特許 6185549 新規のＴＲＰＶ１抑制ペプチド及びこれを含有する皮膚老化防止またはしわ改善用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6185549

(24)【登録日】2017年8月4日

(45)【発行日】2017年8月23日

(54)【発明の名称】新規のＴＲＰＶ１抑制ペプチド及びこれを含有する皮膚老化防止またはしわ改善用組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20170814BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20170814BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20170814BHJP

   A61K 8/02 20060101ALI20170814BHJP

   A61K 8/06 20060101ALI20170814BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170814BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170814BHJP

   A61P 17/18 20060101ALI20170814BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20170814BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20170814BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   A61K8/64

   A61Q19/08

   A61K8/02

   A61K8/06

   A61K38/00

   A61Q19/02

   A61P17/00

   A61P17/16

   A61P17/04

   A61P29/00

   A61P17/18

   A61Q17/04

   C12Q1/02

【請求項の数】6

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2015-500346(P2015-500346)

(86)(22)【出願日】2012年3月16日

(65)【公表番号】特表2015-515455(P2015-515455A)

(43)【公表日】2015年5月28日

(86)【国際出願番号】KR2012001932

(87)【国際公開番号】WO2013137505

(87)【国際公開日】20130919

【審査請求日】2015年1月21日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 第３回ＫＳＩＤ秋季シンポジウム及びＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐ ２０１１ポスター発表集「Ｓｋｉｎ Ａｐｐｅｎｄａｇｅ，Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｆｒｅｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ」，第４９頁，発行日：２０１１年９月１６日，発行所：大韓皮膚研究学会（ＫＳＩＤ）

(73)【特許権者】

【識別番号】509313511

【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団

【氏名又は名称原語表記】ＳＮＵ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100116687

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 爾

(74)【代理人】

【識別番号】100098383

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 純子

(72)【発明者】

【氏名】チョン ジンホ

(72)【発明者】

【氏名】カン ソミン

(72)【発明者】

【氏名】リー ヨンミ

(72)【発明者】

【氏名】リー セラ

(72)【発明者】

【氏名】キム ヨンチョン

【審査官】 田中 耕一郎

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０００９５３７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−０３８６１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Okada, Yuka, et al., American Journal of Pathology (2011), 178(6), 2654-2664

【文献】 Takita, Morichika, et al., Journal of Health Science (2007), 53(2), 240-244

【文献】 Du, Yi-Ru, et al, Biochem Biophys Res Comm., (2011), 408(1), 32-37

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２または配列番号４で表される、ＴＲＰＶ１活性を抑制するペプチド。

【請求項2】

配列番号２及び配列番号４で表されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上を有効成分として含有する、皮膚しわ改善用の化粧料組成物。

【請求項3】

前記ペプチドは、化粧料組成物に０．００１〜２０ｍＭの濃度で含有される、請求項２に記載の化粧料組成物。

【請求項4】

前記化粧料組成物は、化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ゲル、軟膏、パッチまたはフプレーの剤形からなる群より選択されるいずれか一つの剤形を有する、請求項２に記載の化粧料組成物。

【請求項5】

配列番号２及び配列番号４で表されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上を有効成分として含有する、皮膚しわ改善用の薬学的組成物。

【請求項6】

前記ペプチドは、薬学的組成物に０．００１から２０ｍＭの濃度で含有される、請求項５に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞内のCa²⁺流入に影響を及ぼすTRPV1の新規な活性抑制ペプチド及びこれを含有する皮膚老化の防止、皮膚しわの改善、皮膚美白、炎症、かゆみ症、または痛み改善用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚老化は、一般に、しわ、たれ及びたるみの増加と係わる外的及び内的（自然的）な過程によるものである。外的老化は繰り返される紫外線（ultraviolet rays、UV）の露出によって主に発生するので、これを一般に「光老化」と称する。自然に老化した皮膚は滑らかで白くて小じわがあるが、光老化された皮膚は太いしわができて色素沈着及び毛細血管拡張を引き起こしている。

【0003】

皮膚の主な構造的構成要素であるコラーゲンの損傷は皮膚老化の主な要因として考えられており、自然な老化及び光老化皮膚の両方で確認された。コラーゲンの損傷は、部分的にマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase；MMP）の誘導と係わる。MMPは、マトリックス−分解酵素と構成的な観点より関連するファミリーであって、炎症、腫瘍浸湿及び皮膚老化のような多様なプロセスに重要な役割を果たしている。MMPのレベルは、紫外線光、酸化的ストレス及びサイトカインなどのような多様な刺激によって増加する。紫外線照射は、活性タンパク質（activator protein-1；AP-1）のDNA結合を促進させ、コラゲナーゼ（MMP-1）、ストロメリシン（MMP-3）及びゼラチナーゼ（MMP-9）のようなMMPを誘導する。コラーゲンがMMP-1によって分解されれば、MMP-3及びMMP-9によって更に分解される。

【0004】

近年、カルシウムがMMPの発現及び活性を調節することができると報告されている。すなわち、カルシウムはMMP-12の活性化調節に関与し、増加した細胞外カルシウムはヒト角質細胞内でのMMP-9遺伝子の発現を誘導する。一方、Ca²⁺流入の抑制はMMP-1 mRNAのレベルを減少させる。細胞内Ca²⁺レベルの調節は角質細胞からMMP-1の分泌を変化させることができる。

【0005】

一方、TRPV1（transient receptor potential vanilloid type 1）はカルシウム透過性の非-選択的陽イオンチャンネルファミリーの一つである。TRPV1の活性はCa²⁺の流入を誘導し、カプサゼピン（capsazepine）のような特定の拮抗剤によって抑制される。さらに、TRPV1はカプサイシン（capsaicin）、熱、低いpH、ブラジキニン（bradykinin）、PGE₂またはATPなどによって直接的に活性化される。このような活性条件は、TRPV1が熱−化学的刺激及び組織の損傷に対する一次的な生物学的センサーであることを意味する。TRPV1は脳、腎臓、気管支上皮細胞及び表皮角質細胞のような多様な組織に存在するものと報告されている。さらに、カプサイシン刺激は角質細胞の細胞質内Ca²⁺の濃度（レベル）を増加させ、これはカプサゼピンによって抑制される。

【0006】

MMP-1の発現におけるTRPV1の役割が表皮細胞の熱によって誘導されることが報告されたことがあった。UV光はMMPの発現及び皮膚老化を誘導するさらに決定的な因子である。本発明者の以前の研究によれば、TRPV1を通じたCa²⁺の流入は、UVによって誘導されたMMP-1の発現に決定的な要因となり、Ca²⁺依存的タンパク質キナーゼC（protein kinase C、PKC）が信号の伝達に係わっているので、表皮TRPV1は紫外線のような有害な刺激に対するセンサーとして機能するはずであることを提示している。したがって、TRPV1は紫外線の露出などによって引き起こされる皮膚光老化の防止のための標的になり得るので、皮膚老化を防止し予防するため、新規なTRPV1活性抑制物質を開発することが期待されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、TRPV1抑制ペプチド及びこれを含有する皮膚老化の防止、皮膚しわの改善、皮膚美白、炎症、かゆみ症、または痛み改善用の組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記目的を達成するため、本発明は配列番号1から配列番号8で表されるペプチドを提供する。

【0009】

本発明の好適例において、前記ペプチドは新規のTRPV1活性抑制ペプチドとして特定されたものである。

【0010】

前記TRPV1は、TRPファミリーに属している非特異的陽イオンチャンネルであって、唐辛子の辛味成分であるカプサイシンにより活性化されて陽イオンが流入され、膜電圧を形成して刺激が神経系に伝えられる膜タンパク質である。前記TRPV1は幾多の経路を介し活性が調節され、PKA、PKC、Ca²⁺/カルモジュリン依存症タンパク質キナーゼ（CaMK）及びSrcキナーゼを含むリン酸化／脱リン酸化によって活性が調節される。さらに、TRPV1の活性は、転写後の調節システムによって調節される。このようなTRPV1の調節プロセスにはタンパク質-タンパク質の相互作用を含むが、TRPV1と相互作用するタンパク質は極めて少数のものだけが知られている。

【0011】

本発明の好適例において、本発明者らは、TRPV1を標的とする疾患に適用可能なTRPV1活性抑制剤を調べるため研究した結果、配列番号1から8で示される新規なペプチドを特定した。これらの前記ペプチドは、TRPV1タンパク質のリン酸化アミノ酸を基盤とするペプチド配列、またはTRPV1活性によって誘発される細胞内Ca²⁺流入に影響を及ぼすCaMK活性部位を抑制することができるペプチドである。TRPV1活性を効果的に抑制することが確認されたので、前記新規のペプチドを本発明においては、TRPV1活性抑制剤として有用に用いることができる。

【0012】

さらに、本発明は、前記配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含有する皮膚老化防止またはしわ改善用の化粧料組成物を提供する。

【0013】

前記皮膚老化の防止は、光老化または自然老化による皮膚老化の抑制作用を意味するが、前記皮膚老化は特にUV露出による光老化であることが好ましい。

【0014】

本発明の好適例において、前記皮膚しわは光老化または自然老化によるものであってもよく、光老化によるものがより好ましく、UV露出による光老化であることがさらに好ましいが、これに限定されない。前記皮膚老化及びしわは、TRPV1活性を基盤とするのが好ましいが、これに限定されない。

【0015】

前記ペプチドは、化粧料組成物中に0.001から20mMの濃度で含有されるのが好ましく、0.01から10mMの濃度で含有されるのがさらに好ましいが、これに限定されない。前記ペプチドの濃度が0.001mM未満であると、TRPV1抑制及びこれを通じた抗老化及び皮膚しわの改善効果を得ることができず、20mMを超過すれば、含有量の増加に伴う明らかな効果の増大を呈しないので、生産経済性が低下する。

【0016】

本発明に係るペプチドは、一般的な化学合成、例えば、固相ペプチド合成技術（solid-phase peptide synthesis）によって製造することができ、または、前記ペプチドをコードする核酸を含有する組換えベクターにより微生物を形質転換し、培養した該微生物中に発現したペプチドを、通常の方法で回収し精製して製造することもできるが、これらに限定されない。

【0017】

本発明に係る化粧料組成物は、前記ペプチド以外に、本発明が目的とする効果を害させない範囲内で、化粧料に通常使用される任意の一般的な原料を含むことができ、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料等のような通常の補助剤、または担体である。

【0018】

本発明に係る化粧料組成物は、その剤形において特に限定されず、当業界で通常製造される如何なる剤形に製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどに剤形化されることができる。特に、化粧水、エッセンス、ローション、クリーム、パック、ゲル、軟膏、パッチまたはスプレーの剤形に製造されてもよい。

【0019】

前記化粧料組成物の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合には、適切な担体を動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク及び酸化亜鉛からなる群より選ぶことができる。また化粧料組成物がパウダーまたはスプレーの場合は、担体をラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート及びポリアミドパウダーから成る群より選ぶことができ、特にスプレーの場合は、更にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような高圧ガス剤を含むことができる。

【0020】

化粧料組成物が、溶液または乳濁液の剤形の場合は、適切な担体を溶媒、溶解化剤及び乳濁化剤から成る群より選ぶことができ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3-ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

【0021】

化粧料組成物が懸濁液の剤形の場合は、適切な担体を水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガントから成る群より選ぶことができる。化粧料組成物が界面−活性剤含有クレンジングの剤形の場合は、適切な担体を脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体及びエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルから成る群より選ぶことができる。

【0022】

一般に、UV露出後、TRPV1の発現及び活性が増加し、従ってこれにより細胞内Ca²⁺の流入を誘導することが知られており、CaMKもCa²⁺の流入に影響を及ぼす。皮膚老化は、MMP-1、ECM形成関連の基質タンパク質及びUV露出により引起こされる他のサイトカインの増加によって増大する。

【0023】

前記TRPV1は皮膚増殖及び分化の調節に関与し、培養されたヒト角質細胞において、TRPV1が媒介されたカルシウムの流入が、細胞の増殖を抑制し細胞のアポトーシス（死滅）を誘導する。さらに、カプサイシンまたは熱によるTRPV1の活性化は、ヒトの皮膚で表皮の透過障壁の形成を変化させるものと知られている。

【0024】

本発明に係る好適例において、本発明者らは、TRPV1の活性を抑制する新しい抑制剤を開発するために研究した結果、新規なRPV1抑制ペプチド（ペプチド1：QRRPSLKSL、ペプチド2：QRAITILDT、ペプチド3：RRPSL、ペプチド4：RAITI、ペプチド5：MHRQETVDC、ペプチド6：LKKFNARRKL、ペプチド7：RQETV及びペプチド8：KFNAR）を確立し、前記ペプチドによる皮膚老化の抑制及びしわ改善の効果を明確にした。

【0025】

本発明の好適例によれば、ヒト角質細胞株であるHaCaT細胞に前記ペプチドを処理した結果、UV露出によって誘導されるMMP-1の発現が減少した（図1a及び図1bを参照）。更に、IL-1β、IL-6、IL-8及びTNF-αのような炎症誘発性（pro-inflammatory）サイトカインの発現が抑制された（図2aから図2hを参照）。従って、本発明に係るペプチドはUV照射によって増加した細胞内現象を抑制することが明らかとなった。さらに、TRPV1の活性化誘導剤であるカプサイシンのみで処理したコントロールと異なり、カプサイシンで処理した後に本発明のペプチドで処理した実験群は、カプサイシンによる細胞内Ca²⁺の流入を該ペプチドにより抑制する（図3を参照）。

【0026】

さらに、本発明のTRPV1抑制ペプチドの生体（インビボ）内効果を確認するため、無毛マウスの皮膚にUVを照射し、前記ペプチドの処理をした（図4を参照）。その結果、前記ペプチドは、UV露出量に依存して増加した皮膚の厚さを減少させ（図5及び図9を参照）、MMP-13及びMMP-9の発現を減少させ（図6及び図7を参照）、コラーゲンの前駆物質であるプロコラーゲンの発現を増加させた（図8を参照）。さらに、UV露出によって誘導された細胞のアポトーシスを抑制した（図10を参照）。したがって、本発明の新規なペプチドは、皮膚老化に関与するTRPV1の活性を抑制することによりUV露出後に誘導される皮膚老化現象を抑制し、MMPの発現及び活性を抑制させてプロコラーゲンの発現を向上させる効果があり、皮膚しわ及び弾力改善に寄与することができることが明らかとなった。従って、本発明の前記ペプチドは、皮膚老化の防止及びしわの改善のための化粧料組成物の有効成分として有用に用いることができる。

【0027】

さらに、本発明は配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含有する皮膚老化防止またはしわ改善用の薬学的組成物を提供する。

【0028】

本発明の好適例によれば、前記皮膚老化は、光老化または自然老化であってもよく、光老化であることがさらに好ましく、前記光老化はUV露出によるものが最も好ましいが、これに限定されない。

【0029】

前記薬学的組成物に含有される前記ペプチドの濃度は0.001〜20mMであることが好ましく、0.01〜10mMであることがさらに好ましいが、これに限定されない。前記ペプチドの濃度が0.001mM未満であると、皮膚老化の防止またはしわ改善の効果を得ることができず、20mMを超えても、必要以上のペプチドが用いられ、過剰なペプチドは損失されているだけである。

【0030】

本発明に係るTRPV1抑制ペプチドを投与すれば、ヒト角質細胞及び生体（インビボ）内でUV露出によって誘導されるMMP及び炎症誘発性サイトカインの発現を抑制し、皮膚の厚さ及び細胞のアポトーシスを減少させ、UV露出により減少したプロコラーゲンの発現を増加させるので、皮膚老化防止またはしわ改善用の薬学的組成物の有効成分として有用に用いることができる。

【0031】

さらに、本発明は、配列番号1から配列番号8で記載されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含有する皮膚美白用薬学的組成物を提供する。

【0032】

前記薬学的組成物に含有される前記ペプチドの濃度は0.001〜20mMであることが好ましく、0.01〜10mMであることがさらに好ましいが、これに限定されない。前記ペプチドの濃度が0.001mM未満であれば、皮膚美白の効果を十分得ることができず、20mMを超えても、使用するペプチドの量に応じて皮膚美白の効果が上昇しない傾向があるので経済的でない。

【0033】

本発明の好適例において、本発明に係るTRPV1抑制ペプチドは、ヒト角質細胞及び生体（インビボ）内でUV露出によって誘導されるMMPの発現を抑制し、皮膚の厚さ及び細胞の死滅を減少させ、プロコラーゲンの発現を増加させる。TRPV1抑制ペプチドは、このような角質細胞の増殖及び再生作用を介し、UV露出による皮膚のくすみ及び皮膚美白の活性に効果を奏するので、皮膚美白用薬学的組成物の有効成分として有用に用いることができる。

【0034】

さらに、本発明は、配列番号1から配列番号8で記載されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドを有効成分として含有する炎症、かゆみ症、または痛み改善用薬学的組成物を提供する。

【0035】

本発明の前記薬学的組成物に含有される前記ペプチドの濃度は0.001〜20mMであることが好ましく、0.01〜10mMであることがさらに好ましいが、これに限定されない。

【0036】

前記炎症、かゆみ症及び痛みは、UV露出による刺激によって発生したものであり得るが、これに限定されない。

【0037】

本発明の好適例において、本発明のTRPV1抑制ペプチドの抗炎症活性を確認するため、ヒト角質細胞及び生体内でUV露出によって誘導される炎症誘発性サイトカインに対するTRPV1抑制ペプチドの抑制効果を調べた結果、炎症誘発性サイトカインであるIL-1β、IL-6、IL-8及びTNF-α等の発現量が著しく減少した（図2aから図2hを参照）。さらに、前記TRPV1は、多様な疾患及び損傷状態で炎症を誘発することが報告された。具体的には、TRVP1はヒト表皮及び毛嚢由来の角質細胞でカプサイシンによって活性が誘導され、炎症誘発性サイトカインの分泌を促進され、TRPV1と炎症とが関連性あることである。さらに、TRPV1ノックアウトマウスでは、熱に対するしきい値が増加し、関節炎で減少した組織腫脹が観察された（Pharmacology and Therapeutics 2010;125:181.95、Science 2000;288:306.13、Arthritis and Rheumatism 2005;52:3248.56を参照）。

【0038】

それだけでなく、以前の研究等でTRPV1が痛みの伝達経路で重要な役割を果たすことが確認された。すなわち、TRPV1が痛み媒介体によって活性化されると、陽イオンチャンネルのTRPV1を介し陽イオンが流入され、これに伴う活動電位によって中枢神経系（CNS）へ痛みが伝えられる。したがって、TRPV1は既に鎮痛及び消炎剤の開発に重要な標的分子として研究されている（Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society、2011年、pp.3096-3102を参照）。

【0039】

さらに、TRPV1は皮膚のかゆみ症の発生に係っており、これはTRPV1を発現する感覚求心性ニューロンのかゆみ−特異小群集（subpopulation）を介して発生するものとである（J. Clin. Invest. 116、11741186、2006、Biochim. Biophys. Acta 1772、10041021、2007）。TRPV1はニューロン細胞のみならずヒトの皮膚でも発現され、特に結節性痒疹を病んでいる患者の上皮角質細胞でその発現が増加するものである。

【0040】

したがって、本発明に係るTRPV1抑制ペプチドは、TRPV1活性を抑制することにより、TRPV1の活性増加により誘導される炎症、かゆみ症または痛みを改善することができるので、炎症、かゆみ症または痛み薬学的組成物の有効成分として有用に用いることができる。

【0041】

本発明に係る薬学的組成物の投与経路は経口又は非経口とすることができ、特に、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸投与が含まれるが、これに限定されない。前記「非経口」には、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、病巣内注射または注入技術が含まれる。

【0042】

本発明に係る組成物は、TRPV1抑制ペプチドに加えて、更に、同一または類似の機能を示す有効成分を1種以上含有することができる。本発明の前記組成物は、それぞれ通常の方法に従い散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液等の形態に剤形化して用いられることができる。

【0043】

経口投与のための固形製剤には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、丸薬などが含まれる。経口のための液状製剤には、懸濁液剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、一般に用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、それぞれ通常の方法に従い散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、滅菌された水溶液、液剤、非水性溶剤、懸濁液剤、エマルジョン、シロップ、坐剤、エアロゾルなどの外用剤及び滅菌注射製剤の形態に剤形化して用いられることができ、好ましくはクリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはパップ剤の皮膚外用薬学的組成物を調製して用いることができるが、これに限定されるものではない。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。

【0044】

前記組成物は、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、滲透圧調節のための塩及び/または緩衝剤などの補助剤、及びその他治療的に有用な物質を更に含有することができ、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法に従い剤形化することができる。

【0045】

本発明に係る薬学的組成物は、個体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、投与時間、投与経路、排出率、薬物並合及び特定疾患の重症度を含む幾多の要因に従い多様に変わり得る。

【0046】

本発明に係る前記ペプチドを有効成分として含有する薬学的組成物を単位容量形態に剤形化する場合、該組成物中に、有効成分として本発明のペプチドを約0.01〜1,500mgの単位容量で含有することが好ましく、大人の治療に必要な投与量は投与の頻度と強度に応じて、一日に約1〜500mgの範囲が一般的であるが、これに限定されない。大人に対して筋肉内または静脈内投与するとき、一日に大体約5〜300mgの全体投与量が好ましいが、一部の患者に対しては、さらに高い一日投与量が好ましいことがある。

【0047】

本発明に係る組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法等と併用して用いることができる。

【0048】

さらに、本発明は、配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドの薬学的に有効な量を処理または投与するステップを含む皮膚老化防止またはしわ改善の方法を提供する。

【0049】

さらに、本発明は、配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドの薬学的に有効な量を処理または投与するステップを含む皮膚美白方法を提供する。

【0050】

さらに、本発明は、配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドの薬学的に有効な量を処理または投与するステップを含む炎症、かゆみ症、または痛み改善の方法を提供する。

【0051】

ここで、前記薬学的に有効な量とは0.0001〜100mg/kgであり、好ましくは0.001〜10mg/kgであるが、これに制限されるものではない。処理または投与量は、特定の患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間、投与方法、排出率、疾患の重症度などに従い調節されることができる。処理または投与は、一日に一回投与でもよく、数回に分けて実施することもできる。

【0052】

本発明を適用する対象個体は脊椎動物で、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは鼠、兎、ギニーピッグ、ハムスター、犬、猫のような実験動物であり、最も好ましくはチンパンジー、ゴリラのような類人猿類動物である。

【0053】

前記処理または投与方法は、塗布、経口または非経口投与することができ、非経口投与時、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射または胸部内注射によって投与されることができる。

【0054】

前記炎症は、好ましくは、皮膚炎、アレルギー、アトピー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔疾、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛（fibromyalgia）、乾癬関節炎、骨関節炎、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、多発性硬化症、及び急性及び慢性炎症疾患からなる群より選択されるいずれか一つであるが、これらに限定されるものではない。

【0055】

したがって、本発明に係るTRPV1抑制ペプチドは、TRPV1の活性を効果的に抑制するので、TRPV1の活性化により誘導される疾患で、皮膚老化、しわ、美白、並びに炎症、かゆみ症及び痛みの緩和及び改善のため有用に用いることができる。

【0056】

さらに、本発明は
1）TRPV1タンパク質に被検物質を処理するステップと、
2）前記被検物質で処理された実験群のTRPV1タンパク質の活性と、前記被検物質で処理されていない対照群のTRPV1タンパク質との活性を測定することにより、TRPV1タンパク質の活性を減少させる被検物質を選別するステップとを含む、
皮膚老化防止またはしわ改善用候補物質のスクリーニング方法を提供する。

【0057】

併せて、本発明は、本発明の配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つ以上のペプチドを利用したスクリーニング方法を提供する。

【0058】

具体的には、次のステップ：
1）TRPV1を暗号化するポリヌクレオチドを含むプラスミドで宿主細胞を形質転換した形質転換体を製造するステップと、
2）前記形質転換体を、TRPV1特異的活性剤とTRPV1活性抑制剤候補物質とで処理し（実験群）また前記形質転換体を前記TRPV1特異的活性剤と、配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つのペプチドとで処理する（対照群）ステップと、
3）ステップ2）の実験群と対照群のTRPV1イオンチャンネルの活性をそれぞれ測定するステップと、
4）ステップ 3）のそれぞれの測定値を比べ、対照群より低いか同等のTRPV1イオンチャンネルの活性を示すTRPV1活性抑制剤候補物質を選別するステップとを含む、
TRPV1活性抑制剤のスクリーニング方法を提供する。

【0059】

本発明は、さらに他のスクリーニング方法として、次のステップ：
1）TRPV1を暗号化するポリヌクレオチドを含むプラスミドで宿主細胞を形質転換した形質転換体を製造するステップと、
2）前記形質転換体を、TRPV1特異的活性剤と被検物質とで処理し（実験群）、また該形質転換体を前記TRPV1特異的活性剤と、配列番号1から配列番号8で示されるペプチドからなる群より選択されるいずれか一つのペプチドとで処理する（対照群）ステップと、
3）ステップ2）の実験群と対照群のTRPV1イオンチャンネルの活性をそれぞれ測定するステップと、
4）ステップ 3）のそれぞれの測定値を比べ、対照群より低いか同等のTRPV1イオンチャンネルの活性を表す被検物質を選別するステップとを含む、
皮膚老化防止またはしわ改善用候補物質のスクリーニング方法を提供する。

【0060】

本発明の好適例において、ステップ1）の宿主細胞は、ヒト角質細胞株であってもよく、HaCaT細胞株であることがより好ましいが、これに限定されず、イオンチャンネル活性及び抑制剤のハイスリープットスクリーリングの観察（スタディー）に利用することができる細胞株であれば全て利用可能である。

【0061】

前記方法において、ステップ2）のTRPV1特異的活性剤は、UVまたはカプサイシンであることが好ましく、本発明に係る配列番号1から配列番号8で示されるTRPV1抑制ペプチドは0.001〜20mMの濃度で処理されることが好ましく、0.01〜10mMで処理するのがさらに好ましいが、これに限定されない。

【0062】

前記ステップ2）の候補物質は、天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、ポリペプチド、酵素、タンパク質、リガンド、抗体、抗原、バクテリアまたは真菌の代謝産物または生活性分子であることができる。

【0063】

前記ステップ3）のTRPV1イオンチャンネル活性の測定は、カルシウムイメージングによって行われることができ、これに限定されず、TRPV1の活性を確認することができる方法であれば全て使用可能である。

【0064】

本発明に係る配列番号1から配列番号8で示されるペプチドは、TRPV1活性剤として知られたUVまたはカプサイシンによって増加したTRPV1活性を抑制し、動物モデルでTRPV1活性により引起こされる皮膚老化及び皮膚しわの改善効果を有するので、TRPV1活性に対する配列番号1から配列番号8で示されるペプチドの抑制効果と比べ、これと類似するかさらに高い抑制効果を有するTRPV1活性抑制剤及び被検物質を選別することにより、TRPV1によって媒介される皮膚老化またはしわ防止剤の候補物質をスクリーニングすることができる。

【発明の効果】

【0065】

本発明は、皮膚老化防止及びしわ改善の効果がある新規なペプチドを開発したものであって、前記ペプチドは、ヒト角質細胞及び生体内（インビボ）でUV露出によって誘導されるMMP及び炎症誘発性サイトカインの発現を抑制し、皮膚の厚さ及び細胞のアポトーシスを減少させ、UV露出により減少したプロコラーゲンの発現を増加させるので、皮膚老化による皮膚しわ及び弾力を改善し、抗老化効能のある組成物の効能物質として極めて有効である。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1a】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導されたMMP-1の発現量の変化を示す図である。

【図1b】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導されたMMP-1の発現量の変化を示す図である。

【図2a】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図2b】RPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図2c】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図2d】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図2e】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図2f】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図2g】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図2h】TRPV1抑制ペプチドによるUVによって誘導された炎症誘発性サイトカイン発現量の変化を示す図である。

【図3】TRPV1抑制ペプチドによるカプサイシンによって誘導されたCa²⁺流入の変化を示す図である。

【図4】無毛マウスの皮膚に対するTRPV1抑制ペプチドの処理方法を示す図である。

【図5】TRPV1抑制ペプチドによる無毛マウスの皮膚のUVによって増加した皮膚厚さの変化を示す図である。

【図6】TRPV1抑制ペプチドによる無毛マウスの皮膚のUVによって誘導されたMMP-13の発現量の変化を示す図である。

【図7】TRPV1抑制ペプチドによる無毛マウスの皮膚のUVによって誘導されたMMP-13及びMMP-9遺伝子の発現量の変化を示す図である。

【図8】TRPV1抑制ペプチドによる無毛マウスの皮膚のUVによって減少したプロコラーゲン遺伝子の発現量の変化を示す図である。

【図9】TRPV1抑制ペプチドによる無毛マウスの皮膚のUVによって増加した細胞厚さの変化を示す図である。

【図10】TRPV1抑制ペプチドによる無毛マウスの皮膚のUVによって増加した細胞死滅（アポトーシス）の変化を示す図である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0067】

以下、本発明を実施例により詳しく説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の内容が下記実施例により限定されるものではない。

【0068】

＜実施例1＞新規なTRPV1抑制ペプチドの調製
新規なTRPV1抑制ペプチドの配列を合成し[peptron（www.peptron.com）]、各ペプチドの分子量に応じて濃度を計算し、1M濃度でキャリア（エタノール：ポリエチレングリコル（PEG）＝3:7）に溶解させた。

【0069】

その結果、新規なペプチド1：QRRPSLKSL（配列番号1）、ペプチド2：QRAITILDT（配列番号2）、ペプチド3：RRPSL（配列番号3）、ペプチド4：RAITI（配列番号4）、ペプチド5：MHRQETVDC（配列番号5）、ペプチド6：LKKFNARRKL（配列番号6）、ペプチド7：RQETV（配列番号7）及びペプチド8：KFNAR（配列番号8）を収得した。

【0070】

＜実施例2＞ヒト角質細胞の培養及びペプチド処理
＜2-1＞ヒト角質細胞株の培養
不滅化されたヒト角質細胞株であるHaCaTを、グルタミン2mM、ペニシリン400U/ml、ストレプトマイシン50mg/ml及び10%FBSが添加されたDMEM（Dulbecco's modified Eagle's media）培地に、5%CO₂が含まれる37℃の湿潤雰囲気中で培養した。ペプチドの処理のため、前記細胞は80%コンフルエンスに培養し、その後、FBSの添加がない培地で24時間の間維持した。培養完了後、該細胞をリン酸塩緩衝食塩水（PBS）で洗浄したあと、前記＜実施例1＞で調製した各ペプチドで処理した。

【0071】

＜2-2＞UV照射
ウエスタンブロット、リアルタイムRT-PCR実験において、前記実施例＜2-1＞と同様に、それぞれのペプチドでHaCaT細胞を処理したあと、30分後前記HaCaT細胞は275〜380nm範囲の放射スペクトル（ピーク、310〜315nm）でPhilips TL 20W/12 RSの蛍光太陽光を用いて照射された。UVCを遮断するため＜290nmの波長を有するコダセルフィルター（Kodacel filter）（TA401/407；Kodak）を用い、UV強度はワルドマン（Waldmann）UVメーターを用いて測定した。UV照射後、細胞の培養培地はFBSが添加されていない新鮮な培地に取り替えられ、追加的にさらに培養されたあと、前記＜実施例1＞で調整した各ペプチドを培地に添加した。

【0072】

＜実施例3＞TRPV1抑制ペプチドのUVによって誘導されたMMP-1及び炎症誘発性サイトカイン発現抑制活性の確認
＜3-1＞ウエスタンブロットを通じたMMP-1タンパク質発現量の確認
前記UVが照射された細胞の培養培地内に分泌したMMP-1タンパク質の量を測定するため、同一の個数の細胞から収得した同量の培養培地を10% SDS-PAGEにより分離し、ハイボンド（Hybond）ECLメンブラン（Amersham Biosciences、Buckinghamshire、England）に移したあと、MMP-1に対する兎モノクローナル抗体（Lab Frontier）を用いて、増進された化学発光計（Amersham Biosciences）によりウエスタンブロッティング分析を行った。信号の強度は濃度計プログラム（TINA；Raytest Isotopenme b gerate、Straubenhardt、ドイツ）を用いて定量化した。

【0073】

その結果、UV照射群はUV無照射群に比べてMMP-1タンパク質の発現量が増加することが示された。UV照射及びペプチド処理群では、ペプチドの量に依存して、UVによって誘導されるMMP-1タンパク質の発現量が著しく減少することが示された（図1a及び図1b）。

【0074】

＜3-2＞qRT-PCRを通じたMMP-1遺伝子の発現量の確認
MMP-1に対するmRNAの発現量を確認するため、製造社のプロトコルに従い、Trizol（Life Technologies、Rockville、MD）試薬を用いてHaCaT細胞からRNA総量を抽出した。単離されたRNAを、定量及び定性分析のため1%のアガロースゲルに電気泳動した。1μgのRNA総量を用いて20μlの反応容積にしたあと、RT-PCRのための第１鎖cDNA合成キット（first-strand cDNA synthesis kit）（MBI Fermentas、Vilnius、リトアニア）を用いて、製造社の指様に従い第1鎖cDNAを合成した。その後、MMP-1に対するmRNA発現の定量のため、1μlの第1鎖cDNA産物及びSYBRプレミックス（Premix）Ex TaqTM（タカラバイオ（株）、滋賀、日本）を用いて7500リアルタイム PCRシステム（Applied Biosystems、Foster City、CA）上でPCRを行った。この実験法は、下流工程なく直ちにRT-PCR産物を検出することができ、内生的対照群として用いられた36B4遺伝子に特異的なプローブとともに、各因子に対し特異的な染料標識されたDNAプローブの蛍光の増加をモニタリングすることにより遂行可能であった。このとき、次の表1のプライマーを用い、50℃で2分、95℃で2分、引続き40サイクルの95℃で15秒及び60℃で1分の条件下でPCRを実施した。データは、2-DDCT法を用いて分析し、36B4遺伝子の発現量に標準化して遺伝子発現倍数として表し、前記36B4遺伝子の強度に標準化したあと、UV照射群または対照群に比べて増加または減少した割合を算出した。各実験は3回実施し、それぞれ少なくとも3回繰り返した。

【0075】

【表1】

【0076】

その結果、前記実施例＜3-1＞の結果と同様に、UV照射群はUV無照射群に比べMMP-1遺伝子の発現量が著しく増加することが示され、それぞれのUV照射及びペプチド処理群では、ペプチドの処理量に依存してMMP-1遺伝子の発現量が減少することが示された（図1a及び図1b）。したがって、本発明に係るTRPV1抑制ペプチッドは、UV刺激によるMMP-1の発現を減少させる作用をすることが明らかとなった。

【0077】

＜3-3＞炎症誘発性サイトカインの発現量の確認
UVが照射された細胞に対するTRPV1抑制タンパク質のサイトカイン発現量の変化を確認するため、前記実施例＜3-1＞の方法に従い、それぞれのTRPV1抑制ペプチドで処理したHaCaT細胞中のIL-1β、IL-6、IL-8及びTNF-αタンパク質の発現量を測定した。

【0078】

その結果、本発明のTRPV1抑制タンパク質はUV露出によって増加した前記サイトカインの発現量を減少させるものと表れた（図2aから図2h）。

【0079】

＜実施例4＞TRPV1抑制ペプチドのカプサイシンによって誘導されたCa²⁺流入抑制活性の確認
HaCaT細胞をカバーガラス上で培養したあと、4mM Fluo-4 AM（分子プローブ）が添加された無血清培地で常温で45分間培養した。培養後、無血清培地で3回洗浄したあと、カバーガラス上にある細胞を、特注製の観察チャンバーに移して20分間放置した。その後、TRPV1の活性を誘導するため、該細胞をカプサイシンのみ又はカプサイシンと本発明に係るペプチドを用いて、Tyrode'sバッファ（140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl₂、2mM CaCl₂、10mM グルコース、及び10mM HEPES [pH 7.2]）中に最終濃度10mMで準備し、3分間処理した。蛍光の強度はSCAN Ware 5.10ソフトウェア（Zeiss）で調節される適宜なフィルター及びPL Fluotarオブジェクティブ（200、0.5NA）が取り付けられた共焦点レーザースキャニング顕微鏡（confocal laserscanning microscope）（LSM 510 META、Zeiss）を用いて測定した。実験は、37℃の湿潤なチャンバー内で実施した。Ca²⁺の測定を20分間続け、1または4秒ごとに映像を撮影した。

【0080】

その結果、TRPV1抑制ペプチド処理群は、カプサイシンのみで処理したペプチド無処理群に比べてCa²⁺の強度が著しく低いものとなった。したがって、本発明に係るTRPV1抑制ペプチドは、角質細胞内へのCa²⁺の流入を抑制することが明らかとなった（図3）。

【0081】

＜実施例5＞マウスに対するUV照射及びペプチド処理
＜5-1＞マウス飼育及びUV照射
TRPV1抑制ペプチドの生体内皮膚老化抑制活性をインビボで確認するため、6週齢の雌アルビノマウス（Skh-1）を実験前の1週間順化させ、飼料及び水を自由に摂取させた。全ての実験プロトコルは、ソウル大学校の動物運営委員会の承認下で実施した。マウスへのUV照射のため、275〜380nm（310〜315nmでピーク）の放射スペクトルを有するF75/85W/UV21の蛍光太陽灯をUV照射源として用いた。290nm以下の波長を取り除くため、コダセル（Kodacel）フィルター（TA401/407；Kodak、Rochester、NY）をUVチューブの前方に設置した。皮膚表面における照射の強度はUVメーター（モデル585100；Waldmann Co.、Villingen-Schwenningen、ドイツ）を用いて測定し、光源から30cmである個所の照射強度を1.0mW/cm²にした。マウスの背部皮膚上で最初に測定された最小紅斑量（minimal erythema dose；MED）を、24時間後に鋭い境界を有する紅斑の形成に必要な照射最小量に決めた。UVを2MEDで（1MED＝100mJ/cm²）毛のない前記Skh-1マウスの背部に照射した。

【0082】

＜5-2＞マウスに対するTRPV1抑制ペプチドの処理
前記Skh-1マウスを次のような6グループに分けた：（1）UV無処理及び媒体処理（Vehicle-treated）群、（2）UV無処理及び1mMペプチド処理群、（3）UV照射及び媒体処理群、（4）UV照射及び0.01mMペプチド処理群、（5）0.1mMペプチド処理群、（6）UV照射及び1mMペプチド処理群。媒体（Vehicle）は、エタノール（30%）及びポリエチレングリコール（70%）からなる。媒体及びペプチドをUV照射後0及び24時間後マウスの背部皮膚表面に適用した。その後、前記マウスをUV照射後48時間後に殺生して皮膚標本を組織生検した（図4）。

【0083】

＜実施例6＞TRPV1抑制ペプチドによる皮膚厚さ減少の確認
前記実施例＜5-2＞のUV照射前の24時間及び照射後の48時間後にキャリパー（PEACOCK、尾崎製作所（Ozaki MFG Co.Ltd.）、東京、日本）を用いて皮下脂肪の厚さを測定した。具体的に、首部位と尻尾の下の部分で中心線皮膚を上方に取り、皮下脂肪の厚さを首及び尻の間の中間で測定した。

【0084】

その結果、UVを照射することにより皮下脂肪の厚さが急激に増加し、1mMのTRPV1抑制ペプチドで処理した結果、皮下脂肪の厚さが減少した。（図5）。

【0085】

＜実施例7＞生体内（インビボ）でのTRPV1抑制ペプチドのUVによって誘導されたMMP発現抑制活性の確認
＜7-1＞ウエスタンブロットを通じたMMP-13タンパク質発現量の確認
前記実施例＜5-2＞のマウス皮膚組織を、新鮮なプロテアーゼ抑制剤カクテル（Roche、Indianapolis、IN）が添加された冷たい溶解バッファー[50mM Tris-HCl、pH 7.4、150mM NaCl、2mMエチレンジアミンテトラ酢酸（ethylenediamine tetraacetic acid；EDTA）、5mMフェニルメタンスルホニルフルオリド（phenylmethanesulfonyl fluoride；PMSF）、及び1mMジチオスレイトール（dithiothreitol；DTT）、1% Triton X-100]中で均質化した。その後、均質化液を4℃で30分間15,000gで遠心分離して上澄液を収得したあと、これを-70℃で保管した。溶解物に含まれるタンパク質の含量はブラッドフォード（Bradford）分析を介し測定した。同量のタンパク質を8から16%のトリス-グリシンSDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に電気泳動法で移した。引続き、ブロットをブロッキングバッファーで室温で1時間の間ブロッキングしたあと、モノクローナル抗-MMP-13抗体（Neomarkers、Fremont、CA）で培養した。対照群として、β-アクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA）を用いて同様の細胞溶解物でβ-アクチン量（レベル）を測定した。信号の強度は、濃度計プログラムを用いて定量化した。

【0086】

その結果、UV照射群はUV無照射群に比べてMMP-13タンパク質の発現量が増加するものとなり、UV照射及びペプチド処理群では、ペプチドの処理量に依存して、MMP-13タンパク質の発現量が著しく減少するものとなった（図6）。

【0087】

＜7-2＞qRT-PCRを通じたMMP及びプロコラーゲン遺伝子の発現量の確認
前記実施例＜3-2＞で実施した方法に従い、前記実施例＜5-2＞のマウス皮膚組織からRNA総量を分離してcDNAを合成した。MMPに対するmRNA発現の定量のため、SYBR Premix Ex TaqTM（タカラバイオ（株）、滋賀、日本）を用いて7500リアルタイム PCRシステム（Applied Biosystems、Foster City、CA）上でPCRを行った。このとき、下記表2のプライマーを用い、50℃で2分、95℃で2分、引続き40サイクルの95℃で15秒及び60℃で1分の条件下でPCRを実施した。データは、2-DDCT法を用いて分析し、37B4遺伝子の発現量に標準化して遺伝子発現倍数として表し、前記37B4遺伝子の強度に標準化したあと、UV照射群または対照群に比べて増加または減少した割合を算出した。各実験は3回実施し、それぞれ少なくとも3回繰り返した。

【0088】

【表2】

【0089】

その結果、TRPV1抑制ペプチドは、UV照射によって増加したMMP-13及びMMP-9遺伝子の発現を著しく減少させるものとなった（図7）。さらに、UV照射によって減少したプロコラーゲン遺伝子の発現が、TRPV1抑制ペプチド処理によって有意義に増加することを確認した（図8）。

【0090】

＜実施例8＞TRPV1抑制ペプチドのUVによって増加した皮膚厚さ減少活性の確認
TRPV1抑制ペプチドによる皮膚厚さの変化を測定するため、前記実施例＜5-2＞のマウスの皮膚組織を対象にヘマトキシリン及びエオシン（Hematoxylin and eosin；H&E）染色を実施した。具体的には、マウス皮膚組織を10%緩衝ホルマリンに24時間の間固定させたあと、パラフィンに包埋した。連続的なセクション（4μm）をシランコーティングされたスライドにマウンティングし、従来の一般的な方法に従い核染色のためヘマトキシリン溶液で染色し、細胞質染色のためエオシン溶液で染色した。その後、イメージ分析プログラム（BMI plus software、BumMi Universe Co.、Kyungki、韓国）を用いて上皮の厚さを測定した。

【0091】

その結果、マウス皮膚組織はUV照射によって上皮の厚さが増加するものとなり、UV照射及びペプチド処理群において、ペプチドで処理することでUVにより増加した上皮の厚さが減少したものとなった（図9）。

【0092】

＜実施例9＞TRPV1抑制ペプチドのUVによって誘導された細胞死滅（アポトーシス）抑制活性の確認
TRPV1抑制ペプチドのUVによるアポトーシスの抑制効果を確認するため、マウス皮膚組織に対しTUNEL染色を実施した。具体的に、マウス皮膚組織を10%緩衝ホルマリンに24時間の間固定させたあと、パラフィンに包埋した。連続的なセクション（4μm）をシランコーティングされたスライドにマウンティングし、ApopTagPlus Peroxidase In Situアポトーシスキットを利用して一般的なTUNEL染色方法[http://www.millipore.com/userguides.nsf/a73664f9f981af8c852569b9005b4eee/c60bd329d558cd0e852577d80069e1d0/$FILE/S7101MAN.pdf（Millipore^TM）参照]に従い細胞の死滅を確認した。

【0093】

その結果、UV露出によって皮膚組織の細胞アポトーシスが増加し、前記ペプチドは増加した細胞アポトーシスを抑制する効果があった（図10）。

【0094】

＜製造例1＞化粧料の調製
＜1-1＞化粧水（toner）の調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチドを有効成分として含有する化粧水を、下記表3の組成で調製した。

【0095】

【表3】

【0096】

＜1-2＞栄養クリームの調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチドを有効成分として含有した栄養クリームを、下記表4の組成で調製した。

【0097】

【表4】

【0098】

＜1-3＞ローションの調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチドを有効成分として含有するローションを、下記表5の組成で調製した。

【0099】

【表5】

【0100】

＜製造例2＞薬学的製剤の調製
＜2-1＞散剤の調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチド 2g
乳糖 1g
前記成分を混合し、通常の方法に従って気密袋に充填して散剤を調製した。

【0101】

＜2-2＞錠剤の調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチド 100mg
とうもろこし澱粉 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
前記成分を混合したあと、通常の錠剤の製造方法に従い打錠して錠剤を製造した。

【0102】

＜2-3＞カプセル剤の調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチド 100mg
とうもろこし澱粉 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
前記成分を混合したあと、通常のカプセル剤の製造方法に従いゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

【0103】

＜2-4＞丸薬の調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチド 1g
乳糖 1.5g
グリセリン 1g
キシリトール 0.5g
前記成分を混合したあと、通常の丸薬の製造方法に従い、丸薬１個あたり該混合物が4g含まれるように丸薬を製造した。

【0104】

＜2-5＞顆粒の調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチド 150mg
大豆抽出物 50mg
葡萄糖 200mg
澱粉 600mg
前記成分を混合したあと、30%エタノール100mgを添加して摂氏60℃で乾燥し、顆粒を形成したあと袋に充填した。

【0105】

＜2-6＞注射液剤の調製
本発明に係るTRPV1抑制ペプチド 10μg/ml
薄い塩酸BP pH 3.5になるまで
注射用塩化ナトリウムBP 最大1ml
適切な容積の注射用塩化ナトリウムBP中に本発明に係るTRPV1抑制ペプチドを溶解させ、調製した溶液のpHを薄い塩酸BPを用いてpH 3.5に調節したあと、注射用塩化ナトリウムBPを用いて容積を調節した。該溶液を透明なガラスの5mlタイプIアンプルの中に充填させ、ガラスの口を溶解させることにより封入し、120℃で少なくとも15分以上オートクレーブにより殺菌して注射液剤を調製した。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]