特許 6182720 カンプトセシンの新規な２０（Ｓ）−スルホニルアミジン誘導体および当該誘導体の強力な抗癌剤としての使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6182720

(24)【登録日】2017年8月4日

(45)【発行日】2017年8月23日

(54)【発明の名称】カンプトセシンの新規な２０（Ｓ）−スルホニルアミジン誘導体および当該誘導体の強力な抗癌剤としての使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 491/22 20060101AFI20170814BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170814BHJP

【ＦＩ】

   C07D491/22CSP

   A61K31/4745

   A61P35/00

【請求項の数】15

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2016-518190(P2016-518190)

(86)(22)【出願日】2014年9月26日

(65)【公表番号】特表2016-531877(P2016-531877A)

(43)【公表日】2016年10月13日

(86)【国際出願番号】US2014057575

(87)【国際公開番号】WO2015048365

(87)【国際公開日】20150402

【審査請求日】2016年3月24日

(31)【優先権主張番号】61/883,289

(32)【優先日】2013年9月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516088318

【氏名又は名称】チャイナ メディカル ユニバーシティ ホスピタル

(73)【特許権者】

【識別番号】517202320

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】リー，クオ−シン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ケドゥオ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，シャオミン

(72)【発明者】

【氏名】後藤 益生

(72)【発明者】

【氏名】リウ，イン−チェン

(72)【発明者】

【氏名】チャオ，ヨン−ロン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，リウ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ジ−ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ウ，ティアン−シュン

(72)【発明者】

【氏名】テン，チェ−ミン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チー−ヤ

(72)【発明者】

【氏名】パン，ショウ−リン

(72)【発明者】

【氏名】クオ，シェン−チュ

(72)【発明者】

【氏名】ファン，シン−イ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，リン−チュ

(72)【発明者】

【氏名】ウ，ヤン−チャン

(72)【発明者】

【氏名】シエ，ミン−ツァン

(72)【発明者】

【氏名】シュ，チョン ワイ．

(72)【発明者】

【氏名】シュウ，ウェイ−チェン

(72)【発明者】

【氏名】リン，チェン−ファン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，メイ−ジュアン

【審査官】 早乙女 智美

(56)【参考文献】

【文献】 特表平１０−５０６３７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０６７４４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５０９９０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０１６５５２２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０２０８６２０８（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記構造：

【化1】

ただし、Ｒ_１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはフェニルＣ１〜Ｃ３アルキルであり；Ｒ_２は、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ６アルキル、（ＣＨ_３）_ｋＨ_３−ｋＳｉ、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルキルフェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、ブロモフェニル、（ＣＨ_２）_ｊ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｒ_１１であり、この際、ｋは０、１、２または３であり；ｊは１〜５であり；ｉは０〜５であり；ならびにＲ_１１は、下記：

【化2】

であり、この際、Ｒ_８、Ｒ_１０、Ｒ_１２、およびＲ_１３は、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ_３は、Ｈ、ＮＯ_２、下記：

【化3】

であり、この際、Ｒ_８およびＲ_１０は、上記と同様の定義であり；
Ｒ_４は、ＨまたはＮＯ_２であり；
Ｒ_５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、下記：

【化4】

であり；
Ｒ_６は、Ｈ、ＯＨ、または下記：

【化5】

であり；
Ｒ_７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシルであり；ならびに
Ｒ_９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルキルフェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、ブロモフェニル、ピリジル、ナフチル、フリル、チエニル、ピロリル、下記：

【化6】

であり、この際、Ｒ_８およびＲ_１０は、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ｎは、０〜３であり；
ｍは、１〜５であり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｙは、Ｏであり；
Ｚは、Ｏであり；ならびに
Ｗは、Ｏである、
を有する化合物。

【請求項2】

Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７はすべてＨであり、ｎは０であり、ｍは１であり、ならびにＸはＯである、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｒ_９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキルフェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、または下記：

【化7】

である、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｒ_２は、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、または（ＣＨ_２）_ｊ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｒ_１１であり、この際、ｊは１であり；ｉは０または１であり；ならびにＲ_１１は下記：

【化8】

であり、この際、Ｒ_８、Ｒ_１０、Ｒ_１２、およびＲ_１３はすべてメチルである、請求項３に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ_１はＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはフェニルメチルである、請求項４に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルである、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ_２は（ＣＨ_２）_ｊ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｒ_１１であり、この際、ｊは１であり；ｉは０または１であり；ならびにＲ_１１は下記：

【化9】

であり、この際、Ｒ_８、Ｒ_１０、Ｒ_１２、およびＲ_１３はすべてメチルである、請求項５に記載の化合物。

【請求項8】

Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルまたはｐ−フルオロフェニルであり、Ｒ_１およびＲ_４は双方ともＨであり、Ｒ_９はｐ−メチルフェニルであり、ｎは０であり、ｍは１であり、ならびにＸはＯである、請求項１に記載の化合物。

【請求項9】

Ｒ_５はＣＨ_３ＣＨ_２であり、Ｒ_６はＨまたはＯＨであり、Ｒ_７はＨであり、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルであり、およびＲ_３はＨである、請求項８に記載の化合物。

【請求項10】

Ｒ_５はＣＨ_３ＣＨ_２であり、Ｒ_６はＨであり、Ｒ_７はＨであり、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルであり、ならびにＲ_３は下記：

【化10】

である、請求項８に記載の化合物。

【請求項11】

Ｒ_５およびＲ_７は双方ともＨであり、Ｒ_６はＯＨであり、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルであり、ならびにＲ_３は下記：

【化11】

であり、この際、Ｒ_８はメチルである、請求項８に記載の化合物。

【請求項12】

Ｒ_３、Ｒ_５およびＲ_６はすべてＨであり、Ｒ_７はメチルであり、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルである、請求項８に記載の化合物。

【請求項13】

Ｒ_３、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７はすべてＨであり、Ｒ_２はｐ−フルオロフェニルである、請求項８に記載の化合物。

【請求項14】

請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物を含む癌を治療するための薬剤。

【請求項15】

前記癌が、結腸癌、鼻咽頭癌、肺癌、乳癌、前立腺癌または卵巣癌である、請求項１４に記載の薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本本発明は、カンプトセシン（１）の新規な２０−スルホニルアミジン誘導体、当該誘導体の合成方法、および当該誘導体の抗癌剤としての使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
カンプトセシン（ＣＰＴ、１、図１）は、顕著な抗癌効果を有する天然のアルカロイドである^１−３。その抗癌活性は、不可逆な薬剤−酵素−ＤＮＡの三重複合体を安定化し、トポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏ Ｉ）によって誘導される１本鎖ＤＮＡ切断の再連結を防止することによるＤＮＡ Ｔｏｐ Ｉの触媒サイクルの干渉能によるものである^４，５。過去数十年にわたる合成医療化学への集中的な取り組みにより、現在、卵巣癌、肺小細胞癌、及び結腸癌の治療に臨床的に使用される、トポテカン（２）及びイリノテカン（３）等の、強力な１−誘導体が得られた。また、ギマテカン(gimatecan)（４）、ＣＫＤ−６０２（５）、及びＢＮＰ−１３５０（６）等の、数種の誘導体は、前臨床開発または臨床開発の様々な段階である^６−８。臨床使用される１−誘導体は有望な抗癌剤ではあるものの、その治療への使用は、毒性の問題および水溶性の低さによる、デリバリーの問題、さらには血清アルブミンへの開環カルボキシレート(opened carboxylate)の優先的な結合による、活性のあるラクトン形態の不安定性によって、かなり妨げられている^９，１０。

【0003】

プロドラッグ（共役体(conjugate)及びポリマー結合カンプトセシン）、新規な製剤（リポソームまたは微粒子担体）、及び合成親油性カンプトセシンの開発などの、様々なアプローチが、１−ファミリーの抗癌有効性を高めるために、調査された^{１１−１３}。これらのストラテジーのほとんどは、血漿コンパートメントでの活性のある閉環ラクトン形態を維持することを目的とする。遊離２０−ヒドロキシル基は分子内水素結合の形成によりラクトンの開環を優先する^１４が、その一方でこの基のアシル化は閉環したラクトン部分を安定化する必要がある^１５。さらに、導入されたエステル部分における立体的な嵩高さが、カルボキシルエステラーゼ等の様々な酵素によるエステル結合の加水分解を妨げて、これにより毒性を減少するので望ましい。事実、我々自身の結果^{１６，１７}、さらには２０（Ｓ）−アシルエステル^{１８，１９}、２０（Ｓ）−Ｏ−カルボネート結合トリペプチド共役体^２０、および２０（Ｓ）−結合複合糖質^２１を用いた他の結果も、強力な活性に関するエステル化１−誘導体の重要性を支持している。また、２０−ヒドロキシル基のエステル化は、未修飾の１に比して血漿安定性促進し、インビボでの抗腫瘍活性を増大する。

【0004】

アミジンが重要なファーマコフォア(pharmacophore)であることはよく知られており^{２２−２５}、生物活性のある化学物質や薬剤分子設計において広く使用されている。また、生物活性のある機能性断片にスルホニル基を導入することによって、化合物の生物活性が有意に変化する^{２６，２７}；このため、スルホニルアミジンは生物活性のある分子の最適化のための有用な構造モチーフでありうる。この基はまた非常に嵩高いため、大きな酵素が１の２０（Ｓ）−Ｏ−アシルエステルを容易に加水分解をするのを立体的に防止する可能性があり、これはまた毒性を減少させるはずである。これに対して、３の加水分解から形成される化合物である、ＳＮ−３８、は、非常に毒性がたかい^２８。これらの考察から、我々は、１の２０−位置にスルホニルアミジン基を導入することによって、有効性を向上し、毒性を減少し、さらに新規な１−関連抗癌剤候補の物理化学的特性を最適化できると仮定した。したがって、本研究では、我々は、Ｃｕ触媒によるワンポット反応(Cu-catalyzed one pot reaction)を介してＣ−２０位置で１に機能的断片スルホニルアミジンを導入し^２９、抗癌剤となりうるものとして１の新規な誘導体群を合成した。

【発明の概要】

【0005】

発明の要約
本発明は、新規なカンプトセシン（１）の新規な２０−スルホニルアミジン誘導体、これらの合成方法、およびこれらの抗癌剤としての使用に関する。

【0006】

本発明で提供される化合物は下記構造を有する：

【0007】

【化1】

【0008】

ただし、Ｒ_１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはフェニルＣ１〜Ｃ３アルキルであり；
Ｒ_２は、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ６アルキル、（ＣＨ_３）_ｋＨ_３−ｋＳｉ、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルキルフェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、ブロモフェニル、（ＣＨ_２）_ｊ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｒ_１１であり、この際、ｋは０、１、２または３であり；ｊは、１〜５であり；ｉは０〜５であり；およびＲ_１１は下記であり：

【0009】

【化2】

【0010】

この際、Ｒ_８、Ｒ_１０、Ｒ_１２、およびＲ_１３は、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ_３は、Ｈ、ＮＯ_２、

【0011】

【化3】

【0012】

この際、Ｒ_８およびＲ_１０は、上記と同様の定義であり；
Ｒ_４は、ＨまたはＮＯ_２であり；
Ｒ_５は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、

【0013】

【化4】

【0014】

Ｒ_６は、Ｈ、ＯＨ、または

【0015】

【化5】

【0016】

Ｒ_７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシルであり；ならびに
Ｒ_９は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルキルフェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、ブロモフェニル、ピリジル、ナフチル、フリル、チエニル、ピロリル、

【0017】

【化6】

【0018】

この際、Ｒ_８およびＲ_１０は、独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ｎは、０〜３であり；
ｍは、１〜５であり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｙは、Ｏであり；
Ｚは、Ｏであり；ならびに
Ｗは、Ｏである。

【0019】

好ましくは、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７はすべてＨであり、ｎは０であり、ｍは１であり、ならびにＸはＯである。より好ましくは、Ｒ_９はＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキルフェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、または

【0020】

【化7】

【0021】

最も好ましくは、Ｒ_２はヒドロキシルＣ１〜Ｃ６アルキル、フェニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシルフェニル、または（ＣＨ_２）_ｊ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｒ_１１であり、この際、ｊは１であり；ｉは０または１であり；およびＲ_１１は

【0022】

【化8】

【0023】

この際、Ｒ_８、Ｒ_１０、Ｒ_１２、およびＲ_１３はすべてメチルである。さらに、Ｒ_１は好ましくはＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはフェニルメチルである。より好ましくは、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルである。または、Ｒ_２は（ＣＨ_２）_ｊ−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｒ_１１であり、この際、ｊは１であり；ｉは０または１であり；およびＲ_１１は

【0024】

【化9】

【0025】

この際、Ｒ_８、Ｒ_１０、Ｒ_１２、およびＲ_１３はすべてメチルである。

【0026】

好ましくは、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルまたはｐ−フルオロフェニルであり、Ｒ_１およびＲ_４は双方ともＨであり、Ｒ_９はｐ−メチルフェニルであり、ｎは０であり、ｍは１であり、ならびにＸはＯである。より好ましくは、Ｒ_５はＣＨ_３ＣＨ_２であり、Ｒ_６はＨまたはＯＨであり、Ｒ_７はＨであり、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルであり、およびＲ_３はＨである。または、Ｒ_５はＣＨ_３ＣＨ_２であり、Ｒ_６はＨであり、Ｒ_７はＨであり、Ｒ_２でありｐ−メトキシフェニルであり、およびＲ_３は

【0027】

【化10】

【0028】

Ｒ_２がｐ−メトキシフェニルまたはｐ−フルオロフェニルである際、Ｒ_１およびＲ_４は双方ともＨであり、Ｒ_９はｐ−メチルフェニルであり、ｎは０であり、ｍは１であり、ならびにＸはＯであり、好ましくはｉ）Ｒ_５およびＲ_７は双方ともＨであり、Ｒ_６はＯＨであり、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルであり、ならびにＲ_３は

【0029】

【化11】

【0030】

この際、Ｒ_８はメチルである；ｉｉ）Ｒ_３、Ｒ_５およびＲ_６はすべてＨであり、Ｒ_７はメチルであり、Ｒ_２はｐ−メトキシフェニルである；またはｉｉｉ）Ｒ_３、Ｒ_５、Ｒ_６およびＲ_７はすべてＨであり、Ｒ_２はｐ−フルオロフェニルである。

【0031】

癌がである、請求項１７に記載の使用。

【0032】

本発明はまた、癌を治療するための薬剤の製造における本発明の上記化合物の使用をも提供する。

【0033】

好ましくは、癌は、結腸癌，鼻咽頭癌，肺癌，乳癌，前立腺癌または卵巣癌である。

【0034】

本発明はさらに、有効量の上記本発明の化合物を癌の治療を必要とする患者に投与することを有する癌の治療方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】図１は、カンプトセシン（１）、トポテカン（２）およびイリノテカン（３）、ギマテカン(gimatecan)（４）、ＣＫＤ−６０２（５）、ならびにＢＮＰ−１３５０（６）の構造を示す。

【図2】図２は、ヒト結腸直腸ＨＣＴ１１６癌異種移植モデル(human colorectal HCT116 cancer xenograft model)における化合物、９ａの抗癌活性を示すものであり、この際、化合物９ａは本発明の好ましい実施形態の一つにおいて合成された新規な化合物である。

【図3】図３は、９ａが動物の体重に有意な影響を与えないことを示すものである。

【発明を実施するための形態】

【0036】

発明の詳細な説明
我々は、本明細書において、Ｃｕ触媒によるワンポット反応(Cu-catalyzed one pot reaction)を介して１のＣ−２０位置にスルホニルアミジン基を導入し、抗癌剤となりうるものとして９ａ〜９ｌを得たことを記載する。

【0037】

カンプトセシン（１）の新規な２０種の２０−スルホニルアミジン誘導体（９ａ〜９ｌ）を、Ｃｕ触媒による３成分反応(Cu-catalyzed three-component reaction)を介して合成した。これらは、Ａ−５４９、ＤＵ−１４５、ＫＢ、及び多剤耐性（ＭＤＲ）ＫＢｖｉｎ腫瘍細胞系に対してイリノテカン（３）に比して同等またはより優れた細胞毒性を示した。化合物９ａは、１及び３に比してＭＤＲ細胞に対してより良好な細胞毒性を示した。機構的には、９ａは、トポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏ）Ｉを選択的に阻害して、ＡＴＭ／Ｃｈｋ関連ＤＮＡ損傷応答経路(ATM/Chk related DNA damage-response pathway)を活性化することによって顕著なＤＮＡの損傷を誘導した。異種移植モデルでは、９ａは、１００ｍｇ／ｋｇの３に匹敵する、５及び１０ｍｇ／ｋｇで明白な悪影響なしに有意な活性を示した。特に、３００ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）での９ａは、１（ＬＤ_５０ ５６．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）および３（ＬＤ_５０ １７７．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に対して、明白な毒性を示さなかった。そのままの９ａは、１と同様、無細胞アッセイでＴｏｐｏＩ活性を阻害したことから、９ａは、新規なＴｏｐｏＩ阻害剤であることが確認された。２０−スルホニルアミジン１−誘導体９ａは臨床試験の抗癌剤候補(anticancer clinical trial candidate)として開発する利点がある。

【0038】

実施形態Ｉ
化学 スキーム１に示されるように、１の２０−ヒドロキシル基を、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の組み合わせを用いたカルボジイミド法の単純な改変によってエステル化してＮ−Ｂｏｃ−アミノ酸誘導体（７）を適当な収率で提供した。７のＮ−Ｂｏｃ基を、ＣＨ_２Ｃｌ_２におけるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：１）で除去して、カギとなる中間体ＴＦＡ塩８を形成した。次に、我々は、非常に効率のよいＣｕ触媒による３成分カップリング反応(Cu-catalyzed three-component coupling reaction)^２９を適用し、８をｐ−トルエンスルホニルアジド及び広範なアルキンと反応させて、３５〜５８％の収率で所望の化合物９ａ〜ｌを得た。目的分子の構造を^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、及びＨＲ−ＭＳによるデータから明らかにした。

【0039】

【化12】

【0040】

新規な化合物の抗増殖活性および構造−活性の関係 １２種の新規な１−誘導体９ａ〜ｌについて、３連実験でスルホローダミンＢ比色分析(sulforhodamine B colorimetric assay)^３０を用いることによって、４種のヒト腫瘍細胞系、ＫＢ（鼻咽頭）、Ａ−５４９（肺）、ＤＵ−１４５（前立腺）、およびＫＢｖｉｎ（ＭＤＲ ＫＢサブライン（subline)）に対するインビトロでの抗増殖活性を評価した。化合物１および３をコントロールとして使用した。スクリーニング結果を表１に示す。

【0041】

【表1】

【0042】

１２種の新規な化合物（９ａ〜ｌ）はすべて、ＩＣ_５０値が０．０２６〜１１μＭであり、４種の試験した腫瘍細胞系に対して顕著なインビトロ細胞毒性を示すことから、２０−スルホニルアミジン側鎖におけるＲ^１およびＲ^２基の双方が新規な１−誘導体の細胞毒性に影響を与える可能性があることが示された。上記新規な化合物９ａ〜ｌ（ＫＢｖｉｎに対する９ａを除く）は１より効力が小さかった；しかしながら、これらの誘導体はすべて、３に比して同等のまたはより優れた細胞毒性を示した。これらの新規に合成した誘導体のうち、９ａが４種の試験した腫瘍細胞系に対して最も強力な化合物であった。興味深いことに、９ａはまた、１及び３（それぞれ、ＩＣ_５０ ０．１２μＭおよび＞２０μＭ）に比してＫＢｖｉｎに対してより高い細胞毒性（ＩＣ_５０ ０．０２６μＭ）を示した。また、これらの結果から、Ａ−５４９細胞系はこれらの化合物に対して他の３種の細胞系より感受性が高いことが示され、このことは他の１−誘導体の臨床的挙動^１９と一致する。

【0043】

また、構造−活性の関係(Structure-activity relationship)（ＳＡＲ）の相関を、１のこれらの新規な２０−スルホニルアミジン誘導体について同定した。スルホニルアミジンにおいて、Ｒ^２基をフェニルに固定し、Ｒ^１基を変化させると、水素（９ｂ）及びメチル（９ｄ）が９ｆ（イソプロピル）、９ｈ（イソブチル）、及び９ｊ（ｓｅｃ−ブチル）のより大きなアルキル基に比して良好な結果であった。同様の結果がｐ−メトキシフェニルＲ^２基を有する相当する誘導体で認められた。例えば、Ａ−５４９細胞系に対して、細胞毒性効果の順序は、９ａ（Ｈ）＞９ｃ（メチル）＞９ｇ（イソブチル）＞９ｅ（イソプロピル）＞９ｉ（ｓｅｃ−ブチル）であった。したがって、小さい脂肪族鎖が細胞毒性効果がより大きいという点では最良のＲ^１置換基であると考えられる。Ｒ^１基が一定に維持し、Ｒ^２基をフェニルからｐ−メトキシフェニルに変更すると、細胞毒性は改善されることが多かった（例えば、ＫＢｖｉｎに対する９ｂと９ａとを、９ｆと９ｅとを、９ｈと９ｇとを、または９ｊと９ｉとを比較）。加えて、ヒドロキシメチルＲ^２基を有する化合物９ｌは、ｐ−メトキシフェニルＲ^２基を有する９ｋに比して、匹敵する（ＤＵ−１４５、ＫＢ）またはより高い（Ａ−５４９、ＫＢｖｉｎ）細胞毒性を示した。化合物９ｋは、ベンジルＲ^１基を有するが、通常、より小さい（９ａ、９ｃ）アルキルＲ^１基およびより大きな（９ｅ、９ｇ、９ｉ）アルキルＲ^１基を有する化合物の中間の効果を示した。これらの知見から、１−誘導体の細胞毒性プロフィールはＣ−２０での置換基の大きさおよび電子密度に影響を受ける可能性があることが示された。これらのインビトロでの結果に基づいて、化合物９ａをインビボでの評価用に選択した。

【0044】

９ａに関する作用研究のメカニズム
無細胞系での９ａによるＴｏｐｏＩ活性の阻害 エステル化２０−ヒドロキシ基を有する１−誘導体は、カルボキシルエステラーゼによる消化によって活性化されると予想される。そのままの９ａがＴｏｐｏＩを阻害するかどうかを決定するために、精製組換ヒトＴｏｐｏＩを用いる無細胞ＴｏｐｏＩ活性アッセイを使用した。このアッセイでは、超らせんプラスミドＤＮＡを、組換ＴｏｐｏＩによって緩和(relax)、切断(nick)した。これにより、ベヒクルコントロールまたはＴｏｐｏＩ活性に関して阻害効果を示さない試験化合物を用いて、緩和、切断したＤＮＡ(relaxed and nicked DNA)を見出した。細胞内でのカルボキシルエステラーゼによるのと同様この無細胞系で活性化されえないので、１のプロドラッグであることが知られている、化合物３は、同様の結果を示した。これに対して、３の生物活性のある代謝産物である、ＳＮ−３８は、ＴｏｐｏＩ活性を阻害した。特に、我々は、そのままの９ａが１と同様にこの無細胞アッセイにおいてＴｏｐｏＩ活性を阻害することを発見した。我々は、ＴｏｐｏＩに対する９ａの阻害効果が用量に依存することを確認した。ゆえに、我々は、９ａが新規なＴｏｐｏＩ阻害剤であることを確認した。

【0045】

ヒト腫瘍細胞における９ａによるアポトーシスの誘導 Ａ−５４９ヒト肺腺癌上皮細胞が予備の細胞毒性プロフィールにおいて他の試験した癌細胞系より９ａに対して高い感受性を示したので、Ａ−５４９細胞を我々の機構研究に使用した。最初に、我々は、細胞の形態変化を調べた。９ａに接触後、Ａ−５４９細胞は、細胞収縮や膜ブレブ形成(membrane blebbing)等の、アポトーシスに関する形態学的な特徴を示した。さらに、アポトーシスの誘導がＦＩＴＣ−アネキシンＶ(FITC-annexin V)及びヨウ化プロピジウム(propidium iodide)による二重染色によってさらに確認され、これから、９ａ処置によってアポトーシス細胞の割合（％）が増加する（アネキシンＶ(annexin V)陽性細胞集団：ベヒクル 対 ９ａ、２４時間、１．１％ 対 ３．７％、Ｐ＜０．０１；４８時間、２．０％ 対 ３４．１％、Ｐ＜０．００１）ことが示された。ウェスタンブロット分析によって、アポトーシスによる産物(executors of apoptosis)である、カスパーゼ−８、−９、及び−３等の、切断カスパーゼが９ａに応答して形成したことが示された。また、アポトーシスの特徴(hallmark)である、ＰＡＲＰが９ａによって活性化された。これらのデータから、９ａがアポトーシスの誘導によりＡ−５４９細胞の成長を阻害することが示された。

【0046】

９ａによるＤＮＡ損傷応答経路の活性化 １の主要な効果として、共有結合性ＴｏｐｏＩ−ＤＮＡ複合体(covalent Topo I-DNA complex)に結合し、安定化する、ゆえに、Ｓ相で細胞サイクル遅延の誘導、ＤＮＡ結合の防止および最終的にはアポトーシスを引き起こすことがある^３１。９ａがＡ−５４９細胞において１と同じ経路を活性化するか否かを、作用のメカニズムを示すために調べた。第一に、我々は、フローサイトメトリー分析を用いて細胞サイクル分布への９ａの効果を決定した。我々が予想したように、９ａで２４時間処理することによって、Ｓ相及びサブ−Ｇ１_１相での細胞集団が増加した。ＴｏｐｏＩによるＤＮＡ切断アッセイ(Topo I-mediated DNA cleavage assay)を行い、９ａが細胞におけるＴｏｐｏＩ活性の阻害効果を示すか否かを調べた。結果から、１の効果と同様、９ａが超らせんＤＮＡの弛緩を阻害することが示された。しかしながら、９ａ及び１は双方とも、キネオプラストＤＮＡ(kineoplast DNA)（ｋＤＮＡ）をデカテネートし(decatenate)なかったが、既知のＴｏｐｏＩＩ阻害剤である、エトポシドはｋＤＮＡのデカテネーション(decatenation)を効果的に遮断した。１−ＴｏｐｏＩＩ−ＤＮＡ共有結合性複合体が２６Ｓプロテアソーム経路を介してＴｏｐｏＩの転写依存性分解を促進することは知られているため^３２、ＴｏｐｏＩ及びＴｏｐｏＩＩの発現レベルに関する９ａの効果を調べた。ウェスタンブロット分析から、９ａは、８時間処理後にＴｏｐｏＩのタンパク質レベルを有意に阻害し、２４時間処理後にＴｏｐｏＩＩα及びＴｏｐｏＩＩβのレベルに若干影響を与えたことが示された。これらの結果から、９ａがＴｏｐｏＩＩ活性は妨げずにＴｏｐｏＩを阻害することが示された。化合物９ａはＴｏｐｏＩに直接作用し、共有結合性ＴｏｐｏＩ−ＤＮＡ複合体を蓄積した後プロテオソームのＴｏｐｏＩ分解が起こるが、上記は１と同様の効果であり、９ａの細胞毒性に関係する。

【0047】

化合物１は、ＤＮＡ損傷を誘導し、ＡＴＭ−Ｃｈｋ２ ＤＮＡ損傷−応答経路(ATM-Chk2 DNA damage-response pathway)を活性化して癌細胞でアポトーシス経路を開始させることができる^３３。我々は、ＡＴＭが９ａで０．５時間処理した後、１９８１番目のＳｅｒ残基でリン酸化されることを見出した。ダウンストリームエフェクター(downstream effector)である、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、及びヒストンＨ２ＡＸ(histone H2AX)のリン酸化を検出することによって、ＡＴＭキナーゼの活性化を確認した。１３９番目のＳｅｒ残基でのＨ２ＡＸのリン酸化（γＨ２ＡＸ）から、９ａがＤＮＡ二重鎖を切断することが示された。Ｐ５３が、細胞サイクルの調節及びアポトーシスの開始(apoptosis triggering)などの、ＤＮＡ−損傷機能に対して重要な役割を果たす^３４。ｐ５３のアップレギュレーション及びリン酸化が９ａによって大きく促進された。また、ＰＵＭＡやＢＡＸ等のＰ５３ダウンストリームアポトーシスタンパク質は９ａによってかなり増加した。さらに、９ａが、死レセプターが介する外因性のアポトーシス(death receptor-mediated extrinsic apoptosis)の成分である、ＦＡＤＤをアップレギュレートし、さらにミトコンドリア損傷内容物(mitochondrial damage contents)の漏出を防止することによって生存促進タンパク質(pro-survival protein)であるＢｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２をダウンレギュレートした。

【0048】

これらに基づいて、化合部物９ａ（ＹＱＬ−９ａ）が、ＴｏｐｏＩ活性を直接阻害し、ＴｏｐｏＩ発現を抑制し、これによりＳ相での細胞サイクルの遅延、さらにはＤＮＡ損傷−応答経路 (DNA damage-response pathway)の活性化を誘導した後、アポトーシス経路を活性化する。我々のデータは親化合物１に対する９ａの優位性を支持し、これから９ａが優れた抗癌剤候補となりうることが示唆される。したがって、我々はさらに、９ａの抗腫瘍活性及びインビボでの毒性評価を調査した。

【0049】

インビボでの９ａの抗腫瘍活性 ヒト結腸直腸腺癌細胞系 ＨＣＴ１１６を用いた異種移植モデル抗腫瘍アッセイを、表２のレジメに従って行った。３１日間の研究では、１日目の平均容積が約２００ｍｍ^３である確率されたＨＣＴ１１６異種移植を有するマウス（ｎ＝８）の４グループを使用した。各処置グループでの腫瘍成長および動物の体重変化を、週に３回測定した（図２および３）。化合物９ａを７日間静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した後、最後まで毎日１回（ＱＤ）５及び１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ投与グループでは、それぞれ、８匹のマウスのうちの２匹および８匹のマウスのうちの３匹が、完全退縮(regression)を示した。いずれの投与量でも体重に有意な変化はなかった。また、３を用いた実験コントロールは、毎週１回（ＱＷＫ）１００ｍｇ／ｋｇの投与量で抗腫瘍活性を示し（Ｐ＜０．００１）、３匹のマウスが完全退縮を示したことから、我々のインビボでの評価の正確さが支持された。ステューデントのｔ−検定評価(Student’s t-test evaluation)に基づくと、５ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１）及び１０ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．００１）での９ａは、明らかな兆候や症状ならびにアナフィラキシー反応を示すことなく有意なインビボでの抗腫瘍活性を示した。

【0050】

【表2】

【0051】

マウスにおける９ａの毒性評価 マウスにおける９ａの急性毒性を病理学的に評価した。６０匹の８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを任意に６グループに分け（ｎ＝１０）、０日に０（ベヒクルのみ）、３０、１００、２００、または３００ｍｇ／ｋｇの９ａを腹腔内(i.p.)に投与した。１グループを正常コントロールとして処置せずにおいた。すべての処置動物は、アナフィラキシー反応、アレルギー反応、または顕著な体重減少を示さず、正常なコントロール動物と同じくらい健康であったことから、１（ＬＤ_５０＝５６．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）及び３（ＬＤ_５０＝１７７．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）^３５と比較して毒性が有意に低いことが示された。実験期間終了時に、すべての動物を安楽死させて、肝臓、肺、腎臓、及び脾臓の組織をShackelford et al. ^３６に記載のガイドドライに従って病理組織学的に評価し、症候性病変について分類した。病理組織学的評価としては、１）肝臓におけるグリコーゲン沈着、炎症性細胞浸潤、及び病巣壊死、２）腎臓における尿細管の再生、炎症性細胞浸潤、及び慢性の進行性腎症、ならびに３）肺における炎症性細胞浸潤及び腺腫があった。９ａで処置したマウス及び未処置のマウスの組織双方の組織で数個の顕微鏡的病変が観察されたものの、すべての病変は自然発生した病変であり、９ａ投与に関連するものではないと考えられた。ゆえに、９ａ処置動物は、肝臓、脾臓、腎臓及び肺パラメータによる悪影響はなかった。したがって、これらの動物は、３００ｍｇ／ｋｇの９ａによる処置に明らかに耐えられ、許与できる安全プロフィールの兆候であった。

【0052】

我々は、正常組織に対する毒物学的な改善が１の２０−位置のスルホニルアミジン側鎖の導入に関連すると推測する。驚くべきことに、この修飾はＴｏｐｏＩに対する阻害効果を損なわず、閉環ラクトン部分を安定化させ、１の生物活性の改善に寄与するラクトンの開環を防止する可能性がある。代謝及び薬物動態の評価、さらには１のＣ−７位置へのスルホニルアミジン側鎖の導入を含む研究が、現在、この推測に対処するために進行中である。

【0053】

要約すると、新規な一連の２０（Ｓ）−スルホニルアミジン１−誘導体を設計、合成したが、この際、鍵となる工程がＣｕ触媒によるワンポット反応(Cu-catalyzed one pot reaction)であった。１２種の誘導体はすべて３に匹敵するまたは３より優れた細胞毒性を示した。特に、化合物９ａは、多剤耐性ＫＢｖｉｎ細胞に対して、１と同等に強力であり、３よりかなり強力であった。新規な誘導体のＩＣ_５０値は０．０２６〜１１μＭであったことから、２０−スルホニルアミジン側鎖におけるＲ^１およびＲ^２基が新規な１−誘導体の細胞毒性に非常に影響を及ぼすことが示され、これにより重要なＳＡＲ情報が得られた。また、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ量の９ａは、確立されたヒトＨＣＴ１１６結腸直腸腺癌を有するマウスで顕著な抗腫瘍活性を示し、この際、すべての試験した投与量で有意な体重変化はなかった。加えて、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量グループで、それぞれ、８匹のマウスのうち２匹および８匹のマウスのうち３匹が完全退縮(regression)を示した。マウスの肝臓、脾臓、肺および腎臓における急性毒性の病理組織学的評価では、３００ｍｇ／ｋｇの９ａ処置の悪影響はなかった。これらのポジティブな結果により、臨床試験の抗癌剤候補(anticancer clinical trial candidate)となる可能性があるものとして９ａ−関連化合物を開発する根拠が明確にある。

【0054】

実験セクション
一般的な化学情報 Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ酸及びＴＦＡはGL Biochem (Shanghai) Companyから購入した。ＤＩＰＣ及びＤＭＡＰはSigma Chemical Company (China)から購入した。他の試薬及び溶媒は市販の供給元から購入しそのまま使用した。出発物質１を、中国の薬草C. acuminataから単離し、精製した後使用した（９８％超純度）。シリカゲル６０ ＧＦ２５４(Qingdao Haiyang Chemical Co.、Ltd.)を用いたシリカゲルプレートで、分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）を行った。融点は、コッフラー融点装置(Kofler melting point apparatus)でとり、修正しなかった。ＩＲスペクトルをＮＩＣ−５ＤＸ分光光度計で得た。ＭＳ分析をZAB-HS装置およびBruker Daltonics APEXII49e装置で行った。ＮＭＲスペクトルを、ＴＭＳを参考として用い、４００ＭＨｚでBruker AM-400NMRスペクトロメータで記録した(Bruker Company, USA)。すべての試験化合物の純度を、Ｃ−１８結合相カラム(C-18 bounded-phase column)(Eclipse Plus C18、５μＭ粒径、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ)を備えたＨＰＬＣ(Agilent Technologies 1100 series)によって測定した。ＭｅＯＨ及び水を移動相として用いて勾配溶離を行い、２５４ｎｍでモニターした。すべての試験化合物は９５％を超える純度を有していた。

【0055】

鍵となる中間体７および８の合成 適当なＮ−Ｂｏｃ−アミノ酸（３．１３ｍｍｏｌ）を２００ｍＬの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２に室温で溶解した。この溶液に、ＤＩＰＣ（０．５ｍＬ、３．１３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３．１３ｍｍｏｌ）、及び１（３．１３ｍｍｏｌ）を０℃で加えた^１６。この反応混合物を室温まで加温し、１６時間放置した。次に、この溶液を０．１Ｎ ＨＣｌで洗浄し、乾燥し、減圧下で蒸発させて、白色固体を得、これをＭｅＯＨで再結晶化して、Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ酸１エステル誘導体（７）を５６〜８７％の収率で得た。次に、この中間体（７、１ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）及びＴＦＡ（１０ｍＬ）の混合液に溶解し、室温で１時間撹拌した。溶媒を除去し、残った固体をＣＨ_２Ｃｌ_２及びジエチルエーテルで再結晶化して、対応するＴＦＡ塩（８）を５７〜８２％の収率で得た。

【0056】

化合物９ａ〜９１の一般的な合成方法 トリエチルアミン（１．２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３５ｍＬ）におけるＴＦＡ塩８（０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液にゆっくり加え、この混合物を透明な溶液を得られるまで１０分間撹拌した。Ｎ_２雰囲気下で、アルキン（０．５ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホニルアジド（０．６ｍｍｏｌ）、及びＣｕＩ（０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で２〜６時間撹拌した。ＴＬＣによってモニターして、反応が終了した後、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（４ｍＬ）及びＮＨ_４Ｃｌ水溶液（６ｍＬ）を加えることによって希釈した。この混合物をさらに３０分間撹拌し、２層を分離した。水層をＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ×３）で抽出した。有機層をあわせたものをＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。未精製残渣を、ＣＨＣｌ_３−ＭｅＯＨ（１０：１〜２０：１）を溶離液として用いてＳｉゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、９ａ〜９１を得た。

【0057】

【化13】

【0058】

【化14】

【0059】

【化15】

【0060】

【化16】

【0061】

【化17】

【0062】

【化18】

【0063】

【化19】

【0064】

【化20】

【0065】

【化21】

【0066】

【化22】

【0067】

【化23】

【0068】

【化24】

【0069】

細胞系および細胞毒性アッセイ 本操作で使用したヒト腫瘍細胞系は、Ａ−５４９（肺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（トリプルネガティブ乳癌(triple-negative breast cancer)）、ＤＵ−１４５（ホルモン非感受性(hormoneーinsensitive)前立腺癌）、ＫＢ（鼻咽頭の表皮癌から最初に単離）、ＫＢｖｉｎ（ビンクリスチン耐性ＫＢサブライン）およびＨＣＴ１１６（結腸直腸腺癌）であった。ＫＢｖｉｎ以外の、これらの細胞系を、Lineberger Comprehensive Cancer Center (UNC-CH)からまたはＡＴＣＣ(Manassas, VA)から得た。なお、ＫＢｖｉｎは、Professor Y.-C. Cheng (Yale University)からの惜しみない贈り物であった。すべての細胞系を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ(HyClone)を含み、１０％加熱不活性化胎児ウシ血清(HyClone)、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、及び０．２５μｇ／ｍＬ アンホテリシンＢ(Cellgro)を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で空気中で５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中で、維持、アッセイした。化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中で１０ｍＭで調製し、細胞成長に影響のない濃度である、０．０１％（ｖ／ｖ）以下の最終ＤＭＳＯ濃度となるように培地で希釈した。４〜６×１０^３細胞／ウェルを、３７℃で９６ウェルプレート中で様々な濃度の試験化合物と共に７２時間培養した。化合物の抗増殖活性を、開発した方法に従ってスルホローダミンＢアッセイによって測定し、ＮＣＩ^３０で確認し、７２時間連続処置した後のベヒクルコントロールと比べて５０％細胞数が減少した、ＩＣ_５０（μＭ）値として表す。各アッセイを重複サンプルで３連で行った。

【0070】

形態学的観察 培養細胞の形態学的な変化を位相差顕微鏡下で観察し、デジタルカメラ(Nikon, Japan)で撮影した。

【0071】

アポトーシス評価 アポトーシスをアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム二重染色キット(Annexin V-FITC/propidium iodide double staining kit)(BD Biosciences)によって検出した。Ａ−５４９細胞を９ａで２４時間または４８時間処置した。細胞をトリプシン処理によって集め、氷冷したＰＢＳで洗浄した。暗所で室温で１５分間、細胞をアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで標識した。標識細胞をFACSCaliburフローサイトメーター(flow cytometer)(Becton Dickinson)で分析した。

【0072】

細胞サイクルの分析 Ａ−５４９細胞を氷冷した７０％ＥｔＯＨで固定化した後、ヨウ化プロピジウムで染色した。サンプルについて、細胞サイクル測定のためにフローサイトメーターで分析した。各細胞サイクル相の集団を、倍数性（サブ−Ｇ１として＜２Ｎ；Ｇ１として２Ｎ；Ｓとして２Ｎ〜４Ｎ；Ｇ２／Ｍとして４Ｎ）に基づいて算出し、ステューデントのｔ−検定(Student’s t-test)によって統計学的に評価し（Ｐ ＜０．０１）。

【0073】

ウェスタンブロット分析 細胞をプロテイナーゼ阻害剤及びをホスファターゼ阻害剤を含むＰＢＳ中で集め、超音波処理した。全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、イモビロンＰ膜(Immobilon P membrane)(EMD Millipore)に移した。この膜を１次抗体とインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役２次抗体(EMD Millipore)で標識した。化学発光基質キット(Chemilluminence substrate kit)(EMD Millipore)を膜結合ＨＲＰの検出に使用し、Luminsence image analyzer, LAS4000 (Fuji Photo Film Co., Japan)によって可視化した。

【0074】

抗体 カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、ＰＡＲＰ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）、ＡＴＭ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＲ（Ｓｅｒ４２８）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｃｈｋ２（Ｔｈｒ６８）、Ｃｈｋ２、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）、及びｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５）に対する抗体を、Cell Signaling Technologyから購入した。ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｃｈｋ１、及びＰＵＭＡに対する抗体を、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。ＴｏｐｏＩ、ＴｏｐｏＩＩα、ＴｏｐｏＩＩβ、ｐ５３、ＦＡＤＤ、ＢＡＸ、Ｂｃｌ−ｘＬ、及びＢｃｌ−２に対する抗体を、BD Biosciencesから購入した。β−アクチンに対する抗体を、EMD Milliporeから購入した。

【0075】

無細胞系でのトポイソメラーゼＩ活性アッセイ １単位の組換えヒトトポイソメラーゼＩ酵素(TopoGEN)を、最終容積が２０μＬとなるような量の反応バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１ｍＭ スペルミジン、５％ グリセロール）中でベヒクル、９ａ、１、３、またはＳＮ−３８と共に３７℃で２０分間予めインキュベートした後、２５０ｎｇの超らせんプラスミドＤＮＡと共に２０分間インキュベートした。この超らせんの、緩和した、または切断したＤＮＡ(supercoiled, relaxed, or nicked DNA)を、１×ＴＡＥ（トリス−アセテート−ＥＤＴＡ（Tris-Acetate-EDTA)）バッファーにおける１％アガロースゲルによって分離した。エチジウムブロマイド染色アガロースゲルを、Gel Doc XR(Bio-Rad)を用いて撮影した。

【0076】

トポイソメラーゼＩ活性アッセイ ＴｏｐｏＩ活性試験を、製造社の指示に従ってアッセイキット(TopoGEN)を用いて行った。９ａで処置したＡ−５４９細胞の核抽出物を、超らせんＤＮＡ（ＴｏｐｏＩについて）または鎖状に連結したｋＤＮＡ(catenated kDNA) （ＴｏｐｏＩＩについて）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。反応混合物を１×ＴＡＥバッファーにおける１％アガロースゲルによって分離した。このゲルをエチジウムブロマイドで染色し、Gel Doc XR(Bio-Rad)を用いて写真に撮った。

【0077】

異種移植モデル抗腫瘍アッセイ ５〜６週齢のメスｎｕ／ｎｕマウス(National Laboratory Animal Center, Taiwan)の脇腹に、２×１０^６個のヒト結腸直腸腺癌ＨＣＴ１１６細胞を皮下接種した。移植した腫瘍の容積が２００ｍｍ^３の平均容積に達したら、マウスを任意に４グループ（ｎ＝８）に分けた。処置レジメを表２に示す。ベヒクルコントロールおよび５または１０ｍｇ／ｋｇの化合物９ａを、７日間、１日に１回（ＱＤ）ｉ．ｖ．投与した後、最後まで１日に１回ｉ．ｐ．投与した。実験コントロールグループでは、１００ｍｇ／ｋｇの化合物３を週に１回（ＱＷＫ）ｉ．ｖ．投与した。移植片の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）を最後まで３〜４毎に測定し、腫瘍容積をＬＷ^２／２として算出した。結果をステューデントのｔ−検定 (Student’s t-test)によって統計学的に評価した。この研究は、National Taiwan University (Taipei, Taiwan)のInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)から承認され、機関のガイドラインに従って行った。

【0078】

インビボ毒性の病理学的評価 ６０匹の８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウス(National Laboratory Animal Center, Taipei, Taiwan)を用いて、単回投与毒性を評価した。マウスを任意に６グループ（ｎ＝１０）に分けて、０日に０（ベヒクルのみ）、３０、１００、２００、または３００ｍｇ／ｋｇの９ａを１回ｉ．ｐ．注射により投与した。１グループを正常コントロールとして処置しなかった。体重を１５日間３日毎に測定した。実験期間の終了時に、すべての動物をＣＯ_２によって安楽死させ、肝臓、肺、腎臓及び脾臓の組織を秤量した（データは示さず）。組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。３〜５μｍの厚さの切片を病理組織学的評価用に調製した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色したパラフィン切片について、Shackelford et al.^３６に記載されるガイドラインに従って病理組織学的に評価し、徴候的病変を採点した。病変の程度を、以下のように重篤度によって１〜５に分類した；［有意性なし(Nothing significant)、１＝最少(minimal)（＜１％）、２＝若干(slight)（１〜２５％）、３＝少し(moderate)（２６〜５０％）、４＝中程度(moderately severe)（５１〜７５％）、５＝重篤／高い(severe/high)（７６〜１００％）］。統計学的に有意な結果（Ｐ＜０．０５）が示された。本研究は、China Medical University (Taichung, Taiwan)のInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認され、機関のガイドラインに従って行った。

【0079】

略称
ＡＴＭ、変異型毛細血管拡張性運動失調症(ataxia telangiectasia mutated)；ＡＴＲ、Ｒａｄ３関連毛細血管拡張性運動失調症(ataxia telangiectasia and Rad3-related)；Ｃｈｋ、チェックポイントキナーゼ(checkpoint kinase)；ＣＰＴ、カンプトセシン；ＤＩＰＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＭＡＰ、４−ジメチルアミノピリジン；ＦＡＤＤ、Ｆａｓ結合デスドメインタンパク質(Fas-associated protein with death domain)；ＰＵＭＡ、アポトーシスｐ５３上方調節モジュレーター(p53 upregulated modulator of apoptosis)；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；Ｔｏｐｏ、トポイソメラーゼ。

【0080】

実施形態ＩＩ
化合物１０ａ〜１０ｔを合成し、実施形態Ｉに記載されるのと同様の方法を用いて同定し、これらを表３に示す。

【0081】

【化25】

【0082】

トリエチルアミン（１．２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３５ｍＬ）における様々なＴＦＡ塩８（０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液にゆっくり添加し、この混合物を１０分間撹拌すると、透明な溶液が得られた。Ｎ_２雰囲気下で、アルキン（０．５ｍｍｏｌ）、スルホニルアジド（０．６ｍｍｏｌ）、及びＣｕＩ（０．０５ｍｍｏｌ）を室温でこの反応混合物に添加した。ＴＬＣによってモニターして、反応が終了した後、反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（４ｍＬ）及びＮＨ_４Ｃｌ水溶液（６ｍＬ）を加えることによって希釈した。この混合物をさらに３０分間撹拌し、２層を分離した。水層をＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ×３）で抽出した。有機層をあわせたものをＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。未精製残渣を、適当な溶出溶媒系を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。

【0083】

【表3】

【0084】

ヒト腫瘍細胞系に対する化合物１０ａ〜ｔのインビトロでの細胞毒性を表４に示す。

【0085】

【表4】

【0086】

【化26】

【0087】

【化27】

【0088】

【化28】

【0089】

【化29】

【0090】

【化30】

【0091】

【化31】

【0092】

【化32】

【0093】

【化33】

【0094】

【化34】

【0095】

【化35】

【0096】

【化36】

【0097】

【化37】

【0098】

【化38】

【0099】

【化39】

【0100】

【化40】

【0101】

【化41】

【0102】

【化42】

【0103】

【化43】

【0104】

【化44】

【0105】

【化45】

【0106】

実施形態ＩＩＩ
より多くの誘導体を合成し、実施形態Ｉに記載されるのと同様の方法を用いることによって同定し、これらを表５に示す。

【0107】

表５のいくつかの化合物の４種のヒト腫瘍細胞系に対するインビトロでの細胞毒性を表６に示す。

【0108】

【表5-1】

【0109】

【表5-2】

【0110】

【表5-3】

【0111】

【表5-4】

【0112】

【表5-5】

【0113】

【表6】

【0114】

【化46】

【0115】

【化47】

【0116】

【化48】

【0117】

【化49】

【0118】

【化50】

【0119】

【化51】

【0120】

【化52】

【0121】

【化53】

【0122】

【化54】

【0123】

【化55】

【図1】

【図2】

【図3】