特許 6185468 原核細胞内においてヘアピン様ＲＮＡを発現させる方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6185468

(24)【登録日】2017年8月4日

(45)【発行日】2017年8月23日

(54)【発明の名称】原核細胞内においてヘアピン様ＲＮＡを発現させる方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/38 20060101AFI20170814BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170814BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170814BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20170814BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20170814BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20170814BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20170814BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170814BHJP

   A61K 38/28 20060101ALI20170814BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/38

   C12N1/21

   C12N15/00 AZNA

   C12N15/00 G

   A61K31/7105

   A61K48/00

   A61P35/00

   A61P17/02

   A61K38/43

   A61K39/395 J

   A61K38/28

【請求項の数】34

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2014-525992(P2014-525992)

(86)(22)【出願日】2012年2月21日

(65)【公表番号】特表2014-530596(P2014-530596A)

(43)【公表日】2014年11月20日

(86)【国際出願番号】US2012025893

(87)【国際公開番号】WO2013025248

(87)【国際公開日】20130221

【審査請求日】2015年1月7日

(31)【優先権主張番号】61/522,843

(32)【優先日】2011年8月12日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514036689

【氏名又は名称】メロ バイオテクノロジー インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＥＬＬＯ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】リン、シー−ラン

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ドナルド シー．

【審査官】 布川 莉奈

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０７−０５９５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３９９３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３６８２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２９６００８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Corona-Izquierdo FP. et al.，Biofilm formation in Escherichia coli is affected by 3-(N-morpholino)propane sulfonate (MOPS).，Res Microbiol. ，２００２年 ４月，153(3)，p.181-5.

【文献】 Yu M. et al.，Expression of an antibody-targeted plasminogen activator in Escherichia coli using chemically induced stress responses.，Biotechnol Lett. ，２００４年１１月，26(21)，p.1629-34

【文献】 Larsen MD. et al.，Bactofection of lung epithelial cells in vitro and in vivo using a genetically modified Escherichia coli. ，Gene Ther. ，２００８年 ３月，15(6)，p.434-42

【文献】 Hounsa CG. et al.，Application of factorial and Doehlert designs for optimization of pectate lyase production by a recombinant Escherichia coli.，Appl Microbiol Biotechnol.，１９９６年 ７月，45(6)，p.764-70

【文献】 Lewin A. et al.，Viral promoters can initiate expression of toxin genes introduced into Escherichia coli.，BMC Biotechnol. ，２００５年 ６月２０日，5:19，p.1-9

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

原核細胞内において真核プロモーター駆動性遺伝子の発現を誘導してヘアピン様ＲＮＡを発現させる方法であって、３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール、グリセリン、及びそれらの混合物のうちから選択される化学剤と、ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡ及びタンパク質をコードする少なくとも真核プロモーター駆動性遺伝子を有する原核細胞とを接触させることを含み、
前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡが、前記真核プロモーター駆動性遺伝子の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）にコードされている、方法。

【請求項2】

前記化学剤は遺伝子発現の転写誘導物である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記原核細胞を細菌培地中で維持することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記化学剤は、前記細菌培地内において０．０１％〜１％の濃度（ｖ／ｖ）を有する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記細菌培地はルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地である、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記タンパク質及び前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡの少なくとも一方は薬学上又は治療上の適用に有用である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡは、薬学上又は治療上の適用に有用である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡは、ｍｉＲ−３０２ホモログである、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記タンパク質は、薬学上又は治療上の適用に有用である、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記薬学上又は治療上の適用は、多能性幹細胞の生成、幹細胞研究及び治療、癌治療及び疾患治療、傷口治癒処理、ならびに食物収量及び薬物供給の向上からなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。

【請求項11】

原核細胞内において真核プロモーター駆動性遺伝子の発現を調節してヘアピン様ＲＮＡを発現させるための組成物であって、
（ａ）真核プロモーター駆動性遺伝子によるヘアピン様ＲＮＡの発現を誘導又は促進可能な、３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール、グリセリン、及びそれらの混合物のうちから選択される化学剤と、
（ｂ）ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡ及びタンパク質コーディングＲＮＡをコードする真核プロモーター駆動性遺伝子であって、前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡが前記真核プロモーター駆動性遺伝子の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）にコードされている、前記真核プロモーター駆動性遺伝子を含有する複数の原核細胞とを含み、
（ａ）及び（ｂ）は、これらの原核細胞内において真核プロモーター駆動性遺伝子発現を誘発しヘアピン様ＲＮＡを発現させる条件下で混合される組成物。

【請求項12】

前記真核プロモーター駆動性遺伝子は、前記ヘアピン様ＲＮＡの発現を駆動する真核プロモーターを含むベクターにクローニングされている、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも、マイクロＲＮＡと３０％〜１００％の相同性を有する配列を含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

前記タンパク質コーディングＲＮＡは、真核遺伝子のｃＤＮＡ配列と３０％〜１００％の相同性を有する、請求項１１に記載の組成物。

【請求項15】

前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡ又はタンパク質コーディングＲＮＡは、前記原核細胞から分離されるものである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項16】

前記真核プロモーター駆動性遺伝子は、更にペプチドをコードする、請求項１１に記載の組成物。

【請求項17】

前記タンパク質又はペプチドは、前記原核細胞から分離されるものである、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記タンパク質は、酵素又は抗体である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項19】

前記タンパク質は、インスリンのペプチド配列を含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項20】

前記タンパク質は、増殖因子と類似するペプチド配列を含む、請求項１１に記載の組成物。

【請求項21】

前記原核細胞は、細菌細胞である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項22】

前記原核細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項23】

前記化学剤は、遺伝子発現における転写誘導物である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項24】

前記真核プロモーターは、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）の同等物又はｐｏｌ−２と適合性のあるウイルスプロモーターである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項25】

前記ｐｏｌ−２と適合性のあるウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターである、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記真核プロモーター駆動性発現は、ＲＮＡ転写及びタンパク質翻訳を含む細胞内メカニズムである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項27】

前記条件は、３７℃のルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地での細菌培養条件である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項28】

前記化学剤が、前記条件において０．０１％〜１％の濃度（ｖ／ｖ）を有する、請求項１１に記載の組成物。

【請求項29】

前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡは、薬学上又は治療上の適用に有用である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項30】

前記タンパク質コーディングＲＮＡは、薬学上又は治療上の適用に有用である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項31】

前記ヘアピン様構造を有する少なくとも１つのＲＮＡは、ｍｉＲ−３０２ホモログである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項32】

前記マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−３０２ホモログである、請求項１３に記載の組成物。

【請求項33】

前記タンパク質又はペプチドは、薬学上又は治療上の適用に有用である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項34】

前記薬学上又は治療上の適用は、多能性幹細胞の生成、幹細胞研究及び治療、癌治療及び疾患治療、傷口治癒処理、ならびに食物収量及び薬物供給の向上からなる群から選ばれるものである、請求項２９、３０、及び３３のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（優先権）
本発明は、米国仮出願第６１／５２２，８４３号（出願日：２０１１年８月１２日，発明の名称：原核細胞内においてＩＩ型真核ポリメラーゼプロモーター駆動性転写作用を使用するための誘導可能な遺伝子発現組成物及びその応用）の優先権を主張する。
（技術分野）
本発明は、組成物及び当該組成物が原核細胞において真核ＲＮＡプロモーター駆動性転写作用によりリボ核酸（ＲＮＡ、即ちメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）とマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）である）及び／又はタンパク質／ペプチド（即ち、抗体と酵素である）を製造するための適用に関する。具体的には、本発明は、組成物、及び当該組成物を使用して細菌細胞内においてＩＩ型真核ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター駆動性転写作用によりＲＮＡ及び／又はタンパク質／ペプチドを製造することを開示している。一方、本発明は、抗生物質ではなく化学剤を使用して原核細胞内の真核ＲＮＡプロモーター駆動性転写作用を誘発する誘導可能な遺伝子発現組成物も含んでいる。本発明の新規性は、変異性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）の原核プロモーターへの転換、或いは大量の人力と金銭コストがかかるハイブリドーマ又は哺乳類細胞の培養を必要とせず、原核細胞を誘導して迅速な適応作用を起こすことにより、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターを使用して所望のＲＮＡ及び／又はタンパク質／ペプチドを直接発現することと、原核細胞転写の読取りの忠実性（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を向上させることにある。得られた核酸とタンパク質／ペプチドは、薬物開発、疾患治療、腫瘍／癌治療、多能幹（ｉＰＳ）細胞の製造、傷口治癒の促進、及び食物の提供に使用可能である。

【背景技術】

【0002】

当業者は、現在の教科書の教示により、原核細胞と真核細胞の転写メカニズムの間に差異が存在し、かつ互いに不適合性があることをはっきり認識している。例えば、現時点での理解によると、真核ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）はプロモーター配列と直接的には結合せず、付加の補助タンパク質により転写を開始させる必要があるのに対して、原核ＲＮＡポリメラーゼは、機能が完全な酵素（ホロ酵素，ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）であり、プロモーター配列と直接結合して転写を開始させる。当業者にとって、真核メッセンジャーＲＮＡは、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（ｔｙｐｅ ＩＩ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｐｏｌ−２）により細胞核内において合成されてから、タンパク質合成のためにプロセシングされて細胞質に送達されるのに対して、原核メッセンジャーＲＮＡ転写及びタンパク質への翻訳は、同じ場所（細胞質内で）かつＤＮＡの同じ部分で同時に行われることも周知のことである。原核生物、例えば細菌及び古細菌は細胞核のような構造を有していない。上記の差異により、原核細胞が真核ＲＮＡプロモーターを利用して真核ＲＮＡとペプチド／タンパク質を製造することは難しく、ひいては不可能である。

【0003】

Ｂｕｅｃｈｌｅｒの特許文献１及びＭｅｈｔａの特許文献２のような従来技術において、細菌又はファージのプロモーターを利用して細菌細胞内に哺乳類のペプチド及び／又はタンパク質を製造することが試みられた。選択された遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、発現のために、プラスミドベクター内の細菌又はファージプロモーターの後方にクローニングされた。細菌はイントロンを処理するためのＲＮＡスプライシング機構（ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ）を有していないので、当該選択された遺伝子のｃＤＮＡは如何なるノンコーディングイントロンも有してはならない。そして、得られた当該ベクターが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌のコンピテント菌株に導入され、選択された遺伝子の転写産物（メッセンジャーＲＮＡ）を発現し、更に、当該メッセンジャーＲＮＡを翻訳してタンパク質を生成する。しかし、これらの細菌及びファージのプロモーター、例えばＴａｃ、Ｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７、及びＳＰ６ＲＮＡプロモーターは、ＩＩ型ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターではなく、それによる転写作用は変異性を有し変異が生じやすい。一方、Ｍｅｈｔａは、グリセリンが細菌の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の効率を向上させるために使用可能であることも教示しているが、プロモーター駆動性ＲＮＡ転写、特にＩＩ型ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター駆動性ＲＮＡ転写を強化することに関する記述はまったくない。真核細胞と原核細胞の転写システムの間に可能な適合性が欠けているので、上記の従来技術は、原核細胞において原核ＲＮＡプロモーターしか使用できないことに制限されている。

【0004】

非特許文献１及びＧｏｓｓｅｎの特許文献３に開示されたような従来の遺伝子発現を誘導する方法は、抗生物質（例えばテトラサイクリン又はドキシサイクリン）を使用して、テトラサイクリン応答配列で制御されるサイトメガロウイルス（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ−ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＲＥ）−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒａｌ（ＣＭＶ））プロモーター又はｐｏｌ−３（Ｕ６）プロモーター、即ちＴｅｔ−Ｏｎプロモーターの活性化と発現を誘発する必要がある。しかし、これらのＴｅｔ−ＯｎプロモーターはＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターではなく、なお、その機能が原核細胞内でテストされたことはない。したがって、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターから発現するように原核転写機構の適合を誘導することができれば、原核細胞の増殖を抑制する可能性のある従来の抗生物質を使用する毒性誘導方法ではなく、原核細胞と真核細胞の転写メカニズムの間に差異に基づき、新規な誘導可能な遺伝子発現システムを容易に提供できるであろう。

【0005】

本発明は、従来の教科書における原核細胞と真核細胞の転写システムの間に不適合性がある観点に対しては、新規な画期的な発展である。いくつかの化学剤を添加することで、今、我々は原核細胞を誘導して迅速な適応作用を生じさせ、これによりＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターを利用して所望のＲＮＡ及び関連ペプチド／タンパク質を製造できる。その利点として、第一に、製造上、細菌は増殖が速いので経済的であり、第二に、操作上、ハイブリドーマ又は哺乳類細胞を培養する必要がないので、一層簡単になり、第三に、ＩＩ型ポリメラーゼプロモーターに相当する転写（ｐｏｌ−２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を利用し、かつ原核転写メカニズムの読取りの忠実性を向上させたので、生産品質を向上させ、第四に、細菌のみにより所望のＲＮＡと関連ペプチド／タンパク質、及び導入されたプラスミドベクターに対する工業レベルの大量生産を達成でき、最後に、所望のＲＮＡ及びタンパク質は、それぞれ細菌抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ）及び／又は細菌溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）から、分離及び純化されることにより、更に応用される多目的性を有する。したがって、以上をまとめると、原核細胞内において真核ＲＮＡプロモーター駆動性転写を利用する誘導可能なＲＮＡ（即ち、メッセンジャーＲＮＡとマイクロＲＮＡである）及び／又はペプチド／タンパク質（即ち、抗体、増殖因子及び酵素）の製造方法はニーズを高度に満足できる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第７，９５９，９２６号明細書

【特許文献2】米国特許第７，９６８，３１１号明細書

【特許文献3】米国特許第５，４６４，７５８号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ Ｈ．（１９９２）Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ．８９，５５４７−５５５１

【発明の概要】

【0008】

本発明は、原核細胞と真核細胞の遺伝子転写システムの間の差異及び不適合性に基づいている。通常、原核ＲＮＡポリメラーゼは、真核プロモーターを認識せず、逆もまた同様である。しかし、本発明は、転写誘導物として機能する、原核細胞内において真核プロモーター駆動性遺伝子発現を誘導及び／又は強化する複数の化学剤を確認した。同化学剤又は他の化学剤は真核細胞においても原核プロモーター駆動性遺伝子発現を誘導及び／又は強化する転写誘導物として機能できる。したがって、本発明に教示された新規な現象と知識は現在の原核細胞と真核細胞の転写メカニズムの間の差異についての認知に対して、画期的な発展を提供するものである。

【0009】

本発明において発見された転写誘導物は通常、細胞培養の条件において好適なものではない。３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（又は３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＯＰＳ）、エタノール、及びグリセリンの３つは全てのテストされた化学剤のうち最も効果的な誘導物である。これらの化学剤の誘導能力は用量に依存し（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）、かつ濃度と比例している。ＭＯＰＳ、エタノール、及び／又はグリセリンと類似する構造を有するいくつかの化学物質は同じ機能を有し得る。ＭＯＰＳは通常、溶菌とプラスミド抽出の緩衝剤として用いられるので、細菌細胞の培養に好適ではない。エタノールは既知の殺菌剤である。グリセリンは細菌の細胞壁を不安定化させ、形質転換の効率を増加させ得るため、細菌細胞の培養にも好適ではない。なお、グリセリン及びエタノールはいずれも防腐剤として使用可能であり、そのうちグリセリンは静菌性を有し、エタノールは殺菌性を有する。ＭＯＰＳ、エタノール、及びグリセリンが有する既知の機能に基づき、当業者は、本発明を知る前には、微量（０．０１％〜１％の濃度（ｖ／ｖ））のこれらの化学物質で原核細胞内において真核プロモーター駆動性遺伝子発現を誘導することを推知し得なかったであろう。

【0010】

本発明は誘導可能な遺伝子発現組成物であり、いくつかの化学剤を使用して原核細胞内における真核プロモーター駆動性ＲＮＡ転写及び関連ペプチド／タンパク質の合成を促進及び／又は向上させる。当該誘導可能な遺伝子発現組成物は、（ａ）３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール、グリセリン、又はそれらの混合物と類似する構造を有する少なくとも１種の化学剤と、（ｂ）ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター駆動性発現メカニズム又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーター（ｐｏｌ−２ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）駆動性発現メカニズムにより制御される少なくとも１つの遺伝子を含有する複数の原核細胞とを含み、（ａ）と（ｂ）は、当該遺伝子の発現を誘発する条件下で混合される。本発明は、変異性の原核プロモーターへの転換、又はハイブリドーマ又は哺乳類細胞の培養の必要がなく（ハイブリドーマ又は哺乳類細胞の培養に大量の人力と金銭のコストがかかる）、原核細胞を誘導して迅速な適応作用を起こし、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターを使用して所望のＲＮＡ及び／又はタンパク質／ペプチドを直接発現するとともに、原核細胞の転写の読取りの忠実性を向上させるための新規な組成物及びその適用を更に提供し、即ち、ＩＩ型ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）様の転写メカニズム（ｐｏｌ−２−ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を提供することに相当する。発現されるＲＮＡとしては、好ましくは真核ＲＮＡ（即ち、メッセンジャーＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ）であり、これらのタンパク質／ペプチドは抗体と酵素を含む。

【0011】

当該原核細胞は、細菌細胞であり、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であり、かつ当該化学剤は３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール、グリセリン、又はそれらの混合物であることが好ましい。また、当該真核ＲＮＡプロモーターは、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター（即ちＥＦ１α）又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーター（即ち、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ））であることが好ましい。当該真核ＲＮＡプロモーター制御の遺伝子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）、これらの前駆体とホモログ、及びこれらの組合せからなる群から選ばれるノンコーディング（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）又はタンパク質コーディング（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡ転写産物、又はそれら両方をコードする。本発明により生成されるペプチド／タンパク質は上記のタンパク質コーディングメッセンジャーＲＮＡ転写産物から翻訳され、かつ酵素、増殖因子、抗体、インスリン、ボツリヌス毒素、任意の機能タンパク質、それらのホモログ、及びそれらの組合せからなる群から選ばれるものであるが、これに限定されるものではない。好ましくは、当該遺伝子発現を誘導する当該条件は３７℃のＬＢ培地に、当該化学剤が添加された細菌培養条件である。

【0012】

当該化学剤が原核細胞内においてＲＮＡとタンパク質の生成を誘導する能力を例示するために、本発明は、図１Ｂに示すように、レンチウイルスプラスミドベクター、例えば林（Ｌｉｎ）の米国特許出願第１２／１４９，７２５号と第１２／３１８，８０６号におけるプラスミドベクターｐＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２を採用及び変更するとともに、赤色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）を採用し、即ち、ＲＮＡ転写及びタンパク質翻訳を測定する視認マーカーとして、ＲＧＦＰ遺伝子をベクターにクローニングする。本発明において、図１Ａに示すように、ｐＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２ベクターの本来のＣＭＶプロモーターは、ヒトＩＩ型ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターＥＦ１αにより置換され、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２と称する新たなプラスミドベクターを形成した。なお、原核細胞は、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）イントロンを処理できないので、ＲＧＦＰ遺伝子におけるＳｐＲＮＡｉイントロンが除去され、更に、本来のイントロンでコードされた（ｉｎｔｒｏｎ−ｅｎｃｏｄｅｄ）ｍｉＲ−３０２クラスター（ｍｉＲ−３０２ ｃｌｕｓｔｅｒ）が除去され、ＲＧＦＰ遺伝子の５’−非翻訳領域（５’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ、５’−ＵＴＲ）に移動され、ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２遺伝子を形成した。概言すれば、遺伝子の５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲはイントロンの拡張と見られてもよい。こうして、本発明に開示されたｍｉＲ−３０２発現の発現メカニズムは従来の米国特許出願第１２／１４９，７２５号と第１２／３１８，８０６号に記載されたイントロンマイクロＲＮＡの生成メカニズム（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）の範囲に属している。利点として、原核細胞内にはＲＮＡスプライシングが欠けているので、本発明において得られたｍｉＲ−３０２転写産物は依然としてヘアピン様（ｈａｉｒｐｉｎ−ｌｉｋｅ）前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）であり、更に純化されてから、真核細胞内に送達され、成熟ｍｉＲ−３０２を形成し、機能することができる（図１Ｂ）。

【0013】

明確に言うと、以下で説明される図面は本発明を例示・説明するためのものであり、制限的なものではない。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】誘導可能なｐｏｌ−２プロモーター駆動性遺伝子発現の組成物を示す図である。本発明には、実例として、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２組成物を採用し、当該組成物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を形質転換し、ＭＯＰＳ、グリセリン、及び／又はエタノールの誘導下でＲＧＦＰのメッセンジャーＲＮＡとタンパク質、及びｍｉＲ−３０２マイクロＲＮＡ及び／又はその前駆体を生成する。ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２はレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）プラスミドベクターであり、原核細胞と真核細胞の両方で各種のマイクロＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、及び／又はタンパク質／ペプチドを発現するように設計されている。

【図1B】誘導可能なｐｏｌ−２プロモーター駆動の遺伝子発現の組成物により、原核細胞又は真核細胞内においてＲＮＡ転写産物とタンパク質を生成し、真核細胞内においてマイクロＲＮＡを生成するメカニズムを示す図である。本発明には、実例として、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２組成物を採用し、当該組成物でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を形質転換し、ＭＯＰＳ、グリセリン、及び／又はエタノールの誘導下でＲＧＦＰのメッセンジャーＲＮＡとタンパク質、及びｍｉＲ−３０２マイクロＲＮＡ及び／又はその前駆体を生成する。ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２はレンチウイルスプラスミドベクターであり、原核細胞と真核細胞の両方で各種のマイクロＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、及び／又はタンパク質／ペプチドを発現するように設計されている。本発明に教示されたように、当業者は、図１Ｂに開示されたメカニズムにより、任意のマイクロＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡを使用してｍｉＲ−３０２を置換し、又は、任意のメッセンジャーＲＮＡ／タンパク質を使用してＲＧＦＰを置換することができる。黒い矢印は、当該経路が原核細胞と真核細胞に発生することを示し、中空の矢印は、これらのステップは真核細胞内のみに発生することを示す。

【図2】０．１％（ｖ／ｖ）のＭＯＰＳと０．０５％（ｖ／ｖ）のグリセリンで混合処理された（左）、又は未処理（右）の、各細菌培地の結果を示す図である。大腸菌は処理前にｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２で形質転換された。

【図3】０．１％（ｖ／ｖ）のＭＯＰＳで処理された後に、生成された異なる細菌ペレット（ｐｅｌｌｅｔｓ）を示す図である。大腸菌はＭＯＰＳで処理される前にｐＬＶＸ−Ｇｒｎ−ｍｉＲ３０２＋３６７（緑色）又はｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２（赤色）で形質転換された。

【図4】コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞内において、異なる化学物質による、ｐｏｌ−２プロモーター駆動性遺伝子発現を誘導する能力を示す図である。本発明の全てのテストされた化学物質のうち、ＭＯＰＳ、エタノール、及びグリセリンの３つが最も効果的な誘導物である。使用可能な化学物質の濃度範囲は０．００１％〜４％であり、好ましくは０．０１％〜１％である。

【図5】ＭＯＰＳ、グリセリン、及びエタノールのそれぞれの誘導における、ＲＧＦＰタンパク質の発現のウエスタンブロット分析結果を示す図である。細菌のＲｕｖＢタンパク質を、ＲＧＦＰ発現を正規化する（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）ハウスキーピング基準（ｈｏｕｓｅ−ｋｅｅｐｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ）としている。ブランクＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞（即ち、ベクターで形質転換されていない）に由来するタンパク質抽出物を陰性対照群としている。

【図6】ＭＯＰＳ、グリセリン、及びエタノールのそれぞれの誘導における、ｍｉＲ−３０２とその前駆体マイクロＲＮＡクラスター（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ ｃｌｕｓｔｅｒ）の発現のノーザンブロット分析結果を示す図である。ブランクＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞（即ち、ベクターで形質転換されていない）に由来するＲＮＡ抽出物を陰性対照群としている。

【図7】細菌抽出物（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ，ＢＥ）から分離されたｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２によるｉＰＳ細胞の生成を示す図である。当該抽出物のノーザンブロット分析結果は図６に示される。従来の報告のように、ｍｉＲ−３０２で再プログラム化されたｉＰＳ細胞（ｍｉｒＰＳＣ）が球様細胞コロニーに形成され、Ｏｃｔ４、即ち強い標準的なＥＳＣマーカーを発現する。

【図8】Ｏｃｔ４とＳｏｘ２遺伝子のプロモーター領域に、細菌抽出物（ＢＥ）から分離されたｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２（図６に示すようなノーザンブロット分析）で誘導された全体的なＤＮＡ脱メチル化（ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が生じることを示す図である。ＳｉｍｏｎｓｓｏｎとＧｕｒｄｏｎ（Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６，９８４−９９０，２００４）の教示のように、全体的なＤＮＡ脱メチル化及びＯｃｔ４発現は体細胞の再プログラム化にとって必要である。

【図9A】ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理された、各種の腫瘍／癌細胞の体外腫瘍発生能力試験の結果を示す図である。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理されて得られた細胞はｍｉｒＰＳ細胞と称され、乳癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞、肝臓癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞、及び胎児性奇形癌（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）に由来するｍｉｒ−ＰＳ−Ｔｅｒａ２細胞を含む。図９ＡはｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理される前後の細胞形態と細胞周期の速度の変化を示す。各細胞周期ステージに対応するＤＮＡ含有量のフローサイトメトリー分析の結果はグラフとして細胞形態の上方（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）に示される。

【図9B】ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理された、各種の腫瘍／癌細胞の体外腫瘍発生能力試験の結果を示す図である。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理されて得られた細胞はｍｉｒＰＳ細胞と称され、乳癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞、肝臓癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞、及び胎児性奇形癌に由来するｍｉｒ−ＰＳ−Ｔｅｒａ２細胞を含む。図９ＢはｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理される前後の細胞形態と細胞周期の速度の変化を示す。各細胞周期ステージに対応するＤＮＡ含有量のフローサイトメトリー分析の結果はグラフとして細胞形態の上方（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）に示される。

【図9C】ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理された、各種の腫瘍／癌細胞の体外腫瘍発生能力試験の結果を示す図である。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理されて得られた細胞はｍｉｒＰＳ細胞と称され、乳癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞、肝臓癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞、及び胎児性奇形癌に由来するｍｉｒ−ＰＳ−Ｔｅｒａ２細胞を含む。図９Ｃはフローサイトメトリー分析結果の棒グラフであり、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２による、各種の腫瘍／癌細胞からの細胞群の有糸分裂（Ｍ期）及び休止期（Ｇ０／Ｇ１期）における変化に対する用量依存効果を示す。

【図10A】ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理された、各種の腫瘍／癌細胞の体外腫瘍発生能力試験の結果を示す図である。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理されて得られた細胞はｍｉｒＰＳ細胞と称され、乳癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞、肝臓癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞、及び胎児性奇形癌に由来するｍｉｒ−ＰＳ−Ｔｅｒａ２細胞を含む。図１０ＡはｍｉＲ−３０２で抑制されたＭａｔｒｉｇｅｌチャンバーにおける腫瘍細胞の浸潤行為に対する機能性分析（ｎ＝４、ｐ＜０．０５）である。

【図10B】ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理された、各種の腫瘍／癌細胞の体外腫瘍発生能力試験の結果を示す図である。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理されて得られた細胞はｍｉｒＰＳ細胞と称され、乳癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞、肝臓癌に由来するｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞、及び胎児性奇形癌に由来するｍｉｒ−ＰＳ−Ｔｅｒａ２細胞を含む。図１０ＢはｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理される前後の、ヒト骨髄内皮細胞（ｈＢＭＥＣ）単層における細胞の接着（ｎ＝４、ｐ＜０．０５）の比較である。

【図11】ｍｉＲ−３０２ファミリークラスター（Ｔｅｒａ２＋ｍｉｒ−３０２ｓ）又はアンチセンスｍｉＲ−３０２ｄ（Ｔｅｒａ２＋ｍｉｒ−３０２ｄ＊）処理で、生体内腫瘍発生試験における胎児性奇形癌細胞（Ｔｅｒａ−２）の結果（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）を示す図である。胎児性奇形癌は常に、各種の、３つの胚性胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）、即ち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に由来する腫瘍／癌細胞を含み、当該混合型の腫瘍組織は抗腫瘍／癌薬物のテストに使用可能である。（Ａ）インサイチュ注射を実施してから（ｐｏｓｔ−ｉｓ）三週間後、平均腫瘍サイズに対して形態学的評価を行う。全ての腫瘍はいずれも元の移植位置（黒い矢印で示す箇所）に位置している。全ての被試験マウスのいずれも悪液質又は腫瘍転移の症状が観察されていない。（Ｂ）ノーザンブロット分析とウエスタンブロット分析、及び（Ｃ）免疫組織化学染色分析図は、体内ｍｉＲ−３０２による、コア再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４−Ｓｏｘ２−Ｎａｎｏｇと、ｍｉＲ−３０２を標的とするＧ１チェックポイントレギュレーターであるサイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリンＤ１／Ｄ２（ｃｙｃｌｉｎｓ Ｄ１／Ｄ２）、ＢＭＩ−１、及びｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１４Ａｒｆの発現形態に対する効果を示す。

【図12】マイクロＲＮＡｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２を含有する軟膏を使用して、マウス皮膚の開放創を治療する生体傷口治癒試験を示す図である。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で治療するマウスの皮膚傷口は、ブランク軟膏又は他のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−ＨＡ）で治療するマウスの皮膚傷口の少なくとも二倍の大きさである。この試験により、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２による処理は傷口治癒速度を顕著に向上させ、当該治癒速度は他の処理群と対照群の治癒速度のいずれかの二倍を超えたことがはっきり示された。なお、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で治療された後の傷口治癒領域に、正常な毛の再成長が現れ、かつ瘢痕が残っていないのに対し、他の処理群の結果では小さな瘢痕が残り、かつ毛の成長がない（黒い矢印で示す）。

【発明を実施するための形態】

【0015】

［原核細胞内における真核プロモーター駆動性タンパク質コーディング遺伝子発現の誘導］
ｚ−コンピテント大腸菌形質転換キット（ｚ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カリフォルニア州アーバイン）を使用して、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２プラスミドベクターの形質導入で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の形質転換を行い、３７℃のＬＢ培地で培養すると同時に、１７０ｒｐｍで頻繁に振盪する。図２に示されるように、一晩培養を経た後、大腸菌コロニーが０．１％（ｖ／ｖ）のＭＯＰＳと０．０５％（ｖ／ｖ）のグリセリンが添加された条件において、細菌のＬＢ培地を明らかに赤色に染めた赤色の蛍光タンパク質ＲＧＦＰが大量に発現されるのに対し、対照群のコロニーはＲＧＦＰを生成できない。マーカー機能を有するＲＧＦＰの存在は、そのＲＮＡもそのタンパク質も製造できたことを示している。

【0016】

更に、２つの形質転換された大腸菌菌株を使用して、確認された化学剤、例えばＭＯＰＳによるタンパク質の誘導特性を証明及び体現し、そのうちの１つの菌株は、ＣＭＶプロモーターで駆動される緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を有するｐＬＶＸ−Ｇｒｎ−ｍｉＲ３０２＋３６７プラスミドベクターを保有しており、もう１つの菌株は、上記のｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２ベクターを保有している。図３に示されるように、０．１％（ｖ／ｖ）のＭＯＰＳにおいて一晩培養を経た後、ｐＬＶＸ−Ｇｒｎ−ｍｉＲ３０２＋３６７で形質転換された大腸菌は緑色の細胞を生成し、他のｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２プラスミドベクターを有するＥ．ｃｏｌｉでは赤色の細胞が出現した。この結果は、ＭＯＰＳのような化学物質が、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーターにより、所定のＲＮＡ及び関連タンパク質の生成を誘導できることを示している。また、この誘導生成されたＲＮＡとタンパク質は高度に限定されており、かつ当該化学物質の添加により調節できる。ただし、注意すべきことに、当該タンパク質の収量は、これらの細菌細胞がそれぞれの色に染色されて見えるほど相当に高い。

【0017】

図４に示されるように、本発明の全てのテストされた化学物質のうち、３種の最も効果的な誘導物はＭＯＰＳ、グリセリン、及びエタノールである。図５及び実施例３に記載されるように、誘導生成された赤色の蛍光タンパク質ＲＧＦＰは、さらにウエスタンブロット分析でその量が確認される。細菌のＲｕｖＢタンパク質を、ＲＧＦＰ発現を正規化するハウスキーピング基準とする。これらの確認された誘導物の誘導能力は、用量に依存しており、かつ濃度と比例していることが発見された。まったく処理されていない陰性対照群の大腸菌細胞では、いかなる蛍光染料も存在せず、本来の色のみを呈している。したがって、これらの結果を総合すれば、本発明は、新規な化学誘導可能な組成物及びそれが原核細胞内においてＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター、又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーター駆動性遺伝子発現を調節するための適用を明らかに提供した。当該遺伝子の産物はＲＮＡ又はタンパク質／ペプチド、或いはその両方であってもよい。上記の説明により、当業者は他のイントロンを含有しない（ｉｎｔｒｏｎ−ｆｒｅｅ）遺伝子又は関連ｃＤＮＡを使用してＲＧＦＰ遺伝子を置換することで、原核細胞内において機能性ＲＮＡ及び／又はタンパク質を生成することができることは自明である。
［原核細胞内における真核プロモーター駆動性ノンコーディングＲＮＡ発現の誘導］
上記のように、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２ベクターは、ＲＧＦＰ遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に、マイクロＲＮＡｍｉＲ−３０２のクラスター（ｍｉＲ−３０２ ｃｌｕｓｔｅｒ）を含み（図１Ａと図１Ｂ）、当該ＲＧＦＰ遺伝子の誘導された発現も、図１Ｂに示されたメカニズムのように、ｍｉＲ−３０２クラスター（ｍｉＲ−３０２ｓ前駆体）を生成する。原核細胞内に、ＲＮＡスプライシング機構（例えばスプライセオソーム，ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）が欠けているので、本発明において得られたｍｉＲ−３０２クラスターは依然としてヘアピン様前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ又はｐｒｉ−ｍｉＲ−３０２ｓ）であり、分離され、真核細胞内に送達されるのに好適である。真核細胞内において、これらのｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ又はｐｒｉ−ｍｉＲ−３０２ｓは更に処理され成熟ｍｉＲ−３０２ｓ（即ち、ｍｉＲ−３０２マイクロＲＮＡ）になり、機能することができる。同様に、他のマイクロＲＮＡと関連前駆体も、ｍｉＲ−３０２発現の同じステップを経て生成することができる。また、ノンコーディングＲＮＡ、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、上記のマイクロＲＮＡのように発現されるように設計されることができる。これらのノンコーディングＲＮＡは、少なくともマイクロＲＮＡと３０％〜１００％の相同性を有する１つの配列を含むことが好ましい。なお、これらのｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡは、ヘアピンのステム領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎｓ）で完全にマッチでき、哺乳類の前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は通常ミスマッチの（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）塩基対を含む。大部分のマイクロＲＮＡは、所定の遺伝子のサイレンサー（ｓｉｌｅｎｃｅｒｓ）としての機能を有し、かつ多くの生理メカニズム及び病理メカニズムにおいて、生物学的発生（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、幹細胞生成、細胞核再プログラム化（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）、細胞分化、細胞周期調節、腫瘍抑制、免疫防御、アポトーシス、再生（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）、傷口治癒、及び他の多くの各種の特殊な役割を果たしているが、これらに限定されていないので、これらの薬学と治療領域における潜在的な適用は高度に期待されている。形質導入されたプラスミドとノンコーディングＲＮＡ（即ち、マイクロＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ）はいずれも同時に原核細胞、例えば大腸菌により増幅されることができる。増幅ステップの後に、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２プラスミドＤＮＡと転写されたｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ／ｐｒｉ−ｍｉＲ３０２ｓを分離させる方法は実施例５と実施例６に記載されている。増幅されたノンコーディングＲＮＡ（即ち、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ／ｐｒｉ−ｍｉＲ−３０２ｓ）及び／又はベクター（即ち、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２）を真核細胞に送る方法は、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、グリセリン注入（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、ペプチド／リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）／化学物質が媒介する導入、電気穿孔法、遺伝子銃浸透、マイクロインジェクション、トランスポゾン／レトロトランスポゾン挿入、及びアデノウイルス／レトロウイルス／レンチウイルス感染から選ばれるものであってもよい。

【0018】

上記のＲＧＦＰ誘導実験（図４と５）は、化学誘導の存在下又は非存在下で、ノンコーディングｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ及びその成熟ｍｉＲ−３０２産物の、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２で形質転換された細菌内の発現を測定することにも相当する。図６及び実施例４に示されるように、ノーザンブロット分析により、誘導生成されたｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓの量を確認する。ＲＧＦＰ誘導実験の結果（図４と図５）のように、ブランク対照群ではなく、ＭＯＰＳ、グリセリン、及びエタノールで処理された形質転換細菌内で、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓの発現が測定され、これらのｐｏｌ−２プロモーターの化学誘導物は、原核細胞内においてもノンコーディングＲＮＡの発現を起こすことができる。全てのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は類似した構造を有しているので、当業者は、他のノンコーディングマイクロＲＮＡ及び／又は低分子ヘアピンＲＮＡにより、当該ｍｉＲ−３０２クラスターを置換するとともに、原核細胞内において、機能性マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、及び／又はその前駆体／ホモログを生成できることが分かる。
［本発明の幹細胞生成機能の応用］
米国特許出願第１２／１４９，７２５号と第１２／３１８，８０６号の教示のように、マイクロＲＮＡｍｉＲ−３０２は、哺乳類の体細胞を、胚性幹細胞様（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ＥＳＣ）−ｌｉｋｅ）の誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ（ｉＰＳ）ｃｅｌｌｓ）に再プログラム化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍ）するために使用可能である。多くの幹細胞応用及び治療の発展はこれらのＥＳＣ様のｉＰＳ細胞に頼っている。しかし、ｍｉＲ−３０２はヒトＥＳＣ内でのみ大量に生成され、他の分化した組織細胞内では大量に生成されない。ヒトＥＳＣの分離について、多くの議論の余地がある。ヒトＥＳＣの培養は大量の人力と金銭がかかる。ヒトＥＳＣのステップを回避する他の代替的方法として、合成のｍｉＲ−３０２の類似体（ｍｉｍｉｃｓ）を製造する方法があるが、非常に高価でありかつ効率が劣っている。合成ｍｉＲ−３０２と天然ｍｉＲ−３０２の間の類似程度はまだ不確定である。これらの問題を解決するために、本発明は、原核細胞内においてｍｉＲ−３０２及び／又はその前駆体／ホモログを大量に製造するための簡単、低価、迅速、かつ誘導可能な組成物及び方法を提供できる。なお、原核細胞からｍｉＲ−３０２及び／又はその前駆体を分離することは、本発明の図６及び実施例６に示されるように、比較的簡単かつ経済的である。

【0019】

発明者は、実施例５と実施例６の記載のように、ｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２で形質転換された大腸菌細胞を使用して、高品質のｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２ベクター及びｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓを生成し、分離した。米国特許出願第１２／１４９，７２５号と第１２／３１８，８０６号の教示のように、本発明のｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２とｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓによる、ｉＰＳ細胞の生成における使用は予期できるものである。実施例２により、本発明で生産されたｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓをヒト皮膚初代角化細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）に導入した後、当該導入された角化細胞は、再プログラム化されＥＳＣ様のｉＰＳ細胞になり、かつ強いＥＳＣマーカーＯｃｔ４が発現された（図７）。さらに、図８及び実施例８に示されるように、亜硫酸水素塩ＤＮＡ配列試験（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｓａｙ）もＯｃｔ４とＳｏｘ２遺伝子のプロモーター領域に、全体的なＤＮＡの脱メチル化が生じたことを示し、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２は最も重要な再プログラム化因子及びＥＳＣマーカーである。全体的なＤＮＡの脱メチル化及びＯｃｔ４発現は細胞が再プログラム化し始めることに成功し、かつＥＳＣと類似する多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を得る第一歩（Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｇｕｒｄｏｎ，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６：９８４−９９０，２００４）として知られているので、ＭＯＰＳ誘導による（ＭＯＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ）細菌抽出物から分離されたｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２のｉＰＳ細胞生成における効果が証明された。この例は、本発明が、多能性幹細胞の生成のための十分なｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２を含有する細菌抽出物又は細菌溶解物を製造することに使用可能であることを証明した。
［マイクロＲＮＡ抽出物の腫瘍／癌治療における適用］
発明者又は当業者は、本発明（実施例１、５、６）により、十分なマイクロＲＮＡｍｉＲ−３０２の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ又はｐｒｉ−ｍｉＲ−３０２ｓ）及び関連するｍｉＲ−３０２をコードする（ｍｉＲ−３０２−ｅｎｃｏｄｉｎｇ）プラスミドベクターを生産できる。ｍｉＲ−３０２の癌治療における機能とメカニズムは、米国特許出願第１２／３１８，８０６号と第１２／７９２，４１３号を参照できる。従来、林（Ｌｉｎ）等は、この方法の、ヒト黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、前立腺癌（Ｌｉｎ等，ＲＮＡ ２００８）、乳癌、肝細胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び胎児性奇形癌細胞（Ｌｉｎ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０）に対する治療上の実行可能性を既に教示した。図９Ａ〜９Ｂに示されるように、全ての試験された腫瘍／癌細胞は、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理された後、いずれも再プログラム化され正常ｉＰＳ細胞になり、かつ胚様体細胞コロニー（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｃｏｌｏｎｏｉｅｓ）を形成した。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理され得られた細胞はｍｉｒＰＳ細胞と呼ばれ、即ち「ｍｉＲ３０２で誘導された多能性幹細胞（ｍｉＲ３０２−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」の略称である。なお、ｍｉＲ−３０２は、正常組織細胞を除いた、全てのテストされた腫瘍／癌細胞の顕著なアポトーシス（＞９５％）の発生を誘導することができる（Ｌｉｎ等，ＲＮＡ ２００８及びＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０）ことも発見された。フローサイトメトリーにより、細胞周期の各時期のＤＮＡ含有量を更に分析した結果として、全てのｍｉｒＰＳ細胞中において、有糸分裂の細胞群で顕著に減少したことを示した（図９Ｃ）。ｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞において、有糸分裂の細胞群（Ｍ期）が４９％±３％から１１％±２％まで、７８％減少し、ｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞において、４６％±４％から１７％±２％まで、６３％減少し、ｍｉｒＰＳ−Ｔｅｒａ２細胞において、５０％±６％から１９％±４％まで、６２％減少したのに対して、静止／休止中の細胞群（Ｇ０／Ｇ１期）は、ｍｉｒＰＳ−ＭＣＦ７細胞では４１％±４％から７４％±５％まで、ｍｉｒＰＳ−ＨｅｐＧ２細胞では４３％±３％から７１％±４％まで、ｍｉｒＰＳ−Ｔｅｒａ２細胞では４０％±７％から６９％±８％まで、それぞれ８０％、６５％、７２％増加した。これらの結果は、ｍｉＲ−３０２が、これらの腫瘍／癌細胞の迅速な細胞周期の速度を効果的に弱化させ、顕著なアポトーシスを発生させることができることを示した。

【0020】

細胞浸潤試験（実施例９、Ｍａｔｒｉｇｅｌチャンバーを使用する）及び細胞接着試験（実施例１０、細胞がヒト骨髓内皮細胞（ｈＢＭＥＣ）の単細胞層に接着される）等の体外腫瘍発生能力試験（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ）は、ｍｉｒ−３０２による抗増殖特性以外に、他の２種類の抗腫瘍生成の効果を示した。細胞浸潤試験（Ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）は、全てのｍｉｒＰＳ−腫瘍／癌細胞が、移動能力（＜１％まで低下した）を失ったのに対し、元の腫瘍／癌細胞は比較的高い栄養物が補充された間隔域に積極的に浸潤し、ＭＣＦ７細胞において９％±３％以上の細胞群を占め、ＨｅｐＧ２細胞において１６％±４％以上の細胞群を占め、Ｔｅｒａ−２細胞において３％±２％以上の細胞群を占めた（図１０Ａ）ことを示した。これと一致して、細胞接着試験（Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）も、これらのｍｉｒＰＳ−腫瘍／癌細胞は、ｈＢＭＥＣｓ単細胞層に接着できないが、元のＭＣＦ７とＨｅｐＧ２細胞は５０分間の培養後、顕著な細胞群（ＭＣＦ７ ７％±３％、ＨｅｐＧ２ ２０％±２％）が迅速にｈＢＭＥＣ単細胞層（図１０Ｂ）に転移したことを示した。以上をまとめると、これらの発見は全て、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２は、ヒト腫瘍抑制因子であり、細胞の迅速な増殖を弱化させ、腫瘍／癌細胞アポトーシスを発生させ、かつ腫瘍／癌細胞の浸潤及び転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を抑制することができることを強くかつ繰り返して示している。最も重要なことに、この新規なｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２の機能は、悪性皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝臓癌治療、及び胚胎性奇形腫に含まれる異なる類型の組織に対する各種の腫瘍の治療を含むがこれらに限定されない、様々なヒト癌／腫瘍に対抗する普遍的な治療方法を提供できる。

【0021】

ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２の腫瘍抑制機能、及び正常細胞と腫瘍／癌細胞における異なる効果を確認した後、発明者は、更に、生後八週間のオス無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ系統）により、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２の、Ｔｅｒａ２に由来する奇形腫を治療する抗腫瘍薬としての活用可能性（図１１Ａ〜１１Ｃと実施例１１〜１２）を調査した。Ｔｅｒａ−２細胞は元々ヒト胎児性奇形癌に由来し、かつ多種の原始腫瘍組織細胞（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｔｉｍｏｒｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｓ）を含んでいる。その多能性により、Ｔｅｒａ２に由来する奇形腫は通常、多種の体内腫瘍形態の治療モデルとされる。図１１Ａに示されるように、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で３週間治療（Ｔｅｒａ２＋ｍｉｒ−３０２ｓ）した後、我々は、無処理群（１０４±２３ｍｍ^３、ｎ＝４）に比べると、平均腫瘍サイズが８９％以上（＞８９％）（１１±５ｍｍ^３、ｎ＝６）と顕著に減少したことを測定できた。反対に、同じ量のアンチセンス−ｍｉｒ−３０２ｄ（Ｔｅｒａ２＋ｍｉＲ３０２ｄ＊）を投与すると、平均腫瘍サイズが元の１４０％（２５０±７３ｍｍ^３、ｎ＝３）に増加する。ノーザンブロット分析の結果も、これらの異なる処理を受けた奇形腫細胞のうち、ｍｉＲ−３０２の発現レベルと腫瘍サイズが負の相関を呈しており（図１１Ｂ）、即ち、ｍｉＲ−３０２の発現を制御することによって、体内腫瘍の増殖を効果的に制御できることを示した。これらの発現を実証するために、我々は、更にウエスタンブロット分析でｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で処理された奇形腫のうち、Ｇ１チェックポイントレギュレーターＣＤＫ２、サイクリン−Ｄ１／Ｄ２、及びＢＭＩ−１の共同抑制、腫瘍抑制因子ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１４／ｐ１９Ａｒｆおよびコア再プログラム化因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇの共同活性化（図１１Ｂ）を確認した。免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ＩＨＣ）染色で奇形腫組織におけるこれらのタンパク質を分析すると、同様に同じ結果（図１１Ｃ）を証明した。ｍｉＲ−３０２の腫瘍抑制機能及び体内と体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｉｎ ｖｉｖｏ）の一致した結果に基づき、ｍｉＲ−３０２は本発明を使用して癌治療薬物を調製するマイクロＲＮＡの実例とされることが理解できる。
［マイクロＲＮＡ抽出物の傷口治癒処理における適用］
発明者は、本発明において生成された十分なマイクロＲＮＡｍｉＲ−３０２の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ）及び関連するｍｉＲ−３０２をコードするプラスミドベクターの、動物傷口治癒における使用を調査した（実施例１３）。ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ及び関連プラスミドベクターは、実施例１と実施例５に記載された方法により増幅され、かつ実施例５と実施例６に記載された方法により抽出された。そして、分離されたｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ及び関連するプラスミドベクターは、予め用意された、カカオバター、綿実油、オリーブオイル、ピルビン酸ナトリウム、及び白色ワセリンを含む軟膏基剤と混合された。当該予め用意された軟膏基剤におけるｍｉＲ−３０２の前駆体及びベクターの濃度は１０μｇ／ｍＬである。メスで皮膚を切り開いて皮膚の開放創を作る。ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２を含む又は含まない軟膏を傷口に直接塗布し、軟膏は、創部全体を覆った。そして、更に液状包帯（ｌｉｑｕｉｄ ｂａｎｄａｇｅ）で処理済みの領域をシールした。図１２に示されるように、二週間以内に、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２での処理は傷口治癒の速度を顕著に向上させたことがはっきり示され、当該治癒速度は他の処理群と対照群全体の治癒速度の二倍以上である。なお、傷口について、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２で治療された後の傷口治癒領域には正常な毛の再成長が現れ、かつ瘢痕が残っていないのに対して、他の処理群の結果では、小さな瘢痕が残っており、かつ毛の成長がなかった（黒い矢印で示す）。
［本発明の他の適用］
本発明の好ましい適用実施例の一つは、生物医学研究、薬学上及び治療上の適用、例えば遺伝子調節及び遺伝子治療のためのマイクロＲＮＡ及び／又は低分子ヘアピンＲＮＡを生成することである。例えば、米国特許出願第１２／３１８，８０６号に開示されたように、ｍｉＲ−３０２はヒト細胞の腫瘍抑制因子であるが、これに限定されない。本発明は、癌治療又は薬物開発のための十分なｍｉＲ−３０２及び／又はその前駆体／ホモログを製造できる。具体的には、治療性の、微生物、動物又は植物から分離されたマイクロＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ／ｓｈＮＡ）の遺伝子は、プラスミドベクターにクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）され、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーターで制御されることができ、当該プラスミドベクターは、非病原性細菌内に送達されることができる。このマイクロＲＮＡ／ｓｈＮＡの発現ベクターを含む細菌が患者の細胞内に導入されると、当該患者は、グリセリン又はエタノールを服用して当該治療性マイクロＲＮＡ／ｓｈＮＡの当該細菌内での生成を誘発し、細胞内に放出させることで、不調及び／又は疾患を治療することができる。

【0022】

本発明のもう一つの好ましい適用実施例は、生物医学研究、薬学上及び治療上の適用のための機能性タンパク質／ペプチドを生成することである。例えば、得られたタンパク質／ペプチドは、糖尿病を治療するためのインスリン、腫瘍／癌を治療するための腫瘍抑制タンパク質、正常な身体成長を促進させるための増殖因子、生物医学研究又はワクチン／血清に使用される抗体、及び分子生物学及び生物医学研究に使用される全ての種類の生物酵素であってもよいが、これらに限定されない。具体的には、治療性の、かつ微生物、動物又は植物から分離されたタンパク質／ペプチドの遺伝子は、プラスミドベクターにクローニングされ、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーターで制御されることができ、当該プラスミドベクターは、非病原性細菌内に送達されることができる。この遺伝子発現ベクターを含む細菌が患者の細胞内に導入されると、当該患者は、グリセリン又はエタノールを服用して当該治療性タンパク質／ペプチドの当該細菌内での生成を誘発し、細胞内に放出させることで、不調及び／又は疾患を治療する。

【0023】

本発明のもう一つの好ましい適用実施例は、ヒト及び／又は動物のためのタンパク質食物収量及び薬物供給を向上させることである。細菌の迅速な増殖によるタンパク質生成は、コストの高い家畜／動物の維持に必要な時間と人力を低減できる。また、必要のない動物犠牲を回避できる。本発明の利点は、哺乳類遺伝子プロモーターを使用して哺乳類タンパク質を生成し、遺伝子工学と遺伝子修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に伴うリスクを低下させることができることにある。

【0024】

本発明のもう一つの可能な適用実施例は生物兵器を製造することである。例えば、微生物、動物又は植物から分離された毒物／有毒タンパクの遺伝子がプラスミドベクターにクローニングされ、かつＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーターで制御されることが可能であり、当該微生物、動物又は植物は、炭疽杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、毒葛、クラゲ、昆虫、魚類、両生類、及び蛇類等を含むがこれらに限定されない。当該プラスミドベクターは非病原性細菌内に送達されることができる。ｐｏｌ−２プロモーター駆動性遺伝子発現を誘導可能な化学剤が存在しない場合に、これらのプラスミドベクターを保有している細菌はひそかに増幅するが無害である。しかし、化学剤、例えばＭＯＰＳ、エタノール、グリセリン、又はそれらの混合物が環境に存在すれば、細菌内の当該毒物／有毒タンパクの遺伝子が活性化されその効果が発揮される。
Ａ．定義
本発明について理解しやすくするため、いくつかの用語は次のように定義される：
核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の一本鎖又は二本鎖のポリマーである。

【0025】

ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）：糖部分（ペントース（ｐｅｎｔｏｓｅ））、リン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及び窒素含有複素環式塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｂａｓｅ）から構成されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のモノマー。当該塩基は、グリコシド炭素（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｃａｒｂｏｎ，当該ペントースの１’の炭素）を介して、当該糖部分に連結されており、当該塩基及び糖の組合せはヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）である。ヌクレオシドは、当該ペントースの３’位又は５’位で少なくとも１つのリン酸と結合され、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）になる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）はそれぞれに、異なる類型のヌクレオチド単位、即ち、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドからなる。

【0026】

オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）：２つ以上の、好ましくは３つ以上の、そして通常は１０個以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）のモノマーからなる分子である。１３個以上のモノマーを含むオリゴヌクレオチドは通常ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とも呼ばれる。オリゴヌクレオチドの正確な長さは種々の要素に依存するが、当該オリゴヌクレオチドの最も好適な機能又は用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、逆転写、又はそれらの組合せを含む任意の方法で生成できる。

【0027】

ヌクレオチド類似体（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ）：Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）又はＵ（ウラシル）ヌクレオチドとは構造的に異なっているが、核酸分子内の通常のヌクレオチドを置換可能な程度に十分に類似しているプリン（ｐｕｒｉｎｅ）又はピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）ヌクレオチドである。

【0028】

核酸組成物（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）：オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり、例えば、一本鎖又は二本鎖分子構造を有するＤＮＡ又はＲＮＡ配列、又はＤＮＡ／ＲＮＡ配列の混合物である。

【0029】

遺伝子（Ｇｅｎｅ）：核酸組成物のうちのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの配列がＲＮＡ及び／又はポリペプチド（タンパク質）をコードする、その核酸組成物である。遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡ、例えば低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、及びそれらのＲＮＡ前駆体と誘導体をコードし得る。一方、遺伝子は、タンパク質／ペプチドの合成に必須のタンパク質コーディングＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びその前駆体と誘導体をコードし得る。場合によって、タンパク質コーディングＲＮＡは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ配列を含んでもよい。

【0030】

一次ＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉｍａｒｙ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）：遺伝子から直接転写され、かつＲＮＡプロセシングも修飾も受けていないＲＮＡ配列である。
前駆体メッセンジャーＲＮＡ（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）：タンパク質コーディング遺伝子が真核細胞のＩＩ型真核ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）により、転写と呼ばれる細胞内メカニズムによって生成される一次ＲＮＡ転写産物である。前駆体メッセンジャーＲＮＡの配列は、５’末端非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３’末端非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、エキソン（ｅｘｏｎ）及びイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）を含んでいる。

【0031】

イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）：非タンパク質リーディングフレームをコードする遺伝子転写産物配列の一部又は複数の部分であり、例えば、インフレームイントロン（ｉｎ−ｆｒａｍｅ ｉｎｔｒｏｎ）、５’末端非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）及び３’末端非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）である。

【0032】

エキソン（Ｅｘｏｎ）：タンパク質リーディングフレーム（ｃＤＮＡ）をコードする遺伝子転写産物配列の一部又は複数の部分であり、例えば、細胞遺伝子、増殖因子、インスリン、抗体及びそれらの類似物／ホモログと誘導体の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）である。

【0033】

メッセンジャーＲＮＡ（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）：前駆体メッセンジャーＲＮＡのエキソンのアセンブリである。メッセンジャーＲＮＡは、細胞内のＲＮＡスプライシング機構、例えばスプライセオソームによるイントロンの除去の後に形成され、ペプチド／タンパク質合成のためのタンパク質コーディングＲＮＡとして使用される。当該メッセンジャーＲＮＡにコードされるペプチド／タンパク質は、酵素、増殖因子、インスリン、抗体及びそれらの類似物／ホモログと誘導体を含むがこれらに限定されない。

【0034】

相補的デオキシリボ核酸（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ，ｃＤＮＡ）：一本鎖又は二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり、ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、イントロン配列をまったく含んでいない。

【0035】

センス（Ｓｅｎｓｅ）：配列順序及び組成は相同ｍＲＮＡと同じである核酸分子である。センスの構造形態は、「＋」、「ｓ」又は「ｓｅｎｓｅ」の符号で示される。
アンチセンス（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：各ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子である。アンチセンスの構造形態は、「−」符号、或いは、ＤＮＡ又はＲＮＡの前に「ａ」又は「ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」を付けて示され、例えば、「ａＤＮＡ」又は「ａＲＮＡ」である。

【0036】

塩基対（Ｂａｓｅ Ｐａｉｒ，ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子に存在するアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との対関係（ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との対関係である。ＲＮＡにおいて、ウラシル（Ｕ）がチミン（Ｔ）に代わっている。一般に、当該対関係は、水素結合によりなされている。例えば、センス配列「５’−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｕ−３’」は、そのアンチセンス配列「５’−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−３’」と完全塩基対関係を形成できる。

【0037】

５’末端（５’−ｅｎｄ）：１つのヌクレオチドの５’−水酸基がホスホジエステル結合により、次のヌクレオチドの３’−水酸基に結合された連続したヌクレオチドの５’位においてヌクレオチドが欠けている末端である。１つ以上のリン酸塩のような他の官能基が当該末端に存在し得る。

【0038】

３’末端（３’−ｅｎｄ）：１つのヌクレオチドの５’−水酸基がホスホジエステル結合で次のヌクレオチドの３’−水酸基に結合された連続したヌクレオチドの３’位においてヌクレオチドが欠けている末端である。当該末端に他の官能基、多くの場合は水酸基が存在し得る。

【0039】

テンプレート（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）：核酸ポリメラーゼで複製可能な核酸分子である。テンプレートは、ポリメラーゼに依存して、一本鎖、二本鎖又は部分的な二本鎖のいずれであってもよい。合成されたコピーは、当該テンプレート、当該二本鎖テンプレート又は部分的な二本鎖のテンプレートの少なくとも一方の鎖と相補的である。ＲＮＡとＤＮＡはいずれも、５’末端から３’末端の方向に合成される。核酸二本鎖体（ｄｕｐｌｅｘ）の２本の鎖は、これらの２本の鎖の５’末端が当該二本鎖体の反対末端となるように常に整列されている（これらの２本の鎖の３’末端も同様である）。

【0040】

核酸テンプレート（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）：二本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、ハイブリッド分子（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）、或いは、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。

【0041】

保存（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）：ヌクレオチド配列と予め選択された（参照）配列の正確な相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）とが非ランダムにハイブリダイズする場合、当該ヌクレオチド配列は当該予め選択された配列に対して保存されている。

【0042】

相同（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）又は相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）：遺伝子又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列とポリヌクレオチド配列との間の類似性を意味する。核酸配列は、例えば、所定の遺伝子又はｍＲＮＡ配列に対して部分的に又は完全に相同性を有し得る。相同性は、類似するヌクレオチド数がヌクレオチド総数に占める百分率で示されてもよい。

【0043】

相補的（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）又は相補性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ又はＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）：上記の塩基対の規則（「ｂａｓｅ ｐａｉｒ」 ｒｕｌｅ）により、塩基の対合が発生する２つのポリヌクレオチド（即ち、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの配列）である。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「５’−Ａ−Ｃ−Ｔ−３’」及び「５’−Ａ−Ｃ−Ｕ−３’」に対して相補的である。相補性は、２つのＤＮＡの鎖の間、或いは、１つのＤＮＡの鎖と１つのＲＮＡの鎖との間、或いは、２つのＲＮＡの鎖の間のいずれにもあり得る。相補性は、「部分的」、「完全」又は「総合的」であってもよい。一部の核酸塩基のみがこれらの塩基対規則に従って対合する時に、部分的相補性と称される。塩基がこれらの核酸の鎖の間で完全に対合するときに、完全又は総合的相補性と称される。核酸の鎖の間の相補性の程度は、核酸の鎖の間のハイブリダイゼーション効率及び強度に対して重要な影響がある。これは、核酸間の結合による増幅反応と検知方法にとって特に重要である。相補率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ又はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、当該核酸の１つの鎖におけるミスマッチ塩基数が合計塩基に占める比率を参照する。したがって、５０％の相補率は、塩基の半分がミスマッチであり、塩基の半分は一致していることを意味する。核酸の２つの鎖の塩基数が違っている場合でも、核酸の２つの鎖が相補的となり得る。この場合に、相補性は、一部の長い鎖と短い鎖の間に起こり、そのうち、当該長い鎖の当該一部の塩基と短い鎖の塩基が対をなす。

【0044】

相補的塩基（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｙ ｂａｓｅ）：ＤＮＡ又はＲＮＡが二本鎖構造を形成するとき、通常は対になっているヌクレオチドである。
相補的ヌクレオチド配列（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｙ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチド配列であり、２つの鎖の間で引き続く水素結合により特異的にハイブリダイズするもう１つの一本鎖と十分に相補的である配列である。

【0045】

ハイブリダイズ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）及びハイブリダイゼ―ション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）：塩基対により複合体を形成するのに十分相補的なヌクレオチド配列間の、二本鎖の形成である。プライマー（又はスプライステンプレート）が標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、ハイブリダイズで形成された複合体（又はハイブリッド）が十分に安定であり、ＤＮＡ合成を開始するために、ＤＮＡポリメラーゼにより必要とされるプライミング機能を提供する。競合的に阻害される（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）二つの相補的ポリヌクレオチドの間には、特異的な（即ち、非ランダム的な）相互作用が存在する。

【0046】

転写後の遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）：ｍＲＮＡ分解又は翻訳抑制（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）ステージにおける標的遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）効果又はノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）効果であり、通常、外来／ウイルスＤＮＡ、又はＲＮＡ導入遺伝子、又は低分子抑制性ＲＮＡのいずれかにより引き起こされる。

【0047】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）：真核細胞における転写後の遺伝子サイレンシングのメカニズムであり、低分子抑制性ＲＮＡ分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により引き起こされる。これらの低分子ＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとして機能し、これらの低分子ＲＮＡに対して完全に又は部分的に相補的である細胞内遺伝子の発現を干渉する。

【0048】

遺伝子サイレンシング効果（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）：遺伝子機能が抑制された後の細胞の反応であり、細胞周期の減衰（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）、Ｇ０／Ｇ１チェックポイント停止（Ｇ０／Ｇ１−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｒｒｅｓｔ）、腫瘍抑制、抗腫瘍生成、癌細胞アポトーシス、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

【0049】

ノンコーディングＲＮＡ（Ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）：細胞内翻訳メカニズムによりペプチド又はタンパク質を合成できないＲＮＡ転写産物である。ノンコーディングＲＮＡは、長い及び短い調節性ＲＮＡ分子、例えばマイクロＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、及び二本鎖ＲＮＡを含む。これらの調節性のＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとしての機能を有し、細胞内における、これらのノンコーディングＲＮＡに対して完全に又は部分的に相補的である遺伝子の発現を干渉する。

【0050】

マイクロＲＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）：当該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に対して部分的に相補的である標的遺伝子の転写産物に連結可能な一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは通常、長さが約１７〜２７個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡとの間の相補程度に従い、細胞内ｍＲＮＡ標的物を直接分解するか、或いは標的ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を直接抑制するかのいずれかを行うことができる。天然ｍｉＲＮＡは、殆ど全ての真核細胞内から見出され、例えば、抗ウイルス感染の防御機能を有し、また、動植物の発生中の遺伝子発現の調整を可能にする。

【0051】

前駆体マイクロＲＮＡ（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）：１つ又は複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を生成するために細胞内ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅＩＩＩと相互作用するための、ステムアーム（ｓｔｅｍ−ａｒｍ）及びステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）領域を含んでいるヘアピン様一本鎖ＲＮＡであり、これらのマイクロＲＮＡは、その標的遺伝子、又は配列が当該（これらの）マイクロＲＮＡの配列に相補的な遺伝子をサイレンシングすることができる。前駆体マイクロＲＮＡのステムアーム領域は、完全に（１００％）又は部分的に（ミスマッチ）ハイブリダイズされた二本鎖体のいずれかを形成する一方、ステムループはサイクル又はヘアピンループ構造形態を形成すべくステムアーム二本鎖体の一方の端部に連結されている。本発明において、前駆体マイクロＲＮＡは一次マイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含んでもよい。

【0052】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）：サイズが約１８〜２７個の完全な塩基対のリボヌクレオチド二本鎖体であり、かつ殆ど完全に相補的である標的遺伝子の転写産物を分解することができる短い二本鎖ＲＮＡである。

【0053】

低分子ヘアピン又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ又はｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）：ヘアピン様構造を形成するために、一致していない（ｕｎｍａｔｃｈｅｄ）ループオリゴヌクレオチドで分割された、一対の部分的に又は完全に一致したステムアームヌクレオチド配列を含む一本鎖ＲＮＡである。多くの天然マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ヘアピン様ＲＮＡ前駆体、即ち、前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に由来する。

【0054】

ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）：異なる遺伝子環境に移動又は滞在できる組換え型ＤＮＡ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，ｒＤＮＡ）のような組換え型核酸組成物である。一般的に、別の核酸が有効に連結されている。当該ベクターは細胞内での自己複製ができ、当該ベクター及び取付けられたセグメントも複製される。一種の好ましいベクターはエピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）であり、即ち、染色体外（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）での複製が可能な核酸分子である。好ましいベクターは、自己複製、核酸の発現が可能なものである。一つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子及び／又はノンコーディングＲＮＡ遺伝子の発現を誘導できるベクターは、ここでは「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」又は「発現コンピテントベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）」と呼ばれる。特に重要なベクターは、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡのクローニングを可能にする。ベクターの成分は、ウイルスプロモーター又はＩＩ型（ｔｙｐｅ−ＩＩ）のＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ又はｐｏｌ−２）プロモーター、又はその両方、Ｋｏｚａｋコンセンサス翻訳開始位（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ）、複数の制限／クローニング部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ／ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、ｐＵＣ複製開始点（ｐＵＣ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）原核細胞内の少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子を発現するためのＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、哺乳類細胞内の複製のための選択性のＳＶ４０複製開始点（ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎ）、及び／又はテトラサイクリン応答因子を含んでもよい。ベクターの構造は、線形、或いは環形の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡであってもよく、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ＤＮＡ導入遺伝子、ジャンピング遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる。

【0055】

プロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）：ポリメラーゼ分子で識別され（又はそれに結合され）、ＲＮＡの合成を開始させる核酸である。本発明によれば、当該プロモーターは、既知のポリメラーゼ結合位置、エンハンサーとその類似物、及び所要のポリメラーゼを使用してＲＮＡ転写産物の合成を開始可能な任意の配列であってもよい。

【0056】

真核プロモーター（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）：遺伝子転写に必要な、ＩＩ型真核ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）、ｐｏｌ−２同等物、及び／又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーターで識別可能な核酸モチーフ（ｍｏｔｉｆｓ）である。

【0057】

ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ又はｐｏｌ−２）プロモーター（Ｔｙｐｅ−ＩＩ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｏｌ−ＩＩ ｏｒ ｐｏｌ−２）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）：ＩＩ型真核ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ又はｐｏｌ−２）で識別され、かつそれに結合されるＲＮＡプロモーターであり、当該ポリメラーゼは、真核メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及び／又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を転写する。例えば、ｐｏｌ−２プロモーターは、哺乳類のＲＮＡプロモーター又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであってもよいが、それらに限定されない。

【0058】

ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ又はｐｏｌ−２）同等物（Ｔｙｐｅ−ＩＩ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｏｌ−ＩＩ ｏｒ ｐｏｌ−２）Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）：哺乳類ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ又はｐｏｌ−２）及びＰｏｌ−ＩＩ適合性ウイルスＲＮＡポリメラーゼからなる群から選ばれる真核転写機構である。

【0059】

Ｐｏｌ−ＩＩ適合性ウイルスプロモーター（Ｐｏｌ−ＩＩ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）：真核ｐｏｌ−２又はそれと等価な転写機構により遺伝子発現可能なウイルスのＲＮＡプロモーターである。例えば、ｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターであってもよいが、それらに限定されない。

【0060】

シストロン（Ｃｉｓｔｒｏｎ）：アミノ酸残基の配列をコードするＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列であり、上流及び下流ＤＮＡ発現制御要素を含む。
ＲＮＡプロセシング（ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）：ＲＮＡの成熟、修飾、及び分解に関与する細胞内メカニズムであり、ＲＮＡスプライシング、イントロン切除、エキソソーム消化（ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、ナンセンス変異依存分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ，ＮＭＤ）、ＲＮＡエディティング、ＲＮＡプロセシング、及びそれらの組合せを含む。

【0061】

抗生物質耐性遺伝子（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅ）：発現が抗生物質を分解する能力を有する遺伝子である。当該抗生物質は、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、アンピシリン（Ａｍｐ）、ネオマイシン、Ｇ４１８、カナマイシン、エリスロマイシン、パロマイシン（ｐａｒｏｍｙｃｉｎ）、ホスホマイシン、スペクトロマイシン、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、リファピシン、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、セファロチン、タイロシン及びそれらの組合せからなる群から選ばれる。

【0062】

制限／クローニング部位（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ／Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ）：制限酵素切断のためのＤＮＡモチーフである。これらの制限／クローニング部位は、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩ／ＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ／ＬＩ、ＡｓｅＩ、Ａｓｐ７１８Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｌＩ／ＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＢｓｐＨＩ／ＬＵ１１Ｉ／１２０Ｉ、ＢｓｒＩ／ＢＩ／ＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ／ＳＩ、ＢｓｔＢＩ／Ｕ１／ＸＩ、ＣｌａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ／ＩＩ、ＥａｇＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＲＩＩ／４７ＩＩＩ／ＲＶ、ＥｈｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ／ＩＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭａｅＩＩ／ＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ１０Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ／ＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ／ＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩの切断位置を含むがこれらに限定されない。

【0063】

遺伝子送達（Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）：ポリソーム（ｐｏｌｙｓｏｍａｌ）導入、リポソーム導入、化学導入、電気穿孔法、ウイルス感染、ＤＮＡ組換え、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、マイクロインジェクション、遺伝子銃浸透、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる遺伝子工学方法である。

【0064】

遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）：ＤＮＡ制限酵素反応と接合反応、相同性遺伝子の組換え、導入遺伝子混入、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、レトロウイルス感染、及びそれらの組合せからなる群から選ばれるＤＮＡ組換え方法である。

【0065】

細胞周期レギュレーター（Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）：細胞分裂及び細胞増殖速度の制御に関与し、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、サイクリン依存性キナーゼ６（ＣＤＫ６）、サイクリン、ＢＭＩ−１、ｐ１４／ｐ１９Ａｒｆ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１６Ｉｎｋ４ａ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、ｐ２１Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない細胞遺伝子である。

【0066】

腫瘍抑制（Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）：細胞周期の減衰、Ｇ０／Ｇ１チェックポイント停止、腫瘍抑制、抗腫瘍発生、癌細胞アポトーシス、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない細胞の抗腫瘍及び抗癌メカニズムである。

【0067】

標的細胞（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｅｌｌ）：体細胞、組織、幹細胞、生殖細胞、奇形腫細胞、腫瘍細胞、癌細胞、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる単一又は複数のヒト細胞である。

【0068】

癌組織（Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ）：皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍／癌、リンパ腫、血液癌、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる腫瘍組織である。

【0069】

転写誘導物（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｒ）：遺伝子のＲＮＡ転写作用を促進及び／又は強化可能な化学剤である。転写誘導物は、３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール、グリセリン、又はそれらの混合物と類似する化学構造を含むがこれらに限定されない。
抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）：受容体と予め選択されたリガンドを結合するための予め選択された保存ドメイン構造を有するペプチド又はタンパク質分子である。

【0070】

薬学上又は治療上の適用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ又はｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）：多能性幹細胞の生成のような幹細胞の生成と幹細胞研究及び／又は治療発展、癌治療、疾患処理、傷口治癒処理、薬物収量と食物供給の向上、及びそれらの組合せのために有用な生物医学的利用及び／又は装置である。
Ｂ．組成物及び適用
原核細胞内においてＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を誘導するための組成物及びその使用であって、（ａ）３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール、グリセリン、又はそれらの混合物と類似する構造を有する少なくとも１種の化学剤と、（ｂ）ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター駆動性発現メカニズム又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーター駆動性発現メカニズムにより制御される少なくとも１つの遺伝子を含有する複数の原核細胞とを含み、（ａ）と（ｂ）は、当該遺伝子のＲＮＡ及び／又はタンパク質産物が生成されるように当該遺伝子の発現を誘発する条件下で混合される。

【0071】

或いは、本発明は、誘導可能な遺伝子発現組成物であり、化学剤を使用して、原核細胞内において真核ＲＮＡプロモーター駆動性転写作用を促進する。誘導可能な遺伝子発現組成物は、（ａ）ＭＯＰＳ、エタノール、グリセリン、又はそれらの混合物と類似する構造を有する少なくとも１種の化学剤と、（ｂ）ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター駆動性発現メカニズム又はｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーター駆動性発現メカニズムにより制御される少なくとも１つの遺伝子を含有する複数の原核細胞とを含み、（ａ）と（ｂ）は、当該遺伝子の発現を誘発する条件下で混合される。

【0072】

本発明は、原則的に、変異性の原核プロモーターへの転換、又は大量の人力と金銭のコストがかかるハイブリドーマ又は哺乳類細胞の培養の必要がなく、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーターを使用して所望のＲＮＡ及び／又はタンパク質／ペプチドを直接発現する新規な組成物の設計、及びそれにより原核細胞を誘導して生じる迅速な適応作用を提供する。

【0073】

好ましくは、当該原核細胞は細菌細胞であり、具体的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、当該化学剤は３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール、グリセリン、又はそれらの混合物である。なお、当該真核ＲＮＡプロモーターは、ＩＩ型真核ポリメラーゼ（ｐｏｌ−２）プロモーター、例えばＥＦ１α、ｐｏｌ−２適合性ウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターであることが好ましい。当該真核ＲＮＡプロモーター制御の遺伝子は、マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、これらの前駆体とホモログ、及びこれらの組合せからなる群から選ばれるノンコーディング又はタンパク質コーディングＲＮＡ転写産物、又はそれら両方をコードする。本発明において生成されたペプチド／タンパク質は、上記タンパク質コーディングメッセンジャーＲＮＡ転写産物から翻訳されたものであり、酵素、増殖因子、抗体、インスリン、ボツリヌス毒素（ｂｏｔｏｘ）、機能タンパク質とそのホモログ、及びそれらの組合せからなる群から選ばれるものであるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、当該遺伝子発現を誘導する当該条件は３７℃のＬＢ培地に、当該化学剤が添加された細菌培養条件である。

【実施例】

【0074】

１．細菌細胞培養と化学物質処理
ｚ−コンピテント大腸菌形質転換キット（ｚ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カリフォルニア州アーバイン）から得られたコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞株（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α）と望ましいプラスミドベクター、例えばｐＬＶＸ−Ｇｒｎ−ｍｉＲ３０２＋３６７又はｐＬｅｎｔｉ−ＥＦ１α−ＲＧＦＰ−ｍｉＲ３０２とを混合して、形質転換作用を行う。形質転換されていない細菌細胞を、１０ｍＭの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）と０．２ｍＭのブドウ糖が補充された３７℃のＬＢ（ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ））培地において正常に増殖させながら、１７０ｒｐｍで頻繁に振盪した。一方、形質転換した細菌細胞は、上述したＬＢ培地に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを更に添加して培養した。化学誘導のために、１０ｍＭの硫酸マグネシウムと０．２ｍＭのブドウ糖が補充され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが添加されたＬＢ培地において、１リットルごとの当該ＬＢ培地のそれぞれに０．５〜２ｍｌのＭＯＰＳ、グリセリン、エタノール、又はそれらの組合せを添加した。なお、形質転換した細菌細胞は、陰性対照群として、上記のアンピシリンが添加されたが、化学誘導物がまったく添加されていないＬＢ培地において培養された。
２．ヒト細胞培養及びマイクロＲＮＡの導入
ヒト初代表皮細胞（ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｓｋｉｎ ｃｅｌｌｓ，ｈｐＥＳＣ）は、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充された新鮮なＲＰＭＩ１６４０培養液における４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩによって、３７℃で最小２ｍｍ^３の体積から３５分間消化させて分離したものである。分離された角化細胞は、３７℃で５％の二酸化炭素の条件で、ＥｐｉＬｉｆｅ無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）の細胞培養液において培養され、当該培地には、ヒト角化細胞増殖添加剤（ＨＫＧＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）及び抗生物質が添加された。細胞増殖が５０％〜６０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達したときに、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に１分間曝露し、無フェノールレッドのＤＭＥＭ培養液（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ−ｆｒｅｅ ＤＭＥＭｍｅｄｉｕｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一回リンスして、更に、これらの分離された細胞を１：１０で希釈した後、新鮮なＨＫＧＳ添加剤を含むＥｐｉＬｉｆｅ培養液で再播種した。ヒト癌／腫瘍細胞株ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２、及びＴｅｒａ−２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，メリーランド州ロックビル）から取得され、製造者の指示した条件で培養された。マイクロＲＮＡの導入において、１５μｇの分離されたｍｉＲ−３０２及び／又はその前駆体を５０μｌの導入剤（Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）が混合されたＥｐｉＬｉｆｅ培養液に溶解させた。１０分間の培養を経て、当該混合液を１００ｍｍ細胞培養皿内で５０％〜６０％密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達したｈｐＥＳＣ又は癌／腫瘍細胞にそれぞれ添加した。１２〜１８時間後、新鮮なＨＫＧＳ添加剤を含むＥｐｉＬｉｆｅ培養液又はＡＴＣＣの指示した条件の培養液で元の培養液を交換した。３〜４日ごとに、導入ステップを３〜４回繰り返して導入効率を向上させてもよい。細胞形態が球様に変化した後、２０％の血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００μＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−４、５ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１μＭのＡ８３−０１、及び０．１μＭのバルプロン酸（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，カリフォルニア州サンディエゴ）が補充されたｋｎｏｃｋｏｕｔＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、３７℃、５％のＣＯ_２の条件でこれらの細胞（ｍｉｒＰＳＣ）を培養し継代した。
３．タンパク質抽出とウエスタンブロット分析法
製造者が指示したように、プロテアーゼ抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ及びＰＭＳＦが補充されたＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ溶解／抽出試薬（ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ ｌｙｓｉｓ／ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｓｉｇｍａ）により細胞（１，０００，０００個）を溶解させた。そして、１２，０００ｒｐｍ、４℃で当該溶解液を２０分間遠心分離し、遠心分離された上澄液が得られた。改良されたＳＯＦＴｍａｘタンパク質測定パッケージにより、Ｅ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）上でタンパク質濃度を測定した。還元（ｒｅｄｕｃｉｎｇ，＋５０ｍＭ ＤＴＴ）及び非還元（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ，ＤＴＴなし）の条件で、３０μｇの細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液にそれぞれ添加し、６％〜８％のポリアクリルアミドゲルに入れる前に、３分間沸騰させた。そして、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でタンパク質を解析し、その後に、タンパク質をニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングし、当該膜をオデッセーブッロキング試薬（Ｏｄｙｓｓｅｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ネブラスカ州リンカーン）において培養し、室温で２時間保管した。次に、当該試薬に一次抗体を添加し、当該混合物を４℃で保管し作用させた。使用された一次抗体は、Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カリフォルニア州サンタクルーズ）、Ｓｏｘ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｎａｎｏｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＣＤＫ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、サイクリンＤ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、サイクリンＤ２（Ａｂｃａｍ）、ＢＭＩ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ケラチン１６（Ａｂｃａｍ）、β−アクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）、ＲｕｖＢ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びＲＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含んでいる。一晩経た後、ＴＢＳ−Ｔで当該膜を三回リンスし、そして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応性染料（１：２，０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）二次抗体に、室温で１時間曝露した。ＴＢＳ−Ｔで三回リンスした後、Ｌｉ−Ｃｏｒオデッセー赤外線映像装置（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｅｒ）及びオデッセーソフトウェアｖ．１０（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して、免疫ブロットの蛍光スキャン及び映像分析を処理した。
４．ＲＮＡ抽出とノーザンブロット分析法
ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）マイクロＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースティン）により総ＲＮＡ（１０μｇ）を分離した。そして、１５％のＴＢＥ−尿素ポリアクリルアミドゲル又は３．５％の低融点アガロースゲル電気泳動で当該ＲＮＡを分画し、当該分画されたＲＮＡをナイロン膜にエレクトロブロッティングした。そして、［ＬＮＡ］−ＤＮＡプローブ（５’−［ＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣ］ ＡＴＧＧＡＡＧＣＡＣ ＴＴＡ−３’）（配列番号１）により、ｍｉＲ−３０２及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２を検知した。当該プローブは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で純化され、かつ、［^３２Ｐ］−ｄＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，イリノイ州アーリントンハイツ）の存在下で、ターミナルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，２０ ｕｎｉｔｓ）で２０分間テール標識（ｔａｉｌ−ｌａｂｅｌｅｄ）された。
５．プラスミド増幅とプラスミドＤＮＡ／総ＲＮＡ抽出
プラスミドで形質転換（実施例１）されたコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を３７℃で、１０ｍＭの硫酸マグネシウム及び０．２ｍＭのブドウ糖が補充されたＬＢ培地中に一晩培養し、１７０ｒｐｍで頻繁に振盪した。増幅作用以外に、上記培地の１リットルごとに、さらに０．５〜２ｍｌのＭＯＰＳ、グリセリン、及び／又はエタノールを添加して真核プロモーター駆動のＲＮＡ及び／又はタンパク質の生成を誘発した。プラスミド純化キット（ＨｉＳｐｅｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）を使用して、全ての増幅されたプラスミドＤＮＡ及び発現されたｍＲＮＡ／マイクロＲＮＡをあわせて分離し、分離ステップは、製造者の指示したステップに従うが少し調整したものであり、即ち、ＲＮａｓｅ ＡをＰ１緩衝液内に添加しなかった。プラスミド及びｍＲＮＡｓ／マイクロＲＮＡ両方を含む最終抽出産物は、ＤＥＰＣ処理された超純水（ｄｄＨ_２Ｏ）に溶解され、使用されるまで−８０℃で保管された。増幅されたプラスミドベクターのみを純化したい場合に、製造者の指示したステップに従って、ＲＮａｓｅ ＡをＰ１緩衝液に添加する。
６．マイクロＲＮＡ及びｍＲＮＡの分離／純化
更に、製造者の指示に従って、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ分離キット（Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州オースティン）を使用して実施例５の方法により分離された総ＲＮＡを純化した。最終産物は、ＤＥＰＣ処理された超純水（ｄｄＨ_２Ｏ）に溶解され、使用されるまで−８０℃で保管された。細菌ＲＮＡは自然状態において分解が非常に迅速（数時間）であるが、真核ポリ−Ａ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びヘアピン様マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は４℃で比較的安定（半減期が３〜４日にも達する）であるので、この差異を利用して後の適用のための純ｍＲＮＡ及び／又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを取得しておくことができる。例えば、ＲＧＦＰのｍＲＮＡは、細胞導入の検証のために使用可能であり、ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓは、体細胞を胚性幹細胞様（ＥＳＣ−ｌｉｋｅ）のｉＰＳ細胞に再プログラム化するために使用可能である。純化されたｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓを幹細胞培養液に添加して当該再プログラム化を促進及び維持することができる。
７．免疫染色分析
組織サンプルの包埋、切片化、及び染色は、従来の報告のとおりに行われた（林（Ｌｉｎ）等，ＲＮＡ ２００８）。一次抗体は、Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｓｏｘ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ｎａｎｏｇ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びＲＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含んでいる。蛍光染料で標記されたヒツジ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）又はウマ抗マウス（ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）抗体を二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）として使用した。蛍光８０ｉ顕微鏡定量分析システム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ８０ｉ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）及びＭｅｔａｍｏｒｐｈ映像処理プログラム（Ｎｉｋｏｎ）を使用して１００×又は２００×の拡大倍率で結果を検証及び分析した。
８．亜硫酸水素塩によるＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ分離キット（ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ）を使用して約２，０００，０００個の細胞から遺伝子ＤＮＡを分離した。分離されたＤＮＡを１μｇ取って、製造者の指示した方法に従って、亜硫酸水素塩（ＣｐＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，カリフォルニア州テメキュラ）で処理した。亜硫酸水素塩の処理は、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンはシトシンのままである。亜硫酸水素塩ＤＮＡ配列決定の分析について、我々は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇのプロモーター領域を増幅した。Ｏｃｔ３／４プロモーター領域の増幅に使用されたプライマーは、５’−ＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧ ＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴ ＧＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号２）及び５’−ＣＣＣＴＣＣＴＧＡＣ ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣ ＣＡＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３）を含み、Ｎａｎｏｇプロモーター領域の増幅に使用されたプライマーは、５’−ＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴ ＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴ ＴＴＴＴＧ−３’（配列番号４）及び５’−ＡＡＣＣＣＡＣＣＣＴ ＴＡＴＡＡＡＴＴＣＴ ＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号５）を含んでいる。まず、亜硫酸水素塩で修飾されたＤＮＡ（５０ｎｇ）とこれらのプライマー（計１００ｐｍｏｌｅ）を１倍ＰＣＲ緩衝液において混合し、９４℃に加熱してから２分間維持し、そして、すぐに氷で冷却した。その後、高精度のＰＣＲキット（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ）を使用して、９４℃で１分間及び７０℃で３分間のＰＣＲを２５サイクル行った。更に、３％のアガロースゲル電気泳動法で正確な長さを有する増幅されたＤＮＡ産物を分画し、そして、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で当該ＤＮＡ産物を純化してから、ＤＮＡ配列決定を行った。亜硫酸水素塩で修飾されたＤＮＡ配列における変化していないシトシンと、亜硫酸水素塩で修飾されていないＤＮＡ配列における変化していないシトシンとを比較することにより、ＤＮＡメチル化位置の詳細プロフィールを得られた。
９．細胞浸潤試験
２００μｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを単独で、又は、無フェノールレッドＤＭＥＭ培養液に２０％のＦＢＳ及び１％のＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）が補充されたＭａｔｒｉｇｅｌをチャンバーインサート（ｃｈａｍｂｅｒ ｉｎｓｅｒｔｓ，孔径１２μｍ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に塗布し、チャンバーインサートを無菌環境に置き、一晩乾燥させた。無フェノールレッドのＤＭＥＭ培養液により細胞を収集、洗浄、及び再懸濁して、最終的に１００，０００個／ｍｌの細胞密度にした。５００μｌの当該細胞懸濁液を上層チャンバー（ｔｏｐ ｃｈａｍｂｅｒ）内に分配し、１．５ｍｌのＤＭＥＭ条件の培養液を下層チャンバーに添加して走化性勾配（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を形成した。３７℃で１６時間の一晩培養の後、浸潤状況を測定した。脱脂綿により上層チャンバーを拭き、そして１００％のメタノール中で膜下側に位置する浸潤細胞を１０分間固定し、空気乾燥し、クレシルバイオレット（ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ）で２０分間を染色し、水でやさしく洗浄した。乾燥した後、１：１の１００％のエタノール及び０．２Ｍのクエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）を含む洗液を使用して膜上のクレシルバイオレット染色を２０分間溶出し、精密マイクロプレートリーダー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により波長５７０ｎｍでの吸光度を読み取った。被測定サンプルの吸光度と、チャンバーインサート膜層（総細胞数）を拭かない場合に得られた吸光度とを比較して、浸潤細胞の百分率を得た。結果を図１０Ａに示した。
１０．細胞接着試験
細胞接着試験は従来の報告に記載されたとおりに行った（Ｌｉｎ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０）。ヒト骨髓内皮細胞（ｈＢＭＥＣ）を１００，０００個／ｍｌの密度で９６ウェルプレートに蒔き、試験を行う前に、接着培養液（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）［ＲＰＭＩ １６４０／０．１％のＢＳＡ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）］で洗浄した。トリプシン（腫瘍／癌細胞に使用される）又はコラゲナーゼ（ｍｉｒＰＳ細胞に使用される）を使用して、被測定細胞を分離し、無菌生理食塩水で細胞を洗浄し、細胞を１，０００，０００個／ｍｌの密度で１０μＭ ｆｕｒａ−４アセトキシメチルエステル（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ，Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳに再懸濁させ、３７℃の暗い環境で１時間保管した。そして、当該細胞を遠心分離し、１％（ｖ／ｖ）のプロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ，１００ｍＭ）を含む無血清培養液で細胞を洗浄し、そして、当該細胞を接着培養液及び３７℃の暗い環境で２０分間培養し、細胞内の蛍光プローブを活性化する。次に、当該１００，０００個の細胞（１ウェル当たり３００μｌの細胞懸濁液）をコンフルエントな（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ｈＢＭＥＣ内皮細胞単層に添加し、３７℃で５０分間培養した。２５０μｌの接着培養液で二回洗浄し、接着されていない細胞を除去した。蛍光プレートリーダ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して３７℃で励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３０ｎｍで蛍光を読み取った。結果を図１０Ｂに示した。
１１．移植と奇形腫の形成
約５〜１０個のｍｉｒＰＳ細胞に由来する胚様体（４〜８細胞ステージ）を５０μｌのＤＭＥＭ培養液と基底膜基質Ｍａｔｒｉｇｅｌの２：１の混合液に懸濁させ、そしてこれらのｍｉｒＰＳ細胞に由来する胚様体を生後六週間のメス偽妊娠免疫不全ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスの子宮に移植した。当該偽妊娠のマウスを準備する方法として、腹膜内に１ＩＵのヒト閉経期ゴナドトロピン（ｈｕｍａｎ ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ，ＨＭＧ）を二日注射し、そしてヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ，ｈＣＧ）を一日注射した。移植の間に、２．５％のアベルチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）溶液を使用して、マウスごとに０．４ｍｌの用量でマウスを麻酔した。移植後、又は当該移植細胞塊が１００ｍｍ^３の大きさ以上に発達した時、当該異種移植塊（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ ｍａｓｓｅｓ）を３〜４週間監視した。当該嚢腫／奇形腫を切除した後、（長さ×幅^２）／２の式によりその体積を計算し、それに計数及び秤量し、更に組織学分析を行った。奇形腫様組織嚢腫（ｔｅｒａｔｏｍａ−ｌｉｋｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｙｓｔｓ）の形成は通常、移植後約２．５週間で観察できる。結果は図１１Ａに示すとおりである。
１２．生体内腫瘍発生試験
我々は、Ｔｅｒａ−２細胞（総体積１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ−ＰＢＳにおける２，０００，０００個の細胞）を生後八週間のオスマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ系統）の脇腹（例えば、右後肢）に異種移植した。当該腫瘍を週ごとに監視し、Ｔｅｒａ−２の異種移植後一週間で、インサイチュ注射でｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ又はｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２をコードするプラスミドベクター、例えばｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓベクター又はｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｄ＊ベクターを導入した。２μｇ（マウスの体重１ｇあたり）の、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で調製されたｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｓ又はｐＣＭＶ−ｍｉＲ３０２ｄ＊ベクター（総計１０μｇ）により、処理（二回の処理の間に三日の間隔を置く）を５回行った。製造者の使用指示に従って、体内−ｊｅｔＰＥＩデリバリー試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ニューヨーク）を使用した。注射完了三週後、又は、ベクターで処理されていない腫瘍が約１００ｍｍ^３の平均サイズまで増殖した後、サンプルの収集を開始した。主要器官、例えば血液、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脾臓、及び異種移植腫瘍を取り出し、腫瘍の組織学評価及び免疫反応細胞毒性テストを行った。触診で腫瘍の形成を監視し、（長さ×幅^２）／２の式により腫瘍体積を計算した。なお、腫瘍についても、計数、解剖及び秤重し、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ）及び免疫染色試験で組織学検査を行った。組織学検査の結果、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脾臓において検知できる組織病変はなかった。結果を図１１Ａと１１Ｃに示した。
１３．生体傷口治癒試験
Ｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ及び関連プラスミドベクターは、実施例１と実施例５に記載の方法で増幅され、実施例５と実施例６に記載の方法で抽出された。そして、分離されたｐｒｅ−ｍｉＲ−３０２ｓ及び関連プラスミドベクターは、予め用意されたカカオバター、綿実油、オリーブオイル、ピルビン酸ナトリウム、及び白色ワセリンを含む軟膏基剤と混合された。準備された軟膏基剤における当該ｍｉＲ−３０２前駆体の濃度が１０μｇ／ｍＬである。メスにより、皮膚を切開して生皮膚の開放創を生じさせ、約０．５ｃｍの傷口を対照群として生じさせ、１．０ｃｍの傷口を実験群として生じさせた。軟膏（約０．３ｍＬ）を傷口に直接塗布し、創部全体を覆った。更に、液状包帯により処理済みの領域をシールした。
１４．統計分析
免疫染色、ウエスタンブロット及びノーザンブロットの分析について、７５％よりも大きいシグナル強度変化をいずれも陽性結果とみなし、これらの結果は、分析後、平均値±標準差（ｍｅａｎ±ＳＥ）で表す。データの統計分析は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で行われた。主たる効果が有意である場合、ダネットの多重比較（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ）検定を使用して、対照群と顕著な差異がある群（グループ）を識別した。２つの処理群の間を一対ごとに比較するために、両側スチューデントＴ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ ｔｅｓｔ）を使用した。２つ以上の治療群を含む実験については、ＡＮＯＶＡの後に、多重範囲検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ）を実施した。ｐ＜０．０５の確率値は統計学的に有意であると考えた。全てのｐ値は両側試験にて決定した。

【0075】

参考文献

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]