特許 6183358 ３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6183358

(24)【登録日】2017年8月4日

(45)【発行日】2017年8月23日

(54)【発明の名称】３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 13/00 20060101AFI20170814BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170814BHJP

【ＦＩ】

   C12P13/00

   C12N15/00 AZNA

【請求項の数】13

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2014-518304(P2014-518304)

(86)(22)【出願日】2013年3月5日

(86)【国際出願番号】JP2013056025

(87)【国際公開番号】WO2013179711

(87)【国際公開日】20131205

【審査請求日】2015年9月30日

(31)【優先権主張番号】特願2012-122388(P2012-122388)

(32)【優先日】2012年5月29日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000066

【氏名又は名称】味の素株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(74)【代理人】

【識別番号】100113103

【弁理士】

【氏名又は名称】香島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】正瑞 文

(72)【発明者】

【氏名】田島 義教

(72)【発明者】

【氏名】横山 敬一

【審査官】 鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−２８３１６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／００５０９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００８−０２９３２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Biol. Chem., 2006, Vol.281, No.48, pp.36944-36951

【文献】 Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol.1475, pp.10-16

【文献】 J. Bacteriol., 2007, Vol.189, No.5, pp.2155-2159

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １３／００−１３／２４

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が非改変株と比較して増大するように改変された３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有する微生物であって、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性が非改変株と比較して増大するように改変された微生物を培養して、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成することを含む、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。

【請求項2】

前記Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性の増大が、ＮｈｏＡをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＮｈｏＡが、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つに記載のタンパク質である、請求項２に記載の方法：
（Ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ＩＩ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質；あるいは
（ＩＩＩ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。

【請求項4】

前記ＮｈｏＡをコードするＤＮＡが、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＤＮＡである、請求項２に記載の方法：
（ｉ）配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ；あるいは
（ｉｉ）配列番号３に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項5】

微生物がエシェリヒア属、パントエア属、またはコリネバクテリウム属に属する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

微生物が、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、またはコリネバクテリウム・グルタミカムに属する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＧｒｉＩが、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記ＧｒｉＨが、下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれか一つに記載のタンパク質である、請求項８に記載の方法：
（Ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｆ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。

【請求項10】

前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子であり、ｇｒｉＩ遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡであり、かつ、ｇｒｉＨ遺伝子が、下記（ｃ）または（ｄ）に記載のＤＮＡである、請求項７に記載の方法：
（ａ）配列番号１０の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１２の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｄ）上記（ｃ）に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するＤＮＡ。

【請求項11】

以下（１）および（２）を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法：
（１）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること；および
（２）３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化して、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること。

【請求項12】

以下（１’）および（２’）を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法：
（１’）請求項１１に記載の方法により３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること；および
（２’）３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化して、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーを得ること。

【請求項13】

前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の製造方法などに関する。

【背景技術】

【0002】

アミノヒドロキシ安息香酸類は、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体や、高性能耐熱性高分子ポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用である。３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）を基質として、アミノ基を持ったＣ４化合物とＣ３あるいはＣ４化合物との炭素−炭素結合反応を触媒する酵素であるＧｒｉＩ、ならびにＣ７化合物の環化あるいはＣ８化合物の脱炭酸を伴った環化を触媒する酵素であるＧｒｉＨの双方によって２段階で生合成される。

【0003】

【化1】

【0004】

ところで、３，４−ＡＨＢＡは不安定であり、容易に酸化されて２−アミノフェノキサジン−３−オン−８−カルボン酸（ＡＰＯＣ）を生じる（下記参照）。特許文献１には、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）の製造において、副生成物として生じた３，４−ＡＨＢＡが培養液中において経時的にＡＰＯＣに変換されることが記載されている。一方、３，４−ＡｃＡＨＢＡは、３，４−ＡＨＢＡに比し安定である。この理由は、アセチル化により安定化され、上述の酸化が回避できるためである。３，４−ＡｃＡＨＢＡは、酸や塩基などで処理することにより、３，４−ＡＨＢＡに容易に変換できる。３，４−ＡｃＡＨＢＡは、酸化されてＡＰＯＣを生じる不安定な３，４−ＡＨＢＡよりも、取り扱い易い。したがって、３，４−ＡｃＡＨＢＡの優れた製造方法の開発が求められている。

【0005】

【化2】

【0006】

本発明に関連する先行技術としては、以下がある。
特許文献１には、３，４−ＡｃＡＨＢＡの製造において、副生成物として生じた３，４−ＡＨＢＡが培養液中において経時的にＡＰＯＣに変換されることが記載されている。特許文献１はまた、３，４−ＡｃＡＨＢＡを脱アセチル化処理して３，４−ＡＨＢＡを生成することを開示している。
特許文献２には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨを導入したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いることにより３，４−ＡＨＢＡが生成されることが開示されている。
非特許文献１には、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨのエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）への導入により３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡが生成されることが開示されている。
非特許文献２には、ストレプトマイセス・グリセウスにおいてアリールアミン Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｎａｔＡ）を欠失させると、培養中に３，４−ＡｃＡＨＢＡが生成されなくなることが開示されている。
非特許文献３には、エシェリヒア・コリ由来のＮ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｈｏＡ）の機能として、芳香族アミノ基に対するアセチル化を触媒することが開示されている。一方、非特許文献４には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＰ１株が３，５−ＡＨＢＡ（３，４−ＡＨＢＡの構造異性体）の副生物としてＮ−アセチル化体（３，５−ＡｃＡＨＢＡ）を生成すること、ならびにＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＰ１のｎｈｏＡ遺伝子欠損株（ＭＡＲ１株）においても、３，５−ＡｃＡＨＢＡが副生するため、ＮｈｏＡが３，５−ＡＨＢＡのＮ−アセチル化の主要な要因ではないと考えられることが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２００４−２８３１６３号公報

【特許文献2】国際公開第２０１０／００５０９９号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６），３６９４４−３６９５１

【非特許文献2】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９（２００７），２１５５−２１５９

【非特許文献3】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４７５（２０００），１０−１６

【非特許文献4】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，ｖｏｌ．５９（２００６），ｐ．４６４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、安定な化合物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、微生物を用いたプロセスにより、簡便かつ効率的に製造する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、鋭意検討した結果、エシェリヒア・コリにおける３，４−ＡＨＢＡからの３，４−ＡｃＡＨＢＡの副生にはｎｈｏＡが関与することを見出した。本発明者らはまた、ＮｈｏＡ活性が増大するように改変された微生物の使用により、ＡＨＢＡの副生を伴わず、ＡｃＡＨＢＡを生成できること等を見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性が増大するように改変された３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有する微生物であって、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性が増大するように改変された微生物。
〔２〕前記Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性の増大が、ＮｈｏＡをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、〔１〕の微生物。
〔３〕前記ＮｈｏＡが、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか一つに記載のタンパク質である、〔２〕の微生物：
（Ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ＩＩ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質；あるいは
（ＩＩＩ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
〔４〕前記ＮｈｏＡをコードするＤＮＡが、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載のＤＮＡである、〔２〕の微生物：
（ｉ）配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｉｉ）配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
〔５〕微生物がエシェリヒア属、パントエア属、またはコリネバクテリウム属に属する、〔１〕〜〔４〕のいずれかの微生物。
〔６〕微生物が、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、またはコリネバクテリウム・グルタミカムに属する、〔１〕〜〔５〕のいずれかの微生物。
〔７〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能が、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることにより付与された、〔１〕〜〔６〕のいずれかの微生物。
〔８〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質が、ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨである、〔７〕の微生物。
〔９〕前記ＧｒｉＩが、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか一つに記載のタンパク質であり、かつ、前記ＧｒｉＨが、下記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれか一つに記載のタンパク質である、〔８〕の微生物：
（Ａ）配列番号９または配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｃ）上記（Ａ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号１１または配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｅ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質；
（Ｆ）上記（Ｄ）に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質。
〔１０〕前記３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つに記載のＤＮＡであり、かつ、ｇｒｉＨ遺伝子が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つに記載のＤＮＡである、〔７〕の微生物：
（ａ）配列番号１０または配列番号１９の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）上記（ａ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）上記（ａ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、アルドラーゼ活性を有するＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１２または配列番号２１の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｅ）上記（ｄ）に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）上記（ｄ）に示す塩基配列に対して７０％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するＤＮＡ。
〔１１〕〔１〕〜〔１０〕のいずれかの微生物を培養して、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成することを含む、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
〔１２〕以下（１）および（２）を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法：
（１）〔１１〕の方法により３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること；および
（２）３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化して、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること。
〔１３〕以下（１’）および（２’）を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法：
（１’）〔１２〕の方法により３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること；および
（２’）３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化して、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーを得ること。
〔１４〕前記ポリマーが、ポリベンゾオキサゾールポリマーである、〔１３〕の方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、安定な化合物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、簡便かつ効率的に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、逆相カラムクロマトグラフィーによる、（ａ）エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株の培養上清液、（ｂ）エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養上清液、および（ｃ）３，４−ＡＨＢＡ標準品の分析結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有する微生物を提供する。本発明の微生物を用いると、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）の生成が促進され、その結果、培養液中において、非アセチル化体である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）の蓄積が抑制され得る。

【0015】

＜１＞Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）の活性を増大させる改変
本発明の微生物は、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）活性を増大させるように改変することにより、３，４−ＡｃＡＨＢＡの生成を促進し、その結果、培養液中において３，４−ＡＨＢＡの蓄積が抑制され得る。ＮｈｏＡ活性とは、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性であり、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）との関係では、３，４−ＡＨＢＡから３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡｃＡＨＢＡ）を生成する活性をいう。

【0016】

「ＮｈｏＡ活性が増大するように改変された」とは、ＮｈｏＡ活性が、非改変株、例えば、野生株の微生物の比活性よりも高くなったことをいう。ＮｈｏＡ活性は、非改変株と比較して、菌体当たり１５０％以上、好ましくは１８０％以上、さらに望ましくは菌体当たり２００％以上に増大されていることが好ましい。本発明の微生物は、野生株又は非改変株よりＮｈｏＡ活性が増加していればよいが、さらにこれらの株に比べて３，４−ＡｃＡＨＢＡの蓄積が向上していることがより望ましい。また、「ＮｈｏＡ活性が増大するように改変された」とは、例えば、細胞あたりのＮｈｏＡの分子数が増加した場合や、分子あたりのＮｈｏＡ活性が増加した場合等が該当する。具体的には、ＮｈｏＡ活性を増加させるための改変は、通常の変異誘発処理又は遺伝子工学的な処理により導入されてもよい。変異誘発処理の例としては、Ｘ線又は紫外線照射、変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる処理等が挙げられる。このような改変の例としては、ＮｈｏＡ活性が非変異株と比較して増大するよう、染色体上のｎｈｏＡ遺伝子（発現調節領域を含む）に変異を導入することが挙げられる。好ましくは、このような改変は、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで所望の微生物を形質転換することにより達成できる。

【0017】

標的酵素の活性及び活性の増大の程度は、候補菌株から得られる細胞抽出物又はその精製分画を用いて酵素活性を測定し、それを野生株又は非改変株の活性と比較することにより確認され得る。例えば、ＮｈｏＡ活性は、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４７５（２０００），１０−１６に記載の方法により測定され得る。

【0018】

ＮｈｏＡ活性が増大するように改変される微生物としては、３，４−ＡＨＢＡ産生能を固有に有する微生物、および３，４−ＡＨＢＡ産生能を固有に有しないものの、３，４−ＡＨＢＡ産生能が付与された微生物が挙げられる。３，４−ＡＨＢＡ産生能の付与は、後述する方法により行うことができる。本発明で用いられる微生物としては、例えば、細菌、放線菌、菌類が挙げられるが、これに限定されない。微生物は、好ましくは、エシェリヒア属に属する細菌、パントエア属に属する細菌、またはコリネ型細菌である。

【0019】

本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｆ． Ｃ． Ｅｄ． １９９６． Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｐｐ． ２４７７−２４８３． Ｔａｂｌｅ １． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）に記述されている系統のものが含まれる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）またはその亜株（例、ＢＷ２５１１３（ＣＧＳＣ７６３０）、ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３７４７）、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５））、Ｂ株またはその亜株（例、ＢＬ２１（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１０２５）、ＲＥＬ６０６（ＣＧＳＣ１２１４９））などが挙げられる。上記菌株のうち、ＣＧＳＣ番号が記載されているものは、Ｔｈｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／）から分譲を受けることができる。また、上記菌株のうち、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）から分譲を受けることができる。

【0020】

パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９３． ４３： １６２−１７３）。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ、パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレアが挙げられる。具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）（欧州特許出願公開第０９５２２２１号明細書）、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）（欧州特許出願公開第０９５２２２１号明細書）などが挙げられる。尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開第０９５２２２１号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

【0021】

コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９９１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含み、具体的には以下のものが例示される（国際公開第２０１０／００５０９９号）。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

【0022】

ＮｈｏＡとしては、配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、ｎｈｏＡ遺伝子としては、配列番号３の塩基配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。

【0023】

アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。

【0024】

微生物の株によってｎｈｏＡ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがある。例えば、ｎｈｏＡ遺伝子をコードするタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつＮｈｏＡ活性を有するタンパク質が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から１００個、より好ましくは１〜５０個、さらにより好ましくは１から３０個、最も好ましくは１〜２０個または１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、ｎｈｏＡ遺伝子を保持する微生物の個体差に基づき天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。

【0025】

上記置換は、機能的に変化しない中性変異である保存的置換であってもよい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、ｐｈｅ，ｔｒｐ，ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、ｌｅｕ，ｉｌｅ，ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、ｇｌｎ，ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、ｌｙｓ，ａｒｇ，ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、ａｓｐ，ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ｓｅｒ，ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、ａｌａからｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕからｇｌｙ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙからｐｒｏへの置換、ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、及び、ｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換などが挙げられる。

【0026】

ｎｈｏＡ遺伝子はまた、配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｈｏＡ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例、同一性または類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。

【0027】

＜２＞ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を増大させる改変
本発明の微生物は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とアスパラギン酸セミアルデヒド（ＡＳＡ）から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（３，４−ＡＨＢＡ）を生成する活性が増大するように改変されたものであってもよい。このような改変は、例えば、ＤＨＡＰとＡＳＡから３，４−ＡＨＢＡを生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで所望の微生物を形質転換することにより達成できる。ＤＨＡＰとＡＳＡから３，４−ＡＨＢＡを生成する活性を有するタンパク質は、ＤＨＡＰおよびＡＳＡからの３，４−ＡＨＢＡの生成に資するものである限り特に限定されず、例えば、ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性（以下、アルドラーゼ活性と略することがある）を有するタンパク質、およびＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性（以下、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性と略することがある）を有するタンパク質が含まれる。以下、両活性を併せて、３，４−ＡＨＢＡ生合成能ということがある。

【0028】

ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＩ遺伝子、又は、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログ（ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＩ遺伝子ホモログを併せて、単にｇｒｉＩ遺伝子ということがある）が挙げられる。ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Ｂｌａｓｔ検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のｎｓｐＩ遺伝子（配列番号１８、１９）、フランキア・エスピー由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＹＰ＿４８３２８２）、同Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７２）、ストレプトマイセス・スカビエス由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ）、バークホルデリア・エスピー３８３由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｑ３９ＮＱ９）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿２４７３７４）、エシェリヒア・コリ由来のｄｈｎＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄａｔａ）。

【0029】

ＤＨＡＰとＡＳＡの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＨ遺伝子、又は、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログ（ｇｒｉＨ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子ホモログを併せて、単にｇｒｉＨ遺伝子ということがある）が挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとは、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、Ｂｌａｓｔ検索を行うことにより、探索することができる。例えば、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来のｎｓｐＨ遺伝子（配列番号２０、２１）、フランキア・エスピー由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ＿４８３２８３）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７１）、バークホルデリア・エスピー３８３由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＹＰ＿３６６５５２）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＹＰ＿３６６５５３）、ストレプトマイセス・スカビエス由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（〈ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ〉）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿２４８２４４）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１， ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄａｔａ）。

【0030】

本発明で用いられるＧｒｉＩおよびＧｒｉＨ、またはｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、任意の生物に由来するものを用いることができる。例えば、上述したような細菌または放線菌等の微生物に由来するものであってもよく、好ましくは、放線菌に由来するものであってもよい。放線菌としては、例えば、ストレプトマイセス属の微生物が挙げられる。ストレプトマイセス属に属する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ムラヤマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒａｙａｍａｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・スカビエス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ）が挙げられる。ＧｒｉＩおよびＧｒｉＨ、またはｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、同一の微生物に由来していてもよいし、異なる微生物に由来していてもよい。

【0031】

ＧｒｉＩホモログとしては、上記ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号９または１８に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１が挙げられる。また、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとしては、上記ｇｒｉＩ遺伝子の塩基配列である配列番号１０または１９に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８または２０が挙げられる。

【0032】

ＧｒｉＨホモログとしては、上記ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列である配列番号１１または２０に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５が挙げられる。また、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとしては、上記ｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列である配列番号１２または２１に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％または９９％以上の同一性を有し、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするものが望ましい。例えば、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２または３４が挙げられる。

【0033】

アミノ酸配列において変異により活性に影響を与えないアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして、タンパク質変異体を作製してもよい。具体的には、当業者は、１）複数のホモログタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。なお、国際公開第２０１０／００５０９９号は、上記ｇｒｉＩ遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント（国際公開第２０１０／００５０９９号の図１及び図２）、上記ｇｒｉＨ遺伝子ホモログのアミノ酸配列のアラインメント（国際公開第２０１０／００５０９９号の図３及び図４）、これらのコンセンサス（共通）配列（国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号３６、３７）を開示している。前記ｇｒｉＩ遺伝子ホモログには、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログには、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号３７のアミノ酸配列をコードする遺伝子が含まれる。

【0034】

アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、上述したように決定することができる。

【0035】

微生物の種類および株によってｇｒｉＩ遺伝子やｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、エシェリヒア・コリ内で発現することにより、例えば、発現を増強することにより、エシェリヒア・コリの３，４−ＡＨＢＡの生産能を向上させることができるものであればよい。例えば、ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質としては、ｇｒｉＩ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号９または１８）において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつアルドラーゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１が挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質としては、ｇｒｉＨ遺伝子をコードするタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号１１または２０）において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を含み、かつ３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質が望ましい。例えば、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５が挙げられる。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から５０個、さらに好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等には、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的置換は、上述したとおりである。

【0036】

さらに、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、所望の微生物で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、微生物の３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、Ｃ末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で５０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下である。より具体的には、Ｎ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸、又はＣ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。

【0037】

このようなｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むようにそのアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２，２８（１９９２））、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ ３７０，３８９（１９９４））、ＳｔＥＰ−ＰＣＲ（Ｚｈａｏ，Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，２５８（１９９８））によって、遺伝子組換えにより人工的にｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子に変異を導入して活性の高い酵素をコードする遺伝子を取得することが出来る。

【0038】

ｇｒｉＩ遺伝子はまた、ｇｒｉＩ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列（例、配列番号１０または１９、あるいは国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８または２０）に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。ｇｒｉＨ遺伝子はまた、ｇｒｉＨ遺伝子またはそのホモログ遺伝子の塩基配列（例、配列番号１２または２１、あるいは国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２または３４）に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであり得る。「ストリンジェントな条件」は、上述したものと同様である。

【0039】

上記遺伝子ホモログ及び保存的置換に関する記載は、本明細書に記載された他の遺伝子についても同様に適用される。

【0040】

これらのｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子ならびにそれらのホモログ遺伝子が発現することにより３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、これらの遺伝子を、フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有する細菌等に導入し、３，４−ＡＨＢＡ生成活性が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。その場合、例えば鈴木らの方法［Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２８１，８２３−８３３（２００６）］に従い、３，４−ＡＨＢＡを逆相クロマトグラフィーにより定量することでより明確に効果を検証することができる。

【0041】

＜３＞組換えベクター
所望の遺伝子を発現ベクターに導入することによって、本発明に用いられ得る組換えベクターを得ることができる。例えば、ｎｈｏＡ、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨのすべてが用いられる場合、それぞれ発現可能な状態で形質転換体に含まれる限り、それぞれ別の組換えベクターに搭載して形質転換に用いても良いし、ｎｈｏＡ、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨを適当なスペーサーにより連結して、同一の組換えベクターに搭載し、形質転換に用いても良い。また、ｇｒｉＩとｇｒｉＨは同一の微生物に由来する遺伝子であってもよいし、異種微生物に由来する遺伝子であってもよい。同一の微生物に由来する遺伝子であり、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨは染色体上の近接した位置に存在する場合は、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨの双方を含む部位においてＤＮＡを切り出し、ベクターに搭載しても良い。

【0042】

本発明に使用する組換えベクターは、一般にプロモーター、前述の本発明のＤＮＡ、例えばｎｈｏＡ、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨ、および組換え微生物中で該遺伝子を発現させるために必要な制御領域（オペレーターやターミネーター）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。

【0043】

組換えベクターとして使用できる発現ベクターは特に制限されず、所望の微生物中で機能し得るベクターであればよく、プラスミドのように染色体外で自立増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。具体的には、発現ベクターとしては、エシェリヒア属またはパントエア属に導入する場合には、腸内細菌群に属する細菌の中で自律複製可能なプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９（ｐＨＳＧ、ｐＳＴＶはタカラバイオ社より入手可）、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８（ｐＭＷはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。コリネバクテリウム属に導入する場合には、コリネバクテリウム属に属する細菌の中で自律複製可能なプラスミド、例えば、ｐＣＲＹ３０（特開平３−２１０１８４号公報に記載）、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ（特開平２−７２８７６号公報及び米国特許第５１８５２６２号明細書に記載）、ｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３（特開平１−１９１６８６号公報に記載）、ｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６７９号公報に記載）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報に記載）、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４（特開昭５８−１９２９００号公報に記載）、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報に記載）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報に記載）、ｐＣＧ４およびｐＣＧ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報に記載）、ｐＶＣ７（特開平９−０７０２９１号公報に記載）、ｐＶＫ７（特開平１０−２１５８８３号公報に記載）およびその誘導体が挙げられる。

【0044】

本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、所望の微生物における異種タンパク質生産に通常用いられるプロモーターを使用することができる。例えば、エシェリヒア属またはパントエア属では、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーターなどが知られている。また、コリネバクテリウム属においては、コリネバクテリウム属由来の細胞表層タンパク質であるＰＳ１及びＰＳ２をコードする遺伝子のプロモーター（特表平６−５０２５４８に記載）、及びコリネバクテリウム属由来の細胞表層タンパク質であるＳｌｐＡをコードする遺伝子のプロモーター（特開平１０−１０８６７５）などの強力なプロモーターが挙げられる。

【0045】

＜４＞形質転換体
本発明の微生物は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸産生能を有し、かつ、Ｎ−ヒドロキシアリールアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮｈｏＡ）の活性が増大するように改変されている微生物である限り特に限定されないが、好ましくは形質転換体である。本発明の形質転換体は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換されることが好ましい。

【0046】

宿主として用いられる微生物は、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒドおよびアセチル基ドナー（例、アセチルＣｏＡ）を効率的に供給できる微生物であることが好ましい。微生物のアスパルトキナーゼ（ＡＫ）は、本来、リジン等のアミノ酸による協奏的フィードバック阻害を受ける。例えば、エシェリヒア・コリは、非共役酵素であり、単独で機能するアスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫＩＩＩ）を有する。エシェリヒア・コリのＡＫＩＩＩは、本来、リジンによるフィードバック阻害を受ける。一方、コリネ型細菌のＡＫは、αサブユニットとβサブユニットからなるヘテロ蛋白質であり、αサブユニットとβサブユニットの遺伝子上のコード領域は一部重複していることが知られている。コリネ型細菌のＡＫは、本来、リジンとスレオニンによる協奏的フィードバック阻害を受ける。微生物としては、フィードバック阻害を実質的に解除する変異を持ったＡＫ遺伝子を有する微生物が特に好ましい。

【0047】

リジン等のアミノ酸によるフィードバック阻害を解除し得る変異は、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、セラチア・マルセッセンス等の種々の微生物由来のアスパルトキナーゼについて報告されている。エシェリヒア・コリのＡＫＩＩＩについて、リジンによるフィードバック阻害を解除し得る変異としては、例えば、２５０位のグルタミン酸のリジンへの変異（Ｅ２５０Ｋ）、３１８位のメチオニンのイソロイシンへの変異（Ｍ３１８Ｉ）、３４４位のスレオニンのメチオニンへの変異（Ｔ３４４Ｍ）、３４５位のセリンのロイシンへの変異（Ｓ３４５Ｌ）、３５２位のスレオニンのイソロイシンへの変異（Ｔ３５２Ｉ）が報告されている（例、Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７３，２１１−２１５（１９９９）、およびＦａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，５７７−５８２（１９９５）を参照）。また、コリネ型細菌のＡＫについて、フィードバック阻害を解除し得る変異について、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ＡＴＣＣ１３８６９由来の野生型ＡＫのαサブユニット（例、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号３８を参照）を例に挙げて説明する。ＡＫのフィードバック阻害を解除するには、αサブユニット上の位置で表すと、Ｎ末端から２７９番目のアラニン残基がスレオニン残基に、あるいはＮ末端から３１１番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に、あるいはＮ末端から３０１番目のセリン残基がチロシン残基に、あるいはＮ末端から３８０番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に、あるいはＮ末端から３０８番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に、あるいはＮ末端から３２０番目のアルギニン残基がグリシン残基に、あるいはＮ末端から３４５番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に、それぞれ置換するような変異を導入することにより達成される（国際公開第９４／２５６０５号、国際公開第００／６３３８８号、米国特許６８４４１７６号公報、国際公開第０１／０４９８５４号等）。なお、ＡＫは、野生型であってもその由来するコリネ型細菌の種類や株によって、国際公開第２０１０／００５０９９号の配列番号３８に示した配列と比較して数個のアミノ酸残基の相違があるものがあり、このようなアレル変異体であってもよい。このような変異の定義は、前述のｇｒｉＩおよびｇｒｉＨについて述べたものと同義である。

【0048】

本発明では、上述したような変異が導入されたＡＫ遺伝子を有する微生物を用いることができる。なお、ＡＫについては、野生型であってもその由来する微生物の種類および株によって数個のアミノ酸残基の相違があるものがあり、このようなアレル変異体を用いてもよい。アレル変異体について前記フィードバック阻害を解除するための改変部位は、当業者にとって公知の配列アラインメントを実施することにより対応する箇所を特定することができる。ＡＫのフィードバック阻害を解除するための改変は、当業者にとって公知の方法、例えば、２−アミノエチルシステイン等のリジンアナログに耐性を有する変異株の取得や相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入によって達成できる。また、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫ遺伝子を含むプラスミドを用いて微生物を形質転換することによっても、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫの活性を強化した微生物を得ることができる。

【0049】

また、フィードバック阻害を解除した変異型ＡＫ遺伝子を有する微生物は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化したものであってもよい。

【0050】

ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターによる微生物の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５））、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，１０６７−１０７０（１９８９））等を使用することができる。ＡＫのフィードバック阻害を解除するための形質転換を行う場合、３，４−ＡＨＢＡ生成活性を付与するための形質転換とＡＫのフィードバック阻害を解除するための形質転換のいずれを先に行っても良い。

【0051】

＜５＞３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法、ならびに当該製造方法を利用する３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類およびそれを構成単位として含むポリマーの製造方法
＜５−１＞３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法
本発明は、本発明の微生物を培養して、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成することを含む、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法を提供する。３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類は、ジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒドおよびアセチル基ドナー（例、アセチルＣｏＡ）から生合成され得る。したがって、微生物は、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒドおよびアセチル基ドナー（例、アセチルＣｏＡ）を効率的に供給できる微生物であることが好ましい。また、ジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒドおよびアセチル基ドナーを多量に含有する培地中で、微生物を培養してもよい。

【0052】

本発明における３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類には、以下の構造を有する３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸(「３，４−ＡｃＡＨＢＡ」と略すことがある)並びにその誘導体およびその塩が含まれる。

【0053】

【化3】

【0054】

３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の誘導体は、（１）１位のカルボキシル基、３位のアセチルアミノ基および４位のヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１つの基が誘導体化されているか、または（２）１位のカルボキシル基、３位のアセチルアミノ基および４位のヒドロキシル基を保持し、かつ２位、５位および６位の炭素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つの炭素原子上の水素原子が他の原子または基により置換されているか、あるいは（３）上記（１）および（２）の組合せによるものである。上記（２）における他の原子または基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等の炭素原子数１〜６個のアルキル基）、ヒドロキシル基、アルキルオキシ基（アルキル部分は、上記と同様）、アミノ基、モノまたはジアルキルアミノ基（アルキル部分は、上記と同様）、シアノ基、ニトロ基、スルホニル基、カルボキシル基が挙げられる。具体的には、上記（１）の誘導体としては、例えば、１位のカルボキシル基が誘導体化された誘導体（例、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸のカルボキシル基がアルデヒド化された３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）、３位のアセチルアミノ基の水素原子が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、３−アセチルアルキルアミノ誘導体）、および４位のヒドロキシ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、４−アルキルオキシ誘導体）が挙げられる。
塩としては、カルボン酸のアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。

【0055】

本発明の微生物を培養し、培地中で生産される３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収することによって、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を製造することができる。

【0056】

本発明の微生物を培養するための培地は、所望の微生物が生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。培養温度は、通常、２５℃〜４２℃であり、ｐＨは５〜８に制御することが望ましい。培養時間は、通常、２０時間〜９０時間である。

【0057】

本発明の微生物の培養は、酸素供給律速条件下で行うことが望ましい。具体的には菌体生育が対数増殖期に移行した段階で２．０ｐｐｍ以下に保持されることが望ましい。

【0058】

該培養液から３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収・精製する工程で用いる回収方法は、公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、該培養液を３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の溶解性の高い酸性ｐＨに調整してから、菌体を遠心分離や膜ろ過等の方法により除去した培養液上清から回収することが好ましい。菌体を除去した培養液上清からからの３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の回収方法としては、多孔性吸着剤による精製、晶析、沈殿化などが挙げられる。

【0059】

本発明において使用される多孔性吸着剤とは、表面積の大きな多孔質の固型吸着剤であり、具体的には、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、ボーキサイト、マグネシア、活性白土、アクリル系合成吸着剤等に代表される親水性吸着剤、木炭、骨炭、活性炭、芳香族系合成吸着剤等に代表される疎水性吸着剤が挙げられる。本発明においては、不純物を吸着することよって３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上できるものであれば特に限定なく使用できる。ただし、多孔性吸着剤によって吸着される不純物とは、主として生化学的合成の過程において生産される芳香族系化合物が多く含有されるので、本発明においてはこれらの化合物が吸着しやすい活性炭や芳香族系合成吸着剤に代表される疎水性吸着剤が好適に用いられる。これら疎水性吸着剤は単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。

【0060】

活性炭が使用される場合には、その原料としては特に限定はなく、例えば木粉、ヤシ殻などの植物原料、無煙炭、石油ピッチ、コークス等の石炭、石油系原料、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂などの合成樹脂系原料などが挙げられる。また活性炭の形状としては粉末状、粒状、繊維状、フィルターやカートリッジ状の二次加工品等があるが特に限定はなく適宜取り扱いやすいものを選択すればよい。

【0061】

一方、芳香族系合成吸着剤が使用される場合には、その原料としては特に限定はないが、例えば１）無置換基型の芳香族系樹脂、２）疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、３）無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂等の多孔性樹脂が使用できる。具体的化合物としては、例えばスチレン‐ジビニルベンゼン系樹脂等が挙げられる。

【0062】

前述したように該培養液中の３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を多孔性吸着剤に接触させる目的は、不純物を多孔性吸着剤に吸着せしめ、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上させることにあるが、不純物と同時に目的生成物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類も該多孔性吸着剤に少なからず吸着されてしまう場合がある。そこで該培養液中の３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を接触させた後、該多孔性吸着剤に極性有機溶媒を接触させ、該多孔性吸着剤から３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に溶離させることでも３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を単離、回収することが可能である。本発明において使用される極性有機溶媒とは高い誘電率をもつ極性分子からなる有機溶媒のことをいい、上記したように、多孔性吸着剤から３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を溶離させることができるものであれば特に限定されることなく使用できる。極性有機溶媒は単独で使用しても構わないし、２種類以上を所望の配合比で組み合わせて使用しても良い。

【0063】

本発明における晶析または沈殿化とは、目的物質が溶解している溶媒を蒸発させて濃縮したり、あるいは温度を下げたり、あるいは目的物質が溶解している溶媒に貧溶媒を加えたりすることによって、飽和溶解度よりも濃度を高くすることにより結晶または沈殿を生じさせる操作のことを言い、従来公知の方法を含め特に限定されるものではない。また生成した結晶または沈殿は、沈降、濾過、遠心分離などによって分離することができる。

【0064】

＜５−２＞３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法
本発明はまた、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法を提供する。本方法は、以下（１）および（２）を含む：
（１）上述した方法より３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること；および
（２）３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱アセチル化して、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること。

【0065】

本発明における３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類には、以下の構造を有する３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸(「３，４−ＡＨＢＡ」と略すことがある)並びにその誘導体およびその塩が含まれる。

【0066】

【化4】

【0067】

３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の誘導体は、（１）１位のカルボキシル基、３位のアミノ基および４位のヒドロキシル基からなる群より選ばれる少なくとも１つの基が誘導体化されているか、または（２）１位のカルボキシル基、３位のアミノ基および４位のヒドロキシル基を保持し、かつ２位、５位および６位の炭素原子からなる群より選ばれる少なくとも１つの炭素原子上の水素原子が他の原子または基により置換されているか、あるいは（３）上記（１）および（２）の組合せによるものである。上記（２）における他の原子または基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等の炭素原子数１〜６個のアルキル基）、ヒドロキシル基、アルキルオキシ基（アルキル部分は、上記と同様）、アミノ基、モノまたはジアルキルアミノ基（アルキル部分は、上記と同様）、シアノ基、ニトロ基、スルホニル基、カルボキシル基が挙げられる。具体的には、上記（１）の誘導体としては、例えば、１位のカルボキシル基が誘導体化された誘導体（例、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸のカルボキシル基がアルデヒド化された３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）、３位のアミノ基の水素原子が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、３−アルキルアミノ誘導体）、および４位のヒドロキシ基が上記アルキル基等の基で誘導体化された誘導体（例、４−アルキルオキシ誘導体）が挙げられる。
塩としては、カルボン酸のアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウム）塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。

【0068】

本発明の上記方法における工程（１）は、上述した３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法と同様にして行うことができる。

【0069】

本発明の上記方法における工程（２）における脱アセチル化は、当該分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。例えば、脱アセチル化は、酸または塩基を利用した加水分解により行うことができる。酸としては、例えば、Ａｃ−ＡＨＢＡ類の脱アセチル化反応が進行するものであれば特に限定はないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの強酸が好ましい。塩基としては、Ａｃ−ＡＨＢＡ類の脱アセチル化反応が進行するものであれば特に限定はないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化リチウムなどの強塩基を用いることが、脱アセチル化の反応性を高めることができるという点で好ましい。得られた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類は、回収・精製されてもよい。３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の回収・精製は、上述したような３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の回収・精製と同様にして行うことができる。

【0070】

＜５−３＞３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法
本発明はまた、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーの製造方法を提供する。本方法は、以下（１’）および（２’）を含む：
（１’）上述した方法により３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成すること；および
（２’）３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化して、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーを得ること。

【0071】

本発明の上記方法における工程（１’）は、上述した３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法と同様にして行うことができる。

【0072】

本発明の上記方法における工程（２’）は、当該分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。例えば、上述した方法によって得られた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、高温においてメタンスルフォン酸、もしくは、ポリリン酸のような非酸化溶媒酸中で、重縮合によって重合することによってポリマー化することができる（例、国際公開第９１／０１３０４号参照）。本発明のポリマーの製造方法では、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、他のポリマー構成成分とポリマー化させてもよい。他のポリマー構成成分としては、例えば、テレフタル酸およびビスフェノールＡ、またはテレフタル酸およびｐ−フェニレンジアミンが挙げられる。ポリマー化の方法は種々の公知の方法を適用することによって実施可能である（米国特許５１４２０２１号公報、米国特許５２１９９８１号公報、米国特許５４２２４１６号公報、Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ ｅｔ． ａｌ．，（１９９２）Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９３，２４６７−２４７６、Ｍａｒｃｏｓ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ． ａｌ．，（２００１）Ｐｏｌｙｍｅｒ，４２，７９３３−７９４１）。本発明の方法により製造される、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を構成単位として含むポリマーとしては、例えば、ポリベンゾオキサゾールポリマー、ポリエステル、ポリアミドが挙げられる。

【実施例】

【0073】

以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。なお、実施例において宿主として用いられた微生物は、３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸、アスパラギン酸セミアルデヒド、およびアセチル基ドナーであるアセチルＣｏＡを効率的に供給できる微生物である。

【0074】

実施例１：エシェリヒア・コリへのストレプトマイセス・グリセウス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群およびエシェリヒア・コリ由来ｎｈｏＡ遺伝子の導入による３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産菌の構築、および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）エシェリヒア・コリのゲノム情報をもとにした３，４−ＡＨＢＡのＮ−アセチル化を触媒する酵素の探索
ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株において、アリールアミン Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（同意語：ＮａｔＡ；ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ：ＢＡＦ４６９７１．１）が３，４−ＡＨＢＡのＮ−アセチル化反応を触媒することが報告されている［Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ． ａｌ．，（２００７） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８９，２１５５−２１５９］。ＮａｔＡのアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＮａｔＡと同様の機能を有する酵素を探索するため、エシェリヒア・コリＫ−１２株のゲノム情報から、ＮａｔＡと相同性を示す配列を検索した。公開されているデータベース（ＥｃｏＣｙｃ，ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／，Ｋｅｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３，３３４−３３７）を利用し、ｂｌａｓｔｐを用いて検索を行った結果、エシェリヒア・コリＫ−１２株のＮ−ヒドロキシアリルアミン Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（同意語：ＮｈｏＡ，ＥＣ：２．３．１．１１８，ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ：ＮＰ＿４１５９８０．１）が、ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株由来ＮａｔＡと４９％の相同性を示すことを見出した。ＮｈｏＡのアミノ酸配列を配列番号２に、ＮｈｏＡをコードする遺伝子（同意語：ｎｈｏＡ，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＣ＿０００９１３．２、ヌクレオチド１５３２０４８〜１５３２８９３、ＧＩ：９４７２５１）の塩基配列を配列番号３に示す。

【0075】

（２）ｎｈｏＡ遺伝子発現用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリでｎｈｏＡ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株のゲノムを鋳型として、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付与した配列番号４に示す合成オリゴヌクレオチド、更には３’末端にＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を付与した配列番号５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて６０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ｎｈｏＡ遺伝子のネイティブプロモーターおよびｎｈｏＡ遺伝子を含む、約１．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。この断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ社製）にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１９−ＮｈｏＡと名付けた。ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡの全長配列を配列番号６に示す。

【0076】

（３）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
エシェリヒア・コリに３，４−ＡＨＢＡの生産能を付与する為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ， ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）およびエシェリヒア・コリ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片を化学合成した（塩基配列を配列番号７に示す）。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩにて消化処理し、ＰｔａｃおよびＴｔｒｐを含むＤＮＡ断片を得た。精製したＤＮＡ断片と、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号８に示す）。本プラスミドのＰｔａｃ下流に目的遺伝子をクローニングすることで、目的遺伝子の発現増幅が可能となる。

【0077】

（４）エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子の化学合成
ストレプトマイセス・グリセウスＩＦＯ１３３５０株において、３，４−ＡＨＢＡの合成はアルドラーゼ（同意語：ＳＧＲ＿４２４９，ＧｒｉＩ）および３，４−ＡＨＢＡシンターゼ（同意語：ＳＧＲ＿４２４８， ＧｒｉＨ）からなる３，４−ＡＨＢＡ合成酵素群によって触媒される事が既に知られている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ． ａｌ．，（２００６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。ＧｒｉＩは、ｇｒｉＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ２５９６６３．１、ヌクレオチド１３９５６〜１４７８０；ＧＩ：１１７６７６０６０）によりコードされている。ＧｒｉＩタンパク質のアミノ酸配列およびｇｒｉＩ遺伝子の塩基配列を、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示す。また、ＧｒｉＨは、ｇｒｉＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ２５９６６３．１、ヌクレオチド１２６９０〜１３８８０； ＧＩ：１１７６７６０５９）によりコードされている。ＧｒｉＨタンパク質のアミノ酸配列およびｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列を配列番号１１および配列番号１２にそれぞれ示す。
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをＥｃＧｒｉＩＨと名付けた。ＥｃＧｒｉＩＨの５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った（配列番号１３に示す）。両末端に制限酵素認識配列が付与されたＥｃＧｒｉＩＨは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉと名付けた。ｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉの全長配列を配列番号１４に示す。

【0078】

（５）ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子発現用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリでｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＥｃＧｒｉを鋳型として、配列番号１５に示す合成オリゴヌクレオチド、更には配列番号１６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて１５０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥｃＧｒｉＩＨ遺伝子断片を含む、約２．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＥｃＧｒｉＩＨ遺伝子断片と、ＳｍａＩで消化処理されたｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｇｒｉＩＨ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉと名付けた。ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉの全長配列を配列番号１７に示す。

【0079】

（６）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産菌の構築
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と名付けた。つぎに、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＵＣ１９またはｐＵＣ１９−ＮｈｏＡを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性およびアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株にｐＵＣ１９が導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株と名付け、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株にｐＵＣ１９−ＮｈｏＡが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株と名付けた。

【0080】

（７）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産培養
ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株、およびＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株を、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから１白金耳分の菌体を、試験管中の、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＭＳグルコース／Ａｓｐ培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃にて４８時間培養した。ＭＳグルコース／Ａｓｐ培地の組成は以下の表１に記載のとおりである。

【0081】

【表1】

【0082】

ＫＯＨでｐＨ７．０に調整し、１２１℃で２０分オートクレーブを行なった。但し、ＧｌｕｃｏｓｅとＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏは混合し、別殺菌した。ＣａＣＯ_３は乾熱滅菌後に添加した。

【0083】

（８）３，４−ＡＨＢＡ変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）の分子量の分析
実施例１（７）に記載の、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株、およびＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養上清液、３，４−ＡＨＢＡ標準品（東京化成工業株式会社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ａ０８５９）に対する逆相カラムクロマトグラフィーのチャートを図１に示した（分析条件はＳｕｚｕｋｉ ｅｔ． ａｌ．，（２００６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１に記載）。ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養上清液中からは３，４−ＡＨＢＡが検出されず、溶出時間（Ｒ．Ｔ．） ９．５ｍｉｎ．に検出されるピークの高さが、対照であるＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株と比較して増加した。これにより、過剰発現したＮｈｏＡによって、３，４−ＡＨＢＡがＲ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．に検出される化合物に変換されていることが示唆された。
ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株を培養後の培養上清液中に含まれる３，４−ＡＨＢＡ変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）の分子量を、ＬＣ／ＭＳで分析した。分析条件は以下のとおりである。

【0084】

カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ２μｍ ２．１×７５ｍｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
移動相：Ａ＝０．１％ ギ酸／Ｈ_２Ｏ
Ｂ＝０．１％ ギ酸／アセトニトリル
グラジェントプログラム ０ ｍｉｎ． Ａ／Ｂ＝１００／０
３ ｍｉｎ． Ａ／Ｂ＝１００／０
２３ ｍｉｎ． Ａ／Ｂ＝２０／８０
２５ ｍｉｎ． Ａ／Ｂ＝２０／８０
流速： ０．２（ｍＬ／ｍｉｎ．）
カラム温度：室温（２５℃）
検出波長： ２５４ｎｍ（ＰＤＡ）
ＭＳイオン化モード：ＥＳＩ
分析機種： Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２９０（ＬＣ）
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳ ６１３０（ＭＳ）

【0085】

分析の結果、変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）のｍ／ｚ値は１９５．１であり、３，４−ＡＨＢＡのアセチル化体の計算上のｍ／ｚ値（１９５．１）と一致した。以降、変換物（Ｒ．Ｔ．９．５ｍｉｎ．）を３，４−ＡｃＡＨＢＡと呼ぶ。

【0086】

（９）培養液の吸光光度および培養液上清中の３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の定量
実施例１（７）に記載の、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株、およびＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養液の６００ｎｍでのＯｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）値を、分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡ、および３，４−ＡｃＡＨＢＡを逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、蓄積量を定量した（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ． ａｌ．，（２００６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，３６９４４−３６９５１）。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ蓄積量および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量を表２に示した。ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養上清液からは３，４−ＡＨＢＡが検出されず、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株の培養上清液と比べて３，４−ＡｃＡＨＢＡの蓄積量が増加した。また、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養上清中の３，４−ＡＨＢＡ濃度と３，４−ＡｃＡＨＢＡ濃度の和は、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＵＣ１９株に対して１．６７倍となった。

【0087】

【表2】

【0088】

実施例２：エシェリヒア・コリへのストレプトマイセス・ムラヤマエンシス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群およびエシェリヒア・コリ由来ｎｈｏＡ遺伝子の導入による３，４−ＡＨＢＡ生産菌の構築、および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応したｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子の化学合成
ストレプトマイセス・ムラヤマエンシスにおいて、３，４−ＡＨＢＡの合成はアルドラーゼ（同意語：ＮｓｐＩ；ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ：ＢＡＪ０８１７１．１）および３，４−ＡＨＢＡシンターゼ（同意語：ＮｓｐＨ；ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ：ＢＡＪ０８１７２．１）からなる３，４−ＡＨＢＡ合成酵素群によって触媒される事が既に知られている（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ． ａｌ．，（２０１０） Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，６４１−６４３）。ＮｓｐＩは、ｎｓｐＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ５３０１３６、ヌクレオチド８７３０〜９５８４；ＧＩ：２９６７８４９４３）によりコードされている。ＮｓｐＩタンパク質のアミノ酸配列およびｎｓｐＩ遺伝子の塩基配列を配列番号１８および配列番号１９にそれぞれ示す。また、ＮｓｐＨは、ｎｓｐＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ５３０１３６、ヌクレオチド９５９９〜１０７０２；ＧＩ：２９６７８４９４４）によりコードされている。ＮｓｐＨタンパク質のアミノ酸配列およびｎｓｐＨ遺伝子の塩基配列を配列番号２０および配列番号２１にそれぞれ示す。
ｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子をエシェリヒア・コリで効率的に発現させるために、エシェリヒア・コリのコドン使用頻度に対応するようにｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子の配列を変更し、オペロンとして発現するように設計して、これをＥｃＮｓｐＩＨと名付けた。ＥｃＮｓｐＩＨの５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付加し、化学合成を行った。両末端に制限酵素認識配列が付与されたＥｃＮｓｐＩＨは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）にクローニングした。

【0089】

（２）ｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子発現用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリでｎｓｐＩ遺伝子およびｎｓｐＨ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＥｃＮｓｐを鋳型として、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて１５０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＥｃＮｓｐＩＨ遺伝子断片を含む、約２．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＥｃＮｓｐＩＨ遺伝子断片と、ＳｍａＩで消化処理されたｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ［実施例１（３）に記載］を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｎｓｐＩＨ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐと名付けた。

【0090】

（３）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産菌の構築
エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株と名付けた。つぎに、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＵＣ１９またはｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ［実施例１（２）に記載］を導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性およびアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株にｐＵＣ１９が導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９株と名付け、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ株にｐＵＣ１９−ＮｈｏＡが導入された株をＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株と名付けた。

【0091】

（４）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産培養評価
ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９株、およびＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株を、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、試験管中の３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＭＳグルコース／Ａｓｐ培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃にて４８時間培養した。ＭＳグルコース／Ａｓｐ培地の組成は表１に記載のとおりである。
培養後、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡを、実施例１と同様に逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、蓄積量を定量した。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ蓄積量および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量を表３に示した。ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養上清液からは３，４−ＡＨＢＡが検出されず、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９株と比べて３，４−ＡｃＡＨＢＡの蓄積量が増加した。また、ＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９−ＮｈｏＡ株の培養上清中の３，４−ＡＨＢＡ濃度と３，４−ＡｃＡＨＢＡ濃度の和は、対照のＢＷ２５１１３／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＮｓｐ／ｐＵＣ１９株に対して１．６９倍となった。

【0092】

【表3】

【0093】

実施例３：パントエア・アナナティスへのストレプトマイセス・グリセウス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群およびエシェリヒア・コリ由来ｎｈｏＡ遺伝子の導入による３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産菌の構築、および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）ｎｈｏＡ遺伝子発現用プラスミドの構築
パントエア・アナナティスでｎｈｏＡ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株のゲノムを鋳型として、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付与した配列番号４に示す合成オリゴヌクレオチド、更には３’末端にＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を付与した配列番号５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて６０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ｎｈｏＡ遺伝子のネイティブプロモーターおよびｎｈｏＡ遺伝子断片を含む、約１．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。この断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＭＷ２１９（Ｔａｋａｒａ社製）にクローニングした。得られたベクターをｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡと名付けた。ｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡの全長配列を配列番号２２に示す。

【0094】

（２）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産菌の構築
パントエア・アナナティスＳＣ１７株（特開２００６−２３０２０２号公報に記載）のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３０℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。パントエア・アナナティスＳＣ１７株にｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉが導入された株をＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株と名付けた。つぎに、ＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＭＷ２１９またはｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡを導入し、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３０℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性を示す形質転換体を取得した。ＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株にｐＭＷ２１９が導入された株をＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９株と名付け、ＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ株にｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡが導入された株をＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡ株と名付けた。

【0095】

（３）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産培養評価
ＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９株、およびＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡ株を、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３０℃にて２４時間培養した。得られたプレートから１白金耳分の菌体を、試験管中の、３０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールおよび５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＭＳグルコース／Ａｓｐ培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃にて３２時間培養した。ＭＳグルコース／Ａｓｐ培地の組成は表１に記載のとおりである。
培養後、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡを、実施例１（９）と同様に逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、蓄積量を定量した。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ蓄積量および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量を表４に示した。ＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡ株の培養上清液中からは３，４−ＡＨＢＡは検出されず、対照のＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９株と比べ３，４−ＡｃＡＨＢＡの蓄積量が増加した。また、ＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９−ＮｈｏＡ株の培養上清中の３，４−ＡＨＢＡ濃度と３，４−ＡｃＡＨＢＡ濃度の和は、対照のＳＣ１７／ｐＳＴＶ２８−ＥｃＧｒｉ／ｐＭＷ２１９株に対して２．４６倍となった。

【0096】

【表4】

【0097】

実施例４：コリネバクテリウム・グルタミカムへのストレプトマイセス・グリセウス由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子群およびエシェリヒア・コリ由来ｎｈｏＡ遺伝子の導入による３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産菌の構築、および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量の評価
（１）ｎｈｏＡ遺伝子発現用プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムでｎｈｏＡ遺伝子を発現させる為の発現用プラスミドは次の手順で構築した。エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株のゲノムを鋳型として、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を付与した配列番号４に示す合成オリゴヌクレオチド、更には３’末端にＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を付与した配列番号５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＧＸＬポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて１５秒、６８℃にて６０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ｎｈｏＡ遺伝子のネイティブプロモーターおよびｎｈｏＡ遺伝子断片を含む、約１．１ｋｂｐのＰＣＲ産物を取得した。この断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化処理後、同制限酵素で消化処理されたｐＶＣ７（特開平９−０７０２９１号公報に記載）にクローニングした。得られたベクターをｐＶＣ７−ＮｈｏＡと名付けた。ｐＶＣ７−ＮｈｏＡの全長配列を配列番号２３に示す。

【0098】

（２）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産菌の構築
コリネバクテリウム・グルタミカムでｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を発現させるために、特開２０１０−００５０９９号公報に記載のプラスミドｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを用いた。ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨは、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９株由来細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーター配列（Ｐｅｙｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９）の下流にｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を接続した配列を含んでおり、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を効果的に発現可能なプラスミドである。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを導入し、２５（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＣＭＤｅｘプレートに均一に塗布し、３０℃にて２４時間培養した。ＣＭＤｅｘプレートの組成を以下の表５に示す。

【0099】

【表5】

【0100】

得られたプレートから、カナマイシン耐性を示す形質転換体を取得した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９株にｐＰＫ４ｇｒｉＩＨが導入された株をＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ株と名付けた。つぎに、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーションによりｐＶＣ７またはｐＶＣ７−ＮｈｏＡを導入し、２０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンおよび５（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＣＭＤｅｘプレートに均一に塗布し、３０℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、カナマイシン耐性およびクロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ株にｐＶＣ７が導入された株をＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ／ｐＶＣ７株と名付け、ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ株にｐＶＣ７−ＮｈｏＡが導入された株をＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ／ｐＶＣ７−ＮｈｏＡ株と名付けた。

【0101】

（３）３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産培養評価
ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ／ｐＶＣ７株、およびＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ／ｐＶＣ７−ＮｈｏＡ株を、２０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンおよび５（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＣＭＤｅｘプレートに均一に塗布し、３０℃にて２４時間培養した。得られたプレートから１白金耳分の菌体を、試験管中の、２０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンおよび５（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含む３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産用培地４ｍＬに接種し、往復振とう培養装置で３０℃にて５６時間培養した。３，４−ＡｃＡＨＢＡ生産用培地の組成は以下の表６に記載のとおりである。

【0102】

【表6】

【0103】

ＫＯＨでｐＨ７．５に調整し、１２１℃で２０分オートクレーブを行なった。但し、ＧｌｕｃｏｓｅとＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏは混合し、別殺菌した。ＣａＣＯ_３は乾熱滅菌後に添加した。

【0104】

培養後、培養液の６００ｎｍでのＯＤ値を分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２９００）によって測定した。また、培養上清液中に蓄積した３，４−ＡＨＢＡおよび３，４−ＡｃＡＨＢＡを、実施例１（９）と同様に逆相カラムクロマトグラフィーによって分離し、蓄積量を定量した。培養液の６００ｎｍでのＯＤ値、培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ蓄積量および３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量を表７に示した。ＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ／ｐＶＣ７−ＮｈｏＡ株の培養上清液には３，４−ＡＨＢＡが蓄積せず、対照であるＡＴＣＣ１３８６９／ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ／ｐＶＣ７株と比べ３，４−ＡｃＡＨＢＡ蓄積量が増加した。

【0105】

【表7】

【産業上の利用可能性】

【0106】

本発明によって、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体やポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用であるアミノヒドロキシ安息香酸類に容易に変換できるアセチルアミノヒドロキシ安息香酸類を、簡便かつ効率的に製造することができる。よって、例えば、本発明によって得られた３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸に変換し、次いで、変換された３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を重合することでポリベンゾオキサゾール（ＰＢＯ）が得られ、これにより高強度、高弾性率、高耐熱性を有するＰＢＯ繊維やＰＢＯフィルムなどを安価に提供することが可能となる。また、原料である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類に容易に変換できる安定な化合物である３−アセチルアミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生合成によって製造することが可能であることから、本発明の方法は環境低負荷型のプロセスとなり、地球環境に対して優しい製造方法である。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]