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特許6182313癌治療のためのチオキサントンをベースとしたオートファジー阻害剤療法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6182313
(24)【登録日】2017年7月28日
(45)【発行日】2017年8月16日
(54)【発明の名称】癌治療のためのチオキサントンをベースとしたオートファジー阻害剤療法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/382 20060101AFI20170807BHJP
A61K 31/138 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/165 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/166 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/167 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/18 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/27 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/343 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/4045 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/4188 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/4406 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20170807BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20170807BHJP
A61K 33/36 20060101ALI20170807BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20170807BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20170807BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20170807BHJP
【ＦＩ】
A61K31/382
A61K31/138
A61K31/165
A61K31/166
A61K31/167
A61K31/18
A61K31/27
A61K31/343
A61K31/4045
A61K31/4188
A61K31/436
A61K31/4406
A61K31/506
A61K31/7048
A61K33/36
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
【請求項の数】18
【全頁数】38
(21)【出願番号】特願2012-557182(P2012-557182)
(86)(22)【出願日】2011年3月8日
(65)【公表番号】特表2013-522211(P2013-522211A)
(43)【公表日】2013年6月13日
(86)【国際出願番号】US2011027606
(87)【国際公開番号】WO2011112623
(87)【国際公開日】20110915
【審査請求日】2014年2月13日
【審判番号】不服2016-2752(P2016-2752/J1)
【審判請求日】2016年2月24日
(31)【優先権主張番号】61/311,736
(32)【優先日】2010年3月8日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506311677
【氏名又は名称】スペクトラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100095500
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 正和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(72)【発明者】
【氏名】ノーロキ，ステファン，ティー．
(72)【発明者】
【氏名】カルー，ジェニファー，エス，
(72)【発明者】
【氏名】レディ，グル
【合議体】
【審判長】
村上 騎見高
【審判官】
前田 佳与子
【審判官】
穴吹 智子
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第０９／１０８５７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第０９／１３３８６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Ｄｒｕｇｓ，２００９年，Ｖｏｌ．６９ Ｎｏ．１４，ｐ．１９１１−１９３４
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
A61K 31/00-33/44
ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭｅｄＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌の治療用のオートファジーを誘導する化学療法化合物の治療有効量と組み合わせて使用するための医薬組成物であって、
前記オートファジーを誘導する化学療法化合物は、三酸化ヒ素、エトポシド、ラパマイシン、タモキシフェン、テモゾロミド、イマチニブ、ボルテゾミブ、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２，４−ジエンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド、（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド、（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、または｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマート、またはそれらの塩であり、
前記医薬組成物は治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤を含み、前記チオキサントンベースオートファジー阻害剤が、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミド、またはそれらの塩である、医薬組成物。
前記オートファジーを誘導する化学療法化合物は、三酸化ヒ素、エトポシド、ラパマイシン、タモキシフェン、テモゾロミド、イマチニブ、ボルテゾミブ、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２，４−ジエンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド、（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド、（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、または｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマート、またはそれらの塩であり、
前記医薬組成物は治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤を含み、前記チオキサントンベースオートファジー阻害剤が、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミド、またはそれらの塩である、医薬組成物。
【請求項2】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が同時に投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が逐次的に投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が約３時間以内に相互に投与される請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項5】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が約２時間以内に相互に投与される請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項6】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が約１時間以内に相互に投与される請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項7】
癌が、肺癌、脳癌、中枢神経系癌、乳癌、結腸癌、白血病、骨髄腫、前立腺癌、または卵巣癌である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
肺癌が非小細胞肺癌である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および治療有効量のオートファジーを誘導する化学療法化合物が単回一日量または１つの一日量より多くの数に分割されて投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記１つの一日量より多くの分割の数が、２分割の一日量である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が経口投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項12】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が非経口的に投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物がカプセルまた錠剤の形で投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤およびオートファジーを誘導する化学療法化合物が１回以上のサイクルで投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記１サイクルが４日毎に７回を含む請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
放射線療法を投与することをさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項17】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤を使った癌関連症状の緩和が、ｐ５３活性の機能的状態と独立して発生する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項18】
医薬品キットであって、
ａ）治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記チオキサントンベースオートファジー阻害剤が、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミド、またはそれらの塩である、医薬組成物、ならびに
ｂ）治療有効量のオートファジーを誘導する化学療法化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記オートファジーを誘導する化学療法化合物は、三酸化ヒ素、エトポシド、ラパマイシン、タモキシフェン、テモゾロミド、イマチニブ、ボルテゾミブ、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２，４−ジエンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド、（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド、（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、または｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマート、またはそれらの塩である、医薬組成物、
を含むキット。
ａ）治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記チオキサントンベースオートファジー阻害剤が、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミド、またはそれらの塩である、医薬組成物、ならびに
ｂ）治療有効量のオートファジーを誘導する化学療法化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記オートファジーを誘導する化学療法化合物は、三酸化ヒ素、エトポシド、ラパマイシン、タモキシフェン、テモゾロミド、イマチニブ、ボルテゾミブ、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２，４−ジエンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド、（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド、（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、または｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマート、またはそれらの塩である、医薬組成物、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権主張本特許出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１０年３月８日出願の米国特許仮出願第６１／１３１、７３６号の優先権を主張する。この出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
緒言癌は米国における２番目の主要な死亡原因であり、１９９８年には、１、２２８、６００件の新規症例と５６４、８００件の死亡があったと推計されている。過去５０年間で、主に喫煙よる肺癌の死亡割合の増加が原因で、癌の死亡割合は着実に増加している。癌は、全年齢層で発生するが、その発生率は４５才超の年齢で急激に増加する。しかし、癌は、３５〜６５才の米国人の主要な死亡原因であり、また、１５才未満の米国人小児の主要な非偶発的死亡原因でもある。癌による男性の死亡率は女性より高く、黒人は、主要人種集団の中で癌死亡率が最も高い。米国では、男性は生涯に約１／２の確率で癌発症のリスクがあり、女性は、生涯に約１／３の確率で同リスクがある。今後予測される心臓疾患および脳卒中による死亡の引き続く減少に伴い、癌は２０１０年までに全米国人集団の主要な総合的死亡原因になるであろう。
【0003】
癌の診断には、通常、病理学者による組織生検標本の組織学的検査が必要であるが、悪性の初期徴候が、症状またはＸ線撮影画像の異常である場合もある。診断された後は、癌は、通常、手術、化学療法、放射線療法、または標的療法、例えば、免疫療法、ホルモン療法、または血管新生阻害剤療法により治療される。治療の選択は、腫瘍の部位とグレードおよび病期、ならびに患者の全身状態（パフォーマンスステータス）に依存する。さらに、癌のタイプと病期に応じて、これらの癌治療の中から２つ以上を同時に組み合わせるか、または交互に使用することができる。身体の他の部分に損傷を残すことなく癌を完全に除去することが治療の目標であるが、現在の癌治療手法は、完全に成功するには至っていない。手術に関しては、１つには、これは個別のまたは少数の癌細胞の隣接組織に侵入する、または遠くの部位に転移する性質に起因し、その結果、局所外科療法の効力を制約する。化学療法および放射線療法の効力は、身体中の正常組織に対する毒性、または損傷によって制限されることが多い。従って、より有効な癌治療を提供できる化合物、組成物、および方法が強く望まれることになる。さらに、現在治療法が無い特定の型の癌を治療できる化合物、組成物、および方法も、強く望まれるであろう。
【0004】
オートファジー（マクロオートファジーまたはオートファゴサイトーシス）は、異化プロセスであり、これにより、損傷を受けた、重複した、あるいは、不必要なタンパク質およびオルガネラ等の細胞質の成分をリソソーム機構によって分解する。栄養素欠如、代謝ストレスまたは微小環境条件下で、緻密に調節されたプロセスであるこの分解経路が誘導され、エネルギーバランス、損傷を受けたタンパク質のクリアランスおよびストレスへの適応を確実にする。オートファジーは、正常細胞の増殖および成長の一翼を担い、細胞成分の合成と分解の間のバランスの維持を支援する。さらに、このプロセスは、恒常性および生存能を維持するために、代謝ストレス期間の間の代替エネルギーソースとして役立たせることができる分解産物を提供する。従って、オートファジーは、栄養素飢餓状況において細胞保護的な役割を果たす。
【0005】
自己共食いプロセスは、オートファゴソームまたは自食作用胞と呼ばれる二重膜結合小胞中への細胞中の細胞質の一部の封入を行い、タンパク質およびオルガネラ等の成分を残りの細胞質から隔離する。オートファゴソームは、オートファゴソーム前駆体として知られる小さな膜構造の伸張により形成される。この形成は、クラスＩＩＩフォスフォイノシチド−３−キナーゼおよびオートファジー関連遺伝子（Ａｔｇ）６（Ｂｅｃｌｉｎ−１としても知られる）により開始される。これらのオートファゴソーム前駆物質の拡大には、オートファジー制御分子の複合体を産生する２つのユビキチン様複合系の寄与が必要である。１つは、ＡＴＧ１２−ＡＴＧ５−ＡＴＧ１６複合体の結合に関与し、もう一つは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のＬＣ３／ＡＴＧ８およびＡＴＧ４プロテアーゼ複合体への結合に関与する。次に、核形成、拡大、脱外被が起こり、オートファゴソームの形成が完了する。その後、オートファゴソームの外膜が細胞質中でリソソームと融合して、オートリソソームまたはオートファゴリソソームを形成し、ここで、含有物は、酸性のリソソーム加水分解酵素により分解される。オートファジー活性化の最終的結果は、細胞含有物およびストレス誘導シグナルの強さと持続期間に大きく依存する。
【0006】
アミノ酸、脂質、核酸、および糖、等の細胞質およびオルガネラの分解産物が、パーミアーゼによってリソソームから細胞質に排出される。細胞は、これらの細胞分解産物を高分子合成またはエネルギー恒常性維持のための構成要素として利用する。従って、オートファジーは、細胞をリサイクルし、より重要な細胞プロセスに栄養素を再配分するための主要機序である。また、オートファジーは、損傷を受けた、または古い細胞成分、例えば、脱分極したミトコンドリアおよび折り畳みがほどけたタンパク質を分解することによる、タンパク質およびオルガネラの品質管理機能を有する。オートファジーによるタンパク質およびオルガネラの代謝回転は、古くなって、損傷を受けた細胞成分の毒性の増大を防ぎ、恒常性を維持するために重要である。
【0007】
オートファジーは、代謝ストレスおよび低酸素の条件下で腫瘍細胞の生存を増加させ、化学療法、放射線療法、または標的療法により誘導される細胞死を免れるための新規細胞保護的機序として登場していた。例えば、侵襲性の強い癌は、オートファジーに中継して、特に、低酸素および栄養素欠乏環境下、腫瘍細胞生存を維持するための代謝を支援する。さらに、オートファジーは、ストレスが除かれた場合、細胞増殖を再開する能力を有する少数の休眠腫瘍細胞を産生する。オートファジーは、それにより、癌細胞に対しストレス、治療ストレスにも、耐え、条件がさらに適するようになると、増殖を再開する柔軟性を与える。オートファジーにより与えられるこのストレス生存、休眠、および再生のプロセスは、癌治療に成功するための主要な障害となる可能性がある。さらに、癌治療、例えば、化学療法、標的療法、および放射線療法の主要態様は、アポトーシス、壊死または別の形の細胞死によりその癌細胞を死滅させるのに充分な腫瘍細胞の損傷の苦痛を与えることである。腫瘍微小環境における固有の代謝ストレスに加えて、細胞ストレスを増幅し、オートファジーを開始する治療がある。従って、オートファジーは、腫瘍壊死と炎症を制限し、代謝ストレスおよび治療誘導アポトーシスに応答して腫瘍細胞中のゲノム損傷を緩和する保護機能を提供することにより腫瘍細胞の長期生存を可能にする。
【0008】
オートファジーが、腫瘍細胞によって使用される代謝ストレスに耐えるための生存経路であることから、オートファジー阻害剤は、癌治療に有用であることが期待される。オートファジー阻害剤は、治療耐性、特に照射耐性を有する低酸素性の腫瘍領域にある腫瘍細胞を標的にできることから、特に魅力的である。さらに、転移プロセス中の腫瘍細胞は特にオートファジー依存性であり、早期進行およびアジュバント使用状態でのオートファジーを抑止する手法を支援することができる。特定の有用な癌治療は、オートファジーによる分解を阻害し、従来の化学療法剤の効力を高めるための試薬の使用を意図しているが、これは通常オートファジー経路を活性化する。オートファジー阻害剤の添加は、これらの試薬の細胞障害性を高めることが期待されよう。例えば、オートファジー阻害剤を使った治療は、ヒト癌患者におけるアポトーシス誘導化学療法剤の効力を高める可能性がある。従って、オートファジー阻害剤を使った、オートファジー媒介生存の阻止を狙った癌治療は、非常に有用である可能性がある。
【0009】
オートファジーの主要阻害剤を特定することは非常に望ましいが、オートファジー経路を特異的に標的にする試薬は、現状存在しない。本明細書は、広範囲の癌の治療に相乗的薬効が得られるオートファジーを誘導する化学療法化合物または照射と組み合わせたオートファジー阻害剤を提供する。
【発明の概要】
【0010】
従って、本明細書の態様では、チオキサントンベースオートファジー阻害剤が提供される。有用なチオキサントンベースオートファジー阻害剤には、これらに限定されないが、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミド、それらのインダゾール類似体、またはそれらの塩が含まれる。
【0011】
本明細書の他の態様では、癌治療オートファジー誘導化合物が開示される。このような化合物の非制限的例には、三酸化ヒ素、エトポシド、ラパマイシン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、タモキシフェン、テモゾロミド、イマチニブ、ボルテゾミブヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が挙げられる。有用なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤には、これらに限定されないが、ヒドロキサマートタイプヒストン脱アセチル化酵素阻害剤またはベンズアミドタイプヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が含まれる。このような阻害剤の非制限的例には、（２Ｅ、４Ｅ、６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４、６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２、４−ジエンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド、（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド、（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、もしくは｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマート、またはこれらの塩が含まれる。
【0012】
本明細書の他の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む医薬組成物が開示される。一態様では、医薬組成物は、治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤を含む。別の態様では、医薬組成物は、治療有効量の癌治療オートファジー誘導化合物を含む。また別の態様では、医薬組成物は、治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤；および治療有効量の癌治療のオートファジー誘導化合物を含む。本明細書で開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含むことができる。
【0013】
さらに本明細書の別の態様では、癌治療薬物の製造のための、本明細書で開示の化合物もしくは複数化合物または組成物の使用に関し開示される。
【0014】
本明細書のさらに別の態様では、癌の治療方法が開示され、この方法は、有効量の本明細書で開示のチオキサントンベースオートファジー阻害剤を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ、および有効量の本明細書で開示の癌治療オートファジー誘導化合物を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップを含み、チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物の両方の投与により癌関連症状を緩和し、それにより癌を治療する。チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物は、同時投与しても、逐次投与してもよい。チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物の逐次投与は、相互に、約３時間以内、約２時間以内、または約１時間以内のに投与であってもよい。本明細書で開示の化合物、組成物および方法を使って治療可能な癌の非制限的例には、肺癌、脳癌、中枢神経系癌、乳癌、結腸癌、白血病、骨髄腫、前立腺癌、または卵巣癌が含まれる。
【0015】
本明細書のさらなる態様では、本明細書で開示のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物または本明細書で開示のこのような化合物を含む組成物の癌治療のための使用が開示され、チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物の両方の投与により癌に関連す得る症状を緩和し、それにより、癌を治療する。本明細書で開示の化合物、組成物および方法を使って治療可能な癌の非制限的例には、肺癌、脳癌、中枢神経系癌、乳癌、結腸癌、白血病、骨髄腫、前立腺癌、または卵巣癌が含まれる。また他の態様では、方法は、放射線療法の適用をさらに含む。
【0016】
本明細書のさらなる態様では、治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および薬学的に許容可能なキャリア、ならびに治療有効量の癌治療オートファジー誘導化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物含有医薬組成物を含む医薬品キットが開示される。
【0017】
本明細書のさらに他の態様では、癌の治療方法が開示され、この方法は、本明細書で開示の有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ、および本明細書で開示の有効量の放射線療法を、それを必要としている哺乳動物に適用するステップを含み、チオキサントンベースオートファジー阻害剤および放射線療法の投与により癌関連症状が緩和され、それにより、癌を治療する。チオキサントンベースオートファジー阻害剤および放射線療法は、同時投与でも、逐次投与でもよい。チオキサントンベースオートファジー阻害剤および放射線療法の逐次投与は、相互に、約３時間以内、約２時間以内、または約１時間以内の投与であってもよい。本明細書で開示の化合物、組成物および方法を使って治療可能な癌の非制限的例には、肺癌、脳癌、中枢神経系癌、乳癌、結腸癌、白血病、骨髄腫、前立腺癌、または卵巣癌が含まれる。
【0018】
本明細書のさらなる態様では、チオキサントンベースオートファジー阻害剤または本明細書で開示の癌の治療のためのこのような化合物および放射線療法を含む組成物の使用が開示され、チオキサントンベースオートファジー阻害剤および放射線療法の両方の投与により癌関連症状を緩和し、それにより、癌を治療する。本明細書で開示の化合物、組成物および方法を使って治療可能な癌の非制限的例には、肺癌、脳癌、中枢神経系癌、乳癌、結腸癌、白血病、骨髄腫、前立腺癌、または卵巣癌が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】：ルカントンは、オートファジーを阻害する。図１Ａ：ルカントンによるＬＣ３−ＩＩ形成、空胞化、およびＬＭＰの誘導。ＬＣ３−ＩＩは免疫細胞化学により、空胞化（矢印）はギムザ染色により、およびリソソーム膜透過化はアクリジンオレンジ蛍光の消失により可視化した。電子顕微鏡により、空胞化および高電子密度粒子の蓄積（矢印）が認められ、未分解タンパク質の蓄積を示唆している。図１Ｂ：リソソーム膜透過化の定量化。平均±標準偏差、ｎ＝５。＊は対照に対する有意差を示す。Ｐ＜０．０５。図１Ｃ：ルカントンは、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２蓄積を刺激する。図１Ｄ：ルカントンは、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２凝集を刺激する；蛍光顕微鏡による可視像（図１Ｄ）および相対的蛍光の定量化（図１Ｅ）。図１Ｆ：ルカントン、バフィロマイシンＡ１、およびその組み合わせは、ＬＣ３−ＩＩ形成およびＳＱＳＴＭ１／ｐ６２蓄積を誘導する。図１Ｇ：ルカントン、バフィロマイシンＡ１、およびその組み合わせは乳癌細胞株のアポトーシスを誘導する。
【図3】：カテプシンＤ発現が、ルカントン処理後非常に高められる。図３Ａ：アフィメトリクス発現アレイにより、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）が乳癌細胞中の強く発現上昇した遺伝子として特定される。図３Ｂ：乳癌細胞中のカテプシンＤ発現の定量リアルタイムＰＣＲ分析。平均±標準偏差、ｎ＝４。＊は対照に対し有意差を示す。Ｐ＜０．０５。図３Ｃ：ルカントンは、カテプシンＤレベルを増加させ、その凝集を促進する。
【図4】：カテプシンＤの誘導がルカントン媒介アポトーシスに寄与する。図４Ａ：ルカントンは、カテプシンＤ発現およびＬＣ３−ＩＩ形成を誘導する。図４Ｂ：ルカントンは、４つの異なる乳癌細胞株のアポトーシスを誘導する。平均±標準偏差、ｎ＝３。＊は対照に対し有意差を示す。Ｐ＜０．０５。図Ｃ：カテプシンＤノックダウンにより、イムノブロッティングで示すようにルカントン誘導アポトーシスが低減する。図Ｄ：カテプシンＤノックダウンによるルカントン誘導アポトーシス減少の定量化。平均±ＳＤ、ｎ＝３。＊はルカントンで処理した非標的ｓｉＲＮＡ形質移入細胞に対し有意差を示す。Ｐ＜０．０５。
【図5】：ルカントンは、カテプシンＤ発現を誘導し、ｐ５３とは無関係に細胞生存能を低下させる。図５Ａ：ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−細胞を使ってルカントン媒介アポトーシスにｐ５３が必要かどうかを評価した。図５Ｂ：ルカントンは、ｐ５３の状態とは無関係なＨＣＴ１１６細胞中のカテプシンＤレベルを増加させる。図５Ｃ：ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−細胞は、ルカントンに対し同程度の感受性である。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【0020】
発明の詳細な説明無制御細胞増殖が全ての癌の根底にある原因であるため、この無制御細胞増殖を減らす、または防ぐ化合物、組成物、および方法は、癌に対する有効な治療となるであろう。本明細書は、癌細胞により示される無制御細胞増殖を減らす、または防ぐことができる化合物、組成物、および方法を開示する。一部の化合物は、チオキサントンベースオートファジー阻害剤（ＴＡＰＩ）および癌治療オートファジー誘導化合物（ＣＴＡＰＩＣ）を含む。ＴＡＰＩは、腫瘍細胞のオートファジー媒介生存を阻害し、それらの細胞に対し代謝ストレス、低酸素および癌治療、例えば、化学療法、放射線療法、または免疫療法、ホルモン療法等の標的療法、または血管新生阻害剤療法の影響をより受けやすくする。ＣＴＡＰＩＣは、それらの作用機序の結果として、オートファジーを誘導する従来の化学療法または標的療法薬である。驚くべきことに、ＴＡＰＩとＣＴＡＰＩＣは、腫瘍細胞に対し逆の効果を有するが、ＴＡＰＩとＨＤＡＣＩ化合物の組み合わせが、治療上有益な効果を大きく改善し、さらに有効な癌治療を提供する相乗効果を与えることが明らかになった。この知見の当然の結果として、照射治療もまたオートファジーを誘導するために、 ＴＡＰＩおよび照射治療の組み合わせ治療は、相乗的に有益な癌治療をもたらす。
【0021】
本明細書の態様では、一部では、チオキサントンベースオートファジー阻害剤（ＴＡＰＩ）を開示する。実施例のセクションで示されるように、ＴＡＰＩは、オートファジーを阻害し、リソソーム機能を破壊し、カテプシンＤ発現を誘導し、癌細胞に対し細胞障害性であり、ｐ５３状態とは独立した抗癌活性を有し、さらにＣＴＡＰＩＣの抗癌活性を高める。本明細書で開示の方法で有用なＴＡＰＩは、結合した塩基およびリン酸ジエステル結合の無いデオキシリボース糖環に似ているように見える、結合した短鎖を有する任意のチオキサントンベース化合物を含む。ＴＡＰＩの非制限的例には、ルカントン（ミラシルＤ）、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、ヒカントン１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、ルカントンおよびヒカントンのインダゾール類似体、（ＷＩＮ３３３７７）Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メスアンスルホンアミド、ならびに生理学的に許容される誘導体、類似体、およびその塩が含まれる。他のチオキサントン脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ阻害剤が、例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｏｒｂｅｔｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メスアンスルホンアミド（ＷＩＮ３３３７７）および類似体の抗腫瘍活性、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ３：１２８１−１２９２（１９９４）；およびＭａｒｋ Ｐ．Ｗｅｎｔｌａｎｄ、ｅｔ ａｌ．、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メスアンスルホンアミド（ＷＩＮ３３３７７）および関連誘導体の抗固形腫瘍効力および調製、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：６０９−６１４（１９９４）、に記載されている。これらのそれぞれは、参照によってその全体が組み込まれる。
【0022】
この実施形態の態様では、ＴＡＰＩは、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、またはＮ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミドである。これらの化合物の化学構造を以下に示す。【化1】
【化2】
１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン
【化3】
１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン
【化4】
Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミド
【0023】
本明細書の一部の態様では、癌治療オートファジー誘導化合物が開示される。癌治療オートファジー誘導化合物（ＣＴＡＰＩＣ）は、広範な癌の治療に有用で、それにも拘わらずオートファジーを誘導し、それによりアポトーシスを阻害する抗癌化合物の種類に属する。多くの癌治療薬は、オートファジーを誘導する。理由は、それらが因子枯渇または飢餓を模倣することにより、損傷（細胞障害性の化学療法）、代謝ストレス（血管新生阻害剤、２−デオキシグルコース）を誘導し、または増殖シグナル伝達経路を遮断する（標的化無細胞毒性剤、キナーゼ阻害剤）からである。ＣＴＡＰＩＣは、それ自体、化学療法および標的療法化合物類似免疫療法、ホルモン療法、または血管新生阻害剤化合物を含む。このような化合物の非制限的例には、抗血管新生化合物、チロシンキナーゼ阻害剤、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、解糖阻害剤、およびビタミンＤ類似体ならびにレチノイド化合物が含まれる。他のＣＴＡＰＩＣには、これらに制限されないが、三酸化ヒ素、ベバシズマブドカルボプラチンＩ／ＩＩ、ボルテゾミブ、デオキシグルコース、ドセタキセル、エンドスタチン、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イマチニブ、イクサベピロン、ロナファーニブ、ラパマイシン、リンゴ酸スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、およびテムシロリムスが含まれる。
【0024】
本明細書の一部の態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が開示される。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤、ＨＤＡＣＩ、またはＨＤＩ）は、ＨＤＡＣの機能と干渉する化合物の種類に属し、ヒストンの高アセチル化をもたらし、それにより遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。ＨＤＡＣ阻害剤は、化学構造に従って分類され、クラス１、２、および４のＨＤＡＣに対して異なる特異性と親和性が与えられている。ＨＤＡＣ阻害剤の中で、最も強力なのは、ヒドロキサマートタイプ（ヒドロキサム酸タイプ）ＨＤＡＣ阻害剤であり、これは、乳癌に対し用量依存性抗腫瘍活性を示し、皮膚Ｔ細胞リンパ腫治療用として最近承認された。ヒドロキサマートタイプＨＤＡＣ阻害剤の非制限的例には、トリコスタチンＡ、ボリノスタット、Ｍ−３４４、ＣＢＨＡ、ベリノスタット、ダシノスタット、およびパノビノスタットが含まれる。別の重要な種類の臨床的に有効なＨＤＡＣ阻害剤は、ベンズアミドタイプＨＤＡＣ阻害剤で、これは固形および血液腫瘍中で低い毒性と活性を示す。ベンズアミドタイプＨＤＡＣ阻害剤の非制限的例には、エンチノスタット、タセジナリン、およびモセチノスタットが含まれる。他の種類のＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）、例えば、フェニルブチラート、バルプロ酸、および類似の脂肪族酸化合物；環式テトラペプチド、例えば、トラポキシンＢおよびデプシペプチドを含むエポキシケトンおよび非エポキシケトン；求電子ケトン、およびハイブリッド分子である。ＳＣＦＡは、広範に使用され（特にバルプロ酸）、臨床的に有効であるが、弱いＨＤＡＣ阻害定数を有する。サーチュインクラスＩＩＩ ＨＤＡＣは、ＮＡＤ＋依存性であり、従って、ニコチン酸アミド、さらに、ＮＡＤ誘導体、ジヒドロクマリン、ナフトピラノン、および２−ヒドロキシナフトアルデヒドにより阻害される。ＨＤＡＣ阻害剤は、また、強力な放射線増感剤である。
【0025】
エピジェネティックな修飾は、正常細胞において、ＤＮＡ配列を変更することなく遺伝子の転写発現を調節する可逆的クロマチン再編成である。転写は、ＤＮＡからのタンパク質産生に関与するステップの１つである。転写を起こすためには、転写因子は、ＤＮＡ上の特異的結合部位に結合しなければならない。ＤＮＡが凝縮形態にある場合、転写因子が関連する結合部位に接近することは物理的に困難で、まれにしか起こらないことである。
【0026】
ヒストンは、遺伝子の転写調節において中心的役割を果たすタンパク質である。これらの球状タンパク質は、リシンおよびアルギニン残基上に存在するアミン基に起因して通常正に帯電している柔軟なＮ末端を有する。これらの正の電荷は、ヒストンのＮ末端部分がＤＮＡ骨格上の負に帯電したリン酸基と相互作用し結合するのを助ける。これが、ＤＮＡが染色体としての密なクロマチン形態に凝縮させるのを助けるヒストン−ＤＮＡ相互作用である。従って、ＤＮＡが凝縮形態に束ねられるのを保証することにより、ヒストンは、ＤＮＡへの転写因子の結合の制限における主要な役割を果たす。
【0027】
ヒストンのＤＮＡに対する結合は、細胞中に存在する様々な酵素により制御されている。特定の遺伝子の転写が支援されている条件下では、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、またはリシン脱アセチル化酵素（ＫＤＡＣ）として知られる酵素が、ヒストン上のε−Ｎ−アセチルリジン残基にアセチル基を付加する。アセチル化は、ヒストンのＮ末端領域上の正電荷を中和し、その結果、アセチル化ヒストンはもはやＤＮＡ骨格と相互作用できなくなる。この結合の低下により、クロマチン伸張（またはクロマチン脱凝縮）が可能となり、ＤＮＡ結合部位へのアクセスができ、遺伝子転写を活性化することができるため、遺伝子転写が起こるのを許容する。遺伝子の転写がもはや支援されていない状態では、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）として知られる酵素がＨＡＴにより付加されたアセチル基を除去する。脱アセチル化は、ヒストンのＮ末端の正の電荷を増加させ、それにより、ヒストンとＤＮＡ骨格の間の高親和性結合を促進する。生じたクロマチン凝縮により転写因子のＤＮＡ結合部位との交互作用が物理的に遮断されるために、遺伝子の転写が妨げられる。このように、ＨＡＴは、クロマチン脱凝縮を促進して、遺伝子転写を促進するが、一方、ＨＤＡＣは、クロマチン凝縮を促進して遺伝子転写を抑制する。
【0028】
１８個の既知ヒトＨＤＡＣがあり、アクセサリドメインの機能とＤＮＡ配列類似性に基づいて４つのクラスに分類される。最初の２つのクラスは、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）により活性が阻害される「古典的」ＨＤＡＣと見なされ、他方、３つめのクラスは、ＴＳＡに影響を受けないＮＡＤ＋−依存性タンパク質のファミリーである。４つめのクラスは、ＤＮＡ配列の他との相違性のみに基づく非定型カテゴリーと見なされる。クラスＩには、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、およびＨＤＡＣ８が含まれ、カリウム依存性３を減少させる（ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ３）（ＲＰＤ３）酵母転写因子遺伝子に相同性を有する。ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、およびＨＤＡＣ９は、クラスＩＩに属し、酵母ヒストン脱アセチル化酵素１（ＨＤＡ１）に相同性を有する。ＨＤＡＣ６およびＨＤＡＣ１０は、２つの触媒作用部位を含み、クラスＩＩａとして分類される。サーチュインとしても知られるクラスＩＩＩは、ＳＩＲ２に関連し、ＳＩＲＴ１〜７を含み、一方、ＨＤＡＣ１１は、クラスＩとクラスＩＩ ＨＤＡＣの両方に共有される触媒作用中心に保存された残基を有するため、クラスＩＶに入れられる。
【0029】
いくつかの抗悪性腫瘍化合物が、ＨＤＡＣ阻害剤として作用することが知られている。それゆえ、クロマチン凝縮の抑制は、癌の治療における治療薬効を提供可能であると考えられている。その理由は、このようなクロマチンリモデリングにより、１）主要アポトーシスおよび細胞周期調節遺伝子の転写抑制（これにより細胞周期の停止およびアポトーシスを促進する）；２）腫瘍抑制因子ヘテロ接合性の増加、および／または３）血管新生の抑制、が生ずるからである。このようにして、クロマチン凝縮を介した遺伝子転写のエピジェネティックな調節が腫瘍形成に至る重要な機序として登場した。
【0030】
本実施形態の態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒドロキサマートタイプヒストン脱アセチル化酵素またはベンズアミドタイプヒストン脱アセチル化酵素である。本実施形態の別の態様では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、（２Ｅ、４Ｅ、６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４、６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２、４−ジエンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド、（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド、（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、または｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマート、である。これらの阻害剤の化学構造を下記に示す。【化5】
（２Ｅ、４Ｅ、６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４、６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２、４−ジエンアミド
【化6】
Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド
【化7】
４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド
【化8】
Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド
【化9】
（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド
【化10】
（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド
【化11】
（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド
【化12】
Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド
【化13】
４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート
【化14】
４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド
【化15】
Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド
【化16】
３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド
【化17】
｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマート
【0031】
本明細書の一部の態様では、標的療法剤が開示される。標的療法化合物には、これらに限定されないが、免疫療法、ホルモン療法、および血管新生阻害剤化合物が含まれる。ホルモン療法には、特異的ホルモン、特に、ステロイドホルモン、またはこのようなホルモンの産生または活性を阻害する薬剤（ホルモンアンタゴニスト）の外因性投与による内分泌系の操作を含む。ステロイドホルモンは、特定の癌細胞における遺伝子発現の強力な駆動体であるため、特定のホルモンのレベルまたは活性の変更により、特定の癌に成長を停止させる、または細胞死さえも行わせることができる。精巣摘出術や卵巣摘出術等の内分泌器官の外科的除去もまた、ホルモン療法の１つの形として採用可能である、
【0032】
免疫療法は、天然体物質または天然体物質から作られた薬剤を使う治療である。それらは、身体を刺激して癌細胞を攻撃し、他の癌治療が原因の副作用を克服する。免疫療法は、癌の拒絶に免疫系を使用する。主な前提は、患者の免疫系を刺激し、疾患の原因である悪性腫瘍細胞を攻撃することである。これは、患者を免疫化して、患者の自己免疫系が訓練されて、腫瘍細胞を破壊標的として認識することにより、または、治療抗体を薬剤として投与し、患者の免疫系が補充されて、治療抗体が腫瘍細胞を破壊することにより行われる。
【0033】
本明細書で開示の組成物は、本明細書で開示のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物のどのような数および組み合わせを含んでもよく、また、含まなくてもよい。例えば、組成物は、例えば、２つ以上のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および／または癌治療オートファジー誘導化合物、３つ以上のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および／または癌治療オートファジー誘導化合物、４つ以上のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および／または癌治療オートファジー誘導化合物、または５つ以上のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および／または癌治療オートファジー誘導化合物を含んでもよい。
【0034】
本明細書で開示のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物、またはこのような化合物または複数化合物を含む組成物は、通常、医薬組成物として個体に投与される。医薬組成物は、有効成分として治療有効量の少なくとも１つの本明細書で開示の化合物、または薬学的に許容可能なその酸付加塩を、従来の受容可能な医薬品賦形剤と組み合わせて、さらに治療上の使用適したユニット剤形に成形して調製できる。本明細書で使われる用語の「医薬組成物」は、治療有効濃度の活性化合物、例えば、本明細書で開示のいずれかの化合物を指す。医薬組成物は、個体に投与した場合に、有害、アレルギー性、または他の不都合なまたは望まれない反応を生じないことが好ましい。本明細書で開示の医薬組成物は、医学および獣医学用途に有用である。医薬組成物は、単独で個体に投与してもよく、または他の補助的活性化合物、試薬、薬剤またはホルモンと組み合わせてもよい。医薬組成物は、次の従来の非制限的例を含む種々のプロセスのいずれかを使って製造可能である。混合、溶解、造粒、糖衣錠化（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、微粒子化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、包括化（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）、および凍結乾燥。医薬組成物は、次の非制限的例を含む種々の形態のいずれかを取ることができる。無菌の溶液、懸濁液、乳剤、凍結乾燥物、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、粉末、シロップ、エリキシル剤、または投与に適した他の任意の剤形。
【0035】
非経口の注射に適した液体剤形には、生理学的に受容可能な無菌の水性または非水性溶液、分散物、懸濁液または乳剤および無菌の注射可能溶液または分散液に再構成用の無菌の粉末を含んでもよい。適切な水性および非水性キャリア、希釈剤、溶剤またはビークルの例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリセリン、等）、適合するこれらの混合物、植物油（オリーブ油、等）および注射可能有機エステル、例えば、エチルオレアートが含まれる。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散物の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動度が維持可能である。液体製剤では、治療有効量は、典型的には、約０．０００１％（ｗ／ｖ）〜約５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）である。
【0036】
経口投与に適する固形剤形には、カプセル剤、錠剤、丸薬、粉末および粒剤が含まれる。このような固形剤形中で、活性化合物を、少なくとも１つの不活性の通例の賦形剤（またはキャリア）、例えば、ナトリウムクエン酸塩またはジリン酸カルシウムまたは（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖およびアラビアゴム、（ｃ）湿潤剤、例えば、グリセリン、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、カルシウム炭酸塩、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩およびナトリウム炭酸塩、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセリンモノステアラート、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）潤滑剤、例えば、滑石、カルシウムステアリン酸塩、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ナトリウムラウリル硫酸塩またはこれらの混合物、と混合可能である。カプセル剤、錠剤および丸薬の場合は、剤形は、また、緩衝剤も含有することができる。固形製剤では、治療有効量は、典型的には、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【0037】
本明細書で開示の医薬組成物は、任意選択で、活性化合物の薬学的に許容可能な組成物への処理を促進する、薬学的に許容可能なキャリアを含んでもよい。本明細書で使われる用語の「薬学的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織との接触に適し、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題のある合併症のない、合理的な利益／リスク比率と釣り合いの取れた、化合物、物質、組成物、および／または剤形を指す。本明細書で使われる用語の「薬学的に受容可能なキャリア」は、「薬理学的キャリア」に同義であり、投与した場合に実質的に長期または永続する有害な影響のない任意のキャリアを指し、例えば、「薬学的に受容可能なビークル、安定剤、希釈剤、添加剤、補助剤、または賦形剤」等の用語を包含する。このようなキャリアは、通常、活性化合物と混合され、または活性化合物を希釈または封入することが可能で、固形、半固形、または液体試薬であってもよい。活性化合物は、所望のキャリアまたは希釈剤中に溶解させるか、または、懸濁液として入れることができることは理解されよう。下記の非制限的例のいずれかを含む種々の薬学的に許容可能なキャリアが使用可能である。水性媒体、例えば、水、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、等；固体キャリア、例えば、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース、マグネシウム炭酸塩、等；溶剤；分散媒；コーティング；抗菌剤および抗真菌剤；等張性および吸収遅延剤；または任意の他の不活性成分。薬学的に受容可能なキャリアの選択は、投与モードに依存する。いずれかの薬学的に受容可能なキャリアが活性化合物と適合しない場合を除いて、薬学的に許容可能な組成物中でのその使用が意図されている。このような医薬品キャリアの具体的使用の非制限的例は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｗａｒｄ Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、７ｔｈｅｄ．１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０ｔｈｅｄ．２０００）；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、１０ｔｈｅｄ．２００１）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ．Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００３）、で見付けることができる。これらのプロトコルは、ルーチン的であり、いずれの変更も当業者の範囲内で、および本明細書の教示から容易である。
【0038】
本明細書で開示の医薬組成物は、これらに限定されないが、任意選択で、緩衝剤、防腐剤、張性調整剤、塩、抗酸化剤、浸透圧調整剤、生理的物質、薬理学的物質、増量剤、乳化剤、湿潤剤、スイートニングまたは調味料、等の他の薬学的に許容可能な成分（または医薬品成分）を含んでもよい。得られる調製物が薬学的に許容可能である限りにおいて、種々の緩衝剤およびｐＨ調整手段が本明細書で開示の医薬組成物を調整するために使用可能である。このような緩衝剤には、これらに限定されないが、酢酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、中性緩衝食塩水、および燐酸塩緩衝食塩水が挙げられる。酸または塩基が、必要に応じ、組成物のｐＨ調整のために使用可能であることは理解されよう。薬学的に許容可能な抗酸化剤には、これらに限定されないが、ナトリウムメタ重亜硫酸塩、ナトリウムチオ硫酸塩、アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソール、およびブチルヒドロキシトルエンが含まれる。有用な防腐剤には、これらに限定されないが、ベンズアルコニウム塩化物、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安定化オキシクロロ組成物、例えば、ナトリウム亜塩素酸塩ならびにキレート剤、例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミド、カルシウムＤＴＰＡ、およびＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドが含まれる。医薬組成物に有用な張性調整剤には、これらに限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩、マンニトールまたはグリセリンおよび他の薬学的に許容可能な張性調整剤が含まれる。医薬組成物は、塩として提供されてもよく、これらに限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、等の多くの酸との間で形成できる。塩は、対応する遊離塩基型よりも水性または他のプロトン性溶媒中に溶解し易い傾向がある。これらおよび薬理学の分野で既知の他の物質は、本発明で有用な医薬組成物中に含めることが可能であることは理解されよう。
【0039】
本明細書で開示のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物は、また、経時的化合物放出制御プロファイルを達成するための薬物送達プラットホームに組み込むこともできる。このような薬剤送達プラットホームは、ポリマー基質中、典型的には、生分解性、生体内分解性、および／または生体吸収性ポリマー基質中に分散された本明細書で開示の化合物を含む。本明細書で使われる用語の「ポリマー」は、合成ホモまたは共重合体、天然ホモまたは共重合体、ならびにその直鎖、分岐またはスター構造を有する合成修飾物または誘導体を指す。共重合体は、任意の形態、例えば、ランダム、ブロック、分割型、テーパーブロック、接木、またはトリブロックに配列可能である。ポリマーは、通常、縮合ポリマーである。ポリマーは、さらに修飾を受けて、架橋剤の導入、または側方残基の疎水性を変えることにより、機械的または分解特性を高めることができる。架橋の場合、ポリマーは、５％未満の架橋であり、通常は、１％未満の架橋である。
【0040】
適切なポリマーには、これらに限定されないが、アルギン酸塩、脂肪族ポリエステル、シュウ酸ポリアルキレン、ポリアミド、ポリアミドエステル、ポリ酸無水物、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシ脂肪族カルボン酸、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリペプチド、ポリホスファゼン、多糖類、およびポリウレタンが含まれる。ポリマーは、通常、少なくとも約１０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約８０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも約９０％（ｗ／ｗ）の薬剤送達プラットホームを含む。生分解性、生体内分解性、および／または生体吸収性ポリマーおよび薬剤送達プラットホームを作るのに有用な方法の例は、例えば、Ｄｒｏｓｔ、ｅｔ．ａｌ．、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、米国特許第４、７５６、９１１号；Ｓｍｉｔｈ、ｅｔ．ａｌ．、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国特許第５、３７８、４７５号；Ｗｏｎｇａｎｄ Ｋｏｃｈｉｎｋｅ、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｂｙ Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｈｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ａｇｅｎｔｓ、米国特許第７、０４８、９４６号；Ｈｕｇｈｅｓ、ｅｔ．ａｌ．、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ、米国特許公開第２００５／０１８１０１７号；Ｈｕｇｈｅｓ、Ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ Ｌｉｐｉｄ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、米国特許公開第２００５／０２４４４６４号；Ａｌｔｍａｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｒｏｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ、米国特許公開第２０１１／０００８４３７号；に記載されている。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0041】
本実施形態の態様では、基質を構成するポリマーは、ポリペプチド、例えば、絹フィブロイン、ケラチン、またはコラーゲンである。他の態様では、基質を構成するポリマーは、多糖、例えば、セルロース、アガロース、エラスチン、キトサン、キチン、またはグリコサミノグリカン様コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、またはヒアルロン酸である。本実施形態のさらに他の態様では、基質を構成するポリマーは、ポリエステル、例えば、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、ラセミ体乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、およびこれらの組み合わせである。
【0042】
当業者なら、適切な開示薬剤送達プラットホームを形成するための適切なポリマーの選択は、いくつかの因子に依存することを理解できる。適切なポリマーの選択でのより重要な因子には、これらに限定されないが、ポリマーの薬剤との適合性、所望の放出薬剤動力学、移植部位での所望のプラットホームの生分解動力学、移植部位での所望のプラットホームの生体内分解動力学、移植部位での所望のプラットホームの生体吸収性動力学、プラットホームのインビボ機械的性能、処理温度、プラットホームの生体適合性、および患者耐容性が含まれる。ポリマーのインビトロおよびインビボ挙動にある程度影響する他の重要な因子には、成分の化学組成、空間分布、ポリマーの分子量および結晶化度がある。
【0043】
薬剤送達プラットホームは、持続放出薬剤送達プラットホームおよび徐放薬剤送達プラットホームの両方を含む。本明細書で使われる用語の「持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）」は、本明細書で開示の化合物の約７日間以上にわたる放出を指す。本明細書で使われる用語の「徐放（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）」は、本明細書で開示の化合物の約７日間未満の期間の放出を指す。
【0044】
この実施形態態様では、持続放出薬剤送達プラットホームは、例えば、投与後約７日間、投与後約１５日間、投与後約３０日間、投与後約４５日間、投与後約６０日間、または投与後約９０日間にわたり、実質的に一次放出速度式に従い、本明細書で開示の化合物を放出する。本実施形態の他の態様では、持続放出薬剤送達プラットホームは、例えば、少なくとも投与後７日間、少なくとも投与後１５日間、少なくとも投与後３０日間、少なくとも投与後４５日間、少なくとも投与後６０日間、少なくとも投与後７５日間、または少なくとも９０日間にわたり、実質的に一次放出速度式に従い、本明細書で開示の化合物を放出する。
【0045】
この実施形態の態様では、薬剤送達プラットホームは、例えば、投与後約１日間、投与後約２日間、投与後約３日間、投与後約４日間、投与後約５日間、または投与後約６日間にわたり、実質的に一次放出速度式に従い、本明細書で開示の化合物を放出する。本実施形態の他の態様では、薬剤送達プラットホームは、例えば、多くても投与後１日間、多くても投与後２日間、多くても投与後３日間、多くても投与後４日間、多くても投与後５日間、または多くても投与後６日間にわたり、実質的に一次放出速度式に従い、本明細書で開示の化合物を放出する。
【0046】
本明細書の一部の態様では、治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物、ならびに治療有効量の癌治療オートファジー誘導化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を含む医薬品キットが開示される。
【0047】
本明細書の一部の態様では、癌が取り上げられる。チオキサントンベースオートファジー阻害剤、癌治療オートファジー誘導化合物、これらの化合物を含む組成物、および本明細書で開示の方法は、いずれかの癌を治療するのに有用でありうる。癌は、１００疾患を超えるグループであり、これらの疾患では、哺乳類体中で一群の細胞が無制御に増殖を示し、それ故に、基本的には、身体が細胞分裂と増殖を制御するために使う調節機序に影響を与える疾患である。大抵の場合、癌細胞は、腫瘍と呼ばれる細胞凝集塊を形成するが、白血病のように、一部の癌では、細胞は腫瘍を形成しない。腫瘍は、悪性の場合も、良性の場合もある。その上、悪性腫瘍（または癌）は、異常な遺伝物質を有する細胞を含み、通常、急速無制御細胞増殖を起こし、隣接組織に侵入して破壊し、時には、リンパ液または血液を介して身体の他の部位に広がる（すなわち、転移）。癌には、死亡の高発生率が付随する。理由は、身体全体への癌細胞の侵入と転移が止められない場合、癌細胞は、重要臓器に侵入し、器官の機能障害および最終的な死亡をもたらすことになるからである。癌の悪性の特性は、良性腫瘍とは区別されるが、良性腫瘍は、通常増殖が遅く、自己限定的であり、侵入または転移せず、従って、通常は、生命をあやうくするものではない。限局、領域または遠隔病期での癌は、侵襲性であると考えられる。２、３層のみの細胞として発見される非常に早期の、上皮内癌と呼ばれる癌は、非侵襲性であると考えられる。
【0048】
癌は、多様な種類の疾患であり、原因と生物学が大きく異なっている。癌は、単独または組み合わせて作用する種々の因子により引き起こされる。一部の癌は、外部因子、例えば、タバコ、食事、特定の化学薬品、照射、およびウイルスが原因である。他の癌は、内部因子、例えば、ホルモン、免疫状態、および遺伝による遺伝子変異が原因である。通常、癌の原因となる因子への暴露から検出可能な疾患までに、１０年以上の年数がかかる。
【0049】
癌は、通常、腫瘍に似ている細胞のタイプによって、従って、腫瘍の起源であると想定される組織によって分類される。カルシノーマは、上皮細胞由来の悪性腫瘍である。このグループは、最もありふれた癌を代表するものであり、共通型の肺癌、脳癌、中枢神経系癌、乳癌、結腸癌、白血病、骨髄腫、前立腺癌および卵巣癌を含む。肉腫は、結合組織または間葉細胞由来の悪性腫瘍である。芽細胞腫は、通常、悪性腫瘍で、未成熟胚性組織に似ている。これらの腫瘍の多くは、小児で最もよく見られる。リンパ腫および白血病は、造血（血液形成）細胞由来の悪性腫瘍である。最後に、生殖細胞腫瘍は、全能性細胞由来の腫瘍である。成人では、精巣と卵巣に認められることが最も多く、胎児、乳児、および幼児では、身体正中線上、特に、尾骨の先端で見つかることが最も多い。従って、本明細書で使われる用語の「癌」は、原発性癌および転移癌を含み、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、または生殖細胞腫瘍であってもよい。
【0050】
本発明の一部の態様では、癌に関連した症状の緩和が示される。本実施形態の一態様では、緩和される症状は、癌細胞の成長速度の増加である。本実施形態の別の態様では、緩和される症状は、癌細胞の細胞分裂速度の増加である。本実施形態のまた別の態様では、緩和される症状は、癌細胞の隣接組織または器官への侵入の程度の増加である。本実施形態のまた別の態様では、緩和される症状は、転移の程度の増加である。本実施形態のまたさらなる態様では、緩和される症状は、血管新生の増加である。本実施形態のまたさらなる態様では、緩和される症状は、アポトーシスの減少である。本実施形態のまたさらなる態様では、緩和される症状は、細胞死または細胞壊死の減少である。従って、本明細書で開示の化合物、組成物、および方法を使った治療は、癌細胞の成長速度を低下させ、癌細胞の細胞分裂速度を遅らせ、癌細胞の隣接組織または器官への侵入の程度を減らし、転移の程度を減らし、血管新生を減らし、アポトーシスを増やし、および／または細胞死および／または細胞壊死を増やすことになる。
【0051】
本発明の一部の態様では、哺乳動物が取り上げられる。哺乳動物には、ヒトが含まれ、ヒトが患者であってもよい。本発明の他の一部の態様では、個体が取り上げられる。個体には、哺乳動物およびヒトが含まれ、ヒトが患者であってもよい。
【0052】
本発明の一部の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物が投与される。本明細書で使われる用語の「投与」は、臨床的に、治療的に、または実験的に有益な結果を生ずる可能性がある個体への、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の投与を提供する任意の送達機序を意味する。
【0053】
本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物を同時にまたは逐次的に投与可能である。従って、チオキサントンベースオートファジー阻害剤を含む組成物は、癌治療オートファジー誘導化合物を含む組成物として同時に（同時に）、または、任意の順に異なる時点で逐次的に、投与可能である。また、使用される同時の用語は、チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物１つの医薬組成物の一部として、同時に、一緒にされる、または同時に、しかし、別の医薬組成物に一緒にされることの意味であってもよい。このように、各成分は、別々に、しかし、所望の治療効果が得られるように充分接近した時間に、投与を受けることができる。あるいは、チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物の投与は、相互に約１時間以内、相互に約２時間以内、または相互に約３時間以内であってもよい。
【0054】
本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、１つまたは複数のサイクルで投与可能である。一実施形態では、１つのサイクルは、４日毎に１回の投与を７回含む。
【0055】
本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の投与には、種々の腸内または非経口の手法が含まれ、これに限定されないが、任意の受容可能な形態、例えば、錠剤、液体、カプセル、粉末、等の経口投与；任意の受容可能な形態、例えば、ドロップ、スプレー、クリーム剤、ゲルまたは軟膏の局所的投与；任意の受容可能な形態の頬側、鼻、および／または吸入投与；任意の受容可能な形態の直腸の投与；任意の受容可能な形態の腟投与；任意の受容可能な形態の血管内投与、例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および脈管構造内へのカテーテル点滴注入；任意の受容可能な形態の組織周囲および組織内投与、例えば、腹腔内の注射、筋肉内注射、皮下注射、皮下注入、眼内注射、網膜注射、または網膜下注射もしくは硬膜外注射；任意の受容可能な形態の小胞内投与、例えば、カテーテル点滴注入；ならびに留置装置、例えば、インプラント、ステント、パッチ、ペレット、カテーテル、浸透圧ポンプ、坐剤、生体内分解性デリバリーシステム、非生体内分解性デリバリーシステムもしくは別のインプラント持続放出または徐放系よる投与、が含まれる。生分解性高分子の代表的リストおよび使用方法は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ａｂｒａｈａｍ Ｊ．Ｄｏｍｂ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、Ｏｖｅｒｓｅａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９７）に記載されている。
【0056】
本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、種々の経路を使って哺乳動物に投与可能である。本明細書で開示の癌の治療方法に適切な投与経路には、局所性および全身性の投与の両方が含まれる。局所性投与は、哺乳動物全身への投与に比べ、特異的部位への組成物のかなり多くの送達をもたらすが、一方、全身性の投与は、基本的に個体の全身への組成物の送達をもたらす。本明細書で開示の癌の治療方法に適した投与経路には、また、中枢および末梢投与の両方が含まれる。中枢投与は、基本的に個体の中枢神経系への組成物の送達をもたらし、例えば、髄腔内投与、硬膜外投与ならびに頭蓋注射またはインプラントを含む。末梢投与は、基本的に個体の中枢神経系以外の任意の領域への組成物の送達をもたらし、脊椎または脳への直接投与以外の任意の投与経路を包含する。本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の哺乳動物で使われる実際の投与経路は、次記を含む因子（これらに限定されない）を考慮に入れて当業者により決定可能である。癌のタイプ、癌の部位、癌の原因、癌の重症度、目的の軽減度合い、目的の軽減の持続期間、具体的に使用する化合物または複数化合物、使用する化合物または複数化合物の排出速度、使用する化合物または複数化合物薬力学、組成物に含有される他の化合物の性質、具体的投与経路、個体の具体的特性、病歴およびリスク因子、例えば、年齢、体重、総体的な健康、等、またはこれらの任意の組み合わせ。
【0057】
ある実施形態では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、哺乳動物に全身投与される。別の実施形態では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、哺乳動物に局所投与される。本実施形態の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、哺乳動物の腫瘍に投与される。本実施形態の別の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、哺乳動物の腫瘍周辺の領域に投与される。
【0058】
本発明の一部の態様では、治療有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の投与が提供される。本明細書で使われる用語の「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、「治療有効用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」と同義であり、癌の治療に関連して使用される場合は、目的の治療効果を達成するのに必要な最小用量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を意味し、癌に関連する症状を緩和するのに充分な用量を含む。本実施形態の態様では、治療有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、癌に関連する症状を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％緩和する。本実施形態の他の態様では、治療有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、癌に関連する症状を、例えば、最大で１０％、最大で２０％、最大で３０％、最大で４０％、最大で５０％、最大で６０％、最大で７０％、最大で８０％、最大で９０％または最大で１００％緩和する。本実施形態のさらに他の態様では、治療有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、癌に関連する症状を、例えば、約１０％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約１００％、約２０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約２０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約５０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約１００％、約３０％〜約９０％、約３０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、約３０％〜約６０％、または約３０％〜約５０％緩和する。本実施形態のまたさらに他の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物の治療有効量は、例えば、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間、癌に関連する症状を緩和するのに充分な投与量である。
【0059】
組成物中の有効成分の量および癌の治療方法は、適切な投与量が得られるように変更してもよい。本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の哺乳動物に投与される実際の治療有効量は、次記を含む因子（これらに限定されない）を考慮して当業者により決定される。癌のタイプ、癌の部位、癌の原因、癌の重症度、治療の持続期間、目的の軽減度合い、目的の軽減の持続期間、具体的な使用される化合物または複数化合物、使用される化合物または複数化合物の排出速度、使用される化合物または複数化合物の薬力学、組成物中に含まれる他の化合物の性質、具体的投与経路、個体の具体的特性、病歴およびリスク、例えば、年齢、体重、総体的な健康、等、個体の治療に対する反応、またはこれらの任意の組み合わせ。従って、有効成分の有効投与量は、当業者により、個体の利益のために、全ての判定基準を考慮し、最良の判断を行って、容易に決定可能である。
【0060】
さらに、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の反復投与が行われる場合には、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の実際の有効量は、これらに限定されないが、投与頻度、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の半減期、またはこれらの任意の組み合わせ等の因子に、さらに依存することになる。本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の有効量は、インビトロアッセイおよびヒトへの投与の前の動物モデルを使ったインビボ投与調査から推定することが可能であることは、当業者ならわかるであろう。種々の投与経路の様々な効率を考慮すれば、必要な有効量の大きな変動が予想される。例えば、経口投与は、通常、静脈内または硝子体内への注射による投与に比べ、より高い投与量レベルが必要であることが予想されるであろう。これらの投与量レベルの変動は、標準的な経験的最適化手順を使って調節可能であり、この作業は、当業者にはよく知られている。詳細な治療有効投与量レベルとパターンは、上記で特定した因子を考慮して、主治医により決定されるのが好ましい。
【0061】
非制限的例として記載するが、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物を哺乳動物に投与する場合、治療有効量は、通常、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。本実施形態の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の有効量は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約３．０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３．０ｍｇ／ｋｇ、または約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．０ｍｇ／ｋｇであってもよい。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の治療有効量は、例えば、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の治療有効量は、例えば、最大で０．００１ｍｇ／ｋｇ、最大で０．０１ｍｇ／ｋｇ、最大で０．１ｍｇ／ｋｇ、最大で１．０ｍｇ／ｋｇ、最大で１０ｍｇ／ｋｇ、または最大で１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【0062】
投薬量は、単回の投与量であっても、累積投与量（連続投薬量）であってもよく、当業者により容易に決定できる。例えば、癌の治療は、有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の１回限りの投与を含んでもよい。非制限的例として示すが、有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、例えば、癌の症状を呈する部位、またはその近傍への薬剤の単回注射または沈着または単回経口投与として、哺乳動物に１回投与可能である。あるいは、癌の治療は、例えば、毎日１回、数日おきに１回、週１回、月１回、または年１回の範囲で行われる、有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の複数回投与を含んでもよい。非制限的例として示すが、本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、哺乳動物に週１回または２回投与可能である。投与のタイミングは、哺乳動物の症状の重症度等の因子に応じて、哺乳動物毎に変化してもよい。例えば、有効量の本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、不定の期間の間、または哺乳動物がそれ以上治療を必要としなくなるまで、月１回、哺乳動物に投与できる。当業者なら、治療のコースを通して哺乳動物の状態をモニターできること、および投与される本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物の有効量を、それに合うように調節できることをわかるであろう。
【0063】
チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物の組み合わせの投与は、同時であっても、逐次的であっても、本明細書で開示の癌の治療に有益な相乗的治療効果を与える。相乗的治療効果は、本明細書で開示の化合物または組成物が組み合わされて投与される場合、同じ化合物が別々に投与される場合とは対照的に、癌関連症状がより大きな程度で緩和されることである。本実施形態の態様では、同じチオキサントンベースオートファジー阻害剤または同じ癌治療オートファジー誘導化合物の単独投与に比較して、本明細書で開示の化合物または組成物を組み合わせた投与により、例えば、少なくとも１０％多く、少なくとも２０％多く、少なくとも３０％多く、少なくとも４０％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも６０％多く、少なくとも７０％多く、少なくとも８０％多く、少なくとも９０％多く、または少なくとも１００％多く、癌関連症状を緩和する。
【0064】
本明細書で開示の化合物または複数化合物を含む組成物は、本明細書で開示のように、他の治療化合物と組み合わせて哺乳動物に投与して、全体の治療効果を高めることができる。徴候を治療するための複数の化合物の使用は、薬効を高めることができ、一方で、副作用の存在を低減させる。
【0065】
本明細書の一部の態様では、放射線療法が提供される。一実施形態では、本明細書で開示のＴＡＰＩおよびＣＴＡＰＩＣの投与による癌の治療方法は、放射線療法の適用をさらに含んでもよい。放射線療法は、本明細書で開示の化合物および組成物の投与の前、その間、またはその後に投与することができる。別の実施形態では、癌の治療方法は、ＴＡＰＩおよび放射線療法を投与し、ＣＴＡＰＩＣ投与しないことを含む。
【0066】
照射は、種々の方法で投与できる。例えば、照射は、本性として、電磁気的でも、粒子状であってもよい。本発明の実施に有用な電磁気的照射には、これらに限定されないが、ｘ線およびガンマ線が含まれる。好ましい実施形態では、超高電圧ｘ線（ｘ線：４ＭｅＶ以上）を本発明の実施に使用可能である。本発明の実施に有用な粒子状放射には、これらに限定されないが、電子ビーム、陽子線、中性子線、アルファ粒子、およびパイマイナス中間子が含まれる。照射は、従来の放射線医学治療装置および方法を使って、および手術中のおよび定位的方法により、送達することができる。本発明の実施での使用に適した照射治療に関するさらなる考察は、Ｓｔｅｖｅｎ Ａ．Ｌｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９９８）（ｐｕｂｌ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）、の全体を通して、および特に１３と１４章で見付けられる。照射は、また、他の方法、例えば、標的化送達、例えば、放射性の「シード（ｓｅｅｄ）」によって、または標的化放射性複合体の全身送達によって、送達可能である。Ｊ．Ｐａｄａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｒａｄｉｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｌｕｃａｎｔｈｏｎｅ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｃ３ＨＢＡ Ｍａｍｍａｒｙ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｌｕｃａｎｔｈｏｎｅ ｉｎ ａｎ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏａｓｓａｙ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．７：３４７−３５７（１９８１）。他の照射の送達方法も、本発明の実施に際し使用可能である。
【0067】
目的の治療体積に送達される照射の量は、可変であってもよい。好ましい実施形態では、照射は、本明細書で開示の化合物または複数化合物、または組成物と共に照射が投与される場合、宿主の中枢神経系癌の抑止または退縮を起こすのに有効な量が投与される。別の実施形態では、照射を、少なくとも約１グレイ（Ｇｙ）・回で少なくとも１日おきに１回治療体積に投与し、さらに好ましくは、照射を少なくとも約２グレイ（Ｇｙ）・回で少なくとも毎日１回治療体積に投与し、またさらに好ましくは、照射を少なくとも約２グレイ（Ｇｙ）・回で少なくとも毎日１回治療体積に対し、１週間当たり５日間連続して投与する。別の実施形態では、照射を３Ｇｙ・回で毎日、週３回治療体積に対し投与する。別の実施形態では、最初の２３回を初期治療体積に対し投与し、別の７治療回分を追加の治療体積に対し投与する。さらに別の実施形態では、合計で少なくとも約２０Ｇｙ、さらに好ましくは、少なくとも約３０Ｇｙ、もっと好ましくは、少なくとも約６０Ｇｙの照射をそれが必要な宿主に投与する。別のさらに好ましい実施形態では、照射を治療体積でなく、全脳に投与する。全脳に照射する場合は、３０Ｇｙの最大投与量が推奨される。最も好ましい実施形態では、照射を宿主の全脳に投与し、それにより、宿主の転移性の癌が治療される。
【0068】
好ましい実施形態では、治療体積は、ＣＴまたはＭＲＩスキャン上の造影病変、さらに好ましくは、ＣＴまたはＭＲＩスキャン上の造影病変および周辺の浮腫、またさらに好ましくは、ＣＴまたはＭＲＩスキャン上の造影病変および周辺浮腫プラス少なくとも約１ｃｍのマージンを含む。
【0069】
治療計画には、これに限定されないが、対向側方照射野、ｗｅｄｇｅ ｐａｉｒ照射野、回転または複数の照射野技術を含んでもよい。ＣＴ誘導治療計画は、照射野配置の選択の正確さを改善するとして推奨されている。対向二門のものを含む初期の治療体積およびコーンダウン治療体積に対する等量線分布が、全患者に対し推奨されている。初期治療体積および追加治療体積に対する線量分布を示す組み合わせ計画が望ましい。治療体積に対する最小および最大用量は、治療体積の中心の線量の約１０％以内に保持されることが好ましい。
【0070】
本開示の態様は、また、以下のように記述できる：１．治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤を含む医薬組成物。
２．治療有効量の癌治療オートファジー誘導化合物を含む医薬組成物。
３．ａ）治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤；および
ｂ）治療有効量の癌治療オートファジー誘導化合物、
を含む医薬組成物。
４．薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む実施形態１〜３の組成物。
５．実施形態１、３、または４の組成物であって、
チオキサントンベースオートファジー阻害剤が、１−（（２−（ジエチルアミノ）エチル）アミノ）−４−メチルチオキサンテン−９−オン、１−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−４−（ヒドロキシメチル）−９−チオキサンテノン、Ｎ−［［１−［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−９−オキソ−９Ｈ−チアキサンテン−４−イル］メチル］メタンスルホンアミド、これらのインダゾール類似体、またはそれらの塩である組成物。
６．癌治療オートファジー誘導化合物が、三酸化ヒ素、エトポシド、ラパマイシン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、タモキシフェン、テモゾロミド、イマチニブ、またはボルテゾミブである、
実施形態２〜４の組成物。
７．ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、ヒドロキサマートタイプヒストン脱アセチル化酵素阻害剤またはベンズアミドタイプヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、
実施形態６の組成物
８．ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、（２Ｅ、４Ｅ、６Ｒ）−７−（４−ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−４、６−ジメチル−７−オキソヘプタ−２、４−ジエンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニルオクタンジアミド、４−ジメチルアミノ−Ｎ−（６−ヒドロキシカルバモイルヘキシル）−ベンズアミド、Ｎ−ヒドロキシ−３−［（Ｅ）−３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソプロパ−１−エニル］ベンズアミド、（２Ｅ）−３−［３−（アニリノスルホニル）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシアクリルアミド、（（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−ヒドロキシエチル−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、（Ｅ）−Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル］フェニル］プロパ−２−エンアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−Ｎ’−フェニル−オクタンジアミド、４−（２−アミノフェニルカルバモイル）ベンジルカルバマート、４−アセトアミド−Ｎ−（２−アミノフェニル）ベンズアミド、Ｎ−（２−アミノフェニル）−４−［［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］メチル］ベンズアミド、３−（ジメチルアミノメチル）−Ｎ−［２−［４−（ヒドロキシカルバモイル）フェノキシ］エチル］−１−ベンゾフラン−２−カルボキサミド、または｛６−［（ジエチルアミノ）メチル］−２−ナフチル｝メチル｛４−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］フェニル｝カルバマートである、
実施形態６の組成物。
９．癌治療用薬物製造のための実施形態１〜８記載の組成物の使用。
１０．癌の治療方法であって、
ａ）実施形態１または３〜６の有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤 を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ；および
ｂ）実施形態２〜６の有効量の癌治療オートファジー誘導化合物を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ；
を含み、
チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物の両方の投与が、癌関連症状を緩和し、それにより、癌を治療する、
方法。
１１．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物の両方の投与が、癌関連症状を緩和し、それにより、癌を治療する、
癌の治療のための実施形態１〜８に記載の組成物の使用。
１２．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、同時に投与される、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
１３．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、逐次的に投与される、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
１４．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、約３時間以内に相互に投与される、
実施形態１３に記載の方法または使用。
１５．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、約２時間以内に相互に投与される、
実施形態１３に記載の方法または使用。
１６．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、約１時間以内に相互に投与される、
実施形態１３に記載の方法または使用。
１７．治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および治療有効量の癌治療オートファジー誘導化合物が、単回一日量で投与される、または１つの一日量より多くに分割される、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
１８．前記１つの一日量より多くの分割量が、２つに分割した一日量である、
実施形態１７に記載の使用または方法。
１９．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、経口投与される、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
２０．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、非経口的に投与される、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
２１．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、カプセルまたは錠剤の形で投与される、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
２２．チオキサントンベースオートファジー阻害剤および癌治療オートファジー誘導化合物が、１つまたは複数のサイクルで投与される、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
２３．前記１サイクルが、４日毎に７回を含む、
実施形態１０に記載の方法または実施形態１１に記載の使用。
２４．癌が、肺癌、脳癌、中枢神経系癌、乳癌、結腸癌、白血病、骨髄腫、前立腺癌、または卵巣癌である、
実施形態１０もしくは１２〜２３に記載の方法、または実施形態１１〜２３に記載の使用。
２５．肺癌が非小細胞肺癌である、
実施形態２４の方法または使用。
２６．方法または使用が、照射療法、ホルモン療法または免疫療法の投与をさらに含む、
実施形態１０〜２５に記載の方法または使用。
２７．ａ）治療有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物、ならびに
ｂ）治療有効量の癌治療オートファジー誘導化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物、
を含む医薬品キット。
２８．癌の治療方法であって、
ａ）実施形態１、４、または５に記載の有効量のチオキサントンベースオートファジー阻害剤を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ；および
ｂ）有効量の電離放射線を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ；
を含み、
チオキサントンベースオートファジー阻害剤および電離放射線の両方の投与が、癌関連症状を緩和し、それにより、癌を治療する、
方法。
２９．癌の治療方法であって、
ａ）実施形態１または３〜６に記載の有効量のチオキサントンベースオートファジー阻 害剤を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ；
ｂ）実施形態１、４、または６〜８に記載の有効量の癌治療オートファジー誘導化合物を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ；および
ｃ）有効量の電離放射線を、それを必要としている哺乳動物に投与するステップ；
を含み、
チオキサントンベースオートファジー阻害剤、癌治療オートファジー誘導化合物、および電離放射線の投与が、癌関連症状を緩和し、それにより、癌を治療する、
方法。
３１．有効量の電離放射線の投与と組み合わせたチオキサントンベースオートファジー阻害剤の投与が、癌関連症状を緩和し、それにより、癌を治療する、
癌の治療のための、それを必要としている哺乳動物に対する実施形態１、４、または５に記載の組成物の使用。
３２．有効量の電離放射線の投与と組み合わせたチオキサントンベースオートファジー阻害剤、癌治療オートファジー誘導化合物、または両方の投与が、癌関連症状を緩和し、それにより、癌を治療する、
癌の治療のための、それを必要としている哺乳動物に対する実施形態１〜８に記載の組成物の使用。
【0071】
実施例以下の非制限的実施例は、現時点で意図されている代表的実施形態のさらに完全な理解に役立つために、説明の目的のためのみに提供されている。これらの実施例が、化合物、医薬組成物、医薬品キット、または癌の治療方法に関係するものを含め、本明細書に記載されているいずれの実施形態をも制限すると解釈されるべきではない。
【0072】
実施例１：ルカントンは、オートファジー分解を阻害する。ルカントンがリソソーム膜透過化（ＬＭＰ）を誘導する。オートファジーは、細胞生存を促進し、癌細胞がＡＴＰを生成するための細胞成分の再利用を可能とすることにより薬剤耐性をもたらす。このことに合致して、遺伝的にまたは３−ＭＡ等の化合物を使ったオートファジー抑制は、多くの抗癌剤の活性を高める。ルカントンは、抗住血吸虫剤で、化学構造に基づいて、リソソーム機能を破壊でき、オートファジー分解の最後のステップを阻害する。この仮説をテストするために、乳癌細胞を、ルカントンまたはクロロキンで処理し、ＬＣ３−ＩＩの蓄積、空胞化の増加、およびリソソーム膜透過化の出現をアッセイした。
【0073】
ＬＣ３−ＩＩの蓄積は、免疫細胞化学により可視化した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株由来の細胞を、チャンバースライド上に播種し、一晩付着させた。次に、細胞を１０μＭルカントンまたは５０μＭクロロキンで、４８時間処理した。薬剤処理後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％トリトン−Ｘ−１００を使って透過処理し、指示された一次抗体と共に一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合蛍光二次抗体を使ってタンパク質の局在化を可視化した。ＤＰ７１カメラおよび６０Ｘ対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ螢光顕微鏡（Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使って、画像をキャプチャーした。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．１（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を、画像取得に使用した。
【0074】
空胞化の増加は、ギムザ染色および透過型電子顕微鏡により可視化した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株由来の細胞を、チャンバースライドに播種し、１０μＭルカントンまたは５０μＭクロロキンで４８時間処理した。薬剤処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノール中で５分間固定した。次に、細胞を脱イオン水で１：２０に希釈したギムザ染料中で１時間インキュベートした。細胞を水ですすぎ、Ｏｌｙｍｐｕｓ螢光顕微鏡を使って画像化した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．１を使って、画像を取得した。細胞の透過電子顕微鏡撮影を通常の方法で行った。切片をＬＫＢ Ｕｌｔｒａｃｕｔミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）で切りだし、酢酸ウラニルとクエン酸塩鉛で染色し、ＪＥＭ１２３０透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、ＵＳＡ、Ｉｎｃ．、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）で調べた。ＡＭＴ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｃｏｒｐ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使って画像をキャプチャーした。
【0075】
アクリジンオレンジ蛍光の消失によりＬＭＰの出現をモニターした。酸性のリソソームを、アクリジンオレンジ染色により可視化した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株由来細胞を、１０μＭルカントンまたは５０μＭクロロキンで４８時間処理後、１μＭアクリジンオレンジを使って、３７℃で１５分間染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｏｌｙｍｐｕｓ螢光顕微鏡を使って画像をキャプチャーした。酸性であるため、リソソームは、オレンジ蛍光の細胞質の小胞として出現した。５つのランダム視野のアクリジンオレンジ強度の定量化を免疫蛍光法により行い、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．１を使って画像の取得を行った。
【0076】
ルカントンは、ＬＣ３−ＩのＬＣ３−ＩＩへの脂質修飾を誘導し、これは、ＬＣ３のオートファゴソームへの点状局在化を特徴とする（図１Ｂ）。また、ルカントンは、誘導細胞質の空胞化を誘導し、これは、リソソーム膜透過化およびオートファジーの特徴である（図１Ｂ）。さらに、ルカントンは、アクリジンオレンジによるリソソームの赤色染色強度を低下させ、クロロキンおよびルカントンによる処理後のリソソームの酸性の消失を示す（図１Ｂと１Ｃ）。
【0077】
タンパク質の蓄積を生ずるオートファジーの抑制。透過電子顕微鏡による可視化時に、ルカントンまたはクロロキンによる、高電子密度粒子の蓄積の誘導が認められ、タンパク質凝集（図１Ｂ）を示唆している。この知見を確認するために、乳癌細胞をルカントンまたはクロロキンで処理し、ポリユビキチン結合タンパク質ｐ６２またはセクエストソームＩ（ＳＱＳＴＭＩ）の蓄積をアッセイした。このタンパク質は、オートファジーにより分解され、細胞封入体に局在化し、オートファジーによりタンパク質凝集体のクリアランスを促進する役割を果たすことが提唱されてきた。従って、このプロセスの破壊により、ＳＱＳＴＭＩ／ｐ６２の蓄積を生ずるはずである。
【0078】
ＳＱＳＴＭＩ／ｐ６２のレベルと凝集を、それぞれ、イムノブロッティングおよび免疫細胞化学により測定した。イムノブロッティングに対しては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株由来癌細胞を１０μＭルカントンまたは５０μＭクロロキンと共に４８時間インキュベートした。細胞を採取し、ルーチン手法で溶解した。各検体由来の全体細胞タンパク質の約５０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜に移して、膜を０．１％ＴＷＥＥＮ−２０含有トリス緩衝食塩水溶液中の５％脱脂ミルクで１時間ブロックした。次に、ブロットを、一次抗体を使って４℃で一晩探索し、洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼに結合した種特異的二次抗体を使って探索した。免疫反応性材料を強化型化学ルミネッセンス（ＷｅｓｔＰｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＬ）により検出した。
【0079】
オートファジー抑制の他のマーカーと一致して、ＳＱＳＴＭＩ／ｐ６２レベルは、ルカントンで処理後、大きく増加した（図１Ｄ）。免疫細胞化学により、ＳＱＳＴＭＩ／ｐ６２は、基底条件下では拡散した染色パターンを示したが、ルカントンに応答して凝集したことが示された。これらの結果は、ルカントンは、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２蓄積と凝集を刺激し、効果は、ユビキチン化したタンパク質との報告された相互作用と一致することを示す（図１Ｄ）。
【0080】
実施例２：ルカントンは乳癌細胞に対し細胞障害性である。リソソーム膜透過化とそれに続くオートファジーの抑制により、癌細胞の細胞死が誘導されると報告されている。ルカントンの抗癌活性を調べるために、細胞生存能を７つの乳癌細胞株パネルを使ってＭＴＴアッセイにより測定した。
【0081】
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ１９５４、ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＨＣＣ１９３７、およびＢＴ−２０由来細胞を、ウエル当たり１０、０００細胞で９６ウエルミクロ培養プレートに播種し、２４時間付着させた。次に、細胞を種々濃度のルカントンまたはクロロキンで７２時間処理した。薬剤処理後、３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５、ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を添加し、細胞生存能をＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）マイクロプレートリーダーを使って定量化した。インビトロ薬剤暴露後のアポトーシス促進性効果をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色およびｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１ＤＮＡ含量の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析により定量化した。データは、３つの独立した実験の代表値である。ＩＣ５０値は、ＭＴＴアッセイの結果から計算した。
【0082】
ルカントンは、７つの乳癌細胞株パネルで同程度に細胞生存能を低下させた（図２）。さらに、直接比較により、ルカントンは、乳癌細胞生存能低化の点で、ＣＱより非常に強力であることが示され、平均ＩＣ５０は、ＣＱの６６μＭに対し、７．２μＭであった（図２）。
【0083】
実施例３：ルカントンはカテプシンＤの発現を誘導する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを使ったルカントンの癌細胞に及ぼす効果のキャラクタリゼーション。乳癌細胞に対するルカントンの効果をさらに特徴付けるために、乳癌細胞株に対し、発現プロファイリングを行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＴ−２０乳癌細胞株由来の細胞を１０μＭルカントンで４８時間処理した。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使って単離し、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標登録）Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使って処理した。検体当たり３００ｎｇの全ＲＮＡを増幅し、メーカーのインストラクションに従って、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標登録）ヒト遺伝子１．０ ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にハイブリダイズした。これらのアレイは、７６４、８８５の異なるプローブを有する、適切に注釈を付けた約２８、８６９の遺伝子の発現をアッセイする。デフォルトＰａｒｔｅｋ正規化パラメータおよびプローブ配列およびＧＣ含量に合わせて調節したロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）分析（ＧＣ−ＲＭＡ）を使って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＣＥＬファイルをＰＡＲＴＥＫ（商標登録）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｕｉｔｅ（商標登録）６．４（Ｐａｒｔｅｋ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に取り込んだ。分位数正規化を使って、データの正規化を全アレイに対し行った。著しく発現上昇した遺伝子（ｐ＜０．０５および＞４倍増加）を特定した。データは、ルカントン処理後、少なくとも４倍発現上昇した遺伝子を表す。
【0084】
ルカントンに誘導された遺伝子の中で、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、マトリックスメタロプロテアーゼ−ｌ（ＭＭＰＩ）、およびチトクロムＰ４５０、ファミリー１、ｍｅｍｂｅｒＡｌ（ＣＹＰＩＡＩ）が、両細胞株中で増加した（図３Ａ）。
【0085】
カテプシンＤの定量リアルタイムＰＣＲ分析。リソソームプロテアーゼカテプシンＤは、アポトーシスの主要メディエーターであり、それのサイトゾル中への放出は、細胞死を促進すると報告されている。これを考慮して、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使って、ルカントン媒介細胞死の間のカテプシンＤの役割をさらに評価した。ｑＲＴ−ＰＣＲを行うために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＢＴ−２０細胞株由来細胞を１０μＭルカントンで４８時間処理した後、分析用に採取した。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使って単離し、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡｆｒｅｅ（登録商標）Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で処理した。高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使って、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を２０μＬ反応混合物中の１μｇＲＮＡから実行した。カテプシンＤおよびＧＡＰＤＨ転写物を市販のＴａｑＭａｎ＠Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使って増幅した。ｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨの発現に標準化し、相対的遺伝子発現を２−ΔＣｔ法で計算した。
【0086】
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、ルカントンが、両細胞株中でカテプシンＤレベルの顕著な増加を誘導することが確認された（図３Ｂ）。さらに、ルカントンは、また、カテプシンＤタンパク質レベルを劇的に増加させ、免疫細胞化学で測定の結果によると、サイトゾル凝集を促進した（図３Ｃ）。
【0087】
実施例４：カテプシンＤ誘導がルカントン媒介アポトーシスに寄与する。乳癌におけるカテプシンＤの発現。カテプシンＤがルカントン媒介アポトーシスに顕著に寄与するため、イムノブロッティングによりカテプシンＤの発現、およびＰＩ−ＦＡＣＳよりそのアポトーシスを４つの乳癌細胞株で調べた。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ−３、およびＢＴ−２０由来細胞を９６ウエルミクロ培養プレート中に、ウエル当たり１０、０００細胞で播種し、２４時間付着させた。次に、細胞を１０μＭルカントンで７２時間処理した（アポトーシスアッセイ用には４８時間処理）。イムノブロッティング用として、細胞を処理後採取し、カテプシンＤレベルを上述のように測定した。インビトロ薬剤暴露後のアポトーシス促進性効果をｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１ＤＮＡ含量のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析により定量した。データは、３つの独立した実験の代表値である。予期されたように、カテプシンＤレベルは、ルカントン処理後、大きく増加し（図４Ａ）、アポトーシスと相関があった（図４Ｂ）。
【0088】
カテプシンＤのノックダウンがルカントン誘導アポトーシスを減らす。ルカントン誘導アポトーシスにおけるカテプシンＤの機構的役割をさらに確立するために、ｓｉＲＮＡを使ってその発現をノックダウンした（図４Ｃ）。ｓｉＲＮＡカテプシンＤおよび非標的ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡの標本をＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から入手した。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使って、メーカーのプロトコルに従って、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株由来細胞に１００ｎＭの非標的またはカテプシンＤ ｓｉＲＮＡを形質移入た。形質移入細胞を３７℃で２４時間インキュベート後、１０μＭルカントンで４８時間処理した。ＲＮＡｉの効率をα−カテプシンＤ抗体を使ってイムノブロッティングにより、４８時間目に測定した。アポトーシスをＰＩ染色およびフローサイトメトリーにより測定した。結果は、カテプシンＤレベルの減少した細胞で、ルカントン媒介アポトーシスに対し顕著に感受性が低下したことを示した（図４Ｄ）。
【0089】
実施例５：ｐ５３はカテプシンＤの蓄積またはルカントンの活性を低下させない。ｐ５３機能消失は、ヒト癌中の高頻度イベントであり、腫瘍形成と薬剤耐性に関連している。従って、ｐ５３の状態とは独立した効力を有する試薬が強く望まれる。ルカントン媒介細胞死におけるｐ５３の役割を調べるために、アイソジェニックｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞株で実験した（図５Ａ）。重要なのは、ルカントンが、カテプシンＤ蓄積を、ｐ５３の状態に関わりなく同等に誘導することである（図５Ｂ）。カテプシンＤの等効力誘導と一致して、ルカントンは、ＨＣＴ１１６ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−細胞株の両方で同程度に生存能を低下させた（図５Ｃ）。したがってｐ５３の消失は、カテプシンＤ蓄積またはルカントンの活性を低下させない。
【0090】
実施例６：ルカントンはボリノスタットの活性を高める。ルカントンは、オートファジーを阻害するため、この経路を誘導する化学療法剤の活性を高めることができる可能性もある。チオキサントンベースオートファジー阻害剤ボリノスタットは、アポトーシスおよびオートファジーの両方を誘導し、オートファジーの抑制は、そのアポトーシス促進活性を大きく増強する。ルカントンおよびボリノスタットの組み合わせが、有効であるかどうかを判断するために、カテプシンＤの発現をイムノブロッティングを使って、その細胞生存能をＭＴＴアッセイを使って、また、そのアポトーシスをＰＩ−ＦＡＣＳを使って、４つの乳癌細胞株に対し調査した。
【0091】
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−４７４、ＳＫＢＲ−３、およびＢＴ−２０由来の細胞を９６ウエルミクロ培養プレートに、ウエル当たり１０、０００細胞で播種し、２４時間付着させた。イムノブロッティング用として、細胞を１０μＭルカントン、２．５μＭボリノスタット、またはそれらの組み合わせで、７２時間処理後、採取し、カテプシンＤレベルを上述のように測定した。ＭＴＴ細胞生存率アッセイ用として、細胞を１０μＭルカントン、２．５μＭボリノスタット、またはそれらの組み合わせで、７２時間処理した。処置後、３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５、ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を添加し、ＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）マイクロプレートリーダーを使って、細胞生存能を定量した。アポトーシスアッセイ用として、細胞を１０μＭルカントン、２．５μＭボリノスタット、またはそれらの組み合わせで、４８時間処理した。インビトロ薬剤暴露後のアポトーシス促進性効果をｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１ＤＮＡ含量のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色および蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析により定量した。データは、３つの独立した実験の代表値である。
【0092】
ルカントンおよびボリノスタットの組み合わせにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、いずれの単体試薬処理により得られた結果より増加したカテプシンＤ誘導がもたらされた（図６Ａ）。これは、細胞生存能の減少（図６Ｂ）およびアポトーシスの増加（図６Ｃ）と関連していた。これらのデータは、オートファジーのルカントンによる抑制がボリノスタットの抗癌活性の増強に成功した証を提供する。
【0093】
実施例７：ルカントンはベリノスタットの活性を高める。ＨＤＡＣ阻害剤の抗癌活性をうまく増強することができるという知見をさらに探究し発展させるために、他のＨＤＡＣ阻害剤のベリノスタットと組み合わせてルカントンの効力を、ＭＴＴアッセイを使って細胞生存能を、またＰｌ−ＦＡＣＳを使ってアポトーシスを４つの乳癌細胞株で評価することにより調査した。
【0094】
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＴ−２０由来の細胞を９６ウエルミクロ培養プレートを使い、ウエル当たり１０、０００細胞で播種し、２４時間付着させた。ＭＴＴ細胞生存率アッセイ用として、細胞を５μＭルカントン、１μＭベリノスタット、またはこれらの組み合わせで、７２時間処理した。処理後、３−（４、５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２、５、ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を添加し、細胞生存能をＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）マイクロプレートリーダーを使って定量化した。アポトーシスアッセイ用として、細胞を５μＭルカントン、１μＭベリノスタット、またはこれらの組み合わせで、４８時間処理した。インビトロ薬剤暴露後のアポトーシス促進効果をｓｕｂ−Ｇ０／Ｇ１ＤＮＡ含量のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析により定量化した。データは、３つの独立した実験の代表値である。
【0095】
ルカントンおよびベリノスタットの組み合わせにより、細胞生存能の低下（図７Ａ）およびアポトーシスの増加（図７Ｂ）が生じた。これらのデータは、ルカントンによるオートファジーの抑制により、ベリノスタットの抗癌活性をうまく増強できるという証拠を提供する。
【0096】
最後に、本明細書の態様を具体的実施形態に言及して強調しているが、これらの開示実施形態が、本明細書で開示の対象の原理の説明のみのためであることは、当業者なら容易にわかることは理解されよう。従って、開示対象は、本明細書記載の特定の方法、プロトコル、および／または試薬、等に限定されないことは理解されるべきである。従って、本明細書の趣旨と乖離することなく、本明細書の教示に従って開示対象の構成に対する様々な修正と変更または代替を行うことができる。最後に、本明細書で使われる用語は、特定の実施形態を説明するためのみの目的であり、請求項によってのみ規定される本発明の範囲を制限する意図はない。従って、本発明は、示され、記述されたそのままに正確に限定されるものではない。
【0097】
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載され、本発明を実行のための発明者に既知の最良のモードを含む。むろん、これらの記載された実施形態に対する変更は、前述の記載を読み取る際に当業者には明らかとなるであろう。発明者は当業者が必要に応じてこのような変更を採用することを予想し、発明者は具体的に本明細書に記載された内容とは別の方法で実施される本発明も対象としている。従って、本発明は、本明細書に添付された、適用法により許可された請求項に列挙された対象の全ての修正、等価物を含有する。さらに、全ての可能な変更中の上述の実施形態のいずれかの組み合わせは、本明細書で別段の指示がなく、または、文脈との明らかな矛盾がなければ、本発明に包含される。
【0098】
本発明の代替実施形態、要素、またはステップのグルーピングは、制限と解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に参照・要求されても、または本明細書で開示の他のグループメンバーと任意に組み合わされてもよい。１つまたは複数のグループのメンバーが、便宜および／または特許性の理由でグループ中に含まれる、または、欠けることは予想されている。いずれかのこのような包含または欠如が発生する場合、明細書は、修正され、従って、添付請求項で使用される全てのＭａｒｋｕｓｈグループの文書による説明に記載されたグループを含むと見なされる。
【0099】
特段の指示がなければ、本明細書および請求項で使われる特性、項目、量、パラメータ、特性、期間、等を表現する全てのメンバーは、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。本明細書で使われる用語の「約」は、そのように修飾された特性、項目、量、パラメータ、特性、または期間が、表示された特性、項目、量、パラメータ、特性、または期間の値の上下±１０％の範囲を含むことを意味する。従って、それとは反対の指示がなければ、本明細書および添付請求項中で述べられた数字パラメータは、変化してもよい近似値である。最低限でも、また、等価物の原理の適用を請求項の範囲に限定する意図ではなく、各数値表示は、報告されている有効数字の数を考慮して、また、通常の丸め技術を適用して解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記述している数値の範囲および値は近似値であるにも関わらす、具体的な例で記述されている数値の範囲および値は、可能な限り正確に報告されている。しかし、任意の数字の範囲または値は、本質的に、それぞれの試験測定値で認められる標準偏差から生じた必然的な特定の誤差を含んでいる。本明細書の値の数字範囲の列挙は、特定の範囲に入る各別々の数値を個々に参照する簡略的方法として使用することを意図しているに過ぎない。本明細書で別段の指示がなければ、数値範囲の各個別値は、あたかも本明細書でそれぞれが列挙されているように、本明細書中に組み込まれる。
【0100】
本発明の記載の文脈（特に、以下の請求項の文脈）で使われる用語の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似の参照対象は、本明細書で別段の指示がなく、または、文脈との明確な矛盾がなければ、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書記載の全ての方法は、本明細書で別段の指示がなく、または、文脈との明確な矛盾がなければ、任意の適切な順番で実施することができる。本明細書で提供されるいずれか、および全ての例の使用、または代表的用語（例えば、「のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」）は、本発明に対しより良き説明の光明を投じる意図に過ぎず、別段で請求された本発明の範囲に制限を提起するものではない。本明細書中のいかなる用語も、本発明の実施に必要ないずれかの非請求要素を示すと解釈されるべきではない。
【0101】
本明細書で開示の具体的実施形態は、（用語）からなる、または基本的に（用語）からなる、を使って請求項でさらに限定することができる。請求項で使用される場合、出願のままでも、または修正毎に追加した場合も、移行用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｔｅｒｍ）「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項で特定されていない全ての要素、ステップ、または成分を排除する。移行用語「基本的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の範囲を特定された物質またはステップおよび実質的に基本的かつ新規の特性に影響を与えない事項の範囲に制限する。そのように請求された本発明の実施形態は、本質的にまたは明示的に記載され、本明細書で使用可能にされる。
【0102】
本明細書中で引用され特定された全ての特許、特許公報、および他の出版物は、このような出版物中で記載されている、本発明と関連して使用される可能性がある組成物および方法を記載し、開示する目的で、それぞれ、明示的に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの出版物は、その開示が本出願の出願日より前であることのみのために提供される。これに関連して、何であれ、発明者が、先行発明の理由、または他のいずれかの理由でこのような開示に先行する権利を有さないことを認めると解釈されるべきではない。全ての日付に関する記載、またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願者が入手可能な情報に基づいており、日付またはこれらの文書の内容の正確さに関し承認するものではない。