特許 6185907 神経分化のための多能性幹細胞の予備刺激

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6185907

(24)【登録日】2017年8月4日

(45)【発行日】2017年8月23日

(54)【発明の名称】神経分化のための多能性幹細胞の予備刺激

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20170814BHJP

   C12N 5/079 20100101ALI20170814BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12N5/079

【請求項の数】18

【全頁数】47

(21)【出願番号】特願2014-502837(P2014-502837)

(86)(22)【出願日】2012年3月30日

(65)【公表番号】特表2014-510537(P2014-510537A)

(43)【公表日】2014年5月1日

(86)【国際出願番号】US2012031457

(87)【国際公開番号】WO2012135621

(87)【国際公開日】20121004

【審査請求日】2015年3月27日

(31)【優先権主張番号】61/469,527

(32)【優先日】2011年3月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510003830

【氏名又は名称】セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】メイヤー， ネイサン

(72)【発明者】

【氏名】スタンクヴィッツ， ケイシー

(72)【発明者】

【氏名】ラジェシュ， ディーピカ

(72)【発明者】

【氏名】ジョージ， マシュー

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／１２３９０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平０２−５０１５３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０４２６６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１５００３０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０１８３１４０１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１２３３４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−１６２０２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 The Journal of Cell Biology，２００６年，Vol.172, No.1，p.79-90

【文献】 Neuron，２００１年，Vol.30，p.65-78

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト神経細胞について富化された細胞集団を提供するための方法であって、
ａ）ヒト多能性幹細胞の集団を、細胞の多能性を維持する、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培地内で維持するステップと、
ｂ）無血清培養培地内で、支持細胞の不在下で凝集体形成の５日前から５日間〜３日前から３日間にわたってヒト多能性幹細胞の集団を付着性培養において予備刺激するステップであって、該無血清培養培地におけるＴＧＦβおよびｂＦＧＦの濃度が、該ステップａ）における濃度から時間とともに低減する、ステップと、
ｃ）懸濁培養液中でステップｂ）の前記細胞から凝集体を形成するステップであって、前記凝集体が、外部から添加されたＴＧＦβおよびｂＦＧＦを含まない凝集体形成培地内で形成される、凝集体を形成するステップと、
ｄ）前記凝集体をさらに分化させて、少なくとも８５％のヒト神経細胞を含む細胞集団を提供するステップと、
を含む、方法。

【請求項2】

（ｉ）前記ヒト多能性幹細胞が、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ステップｂ）の前記ヒト多能性幹細胞が、非細胞マトリックス成分上で培養され、ならびに／あるいは
（ｉｉｉ）予備刺激するステップｂ）の前記培養培地、凝集体を形成するステップｃ）の前記凝集体形成培地、および／またはさらなる分化のステップｄ）で使用される分化培地が、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８を有する、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｘ）前記外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８が、神経細胞への前記集団の分化に適切であると決定された量であり、および／または
（ｘｘ）神経分化効率を試験して、前記外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の前記適切な量を、前記集団からの細胞の最高神経分化効率と関連付けられた量として決定するステップをさらに含む、
請求項２に記載の方法。

【請求項4】

予備刺激するステップｂ）の前記培養培地、凝集体を形成するステップｃ）の前記凝集体形成培地、および／またはさらなる分化のステップｄ）で使用される分化培地は、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８を有しない、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤が、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤および／またはアクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達阻害剤である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ステップｂ）の前記培養培地が、化学的に定義されている、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ステップｂ）の前記培養培地が、栄養混合物Ｆ−１２を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、Ｂ−２７サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、またはインスリン、トランスフェリン、およびセレニウム（ＩＴＳ）サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記凝集体を形成するステップが、ステップｂ）からの前記細胞を本質的に単一の細胞培養物に解離させることを含む、
請求項１に記載の方法。

【請求項9】

（ｉ）前記形成された凝集体が、平均寸法１０〜４００μｍの直径を有し、および／または
（ｉｉ）前記凝集体が、外部から添加されたミオシンＩＩ阻害剤および／またはＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む、凝集体形成培地において形成され、および／または
（ｉｉｉ）前記懸濁培養液が、５ミリリットル〜２５リットルの体積を有し、および／または
（ｉｖ）前記懸濁培養が、１５ｒｐｍ〜１００ｒｐｍの速度で回転または振とうされる、
請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記細胞集団が、神経細胞を少なくとも９０％含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記細胞集団が、神経細胞を少なくとも９５％含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

神経細胞を富化または単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

神経細胞を含む前記集団を、星状細胞を含む第２の集団にさらに分化するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

神経細胞を含む前記集団が、星状細胞にさらに分化するために血清と接触させられる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

予備刺激するステップｂ）の前記培養培地、凝集体を形成するステップｃ）の前記凝集体形成培地、および／またはさらなる分化のステップｄ）で使用される分化培地が、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８を有しない、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第２の細胞集団が、分化の９０日目前の時点で星状細胞を少なくとも９０％含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記第２の細胞集団が、分化の５０日目前の時点で星状細胞を少なくとも９０％含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

星状細胞を富化または単離するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の背景
本出願は、２０１１年３月３０日に出願された米国特許出願第６１／４６９，５２７号の優先権を主張し、その開示全体が、放棄することなくその全体において参照により本明細書に明確に援用される。

【0002】

本発明は、概して、幹細胞発生の分野に関する。より具体的に、多能性幹細胞からの神経細胞の生成に関する。

【背景技術】

【0003】

多能性幹細胞、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞は、有機体の全ての細胞型を代表する分化した細胞を生成するための潜在的な細胞源である。多能性幹細胞の分化は、自発的または誘導のいずれかで達成され得る。

【0004】

しかしながら、いくつかの障害が、多能性幹細胞から特定の系統細胞の実質的に富化された集団を得るためのパラダイムを開発する妨げとなっている。最新のアプローチは、制御されず、均質集団をもたらさない様式での多能性細胞からの胚様体（すなわち、細胞凝集体）の形成を伴う。混合細胞集団であって、この種の胚様体内のもの等の混合細胞集団は、一般に治療用途または商業用途に適している可能性が低い。霊長類起源の多能性細胞の相対的な脆弱性、それらを培養することの困難度、それらの鋭敏な感度および培養環境内に存在する様々な要因に対する依存、ならびに低効率かつ多様な分化方法に引き続いて付加的問題が起こる。

【0005】

特に、多能性細胞の分化をインビトロで制御して、神経細胞の均質集団を提供することは可能になっていない。加えて、多くの現在の方法は、多能性幹細胞の神経分化を促すために、外来遺伝子の発現に依存している（非特許文献１）。これらの欠点により、神経細胞の本質的に均質な集団をインビトロで形成する能力が制限され、治療応用および商業的応用のためのそれらのさらなる開発を制限している。

【0006】

したがって、特に大規模生成または高効率生成のために、多能性幹細胞の神経分化を向上させる必要がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１８：５０〜５６

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本実施形態は、多能性幹細胞を神経細胞に分化するための方法、特に臨床応用における必要性を満たすように高効率および大規模生成のための方法を提供することにより、当該技術分野における大きな不備を克服する。

【0009】

多能性幹細胞を分化するための手順は、好ましくは、例えば、特定の増殖因子の添加により、特定系統の発生を促すインビボ環境を模倣しようとする培養条件を用いる。インビトロで分化されるときに、１）細胞自体からの内因性発現、２）多能性幹細胞が培養され、および／または後次に分化される血清および／または培地、ならびに３）外因性増殖因子の添加を含む、いくつかの源が増殖因子環境に寄与し得る。

【0010】

明確に定義されていない条件下での幹細胞の培養は、細胞を多能性状態で維持する有効性を阻害し、分化プロトコルの再現性を低減し得る。したがって、多能性細胞は、多能性細胞の分化前に、（例えば、ＴｅＳＲ２またはｍＴｅＳＲ１培地を使用する）定義された培地下、本質的に未分化状態で拡大および維持された。

【0011】

しかしながら、本発明のある特定の態様において、多能性幹細胞が、分化が開始する時まで連続的にＴｅＳＲ等の維持培地上で増殖された場合、ニューロンの収率が著しく変動し得ることがわかった。ＴｅＳＲ培地内の２つの増殖因子、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβが、細胞の分化能に影響するように思われると特定された。多能性幹細胞が「予備刺激」、すなわち、（細胞が依然として付着性培養液中にある間に）凝集体形成の開始前に異なって処理された場合、細胞はその後、さらなる分化時に異なって挙動した。実施例において、ＴｅＳＲ増殖因子の不在下で「予備刺激」された場合、すなわち塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）を有しない任意の培地内で培養された場合、凝集体形成前の数日間に、細胞は驚くべき純度、速度、および一貫性を有する神経系統に発達した。理論に束縛されることを望むものではないが、神経分化はデフォルト系統であってよいが、細胞がデフォルト分化経路を進むことを可能にするために、凝集体形成前に、細胞がデフォルト神経系統の分化を防ぐ（例えば、ＴｅＳＲ培地増殖因子ｂＦＧＦおよびＴＧＦβを回避する）影響を低減する必要があり得る。

【0012】

したがって、本明細書では神経細胞を生成するための方法が提供される。本方法は、例えば、神経分化を低減する外部から添加された増殖因子ｂＦＧＦおよびＴＧＦβを本質的に含まない培地（すなわち、予備刺激培地）内で多能性幹細胞を培養することにより、凝集体形成前に予備刺激ステップを含み得る。この新規の予備刺激ステップは、神経効率を強化し、神経系統細胞を富化するための系統精製の必要性を排除し得る。

【0013】

特定の実施形態において、「分化前」とは、細胞が付着性培養物中に存在する一方で、多能性幹細胞の外観を維持することを意味し得る。分化は、細胞が付着性培養物から凝集体形成に適した条件に移されるとき、またはｂＦＧＦもしくはＴＧＦβを欠失する予備刺激培地内で付着して培養されるときに開始し得る。

【0014】

例えば、予備刺激ステップは、細胞を予備刺激培地へ徐々に移すこと（例えば、予備刺激培地を、時間をかけて添加することにより、培養培地内の増殖因子を減少させること）、または細胞を継代で予備刺激培地に移すことを伴い得る。予備刺激ステップ後に、この方法はさらに、予備刺激された細胞を、神経細胞を含む細胞集団に分化し、それにより神経細胞を生成することを含み得る。

【0015】

この過程は、懸濁培養液中の予備刺激された細胞から凝集体を形成することと、その凝集体を、神経細胞を含む細胞集団にさらに分化することと、を含み得る。この方法はさらに、細胞を、星状細胞を含む第２の集団に分化することを含み得る。星状細胞は、富化または単離され得る。星状細胞の分化は、当該技術分野において適切であることが知られている任意の試薬、例えば、血清または増殖因子等を使用し得る。いくつかの態様において、この方法における星状細胞の分化は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００日前またはその中で導き出せる任意の範囲の時点で、星状細胞を少なくとも約５０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはその中で導き出せる任意の範囲で含む細胞集団を生成し得る。星状細胞分化の方法において、予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化の培養培地は、外部から添加されたＦＧＦ８およびＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤（複数可）の存在下または不在下であり得る。

【0016】

非神経分化を最小限に抑え、神経細胞の純度を増加させるために、培養培地のいずれか、例えば、予備刺激培地、凝集体形成培地、または神経分化培地は本質的に、外部から添加された増殖因子ｂＦＧＦおよびＴＧＦβを含まなくてよい（ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達調節因子の添加を含む）。またこの培地は本質的に、血清および／または血清由来の増殖因子を含まなくてもよい。さらなる実施形態において、培地は、ＢＭＰシグナル伝達および／またはアクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達の陽性調節因子もしくは阻害剤を含む、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達調節因子を含むか、または本質的に含まなくてもよい。例えば、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ドルソモルフィンであり得、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達阻害剤は、ＳＢ４３１５４２であり得る。なおもさらなる実施形態において、培地は、他の外部から添加されたＦＧＦシグナル伝達調節因子、特にＦＧＦ阻害剤を含むか、または本質的に含まなくてもよい。

【0017】

方法は、体細胞核移植に由来する胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹細胞、または胚幹細胞であり得る、多能性幹細胞の分化の開始物質としての使用を伴い得る。ある特定の態様において、多能性幹細胞は、単一の多能性幹細胞にクローン的に由来し得、単一の多能性幹細胞にクローン的に由来する細胞の実質的な部分を含み得るか、または細胞の複数集団のプールであってもよく、細胞の各集団は、単一細胞にクローン的に由来する。特定の態様において、多能性幹細胞は、例えば、単一細胞に由来する、細胞の集団であり得る。

【0018】

単一細胞から多能性幹細胞を得るための例示的過程は、細胞増殖を促進する条件下で、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤（例えば、ブレビスタチン）を含む培地内で、単一の多能性幹細胞をインキュベートすること、例えば、付着性培養条件下でインキュベートすることを含み得る。凝集体形成のために懸濁培養液中で多能性幹細胞を増殖させる前に、発生源としての単一の多能性幹細胞は、１回、２回、３回、４回、または好ましくは少なくとも５回継代され得る。別の態様において、多能性幹細胞は、単一細胞より多くを含むｉＰＳ細胞集団に由来し得る。細胞は、ヒト、マウス、または他の哺乳類細胞であり得る。

【0019】

分化前に、多能性幹細胞は、非細胞マトリックス成分上で培養され得る。マトリックス成分の非限定例は、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−オルニチン、ラミニン、およびフィブロネクチン、ならびにそれらの混合物、例えば、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞からのタンパク質混合物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＧｅｌｔｒｅｘ）および溶解細胞膜調製物を含んでもよい（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ，２００５）。特性化されていない成分により導入された変異型を排除するために、培地は本質的に、外部から添加された動物由来の成分、例えば、血清、支持細胞、または動物由来のタンパク質等を含まない場合があり、動物はヒトではない。

【0020】

培地は、化学的に定義されるか、または未定義であってよい（すなわち、外部から添加された化学的に未定義の成分を含有する）。定義された培地は、すべての原料の既知の量および化学的組成物を有する。未定義の培地は、いくつかの未定義の成分、例えば、細胞抽出物等のいくつかの複合原料を有してよく、これらの成分は、未知の比率の化学種の混合物からなる。特定の例において、定義された培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、例えば、栄養混合物Ｆ−１２を含むＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、Ｂ−２７サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、またはインスリン、トランスフェリン、およびセレニウム（ＩＴＳ）サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に基づいてもよい。

【0021】

いくつかの態様において、細胞は、凝集体形成前約４、８、もしくは１２時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間（またはその中で導き出せる任意の範囲）の間、予備刺激培地内で培養され得る。細胞は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＬ、またはその中で導き出せる任意の範囲の予備刺激培地内で培養され得る。細胞は、４、８、もしくは１２時間、１、２、３、４、５日、またはその中で導き出せる任意の範囲ごとに置き換えられる予備刺激培地内で培養され得る。ある特定の態様において、細胞は、予備刺激期間の間、予備刺激培地内で培養され得る。予備刺激期間は、定義された期間、あるいは選択された多能性幹細胞株もしくはクローン、または他の特定された条件（複数可）に対する最適化により特定される期間であり得る。例えば、定義された予備刺激期間は、分化前約４、８、もしくは１２時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間（またはその中で導き出せる任意の範囲）、あるいはその中で導き出せる任意の範囲から開始し得る。予備刺激期間は、少なくとも約４、８、もしくは１２時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０日間継続し得るか、またはさらなる分化が開始する時点まで継続し得る（任意の中間期間が含まれてもよい）。

【0022】

さらなる態様において、方法は、既定量の外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の存在下で、多能性幹細胞またはその子孫細胞を培養することをさらに含み得る。かかる培養は、予備刺激する（凝集体形成前に培養する）ステップ、凝集体を形成するステップ、またはさらなる分化のステップの任意の時点であり得る。特定の態様において、細胞は、既定量の外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の存在下で、予備刺激の間および／または凝集体形成の間に、最大約１、２、３、４、５、６日間（またはその中で導き出せる任意の範囲）培養され得る。さらに特定の態様において、細胞は、既定量の外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の存在下で、凝集体形成後のさらなる分化の最初の最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間（またはその中で導き出せる任意の範囲）培養され、次に後次の期間に、既定量の外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の不在下で培養され得る。ある特定の態様において、細胞は、予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化の間に、既定量の外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤（複数可）および／またはＦＧＦ８の存在下で培養され得る。ある特定の態様において、細胞は、予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化の間に、既定量の外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の不在下で培養され得る。

【0023】

系列間およびクローン間の変動性に起因して、多能性幹細胞の集団の神経分化のために適切な量のＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８を決定するための方法が提供され得る。ある特定の態様において、この方法はさらに、多能性幹細胞の集団の神経分化効率を試験して、高純度の神経培養物を産出する効率的な神経分化をもたらすために必要とされる、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤（複数可）および／またはＦＧＦ８の適切な量があれば決定することを含み得る。神経分化効率は、すべてのニューロンまたは神経細胞型、例えば、星状細胞に関して測定され得る。

【0024】

分化は、多能性幹細胞の解離の有無に関わらず開始し得る。好ましい実施形態において、分化は、幹細胞を本質的に単一の細胞培養物に解離することを含み得る。解離は、本質的に単一の細胞培養物を生成することができる、現在既知であるか、または今後開発される任意の方法の使用を包含する。例示の実施形態において、細胞は、プロテアーゼ処理またはピペット操作のような機械的処理により解離され得る。例えば、プロテアーゼは、コラゲナーゼ、トリプシン−ＥＤＴＡ、ジスパーゼ、またはそれらの組合せであり得る。代替として、クエン酸ナトリウム、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、またはそれらの組合せ等のキレート化剤を使用して、細胞を解離してもよい。本質的に単一の細胞培養は、細胞の大部分が単一細胞であるか、または関連したままの最大２つの細胞（二重項）であるように、増殖されるべき細胞が互いから解離される細胞培養であり得る。好ましくは、培養されるべき細胞の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超、またはそれ以上が一重項または二重項である。

【0025】

分化方法は、多能性幹細胞を分化することができる、現在既知であるか、または今後開発される任意の方法の使用を包含する。分化は、細胞凝集体（胚様体）を形成することを伴い得るか、または細胞凝集体を形成する必要がない場合がある。特定の実施形態において、解離された細胞は、培地（凝集体形成培地）内で細胞凝集体を形成し得る。凝集体形成培地は、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達調節因子およびｂＦＧＦを含み得るか、または本質的に含まなくてもよい。

【0026】

予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化培養培地のいずれかは、外部から添加された少なくとも、または最大約５〜約２００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８、例えば、少なくとも、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、１８０、２００ｎｇ／ｍＬ、あるいはその中で導き出せる任意の範囲を含有し得る。外部から添加されたＦＧＦ８もしくはＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤は、少なくとも、約、もしくは最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも、約、もしくは最大０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０μＭ、またはその中で導き出せる任意の範囲の量、あるいは高純度の神経細胞型の生成を向上させるために有効な任意の濃度であり得る。

【0027】

解離された細胞の生存を促進するために、培地は、外部から添加されたミオシンＩＩ阻害剤またはＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含み得る。ミオシンＩＩ阻害剤は、ブレビスタチンであり得る。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ＨＡ−１００、またはＨ１１５２であり得る。かかる阻害剤は、約０．０５〜約５０μＭの濃度、例えば、少なくとも、または約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０μＭ（その中で導き出される任意の範囲を含む）、あるいは細胞増殖または生存を促進するために有効な任意の濃度を有し得る。

【0028】

多能性幹細胞から形成された凝集体は、直径約、少なくとも、または最大５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００μｍであり得る。直径は、平均（ｍｅａｎ）、中央、または平均（ａｖｅｒａｇｅ）直径であり得る。別の態様において、凝集体の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％（またはその中で導き出せる任意の範囲）は、少なくとも、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００個の細胞、あるいはその中で導き出せる任意の範囲を含み得る。ある特定の態様において、凝集体の実質的な部分（例えば、少なくとも約５０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはその中で導き出せる任意の範囲）は、直径約８０〜２００μｍである。分化は、変動する凝集体寸法により操作され得る、様々な細胞型間の空間キューおよび相互作用により導かれるため、最適な範囲の凝集体寸法の近似均一性が分化を促進し得る。

【0029】

分化は、付着性培養物または懸濁培養液中で多能性幹細胞および／またはその子孫細胞を培養することを含み得る。特定の実施形態において、分化の間に、細胞は付着性培養物に移されてもよい。例えば、付着性培養物は、非細胞マトリックス成分を有し得る。好ましい実施形態において、この方法を多能性幹細胞の分化に使用し、懸濁培養液中で神経細胞を生成し得る。多能性幹細胞またはその子孫細胞は、懸濁培養液中で培養され得る。さらなる実施形態において、多能性幹細胞の凝集体は、懸濁培養液中で形成され得る。懸濁培養液は、例えばバイオリアクターの中に、約、少なくとも、または最大２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、５００ｍＬ、１リットル、３リットル、５リットル、１０リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、あるいはその中で導き出せる任意の範囲の体積を有し得る。いくつかの実施形態は、体積が標準ペトリ皿または９６−ウェルより大きな空間内で増殖する細胞を伴い、結果的にいくつかの実施形態は、かかる容器の使用を除外する。

【0030】

細胞凝集体の寸法および増殖を最適化するために、懸濁培養液は、少なくとも、または約５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００ｒｐｍ、あるいはその中で導き出せる任意の範囲の速度で移動され得る。この移動は、非限定的な例として、攪拌、振とう、揺動、または回転を含み得る。

【0031】

分化に使用される培地は、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤（複数可）、ｂＦＧＦ阻害剤、または両方の使用を含んでも含まなくてもよい。ＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤および／またはアクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達阻害剤であり得る。ｂＦＧＦシグナル伝達阻害剤は、ＰＤ１６６８６６であり得る。予備刺激による神経誘発の向上によって、この方法は、分化においてかかる阻害剤を使用する必要性を排除し得る。

【0032】

ある特定の態様において、ｉＰＳ細胞または分化した細胞の集団は、単一のｉＰＳ細胞にクローン的に由来し得る。さらなる態様において、少なくとも、または約１０^７、１０^８、１０^９、もしくは最大約１０^１０個（あるいはその中で導き出せる任意の範囲）の細胞の細胞集団が提供され得る。提供される細胞集団は、神経細胞等の細胞を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（あるいはその中で導き出せる任意の範囲）含み得る。特定の実施形態において、細胞集団は、神経細胞を少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（あるいはその中で導き出せる任意の範囲）含み得る。本発明は、現在既知である方法および予備刺激を使用しない方法と比較して、多能性幹細胞の分化から予想外に高い神経細胞の収率を達成し得る。

【0033】

上記方法のいずれかにより提供される神経細胞または星状細胞を含む細胞集団も提供され得る。さらなる実施形態は、少なくとも、または約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０個の神経細胞（またはその中で導き出せる任意の範囲）の単離された細胞集団を提供し得る。分化した細胞は、神経細胞または星状細胞を少なくとも９０％（例えば、少なくとも、または約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、あるいはその中で導き出せる任意の範囲）含み得る。特定の例において、細胞集団は、神経細胞に特異的なプロモータの下で、導入遺伝子（例えば、選択可能および／またはスクリーニング可能なマーカーをコードする）を含有し得る。例えば、導入遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子または蛍光タンパク質コード遺伝子であり得る。神経特異的なプロモータの非限定的な例としては、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、ニューロンクラスＩＩＩ β−チューブリン（ＴＵＪ−１）、シナプシンＩ（ＳＹＮ１）、エノラーゼ２／ニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２／ＮＳＥ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、チューブリンα−１Ａ鎖（ＴＵＢＡ１Ａ）、または微小管関連タンパク質−２（ＭＡＰ−２）のプロモータが挙げられる。この方法はさらに、例えば、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーのニューロン特異的または星状細胞特異的な発現に基づいて、神経細胞または星状細胞を単離または富化することを含み得る。

【0034】

さらなる実施形態において、神経疾患を有する対象を治療するための方法が提供され得る。この方法は、上述の方法により提供される神経細胞または星状細胞を対象に投与することを含み得る。対象は、パーキンソン病、ハンチントン病、リソソーム蓄積症、多発性硬化症、記憶および行動障害、アルツハイマー病、てんかん、発作、黄斑変性、および他の網膜症を含むが、これらに限定されない神経疾患または障害を有し得る。該細胞は、脊髄損傷、脳卒中、もしくは他の神経外傷から生じる神経系傷害の治療に使用することもでき、または手術、化学療法、薬物もしくはアルコール乱用、環境毒素および汚染により誘発される神経疾患および損傷を治療するために使用され得る。該細胞は、例えば、傷害、糖尿病、自己免疫障害、または循環系障害と関連付けられる神経疾患等の末梢神経障害の治療にも有用であり得る。該細胞を使用して、神経内分泌系、および交感神経系および副交感神経系を含む自律神経系の疾患または障害を治療し得る。好適な実施形態において、治療上有効な量の神経細胞または神経細胞内で富化された細胞培養物は、神経疾患を有する患者に投与される。本明細書で使用するとき、「治療上有効な量」という用語は、神経疾患、障害、神経系傷害、損傷、または神経疾患の症状の１つを少なくとも軽減するために十分な細胞の数を指す。好適な実施形態において、神経疾患はパーキンソン病である。

【0035】

本発明の方法および／または組成物の文脈において論じられる実施形態は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して用いられ得る。したがって、１つの方法または組成物に関する実施形態、本発明の他の方法および組成物に同様に適用され得る。

【0036】

本明細書で使用するとき、核酸に関する「コードする（ｅｎｃｏｄｅまたはｅｎｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、当業者が本発明を容易に理解できるように使用されるが、これらの用語は、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅまたはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同義的に使用され得る。

【0037】

本明細書で使用するとき、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味し得る。本明細書で使用するとき、請求項（複数可）において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という語は、１つまたは複数を意味し得る。

【0038】

請求項における「または」という語の使用は、代替物のみを指すこと、または代替物が相互に排他的であることが明示的に示されない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみを指す定義、ならびに「および／または」を支持する。本明細書で使用するとき、「別の」は、少なくとも２番目以降を意味し得る。

【0039】

本出願全体にわたって、「約」という用語は、値が、装置の固有の誤差の変動を含むことを示すために使用され、この方法は、値を決定するため、または研究対象の間に存在する変動を決定するために用いられる。

【0040】

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好適な実施形態を示す一方で、例証のためだけに提供される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
神経細胞を生成するための方法であって、
ａ）外部から添加された形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を本質的に含まない無血清培養培地内で、凝集体形成前に多能性幹細胞の集団を培養することと、
ｂ）懸濁培養液中でステップａ）の上記細胞から凝集体を形成することと、
ｃ）上記凝集体を、神経細胞を含む細胞集団にさらに分化し、それにより神経細胞を生成することと、
を含む、方法。
（項目２）
上記多能性幹細胞が、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップａ）の上記多能性幹細胞が、非細胞マトリックス成分上で培養される、項目１に記載の方法。
（項目４）
ａ）培養するステップ、ｂ）凝集体を形成するステップ、および／またはｃ）さらなる分化のステップの最初の最大約１日、２日、３日、４日、または５日における上記培養培地が、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８を有する、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８が、神経細胞への上記集団の分化に適切であると決定された量である、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記神経分化効率を試験して、上記外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の上記適切な量を、上記集団からの細胞の最高神経分化効率と関連付けられた量として決定することをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
ａ）培養するステップ、ｂ）凝集体を形成するステップ、および／またはｃ）さらなる分化のステップにおける上記培養培地は、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８を有しない、項目１に記載の方法。
（項目８）
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤が、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤および／またはアクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達阻害剤である、項目４〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
ステップａ）の上記培養培地が、化学的に定義される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ステップａ）の上記培養培地が、栄養混合物Ｆ−１２を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、Ｂ−２７サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、またはインスリン、トランスフェリン、およびセレニウム（ＩＴＳ）サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
ステップａ）の上記培養は、凝集体形成前の約１日〜約５日の期間の間である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
凝集体を形成することが、ステップａ）からの上記細胞を本質的に単一の細胞培養物に解離させることを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記凝集体が、外部から添加されたＴＧＦβおよびｂＦＧＦを本質的に含まない凝集体形成培地内で形成される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記形成された凝集体が、平均寸法約１０〜４００μｍの直径を有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記凝集体が、外部から添加されたミオシンＩＩ阻害剤および／またはＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む、凝集体形成培地において形成される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記懸濁培養液が、約５ミリリットル〜約２５リットルの体積を有する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記懸濁培養が、約１５ｒｐｍ〜約１００ｒｐｍの速度で回転または振とうされる、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記細胞集団が、神経細胞を少なくとも約９０％含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
上記細胞集団が、神経細胞を少なくとも約９５％含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
神経細胞を富化または単離することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
神経細胞を含む上記集団を、星状細胞を含む第２の集団にさらに分化することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
神経細胞を含む上記集団が、星状細胞にさらに分化するために血清と接触させられる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ａ）培養するステップ、ｂ）凝集体を形成するステップ、およびｃ）さらなる分化のステップにおける上記培養培地が、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８を有しない、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記第２の細胞集団が、分化の９０日目前の時点で星状細胞を少なくとも約９０％含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
上記第２の細胞集団が、分化の５０日目前の時点で星状細胞を少なくとも約９０％含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
星状細胞を富化または単離することをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
神経疾患を有する対象を治療するための方法であって、治療上有効な量の項目１〜２０のいずれかに記載の方法により調製される上記神経細胞または項目２１〜２６のいずれかに記載の方法により調製される星状細胞を上記対象に投与することを含む、方法。

【図面の簡単な説明】

【0041】

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態に関する詳細な説明と併せて、これらの図面の１つ以上を参照することにより良好に理解され得る。

【0042】

【図1】アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦおよびＢＭＰ阻害剤を使用する公開済みの方法から得られる分化は、３．７％ニューロンである培養物をもたらした（図１Ａ）。Ｎ２予備刺激された細胞から得られる培養物は、９５．９８％ニューロンであった（図１Ｂ）。培養物は、分化の２４日目に分析した。

【図2-1】ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ａ）、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ｂ）、インスリン、トランスフェリン、およびセレニウム（ＩＴＳ）サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ｃ）、およびサプリメントを含まないＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ｄ）を用いる予備刺激はすべて、β_ＩＩＩチューブリン／ネスチンフローサイトメトリーにより測定されるように、９５％ニューロン以上の純度をもたらした。培養物は、２７日目に分析した。

【図2-2】ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ａ）、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ｂ）、インスリン、トランスフェリン、およびセレニウム（ＩＴＳ）サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ｃ）、およびサプリメントを含まないＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地（図２Ｄ）を用いる予備刺激はすべて、β_ＩＩＩチューブリン／ネスチンフローサイトメトリーにより測定されるように、９５％ニューロン以上の純度をもたらした。培養物は、２７日目に分析した。

【図3-1】予備刺激および／または早期分化の間のＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤ドルソモルフィンおよび／またはＳＢ−４３１５４２および／またはＦＧＦ８の混入は、ある特定の多能性幹細胞株およびクローンのニューロンの純度を向上させることができる（ｗｐ＝ウェルプレート、Ｎ２＝Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地）（図３Ａ）。２７日目のフローサイトメトリー分析、ＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤および／またはＦＧＦ８を含有する培地内で細胞を培養した（表に列挙される最終日を除いて、細胞を毎日供給した）（図３Ｂ）。−２、−１、０および１日目に、たった１つのＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤を培養培地（ＳＢ−４３１５４２またはドルソモルフィン）に添加して、同一のタイムフレームの間の培養培地への両阻害剤の添加と比較して、２８日目にニューロン細胞純度を生成することができる（図３Ｃ）。

【図3-2】予備刺激および／または早期分化の間のＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤ドルソモルフィンおよび／またはＳＢ−４３１５４２および／またはＦＧＦ８の混入は、ある特定の多能性幹細胞株およびクローンのニューロンの純度を向上させることができる（ｗｐ＝ウェルプレート、Ｎ２＝Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２基礎培地）（図３Ａ）。２７日目のフローサイトメトリー分析、ＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤および／またはＦＧＦ８を含有する培地内で細胞を培養した（表に列挙される最終日を除いて、細胞を毎日供給した）（図３Ｂ）。−２、−１、０および１日目に、たった１つのＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤を培養培地（ＳＢ−４３１５４２またはドルソモルフィン）に添加して、同一のタイムフレームの間の培養培地への両阻害剤の添加と比較して、２８日目にニューロン細胞純度を生成することができる（図３Ｃ）。

【発明を実施するための形態】

【0043】

Ｉ．導入
多様な異なる方法および組成物が、本明細書において説明される。ある特定の実施形態は、幹細胞分化過程を向上させる、いくつかの重要な利点に関する。多能性幹細胞の神経分化能は、分化前の幹細胞の培養環境により影響され得ることが発見されている。いくつかの実施形態において、方法は、特に神経分化能を低減する増殖因子の不在下で予備刺激培地を使用することにより、多能性幹細胞の分化からの神経細胞の均一性および収率を増加させるために開発され得る。

【0044】

「多能性」とは、１つ以上の組織または器官を構成するすべての細胞、例えば、内胚葉（胃の内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（上皮組織および神経系）の３つの胚葉層のいずれかに分化する能力を有する幹細胞を指す。

【0045】

一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと省略される「誘導多能性幹細胞」は、非多能性細胞、典型的に成体体細胞、または最終分化した細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、上皮細胞等から、再プログラム化因子を導入するか、またはそれと接触させることにより、人工的に調製された多能性幹細胞の一種を指す。

【0046】

「胚幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。

【0047】

「付着性培養物」は、細胞または細胞の凝集体が表面に付着する培養物を指す。

【0048】

「懸濁培養液」は、細胞または細胞の凝集体が、液体培地中に懸濁される間に増殖する培養液を指す。

【0049】

外部から添加された成分を「本質的に含まない」とは、細胞以外の源から特定された成分を培地内に含まないか、または本質的に含まない培地を指す。外部から添加された増殖因子またはシグナル伝達阻害剤、例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤等を「本質的に含まない」とは、最小量または検出不可能な量の外部から添加された成分を意味し得る。例えば、ＴＧＦβもしくはｂＦＧＦを本質的に含まない培地もしくは環境は、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０１、０．００１ｎｇ／ｍＬ未満、またはその中で導き出せる任意の範囲を含有することができる。例えば、シグナル伝達阻害剤を本質的に含まない培地もしくは環境は、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１μＭ未満、またはその中で導き出せる任意の範囲を含有することができる。

【0050】

「ＲＯＣＫ阻害剤」として省略される「Ｒｈｏ関連キナーゼ阻害剤」は、例えば、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等の細胞内のＲｈｏ関連キナーゼまたはそのシグナル伝達経路の機能を阻害または低減する任意の物質を指す。本明細書で使用するとき、「ＲＯＣＫシグナル伝達経路」は、細胞内のＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路、例えば、Ｒｈｏ−ＲＯＣＫ−ミオシンＩＩシグナル伝達経路、その上流シグナル伝達経路、またはその下流シグナル伝達経路に関与する、任意のシグナルプロセッサを含み得る。ＲＯＣＫ阻害剤の例としては、Ｒｈｏ特異的阻害剤またはＲＯＣＫ特異的阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0051】

「ミオシンＩＩ阻害剤」は、細胞内のミオシンＩＩまたはそのシグナル伝達経路の機能を阻害または低減する任意の物質、例えば、小分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を指す。ミオシンＩＩ阻害剤の例としては、ＭＲＬＣ（ミオシン調節軽鎖）特異的阻害剤またはミオシンＩＩ特異的阻害剤を含む。

【0052】

「分化」は、あまり特殊化されていない細胞が、より特殊化される、少なくとも新しい細胞型の子孫を形成する過程である。

【0053】

「凝集促進培地」という用語は、作用機序に関する任意の制限なしに、細胞の凝集体形成を強化する任意の培地を意味する。

【0054】

「凝集体」という用語、すなわち、胚様体は、懸濁液中で培養される分化した細胞、部分的に分化した細胞、および／または多能性幹細胞を含む、細胞の同種または異種クラスタを指す。

【0055】

「ニューロン」または「神経細胞」または「神経細胞型」または「神経系統」は、任意のニューロン系統細胞を含み得、特別の定めのない限り、任意の制限なしにニューロンの個体発生の任意の段階にある細胞を指す。例えば、ニューロンは、両ニューロン前駆体、成熟ニューロン、および星状細胞等の神経細胞型を含み得る。

【0056】

特定タンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、または「フラグメント」は、適切な調節配列の制御下に配置される場合、インビトロまたはインビボで、転写され、また遺伝子生成物、例えば、ポリペプチドに随意に翻訳される核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ形態のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５′（アミノ）末端の開始コドン、および３′（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより決定される。遺伝子としては、原核または真核ｍＲＮＡのｃＤＮＡ、原核または真核ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を挙げることができるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、遺伝子配列に対して３′に位置する。

【0057】

「導入遺伝子」という用語は、人工的または自然な手段により細胞または有機体に導入された遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチド、例えば、外因性核酸を指す。外因性核酸は、異なる有機体または細胞に由来し得るか、または有機体もしくは細胞内で自然発生する核酸の１つ以上の追加の複製であり得る。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、またはそうでなければ自然界に見られるものとは異なる核酸配列が両脇に並ぶ。

【0058】

「プロモータ」という用語は、本明細書において、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すように、その通常の意味で使用され、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３′方向）コード領域の転写を開始することができる遺伝子に由来する。

ＩＩ．多能性幹細胞の源

【0059】

多能性幹細胞は、多能性幹細胞の神経導入のために本方法において使用され得る。本発明において、神経発生能を向上させる条件下で多能性幹細胞を予備刺激することにより、神経分化効率を向上させるための方法および組成物が開示された。

【0060】

「多能性幹細胞」という用語は、全３つの胚葉層、つまり内胚葉、中胚葉、および外胚葉の細胞を生じることができる細胞を指す。理論では、多能性幹細胞は身体の任意の細胞に分化することができるが、実験的な多能性の決定は、典型的に、各胚葉層のいくつかの細胞型への多能性細胞の分化に基づく。本発明のいくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、胚盤胞の内細胞塊に由来する胚幹（ＥＳ）細胞である。他の実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞を再プログラム化することに由来する誘導多能性幹細胞である。ある特定の実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞核移植に由来する胚幹細胞である。

Ａ．胚幹細胞

【0061】

胚幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内細胞塊に由来する多能性細胞である。ＥＳ細胞は、発達する胚の外側栄養外胚葉層を除去し、次いで非増殖細胞の支持層上で内塊細胞を培養することにより単離され得る。適切な条件下で、増殖する未分化のＥＳ細胞のコロニーが生成される。コロニーは、除去され、個別の細胞に解離された後、新鮮な支持層上に再播種され得る。再播種された細胞は増殖を続けることができ、未分化のＥＳ細胞の新しいコロニーを生成する。次いで新しいコロニーが除去され、解離され、再度播種されて、増殖が可能になり得る。未分化のＥＳ細胞を「二次培養する」または「継代する」この過程を何度も反復して、未分化のＥＳ細胞を含有する細胞株を生成することができる（米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号）。「一次細胞培養物」は、胚盤胞の内細胞塊等の組織から直接得られる細胞の培養物である。「二次培養物」は、一時細胞培養物に由来する任意の培養物である。

【0062】

マウスＥＳ細胞を得るための方法はよく知られている。一方法において、マウスの１２９株からの移植前胚盤胞は、マウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、内細胞塊は、ウシ胎仔血清を含有する培地内で、化学的に不活性化されたマウス胚線維芽細胞の支持細胞層上で培養される。発達する未分化のＥＳ細胞のコロニーは、ウシ胎仔血清の存在下で、マウス胚線維芽細胞の支持層上で二次培養されて、ＥＳ細胞の集団を生成する。いくつかの方法において、マウスＥＳ細胞は、サイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を血清含有培養培地に添加することにより、支持層の不在下で増殖され得る（Ｓｍｉｔｈ，２０００）。他の方法において、マウスＥＳ細胞は、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下で、無血清培地内で増殖され得る（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0063】

ヒトＥＳ細胞は、前述の方法を使用して胚盤胞から得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ，２０００）。一方法において、５日目のヒト胚盤胞は、ウサギ抗ヒト脾細胞抗血清に曝露され、次いで溶解栄養外胚葉細胞に相補的なモルモットの１：５希釈に曝露される。溶解された栄養外胚葉細胞を正常な内細胞塊から除去した後、内細胞塊は、γ−不活性化マウス胚線維芽細胞の支持層上で、ウシ胎仔血清の存在下で培養される。９〜１５日後、内細胞塊に由来する細胞の凝集塊は、化学的に（すなわち、トリプシンに曝露される）または機械的に解離され、ウシ胎仔血清およびマウス胚線維芽細胞の支持層を含有する新鮮な培地内に再播種され得る。さらなる増殖時に、未分化の形態を有するコロニーは、マイクロピペットにより選択され、機械的に凝集塊に解離されて、再播種される（米国特許第６，８３３，２６９を参照）。ＥＳ様形態は、明らかに高い核対細胞質比および顕著な核小体を有する小型コロニーとして特性化される。得られるＥＳ細胞は、簡単なトリプシン処理、またはマイクロピペットによる個別のコロニーの選択により日常的に継代され得る。いくつかの方法において、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で、線維芽細胞の支持層上でＥＳ細胞を培養することにより、血清なしに増殖され得る（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，２０００）。他の方法において、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「馴化」培地の存在下で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはラミニン等のタンパク質マトリックス上で細胞を培養することにより、支持細胞層なしに増殖され得る（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）。培地は、線維芽細胞と共培養することにより事前に馴化される。

【0064】

アカゲサルおよび一般的なマーモセットＥＳ細胞の単離方法も既知である（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｏｄｏｒｉｃｏ，２０００）。

【0065】

ＥＳ細胞の別の源は、樹立ＥＳ細胞株である。様々なマウス細胞株およびヒトＥＳ細胞株は既知であり、それらの増殖および繁殖のための条件は定義されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞株は、マウス株１２９胚の内細胞塊から樹立され、ＣＧＲ８細胞の培養物は、支持層なしにＬＩＦの存在下で増殖され得る。さらなる例として、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３およびＨ１４は、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより樹立された。加えて、Ｈ１株のサブクローンＨ９．１およびＨ９．２が開発されている。当該技術分野において既知の事実上任意のＥＳまたは幹細胞株、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｙｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ，２００８に記載されるもの等は、本発明とともに使用され得ることが予想される。

【0066】

本発明と併用するためのＥＳ細胞の源は、胚盤胞、胚盤胞の内細胞塊を培養することに由来する細胞、または樹立細胞株の培養物から得られる細胞であり得る。したがって、本明細書で使用するとき、「ＥＳ細胞」という用語は、胚盤胞の内細胞塊、内塊細胞の培養物から得られるＥＳ細胞、およびＥＳ細胞株の培養物から得られるＥＳ細胞を指し得る。

Ｂ．誘導多能性幹細胞

【0067】

誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ＥＳ細胞の特徴を有するが、分化した体細胞の再プログラム化により得られる細胞である。誘導多能性幹細胞は、様々な方法により得られている。一方法において、成人の皮膚線維芽細胞を、レトロウイルス導入を使用して、転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４により形質導入される（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。形質導入された細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補充した培地内のＳＮＬ支持細胞（ＬＩＦを生成するマウス細胞線維芽細胞株）上に播種する。約２５日後、ヒトＥＳ細胞コロニーに類似するコロニーが、培養物中に出現する。ＥＳ細胞様コロニーを採取し、ｂＦＧＦの存在下、支持細胞上で拡大される。

【0068】

細胞特徴に基づいて、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は、誘導多能性幹細胞である。誘導多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態的に類似し、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。またヒトＥＳ細胞の分化をもたらすことが知られている条件下で増殖されるときに、誘導多能性幹細胞がそれに応じて分化する。例えば、誘導多能性幹細胞は、ニューロン構造およびニューロンマーカーを有する細胞に分化することができる。例えば、Ｙｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ，２００８に記載されるものを含む、事実上任意のｉＰＳ細胞または細胞株を、本発明とともに使用し得ることが予想される。

【0069】

別の方法において、ヒト胎児または新生児線維芽細胞は、レンチウイルス導入を使用して、４つの遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８により形質導入される（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。感染後１２〜２０日目に、ヒトＥＳ細胞形態を有するコロニーが目に見えるようになる。コロニーを採取し、拡大する。コロニーを形成する誘導多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞に形態的に類似し、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現して、マウスへの注入後に、神経組織、軟骨、および腸上皮を有する奇形腫を形成する。

【0070】

マウスから誘導多能性幹細胞を調製する方法も既知である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，２００６）。ｉＰＳ細胞の誘導は、典型的に、Ｓｏｘファミリーの少なくとも１つのメンバー、およびＯｃｔファミリーの少なくとも１つのメンバーの発現またはそれらに対する曝露を必要とする。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞同一性を特定する転写調節階級の中心となると考えられる。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５、またはＳｏｘ−１８であり得、ＯｃｔはＯｃｔ−４であり得る。付加因子は、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃのような再プログラム化効率を増加させ得、再プログラム化因子の特定群は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、および随意にＬｉｎ−２８を含む群、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、および随意にｃ−Ｍｙｃを含む群であり得る。

【0071】

ＥＳ細胞のようなＩＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１の抗体を使用して、免疫組織化学またはフローサイトメトリーにより同定または確認され得る、特徴的な抗原を有する（Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。胚幹細胞の多能性は、約０．５〜１０×１０^６個の細胞を、８〜１２週齢の雄ＳＣＩＤマウスの後脚筋肉に注入することにより確認され得る。３つの胚葉層のそれぞれの少なくとも１つの細胞型を実証する奇形腫が発達する。

【0072】

本発明のある特定の態様において、ｉＰＳ細胞は、上述のＫｌｆまたはＮａｎｏｇと併せて、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２等のＯｃｔファミリーメンバーおよびＳｏxファミリーメンバーを含む再プログラム化因子を使用して、再プログラム化体細胞から形成される。本発明のある特定の態様における体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞、またはβ細胞等の多能性に誘導され得る任意の体細胞であり得る。ある特定の態様において、Ｔ細胞は、再プログラム化のための体細胞の源として使用され得る（参照により本明細書に援用される、米国特許出願第６１／１８４，５４６号を参照）。

【0073】

再プログラム化因子は、統合ベクター、染色体的に非統合のＲＮＡウイルスベクター（参照により本明細書に援用される、米国特許出願第１３／０５４，０２２号を参照）、またはＥＢＶ要素ベースのシステム等のエピソームベクター（参照により本明細書に援用される、米国特許出願第６１／０５８，８５８号、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照）等の１つ以上のベクターに含まれる発現カセットから発現され得る。さらなる態様において、再プログラム化タンパク質またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）は、タンパク質またはＲＮＡ形質導入により体細胞に直接導入され得る（参照により本明細書に援用される、米国特許出願第６１／１７２，０７９号、Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０を参照）。

Ｃ．体細胞核移植に由来する胚幹細胞

【0074】

多能性幹細胞は、ドナー核が無紡錘卵母細胞に移植される体細胞核移植により調製され得る。核移植により生成される幹細胞は、遺伝子学的にドナー核と同一である。一方法において、アカゲザルの皮膚線維芽細胞からのドナー線維芽細胞核は、電気融合により無紡錘、成熟中期ＩＩアカゲザル卵母細胞の細胞質に導入される（Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。融合された卵母細胞は、イオノマイシンへの曝露により活性化された後、胚盤胞段階まで培養される。次いで選択された胚盤胞の内細胞塊を培養して、胚幹細胞株を生成する。胚幹細胞株は、正常なＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現して、インビトロおよびインビボの両方で複数の細胞型に分化する。本明細書で使用するとき、「ＥＳ細胞」という用語は、受精した核を含有する胚に由来する胚幹細胞を指す。ＥＳ細胞は、核移植により生成される胚幹細胞から区別され、「体細胞核移植に由来する胚幹細胞」と称される。

ＩＩＩ．多能性幹細胞の予備刺激および分化条件

【0075】

培養条件に応じて、多能性幹細胞は、分化した細胞または未分化細胞のコロニーを生成することができる。向上した分化の一貫性および効率のために、多能性幹細胞の分化の特定の予備刺激条件を使用するための方法が提供される。例えば、多能性幹細胞は、分化前、より具体的には凝集体形成の誘導前に、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦのような増殖因子を本質的に含まない培地内で培養される。別段の定めがない限り、分化は、自発変化によらず、少なくとも培養条件の変化を伴い得る誘導（例えば、凝集体形成）により達成される。

【0076】

多能性幹細胞の「予備刺激」は、凝集体形成の開始前、多能性幹細胞が所望の分化のために調整され得る間の期間または過程を意味し得る。「分化する」という用語は、進行経路を下る細胞の進行を意味する。「分化した」という用語は、別の細胞と比較して、進行経路を下る細胞の進行を説明する相対用語である。例えば、多能性細胞は、体の任意の細胞を生じ得るが、造血細胞等のより分化した細胞は、より少数の細胞型を生じる。

【0077】

多能性幹細胞の培養物は、集団中の幹細胞およびそれらの誘導体の実質的な割合（例えば、少なくとも約５０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはその中で導き出せる任意の範囲）が、未分化細胞の形態的特徴を示す場合に「未分化」とされ、胚または成体起源の分化した細胞からそれらを明らかに区別する。未分化ＥＳまたはｉＰＳ細胞は、当業者により認識され、典型的に、高い核／細胞質比および顕著な核を有する細胞のコロニー内で２次元の顕微鏡ビューに出現する。未分化細胞のコロニーは、分化された近隣細胞を有し得ることが理解される。

【0078】

ある特定の態様において、本方法の開始細胞は、少なくとも、または約１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３個、またはその中で導き出せる任意の範囲の細胞を含み得る。開始細胞集団は、少なくとも、または約１０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８個の細胞／ｍＬ、またはその中で導き出せる任意の範囲の播種密度を有し得る。

Ａ．予備刺激および分化のための培地

【0079】

本発明のある特定の態様による予備刺激または分化培地は、その基礎培地として動物細胞を培養するために使用される培地を使用して調製され得る。予備刺激培地は、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦを本質的に含まない培地であり得る。分化に使用される培地のいずれかは、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦを含有し得るか、またはＴＧＦβおよびｂＦＧＦを本質的に含まない培地であってもよい。ある特定の態様において、予備刺激培地または分化培地は、外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および外部から添加されたｂＦＧＦ阻害剤の必要性を排除し得る。

【0080】

ある特定の態様において、予備刺激培地、凝集体形成培地、またはさらなる分化のための培地は、ＦＧＦ８（線維芽細胞増殖因子８）またはＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達の阻害剤、例えば、ＳＢ−４３１５４２またはドルソモルフィンを含有し得る。特定の態様において、ＦＧＦ８またはＴＧＦスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤（複数可）は、細胞の同一バッチ、株、またはクローンに対する別個の実験により決定される適量で存在し得る（参照により本明細書に援用される、米国特許出願第６１／３９４，５８９号を参照）。

【0081】

基礎培地として、任意の化学的に定義された培地、例えば、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、グラスゴーＭＥＭ、向上したＭＥＭ亜鉛オプション、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ １６４０、およびフィッシャー培地、それらの変異型または組合せが使用され得、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦは含まれても含まれなくてもよい。

【0082】

さらなる実施形態において、細胞予備刺激または分化環境は、Ｂ−２７サプリメント、インスリン、トランスフェリン、およびセレニウム（ＩＴＳ）サプリメント、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２サプリメント（５μｇ／ｍＬインスリン、１００μｇ／ｍＬトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭセレニウム、１００μＭプトレシン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ，ａｎｄ Ｓａｔｏ，１９７９ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７６，５１４〜５１７）およびβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）等のサプリメントを含有することもできる。フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、レチノイン酸を含むが、これらに限定されない付加因子が添加されてもされなくてもよいことが企図される。

【0083】

例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）のメンバー、ＦＧＦ２および／またはＦＧＦ８を含む線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー、血小板由来増殖因子ファミリー（ＰＤＧＦ）のメンバー、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／成長および分化因子（ＧＤＦ）因子ファミリー拮抗薬のメンバー（ノギン、ホリスタチン、コルジン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン、および無羊膜を含むが、これらに限定されない）等の増殖因子は、予備刺激培地、凝集体形成培地、および／またはさらなる分化培地に添加されてもされなくてもよい。ＴＧＦ、ＢＭＰ、およびＧＤＦ拮抗薬は、ＴＧＦ、ＢＭＰ、およびＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形態でも添加され得る。添加されてもされなくてもよい他の因子としては、デルタ様および鋸歯状ファミリーのタンパク質、ならびにγセクレターゼ阻害剤およびＤＡＰＴ等のノッチ処理または開裂の他の阻害剤を含むが、これらに限定されないノッチ受容体ファミリーを通じてシグナル伝達を活性化または不活性化することができる分子が挙げられる。他の増殖因子としては、インスリン様増殖因子ファミリー（ＩＧＦ）、無翼関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、およびヘッジホッグ因子ファミリーのメンバーが挙げられ得る。

【0084】

付加因子を、予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化の培地に付加して、神経幹／前駆体増殖および生存、ならびにニューロン生存および分化を促進してもよい。これらの神経栄養因子としては、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／成長および分化因子（ＧＤＦ）ファミリーのメンバー、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリー（ニュールツリン、ニューブラスチン／アルテミン、およびペルセフィンを含むが、これらに限定されない）、ならびに肝細胞増殖因子に関連し、それを含む因子が挙げられるが、これらに限定されない。末端分化されて有糸分裂後ニューロンを形成する神経培養物は、５−フルオロ２′−デオキシウリジン、およびシトシンβ−Ｄ−アラビノ−フラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含むが、これらに限定されない有糸分裂阻害剤または有糸分裂の混合物も含有し得る。

【0085】

培地は、血清含有培地または無血清培地であり得る。無血清培地は、未処理または未精製血清を含まない培地を指してよく、したがって、精製血液由来成分または動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を含む培地を含み得る。異種動物由来成分による汚染を防ぐ観点から、血清は、幹細胞（複数可）の動物と同一の動物に由来し得る。

【0086】

培地は、血清の任意の代替物を含有してもしなくてもよい。血清の代替物としては、アルブミン（例えば、脂質に富むアルブミン、組み換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン、およびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３′−チオールグリセロール、またはその相当物を適切に含有する材料を挙げることができる。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に開示される方法により調製され得る。あるいは、さらなる便宜のために任意の市販の材料を使用することができる。市販の材料としては、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、化学的に定義された脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）、およびＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。

【0087】

培地は、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン（複数可）、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩を含有することもできる。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５、または０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．１、０．２、０．５、０．８、１、１．５、２、２．５、５、７．５、１０ｍＭ、または任意の中間値であり得るが、濃度は、幹細胞（複数可）を培養するために適切である限り、特にそれに限定されない。

【0088】

多能性幹細胞の予備刺激のための時間は、向上した神経誘導等の所望の効果が達成され得るための期間である限り、特に限定されない。例えば、予備刺激のための時間は、解離前の少なくとも、または約１０、１５、２０、２５、３０分から数時間（例えば、少なくとも、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間、またはその中で導き出せる任意の範囲）であり得る。他の実施形態において、幹細胞は、少なくとも１〜５継代にわたって、予備刺激培地内で培養され得る。

【0089】

予備刺激される多能性幹細胞（複数可）の密度は、それが少なくとも、または約１０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８細胞／ｃｍ^２、あるいは向上した神経誘導等の所望の効果が達成され得る密度である限り、特に限定されない。例えば、約１．０×１０^４〜１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２、より具体的に約２．０×１０^４〜６．５×１０^５細胞／ｃｍ^２、および最も具体的に約３．０×１０^４〜３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２である。

【0090】

ある特定の実施形態において、多能性幹細胞は、凝集体形成前に予備刺激培地内で培養され、神経誘導を向上させる（例えば、単一細胞または小さな凝集体に解離されて凝集体形成を誘導する前）。本発明のある特定の実施形態において、幹細胞は、支持細胞、支持細胞抽出物、および／または血清の不在下で培養され得る。

Ｂ．培養条件

【0091】

細胞（複数可）を培養するために使用される培養容器としては、細胞をその中で培養することができる限り、フラスコ、組織培養のためのフラスコ、スピナーフラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養のための皿、マルチ皿、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバスライド、管、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバ、培養バッグ、およびローラーボトルが挙げられるが、これらに特に限定されない。細胞は、培養の必要性に応じて、少なくとも、または約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、８００、１０００、１５００ｍＬ、あるいはその中で導き出せる任意の範囲の体積で培養され得る。ある特定の実施形態において、培養容器は、バイオリアクターであり得、生物学的に活性な環境を支持する任意の装置またはシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくとも、または約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、あるいはその中で導き出せる任意の範囲の体積を有し得る。

【0092】

培養容器表面は、目的により、細胞付着性を有してまたは有さずに準備され得る。細胞付着性培養容器は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の細胞付着のための任意の基質で被覆されて、細胞に対する容器表面の付着性を向上させることができる。細胞付着に使用される基質は、幹細胞または支持細胞（使用される場合）を付着することが意図される任意の材料であり得る。細胞付着の非限定的な基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｄ−オルニチン、ラミニン、ビトロネクチン、およびフィブロネクチン、およびそれらの混合物、例えば、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス肉腫細胞からのタンパク質混合物（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＧｅｌｔｒｅｘ）および溶解細胞膜調製物が挙げられる（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0093】

他の培養条件は、適切に定義され得る。例えば、培養温度は、約３０〜４０℃、例えば、少なくとも、または約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であり得るが、特にそれらに限定されない。ＣＯ_２濃度は、約１〜１０％、例えば、約２〜７％、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。酸素圧は、少なくとも、または約１、５、８、１０、２０％、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。

【0094】

付着培養物は、ある特定の態様において使用され得る。この場合、細胞は、支持細胞の存在下で培養され得る。支持細胞が本発明の方法において使用される例において、胎児線維芽細胞等のストローマ細胞は、支持細胞として使用され得る（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９４）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３）、Ｍａｒｔｉｎ（１９８１）、Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１）、Ｊａｉｎｃｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９６９）、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）、Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）、ならびに国際公開第０１／０８８１００号および同第２００５／０８０５５４号を参照）。

【0095】

他の態様において、懸濁培養液が使用され得る。懸濁培養液は、担体上の懸濁培養液（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）またはゲル／バイオポリマーカプセル化（米国特許公開第２００７／０１１６６８０号）を含み得る。幹細胞の懸濁培養液は、幹細胞が、培地内の培養容器または支持細胞（使用される場合）に関して、非付着性条件下で培養されることを意味する。幹細胞の懸濁培養液としては、幹細胞の解離培養液および幹細胞の凝集体懸濁液が挙げられる。幹細胞の解離培養は、懸濁された幹細胞が培養されることを意味し、幹細胞の解離培養としては、単一細胞の解離培養、または複数の幹細胞（例えば、約２〜４００細胞）からなる小細胞凝集体の解離培養が挙げられる。前述の解離培養が継続するときに、培養され、解離された細胞は、より大きな幹細胞の凝集体を形成し、その後凝集体懸濁培養が行われ得る。凝集体懸濁培養としては、胚様体培養法（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照）、およびＳＦＥＢ（無血清胚様体）法（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００５、国際公開第２００５／１２３９０２号）が挙げられる。

Ｃ．多能性幹細胞の培養

【0096】

ＥＳ細胞等の多能性幹細胞を調製および培養するための方法は、奇形腫および胚幹細胞を含む、細胞生物学、組織培養、および発生学における標準的なテキストおよびレビュー：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８７）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（１９９３）、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９８）において認められ得、すべて参照により本明細書に援用される。組織培養において使用される標準方法は、概して、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（１９８７）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７＆１９９５）に記載される。

【0097】

体細胞が再プログラム化因子の中に導入されるか、またはそれと接触した後に、これらの細胞は、多能性および未分化状態を維持するために十分な培地内で培養され得る。誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、参照により本明細書に援用される、米国特許公開第２００７／０２３８１７０号、および米国特許公開第２００３／０２１１６０３号、および米国特許公開第２００８／０１７１３８５号に記載されるように、霊長類多能性幹細胞、より具体的には、胚幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技法を使用することができる。当業者には既知であるように、多能性幹細胞の培養および維持のための付加的方法が、本発明とともに使用されてよいことが理解される。

【0098】

ある特定の実施形態において、未定義の条件が使用され得、例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態で維持するために、線維芽支持細胞または線維芽支持細胞に曝露された培地上で培養され得る。あるいは、多能性細胞は、定義された支持細胞非依存性の培養系、例えば、ＴｅＳＲ培地（Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ、Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）またはＥ８培地（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６７９６）を使用して、本質的に未分化状態で培養および維持されてよい。支持細胞非依存性の培養系および培地を使用して、多能性細胞を培養および維持し得る。これらのアプローチは、ヒト多能性幹細胞を、マウス線維芽細胞「支持細胞層」を必要とすることなく、本質的に未分化状態で維持することを可能にする。本明細書に記載のとおり、所望のとおり費用を低減するために、これらの方法に様々な修正を行ってよい。

【0099】

様々なマトリックス成分は、ヒト多能性幹細胞を培養、維持、または分化する際に使用され得る。例えば、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンを組み合わせて使用し、参照によりそれら全体が援用される、Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．（２００６ａ、２００６ｂ）に記載のとおり、多能性細胞増殖のための固体支持体を提供する手段として培養表面を被覆し得る。

【0100】

Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用して、ヒト多能性幹細胞の細胞培養および維持のための基質を提供してもよい。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、マウス腫瘍細胞により分泌されたゼラチン状タンパク質混合物であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多くの組織において認められる複雑な細胞外環境に類似し、細胞培養の基質として細胞生物学者により使用される。

Ｄ．ＲＯＣＫ阻害剤およびミオシンＩＩ阻害剤

【0101】

多能性幹細胞、特にヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、クローン単離または拡張および分化誘導に重要な、細胞分離および解離時にアポトーシスの影響を受け易い。分化のための幹細胞クローンを得るために、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を使用して、クローン化効率を増加させ得る。

【0102】

最近では、解離した多能性幹細胞のクローン化効率および生存を増加させる分子の小群、例えば、ＲＯＣＫ関連シグナル伝達経路の阻害剤である、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、例えば、Ｒｈｏ特異的阻害剤、ＲＯＣＫ特異的阻害剤、またはミオシンＩＩ特異的阻害剤が発見されている。本発明のある特定の態様において、ＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞の培養および継代、および／または幹細胞の分化のために使用され得る。したがって、ＲＯＣＫ阻害剤は、多能性幹細胞が増殖、解離、凝集体形成、または分化、例えば、付着性培養または懸濁培養を経る任意の細胞培養培地内で存在し得る。

【0103】

ＲＯＣＫシグナル伝達経路は、ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅ、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏの下流にある主なエフェクタキナーゼ）、ミオシンＩＩ（ＲＯＣＫの下流にある主要エフェクタ）（Ｈａｒｂ ｅｔ ａｌ．，２００８）、および任意の中間、上流、または下流シグナルプロセッサを含み得る。ＲＯＣＫは、ミオシンホスファターゼ標的サブユニット１（ＭＹＰＴ１）をリン酸化および不活性化し得、ＲＯＣＫの主な下流標的の１つは、ミオシン調節軽鎖（ＭＲＬＣ）の脱リン酸化を通じて、ミオシン機能を負に調節する。

【0104】

Ｒｈｏ特異的阻害剤、例えば、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素、および／またはミオシンＩＩ特異的阻害剤は、本発明のある特定の態様においてＲＯＣＫ阻害剤として使用されてもよい。本明細書において別段の定めがない限り、ミオシンＩＩ阻害剤、例えば、ブレビスタチンは、ＲＯＣＫ阻害剤の実験的使用の代用となり得る。

【0105】

ミオシンＩＩは、筋肉の収縮におけるその役割について最初に研究されたが、非筋肉細胞内でも機能する。ミオシンＩＩ（従来のミオシンとしても知られる）は、２つの重鎖を含有し、それぞれ約２０００アミノ酸長であり、頭部および尾部ドメインを構成する。これらの重鎖のそれぞれは、Ｎ末端頭部ドメインを含有するが、Ｃ末端尾部は、巻かれたコイル形態を取り、２つの重鎖を一緒に保持する（例えば、カドゥケウスにおいて、互いに巻き付いている２匹の蛇を想像されたい）。したがって、ミオシンＩＩは、２つの頭部を有する。４つの軽鎖（１頭部当たり２つ）も含み、頭部と尾部の間の「頸部」領域において重鎖を結合する。これらの軽鎖は、必須軽鎖および調節軽鎖と呼ばれる場合が多い。例示のミオシンＩＩ特異的阻害剤は、ブレビスタチンまたはその類似体であり得る。

【0106】

ＲＯＣＫは、Ｒｈｏの標的タンパク質として機能する、セリン／トレオニンキナーゼである（その３つのアイソフォームが存在する−ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣ）。これらのキナーゼは、ＲｈｏＡ誘導性ストレス線維および接着斑の形成の媒体として最初に特性化された。２つのＲＯＣＫアイソフォーム、ＲＯＣＫ１（ｐ１６０ＲＯＣＫ、ＲＯＫβとも呼ばれる）、およびＲＯＣＫ２（ＲＯＫα）は、Ｎ末端キナーゼドメインに続いて、Ｒｈｏ結合ドメインを含有する巻かれたコイルドメイン、およびプレクストリン相同ドメイン（ＰＨ）からなる。両ＲＯＣＫは、細胞骨格調節因子であり、ストレス線維形成、平滑筋収縮、細胞付着、膜の波打ち、および細胞運動性に対するＲｈｏＡ効果を媒介する。ＲＯＣＫは、ミオシンＩＩ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）、ならびにホスファターゼおよびテンシン相同体（ＰＴＥＮ）等の下流分子を標的とすることにより、それらの生物学的活性を誘起し得る。

【0107】

例示のＲＯＣＫ特異的阻害剤は、Ｙ−２７６３２であり、ＲＯＣＫ１を選択的に標的とする（だけでなくＲＯＣＫ２を阻害する）とともに、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを阻害する。他のＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｈ−１１５２、Ｙ−３０１４１、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、およびＳＢ−７７２０７７−Ｂが挙げられる。Ｄｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（上記）、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）、およびＳａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）は、それぞれその全体が記載されるかのように、参照により本明細書に援用される。

【0108】

ＲＯＣＫ阻害剤の他の非限定的な例としては、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合ペプチド、拮抗薬ペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶフラグメント、優位陰性変異株およびそれらの発現ベクターが挙げられる。さらに、他の低分子化合物がＲＯＣＫ阻害剤として知られているため、かかる化合物またはその誘導体を実施形態において使用することもできる（例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、および同第２００３００８７９１９号、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、および同第２００４／０３９７９６号を参照）。本発明のある特定の態様において、ＲＯＣＫ阻害剤の１つまたは２つ以上の組合せを使用することもできる。

【0109】

いくつかの実施形態により、幹細胞は、培地内のＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤で処理され得る。それにより、本発明の方法において使用される培地は、既にＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含有し得、あるいは代替として、本発明の方法は、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を培地に添加するステップを伴い得る。培地内のＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の濃度は、それが幹細胞の向上した生存率等の所望の効果を達成し得る限り、特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１００、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、またはブレビスタチンは、少なくとも、または約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５００〜約１０００μＭ、またはその中で導き出せる任意の範囲の有効濃度で使用され得る。これらの量は、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の個別の量、あるいは１つ以上のＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤と併せた量を指し得る。

【0110】

ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤で処理するための時間は、それが幹細胞の向上した生存率等の所望の効果が達成され得る期間である限り、特に限定されない。例えば、幹細胞は、解離前の少なくとも、または約１０、１５、２０、２５、３０分〜数時間（例えば、少なくとも、または約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間、またはその中で導き出せる任意の範囲）の間、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の存在下で維持される。解離後、多能性幹細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤で、例えば、少なくとも、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２４、４８時間、またはそれ以上の間処理され、所望の効果を達成する。

【0111】

他の実施形態において、幹細胞は、少なくとも１〜５継代の間、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の存在下で維持される。随意に、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤は、後次に、例えば、約４、８、１２時間後、または約２、約４、または約６日後、あるいはその中で導き出せる任意の範囲後に培養培地から回収される。他の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤は、少なくとも１、２、３、４、５継代またはそれ以上、あるいはその中で導き出せる任意の範囲後に回収される。

【0112】

ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤で処理される幹細胞（複数可）の密度は、それが幹細胞の向上した生存率等の所望の効果が達成され得る密度である限り、特に限定されない。例えば、約１．０×１０^１〜１．０×１０^７細胞／ｍＬ、より具体的には約１．０×１０^２〜１．０×１０^７細胞／ｍＬ、さらにより具体的には約１．０×１０^３〜１．０×１０^７細胞／ｍＬ、および最も具体的には約３．０×１０^４〜２．０×１０^６細胞／ｍＬである。

【0113】

ある特定の実施形態において、幹細胞は、低密度での生存（単一細胞または小凝集体に解離される）、クローン化効率、または継代効率を向上させるように、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の存在下で培養される。本発明のある特定の実施形態において、幹細胞は、支持細胞、支持細胞抽出物、および／または血清の不在下で培養される。幹細胞は、サブクローン化または継代前、例えば、サブクローン化または継代前の少なくとも１時間、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の存在下で培養され得る。代替または付加として、幹細胞は、サブクローン化または継代の間または後にＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の存在下で維持される。

【0114】

ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤で処理される幹細胞は、細胞を予備刺激して神経誘導を向上させた後の解離細胞または非解離細胞であり得る。解離細胞は、細胞解離を促進するように処理された細胞を指す（例えば、後述の解離）。解離細胞は、いくつかの（典型的に約２〜５０、２〜２０、または２〜１０）細胞の小さな細胞塊（凝集体）を形成した単一および複数の細胞を含む。解離細胞は、懸濁（浮遊）細胞または付着性細胞であり得る。例えば、ヒトＥＳ細胞等のＥＳ細胞は、解離（および／または解離後の懸濁培養）等の特定条件の影響を受け易いことがわかった。

【0115】

本発明のある特定の態様は、幹細胞を解離するステップをさらに伴い得る。幹細胞の解離は、任意の既知の手順を使用して行われ得る。これらの手順は、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ）等による処理、および機械的解離等の操作（例えば、ピペット操作）を含む。幹細胞（複数可）は、解離前および／または後にＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤で処理され得る。例えば、幹細胞（複数可）は、解離後にのみ処理されてもよい。

Ｅ．単一細胞の継代

【0116】

多能性幹細胞培養のいくつかの実施形態において、培養容器が充填されると、解離に適した任意の方法により、コロニーは凝集された細胞またはさらに単一細胞に分割され、次いで細胞は、継代するための新しい培養容器に入れられる。細胞継代または分割は、長期間にわたって培養された条件下で、細胞が生存および増殖することを可能にする技法である。細胞は、典型的に、約７０％〜１００％コンフルエントであるときに継代される。

【0117】

多能性幹細胞の単一細胞解離に続く単一細胞の継代は、細胞拡大、細胞分類、および分化の定義された播種を促進する、および培養手順およびクローン拡張の自動化を可能にする等のいくつかの利点を有する本方法において使用され得る。例えば、単一細胞にクローン的に由来する子孫細胞は、遺伝的構造において同種であり、および／または細胞周期において同期され得、標的とされた分化を増加させ得る。単一細胞継代の例示的な方法は、参照により本明細書に援用される、米国特許出願第２００８／０１７１３８５号に記載のとおりであり得る。

【0118】

ある特定の実施形態において、多能性幹細胞は、単一の個別細胞、または単一の個別細胞の組合せ、および２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の細胞を含む、小細胞群に解離され得る。解離は、機械的力、または細胞解離剤、例えば、ＮａＣｉｔｒａｔｅ、あるいは酵素、例えば、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ等により達成され得る。

【0119】

多能性幹細胞の源および拡大の必要性に基づいて、解離細胞は、個別に、または小さな群で新しい培養容器に、例えば、少なくとも、または約１：２、１：４、１：５、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、あるいはその中で導き出せる任意の範囲の分割比で移され得る。懸濁細胞株の分割比は、培養細胞懸濁液の体積に対して行われ得る。継代間隔は、少なくとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日ごと、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。例えば、異なる酵素継代プロトコルに達成可能な分割比は、３〜７日ごとに１：２、４〜７日ごとに１：３、および約７日ごとに１：５〜１：１０、７日ごとに１：５０〜１：１００であり得る。高い分割率が使用される場合、継代間隔は、少なくとも１２〜１４日、過剰な自発分化または細胞死に起因して、細胞喪失なしに任意の期間まで延長され得る。

【0120】

ある特定の態様において、単一細胞継代は、クローン化効率および細胞の生存を増加させるために有効な小分子、例えば、上述のＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤の存在下であり得る。かかるＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、またはブレビスタチンは、有効な濃度、例えば、少なくとも、または約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０〜約１００μＭ、あるいはその中で導き出せる任意の範囲で使用され得る。

Ｆ．幹細胞の分化

【0121】

多能性幹細胞の神経分化効率を向上するための方法が提供され得る。多能性幹細胞の分化は、例えば、付着コロニー内で、または細胞凝集体の形成により、例えば、低付着環境内で、多様な方法で誘導され得、それらの凝集体は、胚葉体（ＥＢ）と称される。分子および細胞形態シグナル、ならびにＥＢ内の事象は、胚の発達においてかかる細胞の自然な個体発生の多くの態様を模倣する。

【0122】

胚葉体（ＥＢ）は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に由来する細胞の凝集体であり、マウス胚幹細胞を用いて長年研究されている。インビボ分化に固有のキューのいくつかを反復するために、本発明のある特定の態様は、三次元凝集体（すなわち、胚葉体）を中間ステップとして用い得る。細胞凝集体の開始時に、分化が開始され得、細胞は、限られた範囲内で胚の進化を反復し始める場合がある。それらは栄養外胚葉組織（胎盤を含む）を形成することはできないが、有機体に存在する事実上すべての他の種類の細胞が進化し得る。本発明は、神経分化に続く凝集体形成をさらに促進し得る。

【0123】

細胞凝集は、懸滴すること、非組織培養処理したプレートまたはスピナーフラスコ上に播種することにより課され得、いずれかの方法は、細胞が表面に付着して、典型的なコロニー増殖を形成することを防ぐ。上述のとおり、ＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤は、多能性幹細胞を培養するための凝集体の形成前、形成中、または形成後に使用され得る。

【0124】

多能性幹細胞は、細胞培養の技術分野において知られている任意の方法を使用して、凝集促進培地に播種され得る。例えば、多能性幹細胞は、単一のコロニーまたはクローン群として凝集促進培地に播種され得、多能性幹細胞は、本質的に個別の細胞として播種され得る。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、当該技術分野において知られている機械的または酵素的方法を使用して、本質的に個別の細胞に解離される。非限定的な例として、多能性幹細胞は、細胞と培養表面との間、ならびに細胞間の接続を妨害する、タンパク質分解酵素に曝露され得る。凝集体形成および分化のための多能性幹細胞を個別化するために使用され得る酵素としては、その様々な商用剤形のトリプシン、例えば、ＴｒｙｐＬＥ、またはＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）等の酵素の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0125】

ある特定の実施形態において、多能性細胞は、培養表面上の培養形成のために、本質的に個別の（または分散された）細胞として、培養培地に添加または播種され得る。細胞が播種される培養培地は、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦ等の増殖因子を好ましくは本質的に含まない培地を含み得る。

【0126】

例えば、分散された多能性細胞は、約１０^４細胞／ｍＬ〜約１０^１０細胞／ｍＬの密度で培養培地に播種される。より具体的に、多能性細胞は、約１０^５細胞／ｍＬ〜約１０^７細胞／ｍＬ、または約０．５×１０^６細胞／ｍＬ〜約３×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種される。これらの実施形態において、培養表面は、当該技術分野において標準的な無菌細胞培養法と適合する任意の材料、例えば、非付着性表面から本質的になり得る。培養表面は、本明細書に記載されるマトリックス成分を付加的に含み得る。ある特定の実施形態において、マトリックス成分は、表面を細胞および培地と接触させる前に、培養表面に適用され得る。

【0127】

ある特定の実施形態において、付着性培養された多能性幹細胞は、ＴＧＦβおよびｂＦＧＦを本質的に含まない予備刺激培地に徐々に移行され得る。次いで予備刺激された細胞は、懸濁培養液中で凝集体に関連付けるように誘導され、神経系統にさらに分化され得る。

【0128】

この方法は、インビトロでの星状細胞への細胞の分化をさらに含み得る。ある特定の態様において、新規の予備刺激ステップは、他の神経分化手順より迅速かつ高い純度で神経分化を強化し得る。さらに、予備刺激された幹細胞からの星状細胞形成は、他の星状細胞生成手順と比較してはるかに速く、高い純度の星状細胞を産出する。多能性幹細胞由来の神経系統細胞からの星状細胞の分化は、増殖に至る一連の生物学的事象のカスケードを活性化する当該技術分野において知られる任意の方法により誘導され得、これにはイノシトール三リン酸塩および細胞内Ｃａ^２＋の解放、ジアシルグリセロールの解放、ならびにタンパク質キナーゼＣおよび他の細胞キナーゼの活性化等が挙げられる。ホルボールエステル、分化誘導増殖因子、および他の化学シグナルによる処理は、分化を誘導し得る。分化は、ポリ−Ｌ−リシンおよびポリ−Ｌ−オルニチン等のイオン負荷した表面で被覆されたフラスコ、プレート、またはカバースリップ等の播種された基質上に細胞を置くことにより誘導することもできる。

【0129】

コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、マトリゲル等の他の基質を使用して、分化を誘導し得る。分化は、増殖を再開することなく（すなわち、神経球を解離することなく）、増殖誘導増殖因子の存在下で、細胞を懸濁液中に残すことにより誘導することもできる。

【0130】

１つの例示的な方法は、培養培地内の播種基質上で細胞を培養することを含む。次いで増殖誘導増殖因子は、細胞に投与され得る。増殖誘導増殖因子は、細胞を基質（例えば、ポリオルニチン処理されたプラスチックまたはグラス）に付着させ、平坦にし、異なる細胞型への分化を開始させることができる。

【0131】

培養培地は、星状細胞の形成を増強するために、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清を０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、１５．０％（またはその中で導き出せる任意の範囲で）含有し得るが、ある特定の用途の場合、定義された条件が必要であれば、血清は使用されない。凝集体からのさらなる分化の開始後約２０、３０、４０、５０、６０日以内に、細胞子孫の大部分またはすべては、当該技術分野においてよく知られている免疫細胞化学技法により決定される、星状細胞に特異的な抗原を発現し始める場合がある。

ＩＶ．シグナル伝達阻害剤

【0132】

本発明のある特定の態様において、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤は、神経細胞への幹細胞の分化に使用されてもされなくてもよい。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤としては、骨形成タンパク質のシグナル伝達経路の１つ以上の調節因子、アクチビンＡ／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ相同体１（ＤＫＫ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0133】

特定の態様において、分化の間にＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤を添加する必要性は、予備刺激培養条件、特に外部から添加されたＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達調節因子およびｂＦＧＦを本質的に含まない条件において、多能性幹細胞を培養することにより排除され得る。

【0134】

特定の態様において、ある特定の多能性幹細胞株およびクローンは、高純度および効率で発生するために、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤が、神経分化のための予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化の間に存在する必要があり得る。さらに、この要件は、過程の予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化部分の１つ以上の時点で、ＦＧＦ８が培地内に含まれる場合に除去され得る。

【0135】

幹細胞は、後生動物体の多数の胚および成体細胞型を生成する際に、自己再生能力および多能性を呈する（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００８により検討される）。増殖因子、例えば、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦ、およびｂＦＧＦは、幹細胞自己再生および分化を調節する。

【0136】

形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーシグナル伝達経路は、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、細胞ホメオスタシス、および他の細胞機能を含む、成体有機体および進化している胚の両方における多くの細胞過程に関与する。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路が調節する広範な細胞過程に関わらず、この過程は、比較的単純である。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドは、Ｉ型受容体を採用およびリン酸化するＩＩ型受容体に結合する。次いでＩ型受容体は、受容体調節されたＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ）をリン酸化し、ここでｃｏＳＭＡＤ ＳＭＡＤ４を結合することができる。Ｒ−ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は、それらが転写因子として作用し、標的遺伝子発現の調節に関与する核内に蓄積する。

【0137】

ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、またはＦＧＦ−βとしても知られる塩基性線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。培養物内でマウスおよびヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）自己再生を支持する、最も広く使用される増殖因子であるＦＧＦ２は、ＢＭＰ様活動を抑制する一方で、ＴＧＦβ／アクチビン／ノーダル／ＧＤＦリガンド、および受容体を誘導する（Ｇｒｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。さらに、アクチビン／ＧＤＦ／ＴＧＦβ／ノーダルＩ型受容体ファミリーの製薬学的阻害剤は、ヒトおよびマウスＥＳＣ自己再生を抑制する（Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。一般に、ＴＧＦβアクチビン／ノーダル／ＧＤＦは、多能性前駆体細胞の分化を阻害するが、ＢＭＰは、それらの分化を誘導する（Ｗａｔａｂｅ ａｎｄ Ｍｉｙａｚｏｎｏ，２００９）。

【0138】

ＥＳＣの自己再生を促進するために、ＴＧＦβ／ノーダル／アクチビン／ＧＤＦシグナル伝達は、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を活性化し、重要な幹細胞転写因子の１つである、Ｎａｎｏｇを直接誘導する（Ｘｕ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＴＧＦβスーパーファミリーおよびＦＧＦシグナル伝達は、Ｓｍａｄ複合体のＮａｎｏｇプロモータへの結合を強化することにより相乗作用を与える。驚くべきことに、ＮＡＮＯＧは、ＥＳＣ内のＴＧＦβ（自己再生因子）とＢＭＰ（分化因子）との間の拮抗薬に分子結合を提供する。Ｎａｎｏｇは、ＳＭＡＤ１に結合し、その転写活性を阻害して、初期中胚葉分化または進化後期の組織特異的分化を促進するＢＭＰシグナル伝達能を制限する（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。この例は、これらの経路の転写およびシグナル伝達因子のゲノム全体の解析結果として、ＥＳＣ自己再生および分化の付加調節因子に拡張される可能性がある（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0139】

リガンドのＴＧＦβスーパーファミリーは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、ノーダル、およびＴＧＦβを含む。シグナル伝達は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドのＴＧＦβＩＩ型受容体への結合から始まる。ＩＩ型受容体は、セリン／トレオニン受容体キナーゼであり、Ｉ型受容体のリン酸化を触媒する。各リガンド群は、特定のＩＩ型受容体に結合する。哺乳類において、７つの既知のＩ型受容体および５つのＩＩ型受容体がある。

【0140】

３つのアクチビン：アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢがある。アクチビンは、胚発生および骨形成に関与する。これらは、下垂体、生殖腺、および視床下部ホルモン、ならびにインスリンを含む多くのホルモンも調節する。それらは、神経細胞生存因子でもある。

【0141】

ＢＭＰは、骨形成タンパク質受容体２型（ＢＭＰＲ２）に結合する。それらは、骨形成、細胞分化、前方／後方軸特定化、増殖、およびホメオスタシスを含む多くの細胞機能に関与する。

【0142】

ＴＧＦβファミリーは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３を含む。ＢＭＰと同様に、ＴＧＦβは、胚発生および細胞分化に関与するが、それらはアポトーシスならびに他の機能にも関与する。それらはＴＧＦβ受容体２型（ＴＧＦＢＲ２）に結合する。

【0143】

ノーダルは、アクチビンＡ受容体、ＩＩＢ型ＡＣＶＲ２Ｂに結合する。次いで、アクチビンＡ受容体ＩＢ型（ＡＣＶＲ１Ｂ）またはアクチビンＡ受容体ＩＣ型（ＡＣＶＲ１Ｃ）のいずれかを有する受容体複合体を形成することができる。

【0144】

ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路（表１）は、広範な細胞過程に関与し、後次に極めて重度に調節される。経路が正負両方で調節される多様な機序があり、リガンドおよびＲ−ＳＭＡＤの作用薬があり、デコイ受容体があり、またＲ−ＳＭＡＤおよび受容体はユビキチン化される。

【表1】

【0145】

本明細書で使用するとき、「ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー」または同様の用語は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知のメンバーとの相同性、またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知のメンバーとの機能の類似性に起因して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するとして、当業者により一般に特性化される増殖因子を指す。本発明の特定の実施形態において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーが存在する場合、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの変異型またはその機能フラグメントは、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦブランチに対してＳＭＡＤ２または３を活性化し、ＢＭＰブランチに対してＳＭＡＤ１、５、または８を活性化する。ある特定の実施形態において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）、および骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）からなる群から選択される。一実施形態において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、アクチビンＡである。

【0146】

ある特定の実施形態において、組成物および方法は、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達の阻害剤もしくは不活性化剤の存在または不在下での条件を含む。本明細書で使用するとき、「アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達の阻害剤または不活性化剤」は、１つ以上のアクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦタンパク質、またはその可能なシグナル伝達経路のいずれかを通じてそれらの上流または下流シグナル伝達成分のいずれかの活性を無効にする薬剤を指す。非限定的な例としては、ＳＢ−４３１５４２が挙げられる。

【0147】

ある特定の実施形態において、組成物および方法は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤または不活性化剤の存在または不在下での条件を含む。本明細書で使用するとき、「ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤または不活性化剤」は、１つ以上のＢＭＰタンパク質、またはその可能なシグナル伝達経路のいずれかを通じてそれらの上流または下流シグナル伝達成分のいずれかの活性を無効にする薬剤を指す。ＢＭＰシグナル伝達を不活性化するために使用される化合物（複数可）は、当該技術分野において既知であるか、または今後発見される任意の化合物であり得る。ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例としては、ドルソモルフィン、優位陰性切断ＢＭＰ受容体、可溶性ＢＭＰ受容体、ＢＭＰ受容体−Ｆｃキメラ、ノギン、ホリスタチン、コルジン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン、高用量アクチビン、および無羊膜が挙げられる。

Ｖ．非静的培養

【0148】

ある特定の態様において、非静的培養は、多能性幹細胞の培養および分化に使用され得る。懸濁培養液を使用して、大規模なＥＢおよび後次に分化細胞を生成することができるが、静的培養は、形成されるＥＢの大きさおよび形状をほとんど制御せず、これはそこから分化される細胞の収率および品質に直接影響を及ぼす。非静的培養は、プラットホームまたは培養容器、特に大容量回転バイオリアクターを使用する、例えば、振とう、回転、または攪拌することにより、制御された移動速度で保持される細胞を有する任意の培養であり得る。攪拌は、栄養素および細胞廃棄物の循環を向上させ得、より均一な環境を提供することにより、細胞攪拌を制御するように使用され得る。例えば、回転速度は、少なくとも、または最大約２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００ｒｐｍ、またはその中で導き出せる任意の範囲に設定され得る。多能性幹細胞、細胞凝集体、分化した幹細胞、またはそこから派生する子孫細胞の非静的培養における培養期間は、少なくとも、または約４時間、８時間、１６時間、または１、２、３、４、５、６日、または１、２、３、４、５、６、７週間、あるいはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。

ＶＩ．ニューロン系統の特性化

【0149】

神経細胞を同定し、神経系統に対する分化効率を決定し、神経細胞を選択または単離するか、または神経細胞を富化するために、神経系統の特徴が評価され得る（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0150】

特定の実施形態において、培養された細胞を含む前駆体神経系統細胞は、ネスチン、Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６、ＦＯＲＳＥ−１、Ｎ−ＣＡＤ、ＣＤ１３３、ＦＯＸＧ１、および３ＣＢ２の検出可能なマーカーの１つ以上を発現することにより特性化され得る。かかる細胞の培養は、本明細書に記載の方法により、または今後開発される他の方法により生成され得る。特定の実施形態において、培養された細胞を含む成熟神経細胞は、Ｄｃｘ、ＭＡＰ−２、シナプシン１、ＴｕＪ１、ＮＳＥ、Ｍａｐ２ａ、Ｇａｐ４３、ＮＦ、ＣＤ２４、ＣＤＨ２／ＣＤ３２５、シナプトフィシン、およびＣＤ５６／ＮＣＡＭの検出可能なマーカーの１つ以上を発現することにより特性化され得る。かかる細胞の培養は、本明細書に記載の方法により、または今後開発される他の方法により生成され得る。

【0151】

神経細胞は、いくつかの表現型基準により特性化することができる。この基準は、形態的特徴の顕微鏡観察、発現した細胞マーカー、酵素活性、神経伝達物質、およびそれらの受容体の検出または定量、ならびに電気物理的機能を含むが、これらに限定されない。

【0152】

本発明において実現されるある特定の細胞は、ニューロン細胞に特徴的な形態的特徴を有する。これらの特徴は、当業者により認識される。例えば、ニューロンは、小細胞体、ならびに軸索および樹状細胞を連想させる複数の突起を含む。

【0153】

神経細胞は、それらがドーパミン作動性ニューロン（マーカーはＴＨ、ＡａＤＣ、Ｄａｔ、Ｏｔｘ−２、およびＶＭＡＴ２を含む）、コリン作動性ニューロン（マーカーは、ＮＧＦ、ＣｈＡＴを含む）、ＧＡＢＡ作動性ニューロン（マーカーは、ＧＡＤ６７およびｖＧＡＴを含む）、グルタミン作動性ニューロン（マーカーはｖＧＬＵＴ１を含む）、セロトン作動性ニューロン、モーターニューロン（マーカーはＨＢ９、ＳＭＮ、ＣｈＡＴ、ＮＫＸ６を含む）、感覚ニューロン（マーカーはＰＯＵ４Ｆ１およびペリフェリンを含む）、星状細胞（マーカーはＧＦＡＰおよびＴａｐａ１を含む）、およびオリゴデンドロサイト（マーカーはＯ１、Ｏ４、ＣＮＰａｓｅ、およびＭＢＰを含む）を含むが、これらに限定されない特定種の神経細胞を特徴とする表現型マーカーを発現するかどうかによっても特性化され得る。

【0154】

また特定の神経亜型、特に末端分化した細胞、例えば、ドーパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性、グルタミン作動性、セロトン作動性、およびコリン作動性ニューロンに特徴的であるのは、神経伝達物質の生合成、放出、および取り込みに関与する受容体および酵素、ならびにシナプス伝達に関連する脱分極および再分極に関与するイオンチャネルである。シナプス形成の証拠は、シナプトフィシンの染色により得られ得る。ある特定の神経伝達物質に対する受容性の証拠は、γアミノブチル酸（ＧＡＢＡ）、グルタミン酸塩、ドーパミン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ノルアドレナリン、アセチルコリン、およびセロトニンの受容体を検出することにより得られ得る。

【0155】

特定の態様において、星状細胞を提供するための方法が提供され得る。星状細胞は、中枢神経系内のグリア細胞の亜型である。それらは星状グリア細胞としても知られる。星形をしたそれらの多くの突起は、ニューロンにより形成されたシナプスを被覆する。星状細胞は、組織学的分析を使用して従来同定され、これらの細胞の多くは、中間フィラメントグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現する。星状細胞の３つの形態は、ＣＮＳ、線維、原形質、および橈骨神経に存在する。線維性グリアは、通常、白質内に位置し、オルガネラが比較的少なく、長い未分枝細胞突起を呈する。この種は、多くの場合、細胞が近位にあるときに、細胞を毛細壁の外側に物理的に接続する「血管フィート」を有する。原形質グリアは、灰質組織において認められ、大量のオルガネラを有し、短く高度に分枝した三次突起を呈する。橈骨神経グリアは、心室の軸に垂直な平面に配置される。それらの突起の１つは軟膜を中心とするが、灰質に深く埋め込まれるものもある。橈骨神経グリアは、進化の間に大部分が存在し、ニューロンの遷移において役割を果たす。網膜のミュラー細胞および小脳皮質のＢｅｒｇｍａｎｎグリア細胞は、成体期の間も存在するという例外を示す。軟膜の近位にあるときに、星状細胞の３つの形態はすべて、突起を出して軟膜−グリア膜を形成する。

ＶＩＩ．細胞の遺伝子変化

【0156】

本発明の細胞は、分化前、分化中、または分化後のいずれかに、細胞の遺伝子操作により１つ以上の遺伝子変化を含有するように形成され得る（米国特許公開第２００２／０１６８７６６号）。ポリヌクレオチドが人工的操作の任意の適切な手段により細胞に移されるとき、または細胞がポリヌクレオチドを継承したもともと改変されている細胞の子孫である場合、「遺伝子的に改変される」または「遺伝子組み換えされる」と言われる。例えば、細胞は、それらが制限された発生系統の細胞または末端分化した細胞に進化する前または後のいずれかに、テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように細胞を遺伝的に改変することにより、それらの複製能を増加させるように処理され得る（米国特許公開第２００３／００２２３６７号）。

【0157】

細胞の遺伝子操作には多様な機序が用いられ得る。例えば、統合がゲノム内の本質的にランダムな部位（複数可）で起こる場合において、ポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、アデノ関連ウイルスベクター（機能的Ｒｅｐ遺伝子なし）内で、またはトランスポゾン系の一部として（例えば、ピギーバックベクター）導入され得る。他の態様において、ポリヌクレオチドは、選択されたゲノム部位に統合され、例えば、核酸は、ＡＡＶＳ１統合部位において統合され得る（例えば、機能的Ｒｅｐ遺伝子の存在下でアデノ関連ウイルスベクターを使用することにより）。同様に、ある特定の態様において、選択されたゲノム部位での統合は、相同的組み換えにより行われ得る。哺乳類細胞における標準ＨＲの効率は、処理される細胞の１０^−６〜１０^−９のみである（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９９０）。メガヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｉ−Ｓｃｅｌの使用は、ＨＲの効率を高めるために使用されている。天然メガヌクレアーゼならびに修飾された標的特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼはいずれも、ＨＲ効率を高めるために利用されている（Ｐｉｎｇｏｕｄ ａｎｄ Ｓｉｌｖａ，２００７、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＨＲの効率を高めるための別の道は、プログラム可能なＤＮＡ特異性ドメインを有するキメラエンドヌクレアーゼを操作することである（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、かかるキメラ分子の一例であり、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、ＦｏｋＩ等のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合される（Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ，２００５、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０６０６において検討される）。かかる特異性分子の別の群は、ＦｏｋＩ等のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合された転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１：国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００１５４）。本明細書で使用するとき、選択されたゲノム部位での統合は、ゲノム内の２つの連続するヌクレオチド位の間、または連続しない２つのヌクレオチド位の間の核酸分子（またはその一部）の挿入を含み得る（例えば、介在するゲノム配列の置換をもたらす）。例えば、選択されたゲノム部位における核酸の統合は、遺伝子エクソン、イントロン、プロモータ、コード配列、または遺伝子全体の置換を含み得る。

【0158】

また本発明の細胞は、組織再生に関与する能力、または投与部位に治療的遺伝子を送達する能力を強化するために、遺伝子的に改変され得る。例えば、ベクターは、所望の遺伝子に対して既知のコード配列を使用して設計され、神経特異的なプロモータに操作可能に結合される。

【0159】

本発明のある特定の実施形態において、所望の核酸構成を含有する細胞は、発現ベクター内に、例えば、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー等のマーカーを含むことにより、インビトロまたはインビボで同定され得る。かかるマーカーは、細胞への同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にするか、または組織特異的なプロモータを使用することにより、分化した神経細胞の富化または同定を助ける。例えば、ＴｕＪ−１、Ｍａｐ−２、Ｄｃｘ、シナプシン、エノラーゼ２、グリア細胞線維性酸性タンパク質、またはチューブリンα−１Ａ鎖を含むが、これらに限定されないニューロン特異的なプロモータが使用され得る。

【0160】

一般に、選択可能マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択可能マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであるが、負の選択可能マーカーは、その存在がその選択を防ぐものである。正の選択可能マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。通常、薬物選択マーカーの包含は、形質転換細胞のクローニングおよび同定を支援し、例えば、ブラスチシジン、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールへの耐性を付与する遺伝子は、有用な選択可能マーカーである。

【0161】

条件の実施に基づいて形質転換細胞の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、ＧＦＰ等のスクリーニング可能なマーカーを含み、その基礎が比色分析である、他の種のマーカーも考慮される。代替として、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等のスクリーニング可能な酵素が利用され得る。当業者は、恐らくＦＡＣＳ分析と併せて、免疫学的マーカーを用いる方法も把握している。このマーカーは、遺伝子生成物をコードする核酸と同時に発現することができる限り使用され得る。選択可能かつスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者によく知られている。

ＶＩＩＩ．神経細胞または神経細胞型の使用

【0162】

本発明の方法を使用して生成されたヒト神経細胞（星状細胞等の神経細胞型を含む）は、多様な用途を有する。特に、神経細胞は、核移植技術の核材料の源として使用することができ、移植のための器官の細胞、組織、または成分を生成するために使用することができる。本発明は、本発明の神経細胞がヒト細胞治療またはヒト遺伝子治療において使用されて、パーキンソン病、ハンチントン病、リソソーム蓄積病、多発性硬化症、記憶および行動障害、アルツハイマー病、てんかん、発作、黄斑変性、および他の網膜症を含むが、これらに限定されない神経疾患または障害を有する患者を治療し得ると考える。

【0163】

これらの細胞は、脊髄損傷、脳卒中、または他の神経外傷から生じる神経系傷害の治療において使用することもできるか、または手術、化学療法、薬物またはアルコール乱用、環境毒素および汚染により誘発される神経疾患および損傷を治療するために使用することができる。これらの細胞は、傷害、糖尿病、自己免疫障害、または循環系障害と関連付けられる末梢神経障害の治療においても有用である。これらの細胞を使用して、神経分泌系、ならびに交感神経系および副交感神経系を含む自律神経系の疾患または障害を治療し得る。

【0164】

好適な実施形態において、治療上有効な量の神経細胞または神経細胞内で富化された細胞培養物は、神経疾患のある患者に投与される。本明細書で使用するとき、「治療上有効な量」という用語は、神経疾患、障害、神経系傷害、損傷、または神経疾患の症状の１つを少なくとも軽減するために十分な細胞の数を指す。

【0165】

本発明の神経細胞は、神経分化もしくは生存に対する分子の効果を試験する際、毒性試験において、または神経もしくはニューロン機能に対するそれらの効果について分子を試験する際にも使用され得る。これは、神経またはニューロン分化、発達、生存、可塑性、または機能に影響する特定の特性を有する因子を同定するためのスクリーンを含み得る。本出願において、細胞培養物は、神経幹細胞、神経前駆体、または分化した神経もしくはニューロン細胞型と相互作用し、その生物学に影響する新しい薬物および化合物の発見、開発、および試験において優れた利用性を有し得る。神経細胞は、軸誘導、神経変性疾患、ニューロン可塑性、ならびに学習および記憶を含むが、これらに限定されない神経発達および機能不全の細胞および分子的根拠を同定するように設計された研究においても優れた利用性を有し得る。かかる基礎的神経生物学研究は、これらの過程の新規分子成分を同定し、既存の薬物および化合物に新規の用途を提供すると同時に、新しい薬物標的または薬物候補を同定し得る。

【0166】

神経細胞内で富化された神経細胞またはヒト細胞培養物は、脳移植に続いてインビボで分散および分化し得る。特に、脳室内移植に続いて、細胞は、脳室壁に沿って広く分散し、上衣下層に移動することができ得る。細胞はさらに、脳の未治療（例えば、注入により）側、視床、前頭皮質、尾状核被殻、および小隆起を含むが、これらに限定されない部位を含む、脳のより深い領域に移動することができる。さらに、神経細胞または神経細胞内で富化されたヒト細胞培養物は、神経組織に直接注入され得、続いて注入部位から細胞の分散を伴う。これは、中枢神経系または末梢神経系の任意の領域、核、神経叢、神経節、または構造を含み得る。

【実施例】

【0167】

ＩＸ．実施例
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示される技法が、本発明の実践において良好に機能することが本発明者により発見された技法を表し、したがって、その実践の好適な様式を構成すると考慮され得る。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでもなお同様または類似の結果を得ることができることを理解する。

（実施例１）
分化前のｉＰＳ細胞の予備刺激は優れた神経誘導をもたらす

【0168】

細胞凝集体または胚様体（ＥＢ）の懸濁培養による機能性ニューロンへの多能性細胞培養物の分化は、変動性の高い過程である。ＴＧＦβ阻害剤（例えば、ＳＢ−４３１５４２、ドルソモルフィンまたはノギン（これらもまたＢＭＰ阻害剤である））を使用する現在公開されている方法による神経分化の成功は、使用される細胞株ならびに多能性細胞培養方法および培地に依存し、継代間で変動し得る。

【0169】

ここで多能性細胞は、凝集体／ＥＢ形成前に増殖因子を含まない培地において「予備刺激」され、ＴＧＦβスーパーファミリーの小分子阻害剤（例えば、アクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦ分枝およびＢＭＰ分枝）を使用せずに、非常に効率的な分化をニューロン系統にもたらした（９５％超の純度）。この予備刺激法は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の２つの阻害剤を使用する、公開された文献に基づく方法を対照とする（ＢＭＰシグナル伝達阻害剤およびアクチビン／ノーダル／ＴＧＦβ／ＧＤＦシグナル伝達阻害剤：米国特許公開第２０１１０２２９４４１号および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４４８７）。図１Ａは、ＴｅＳＲ培地内で凝集体を形成する（８０％ １Ｘ ＴｅＳＲ、２０％ ＴｅＳＲ１ ５Ｘサプリメント）、９９％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１％ Ｎ２ ５０Ｘサプリメント培地に凝集体を移す、および凝集体を１０μＭ ＳＢ−４３１５４２および１μＭドルソモルフィンで処理する方法を使用して、分化された細胞の純度を示す。図１Ｂは、９０％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１％ Ｎ２ ５０Ｘサプリメント培地内で、凝集体形成前の３日間、多能性細胞を予備刺激することにより生成された培養物の純度を示す（−３日目＝４０％ １Ｘ ＴｅＳＲ、１０％ ＴｅＳＲ１ ５Ｘサプリメント、４９．５％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、０．５％ Ｎ２ １００Ｘサプリメント：−２日目および−１日目＝９９％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１％ Ｎ２ １００Ｘサプリメント）。ＳＢ４３１５４２およびドルソモルフィンは使用されなかった。純度は、β_ＩＩＩチューブリンを関与ニューロンマーカーとして使用し、ネスチンを神経前駆体マーカーとして使用するフローサイトメトリーにより決定された。

（実施例２）
ＤＭＥＭ−Ｆ１２およびＮ２サプリメントを用いた予備刺激による神経誘導は、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβの除去に起因する

【0170】

多能性細胞は、通常、多能性の維持のための主な増殖因子として、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβを含有する、ｍＴｅＳＲ培養培地内で維持される。ＴｅＳＲは、基礎培地としてのＤＭＥＭ−Ｆ１２からなり、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβに加えて、インスリン、ホロトランスフェリン、およびセレニウムも含有する。Ｎ２サプリメントは、インスリン、ホロ−トランスフェリン、セレニウム、プロゲステロン、およびプトレシンを含有する。Ｎ２サプリメント内の個別の成分の濃度は、供給者により変動し得る。１Ｘ Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に多能性細胞を徐々に移行することは、長期間にわたってｂＦＧＦおよびＴＧＦβ増殖因子の利用可能性を低減し、他の成分における変化はほとんどない。ｍＴｅＳＲ内で著しいレベルで利用可能でない１Ｘ Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地内に存在する唯一の成分は、プロゲステロンおよびプトレシンである。Ｎ２サプリメント内に存在する特定成分が神経誘導の増加に関与するかどうかを調査するために、実施例１に詳述されるように、凝集体形成前に、様々な供給者からのＮ２または市販のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、およびセレニウム）溶液のいずれかを補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２培地、ならびに追加のサプリメントを含まない単独ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地内でそれらを培養することにより、多能性細胞を３日間予備刺激した。結果は、２Ｄ形式で予備刺激されたすべての条件が、９５％以上のニューロンを呈した培地をもたらしたことを示した（図２Ａ〜２Ｄ）。これらの結果は、予備刺激の作用の主な機序は、３Ｄ凝集体形成前のｂＦＧＦおよびＴＧＦβ増殖因子濃度の段階的な低減であることを示す。

（実施例３）
ニューロン生成手順

【0171】

ｉＰＳ細胞は、ＴｅＳＲ培地内のマトリゲル（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびクエン酸ナトリウム上で維持され、凝集体形成前に１継代分裂し、Ｔ１５０フラスコ内で増殖されるが、他の培養形式の開始細胞に対して拡大縮小され得る。可変濃度のＴＧＦβおよび／またはｂＦＧＦを含有する代替多能性細胞培養培地（例えば、Ｅ８培地、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を使用して、異なるｉＰＳ細胞株またはクローンの神経分化を最適化することができる。次いで多能性細胞培養物を、凝集体形成前の３または４日間、分化のために「予備刺激」した。細胞の予備刺激は、１Ｘ Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２に細胞を段階的に移行することを伴い、これはＴＧＦβおよびｂＦＧＦを含有しない。予備刺激プロトコルの例は、上記からのクエン酸ナトリウム分割細胞を、−４および−５日目の間（凝集体形成の開始について参照される）、８０％ １Ｘ ＴｅＳＲ／２０％ ＴｅＳＲ１ ５Ｘサプリメントおよび１０μＭブレビスタチン内で培養することと、消費した培地を−３日目に除去することと、細胞を１日神経移植培地（４０％ １Ｘ ＴｅＳＲ、１０％ ＴｅＳＲ１ ５Ｘサプリメント、４９．５％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、０．５％ Ｎ２ １００Ｘサプリメント）内で培養することと、消費した培地を−２日目に除去することと、細胞を−２および−１日目に神経誘導培地（９９％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１％ Ｎ２ １００Ｘサプリメント）内で、−１日目に培地変化を伴って培養することと、を含む。予備刺激後の例示の神経誘導手順に関する詳細は、以下に提供される。

【0172】

ニューロン分化過程の０日目に（具体的には、凝集体形成）、Ｔ１５０フラスコから細胞を採取し（一度に最大５個のフラスコ）、培地が吸引された後、１２ｍＬの温かいＴｒｙｐＬＥを各フラスコに添加し、細胞を３７℃で７分間インキュベートする。一方で、各Ｔ１５０に１本の５０ｍＬ円錐管を、１２ｍＬ９０％１Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２／１０％ ＦＢＳを添加することにより調製する。７分間のインキュベーション後に、単一細胞溶液への静かな滴定により細胞を解離し、細胞溶液を調製した５０ｍＬ管に移す。細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを吸引する。各ペレットは、少なくとも２０ｍＬの凝集体形成培地（９９％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０μＭブレビスタチンを含む１％ Ｎ２ １００Ｘサプリメント）内で再懸濁する。管は組み合わされてよく、細胞をカウントする（ＣＥＤＥＸ ＨｉＲＥＳ細胞カウンター）。細胞は、凝集体形成培地（上記参照）を含むＴ２５およびスピナーフラスコのいずれの場合も１ｍＬ当たり１．０×１０^６細胞に希釈される。濃縮された細胞懸濁液は、適切な体積の凝集体形成培地とともに、スピナーフラスコに直接添加され得る。希釈された細胞ストックをカウントする（ＣＥＤＥＸ ＨｉＲＥＳ細胞カウンター）。５ｍＬの希釈された細胞ストックは、Ｔ２５ＵＬＡフラスコに注ぎ、１２５ｍＬまたは１Ｌの希釈された細胞ストックは、１２５ｍＬまたは１Ｌのスピナーフラスコにそれぞれ注ぐ。希釈された細胞を含む各フラスコは、７％ ＣＯ_２を含む３７℃インキュベーター内のロッカーまたはスピナーベース上に置く。ロッカーは、Ｔ２５の場合、約１５ＲＰＭで回転する必要があり、スピナーフラスコは、７０ＲＰＭ（１２５ｍＬスピナーの場合）または４０ＲＰＭ（１Ｌスピナーの場合）で動作する磁気攪拌プラットホーム上に置く必要がある。

【0173】

１日目に、Ｔ２５フラスコ内の細胞は、細胞培養フード内の縁部で各フラスコを、角度をつけて動かすことにより供給され、懸濁した凝集体がフラスコまたはスピナーフラスコの底に１０分間沈殿することを可能にする。消費された培地を吸引し、Ｔ２５の場合、細胞に５ｍＬの神経誘導培地（９９％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１％ Ｎ２ １００Ｘサプリメント）、１２５ｍＬスピナーフラスコの場合、約１００ｍＬ、および１Ｌスピナーフラスコの場合約８００ｍＬが供給される。７％ ＣＯ_２を含む３７℃のインキュベーターにフラスコを戻す。２日目〜６日目の各日に、フラスコを処理し、培地を同一方法でリフレッシュする。７日目から、一日おきに新しい神経誘導培地を細胞に供給することを除いて、同一方法でフラスコを処理する。１４日目は、凝集体解離および２Ｄ培養容器への個別化した細胞の播種に最適な日である。凝集体は、円錐管に移され、遠心分離機において１２００ＲＰＭで３０秒間回転することにより分注する。上澄みを吸引し、５ｍＬの凝集体培養当たり１ｍＬの温かいＴｒｙｐＬＥを添加し、３７℃の温浴中で５〜８分間インキュベートする。静かに分注することにより、細胞の第１の管の解離を評価する。凝集体が容易に分解する場合、ＴｒｙｐＬＥを当量の９０％１Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２／１０％ ＦＢＳで急冷する。凝集体が容易に分解しない場合は、より長くインキュベートし、次いで解離を再度評価した後に急冷する。Ｐ１０００ピペットマンまたは血清学ピペットを使用して、凝集体を静かに解離する。細胞は、１２００ＲＰＭで５分間、遠心分離機内でペレット操作される。細胞を２．３ｍＬ（またはスピナーフラスコに対して拡大縮小される）の神経播種培地（９８％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２％ Ｂ２７ ５０Ｘサプリメント、１０μＭブレビスタチン）内で再懸濁する。懸濁液中の細胞をＣＥＤＥＸ上でカウントし、神経播種培地を用いて、濃度を１．０×１０^６細胞／ｍＬに調整する。ＣＥＤＥＸ上で再度細胞をカウントする。マトリゲルで被覆された６ウェルプレートの各ウェルに（ウェル当たり約２００万細胞で播種される）、２ｍＬの細胞懸濁液を添加し、Ｔ１５０フラスコ（３０ｍＬ）または二重ＣｅｌｌＳｔａｃｋｓ（２６０ｍＬ）に播種するために適切に拡大縮小され得る。解離した凝集体を播種した翌日、およびその２日後（例えば、１５日目および１７日目）、消費された培地を吸引し、２Ｄ培養容器に付着性の神経維持培地（９８％ ＤＭＥＭ−Ｆ１、２％ Ｂ２７ ５０Ｘサプリメント）が以下のように供給される。６ウェルプレートのウェル当たり２ｍＬ培地、Ｔ１５０当たり３０ｍＬ、および二重ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ当たり２６０ｍＬ。付着性の神経維持培地の４日後（２回の供給）、１９日目に神経成熟培地＃１（９８％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２％ Ｂ２７ ５０Ｘサプリメント、２．５μＭ ＤＡＰＴ）を培養物に１回供給する。２１日目に、適量の温かいＴｒｙｐＬＥを使用して、約６分間、細胞を採取する。等量の９０％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２／１０％ ＦＢＳを含有する円錐管に細胞を移す。次いで培養容器を当量の９０％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２／１０％ ＦＢＳで洗浄し、追加の細胞を回復する。細胞は、１２００ＲＰＭで５分間、ピペットで取り、上澄みを吸引する。神経播種培地＃２（９７％ １Ｘ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、２％ Ｂ２７ ５０Ｘサプリメント、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ １００Ｘサプリメント、１０μＭブレビスタチン）内で細胞を再懸濁し、ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニンで被覆された培養容器の上に約２８０ｋ細胞／ｃｍ^２の密度で播種される。２４時間後、培地を吸引し、当量の神経成熟培地＃２と置き換えた（９７％ １Ｘ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、２％ Ｂ２７ ５０Ｘサプリメント、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ １００Ｘサプリメント、２．５μＭ ＤＡＰＴ）。培地交換は、神経成熟培地＃２を最初に供給した後、所望の神経成熟が達成されるまで４８時間ごとに行われる（典型的に、２８日目または３０日目）。

【0174】

ニューロンは、ニューロン特異的プロモータ（例えば、ＤＣＸ、ＴＵＪ−１、ＳＹ１、ＥＮＯ２ ＮＳＥ、ＧＦＡＰ、ＴＵＢＡ１Ａ、またはＭａｐ−２）の調節下で、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ブラスチジン、ネオマイシン、プロマイシン、またはヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子）またはスクリーニング可能なマーカー（例えば、蛍光タンパク質）を含有する多能性幹細胞クローンを利用することにより、分化手順の間に富化または選択され得る。分化手順の最後に（３０日目〜４５日目）、１）βＩＩＩ−チューブリン／ネスチン、および／またはＤＣＸ／ネスチン二本鎖を用いるフローサイトメトリーにより純度、２）免疫細胞化学による神経亜型の相対組成物（例えば、ドーパミン作動性、ＧＡＢＡ作動性、またはグルタミン作動性）、および３）電気物理学による所望の神経機能（例えば、単一細胞パッチ塊または多電極アレイ）について細胞を試験する。

（実施例４）
多能性幹細胞株およびクローン変動性

【0175】

多能性幹細胞の分化能は、幹細胞の内因性シグナル伝達状態の株間およびさらにはクローン間変動性に起因し得ることが観察された。実施例３のニューロン分化手順を利用して、異なる多能性幹細胞株およびクローンが、神経系統への分化を向上させるために、予備刺激培地、凝集体培地、および／またはさらなる分化培地内で１つ以上のＴＧＦβスーパーファミリー阻害剤および／またはＦＧＦ８の添加を必要とすることが観察された。ＦＧＦシグナル伝達は、内因性神経誘導体として報告されるＦＧＦ８による神経誘導において重要な役割を果たすことが報告された（Ｓｔｅｍｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。上記実施例３に詳述される手順を利用して、ｉＰＳＣ株１７２９ｃ４は、１０μＭ ＳＢ−４３１５４２および／または１μＭドルソモルフィンおよび／または１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ８も含有する、細胞培養培地内で、−３、−２、−１、０、１、２、３、および４日目の間（０日目は凝集体形成の開始日）培養した（図３Ａ）。２７日目に、βＩＩＩ−チューブリン／ネスチン二本鎖を用いるフローサイトメトリーにより、細胞の純度を試験した（図３Ｂ）。一般に、この特定のｉＰＳＣ株について、阻害剤を含有する条件は、予備刺激、凝集体形成、および／またはさらなる分化の間のある日数の間、阻害剤を含有しない条件（阻害剤またはＦＧＦ８が添加されない対照実施例３）より高い神経系統純度をもたらした。例えば、ＳＢ−４３１５４２およびドルソモルフィンが−２、−１、０、および１日目に存在する場合（図３Ｂにおいて「阻害剤−２〜２日目」と示される）、細胞の９２％はβＩＩＩ−チューブリン／ネスチン陽性であった。しかしながら、ＦＧＦ８は、高純度のニューロン培養を産出する阻害剤の代わりに使用され得る（すなわち、−３日目に存在するＦＧＦ８、細胞の９０％はβＩＩＩ−チューブリン／ネスチン陽性であった）。異なるｉＰＳＣ株を利用する別個の実験において（２．０４２）、−２、−１、０、および１日目に、培地中の１０μＭ ＳＢ−４３１５４２または１μＭドルソモルフィンの１つのみを添加することは、両方の阻害剤が使用された場合と比較して、βＩＩＩ−チューブリン／ネスチン二本鎖により決定されるように、同様に高いニューロン純度をもたらしたが（図３Ｃ）、阻害剤の欠失（実験３過程対照）は、９日目までに分化の失敗をもたらした。これらの結果は、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達阻害剤および／またはＦＧＦ８の組合せ、ならびに両方を欠失する条件を利用する滴定実験は、個別の多能性幹細胞株およびクローンについて、神経系統への分化を最適化するための重要な最初のステップであり得ることを示唆する。

（実施例５）
星状細胞生成手順

【0176】

星状細胞は、中枢神経系において認められる星状膠細胞である。それらは、脳内の正常なホメオスタシスを維持することを含む、多様な機能を行う。星状細胞の機能における異常は、いくつかの疾患状態において示唆されている。このようにして、時間効率の良い手順により生成された高純度の星状細胞の容易に入手可能な源を有することは、星状細胞の役割の理解ならびに神経障害および傷害の治療に著しく有益であり得る。多能性幹細胞から星状細胞を生成するための方法は、既に報告されている（Ｋｒｅｎｃｉｋ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，２０１１、Ｋｒｅｎｃｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、プロトコルの多くは、比較的長く（６ヶ月以上）、および／または細胞および他のニューロン細胞型を汚染することと比較して、星状細胞の低い純度をもたらす。このようにして、高純度の星状細胞を生成するための時間効率の良い手順が必要とされる。

【0177】

ｉＰＳ細胞株８００４は、−２、−１、０、および１日目に、１０μＭ ＳＢ−４３１５４２を培養培地に添加するかしないかに関わらず、実施例３の手順を使用して分化された。２８日目に、ＴＵＪ１／ネスチンフローサイトメトリー染色により決定されるニューロン純度は、ＳＢ−４３１５４２を添加しない場合８０％、ＳＢ−４３１５４２を添加した場合は９７％であった。手順の３０日目から開始して、細胞に９０％ １Ｘ ＤＭＥＭ−Ｆ１２／１０％ ＦＢＳを７日おきに供給した。星状細胞の過増殖は、４５日目に最初に検出された。４８日目に、星状細胞のマーカーとしてＧＦＡＰを使用して、星状細胞の純度について、培養物をフローサイトメトリーにより分析した。−２、−１、０、および１日目に、ＳＢ−４３１５４２を添加せずに培養した細胞は、９１％ ＧＦＡＰ細胞を呈した（星状細胞を示す）。興味深いことに、ＳＢ−４３１５４２を添加して培養した細胞は、５６％ ＧＦＡＰ陽性細胞を呈した。これらの結果は、神経系統分化の初期段階で神経細胞型の純度が低いほど（ＴＵＪ１／ネスチンフローサイトメトリー染色により評価されたように）、星状細胞をもたらす条件下で培養された場合、より高い純度の星状細胞を産出し得ることを示す。つまり、本明細書に詳述される方法は、既存の星状細胞分化方法に対して時間効率の良い方法で高純度の星状細胞の培養を生成する方法を提供する。

***

【0178】

本明細書に開示および請求される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく生成および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好適な実施形態に関して説明されたが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法、ステップ、または方法のステップのシーケンスに変型が適用され得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的に、化学的および生理学的に関連するある特定の薬剤は、本明細書に記載の薬剤に代替され得るが、同一または類似の結果が達成されることが明らかとなるであろう。当業者に明らかなかかる類似の代替物および修正のすべては、添付の請求項により定義されるように、本発明の趣旨、範囲、および概念内であると見なされる。

【0179】

参考文献

以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されるものに補足的な例示的手順のまたは他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に明確に援用される。
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米国特許公開第２００４００１４７５５号
米国特許公開第２００５０１９２３０４号
米国特許公開第２００５０２０９２６１号
米国特許公開第２００７／０１１６６８０号
米国特許公開第２００７／０２３８１７０号
米国特許公開第２００８／０１７１３８５号
米国特許公開第２０１１／０２２９４４１号
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Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：１９６−２０６．，２００８．
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Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３９４：１８９−１９３，２０１０．
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Ｙｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０，２００７．
Ｙｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９２８）：７９７−８０１，２００９．

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】