波とマイクロバブルを用いるソノポレーション法等を用いることができる。

【0037】

本発明のＭＲＩ造影剤の剤形は、エレクトロポレーション等に用いる細胞処理液、組織処理液の形態のほか、注射剤やカテーテル用液剤、経口用液剤等の形態が挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。

【0038】

投与量は、標的となる組織や細胞の種類、数、疑われている疾患の種類、進行度、患者の年齢、性別、体重等により適宜調整することができ、必ずしも限定されるものでは無いが、一般に、下記の量が選択し得る。経口、経皮、注射等によって組織に投与する際には、１回の投与量は、通常、上記の高分子化合物量として、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。Ｇｄ重量としては、１回の投与当たり、０．００１ｍｇから１０ｍｇ投与することが好ましい。また、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞膜融合性リポソームを用いる方法等によって細胞内に直接投与する際には、１細胞辺り１０^７〜１０^１２個の金属キレート複合体が入る様に投与することが好ましい。この量を投与された細胞は、細胞分裂に際して、分裂細胞にも適当な量の金属キレート複合体が分配されるため、細胞移植の増殖による組織の再生課程の追跡が、より確実となるからである。

【0039】

細胞移植に際し、ｉｎ ｖｉｖｏ、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、又は細胞膜融合性リポソームを用いる方法等によってＭＲＩ造影剤を移植する細胞に導入できる。当該導入細胞を移植した後、４．７Ｔ（３次元）ＭＲＩ等によって、移植細胞、及びその分裂細胞の様子を経時的に観察することができる。本発明のＭＲＩ造影剤を細胞内に導入した場合、細胞分裂後も細胞群のほぼ全体に亘って、それらが存在していることが観察されており、例えば再生治療等において、移植細胞の増殖の様子を観察することが可能となる。

【0040】

以下、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限られるものでは無い。

【実施例】

【0041】

実施例１：高分子化合物の調製
分子量（ＭＷ）１０，０００、１５，０００、２０，０００の４分岐ＰＥＧ（日本油脂より入手）それぞれに対して、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルを脱水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に溶解し、Ａｒ雰囲気下で室温にて２４時間攪拌した。その後、分子量カット３５００の透析膜により精製後、凍結乾燥により、Ｇｄ−４ａｒｍ−ＰＥＧを得た。同様にして、ＭＷ１５，０００の８分岐ＰＥＧ（日本油脂より入手）から、Ｇｄ−４ａｒｍ−ＰＥＧを得た。また、ＭＷ１０，０００の直鎖状ＰＥＧ（日本油脂より入手）から、同様の操作を経て、Ｇｄ−ｌｉｎｅａｒ−ＰＥＧを得た。合成した分子は、ＮＭＲにより構造ならびにＤＯＴＡの導入率を決定した。Ｇｄ導入率についてはＩＣＰ−ＭＳにより同定した。各高分子化合物の詳細を、表１に示す。

【0042】

【表1】

【0043】

実施例２：高分子化合物の体外排泄の調査
実施例１で調製した高分子化合物、および、主鎖として分子量１５，０００〜２０，０００のデキストランを用いて実施例１と同様に調製した化合物（Ｇｄ−Ｄｅｘｔｒａｎ）を、ＳＤラット（約２００ｇ）の大腿筋へ注入（Ｇｄ量として０．８μｍｏｌ、１００μＬ／１００ｇ）し、２４時間後に尿を回収した。回収した尿を硝酸により分解し含まれるＧｄ濃度をＩＣＰ−ＭＳにより定量することで、体外排泄量を算出した。

【0044】

結果、ＤＭＳＯ中で２４時間撹拌することにより、直鎖状あるいは分岐構造をもつＰＥＧの末端にＤＯＴＡによりキレートされたＧｄを導入することができた（表１）。この造影剤をラットにインジェクトして、時間に対する体外排泄量をプロットしたものを図２に示す。時間経過に伴っていずれの高分子化合物も体外へと排泄されるプロファイルを示した。注入６日後の排泄量を比較した結果、４あるいは８分岐の分子量１５，０００をもつＰＥＧからなる造影剤は、７５％が尿中排泄した。一方で、分子量が２０，０００の４分岐構造をもつ高分子化合物や、デキストランを主鎖にもつ化合物は、５０％程度の体外排泄量に留まった。つまり、分子量や分岐構造は体外排泄の速度を変化させる事が示された。この結果より、分子量１５，０００の４あるいは８分岐構造をもつＰＥＧは速やかに体外排泄されることが明らかとなった。

【0045】

実施例３：間葉系幹細胞に対する本発明の高分子化合物による造影剤の標識とＭＲＩ画像における造影効果
ラットの骨髄から採取した間葉系幹細胞（１×１０^６個）に対して、ソナゾイド（マイクロバブル、５×１０^７個）とＧｄ−８ａｒｍ−ＰＥＧ（Ｍｗ：１，５０００）をポリスチレンチューブ内で混合し、超音波照射した（出力：２．５Ｗ／ｃｍ^２、時間：１２０秒、負荷サイクル：２０％）。その後、ＦＡＣＳにより導入された割合、およびＭＲＩによる標識化細胞の造影効果を検討した。

【0046】

超音波照射によりＧｄで標識されたＰＥＧ造影剤の間葉系幹細胞への導入効率をＦＡＣＳにより定量した。その結果、超音波によるソノポレーション法を用いることで２９−４３％の細胞に対してＰＥＧ造影剤を導入することができた（図２）。

【0047】

次いで、ＮＭＲにより造影剤の緩和能を測定した結果、Ｔ１強調における造影効率としてＲ_１を測定した結果、８または４分岐構造のＰＥＧ造影剤は、デキストランを主鎖とするＧｄ造影剤と比較して２倍程度の高い緩和能を示した（表１）。

【0048】

造影剤を導入したラット由来間葉系幹細胞の懸濁液を１．５Ｔ ＭＲＩにより撮像した（図３）。その結果、ＰＥＧが導入された細胞では、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の細胞懸濁液と比較して有意なコントラストを得ることができた。

【0049】

以上の結果より、ＰＥＧを主鎖骨格にもつ高分子造影剤は、ソノポレーション法により細胞へ標識することで、ＭＲＩにおいて標識細胞を有意に造影できることから、早期体外排泄能を有する細胞標識用ＭＲＩ造影剤として有効であることが示された。一方、従来の低分子造影剤に比べて優れた血中滞留性に基づいて末梢血管の撮像をも可能にする造影剤として利用できることも明らかとなっている。

【産業上の利用可能性】

【0050】

本発明の高分子化合物は、細胞移植における細胞標識用造影剤として利用可能である。分岐ＰＥＧを原材料として、末端のアミノ基に対して金属キレート化剤を反応させることで容易にガドリニウムキレート剤を合成できるため、製品化プロセスにおいても安価に大量合成できる。また、ＰＥＧは生体適合性が高い材料として認知されており、既に医薬品製造用の添加剤として応用されていることからも、安全性が担保されているといえる。

【図1】

【図2】

【図3】