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▶ トランスレーショナル サイエンシィズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6184410
(24)【登録日】2017年8月4日
(45)【発行日】2017年8月23日
(54)【発明の名称】ＳＥＲＰＩＮＦ２結合分子および使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20170814BHJP
A61P 7/10 20060101ALI20170814BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20170814BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20170814BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 P
A61P7/10
A61P9/10
A61P43/00 105
【請求項の数】19
【全頁数】28
(21)【出願番号】特願2014-529840(P2014-529840)
(86)(22)【出願日】2012年9月6日
(65)【公表番号】特表2014-525476(P2014-525476A)
(43)【公表日】2014年9月29日
(86)【国際出願番号】US2012053900
(87)【国際公開番号】WO2013036596
(87)【国際公開日】20130314
【審査請求日】2015年6月24日
(31)【優先権主張番号】61/531,278
(32)【優先日】2011年9月6日
(33)【優先権主張国】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】514132305
【氏名又は名称】トランスレーショナル サイエンシィズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】リード，ガイ，エル．
【審査官】
小堀 麻子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００２−５２５３４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Blood，２００１年，Vol.97, No.10，p.3086-92
【文献】
Therapeutic Research，２００６年，Vol.27, No.9，p.1668-1674
【文献】
ブレインサイエンス，１９９６年，Vol.7, No.4，p.389-394
【文献】
醫學のあゆみ，１９８９年，Vol.151, No.1，p.47
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者において、血栓症によって引き起こされる虚血状態から生じる出血または浮腫による障害または死亡を防止するための医薬組成物であって、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させ、それにより、前記患者における出血または浮腫による障害または死亡を防止する有効量の抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記出血または浮腫は、神経、心臓、肝臓、膵臓、呼吸器、または腎臓の出血または浮腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントは、２８〜９１ナノモル／ｋｇの用量範囲で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
患者において、血栓症によって引き起こされる虚血状態から生じる組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）毒性による障害または死亡を防止するための医薬組成物であって、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させ、それにより、ＴＰＡ毒性による障害または死亡を防止する有効量の抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項5】
前記ＴＰＡ毒性は、出血、器官浮腫、またはアポトーシスを引き起こす、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記患者がＴＰＡに誘発される損傷の危険性にある、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ＴＰＡ毒性は、虚血または外傷に起因する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ＴＰＡ毒性は、神経、心臓、肝臓、膵臓、呼吸器、または腎臓の損傷を引き起こす、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項9】
組織プラスミノーゲン活性化因子は、４８時間以内に事前に前記患者に投与されている、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントは、２８〜９１ナノモル／ｋｇの用量範囲で投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項11】
患者において、血栓症によって引き起こされる虚血状態から生じるアポトーシスの予防を行うための医薬組成物であって、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低下させ、それにより、前記患者におけるアポトーシスを予防する有効量の抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項12】
前記アポトーシスは、神経、心臓、肝臓、膵臓、肺、または腎臓の細胞に生じる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントは、２８〜９１ナノモル／ｋｇの用量範囲で投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
患者において、血栓症によって引き起こされる長期虚血を防止するための医薬組成物であって、前記患者においてＳｅｒｐｉｎＦ２濃度または活性を低減させ、前記長期虚血を防止する有効量の抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項15】
前記長期虚血は、少なくとも４０分間現れている、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記長期虚血は、神経、心臓、肝臓、膵臓、肺、または腎臓の組織に生じる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記患者が神経損傷を示す神経症状を有する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記神経症状は、Ｒａｎｋｉｎ １またはＮＩＨ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ ４よりも重度かまたはそれと同等として分類される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体又はそのフラグメントは、２８〜９１ナノモル／ｋｇの用量範囲で投与される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照本出願は、２０１１年９月６日に出願された米国仮出願第６１／５３１，２７８号の優先権を主張し、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
関連出願の相互参照本発明は、部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ認可番号第ＨＬ０９２７５０号および同第ＮＳ０７３１４７号のもとに、政府支援によりなされた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0003】
本発明は、概して、典型的にプラスミノーゲン活性化因子レベルの増加と関連する状態におけるＳｅｒｐｉｎＦ２の活性に起因する、組織傷害後の細胞損傷、出血、および器官腫脹による病的状態、障害、および死亡を予防または低減させるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
心臓、脳、腎臓、および肺への組織傷害は、毒性、壊死、アポトーシス、および他の機構による細胞の死滅をもたらす可能性がある。これは、器官構成要素の構造劣化、血管障壁の破壊、および細胞腫脹をもたらす。結果は、器官浮腫、出血、および機能喪失であり得る。例えば、脳の浮腫または腫脹は、外傷、傷害、または脳卒中の懸念される合併症であり、死亡または障害を引き起こし得る１。脳の腫脹はまた、出血の結果として生じ得る２。眼の場合、黄斑浮腫は、網膜中心静脈閉塞症の結果として生じ得る３。心筋浮腫は、心筋虚血の早期マーカーである４、５。虚血再灌流は、肺透過性を増加させ、肺浮腫も同様に誘発する６。１つの器官における虚血および再灌流は、その器官における浮腫を引き起こし、さらに、その他の器官における腫脹および機能不全を引き起こし得る。例えば、腸の虚血再灌流は、腸、ならびに腎臓および肺の浮腫をもたらし得る７。同様に、肝臓の虚血は、肝臓および腎臓の傷害および浮腫をもたらし得る８。虚血および再灌流は、血管障壁の破壊および膵臓の浮腫につながる９。虚血および再灌流は、内皮細胞の死滅およびアポトーシスにつながる１０。微小血管傷害は、虚血および再灌流後に生じる１１。
【0005】
脳卒中は、１年間に５７０万人を上回る死者を出す国民的健康問題であり、障害の主な原因である１２。脳卒中は、マトリクスメタロプロテアーゼの発現を増加させて、血液脳関門の破壊を促進し、脳の腫脹または浮腫を増加させ、出血の危険性を増加させる。脳卒中を有する患者において、１週間以内の死亡の９０％は、脳腫脹および出血等、神経性要因によるものである１５〜１７。大規模な脳浮腫を伴う脳卒中は、頭蓋内圧の増加および意識喪失を引き起こし得るため、悪性または重度と見なされる。浮腫および／または出血からもたらされる頭蓋内圧の増加は、高い死亡率と関連し、ヘルニア形成につながり得る１８、１９。重大な脳腫脹の発見は、患者の予後不良を意味するが、梗塞寸法の測定値は、障害の重要な臨床的予測因子であるとは考えられていない２０、２１。
【0006】
組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）は、血液凝固分解酵素プラスミンの産生を触媒し、唯一のＦＤＡに認可された脳卒中の治療である。残念なことに、ＴＰＡの治療的有用性は、その有害または神経毒性の作用によって制限されると見られる。ＴＰＡは、治療を受けた患者の１１〜１３％のみにおいて障害を低減させる２２〜２４。ＴＰＡはまた、脳出血をもたらす血液脳関門の破壊の危険性を著しく増加させ、これは用量依存的様式で生じる２５。長期虚血後の患者へのＴＰＡの投与は、死亡率を増加させ得る２６。
【0007】
ＴＰＡは、内皮細胞およびニューロンによって発現され、したがって、血管裂孔および脳実質の両方に存在する２７。内在性ＴＰＡのレベルは、傷害に応答して脳内で上昇する２８〜３０。中大脳動脈（ＭＣＡ）の機械的（非血栓性）閉塞のモデルにおいて、内在性ＴＰＡは、神経細胞死を増加させ、ＴＰＡの薬理学的投与は、脳傷害をさらに亢進させる３１〜３３。脳梗塞後の神経損傷は、部分的に興奮毒素によって媒介されると考えられる２７。ＴＰＡが、プラスミノーゲン依存性機構を通じて興奮毒性脳傷害を亢進し３４、プラスミンのセリンプロテアーゼ阻害剤（ｓｅｒｐｉｎ）であるＳｅｒｐｉｎＦ２（α２抗プラスミンとしても知られる）が保護作用を有することが示されている３５〜３７。総合すると、機械的閉塞モデルにおけるこれらのデータは、ＴＰＡがそのプラスミン産生を通じて脳への神経毒性作用を発揮し、ＳｅｒｐｉｎＦ２によるプラスミン活性の阻害が、神経毒性を低減させることを示す。逆説的ではあるが、典型的には血栓性（非機械的）閉塞によって引き起こされるヒト虚血性脳卒中については、ＳｅｒｐｉｎＦ２は、悪影響を及ぼし得ることを示唆する危険因子である３８、３９。
【0008】
脳に加えて、内在性または投与されたＴＰＡは、身体全体の他の組織における虚血後、有害な影響を有する。腎臓における虚血後、ＴＰＡは、組織損傷を増加させる４０。同様に、肺における虚血後、ＴＰＡは、肺傷害を亢進し、肺機能を低下させる４１。ＴＰＡは、心虚血後、筋細胞組織損傷を増加させることも示されている４２。ニューロンへのその有害な作用に類似して、ＴＰＡはまた、眼において興奮毒素によって誘発される網膜細胞損傷を亢進させる４３。
【0009】
Ｎａｇａｉらへの米国特許第６，９４６，４３８号は、動物において機械的閉塞によって誘発される局所脳虚血梗塞の治療のために、インビボでα２抗プラスミン（ＳｅｒｐｉｎＦ２）濃度または活性を低減させる、プラスミン、ミニプラスミン、およびマイクロプラスミン等の化合物の使用を提供する。しかしながら、機械的閉塞は、主に血栓症または凝血の塞栓症（血栓塞栓症）によって引き起こされる、ヒト虚血性脳卒中を想定したものではない。血栓の存在は、フィブリン生成物ならびに血小板および凝固系の活性化と関連付けられ、これは、虚血性微小血管系に影響を及ぼし、下流血栓症を引き起こし、ニューロンおよび他の細胞に神経毒性作用を有し得る４４。機械的閉塞は、血栓性閉塞によって引き起こされるものとは異なるパターンの、ＴＰＡと関連する細胞傷害を誘発することが発見されている３０、４４〜４６。例えば、Ｎａｇａｉらは、機械的閉塞および血栓性脳卒中のモデルにおけるＰＡＩ−１トランスジェニックマウスに対して矛盾する結果を見出した３０。これらの同じ著者による研究は、機械的閉塞によって誘発される局所虚血性梗塞を低減させる化合物が、血栓症によって誘発される虚血性脳卒中に対して逆の作用を有し得ることを示唆するため、Ｎａｇａｉらによって米国特許第６，９４６，４３８号に記載された化合物が、血栓性閉塞によって引き起こされる神経細胞死を低減させるかどうかは、予測できない。さらに、米国特許第６，９４６，４３８号において、Ｎａｇａｉらは、このような化合物が、虚血性脳卒中後の障害、脳腫脹、出血、または死亡を予防し得るかにどうかを教示していない。機械的閉塞は、血栓性脳卒中を想定しておらず、可能性のある治療法の価値を正確に予測するものではないため、血栓塞栓性脳卒中等、血栓症によって引き起こされる虚血状態における細胞損傷、腫脹、浮腫、および出血を予防または低減する組成物および方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【0010】
本発明は、患者における出血、器官浮腫、長期虚血、微小血管障壁の破壊、アポトーシス、またはＴＰＡ毒性を防止するための方法および組成物であって、患者にＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与することを含む、方法および組成物を提供する。本防止方法は、本明細書に記載される状態の予防および治療のための方法を含む。
【0011】
本発明はまた、本明細書に記載される状態の全ての治療のための薬品の製造方法を提供する。本発明は、種々の実施形態において、ＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子が、抗体、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、または小分子から選択されるＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤であることを規定する。ある特定の実施形態において、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤は、抗体である。ある特定の実施形態において、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤は、２８〜９１ナノモル／ｋｇの用量範囲で投与される。
【0012】
具体的には、本発明は、出血または浮腫による機能障害または死亡の防止を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、それによって患者における出血または浮腫による障害または死亡を防止することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、出血または浮腫は、神経、心臓、肝臓、膵臓、呼吸器、または腎臓のものである。
【0013】
本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）毒性による障害または死亡の防止を、それを必要とする患者において行う方法であって、前記患者に、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、それによって、ＴＰＡ毒性による障害または死亡を防止することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＴＰＡ毒性は、出血、器官浮腫、またはアポトーシスを引き起こす。ある特定の実施形態において、本発明は、患者がＴＰＡに誘発される損傷の危険性にあることを判定する、先行ステップを含む。ある特定の実施形態において、ＴＰＡ毒性は、虚血または外傷に起因する。本発明は、ＴＰＡ毒性が、神経、心臓、肝臓、膵臓、呼吸器、または腎臓の損傷を引き起こし得ることを規定する。ある特定の実施形態において、ＴＰＡ毒性は、ＴＰＡが４８時間以内に事前に患者に投与されていることを判定することによって評価される。ある特定の実施形態において、プラスミノーゲン活性化因子またはセリンプロテアーゼ酵素は、４８時間以内に事前に患者に投与されている。
【0014】
本発明は、アポトーシスの予防を、それを必要とする患者に行う方法であって、患者に、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低下させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、それによって、患者におけるアポトーシスを予防することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、アポトーシスは、神経、心臓、肝臓、膵臓、肺、または腎臓の細胞に生じる。
【0015】
本発明は、長期虚血の防止を、それを必要とする患者において行う方法であって、前記患者に、前記患者においてＳｅｒｐｉｎＦ２濃度または活性を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、そうして長期虚血を防止することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、長期虚血は、少なくとも４０分間現れている。ある特定の実施形態において、長期虚血は、神経、心臓、肝臓、膵臓、肺、または腎臓の組織に生じる。ある特定の実施形態において、本方法は、患者が、神経損傷を示す神経症状を有することを判定する、先行ステップを含む。ある特定の実施形態において、神経症状は、Ｒａｎｋｉｎ １またはＮＩＨ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ ４よりも重度かまたはそれと同等として分類される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図3A】ＳｅｒｐｉｎＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、死亡率、神経傷害、浮腫、出血、および障害を低減させる。図３Ａ）完全抗体（Ａｂ）またはＦａｂフラグメントの形態のＳＦ２−Ｉは、対照またはＴＰＡ処置マウスと比較して、死亡を予防する。（＊＊＊ＴＰＡと対比してｐ＜０．０００５、対照と対比してｐ＜０．００５）。
【図4A】ＳＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊（図４Ａ）、ＭＭＰ−９発現（図４Ｂ）、およびＴＵＮＥＬ染色によって測定されるアポトーシス（図４Ｃ）、またはカスパーゼ３切断によって測定されるアポトーシス（図４Ｄ）を予防する。（ＳＦ２−Ｉと対照とを対比して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図4B】ＳＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊（図４Ａ）、ＭＭＰ−９発現（図４Ｂ）、およびＴＵＮＥＬ染色によって測定されるアポトーシス（図４Ｃ）、またはカスパーゼ３切断によって測定されるアポトーシス（図４Ｄ）を予防する。（ＳＦ２−Ｉと対照とを対比して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図4C】ＳＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊（図４Ａ）、ＭＭＰ−９発現（図４Ｂ）、およびＴＵＮＥＬ染色によって測定されるアポトーシス（図４Ｃ）、またはカスパーゼ３切断によって測定されるアポトーシス（図４Ｄ）を予防する。（ＳＦ２−Ｉと対照とを対比して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図4D】ＳＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊（図４Ａ）、ＭＭＰ−９発現（図４Ｂ）、およびＴＵＮＥＬ染色によって測定されるアポトーシス（図４Ｃ）、またはカスパーゼ３切断によって測定されるアポトーシス（図４Ｄ）を予防する。（ＳＦ２−Ｉと対照とを対比して＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図5A】溶解の成功にかかわらない、虚血脳へのＴＰＡの神経毒性作用。マウスを、血栓塞栓症によって誘発される２．５時間の虚血後、標準用量ＴＰＡ（１０ｍｇ）または低用量ＴＰＡ（２ｍｇ）で処置した。図５Ａ）脳半球体積パーセントとして測定される神経細胞死。
【図6A】ＳＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、ＴＰＡの神経毒性作用を無効にして、神経細胞死および出血を低減させる。血栓塞栓症によって誘発される２．５時間の虚血後、マウスを、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤（ＳＦ２−Ｉ）ありまたはなしで、標準用量（１０ｍｇ／ｋｇ）または低用量（２ｍｇ／ｋｇ）のＴＰＡで処置した。図６Ａ）脳半球体積パーセントとして測定される神経細胞死。
【図7A】ＳＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、ＴＰＡの神経毒性作用を無効にして、脳卒中生存体における神経細胞死、出血、および脳腫脹を低減させる。血栓塞栓性脳卒中の後、マウスを、ＴＰＡ単独（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＳＦ２−阻害剤とともにＴＰＡ（２ｍｇ／ｋｇ）で処置した。図７Ａ）脳半球体積パーセントとして測定される神経細胞死。
【図8A】ＳＦ２（ＳＦ２−Ｉ）を阻害または不活性化する薬剤は、ＴＰＡの神経毒性作用を無効にして、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊（図８Ａ）、ＭＭＰ−９発現（図８Ｂ）、およびＴＵＮＥＬ染色によって測定されるアポトーシス（図８Ｃ）を予防する。（ＴＰＡとＴＰＡ＋ＳＦ２−Ｉとを対比して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例への参照によって、より容易に理解することができる。しかしながら、本化合物、組成物、および方法を開示および説明する前に、特定のポリペプチド、特定の核酸、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、または特定の方法等が、当然ながら多様であり得、その多数の変更および変化形が当業者には明らかであろうため、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、制限することを意図するものではないこともまた、理解されたい。
【0018】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明示されない限り、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つの薬剤」への言及は、このような異なる薬剤のうちの１つ以上を含み、「その方法」への言及は、本明細書に記載される方法に修正を加えるかまたはそれと置き換えることが可能な当業者に既知の同等のステップおよび方法への言及を含む。
【0019】
別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって広く理解される意味を有する。本発明の実施は、別段に示されない限り、細胞生物学、分子生物学、遺伝学、化学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来的な技術を利用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、Ｇｕｔｈｒｉｅ＆Ｆｉｎｋ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１−８６３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｅａｒｓｅ，Ａ．Ｇ．Ｅ．，Ｖｏｌ．１（１９８０），Ｖｏｌ．２（１９８５），ａｎｄ Ｖｏｌ．３（１９９０）を参照されたい。
【0020】
本発明は、患者における出血、器官浮腫、長期虚血、微小血管障壁の破壊、アポトーシス、またはＴＰＡ毒性を防止するための方法であって、患者に、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与することを含む、方法を提供する。本防止方法は、本明細書に記載される状態の予防および治療のための方法を含む。
【0021】
本発明はまた、本明細書に記載される状態の治療のための薬品の製造方法を提供する。本発明は、種々の実施形態において、ＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子が、抗体、ペプチド、ＤＮＡアプタマー、または小分子から選択されるＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤であることを規定する。ある特定の実施形態において、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤は、抗体である。ＳｅｒｐｉｎＦ２上の活性部位に直接結合することによって、または間接的にＳｅｒｐｉｎＦ２の他の領域に結合することによって、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性を隔絶するか、またはそうでなければ低減もしくは低下させ、それによって、ＴＰＡ毒性と関連する細胞損傷を低減させる、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤。ある特定の実施形態において、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤は、２８〜９１ナノモル／ｋｇの用量範囲で投与される。
【0022】
具体的には、本発明は、出血または浮腫による機能障害または死亡の防止を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、それによって患者における出血または浮腫による障害または死亡を防止することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、出血または浮腫は、神経、心臓、肝臓、膵臓、呼吸器、または腎臓の組織のうちのいずれか１つ以上に特異的である。
【0023】
本発明は、アポトーシスの予防を、それを必要とする患者に行う方法であって、患者に、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低下させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、それによって、患者におけるアポトーシスを予防することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、アポトーシスは、神経、心臓、肝臓、膵臓、肺、または腎臓の細胞のうちのいずれか１つ以上に生じる。
【0024】
本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）毒性による障害または死亡の防止を、それを必要とする患者において行う方法であって、前記患者に、ＳｅｒｐｉｎＦ２活性または濃度を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、それによって、ＴＰＡ毒性による障害または死亡を防止することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＴＰＡ毒性は、出血、器官浮腫、またはアポトーシスを引き起こす。ある特定の実施形態において、本発明は、患者がＴＰＡに誘発される損傷の危険性にあることを判定する、先行ステップを含む。種々の実施形態において、ＴＰＡ毒性は、虚血または外傷と関連するか、または関連しない。本発明は、ＴＰＡ毒性が、神経、心臓、肝臓、膵臓、呼吸器、または腎臓の損傷を引き起こし得ることを規定する。ある特定の実施形態において、ＴＰＡ毒性は、ＴＰＡが４８時間以内に事前に患者に投与されていることを判定することによって評価される。ある特定の実施形態において、プラスミノーゲン活性化因子またはセリンプロテアーゼ酵素は、４８時間以内に事前に患者に投与されている。
【0025】
本発明は、長期虚血の防止を、それを必要とする患者において行う方法であって、前記患者に、前記患者においてＳｅｒｐｉｎＦ２濃度または活性を低減させるＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子の有効量を投与し、そうして長期虚血を防止することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、長期虚血は、少なくとも４０分間現れている。ある特定の実施形態において、虚血は、少なくとも５０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、およびそれ以上の間持続している。ある特定の実施形態において、長期虚血は、神経、心臓、肝臓、膵臓、肺、または腎臓の組織のいずれかに生じる。ある特定の実施形態において、本方法は、患者が、神経損傷を示す神経症状を有することを判定する、先行ステップを含む。ある特定の実施形態において、神経症状は、Ｒａｎｋｉｎ １またはＮＩＨ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ ４よりも重度かまたはそれと同等として分類される。したがって、ある特定の実施形態において、本発明はまた、虚血を有する患者における効果的な治療の時間枠を延長させる。
【0026】
ある特定の実施形態において、出血、器官浮腫、長期虚血、微小血管障壁の破壊、アポトーシス、またはＴＰＡ毒性は、虚血からもたらされる。ある特定の実施形態において、本発明は、虚血が血栓性虚血性脳卒中に起因することを判定する、先行ステップを含む。ある特定の実施形態において、本発明は、虚血が機械的閉塞に起因しないことを判定する先行ステップをさらに含む。ある特定の実施形態において、出血、器官浮腫、長期虚血、微小血管障壁の破壊、アポトーシス、またはＴＰＡ毒性は、脳組織内のものではなく、脳卒中以外の状態からもたらされる。
【0027】
本発明はまた、内在性または外的に投与されたかのいずれかである、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子によって誘発される神経毒性の危険性にある、長期虚血と関連する患者における神経損傷、機能障害、または死亡を減少させる、組成物およびその使用方法を提供する。本開示は、ＳｅｒｐｉｎＦ２結合剤および／または分子、例えば、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤が、脳ならびに他の器官における血液凝固によって引き起こされる血栓塞栓性脳卒中または虚血性損傷において、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の細胞毒性を低減させるために使用可能であることを、初めて記載する。
【0028】
虚血における細胞損傷を低減させることは、限定することなく、中枢または末梢神経系、肝臓／脾臓／網内皮系、腎臓および泌尿生殖器系、心臓血管系、呼吸器系、内分泌系、皮膚、胃腸系、神経感覚系、筋骨格系、および造血−リンパ系の組織を含む、必要性のある任意の組織で行うことができる。
【0029】
本明細書に使用される際、ＳｅｒｐｉｎＦ２結合剤または分子には、他の分子の中でも、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を挙げることができる。「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）という用語は、ＳｅｒｐｉｎＦ２に特異的に結合することが可能な、インタクトな分子、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント等）、一本鎖抗原結合タンパク質、「ヒト化」抗体、およびキメラ抗体を意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクト抗体のＦｃフラグメントが欠けており、血液循環からより迅速に除去され、インタクトな抗体よりも低い非特異的組織結合を有し得る。
【0030】
Ｒｅｅｄらへの米国特許第６，１１４，５０６号および係属中の米国公開第２０１０００８６５３６号は、ＭＡｂ ４９Ｃ９、７０Ｂ１１、７７Ａ３、およびＲＷＲを含むがこれらに限定されない、ＳｅｒｐｉｎＦ２（α２抗プラスミンとしても知られる）結合分子のある特定の他の使用を開示し、これらの分子の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。さらなる例示的なＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子には、次の市販入手可能な抗体が挙げられる：ＭＡＰ４Ｈ９に対するモノクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、２７Ｃ９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、１４ＡＰ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＭＰＷ１４ＡＰ（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ ＧｍｂＨ）、３６１７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＳｅｒｐｉｎＦ２に対するヤギポリクローナル抗体（Ｂｉｏｐｏｏｌ）、ならびにＧｅｎｅｔｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能なＳｅｒｐｉｎＦ２に対する他の抗ヒトポリクローナルおよびモノクローナル抗体。本発明はまた、分子生物学技術を通じて構築されたヒト化およびヒト抗体の使用を企図する。
【0031】
「ＳｅｒｐｉｎＦ２結合」および「特異的に結合する」という語句は、ポリペプチドおよび他の生物製剤の不均一集団におけるポリペプチドの存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された免疫測定条件下において、特定のポリペプチドに結合した指定の抗体（または他の結合剤）は、試料中に存在する他のポリペプチドに相当量で結合しない。このような条件下における抗体の選択的結合は、特定のポリペプチドに対するその特異性のために選択される抗体を必要とする可能性がある。種々の免疫測定形式を使用して、特定のポリペプチドと選択的に結合する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定法は、ポリペプチドとの選択的免疫反応性を有する抗体を選択するために日常的に使用される。選択的結合を判定するために使用可能な免疫測定形式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照されたい。
【0032】
本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって調製することができる。例えば、ＳｅｒｐｉｎＦ２（またはその断片、溶解物等）は、ＳｅｒｐｉｎＦ２に結合することが可能なポリクローナル抗体を含有する血清の生成を誘発するために、動物に投与することができる。好ましい方法において、本発明のＳｅｒｐｉｎＦ２抗体の調製物を調製し、天然の混入物質を実質的に含まないように精製する。このような調製物を、次いで、より高度な特異活性のポリクローナル抗血清を生成するために、動物に導入する。
【0033】
本発明の抗体はまた、ファージディスプレイ技術を使用して調製することもできる。ファージディスプレイを使用して抗体を調製する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８、Ｈｕｓｅ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、Ｋａｎｇ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１１２０−１１１２３、Ｍａｒｋｓ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４を参照されたい。
【0034】
いくつかの場合において、種々の宿主からモノクローナル抗体（ＳｅｒｐｉｎＦ２結合分子）を調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”（Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）およびその中の参考文献、ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８に見出すことができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製することができる。一般に、このような手順は、抗原または抗原を発現する細胞で、動物（好ましくはマウス）に免疫付与を行うことを伴う。好ましい抗原は、精製されたＳｅｒｐｉｎＦ２またはそのフラグメントである。好適な細胞は、抗ＳｅｒｐｉｎＦ２抗体を分泌するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の好適な組織培養培地において培養することができるが、しかしながら、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で不活性化）を補充し、約１０ｕｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したアール変法イーグル培地で細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾臓細胞を抽出し、好適な骨髄腫細胞系と融合させる。体細胞融合方法は、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１）に記載される。融合した後、結果として得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地中で選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２で記載される限界希釈によってクローニングする。次いで、このような選択を通じて得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ＳｅｒｐｉｎＦ２に結合することができる抗体を分泌するクローンを識別する。
【0035】
あるいは、ＳｅｒｐｉｎＦ２抗原に結合することができる追加の抗体を、抗イディオタイプ抗体の使用を通じた２段階法で生成してもよい。このような方法は、抗体そのものが抗原であり、したがって、第２の抗体に結合する抗体を得ることができるという事実を利用する。この方法に従って、ＳｅｒｐｉｎＦ２特異的抗体を使用して、動物、好ましくはマウスに免疫付与を行う。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を生成し、このハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、ＳｅｒｐｉｎＦ２特異的抗体に結合する能力をＳｅｒｐｉｎＦ２抗原によって遮断することができる抗体を生成するクローンを識別する。このような抗体は、ＳｅｒｐｉｎＦ２特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、さらなるＳｅｒｐｉｎＦ２特異的抗体の形成を誘発する動物に免疫付与を行うために使用可能である。
【0036】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントを、本明細書に開示される方法に従って使用することができることが理解される。このようなフラグメントは、典型的に、タンパク質分解的切断によって、パパイン（Ｆａｂフラグメントの生成のため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの生成のため）等の酵素を使用して生成される。あるいは、ＳｅｒｐｉｎＦ２結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術の適用を通じて、合成化学、またはビオチニル化によって、生成されてもよい。
【0037】
上述のＭＡｂを生成するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用して生成された、ヒト化またはキメラ抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。ヒト化抗体は、マウスＡｂのフレームワークまたは他の領域が、非マウス抗体の相同領域で置き換えられた抗体である。キメラ抗体は、マウス定常領域が、非マウス定常領域で置き換えられている抗体である。キメラ抗体の生成方法は、当該技術分野で既知である。評論については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７（１９８５）、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）を参照されたく、また、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号（Ｍａｒ．２８，１９８９）、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第ＥＰ１７１４９６号（Ｆｅｂ．１９，１９８６）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，同第ＥＰ１７３４９４号（Ｍａｒ．５，１９８６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際特許第ＷＯ８６０１５３３号（Ｍａｒ．１３，１９８６）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，同第ＷＯ８７０２６７１号（Ｍａｙ７，１９８７）、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−６４６（１９８４）、およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−２７０（１９８５）も参照されたい。ヒト化抗体の生成方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−７８３（１９９１）号を参照されたい。
【0038】
（１）ヒトおよび非ヒトの血液循環中ＳｅｒｐｉｎＦ２、ならびに（２）ヒトおよび非ヒトフィブリン架橋ＳｅｒｐｉｎＦ２の両方に結合することができる抗体もまた、本発明において提供される。このような抗体は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、および米国特許第５，４５５，０３０号を参照されたく、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。上述の抗体の変異体もまた、本発明の範囲内であることが意図される。
【0039】
特に抗体またはそのフラグメントではないＳｅｒｐｉｎＦ２結合剤または分子もまた、本発明において提供される。このようなＳｅｒｐｉｎＦ２結合剤または分子のスクリーニングは、当該技術分野で日常的である。コンビナトリアルケミストリー技術を通じて生成される、対象とされる特定の既知の化合物または化合物のライブラリを、例えば、所望される結合および変換活性についてスクリーニングすることができる。さらに、ファージディスプレイ技術を使用して、例えば、所望される結合および変換活性について、ペプチドを識別することができる。一般に、ファージディスプレイは、ペプチドまたはタンパク質の変異体のライブラリがファージビリオンの外側に発現されるが、各変異体をコードする遺伝子材料はその内側に存在する、選択技術を説明する（Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．４：１４、Ｆｅｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．：５４，３２、ＢｏｕＨａｍｄａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８００９）。これは、各変異体タンパク質配列と、それをコードするＤＮＡとの間に物理的な連結を作出し、これが、パニングと称されるインビトロでの選択プロセスによって所与の標的分子に対する結合親和性に基づいた急速な分割を可能にする（Ｗｈａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０５，６６５）。その最も単純な形態において、パニングは、ファージディスプレイしたペプチドのライブラリを、標的でコーティングしたプレート（またはビーズ）とともにインキュベートし、未結合のファージを洗い落とし、特異的に結合したファージを溶出することによって行われる。次いで、溶出されたファージを増幅し、追加の結合／増幅サイクルを行って、プールを、結合配列に富むようにする。３〜４回行った後、個々のクローンを、ＤＮＡシークエンシングおよびＥＬＩＳＡによって特徴付ける。ファージディスプレイ技術の多数の変化形は、当業者に既知であり、本発明の目的に適合され得る。
【0040】
一実施形態において、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍａｓｓ，ＭＡ）によって提供されるようなファージディスプレイペプチドライブラリを使用する。事前に作成されたランダムなペプチドライブラリであるＰｈ．Ｄ．ライブラリは、エピトープマッピング、タンパク質−タンパク質結合の識別（Ｒｏｚｉｎｏｖ ａｎｄ Ｎｏｌａｎ，１９９８，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−２８）、および酵素阻害剤（Ｒｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：１９７−２０３）を含む、無数の類似用途に使用されている。
【0041】
本明細書に使用される際、「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒトであることを意図する。好ましくは、患者は、ヒトである。本明細書に使用される際、「投与する」という用語は、組成物を細胞または患者に導入する種々の手段を指す。これらの手段は、当該技術分野で周知であり、例えば、非経口送達のための注射または注入、経口投与のための錠剤、丸剤、カプセル、または他の固形物、点鼻液またはスプレー、エアロゾル、吸入剤、局所製剤、リポソーム製剤等が挙げられ得る。本明細書に使用される際、「有効量」および「治療量」という用語は、所望される結果をもたらすであろう量を指し、選択されたＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤の特異的活性および患者の状態に応じて、当業者によって容易に決定することができる。ある特定の実施形態において、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤の有効量または治療量は、２８〜９１ナノモル／ｋｇ、４．２〜１３．６５ｍｇ／ｋｇ、または１モルのＳｅｒｐｉｎＦ２に対して０．５〜１．０モルの阻害剤の用量範囲である。
【0042】
本発明の組成物は、種々の投与手段のために製剤化することができる。本明細書に使用される際、投与の「経路」という用語は、限定されないが、皮下注射、静脈内注射、眼内注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、気管内投与、硬膜外投与、吸入、鼻腔内投与、経口投与、舌下投与、口腔投与、直腸投与、膣内投与、および局所投与を含むことを意図する。活性成分として、ペプチド、抗体もしくは抗体フラグメント、アンチセンス核酸、受容体デコイ、リボザイム、センスポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アプタマー、または小分子作用物質を含有する水性組成物の調製は、本開示を踏まえると、当業者に理解されるであろう。典型的に、このような組成物は、注射剤として、溶液または懸濁液のいずれかとして調製され得、注射前に液体を添加することによって溶液または懸濁液を調製するために使用するのに好適な固体の形態もまた調製可能であり、調製物はまた、乳化されてもよい。
【0043】
注射剤に好適な医薬品形態には、滅菌水溶液もしくは懸濁液、ゴマ油、ピーナツ油、もしくは水性プロピレングリコールを含む製剤、および滅菌注射溶液もしくは懸濁液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は、滅菌でなければならず、注射可能性が存在する程度に流体でなければならない。これは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。
【0044】
本発明の組成物は、中性形態または塩形態で、滅菌水性組成物に製剤化することができる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての溶液を、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成）、および例えば、塩酸もしくはリン酸等の無機酸、または酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸とともに形成されたものが挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成された塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。
【0045】
好適な担体には、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する、溶媒および分散媒が挙げられる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用によって、分散剤の場合は必要な粒径の維持によって、および／または界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【0046】
保管および使用の通常の条件下において、全てのこのような調製物は、微生物の成長を予防するために、保存剤を含むべきである。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって、もたらされ得る。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【0047】
製剤化の前、またはその時点で、本発明の組成物は、必要に応じて、望ましくない低分子量分子を除去するために広範囲にわたって透析される、および／または所望されるビヒクル中へのより迅速な製剤化のために凍結乾燥されるべきである。滅菌注射可能溶液は、必要な量の活性剤を、必要に応じて、上に列挙された種々の他の成分とともに、適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、種々の滅菌された活性成分を、標準的な分散媒と上に列挙されたものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。
【0048】
滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合では、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末に加えて、任意の追加の所望される成分が、事前に滅菌濾過されたその溶液から得られる、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【0049】
本発明による好適な医薬組成物は、一般に、意図される使用に応じて、様々な範囲の最終濃度を得るために、滅菌水溶液等の許容される薬学的希釈剤または賦形剤と混合される、ある量の活性成分を含む。調製技術は、概して、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８０によって例示されるように、当該技術分野で周知である。ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される滅菌性、発熱性、ならびに一般的安全性および純度基準を満たす必要があることを理解されたい。
【0050】
長期虚血と関連する、および／またはＳｅｒｐｉｎＦ２の活性と関連する、内在性かまたは外的に投与されたかのいずれかである組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）によって誘発される神経毒性の危険性にある患者において、細胞傷害、神経損傷、腫脹、機能障害、死亡、および脳出血を予防および／または低減させるための本開示の方法に使用される化合物または分子の有効量を含む、医薬組成物を提供する。虚血を有する患者において有効な治療の時間枠を延長させることによって、神経損傷、機能障害、死亡、または出血を減少させるための本開示の方法に使用される化合物または分子の有効量を含む、医薬組成物もまた提供される。
【0051】
長期虚血、外傷、または脳傷害の原因は、まず、筋力低下、発話変容、意識変容、発作、または正常神経機能の他の障害を含み得る神経症状によって明らかとなる。医師または他の好適に訓練された医療従事者は、患者の面談および検査の後、長期虚血状態、外傷、または脳卒中発症の診断の判定を行う。診断は、動脈閉塞、脳低灌流、梗塞、神経細胞損傷、浮腫等の兆候を明らかにすることが可能な動脈造影法、またはＣＴ、ＭＲＩ、もしくはＰＥＴスキャニング、または他の脳の画像検査によって、確認または否定することができる。さらに、診断検査（例えば、画像、ＥＥＧ、血液検査等）を使用して、重大な頭蓋内出血、非虚血性発作の場合等、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤が不適切であろう状態を識別することができる。本発明は、神経症状および障害をもたらしている長期虚血、外傷、または脳への他の傷害の判定または診断後に、ＳｅｒｐｉｎＦ２結合剤の投与を提供する。このような障害は、Ｒａｎｋｉｎスケール、ＮＩＨ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ、Ｇｌａｓｇｏｗスケール等の臨床スケールにより評価することができる。
【0052】
本発明はまた、予測される虚血、外傷、または傷害の前に、ＳｅｒｐｉｎＦ２結合剤を投与する方法を提供するが、ただし、患者が、許容されない出血の危険性を排除されていることを条件とする。このような事例において、虚血は、頸動脈内膜剥離術中、脳塞栓を併発する心臓もしくは主幹動脈手術の後、または心臓弁膜手術後等、脳血管の閉塞によって誘発され得る。患者の虚血状態のこのような判定は、診断検査の試験および実施下における患者の処置を通じた、問題の身体的変換および／または医療機器の使用を伴う。
【0053】
上記は本発明の好ましい実施形態に関するものであり、多数の変更が、本発明の範囲から逸脱することなくそこになされ得ることもまた、理解されたい。本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは、決してその範囲に制限を課すとして解釈されるものではない。逆に、種々の他の実施形態、その修正、および同等物を用いることができ、これらは、本明細書の説明を読むことで、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者に示され得ることを、明確に理解されたい。
【実施例】
【0054】
方法ＭＣＡ血栓塞栓症モデル４７、４８。正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ成体マウス（２９〜３５ｇ）を、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。マウスを、制御された温度および湿度で定期的な１２時間の明／暗サイクルのマイクロ隔離ケージに収容し、餌および水に自由にアクセスさせた。実験は、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＤＨＨＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．（ＮＩＨ）８５−２３ Ｒｅｖｉｓｅｄ １９８５）に記載されるガイドラインを守り、ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ’ｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で行った。マウスに、手術中、ＴＯＰＯ Ｄｕａｌ Ｍｏｄｅ Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ（Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ，Ｔｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）を使用して、記載のように、１．５〜２％のイソフルランおよびＯ２を用いて人工呼吸を行った４９。体温を、加温パッドを用いて３７℃で維持した。脳血流を、光ファイバープローブを有するレーザードップラー監視器によって監視した（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＰｏｗｅｒＬａｂ ２／２６、血流メータＭＬ１９１、ＯｘｙＦｌｏ Ｐｒｏｂｅ ＭＳＦ１００ＸＰ）。左総頸動脈を、頸部切開後に単離し、外頸動脈、甲状腺、および後頭動脈を、結紮した。微小血管クリップを、総頸動脈および内頚動脈に一時的に設置した。小動脈切開を、凝血を含有するＰＥ８カテーテルの逆行性挿入のために外頸動脈に行った。凝血を、１２５Ｉ−フィブリノゲン（約１００，０００ｃｐｍ／２０ｕｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＮＥＸ４３０１１０ＵＣ）と混合した正常マウスからのプールした新鮮凍結物から作製し、エバンスブルー染料で染色した。凝血を含有するＰＥ８管を、γ線シンチレーション計測器で計測し、左外頸動脈に挿入し、ＩＣＡからＭＣＡの起点まで挿入し、１００ｕｌ体積の生理食塩水中、０．４５ｍＬ／分の速度で、血栓塞栓形成を行った。Ｇｅｉｇｅｒ−Ｍｕｌｌｅｒ計測器を使用して、適切な塞栓形成を確認した。
【0055】
塞栓後の適切な時点で、ＴＰＡ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）をボーラスで与え（用量の２０％）、続いて、反対側の頸静脈を介して、３００ｕｌ中の生理食塩水中で、３０分間にわたり注入した（用量の８０％）。他の実験においては、ＴＰＡおよび／もしくはＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤（４Ｈ９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）、またはＳｅｒｐｉｎＦ２もしくは生理食塩水（対照）を、反対側の頸静脈を介して投与した。４時間の虚血後、動物を安楽死させ、クエン酸血を心穿刺によって単離し、組織を、記載したように灌流させた４９。脳を、２ｍｍ切片に冠状に切断し、肉眼的出血をデジタルで画像化するために撮影した。切片を、ＴＴＣにおいてインキュベートして、生存組織を識別した。脳卒中後の生存および障害を調査する実験においては、動物に、血栓塞栓の３０分またはそれ以上後に、示される薬剤を投与した。
【0056】
脳半球寸法、肉眼的出血の範囲、および神経傷害の範囲を、盲検の試験員がＩｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．２ソフトウェアを使用してデジタル分析し、切片の厚さで乗じて、Ｓｗａｎｓｏｎ法を用いて体積（ｍｍ）３を判定した５０。平均体積は、脳あたり少なくとも８つの異なる測定から判定した。各郡の平均値の平均を、Ｎｅｕｍａｎ Ｋｅｕｌｓ補正を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって比較した。溶解物の量を、記載したように、脳内の残存血栓放射を初期凝血のものと比較することにより判定した５１。
【0057】
プラスミノーゲンおよびフィブリノゲンのレベルを、記載したように、脳卒中後、血漿において二重に測定した５２。各郡の平均値の平均を、Ｎｅｕｍａｎ Ｋｅｕｌｓ補正を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって比較した。
【0058】
データ分析統計的分析を上述のように実行し、群間の相違は、Ｐ＜０．０５の場合に有意であると見なした。データは、平均±標準誤差として報告する。
【0059】
結果血栓塞栓は、典型的に、脳半球血流を約８０％低減させた（図１Ａ）。血栓塞栓は、ＭＣＡの近位に容易に検出され（図１Ｂ）、罹患した皮質の白化が見られた（示されない）。プラセボ（対照）で処置した血栓塞栓群のマウスには、広範囲の神経細胞死が見られたが、血栓塞栓を受容しなかった偽処置群のマウスには神経細胞死は見られなかった。脳卒中後の内在性ＴＰＡ活性の亢進についての以前の報告と一致して、対照には血栓塞栓の有意な線維素溶解が見られた（２０．６±２．５％）５３、５４。
【0060】
先行研究とは対照的に３６、ＳｅｒｐｉｎＦ２の投与は、予想外にも、対照と比較して、神経細胞損傷を減少させるのではなく増加させた。（ｐ＜０．０１、図３Ａ、Ｂ）。ＳｅｒｐｉｎＦ２の投与は、対照マウスまたはＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤を受けたマウスと比較して、血栓塞栓の溶解物を有意に減少させた（ｐ＜０．０１）。ＳｅｒｐｉｎＦ２の投与はまた、虚血脳半球における腫脹または浮腫を著しく増加させ、これはもう１つの予想外の発見であった（図３Ｃ、ｐ＜０．０５）。対照またはＳｅｒｐｉｎＦ２処置マウスのいずれにも、脳出血は検出されなかった。
【0061】
ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤でのマウスの処置は、ＴＰＡ処置マウス（ｐ＜０．０００５、図２ａ）または対照マウス（ｐ＜０．００５、図３Ａ）と比較して、死亡率を著しく低減させた。この効果は、完全モノクローナル抗体およびＦａｂフラグメントの両方が、ＴＰＡ（ｐ＜０．００１、図３Ａ）および対照（ｐ＜０．０１、図３Ａ）と比較して、生存を助けたことから、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤の分子形態に依存するものではない。生存効果はまた、用量依存性であった：低容量のＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤は、より高用量のものよりも効果が低かったが（ｐ＝０．０５、示されない）、対照およびＴＰＡと比較して、依然として死亡率を低減させた（ｐ＝０．０１）。初期脳卒中期間（＞１２時間）を生存したマウスの脳の顕微鏡検査は、ＳｅｒｐｉｎＦ２の不活性化が、完全抗体またはＦａｂの形態にかかわらず、対照またはＴＰＡ処置マウスと比較して、神経細胞死を低減させたことを示した（図３Ｂ、ｐ＜０．００１）。ＳＦ２の不活性化は、対照マウス（図３Ｃ、ｐ＜０．０１）またはＴＰＡを受容したもの（図３Ｃ、ｐ＜０．０５）と比較して、脳出血を予防した。完全抗体またはＦａｂによるＳｅｒｐｉｎＦ２の不活性化は、対照（図３Ｄ、ｐ＜０．００１）およびＴＰＡ処置マウス（図３Ｄ、ｐ＜０．０５）と比較して、脳腫脹を予防した。脳卒中後の機能的制限を判定するために、挙動試験を、回復の１週間後に行った。生存は、対照またはＴＰＡ処置マウスでは著しく制限され、したがって、外科処置を受けたが脳卒中を有さない偽処置マウスを、比較に使用した。脳卒中を有さない偽処置マウスと比較すると、ＳＦ２−Ｉでの処置は、脳卒中後のマウスの標準的な挙動試験である回転シリンダー（ロータロッド）上でバランスを維持する能力によって判断した場合、マウスの障害を予防した（図３Ｅ）５５。
【0062】
通常、中大脳動脈の閉塞は、神経回復の乏しさ、より高い死亡率、および脳浮腫または腫脹と関連する５６。脳腫脹は、血液から脳組織への流体の移動を可能にする、血液脳関門の破壊に起因する。血液脳関門の開放は、部分的に、脳卒中後の血管周囲組織中の内在性ＴＰＡ活性の増加に起因する５７。対照脳の顕微鏡分析は、血漿タンパク質であるアルブミンのレベルが、脳卒中のない側の脳（ｐ＜０．００５）または偽処置（ｐ＜０．００１、示されない）と比較して、脳卒中を罹患した側の脳では、数倍増加したことを示した。アルブミンの染色は、血管周囲領域において最も強力であった。対照と比較すると、ＳＦ２の阻害は、低減した血液脳関門破壊と一致して、アルブミンの染色を有意に低減させた（図４Ａ、ｐ＜０．０１）。ＭＭＰ−９は、血液脳関門の破壊に寄与する５８。ＭＭＰ−９のレベルは、脳卒中後に増加し５８、ヒトにおける出血の危険性の増加と関連する５９。ＭＭＰ−９の発現は、典型的に血液脳関門と関連する星状膠細胞足突起領域に見られることが多かった。対照マウスと比較すると、ＳＦ２の阻害は、ＭＭＰ−９発現を有意に低減させた（図４Ｂ、ｐ＜０．００１）。ＳＦ２の阻害が、神経細胞死、ＭＭＰ−９発現、および血液脳関門の破壊を低減させたため、これは、アポトーシスと関連する脳細胞死もまた減少させ得る。この概念と一致して、ＴＵＮＥＬ染色細胞パーセントは、対照と比較して、ＳＦ２不活性化因子で処置したマウスでは有意に減少した（図４Ｃ、ｐ＜０．０１）。さらに、より特異的なアポトーシス指標である切断されたカスパーゼ３に対する染色もまた、ＳＦ２不活性化因子で処置したマウスにおいて低減された（図４Ｄ、ｐ＜０．００１）。
【0063】
ＴＰＡは、現在のところ唯一のＦＤＡに認可された虚血性脳卒中の治療である。ヒト脳卒中の典型的な治療時間を想定した、２．５時間の虚血後のマウスへの標準用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＰＡ投与は、対照と比較して、神経細胞死を有意に増加させ（ｐ＜０．０１、図５Ａ）、ＴＰＡが神経傷害を亢進したことを示す。標準用量のＴＰＡはまた、血栓塞栓の分解を有意に増加させ（ｐ＜０．０１、図５Ｂ）、脳出血の顕著な増加をもたらした（ｐ＜０．０５、図５Ｃ）。２．５時間の虚血後の低用量のＴＰＡ（２ｍｇ／ｋｇ）の投与は、対照マウスと比較して、神経細胞死を亢進した（ｐ＜０．０１、図５Ａ）。低用量のＴＰＡは、血栓の分解の有意な増加も出血の増加も行わなかった（図５ＢおよびＣ）。
【0064】
先行研究は、ＳｅｒｐｉｎＦ２の投与が、ＴＰＡに誘発される神経毒性を低減させることを示唆していた３５。驚くべきことには、しかしながら、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤とともに標準用量のＴＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与することにより、ＴＰＡ単独と比較して、神経損傷が著しく低減した（図６Ａ、ｐ＜０．０１）。同様に、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤とともに低用量のＴＰＡを投与することにより、低用量のＴＰＡ単独と比較して、神経損傷が有意に低減した（ｐ＜０．０１）。最後には、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤とともに標準用量のＴＰＡを投与することにより、標準用量のＴＰＡ単独によって引き起こされる出血が著しく低減した（図６Ｂ、ｐ＜０．０１）。
【0065】
ＳｅｒｐｉｎＦ２が、神経細胞死に対するＴＰＡの作用を亢進すると見られることから、ＳＦ２−Ｉが、血栓塞栓性脳卒中後のＴＰＡ関連の死亡率を低減させるかどうかを試験した。死亡率は、ＴＰＡ処置後、７８％であったが、マウスをＴＰＡおよびＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤で処置した場合、０％であった（ｐ＝０．００５）。ＴＰＡおよびＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤での処置は、ＴＰＡ単独と比較して、神経細胞死を低減させた（図７Ａ、ｐ＜０．０１）。ＴＰＡおよびＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤での処置はまた、ＴＰＡ単独と比較して、失血を予防した（図７Ｂ、ｐ＜０．００１）。最後には、ＴＰＡおよびＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤の組み合わせは、ＴＰＡ単独と比較して、脳半球腫脹を有意に低減させた（図７Ｃ、ｐ＜０．０５）。総合すると、これらの研究は、ＳｅｒｐｉｎＦ２の阻害は、内在性および外的ＴＰＡの作用を逆行させ、虚血性脳卒中後の生存を有意に増加させる。これは、ＳｅｒｐｉｎＦの阻害が、脳卒中後の死亡および障害の主要な原因である出血および脳腫脹を予防するという事実と関連すると考えられる。
【0066】
ＳＦ２の阻害は、ＴＰＡに誘発される出血を低減させるため、これはまた、ＴＰＡ処置マウスにおける血液脳関門の完全性を保護することができる。ＴＰＡ単独で処置したマウスにおいては、コラーゲンＩＶ免疫染色によって識別される、血管裂孔の外側へのアルブミンの漏出が見られた（図８Ａ）。対照的に、アルブミンの漏出は、血液脳関門の破壊の低減と一致して、ＴＰＡおよびＳＦ２−Ｉで処置したマウスにおいて著しく低減された（図８Ａ、ｐ＜０．０５）。マトリックスメタロプロテアーゼ−９は、ＴＰＡ療法後の血液脳関門の破壊、出血、および脳浮腫の重要な媒介物質として識別されている６０、６１。ＴＰＡ処置マウスは、対照の未処置マウスよりも有意に高い、脳内のＭＭＰ−９の発現を示した（ｐ＜０．０１）。ＴＰＡおよびＳＦ２−Ｉでの併用療法は、ＭＭＰ−９レベルを著しく低減させた（図８Ｂ、ｐ＜０．０１）。ＴＰＡ処置はまた、脳卒中領域におけるアポトーシスの亢進と一致して、ＴＵＮＥＬ染色を有意に強化した（図８Ｃ）。比較すると、ＴＰＡおよびＳＦ２−Ｉの組み合わせは、アポトーシスに対する保護と一致して、ＴＵＮＥＬ染色を著しく低減させた（図８Ｃ、ｐ＜０．００１）。
【0067】
機械的閉塞および脳傷害のモデルにおいて、ＴＰＡ発現は、脳傷害後に強化される２８〜３０。これらのモデルにおいて、内在性および薬理学的ＴＰＡはいずれも神経毒性であり、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤は、神経毒性を低減させる３１〜３３。多数の異なる機構が、ＴＰＡの神経毒性を説明するために提示されている２７、６１。しかしながら、ヒト脳卒中の圧倒的多数が、血栓性または血栓塞栓性の動脈閉塞に起因するため、非血栓的方法で観察されたＴＰＡの神経毒性が、血栓分解におけるＴＰＡの作用が神経保護であり得るヒト虚血性脳卒中との限定された翻訳関連性を有し得ることが議論されている６２。ヒト脳卒中との翻訳関連性を有する様式で、ＴＰＡの全体的な神経保護および神経毒性作用を試験するために、Ｚｈａｎｇら４７によって記載される血栓塞栓性脳卒中モデルを、改良した。結果は、異なる虚血期間後の神経細胞死、出血、線維素溶解、および腫脹の同時試験を可能にする、大血管（ＭＣＡ）血栓塞栓症の再生可能モデルであった。
【0068】
ほとんどのヒトに、２時間以上の虚血後、脳卒中が現れた。血栓塞栓の２．５時間後、すなわち、ヒト治療の時期をより厳密に想定した時点で、ＴＰＡ処置を行った場合、神経毒性作用を有した。血栓塞栓の分解の増加が成功したにもかかわらず、ＴＰＡはまた、神経細胞死および脳出血も有意に増加させた。ＴＰＡでの処置はまた、血栓塞栓性脳卒中後の生存率に影響を及ぼした。ＴＰＡで処置したマウスは、治療の２４時間後、有意な死亡率を有した（７８％）。これらの致死的な神経毒性作用は、プラスミノーゲン（ｐ＜０．０１）およびフィブリノゲン消費（ｐ＜０．００１）によって示されるように、ＴＰＡが全身的プラスミノーゲン活性化を誘発しているという明らかな証拠にもかかわらず、生じた。
【0069】
機械的閉塞を用いた先行研究は、ＳｅｒｐｉｎＦ２が、ＴＰＡの神経毒性から保護することを示す３６。ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤を用いた先行研究は、それらが、ＴＰＡ活性を直接亢進することを示す（米国特許第６，１１４，５０６号）。ＴＰＡ活性の増加は、長期虚血後の神経細胞死の増加、出血（図５）、死亡（図３）、血液脳関門の破壊、ＭＭＰ−９発現の増加、およびアポトーシス（図６）と関連する。したがって、ＳｅｒｐｉｎＦ２阻害剤が、ＴＰＡのこれらの神経毒性作用を著しく低減させることは、予測されない。
【0070】
要約すると、虚血性脳卒中の血栓塞栓モデルにおいて、標準用量および低用量のＴＰＡは、長期虚血後の線維素溶解の成功を伴ってまたは伴わずに、神経細胞死を引き起こした。以前の予想とは対照的に、ＳｅｒｐｉｎＦ２の阻害剤での処置は、薬理学的および内在性ＴＰＡの神経毒性を著しく低減させ、血栓塞栓性脳卒中後の生存率を高めた。
【0071】
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２０． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＫＣ，Ｗａｇｎｅｒ ＤＰ，Ｗａｎｇ ＸＱ，ｅｔ ａｌ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｍｏｄｅｌ：ｄｏｅｓ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｌｅｓｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆｆｅｒ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｕｔｃｏｍｅ？Ｓｔｒｏｋｅ ２００７；３８：１８２０−５．
２１． Ｓａｖｅｒ ＪＬ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＫＣ，Ｈｏｍｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ ａｓ ａ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｏｒ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｏｕｔｃｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｔｈｅ ＲＡＮＴＴＡＳ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｓｔｒｏｋｅ １９９９；３０：２９３−８．
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２３． Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ ＡＶ，Ｄｅｍｃｈｕｋ ＡＭ，Ｆｅｌｂｅｒｇ ＲＡ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒａｍａｔｉｃ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔＰＡ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｗｈｅｎ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｗｉｔｈ ２−ＭＨｚ ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ ｄｏｐｐｌｅｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．Ｓｔｒｏｋｅ ２０００；３１：６１０−４．
２４． Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ＴＧ，Ｌｉｂｍａｎ ＲＢ，Ｆｒａｎｋｅｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ａｔ ｏｎｅ ｙｅａｒ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９９；３４０：１７８１−７．
２５． Ｌｅｖｙ ＤＥ，Ｂｒｏｔｔ ＴＧ，Ｈａｌｅｙ ＥＣ，Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｈｅｍａｔｏｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｏｒ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ．Ｓｔｒｏｋｅ １９９４；２５：２９１−７．
２６． Ｌｅｅｓ ＫＲ，Ｂｌｕｈｍｋｉ Ｅ，ｖｏｎ Ｋｕｍｍｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｍｅ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｌｔｅｐｌａｓｅ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ：ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＥＣＡＳＳ，ＡＴＬＡＮＴＩＳ，ＮＩＮＤＳ，ａｎｄ ＥＰＩＴＨＥＴ ｔｒｉａｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１６９５−７０３．
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２８． Ｓｔｅｈｌｉｎｇ Ｆ，Ｗｅｂｅｒ Ｒ，Ｏｚｃｅｌｉｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｕｔｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ２００８；４４１：３９−４３．
２９． Ｄｉｅｔｚｍａｎｎ Ｋ，ｖｏｎ Ｂｏｓｓａｎｙｉ Ｐ，Ｋｒａｕｓｅ Ｄ，Ｗｉｔｔｉｇ Ｈ，Ｍａｗｒｉｎ Ｃ，Ｋｉｒｃｈｅｓ Ｅ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ＰＡＩ−１ ａｎｄ ＰＡＩ−２ ｉｎ ｐｏｓｔｔｒａｕｍａｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＮＳ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｉｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｒａｍａｔｉｃ ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ａｒｒｅｓｔｓ：ａｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ２０００；１９６：１５−２１．
３０． Ｎａｇａｉ Ｎ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ，Ｖａｎ Ｈｏｅｆ Ｂ，Ｌｉｊｎｅｎ ＨＲ，Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００５；３：１３７９−８４．
３１． Ｗａｎｇ ＹＦ，Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｓ，Ｓｔｉｅｇ ＰＥ，Ｓｏｒｉａｎｏ ＳＧ，Ｌｉｐｔｏｎ ＳＡ．Ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔＰＡ）ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ ａｆｔｅｒ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ａｎｄ ｔＰＡ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９８；４：２２８−３１．
３２． Ｎａｇａｉ Ｎ，Ｄｅ Ｍｏｌ Ｍ，Ｌｉｊｎｅｎ ＨＲ，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ Ｐ，Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ａ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９；９９：２４４０−４．
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３５． Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ，Ｂｕｇｇｅ ＴＨ，Ｄｅｇｅｎ ＪＬ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｓ．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ａ ｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｐｌａｓｍｉｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １９９７；９４：９７７９−８１．
３６． Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ，Ｒｏｇｏｖｅ ＡＤ，Ｂｕｇｇｅ ＴＨ，Ｄｅｇｅｎ ＪＬ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｓ．Ａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃａｓｃａｄｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９７；１７：５４３−５２．
３７． Ｙｅｐｅｓ Ｍ，Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ Ｍ，Ｃｏｌｅｍａｎ ＴＡ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｉｚｕｒｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｂｙ ｎｅｕｒｏｓｅｒｐｉｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｓ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００２；１０９：１５７１−８．
３８． Ｓｕｒｉ ＭＦ，Ｙａｍａｇｉｓｈｉ Ｋ，Ａｌｅｋｓｉｃ Ｎ，Ｈａｎｎａｎ ＰＪ，Ｆｏｌｓｏｍ ＡＲ．Ｎｏｖｅｌ ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｒｉｓｋ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ：ｔｈｅ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｒｉｓｋ ｉｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（ＡＲＩＣ）Ｓｔｕｄｙ．Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ ２０１０；２９：４９７−５０２．
３９． Ｍａｒｔｉ−Ｆａｂｒｅｇａｓ Ｊ，Ｂｏｒｒｅｌｌ Ｍ，Ｃｏｃｈｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｔ−ＰＡ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００５；６５：３６６−７０．
４０． Ｒｏｅｌｏｆｓ ＪＪ，Ｒｏｕｓｃｈｏｐ ＫＭ，Ｌｅｅｍａｎｓ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００６；１７：１３１−４０．
４１． Ｚｈａｏ Ｙ，Ｓｈａｒｍａ ＡＫ，ＬａＰａｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｌｕｎｇ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｖｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１１；３００：Ｌ７１８−２９．
４２． Ｈｏｎｇ ＴＴ，Ｈｕａｎｇ Ｊ，Ｌｕｃｃｈｅｓｉ ＢＲ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｖｓ．ａｌｆｉｍｅｐｒａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００６；２９０：Ｈ９５９−６７．
４３． Ｋｕｍａｄａ Ｍ，Ｎｉｗａ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ＮＭＤＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｄａｍａｇｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００４；２００：４８−５３．
４４． Ｄｅｌ Ｚｏｐｐｏ ＧＪ．Ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ：ａ ＰＡＩ−１ ｃｏｎｕｎｄｒｕｍ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００５；３：１３７６−８．
４５． Ａｏｋｉ Ｔ，Ｓｕｍｉｉ Ｔ，Ｍｏｒｉ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｌｏ ＥＨ．Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ：ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｖｅｒｓｕｓ ｅｍｂｏｌｉｃ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｒａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ ２００２；３３：２７１１−７．
４６． Ａｓａｈｉ Ｍ，Ｈｕａｎｇ Ｚ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔａｔｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｂｏｔｈ ｅＮＯＳ ａｎｄ ｔＰＡ ｉｎ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２００５；２５：７２２−９．
４７． Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ，Ｚｈａｎｇ ＲＬ，Ｇｏｕｓｓｅｖ Ａ．Ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｍｂｏｌｉｃ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９９７；１７：１０８１−８．
４８． Ｚｈａｎｇ ＺＧ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｄｉｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｎｉ−ｅｍｂｏｌｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｏｆｆｅｒｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｕｎｉｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｉｎｇ ｍｏｕｓｅ．Ｓｔｒｏｋｅ ２００５；３６：２７０１−４．
４９． Ｈｏｕｎｇ ＡＫ，ＭｃＮａｍｅｅ ＲＡ，Ｋｅｒｎｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ，ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００９；２９６：Ｈ６５５−６１．
５０． Ｓｗａｎｓｏｎ ＲＡ，Ｍｏｒｔｏｎ ＭＴ，Ｔｓａｏ−Ｗｕ Ｇ，Ｓａｖａｌｏｓ ＲＡ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｃ，Ｓｈａｒｐ ＦＲ．Ａ ｓｅｍｉａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９９０；１０：２９０−３．
５１． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＢＲ，Ｈｏｕｎｇ ＡＫ，Ｒｅｅｄ ＧＬ．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｌｉｆｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＸＩＩＩ ｉｎ ｔｈｒｏｍｂｉ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｕｓ ａｇｉｎｇ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００；１０２：１１５１−７．
５２． Ｓａｚｏｎｏｖａ ＩＹ，ＭｃＮａｍｅｅ ＲＡ，Ｈｏｕｎｇ ＡＫ，Ｋｉｎｇ ＳＭ，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ Ｌ，Ｒｅｅｄ ＧＬ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｆｉｂｒｉｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｓｏｌｖｅ ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｓ ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｔｈａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００９；７：１３２１−８．
５３． Ｚｕｎｋｅｒ Ｐ，Ｓｃｈｉｃｋ Ａ，Ｐａｄｒｏ Ｔ，Ｋｉｅｎａｓｔ Ｊ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ａ，Ｒｉｎｇｅｌｓｔｅｉｎ ＥＢ．Ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔｒｏｋｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９；２１：７２７−３２．
５４． Ｗａｎｇ Ｘ，Ｌｅｅ ＳＲ，Ａｒａｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００３；９：１３１３−７．
５５． Ｈｕｎｔｅｒ ＡＪ，Ｈａｔｃｈｅｒ Ｊ，Ｖｉｒｌｅｙ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ ａｆｔｅｒ ｆｏｃａｌ ｓｔｒｏｋｅ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０００；３９：８０６−１６．
５６． Ｈｅｉｎｓｉｕｓ Ｔ，Ｂｏｇｏｕｓｓｌａｖｓｋｙ Ｊ，Ｖａｎ Ｍｅｌｌｅ Ｇ．Ｌａｒｇｅ ｉｎｆａｒｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ．Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９９８；５０：３４１−５０．
５７． Ｙｅｐｅｓ Ｍ，Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ Ｍ，Ｍｏｏｒｅ ＥＧ，Ｂｕｇｇｅ ＴＨ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ＤＫ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＤＡ．Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ ｏｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｖｉａ ｔｈｅ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：１５３３−４０．
５８． Ａｓａｈｉ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｍｏｒｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｍａｔｔｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００１；２１：７７２４−３２．
５９． Ｍｏｎｔａｎｅｒ Ｊ，Ｍｏｌｉｎａ ＣＡ，Ｍｏｎａｓｔｅｒｉｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｔｒｏｋｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３；１０７：５９８−６０３．
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６２． Ｔａｂｒｉｚｉ Ｐ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｓｅｅｄｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔＰＡ）ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｆｉｂｒｉｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｓｔｒｏｋｅ ｍｏｄｅｌ：ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔＰＡ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｍｉｃｅ ｏｎ ａ ｍａｔｃｈｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １９９９；１９：２８０１−６．