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特許6185908ジアリールスルフィド骨格を含有する光解離性保護基

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6185908

(24)【登録日】2017年8月4日

(45)【発行日】2017年8月23日

(54)【発明の名称】ジアリールスルフィド骨格を含有する光解離性保護基

(51)【国際特許分類】

C07C 323/19 20060101AFI20170814BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20170814BHJP

C07K 1/06 20060101ALI20170814BHJP

C07D 207/16 20060101ALI20170814BHJP

C07D 231/12 20060101ALI20170814BHJP

C07H 19/073 20060101ALI20170814BHJP

C07H 19/10 20060101ALI20170814BHJP

C07H 19/173 20060101ALI20170814BHJP

C07H 19/20 20060101ALI20170814BHJP

C07H 21/04 20060101ALI20170814BHJP

G01N 37/00 20060101ALI20170814BHJP

G01N 33/543 20060101ALI20170814BHJP

C07C 319/20 20060101ALI20170814BHJP

【ＦＩ】

C07C323/19CSP

C12N15/00 AZNA

C07K1/06

C12N15/00 F

C07D207/16

C07D231/12 C

C07H19/073

C07H19/10

C07H19/173

C07H19/20

C07H21/04 A

G01N37/00 102

G01N33/543 525W

G01N33/543 525U

C07C319/20

【請求項の数】19

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2014-503096(P2014-503096)

(86)(22)【出願日】2012年4月2日

(65)【公表番号】特表2014-516923(P2014-516923A)

(43)【公表日】2014年7月17日

(86)【国際出願番号】EP2012055918

(87)【国際公開番号】WO2012136604

(87)【国際公開日】20121011

【審査請求日】2015年3月16日

(31)【優先権主張番号】11161556.3

(32)【優先日】2011年4月7日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラロシュアーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡＲＯＣＨＥＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本修

(74)【代理人】

【識別番号】100162455

【弁理士】

【氏名又は名称】辻本典子

(72)【発明者】

【氏名】シュテンゲレ，クラウス−ペーター

【審査官】土橋敬介

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００７／０９２８５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許第０４８６３５０７（ＵＳ，Ａ）

【文献】特開昭６４−０２５７６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０００−１８６０７６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の式：

【化1】

の化合物であって、
Ａは−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−からなる群から選択され、そして
Ｒ１は未置換または置換されたアリールまたはヘテロアリール基であり、Ｒ３はＨ、メチル基またはエチル基であり、そして
ここでＲ２は

【化2】

であり、またはここでＲ２は

【化3】

であり、ここでＲ４はＨ、または、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートもしくはホスフェートトリエステルを形成しており、そして
ここでＲ５はＨ、ＯＨ、ハロゲンもしくはＸＲ６であり、ここでＸはＯもしくはＳであり、Ｒ６はＨ、アルキル基、アリール基であり、もしくはＯＲ６はホスホラミダイト、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネートもしくはアセタールもしくはシリコーン部分を形成しており、そして
ここでＢはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、ヒポキサンチン−９−イル、５−メチルシトシニル−１−イル、５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸−１−イルもしくは５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸アミド−３−イルからなる群から選択され、ここでＢがアデニン、シトシンもしくはグアニンである場合、第１級アミノ基は保護基を有していてもよく［Ｂがアデニン、シトシンまたはグアニンである場合、保護基はフェノキシアセチル−、４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェノキシアセチル−、４−イソプロピル−フェノキシアセチル−またはジメチルホルムアミジノ残基であり、Ｂがアデニンである場合、保護基はベンゾイル−またはｐ−ニトロ−フェニル−エトキシ−カルボニル−（ＮＰＥＯＣ）残基であり、Ｂがグアニンである場合、保護基はイソブチロイル−、ｐ−ニトロフェニルエチル（ｐ−ＮＰＥ）またはＮＰＥＯＣ残基であり、Ｂがシトシンである場合、保護基はベンゾイル−、イソブチリル−、またはＮＰＥＯＣ残基である］、もしくはＢがチミンもしくはウラシルである場合、Ｏ^４位において保護基［当該保護基は、２−ニトロベンジルオキシカルボニル−（ＮＢＯＣ）、２−ニトロフェニル−エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）、２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）−プロピルオキシ−カルボニル（ＭｅＮＰＰＯＣ）、２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）−オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、ジメトキシ−ベンゾ−イニリル−オキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル）−エチルスルホニル（ＮＰＥＳ）、及び（２−ニトロフェニル）−プロピルスルホニル（ＮＰＰＳ）からなる群より選ばれる］があってもよく、または
ここでＲ２は

【化4】

であり、ここでＲ７は式Ｉａに対してウレタン結合を形成している天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸であり、もしくは
ここで式ＩＶは式Ｉａに対してエステル結合を形成している天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸のカルボキシ官能基を表す、
前記化合物。

【請求項2】

Ｒ１がフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基、もしくは２−ピリジル基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ａが−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であることを特徴とする、請求項１または２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｒ３がＨまたはエチル基であることを特徴とする、請求項１〜３の１項に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ４がＨかつＲ５がＨであることを特徴とする、請求項１〜４の１項に記載の化合物。

【請求項6】

Ｂがアデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５の１項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ７が天然アミノ酸であることを特徴とする、請求項１〜４の１項に記載の化合物。

【請求項8】

マスクレスフォトリソグラフィーを用いる光活性化保護基としての、請求項１〜７の１項に記載の化合物の使用。

【請求項9】

マスクレスフォトリソグラフィーに基づくＤＮＡアレイ合成のための、３’−ＯＨ末端または５’−ＯＨ末端におけるヌクレオシド誘導体中の中間的または永久的ＯＨ保護基としての、請求項１〜６の１項に記載の化合物の使用。

【請求項10】

マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のための、アミノ酸中のＮＨ保護基としての、請求項７に記載の化合物の使用。

【請求項11】

マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のための、アミノ酸中のＣＯＯＨ保護基としての、請求項７に記載の化合物の使用。

【請求項12】

マスクレスフォトリソグラフィーに基づく炭水化物の合成のための、ＯＨ保護基としての、請求項７に記載の化合物の使用。

【請求項13】

直交保護基戦略のための、ＳＨ保護基としての、請求項７に記載の化合物の使用。

【請求項14】

３７４〜４０５ｎｍの波長を有する光がマスクレスフォトリソグラフィーのために用いられることを特徴とする、請求項８〜１２の１項に記載の化合物の使用。

【請求項15】

３９０ｎｍの波長を有する光がマスクレスフォトリソグラフィーのために用いられることを特徴とする、請求項８〜１２および１４の１項に記載の化合物の使用。

【請求項16】

以下の工程：
ａ）出発物質としてのｐ−ジエチルベンゼンの提供
ｂ）フェニル環の臭素化
ｃ）得られた化合物の硝酸および硫酸中での該臭素に対するパラ位におけるニトロ化
ｄ）精製および結晶化
ｅ）該化合物のベンジル位におけるヒドロキシメチル化
ｆ）チオフェノールを用いる該芳香族臭素基のアリールスルフィドへの変換
ｇ）精製
ｈ）アルコールのクロロカーボネートへの変換
ｉ）該クロロカーボネートのヌクレオシドとの反応および該ヌクレオシドのホスファイト化剤との反応、または
該クロロカーボネートのアミノ酸との反応；
を含む、請求項１〜７の１項に記載のジアリールスルフィド骨格を含有する光解離性保護基を調製するための方法。

【請求項17】

Ｒ１がフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基または２−ピリジル基であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

Ａが−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

Ｒ３がエチル基であることを特徴とする、請求項１６〜１８の１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ジアリールスルフィド発色団を含有する光活性化（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｂｌｅ）保護基、その合成のための方法およびマスクレスフォトリソグラフィーに基づくアレイ合成を用いる光活性化保護基としてのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

光解離性（Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）保護基（ＰＬＰＧ）は生体分子、例えば核酸およびそれらの誘導体、タンパク質、ペプチドおよび炭水化物の合成のために用いられるヌクレオシド類、ヌクレオチド類、糖類およびアミノ酸類中に存在する官能基のブロッキングにおいて重要な役割を果たす。加えて、ＰＬＰＧは保護された官能基の脱保護を光曝露により簡単に実施することができるという利点を有する。従って、ＰＬＰＧはオリゴヌクレオチド類またはペプチド類の固体支持体上でのマスクレスフォトリソグラフィーに基づく空間的に分解された（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）合成のための基礎を提供する。この技法の主な利点は、高分解能マイクロアレイを製造することができることである。そのような高分解能マイクロアレイは、それらが単一のアレイ上での多数の試料の高スループットかつ対費用効果の高い分析を実施する可能性を提供するため、医学および医薬研究における生体分子の分析のために非常に重要である。

【0003】

マイクロアレイの合成のためのＰＬＰＧの使用は当技術で周知である。一般的に用いられるフォトリソグラフィーに基づくオリゴヌクレオチド合成のためのＰＬＰＧは、例えばα−メチル−６−ニトロピペロニル−オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）(Pease, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5022-5026)、２−（２−ニトロフェニル）−プロポキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）(Hasan, et al., Tetrahedron 53 (1997) 4247-4264)である。一般的に用いられるフォトリソグラフィーに基づくペプチド合成のためのＰＬＰＧは、例えばニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）(Fodor, et al., Science 251 (1991) 767-773)および２−ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）(Patchornik, et al., J. Am. Chem. Soc. 92 (1970) 6333-6335)である。

【0004】

先行技術のＰＬＰＧの主な欠点は、その保護された官能基の脱保護のためにおおよそ３６５ｎｍ以下の波長の光を用いなければならないことである。そのような波長を生成するのに適した光源は、例えば水銀灯、エキシマーレーザー、ＵＶ−ＬＥＤ、および周波数逓倍（ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ）固体レーザーである。そのような光源は、高い購入費用を特徴とし、限られた光量しか提供せず、短い寿命を有し、これらは高い全体の運転費用につながる。上記で言及した光源のいくつかは危険な物質、例えば水銀を含有するため、労働安全を確保するための適切な行動および適正な廃棄が必要であり、それがさらに費用を増大させる。

【0005】

オリゴヌクレオチドまたはペプチドのフォトリソグラフィーに基づく合成のために用いられる光学装置、例えばマイクロミラー装置（ＷＯ０３／０６５０３８）は、主におおよそ３８０〜７８０ｎｍの可視波長範囲のために設計されており、すなわちそのような装置はそれぞれの可視波長範囲に関する透明性に関して最適化された反射防止または保護用傷防止（ａｎｔｉｓｃｒａｔｃｈ）コーティングを有する。従って、現状技術で既知のＰＬＰＧで保護された官能基の脱保護に必要な３６５ｎｍの近紫外波長は、近紫外波長に関して最適化されている光学装置を必要とする。光学装置のほとんどは可視光での使用に関して最適化されているため、そのような最適化はしばしばその光学装置から可視光での使用を意図したコーティングを除去することおよび／またはその光学装置を近紫外もしくは紫外光での使用を意図した物質でコーティングすることを含む。

【0006】

さらに、上記で言及した光源のいくつかは広いスペクトルの波長を生成し、例えば水銀灯は紫外から赤外までの範囲の光を放射し、その両方が生体分子の合成に関する不都合な作用を有する。紫外線は例えば合成されたＤＮＡにより吸収されてリン酸主鎖の基の切断による鎖内でのランダムな破断、グアニン塩基の酸化およびそれに続く鎖の破断、または特にチミン塩基の光二量化をもたらし得る。さらに、紫外光は特定のアミノ酸の破壊、例えばラジカル酸化によるトリプトファンの破壊、または硫黄酸化によるシステインおよびメチオニンの破壊ももたらす。結果として、ＤＮＡまたはペプチドマイクロアレイは、合成されたＤＮＡ鎖およびペプチドそれぞれの定まらない長さのため、低品質である可能性がある。

【0007】

それに対し、赤外光は光学装置の昇温をもたらし、それは結果としてその光学装置の変形をもたらす。マイクロミラー装置を使用する場合、例えば、その装置の１℃の温度上昇は反射された光のおおよそ１０μｍのドリフト（ｄｒｉｆｔ）をもたらし、従ってそのマイクロアレイ上のそれぞれの特徴上の焦点の喪失をもたらす。固体支持体上のオリゴヌクレオチドまたはペプチドのフォトリソグラフィーに基づく合成における必要とされる正確さを考慮すると、そのような収差はそのアレイの質の低下をもたらすであろう。結果として、オリゴヌクレオチドまたはペプチドアレイの品質を確実にするため、３６５ｎｍでの脱保護に必要な光源により生成された望まれない紫外および赤外波長を（例えばフィルターにより）除去するために追加の努力および費用が必要である。

【0008】

従って、本発明の目的は、上記で言及した先行技術の欠点を示さないＰＬＰＧの提供である。従って、可視光を用いた官能基の脱保護に適したＰＬＰＧが本明細書において提供される。結果として、無害かつ対費用効果の高い光源ならびに規則正しい光学素子をフォトリソグラフィーに基づくオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成のために用いることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】ＷＯ０３／０６５０３８

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Pease, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5022-5026

【非特許文献2】Hasan, et al., Tetrahedron 53 (1997) 4247-4264

【非特許文献3】Fodor, et al., Science 251 (1991) 767-773

【非特許文献4】Patchornik, et al., J. Am. Chem. Soc. 92 (1970) 6333-6335

【発明の概要】

【0011】

第１観点において、本発明は次の一般式を有するジアリールスルフィド発色団を含有する光解離性保護基に向けられており：

【0012】

【化1】

【0013】

ここでＹはＳまたはＯであり、そして
Ａは−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−からなる群から選択され、Ｒ１は未置換または置換されたアリールまたはヘテロアリール基であり、Ｒ３はＨ、メチル基またはエチル基であり、ここでＲ２はＨであり、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートもしくはホスフェートトリエステルを形成しており、またはここでＲ２は

【0014】

【化2】

【0015】

であり、またはここでＲ２は

【0016】

【化3】

【0017】

であり、ここでＲ４はＨであり、もしくはＯＲ４はホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートもしくはホスフェートトリエステルを形成しており、ここでＲ５はＨ、ＯＨ、ハロゲンもしくはＸＲ６であり、ここでＸはＯもしくはＳであり、Ｒ６はＨ、アルキル基、アリール基であり、もしくはＯＲ６はホスホラミダイト、ホスホジエステル、ホスホトリエステルもしくはＨ−ホスホネートもしくはアセタールもしくはシリコーン部分を形成しており、ここでＢはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、ヒポキサンチン−９−イル、５−メチルシトシニル−１−イル、５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸−１−イルもしくは５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸アミド−３−イルからなる群から選択され、ここでＢがアデニン、シトシンもしくはグアニンである場合、その第１級アミノ基は場合により保護基を有し、もしくはＢがチミンもしくはウラシルである場合、Ｏ４位において場合により保護基があり、
またはここでＲ２は

【0018】

【化4】

【0019】

であり、ここでＲ７は式Ｉｂに対してウレタン結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体であり、もしくはここで式ＩＶは式Ｉｂに対してエステル結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のカルボキシ官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を表す。

【0020】

Ｒ１は好ましくはフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基、２−ピリジル基、アミノフェニル基、Ｎ−アルキルアミノフェニル基、Ｎ−アシルアミノフェニル基、カルボキシフェニル基、フェニルカルボン酸エステルもしくはアミドであり、および／またはＡは好ましくは−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であり、および／またはＲ２はホスホラミダイトもしくは−Ｐ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ−ｉＰｒ_２）であり、および／またはＰ４は好ましくはＨであり、および／またはＲ５は好ましくはＨであり、および／またはＲ７は好ましくは天然アミノ酸である。Ｂはアデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルからなる群から選択され、より好ましくは、Ｂがアデニン、シトシンまたはグアニンである場合、その保護基はフェノキシアセチル−、４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェノキシアセチル−、４−イソプロピル−フェノキシアセチル−またはジメチルホルムアミジノ残基であり、Ｂがアデニンである場合、その保護基はベンゾイル−またはｐ−ニトロ−フェニル−エトキシ−カルボニル−（ＮＰＥＯＣ）残基であり、Ｂがグアニンである場合、その保護基はイソブチロイル−、ｐ−ニトロフェニルエチル（ｐ−ＮＰＥ）またはＮＰＥＯＣ残基であり、Ｂがシトシンである場合、その保護基はベンゾイル−、イソブチリル−、またはＮＰＥＯＣ残基である。

【0021】

本発明の化合物は様々な異なる適用のために用いることができる。１観点において、本発明はその化合物のマスクレスフォトリソグラフィーを用いる光活性化保護基としての使用に向けられている。１態様において、その化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくＤＮＡアレイ合成のために、３’−ＯＨ末端または５’−ＯＨ末端におけるヌクレオシド誘導体中の中間的または永久的ＯＨ保護基として用いられる。さらに、その化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のために、アミノ酸中のＮＨ保護基として用いられる。別の態様において、その化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のためにアミノ酸中のＣＯＯＨ保護基として、および／またはマスクレスフォトリソグラフィーに基づく炭水化物の合成のためにＯＨ保護基として、および／または直交保護基戦略のためにＳＨ保護基として用いられる。別の態様において、その化合物は３７４〜４０５ｎｍの、好ましくは３９０ｎｍの波長を有するマスクレスフォトリソグラフィーのために用いられる。

【0022】

別の観点において、本発明は、以下の工程：
ａ）出発物質としてのｐ−ジエチルベンゼンの提供
ｂ）フェニル環の臭素化
ｃ）得られた化合物の硝酸および硫酸中でのその臭素に対するパラ位におけるニトロ化
ｄ）精製および結晶化
ｅ）その化合物のベンジル位におけるヒドロキシメチル化
ｆ）チオフェノールを用いるその芳香族臭素基のアリールスルフィドへの変換
ｇ）精製
ｈ）アルコールのクロロカーボネートへの変換
ｉ）そのクロロカーボネートのヌクレオシドとの反応およびそのヌクレオシドのホスファイト化剤との反応、または
そのクロロカーボネートのアミノ酸誘導体との反応；
を含む、上記で記述したようなジアリールスルフィド骨格を含有する光解離性保護基の合成のための方法に向けられている。

【0023】

１態様において、Ｒ１はフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−または２−ナフチル基、２−ピリジル基であり、Ａは−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であり、かつＲ３はＨまたはエチル基である。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１：本発明に従うＰＬＰＧの３９０ｎｍの波長における半減期を、用いた溶媒に応じて示す。光曝露はそれぞれ２、４、６秒間または２、４、６、８秒間または２、４、６、８、１２秒間実施した。

【図2】図２：本発明に従うＰＬＰＧの４０４ｎｍの波長における半減期を、用いた溶媒に応じて示す。光曝露はそれぞれ１、２、３、４分間または１、２、３、５分間実施した。

【図3】図３：ＰＬＰＧの紫外吸収特性。

【図4-1】図４：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸の合成経路。

【図4-2】図４：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸の合成経路。

【図4-3】図４：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸の合成経路。

【図4-4】図４：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸の合成経路。

【図4-5】図４：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸の合成経路。

【図4-6】図４：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸の合成経路。

【図5-1】図５：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−ヌクレオチドの合成経路。

【図5-2】図５：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−ヌクレオチドの合成経路。

【図5-3】図５：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−ヌクレオチドの合成経路。

【図6-1】図６：本発明に従うさらなるＰＬＰＧの合成経路。

【図6-2】図６：本発明に従うさらなるＰＬＰＧの合成経路。

【図7-1】図７：さらなるアルキル置換基なしのＰＬＰＧの代替合成経路。

【図7-2】図７：さらなるアルキル置換基なしのＰＬＰＧの代替合成経路。

【図7-3】図７：さらなるアルキル置換基なしのＰＬＰＧの代替合成経路。

【図8】図８：ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸を用いて本発明に従って合成された、抗Ｖ５抗体の標的配列を含有するペプチドアレイのマイクロアレイ走査。

【発明を実施するための形態】

【0025】

以下の定義は、本明細書において本発明を記述するために用いられる様々な用語の意味および範囲を説明および定義するために述べられている。
用語“未置換の”は本明細書において当業者に既知であるように用いられており、完全に炭素および水素からなる炭化水素鎖を指す。

【0026】

用語“置換された”は本明細書において当業者に既知であるように用いられており、化学基または置換基（典型的にはＨまたはＯＨ）の官能基による置換を指し、特に意図されている官能基には、求電子基（例えばＣ（Ｏ）−ＯＲ、Ｃ（Ｘ）−ＯＨ等）、求核基（例えば−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＣ等）、イオン性基（例えば−ＮＨ３−）、極性基（例えば−ＯＨ）、非極性基（例えばアリール、アルキル、アルケニル、アルキニル等）、およびハロゲン（例えば−Ｆ、−Ｃｌ）およびそれらの組み合わせが含まれる。

【0027】

用語“保護基”は本明細書において当業者に既知であるように用いられており、（例えば共有結合、イオン結合、または錯体により）潜在的に反応性である基に結合しておりその潜在的に反応性である基が特定の反応条件下で反応するのを妨げる置換基、官能基、リガンド等を指す。潜在的に反応性である基には、例えばアミン類、カルボン酸類、アルコール類、二重結合等が含まれる。本発明に従う保護基は光解離性保護基であり、それには２−ニトロベンジルオキシカルボニル−（ＮＢＯＣ）、２−ニトロフェニル−エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）、２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）−プロピルオキシ−カルボニル（ＭｅＮＰＰＯＣ）、２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）−オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、ジメトキシ−ベンゾ−イニリル−オキシカルボニル（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−ｂｅｎｚｏ−ｉｎｙｌｙｌ−ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（ＤＭＢＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル）−エチルスルホニル（ＮＰＥＳ）、（２−ニトロフェニル）−プロピルスルホニル（ＮＰＰＳ）等が含まれるが、それらに限定されない。

【0028】

用語“アリール”は本明細書において当業者に既知であるように用いられており、水素および炭素原子のみからなる芳香族残基、例えばフェニル（Ｃ_６Ｈ_５−）、ナフチル（Ｃ_１０Ｈ_７−）、ピレニル−またはアントラセニル（Ｃ_１４Ｈ_９−）残基を指す。そのアリールは、例えばアルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、もしくはｔｅｒｔ−ブチル、またはアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、もしくはイソプロポキシ、またはハロゲン原子、例えば臭素、塩素、もしくはフッ素で置換されていることができ、または未置換であることができる。

【0029】

用語“ヘテロアリール”は本明細書において当業者に既知であるように用いられており、５または６個の環原子を有し、少なくとも１個の環原子が酸素、硫黄、および窒素からなる群から選択され、残りの環原子が炭素である環状芳香族基を指す。そのヘテロ芳香族環は、ベンゾチオフェン、ベンズイミダゾール、プテリジンまたはアロキサジンのように、他のアリールまたはヘテロアリール環と一緒に縮合ヘテロ芳香族系を形成していてよい。

【0030】

用語“アルキル”は本明細書において当業者に既知であるように用いられており、炭素および水素原子のみからなる一価の残基を指す。アルキルは一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１を有する同族列を形成する。アルキルは直鎖または分枝状アルキルであることができ、例えばそのアルキルは２個の炭素残基に連結された中央の炭素原子で分枝している第２級アルキルまたは３個の炭素残基に連結された中央の炭素原子で分枝している第３級アルキルであることができる。

【0031】

基−Ａ−Ｏ−中の文字Ａは、１から２個までの線状に共有結合的に連結された原子を含む“断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）リンカー”、例えばメチレン−またはエチレン−を表す。用語“断片化リンカー”は本明細書において当業者に既知であるように用いられており、光化学において一次光過程を化学開裂反応に変換することによりそのＰＬＰＧの光に誘導される分裂を達成する部分として用いられる部分に関する。従って、第１観点において、その二価の基−Ａ−は、官能基Ｒ２をニトロフェニル発色団と連結する連結基を指す。１態様において、その連結基Ａの１〜２原子の鎖は、置換された、または未置換の、分枝状または線状の、飽和または不飽和の炭化水素鎖の形態で、完全に水素および炭素原子で構成されていることができる。

【0032】

その炭化水素鎖は分枝して１個以上のアルキル基を有することもでき、ここでそのアルキル基はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであることができる。

【0033】

そのような炭化水素鎖は、例えばハロゲン原子により置換されることもできる。従って、それぞれの炭化水素鎖の１個の水素原子から３個の水素原子までを例えばハロゲンにより置換することができる。

【0034】

連結基という用語の定義の文脈中の用語“分枝状”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、分子または部分の主鎖における側鎖の存在を指す。従って、分枝状連結基は、１個以上のアルキル基を側鎖として有する上記で定義されたような炭化水素鎖であることができ、ここでそのアルキル基はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり、好ましくはメチルまたはエチル基である。Ａにより表される分枝状炭化水素鎖において、１個から全部までの炭素原子は１個以上の上記で定義されたようなアルキル基を有することができる。

【0035】

連結基という用語の定義の文脈中の用語“飽和した”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、その基の全ての員がそれぞれの隣接する原子（単数または複数）に単結合により連結されている連結基に関する。従って、飽和した炭化水素鎖は式−（ＣＨ_２）_ｎ−により表され、ｎは１から２までの範囲の整数である。

【0036】

用語“官能基”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、化学分子の一部を形成し、それら自体が特徴的な反応を経て、そして多くの場合においてその分子の残りの部分の反応性に影響を及ぼす、数多くの原子の組み合わせのいずれかを指す。典型的な官能基は、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、カルボニル、アミノ、アジド、アルキニル、チオールおよびニトリルである。

【0037】

用語“固体支持体”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、好ましくは大きな表面積を有し、その表面に有機分子が結合形成により付着することができ、または電子的もしくは静的（ｓｔａｔｉｃ）相互作用により、例えば官能基による結合形成により吸収されることができる、あらゆる不溶性かつ剛性または半剛性の無機または有機性物質を指す。

【0038】

用語“生体分子”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、生きた生物により生成されるあらゆる有機分子を、またはそのような化合物のあらゆる人工的に生成された誘導体を指し、大きなポリマー性分子、例えばタンパク質、多糖類、炭水化物、脂質、核酸およびオリゴヌクレオチド類、ならびに小分子、例えば一次代謝産物、二次代謝産物、および天然産物が含まれる。

【0039】

用語“核酸”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、単量体ヌクレオチドの鎖からなる高分子を指し、ここでそれぞれのヌクレオチドは３つの構成要素からなる：窒素性複素環式塩基、それはプリンまたはピリミジンのどちらかである；ペントース糖；およびホスフェート基。

【0040】

用語“天然アミノ酸”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、タンパク質生合成のために用いられる２０種類の標準的なアミノ酸ならびに翻訳の間にタンパク質中に組み込まれ得る全てのアミノ酸（ピロリシンおよびセレノシステインが含まれる）を指す。その２０種類の標準的なアミノ酸には、ヒスチジン、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、アルギニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンおよびリシンが含まれる。

【0041】

用語“非天然アミノ酸”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、標準的な遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の中になく、翻訳の間にタンパク質中に組み込まれることもない有機化合物を指す。さらに、用語“非天然アミノ酸”は、天然に存在しない有機化合物を指す。従って、非天然アミノ酸にはアミノ酸またはアミノ酸の類似体、アミノ酸のＤ−立体異性体（Ｄ−ｉｓｏｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ）、シトルリン、ホモシトルリン、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、オルニチン、４−アミノ−フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グリシン、ノルロイシン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、α−アミノ酪酸、ｔｅｒｔ−ブチルアラニン、２−アミノイソ酪酸、α−アミノイソ酪酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸、セレノメチオニン、ジヒドロアラニン、ランチオニン、γ−アミノ酪酸、およびそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定されず、ここでそのアミン窒素はモノ−またはジ−アルキル化されている。

【0042】

用語“ペプチド”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、線状鎖中に配列され、隣接するアミノ酸残基のカルボキシルおよびアミノ基の間のペプチド結合により一緒に連結されたアミノ酸で作られた有機化合物を指す。

【0043】

用語“アミノ基”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、第１級（−ＮＨ_２）、第２級（−ＮＨＲ_１）、または第３級（−ＮＲ_１Ｒ_２）を指し、陽イオン形態では第４級（−ＮＲ_１Ｒ_２Ｒ_３）であってよい。アミノ基の例には、−ＮＨ_２、−ＮＨＣＨ_３、−ＮＨＣ（ＣＨ_３）_２、−Ｎ（ＣＨ_３）_２および−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２が含まれるが、それらに限定されない。環状アミノ基の例には、アジリジノ、アゼチジノ、ピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノ、モルホリノ、およびチオモルホリノが含まれるが、それらに限定されない。

【0044】

用語“マスクレスフォトリソグラフィー”は、本明細書において当業者に既知であるように用いられており、写真マスク（ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃｍａｓｋｓ）を用いないＤＮＡまたはペプチドマイクロアレイの合成のための技法を指す。マスクレスフォトリソグラフィーは、独立してアドレス指定でき（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）、ソフトウェア制御の下で操作可能である光スイッチング素子のアレイを用いる。そのような光スイッチング素子の例は、マイクロミラー装置である。好ましいマイクロミラー装置は、ＴｅｘａｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．からのＤｉｇｉｔａｌＬｉｇｈｔＰｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＤＬＰ）である。

【0045】

本発明は、フォトリソグラフィーに基づくオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成のために用いることができる、次の構造を有するジアリールスルフィド発色団を含有するＰＬＰＧに関し：

【0046】

【化5】

【0047】

ここでＡは−ＣＨ２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ２−ＣＨ（アルキル（Ａｌｋｙ）、アリール）−および−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（アルキル、アリール）−からなる群から選択され、
Ｒ１は未置換または置換されたアリールもしくはヘテロアリール基または縮合したアリールもしくはヘテロアリール基であり、Ｒ３はＨ、メチル基またはエチル基であり、そして
ここでＲ２は

【0048】

【化6】

【0049】

であり、またはここでＲ２は

【0050】

【化7】

【0051】

であり、ここでＲ４はＨ、アルキル基、アリール基であり、もしくはＯＲ４はホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートもしくはホスフェートトリエステルを形成しており、そして
ここでＲ５はＨ、ＯＨ、ハロゲンもしくはＸＲ６であり、ここでＸはＯもしくはＳであり、Ｒ６はアルキル基、アリール基であり、もしくはＯＲ６はホスホラミダイト基、ホスホジエステル、ホスホトリエステルもしくはＨ−ホスホネートもしくはアセタールもしくはシリコーン部分を形成しており、そして
ここでＢはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、ヒポキサンチン−９−イル、５−メチルシトシニル−１−イル、５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸−１−イルもしくは５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸アミド−３−イルからなる群から選択され、ここでＢがアデニン、シトシンもしくはグアニンである場合、その第１級アミノ基は場合により保護基を有し、もしくはＢがチミンもしくはウラシルである場合、Ｏ４位において場合により保護基があり、
またはここでＲ２は

【0052】

【化8】

【0053】

であり、ここでＲ７は式Ｉａに対してウレタン結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体であり、それにはα−もしくはβ−アミノ酸が含まれるが、それらに限定されず、
もしくはここで式ＩＶは式Ｉａに対してエステル結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のカルボキシ官能基を表し、それにはα−もしくはβ−アミノ酸が含まれるが、それらに限定されない。

【0054】

別の態様において、Ｒ１がフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基または２−もしくは４−ピリジル基であり、Ａが−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であり、Ｒ４がＨかつＲ５がＨであり、Ｒ４がＨかつＲ５がＯＨまたはＯＳｉ（Ａｌｋｙｌ３）であることを特徴とする、式Ｉａに従う化合物が用いられる。

【0055】

別の態様において、Ｂがアデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシンまたはウラシルからなる群から選択されることを特徴とする、式Ｉａに従う化合物が用いられる。

【0056】

別の態様において、Ｂがアデニン、シトシンまたはグアニンである場合、その保護基はフェノキシアセチル−、４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェノキシアセチル−、４−イソプロピル−フェノキシアセチル−またはジメチルホルムアミジノ残基であり、Ｂがアデニンである場合、その保護基はベンゾイル残基であり、Ｂがグアニンである場合、その保護基はイソブチロイル残基であり、そしてＢがシトシンである場合、その保護基はベンゾイル−−またはイソブチロイル残基であることを特徴とする、式Ｉａに従う化合物が用いられる。

【0057】

別の態様において、Ｒ７が天然アミノ酸であることを特徴とする、式Ｉａに従う化合物が用いられる。
フォトリソグラフィーに基づくオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成のために用いることができるジアリールスルフィド発色団を含有するＰＬＰＧは、好ましくは次の構造を有する：

【0058】

【化9】

【0059】

【化10】

【0060】

【化11】

【0061】

【化12】

【0062】

【化13】

【0063】

。
本発明はさらに、式Ｉａに従う化合物のマスクレスフォトリソグラフィーを用いる光活性化保護基としての使用に関する。本発明の１態様において、合成プロセスの間に曝露した領域中のヌクレオチドおよびアミノ酸をそれぞれ脱保護するために、マイクロミラー装置を用いてそのオリゴヌクレオチドおよびペプチドマイクロアレイの可視光への空間的選択的曝露を実施する。ヌクレオチドおよびアミノ酸それぞれの脱保護はそれぞれの次のヌクレオチドまたはアミノ酸のための次の連結部位の解放につながる。その特定の領域内の解放された連結部位に連結されるべき次のヌクレオチドまたはアミノ酸は、そのアレイ上に注がれる溶媒プラス活性化試薬中にそれを提供することにより簡単に付加される。この戦略を、望まれる長さおよび設計のオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドそれぞれが得られるまで繰り返す。この戦略を用いることにより、ｃｍ^２あたり少なくとも１００００個、好ましくは１０００００〜５０００００個の特徴の高度に密集したマイクロアレイを製造することが可能である。

【0064】

本発明に従うＰＬＰＧは３７５ｎｍから４２０ｎｍまでの範囲の、好ましくは３９０ｎｍから４０５ｎｍまでの範囲の可視光を用いることにより除去することができる。脱保護に関してより好ましいのは、３９０ｎｍおよび４０４ｎｍそれぞれの波長である。両方の波長は、おおよそ３６５ｎｍにおける近紫外範囲での脱保護を実施するのに必要な光源と比較してはるかに安上がりである光源を用いて生成することができる。好ましくは、３７５ｎｍから４２０ｎｍまでの範囲内の、好ましくは３９０ｎｍおよび４０４ｎｍの固体レーザーを、本発明に従うＰＬＰＧを除去するための光源として用いる。より好ましくは、３７５ｎｍから４２０ｎｍまでの範囲内の、好ましくは３９０ｎｍおよび４０４ｎｍの十分な放射を有するＬＥＤ（発光ダイオード）を、本発明に従うＰＬＰＧを除去するための光源として用いる。特にＬＥＤは、それらが例えばブルーレイプレーヤーにおける使用のために大量生産されているため、低費用な製品である。

【0065】

さらなる態様において、マイクロミラー装置が用いられ、それは３７５ｎｍ〜４２０ｎｍの範囲の、好ましくは３９０ｎｍ〜４１０ｎｍの範囲の、より好ましくは３９０ｎｍおよび４０４ｎｍそれぞれにおける可視光の使用に関して最適化されている。さらなる態様において、そのマイクロミラー装置のコーティングは可視光で用いられるためにその装置上に残っている。紫外または近紫外光に関して用いられる装置はその目的に関して最適化されていなければならず、すなわちそのマイクロミラー素子上のコーティングは研磨により除去されなければならない。

【0066】

別の態様において、ＬＣＤディスプレーまたはビームスプリッターを光源および合成領域の間の事実上のマスクとして用いることができる。
オリゴヌクレオチドおよびペプチドのフォトリソグラフィーでの合成はそれぞれ支持体、好ましくは固体支持体上で実施することができる。その支持体は、そのような目的のために用いられる当業者に既知のあらゆる物質で作られていることができ、好ましくはその支持体はプラスチック、シリコン、ダイヤモンド炭素またはガラスで作られている。より好ましくは、プラスチックまたはガラスが支持体として用いられ、材料としてさらにもっと好ましいのは光学グレードのポリオレフィンまたは光学グレードの顕微鏡スライドガラスである。その支持体は、あらゆる形態、例えばビーズ、ゲル、プレート、膜、スライドまたは好ましくはチップで提供され得る。その支持体は透明または不透明であることができ、好ましくはその支持体は３７５ｎｍ〜４１０ｎｍの波長において少なくとも３０％、好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも９０％の光透過を示す。

【0067】

本発明に従うＰＬＰＧは、保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが必要である、当業者に既知のオリゴヌクレオチド合成のためのあらゆるプロセスにおいて用いることができる。好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧ−ヌクレオチドは溶液中でのオリゴヌクレオチドの合成のために用いることができ、より好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧ−ヌクレオチドは固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成のために用いることができる。その合成は、現状技術において既知のあらゆる標準的な方法により実施することができる。より好ましくは、その合成はフォトリソグラフィー技法、例えば上記で説明したようなマイクロアレイ上の空間的に選択された特徴に光を当てるためにマイクロミラー装置を用いるマスクレス技法を用いることにより実施することができる。

【0068】

当業者に既知の溶媒、例えばアセトニトリルをオリゴヌクレオチド合成の間に用いることができる。
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドまたはヌクレオチドに結合したＰＬＰＧは、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの溶媒中の濃度で用いることができる。好ましくは、１０ｍｍｏｌ／Ｌ〜４０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いることができる。より好ましくは、そのＰＬＰＧ−ヌクレオチドは２５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いることができる。

【0069】

そのヌクレオシドまたはヌクレオチドに結合したＰＬＰＧは、当業者に既知の増感剤と関連して用いることができ、それはその脱保護反応の有効性を増大させる。特に、ベンゾフェノン、キサントンおよびチオキサントン誘導体、例えばチオキサンテン−９−オン、アルキルチオキサンテン−９−オン、例えばイソプロピルチオキサンテン−９−オン、２−エチルチオキサンテン−９−オン、２−クロロ−チオキサンテン−９−オン、１，４−ジメトキシチオキサンテン−９−オンを増感剤として用いることができる。

【0070】

オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、配列捕捉、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、ＣＨＩＰ−チップ分析、ＤＮＡメチル化分析、遺伝子発現分析および比較ゲノム配列決定が含まれるがそれらに限定されない様々な目的のために用いることができる。

【0071】

別の態様において、式Ｉａに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくＤＮＡアレイ合成において、炭素エステル（ｃａｒｂｏｎｅｓｔｅｒ）として、３’−ＯＨ末端または５’−ＯＨ末端におけるヌクレオシド誘導体中の中間的または永久的ＯＨ保護基として用いられ、ここでその合成は３’−５’方向で、または５’−３’方向で実施することができる。

【0072】

そのＰＬＰＧが５’末端に位置する場合、そのヌクレオチドはホスホラミダイト基をその３’末端上に有し、それは固体支持体上の遊離の−ＯＨ基と反応して安定な伸長されたオリゴヌクレオチドを形成することができる。全てのオリゴヌクレオチドが合成された後、全てのＰＬＰＧは除去され、その固体支持体上にまだ結合しているオリゴヌクレオチドは遊離の５’−ＯＨを有する。

【0073】

しかし、そのＰＬＰＧが３’末端に位置する場合、そのヌクレオチドはホスホラミダイト基をその５’末端上に有し、それは固体支持体上のあらゆる遊離の−ＯＨ基と反応して安定な伸長されたオリゴヌクレオチドを形成することができる。全てのオリゴヌクレオチドが合成された後、全てのＰＬＰＧは除去され、その固体支持体上にまだ結合しているオリゴヌクレオチドは遊離の３’−ＯＨを有する。

【0074】

両方のタイプの固定化がハイブリダイゼーションに基づくアッセイを可能にするが、遊離の３’−ＯＨを提示するオリゴヌクレオチドのみを、検出、標識、キャップ形成またはライゲーションもしくは酵素的重合による伸長のための酵素反応のために用いることができる。

【0075】

本発明に従うＰＬＰＧは、さらに、保護されたアミノ酸が必要である当業者に既知のあらゆるペプチド合成のためのプロセスにおいて用いることができる。用いられるアミノ酸は非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体および好ましくは天然アミノ酸であることができる。好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは溶液中でのオリゴペプチドの合成のために用いることができ、より好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは固体支持体上でのオリゴペプチドの合成のために用いることができる。その合成は、現状技術において既知のあらゆる標準的な方法により実施することができる。より好ましくは、その合成はフォトリソグラフィー技法、例えば上記で説明したようなマイクロアレイ上の空間的に選択された特徴に可視光を当てるためにマイクロミラー装置を用いる技法により実施することができる。

【0076】

その脱保護反応はそのペプチド合成プロセスの間に用いられる溶媒に依存することが示されている。当業者に既知の溶媒をペプチド合成の間に用いることができる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）またはイソプロパノールのような極性溶媒を用いることができる。前記の溶媒は、特定の添加剤、好ましくはイミダゾール、ヒドロキシルアミンおよび水を含有することができる。イミダゾールは０．１％〜３％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５％〜１．５％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することができ、より好ましくはイミダゾールは１％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することができる。ヒドロキシルアミンは０．１％〜３％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．２％〜１％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することができ、より好ましくはヒドロキシルアミンは１％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することができる。水は０．１％〜２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１％〜１７％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することができ、より好ましくは水は１％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することができる。溶媒として最も好ましいのはＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ＋１％イミダゾール、ＮＭＰ＋０．５％ヒドロキシルアミン、ＭｅＣＮ＋１％Ｈ_２Ｏ、ＭｅＣＮ＋１％Ｈ_２Ｏ＋１％イミダゾール、イソプロパノール＋１％イミダゾール、イソプロパノール＋１２％Ｈ_２Ｏ＋１％イミダゾールである。

【0077】

ペプチド合成のためのアミノ酸に結合したＰＬＰＧは、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの溶媒中の濃度で用いることができる。好ましくは、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いることができる。より好ましくは、そのＰＬＰＧは０．３ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いることができる。

【0078】

そのアミノ酸に結合したＰＬＰＧは、当業者に既知の増感剤と関連して用いることができ、それはその脱保護反応の有効性を増大させる。
オリゴペプチドマイクロアレイは、抗体ライブラリーのスクリーニング、生物学的試料の定量または定性分析、バイオマーカーの発見、稀なタンパク質の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、非常に豊富なタンパク質の枯渇、タンパク質間相互作用の分析、ＤＮＡ−タンパク質相互作用またはＲＮＡ−タンパク質相互作用の分析が含まれるがそれらに限定されない様々な目的のために用いることができる。

【0079】

別の態様において、式Ｉａに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のために、ウレタンとしてのアミノ酸中のＮＨ保護基として用いられる。そのＰＬＰＧは、ＮＨをブロッキングされた（ＮＨ−ｂｌｏｃｋｅｄ）遊離酸、活性化されたエステル、酸ハロゲン化物、無水物（分子間またはＮ−カルボキシ−無水物（ＮＣＡ）として分子内）として用いられる。

【0080】

別の態様において、式Ｉａに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のために、逆方向の合成のためのエステルとしてのアミノ酸中のＣＯＯＨ保護基として用いられる。

【0081】

本発明に従うＰＬＰＧは、さらに、保護された糖類が必要である当業者に既知のあらゆるプロセスにおいて用いることができる。用いられる糖類は、アルドヘキソースおよびアルドペントースのような化合物であることができる。好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは溶液中での炭水化物、糖タンパク質およびプロテオグリカン類の合成のために用いることができ、より好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは固体支持体上での炭水化物、糖タンパク質およびプロテオグリカン類の合成のために用いることができる。その合成は、現状技術において既知のあらゆる標準的な方法により実施することができる。より好ましくは、その合成はフォトリソグラフィー技法、例えば上記で説明したようなマイクロアレイ上の空間的に選択された特徴に可視光を当てるためにマイクロミラー装置を用いる技法により実施することができる。

【0082】

炭水化物マイクロアレイは、糖類−タンパク質相互作用の分析、タンパク質および細胞の高スループット分析、グリカン類およびそれらの分子相互作用の分析が含まれるがそれらに限定されない様々な目的のために用いることができる。

【0083】

別の態様において、式Ｉａに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づく炭水化物、糖タンパク質、プロテオグリカン類等の合成のために、エーテルとしてのＯＨ保護基として用いられる。

【0084】

別の態様において、式Ｉａに従う化合物は、エーテル、エステルまたはチオカーボネートとしての直交戦略のためのＳＨ保護基として用いられる。
別の態様において、式Ｉａに従う化合物は、生物学的に活性な構造をポリメラーゼ反応またはＡＴＰ依存性の生化学的変換の開始のために解放するための光活性化保護基として用いられる。

【0085】

本発明はさらに、マスクレスフォトリソグラフィーのために３７５ｎｍ〜４０５ｎｍの、好ましくは３９０の波長を有する光が用いられることを特徴とする、式Ｉａに従う化合物の使用に関する。

【0086】

本発明はさらに、フォトリソグラフィーに基づくオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成のために用いることができるジアリールスルフィド骨格を含有するＰＬＰＧを生成するための方法に関し、ここでその方法は以下の工程を含む：
ａ）出発物質としてｐ−ジエチルベンゼンを提供する。

【0087】

ｂ）分子臭素の作用によるフェニル環の１つの位置における臭素化、および蒸留による精製。
ｃ）得られた化合物の硝酸および硫酸中でのその臭素に対するパラ位におけるニトロ化、ならびにシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーおよび結晶化による単離および精製。

【0088】

ｄ）ＤＭＳＯおよびトリトンＢ中でのパラホルムアルデヒドの作用による、ベンジル位におけるその化合物のヒドロキシメチル化。
ｅ）ＤＭＦ中での適切なチオフェノール、チオナフトール等、炭酸カリウムおよび触媒量の銅（ＩＩ）塩の作用による、その芳香族臭素基のアリールスルフィドへの変換、ならびにシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製。

【0089】

ｆ）ＴＨＦおよびトリエチルアミン中でのトリホスゲン（ｔｒｉｐｈｏｓｇｅｎ）の作用による、前のアルコールのクロロカーボネートへの変換。
ｇ）そのクロロカーボネートの適切なヌクレオシドとの反応、そしてさらにそのヌクレオシドをホスファイト化剤と反応させて適切なホスホラミダイトにする、または
そのクロロカーボネートの適切なアミノ酸誘導体との反応。

【0090】

以下の実施例は本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。述べられた手順において本発明の精神から逸脱することなく修正を行うことができることは理解されている。

【0091】

さらなる態様は、以下の項目に含まれる：
１．次の式の化合物：

【0092】

【化14】

【0093】

ここでＡは−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−からなる群から選択され、そして
Ｒ１は未置換または置換されたアリールまたはヘテロアリール基であり、Ｒ３はＨ、メチル基またはエチル基であり、そして
ここでＲ２は

【0094】

【化15】

【0095】

であり、またはここでＲ２は

【0096】

【化16】

【0097】

であり、ここでＲ４はＨであり、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートもしくはホスフェートトリエステルを形成しており、そして
ここでＲ５はＨ、ＯＨ、ハロゲンもしくはＸＲ６であり、ここでＸはＯもしくはＳであり、Ｒ６はＨ、アルキル基、アリール基であり、もしくはＯＲ６はホスホラミダイト、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネートもしくはアセタールもしくはシリコン部分を形成しており、そして
ここでＢはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、ヒポキサンチン−９−イル、５−メチルシトシニル−１−イル、５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸−１−イルもしくは５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸アミド−３−イルからなる群から選択され、ここでＢがアデニン、シトシンもしくはグアニンである場合、その第１級アミノ基は場合により保護基を有し、もしくはＢがチミンもしくはウラシルである場合、Ｏ^４位において場合により保護基があり、または
ここでＲ２は

【0098】

【化17】

【0099】

であり、ここでＲ７は式Ｉａに対してウレタン結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体であり、もしくは
ここで式ＩＶは式Ｉａに対してエステル結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のカルボキシ官能基を表す。

【0100】

２．Ｒ１がフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基または２−ピリジル基であることを特徴とする、項目１に従う化合物。
３．Ａが−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であることを特徴とする、項目１または２に従う化合物。

【0101】

４．Ｒ３がＨまたはエチル基であることを特徴とする、項目１〜３に従う化合物。
５．Ｒ４がＨかつＲ５がＨであることを特徴とする、項目１〜４に従う化合物。
６．Ｂがアデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルからなる群から選択されることを特徴とする、項目１〜５に従う化合物。

【0102】

７．Ｂがアデニン、シトシンまたはグアニンである場合、その保護基はフェノキシアセチル−、４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェノキシアセチル−、４−イソプロピル−フェノキシアセチル−またはジメチルホルムアミジノ残基であり、Ｂがアデニンである場合、その保護基はベンゾイル−またはｐ−ニトロ−フェニル−エトキシ−カルボニル−（ＮＰＥＯＣ）残基であり、Ｂがグアニンである場合、その保護基はイソブチロイル−、ｐ−ニトロフェニルエチル（ｐ−ＮＰＥ）またはＮＰＥＯＣ残基であり、Ｂがシトシンである場合、その保護基はベンゾイル−、イソブチリル−、またはＮＰＥＯＣ残基であることを特徴とする、項目１〜６に従う化合物。

【0103】

８．Ｒ７が天然アミノ酸であることを特徴とする、項目１〜４に従う化合物。
９．マスクレスフォトリソグラフィーを用いる光活性化保護基としての、項目１〜８に従う化合物の使用。

【0104】

１０．マスクレスフォトリソグラフィーに基づくＤＮＡアレイ合成のための、３’−ＯＨ末端または５’−ＯＨ末端におけるヌクレオシド誘導体中の中間的または永久的ＯＨ保護基としての、項目７に従う化合物の使用。

【0105】

１１．マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のための、アミノ酸中のＮＨ保護基としての、項目８に従う化合物の使用。
１２．マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のための、アミノ酸中のＣＯＯＨ保護基としての、項目８に従う化合物の使用。

【0106】

１３．マスクレスフォトリソグラフィーに基づく炭水化物の合成のための、ＯＨ保護基としての、項目８に従う化合物の使用。
１４．直交保護基戦略のための、ＳＨ保護基としての、項目８に従う化合物の使用。

【0107】

１５．３７４〜４０５ｎｍの、好ましくは３９０ｎｍの波長を有する光がマスクレスフォトリソグラフィーのために用いられることを特徴とする、項目８〜１３に従う化合物の使用。

【0108】

１６．以下の工程：
ａ）出発物質としてのｐ−ジエチルベンゼンの提供
ｂ）フェニル環の臭素化
ｃ）得られた化合物の硝酸および硫酸中でのその臭素に対するパラ位におけるニトロ化
ｄ）精製および結晶化
ｅ）その化合物のベンジル位におけるヒドロキシメチル化
ｆ）チオフェノールを用いるその芳香族臭素基のアリールスルフィドへの変換
ｇ）精製
ｈ）アルコールのクロロカーボネートへの変換
ｉ）そのクロロカーボネートのヌクレオシドとの反応およびそのヌクレオシドのホスファイト化剤との反応、または
そのクロロカーボネートのアミノ酸誘導体との反応；
を含む、項目１〜８の１項に従うジアリールスルフィド骨格を含有する光解離性保護基を調製するための方法。

【0109】

１７．Ｒ１がフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基または２−ピリジル基であることを特徴とする、項目１６に従う方法。
１８．Ａが−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であることを特徴とする、項目１６または１７に従う方法。

【0110】

１９．Ｒ３がＨまたはエチル基であることを特徴とする、項目１６〜１８に従う方法。
本開示はさらに、フォトリソグラフィーに基づくオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成のために用いることができる、次の構造を有するジアリールスルフィド発色団を含有するＰＬＰＧに関し：

【0111】

【化18】

【0112】

ここでＹはＳまたはＯであり、そして
Ａは−ＣＨ２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ２−ＣＨ（アルキル（Ａｌｋｙ）、アリール）−および−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ（アルキル、アリール）−からなる群から選択され、
Ｒ１は未置換または置換されたアリールもしくはヘテロアリール基または縮合したアリールもしくはヘテロアリール基であり、Ｒ３はＨ、メチル基またはエチル基であり、そして
ここでＲ２はＨであり、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートもしくはホスフェートトリエステルを形成しており、または
ここでＲ２は

【0113】

【化19】

【0114】

であり、またはここでＲ２は

【0115】

【化20】

【0116】

【0117】

【化21】

【0118】

であり、ここでＲ７は式Ｉｂに対してウレタン結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体であり、それにはα−もしくはβ−アミノ酸が含まれるがそれらに限定されず、
もしくはここで式ＩＶは式Ｉｂに対してエステル結合を形成している天然アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のカルボキシ官能基を表し、それにはα−もしくはβ−アミノ酸が含まれるが、それらに限定されない。

【0119】

別の態様において、Ｒ１がフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基、アミノフェニル基、Ｎ−アルキルアミノフェニル基、Ｎ−アシルアミノフェニル基、カルボキシフェニル基、フェニルカルボン酸エステル、アミドまたは２−もしくは４−ピリジル基であり、Ａが−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−であり、Ｒ２がホスホラミダイトまたは−Ｐ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ−ｉＰｒ_２）であり、Ｒ３がＨまたはエチル基であり、Ｒ４がＨかつＲ５がＨであり、Ｒ４がＨかつＲ５がＯＨまたはＯＳｉ（Ａｌｋｙｌ３）であることを特徴とする、式Ｉｂに従う化合物が用いられる。

【0120】

別の態様において、Ｂがアデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシンまたはウラシルからなる群から選択されることを特徴とする、式Ｉｂに従う化合物が用いられる。

【0121】

別の態様において、Ｂがアデニン、シトシンまたはグアニンである場合、その保護基はフェノキシアセチル−、４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェノキシアセチル−、４−イソプロピル−フェノキシアセチル−またはジメチルホルムアミジノ残基であり、Ｂがアデニンである場合、その保護基はベンゾイル残基であり、Ｂがグアニンである場合、その保護基はイソブチロイル残基であり、Ｂがシトシンである場合、その保護基はベンゾイル−−またはイソブチロイル残基であることを特徴とする、式Ｉｂに従う化合物が用いられる。

【0122】

別の態様において、Ｒ７が天然アミノ酸であることを特徴とする、式Ｉｂに従う化合物が用いられる。
本開示はさらに、式Ｉｂに従う化合物のマスクレスフォトリソグラフィーを用いる光活性化保護基としての使用に関する。本開示の１態様において、合成プロセスの間に曝露した領域中のヌクレオチドおよびアミノ酸をそれぞれ脱保護するために、マイクロミラー装置を用いてそのオリゴヌクレオチドおよびペプチドマイクロアレイの可視光への空間的選択的曝露を実施する。ヌクレオチドおよびアミノ酸それぞれの脱保護はそれぞれの次のヌクレオチドまたはアミノ酸のための次の連結部位の解放につながる。その特定の領域内の解放された連結部位に連結されるべき次のヌクレオチドまたはアミノ酸は、そのアレイ上に注がれる溶媒プラス活性化試薬中にそれを提供することにより簡単に付加される。この戦略を、望まれる長さおよび設計のオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドそれぞれが得られるまで繰り返す。この戦略を用いることにより、ｃｍ^２あたり少なくとも１００００個、好ましくは１０００００〜５０００００個の特徴の高度に密集したマイクロアレイを製造することが可能である。

【0123】

本開示に従うＰＬＰＧは３７５ｎｍから４２０ｎｍまでの範囲の、好ましくは３９０ｎｍから４０５ｎｍまでの範囲の可視光を用いることにより除去することができる。脱保護に関してより好ましいのは、３９０ｎｍおよび４０４ｎｍそれぞれの波長である。両方の波長は、おおよそ３６５ｎｍにおける近紫外範囲での脱保護を実施するのに必要な光源と比較してはるかに安上がりである光源を用いて生成することができる。好ましくは、３７５ｎｍから４２０ｎｍまでの範囲内の、好ましくは３９０ｎｍおよび４０４ｎｍの固体レーザーを、本開示に従うＰＬＰＧを除去するための光源として用いる。より好ましくは、３７５ｎｍから４２０ｎｍまでの範囲内の、好ましくは３９０ｎｍおよび４０４ｎｍの十分な放射を有するＬＥＤ（発光ダイオード）を、本開示に従うＰＬＰＧを除去するための光源として用いる。特にＬＥＤは、それらが例えばブルーレイプレーヤーにおける使用のために大量生産されているため、低費用な製品である。

【0124】

【0125】

【0126】

本開示に従うＰＬＰＧは、保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが必要である、当業者に既知のオリゴヌクレオチド合成のためのあらゆるプロセスにおいて用いることができる。好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧ−ヌクレオチドは溶液中でのオリゴヌクレオチドの合成のために用いることができ、より好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧ−ヌクレオチドは固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成のために用いることができる。その合成は、現状技術において既知のあらゆる標準的な方法により実施することができる。より好ましくは、その合成はフォトリソグラフィー技法、例えば上記で説明したようなマイクロアレイ上の空間的に選択された特徴に光を当てるためにマイクロミラー装置を用いるマスクレス技法を用いることにより実施することができる。

【0127】

【0128】

【0129】

【0130】

別の態様において、式Ｉｂに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくＤＮＡアレイ合成において、炭素エステル（ｃａｒｂｏｎｅｓｔｅｒ）として、３’−ＯＨ末端または５’−ＯＨ末端におけるヌクレオシド誘導体中の中間的または永久的ＯＨ保護基として用いられ、ここでその合成は３’−５’方向で、または５’−３’方向で実施することができる。

【0131】

【0132】

【0133】

【0134】

本開示に従うＰＬＰＧは、さらに、保護されたアミノ酸が必要である当業者に既知のあらゆるペプチド合成のためのプロセスにおいて用いることができる。用いられるアミノ酸は非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体および好ましくは天然アミノ酸であることができる。好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは溶液中でのオリゴペプチドの合成のために用いることができ、より好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは固体支持体上でのオリゴペプチドの合成のために用いることができる。その合成は、現状技術において既知のあらゆる標準的な方法により実施することができる。より好ましくは、その合成はフォトリソグラフィー技法、例えば上記で説明したようなマイクロアレイ上の空間的に選択された特徴に可視光を当てるためにマイクロミラー装置を用いる技法により実施することができる。

【0135】

【0136】

【0137】

【0138】

別の態様において、式Ｉｂに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のために、ウレタンとしてのアミノ酸中のＮＨ保護基として用いられる。そのＰＬＰＧは、ＮＨをブロッキングされた（ＮＨ−ｂｌｏｃｋｅｄ）遊離酸、活性化されたエステル、酸ハロゲン化物、無水物（分子間またはＮ−カルボキシ−無水物（ＮＣＡ）として分子内）として用いられる。

【0139】

別の態様において、式Ｉｂに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づくペプチドアレイ合成のために、逆方向の合成のためのエステルとしてのアミノ酸中のＣＯＯＨ保護基として用いられる。

【0140】

本開示に従うＰＬＰＧは、さらに、保護された糖類が必要である当業者に既知のあらゆるプロセスにおいて用いることができる。用いられる糖類は、アルドヘキソースおよびアルドペントースのような化合物であることができる。好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは溶液中での炭水化物、糖タンパク質およびプロテオグリカン類の合成のために用いることができ、より好ましくは、本明細書で記述されるようなＰＬＰＧは固体支持体上での炭水化物、糖タンパク質およびプロテオグリカン類の合成のために用いることができる。その合成は、現状技術において既知のあらゆる標準的な方法により実施することができる。より好ましくは、その合成はフォトリソグラフィー技法、例えば上記で説明したようなマイクロアレイ上の空間的に選択された特徴に可視光を当てるためにマイクロミラー装置を用いる技法により実施することができる。

【0141】

【0142】

別の態様において、式Ｉｂに従う化合物は、マスクレスフォトリソグラフィーに基づく炭水化物、糖タンパク質、プロテオグリカン類等の合成のために、エーテルとしてのＯＨ保護基として用いられる。

【0143】

別の態様において、式Ｉｂに従う化合物は、エーテル、エステルまたはチオカーボネートとしての直交戦略のためのＳＨ保護基として用いられる。
別の態様において、式Ｉｂに従う化合物は、生物学的に活性な構造をポリメラーゼ反応またはＡＴＰ依存性の生化学的変換の開始のために解放するための光活性化保護基として用いられる。

【0144】

本開示はさらに、マスクレスフォトリソグラフィーのために３７５ｎｍ〜４０５ｎｍの、好ましくは３９０の波長を有する光が用いられることを特徴とする、式Ｉｂに従う化合物の使用に関する。

【0145】

本開示はさらに、フォトリソグラフィーに基づくオリゴヌクレオチドおよびペプチド合成のために用いることができるジアリールスルフィド骨格を含有するＰＬＰＧを生成するための方法に関し、ここでその方法は以下の工程を含む：
ａ）出発物質としてｐ−ジエチルベンゼンを提供する。

【0146】

【0147】

【0148】

【実施例】

【0149】

実施例１：
３９０ｎｍおよび４０４ｎｍの波長における、溶媒に依存する５ＰｙＳ４ＥｔＮＰＰＯＣ−チミジンの半減期の評価
ＰＬＰＧの半減期を評価するため、５ＰｙＳ４ＥｔＮＰＰＯＣ−チミジンを図１および２において示した溶媒中でｃ＝０．３ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解させた。溶媒として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）およびイソプロパノールを用いた。イミダゾール、ヒドロキシルアミンまたは水を、その表において示したようにその溶媒に添加した。３９０ｎｍの照射波長の場合（図１）、光曝露をそれぞれ２、４、６秒間または２、４、６、８秒間または２、４、６、８、１２秒間実施して、スレオニンの脱保護を誘導した。４０４ｎｍの照射波長の場合（図２）、光曝露をそれぞれ１、２、３、４分間または１、２、３、５分間実施して、チミジンの脱保護を誘導した。続いて、保護されたチミジンの初期量の５０％を脱保護するために必要な期間を評価するために、その溶液をＨＰＬＣにより分析した。次いでその半減期を、その曝露時間の結果もたらされる期間から外挿した。図１および２から理解することができるように、３９０ｎｍの波長の場合、最も速い脱保護はＤＭＳＯ（２．１秒）、ＮＭＰ＋０．５％ヒドロキシルアミン（１．８秒）、ＭｅＣＮ＋１％Ｈ_２Ｏ（２．０秒）およびイソプロパノール＋１２％Ｈ_２Ｏ＋１％イミダゾール（２．２秒）で達成された。４０４ｎｍの波長の場合、最も速い脱保護はＤＭＳＯ＋１％イミダゾール（２．５分）、ＮＭＰ＋０．５％ヒドロキシルアミン（１．８分）、ＭｅＣＮ＋１％Ｈ_２Ｏ＋１％イミダゾール（２．６分）およびイソプロパノール＋１２％Ｈ_２Ｏ＋１％イミダゾール（３．８分）で達成された。３９０ｎｍ（数秒）および４０４ｎｍ（数分）の間の著しい時間の差に関して、前者の場合ランプの電力出力が１５Ｗであり、一方で後者の場合ランプの電力出力が０．０８Ｗであったことを考慮しなければならない。

【0150】

実施例２：
ＰＬＰＧの紫外吸収特性
一般的に用いられる波長における様々なＰＬＰＧに関する紫外吸収を図３において示す。本発明に従うＰＬＰＧを有するフェニルアラニンの適切な誘導体を、ＵＶグレードのメタノール中で１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。紫外スペクトルを走査光度計で記録し、所与の波長において吸収値を得た。モル吸光係数を分子量からランベルト・ベールの法則を用いて計算した。あらゆるＰＬＰＧの脱保護速度は、おおよそ三重項（ｔｒｉｐｌｅｔｔ）量子収率×モル吸光係数の積である。従って、ＰｈＳ−フェニルアラニンは３９０ｎｍの照射波長においてＢＴＡ−フェニルアラニンよりも１５倍効率的に脱保護され、ＮＰＰＯＣ−フェニルアラニンよりも約２５倍効率的に脱保護されると概算することができる。

【0151】

実施例３：
ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸を用いた、抗Ｖ５抗体の標的配列を含有するペプチドアレイの合成
標的エピトープ：（Ｈ）ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ−（ＯＨ）
アレイ上のペプチド特徴を、ＲｏｃｈｅＮｉｍｂｌｅｇｅｎマスクレスアレイ合成装置上で、図８における合成スキームに従って、次の光量（ｌｉｇｈｔｄｏｓｅ）で、変動する密度のパターンで合成した：
アレイ１：１９０ｍＷ／平方ｃｍ［３６５ｎｍ］で２．５秒間の照射
アレイ２：１９０ｍＷ／平方ｃｍ［３６５ｎｍ］で３．５秒間の照射
アレイ３：１９０ｍＷ／平方ｃｍ［３６５ｎｍ］で４．５秒間の照射
曝露はＮＭＰ／ヒドロキシルアミン（１％）中で行われた。このランプ強度でのＮＰＰＯＣアミノ酸に関する標準的な照射時間は５０秒であったであろう。そのアレイの全ての特徴は、同じＶ−５抗原配列を含有していた。カップリングは標準的な条件下（ペプチドグレードのＤＭＦ中の３０ｍＭアミノ酸、３０ｍＭ活性化剤（ＨＢＴＵおよびＨＯＢＴ）および６０ｍＭヒューニッヒ塩基）であり、順次Ｇｒｅｉｎｅｒ３Ｄ−アミノ官能基化スライドガラスとカップリングさせた。サイクル間ならびにカップリングおよび照射の間の洗浄は、ＮＭＰを用いた。そのアレイの最後の脱保護は、トリフルオロ酢酸、水、トリイソプロピルシラン９７．５：２：０．５中に１時間浸すことにより達成された。水で完全に洗浄した後、そのアレイを、製造業者が推奨する緩衝系中で１：１００００希釈（０．１μｇ／ｍＬ）したＳｉｇｍａから得た（Ｃｙ−３蛍光色素で標識された）抗Ｖ５抗体と共に、室温で一夜保温した。緩衝液での洗浄および乾燥の後、そのアレイを、ＲｏｃｈｅＮｉｍｂｌｅｇｅｎＭＳ２００蛍光走査装置において、適切なフィルター設定で、２μｍの分解能で走査した。画像をＮｉｍｂｌｅｓｃａｎおよびＧｅｎｅｐｉｘ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）ソフトウェアパッケージで分析した。

【0152】

その結果は、図８ｂにおいて示したように、その３通りの光量（ｄｏｓｅｓ）にわたって優秀なシグナル強度を示し、それは５００ｍＷ^＊ｓ未満での完全な光脱保護を示し、一方でＮＰＰＯＣ−アミノ酸は同じ結果を達成するのに約１０，０００ｍＷ^＊ｓを必要とするであろう。

【0153】

加えて、同じ実験を、ＲｏｃｈｅＮｉｍｂｌｅｇｅｎマスクレスアレイ合成装置上で、図８ａにおける合成スキームに従って、次の光量で実施した：
領域１〜３０：９０ｍＷ／平方ｃｍ［３９０ｎｍ］で１〜３０秒間の照射
保温、染色および洗浄は上記で言及した通りに行った。

【0154】

その結果は、図８ｃにおいて示したように、３９０ｎｍでの約２１秒間の照射において最大値を有する優秀なシグナル強度を示し、それは２，０００ｍＷ^＊ｓ未満での完全な光脱保護を示し、一方でＮＰＰＯＣ−アミノ酸は３９０ｎｍでは不十分に脱保護され、作製したペプチドに起因すると考えられるシグナルを与えない。

【0155】

実施例４：
ジスルフィド−ＰＬＰＧ−アミノ酸の合成
合成経路を下記で示すようにそれぞれの図において示す。

【0156】

フェニル−チオ−ＮＰＰＯＣ−アミノ酸の一般式

【0157】

【化22】

【0158】

ａ）２−（２−ニトロ−４−エチル−５−チオフェニル−フェニル）プロパノール（“ＰｈＳＮＰＰＯＨ”）
1,4-ジエチルベンゼン 1902.6 g 14.18 mol 1等量
臭素 2288 g 14.32 mol 1.01等量
鉄(粉末) 26 g
対応する合成経路を図４ａにおいて示す。数滴の臭素を１９０２．６ｇの１，４−ジエチルベンゼンおよび２６ｇの鉄粉の混合物に添加する。その混合物を周囲温度でＨＢｒの放出が開始するまで撹拌する。次いでその混合物を氷浴中で冷却し、さらに２２８８ｇの臭素を強い撹拌の下でおおよそ５時間の期間をかけて添加する。次いで氷浴を取り外し、その混合物を周囲温度で一夜撹拌する。その反応混合物を水、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で、そして再度水で洗浄する。その粗生成物をトルエンで希釈し、真空中で濃縮および蒸留する（おおよそ５ｍｂａｒ／８２〜８４℃）。

【0159】

２７４０ｇの２，５−ジエチル−ブロモベンゼン（無色の液体）が得られる（収率：理論値の９０％）
¹H-NMR (300MHz, DMSO):
7.37 ppm (d, 1H, Ar-H); 7.20 ppm (d, 1H, Ar-H); 7.12 ppm (dd, 1H, Ar-H); 2.65 ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃); 2.56 ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃), 1.20-1.15 ppm (m, 6H, 2x CH₃)。

【0160】

ｂ）２，５−ジエチル−４−ニトロ−ブロモベンゼン
2,5-ジエチル-ブロモベンゼン 426 g 2 mol
HNO₃(65%) 202 ml
濃H₂SO₄ 241 ml
対応する合成経路を図４ｂにおいて示す。氷冷下で２４１ｍＬの濃Ｈ_２ＳＯ_４を２０２ｍＬのＨＮＯ_３（６５％）にゆっくりと添加する。氷冷および強い撹拌の下で、この混合物を４２６ｇの２，５−ジエチル−ブロモベンゼンの中にゆっくりと滴下する(添加時間：２時間)。その反応混合物を周囲温度で一夜撹拌する。次いでその混合物を氷上に注ぎ、ジクロロメタンで希釈し、水で２回洗浄し、最後に飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で洗浄する。その有機相をトルエンで希釈し、真空中で濃縮し、速い濾過（シリカゲル、移動相イソヘキサン）により精製する。

【0161】

２１７ｇのわずかに黄色の油が得られる（収率：理論値の４２％）。
¹H-NMR (300MHz, DMSO):
7.74 ppm (s, 2H, Ar-H); 4.72 ppm (t, 1H, OH); 3.54-3.48 ppm (m, 2H, HO-CH₂), 3.26-3.14 ppm (m, 1H, HO-CH₂-CH); 2.74 ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃); 1.25-1.15 ppm (m, 6H, 2x CH₃)。

【0162】

ｃ）２−（２−ニトロ−４−エチル−５−ブロモフェニル）プロパン−１−オール（“ＢｒＥｔＮＰＰＯＨ”）
2,5-ジエチル-4-ニトロ-ブロモベンゼン 1000 g 3.87 mol 1等量
パラホルムアルデヒド 418.8 g 4.65 mol 1.2等量
トリトンB (メタノール中40%) 1090 ml
DMSO 5.2 l
酢酸 400 ml
対応する合成経路を図４ｃにおいて示す。１０００ｇの２，５−ジエチル−４−ニトロ−ブロモベンゼン、４１８．８ｇのパラホルムアルデヒド、１０９０ｍＬのトリトンＢ（メタノール中４０％）および５．２ＬのＤＭＳＯの混合物を、８０〜９０℃で２時間加熱する。加熱のスイッチを切り、その混合物をさらに４時間撹拌する。４００ｍＬの酢酸を添加する。その混合物を水でおおよそ１５Ｌの量まで希釈し、２Ｌのトルエンで２回抽出する。そのトルエン抽出物を１Ｌの水で２回洗浄し、次いで真空中で濃縮する。その粗生成物をクロマトグラフィー（シリカゲル、勾配：イソヘキサン〜イソヘキサン／ＥｔＯＡｃ３０％）により精製する。

【0163】

収量：５２１ｇの２−（２−ニトロ−４−エチル−５−ブロモフェニル）プロパン−１−オールが褐色の油として得られ（理論値の４６％）、加えてより低い純度のものが７７ｇ得られた。

【0164】

¹H-NMR (300MHz, DMSO):
7.74 ppm (s, 2H, Ar-H); 4.72 ppm (t, 1H, OH); 3.54-3.48 ppm (m, 2H, HO-CH₂), 3.26-3.14 ppm (m, 1H, HO-CH₂-CH); 2.74ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃); 1.25-1.15 ppm (m, 6H, 2x CH₃)。

【0165】

ｄ）２−（２−ニトロ−４−エチル−５−チオフェニルフェニル）プロパノール（ＰｈＳＮＰＰＯＨ）
BrEtNPPOH 450 g 1.56 mol 1等量
チオフェノール 172 g 156 mol 1等量
K₂CO₃ 324 g 2.34 mol 1.5等量
DMF 2 L
対応する合成経路を図４ｄにおいて示す。反応物およびＤＭＦの混合物を、１４０〜１６０℃で５時間撹拌した。１１０に冷却した後、溶媒を真空下での蒸留により除去した。残留物をおおよそ２．５Ｌの水で処理し、おおよそ１Ｌのジクロロメタンで抽出した。その有機相を希ＮａＯＨおよび水で洗浄し、次いで真空中で蒸発させて乾燥させ、さらに共沸性トルエン／エタノール混合物で蒸留し、シリカゲル上でのヘキサン類中５〜３０％酢酸エチル中でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。

【0166】

収量：３５２ｇの透明な黄色の油（７１％）。
ｅ）２−（２−ニトロ−４−エチル−５−チオフェニルフェニル）プロパノールクロロカーボネート（“ＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌ”）
PhSNPPOH 352 g 1.11 mol 1等量
トリエチルアミン 112.2 g 1.11 mol 1等量
トリホスゲン 219.4 g 2.22 mol ホスゲン 2等量
THF 約1.7 L
対応する合成経路を図４ｅにおいて示す。２１９．４ｇのトリホスゲンを１Ｌの乾燥ＴＨＦ中で３０分間の撹拌の下で溶解させた。氷冷下で、７００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の３５２ｇのＰｈＳＮＰＰＯＨおよび１１２．２ｇのＮＥｔ_３を３時間の期間をかけてゆっくりと添加した。一夜静置した後、氷浴を４０℃の水浴と取り替え、過剰なホスゲンおよび約１ＬのＴＨＦを真空中で除去した。その懸濁液を濾過し、残留物を少量のＴＨＦで洗浄し、濾液を真空中で蒸発させて乾燥させた。

【0167】

収量：４１０．３ｇの黄色の結晶（９７％）
その物質は精製しないでもさらなる使用に関して純粋である。
ｆ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−グリシン−ＯＨ
グリシン 5.81 g 0.0774 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 29.4 g 0.0774 mol 1等量
Na₂CO₃ 18.1 g 0.1703 mol 2.2等量
水 190 mL
THF 150 mL
対応する合成経路を図４ｆにおいて示す。５．８１ｇのグリシンおよび１８．１ｇのＮａ_２ＣＯ_３を１９０ｍＬの水および６０ｍＬのＴＨＦ中で溶解させる。その溶液を氷浴中で撹拌し、２９．４ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの９０ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させ、その溶液をｐＨ１１に調節する。その溶液をおおよそ５００ｍＬのヘキサン／酢酸エチル１：１で２回抽出し、ｐＨを希ＨＣｌで２．５に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜３％）を用いて精製する。

【0168】

収量：２１ｇの淡黄色の非晶質の泡状物質（６５％）。
ｇ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−プロリン−ＯＨ
プロリン 8.6 g 0.075 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 28.5 g 0.075 mol 1等量
Na₂CO₃ 17.5 g 0.165 mol 2.2等量
水 1000 ml
THF 1200 ml
対応する合成経路を図４ｇにおいて示す。８．６ｇのプロリンおよび１７．５ｇのＮａ_２ＣＯ_３を１０００ｍＬの水および１０００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させる。その溶液を氷浴中で撹拌し、２８．５ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの２００ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させ、その溶液をｐＨ１１に調節する。その溶液をおおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、ｐＨを希ＨＣｌで２．５に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜２％）を用いて精製する。

【0169】

収量：２１．７ｇの淡黄色の非晶質の泡状物質（６３％）。
ｈ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−イソロイシン−ＯＨ
イソロイシン 9.97 g 0.076 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 28.9 g 0.076 mol 1等量
Na₂CO₃ 26.8 g 0.25 mol 3.3等量
水 300 ml
THF 300 ml
対応する合成経路を図４ｈにおいて示す。９．９７ｇのイソロイシンおよび２６．８ｇのＮａ_２ＣＯ_３を３００ｍＬの水および２００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させる。その溶液を氷浴中で撹拌し、２８．９ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの９０ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させ、その溶液のｐＨを９．５に調節する。

【0170】

その溶液をおおよそ５００ｍＬのヘキサン／酢酸エチル１：１で２回抽出し、ｐＨを希ＨＣｌで３．２に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜２％）を用いて精製する。

【0171】

収量：１５ｇの淡黄色の油（４２％）。
ｉ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−アスパラギン酸−ＯＨ
アスパルテート 10.5 g 0.0789 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 30.0 g 0.0789 mol 1等量
Na₂CO₃ 23.0 g 0.22 mol 2.8等量
水 1000 ml
THF 1200 ml
対応する合成経路を図４ｉにおいて示す。１０．５ｇのアスパルテートおよび２３ｇのＮａ_２ＣＯ_３を１０００ｍＬの水および１０００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させる。その溶液を氷浴中で撹拌し、３０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの２００ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。その溶液をおおよそ５００ｍＬのヘキサン／酢酸エチル１：１で２回抽出し、ｐＨを希ＨＣｌで２に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜２％）を用いて精製する。

【0172】

収量：２８ｇの淡黄色の非晶質の泡状物質（７４％）。
ｊ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−アスパラギン−ＯＨ
アスパラギン 12.7 g 0.0848 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 32.2 g 0.0848 mol 1等量
Na₂CO₃ 19.8 g 0.1866 mol 2.2等量
水 1000 ml
THF 1200 ml
対応する合成経路を図４ｊにおいて示す。１２．７ｇのアスパラギンおよび１９．８ｇのＮａ_２ＣＯ_３を１０００ｍＬの水および１０００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させる。その溶液を氷浴中で撹拌し、３２．２ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの２００ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。その溶液をおおよそ５００ｍＬのエーテルで２回抽出し、ｐＨを希ＨＣｌで２に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、酢酸エチルからの結晶化により精製する。

【0173】

収量：２８ｇの淡黄色の結晶（７３％）。
ｋ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ロイシン−ＯＨ
ロイシン 12.1 g 0.092 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 35.0 g 0.092 mol 1等量
Na₂CO₃ 21.5 g 0.202 mol 2.2等量
水 250 ml
THF 250 ml
対応する合成経路を図４ｋにおいて示す。１２．１ｇのロイシンおよび２１．５ｇのＮａ_２ＣＯ_３を２５０ｍＬの水および２００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させる。その溶液を氷浴中で撹拌し、３５ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの５０ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。その溶液をおおよそ３００ｍＬのヘキサン／酢酸エチル１：１で２回抽出し、ｐＨを希ＨＣｌで３に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜３％）を用いて精製する。

【0174】

収量：４０ｇの黄色の油（９１％）。
ｌ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃ_６−スペーサー
6-アミノ-ヘキサン酸 3.45 g 0.0263 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 10.0 g 0.0263 mol 1等量
Na₂CO₃ 6.1 g 0.0579 mol 2.2等量
水 300 ml
THF 200 ml
対応する合成経路を図４ｌにおいて示す。３．４５ｇの６−アミノ−ヘキサン酸および６．１ｇのＮａ_２ＣＯ_３を、３００ｍＬの水および１２０ｍＬのＴＨＦ中で溶解させる。その溶液を氷浴中で撹拌し、１０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの８０ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。ｐＨを１０．５に調節した。その溶液をおおよそ３００ｍＬのエーテルで２回抽出し、ｐＨを希ＨＣｌで２．３に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜５％および酢酸０．５％）を用いて精製する。

【0175】

収量：１０．４ｇの淡黄色の油（８３％）。
ｍ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−リシン（Ｂｏｃ）−ＯＨ
Fmoc-リシン(Boc)-OH 37.0 g 0.079 mol 1等量
ピペリジン 33.6 g 0.395 mol 5等量
THF 1400 ml
Na₂CO₃ 18.4 g 0.174 mol 2.2等量
PhSNPPOC-Cl 30.0 g 0.079 mol 1等量
３７．０ｇのＦｍｏｃ−リシン（Ｂｏｃ）−ＯＨを４００ｍｌのＴＨＦ中で溶解させ、３３．６ｇのピペリジンで、機械式撹拌器のブレードによる撹拌の下で３時間処理する。その期間の後、ＴＬＣは完全なＦＭＯＣの除去を示した。水（おおよそ２Ｌ）を添加し、さらに３０分間撹拌した。沈殿を吸引により濾過した。その透明な濾液に１８．４ｇのＮａ_２ＣＯ_３を入れ、蒸発させて乾燥させた。繰り返し水を添加して蒸留することにより、全てのピペリジンが除去されるまで蒸発を継続した。その残留物をおおよそ１Ｌの水中で溶解させ、８００ｍＬのＴＨＦで処理した。その溶液を氷浴中で撹拌し、３０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの２００ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。ｐＨを希ＨＣｌで２に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜１％）を用いて精製する。

【0176】

収量：２８．３ｇの淡橙色の非晶質の泡状物質（６０％）。
ｎ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−セリン（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ
Fmoc-セリン(t-Bu)-OH 30.3 g 0.079 mol 1等量
ピペリジン 33.6 g 0.395 mol 5等量
THF 1600 ml
Na₂CO₃ 18.4 g 0.174 mol 2.2等量
PhSNPPOC-Cl 30.0 g 0.079 mol 1等量
３０．３ｇのＦｍｏｃ−セリン（Ｂｏｃ）−ＯＨを６００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させ、３３．６ｇのピペリジンで、機械式撹拌器のブレードによる撹拌の下で３時間処理する。その期間の後、ＴＬＣは完全なＦＭＯＣの除去を示した。水（おおよそ２Ｌ）を添加し、さらに６０分間撹拌した。沈殿を吸引により濾過した。その透明な濾液に１８．４ｇのＮａ_２ＣＯ_３を入れ、蒸発させて乾燥させた。繰り返し水を添加して蒸留することにより、全てのピペリジンが除去されるまで蒸発を継続した。その残留物をおおよそ６００ｍＬの水中で溶解させ、濾過し、８００ｍＬのＴＨＦで処理した。その溶液を氷浴中で撹拌し、３０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの２００ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。ｐＨを希ＨＣｌで２に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜１％）を用いて精製する。

【0177】

収量：３０．９ｇの淡黄色の非晶質の泡状物質（７７％）。
ｏ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−スレオニン（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ
Fmoc-Thr(t-Bu)-OH 31.4 g 0.079 mol 1等量
ピペリジン 33.6 g 0.395 mol 5等量
THF 1300 ml
Na₂CO₃ 18.4 g 0.174 mol 2.2等量
PhSNPPOC-Cl 30.0 g 0.079 mol 1等量
３１．４ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨを６００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させ、３３．６ｇのピペリジンで、機械式撹拌器のブレードによる撹拌の下で４時間処理する。その期間の後、ＴＬＣは完全なＦＭＯＣの除去を示した。水（おおよそ３Ｌ）を添加し、さらに３０分間撹拌した。沈殿を吸引により濾過した。その透明な濾液に１８．４ｇのＮａ_２ＣＯ_３を入れ、蒸発させて乾燥させた。繰り返し水を添加して蒸留することにより、全てのピペリジンが除去されるまで蒸発を継続した。その残留物をおおよそ６００ｍＬの水中で溶解させ、濾過し、８００ｍＬのＴＨＦで処理した。その溶液を氷浴中で撹拌し、３０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの１００ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。ｐＨを希ＨＣｌで２に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中メタノール（０〜１％）を用いて精製する。

【0178】

収量：３０．９ｇの淡黄色の非晶質の泡状物質（６９％）。
ｐ）ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ヒスチジン（Ｔｒｔ）−ＯＨ
工程１：
Fmoc-His(Trt)-OH 100 g 0.161 mol 1等量
ピペリジン 140 g 1.614 mol 10等量
THF 2000 ml
１００ｇのＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを２０００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させ、１４０ｇのピペリジンで、機械式撹拌器のブレードによる撹拌の下で２時間処理する。その期間の後、ＴＬＣは完全なＦＭＯＣの除去を示した。

【0179】

水（おおよそ４Ｌ）を添加し、さらに３０分間撹拌した。沈殿を吸引により濾過した。その透明な濾液を濃縮して全てのＴＨＦを除去した。ｐＨを希ＨＣｌで２．５に調節し、その混合物を一夜撹拌した。

【0180】

濾過すると５３ｇの無色の結晶が得られ（８３％）、それを空気中で一夜乾燥させた。
工程２：
H-His(Trt)-OH 20.9 g 0.0526 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 20.0 g 0.0526 mol 1等量
Na₂CO₃ 12.3 g 0.116 mol 2.2等量
THF 800 ml
上記からの結晶２０ｇおよび１２．３ｇのＮａ_２ＣＯ_３を、おおよそ８００ｍＬの水および７００ｍＬのＴＨＦ中で溶解させた。その溶液を氷浴中で撹拌し、２０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの１００ｍＬのＴＨＦ中における溶液で１滴ずつ処理する。撹拌を２０分間継続する。ＴＨＦを蒸発させた。ｐＨを希ＨＣｌで１．５に調節し、おおよそ５００ｍＬの酢酸エチルで抽出する。有機相をおおよそ５００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ジクロロメタンおよび酢酸（０．０１％）中０〜１％メタノールを用いて精製する。

【0181】

収量：１０ｇの淡い非晶質の泡状物質（２６％）。
実施例５：
ジスルフィド−ＰＬＰＧ−ヌクレオチドの合成
５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＢ−３’−ＰＡ’ｓ
ａ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＴ
チミジン 19.1 g 0.0789 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 30.0 g 0.0789 mol 1等量
ピリジン 300 ml
ジクロロメタン 50 ml
１９．１ｇのチミジンの３００ｍＬの乾燥ピリジン中における溶液を、氷浴中で撹拌する。１滴ずつ、３０．０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの５０ｍＬのジクロロメタン中における溶液を添加する。１０分間撹拌を継続した後、その溶液を８００ｍＬの水で２回洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その残留物をトルエン／エタノールの混合物と同時蒸発させる。精製はシリカゲル上でのジクロロメタン中メタノール（０〜２．５％）中でのカラムクロマトグラフィーにより成し遂げられた。

【0182】

収量：２８ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（６０％）。
ｂ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＴ−３’−ＰＡ
5’-PhSNPPOC-dT 27.1 g 0.0463 mol 1等量
DCI 2.7 g 0.0232 mol 0.5等量
P-試薬 13.5 g 0.0449 mol 0.97等量
ジクロロメタン 300 ml
強く乾燥させた防湿下での反応物の混合物を、室温で一夜撹拌した。ヘキサンをわずかに濁りが残るまで添加した。１０分間撹拌した後、沈殿を吸引により濾過し、粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中６５％から８０％酢酸エチルまでの勾配を用いて精製する。

【0183】

収量：２９．７ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（８１％）
P-NMR: 144,4 (m) ppm , 純度９４％。
ｃ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＣ^Ａｃ
dC^Ac 28.3 g 0.105 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 40 g 0.105 mol 1等量
ピリジン 650 ml
ジクロロメタン 100 ml
２８．３ｇのＮ−（アセチル）−２’−デオキシ−シチジンの溶液を２００ｍＬのピリジンと共に２回同時蒸発させ、２５０ｍＬの乾燥ピリジン中で溶解させ、氷浴中で撹拌した。１滴ずつ、４０．０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの１００ｍＬのジクロロメタン中における溶液を添加する。１０分間撹拌を継続した後、その溶液を８００ｍＬの水で２回洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その残留物をトルエン／エタノールの混合物と同時蒸発させる。精製はシリカゲル上でのジクロロメタン中メタノール（０〜２．５％）中でのカラムクロマトグラフィーにより成し遂げられた。

【0184】

収量：３１ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（４８％）。
ｄ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＣ^Ａｃ−３’−ＰＡ
5’-PhSNPPOC-dC^Ac 29.0 g 0.0473 mol 1等量
DCI 2.8 g 0.0237 mol 0.5等量
P-試薬 13.8 g 0.0459 mol 0.97等量
ジクロロメタン 300 ml
強く乾燥させた防湿下での反応物の混合物を、室温で一夜撹拌した。ヘキサンをわずかに濁りが残るまで添加した。その粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中６５％から８０％酢酸エチルまでの勾配を用いて精製する。

【0185】

収量：２１．５ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（５６％）
P-NMR: 144,6 (m) ppm , 純度９９％。
ｅ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＡ^ｔａｃ
dA^tac 46.3 g 0.105 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 40 g 0.105 mol 1等量
ピリジン 650 ml
ジクロロメタン 100 ml
４６．３ｇのＮ−（ｔｅｒｔ−ブチル−フェノキシアセチル）−２’−デオキシ−アデノシンの溶液を２００ｍＬのピリジンと共に２回同時蒸発させ、２５０ｍＬの乾燥ピリジン中で溶解させ、氷浴中で撹拌した。１滴ずつ、４０．０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの１００ｍＬのジクロロメタン中における溶液を添加する。１０分間撹拌を継続した後、その溶液を８００ｍＬの炭酸水素ナトリウム溶液および水で２回洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その残留物をトルエン／エタノールの混合物と同時蒸発させる。精製はシリカゲル上でのジクロロメタン中メタノール（０〜１．５％）中でのカラムクロマトグラフィーにより成し遂げられた。

【0186】

収量：３５ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（４２％）。
ｆ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＡ^ｔａｃ−３’−ＰＡ
5’-PhSNPPOC-dA^tac 32.3 g 0.0412 mol 1等量
DCI 2.4 g 0.0206 mol 0.5等量
P-試薬 12.0 g 0.0399 mol 0.97等量
ジクロロメタン 300 ml
強く乾燥させた防湿下での反応物の混合物を、室温で一夜撹拌した。ヘキサンをわずかに濁りが残るまで添加した。１０分間撹拌した後、その沈殿を吸引により濾過し、その粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中５０％から６５％酢酸エチルまでの勾配を用いて精製する。

【0187】

収量：３２ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（７９％）
P-NMR: 144,3 (m) ppm , 純度９９％。
ｇ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＧ^ｔａｃ
dG^tac 48.2 g 0.105 mol 1等量
PhSNPPOC-Cl 40 g 0.105 mol 1等量
ピリジン 800 ml
ジクロロメタン 60 ml
４８．２ｇのＮ−（ｔｅｒｔ−ブチル−フェノキシアセチル）−２’−デオキシ−グアノシンの溶液を２００ｍＬのピリジンと共に２回同時蒸発させ、４００ｍＬの乾燥ピリジン中で溶解させ、氷浴中で撹拌した。１滴ずつ、４０．０ｇのＰｈＳＮＰＰＯＣ−Ｃｌの６００ｍＬのジクロロメタン中における溶液を添加する。１０分間撹拌を継続した後、その溶液を８００ｍＬの水で２回洗浄し、蒸発させて乾燥させる。その残留物をトルエン／エタノールの混合物と同時蒸発させる。精製はシリカゲル上でのジクロロメタン中メタノール（０〜５％）中でのカラムクロマトグラフィーにより成し遂げられた。

【0188】

収量：３５ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（４２％）。
ｈ）５’−ＰｈＳＮＰＰＯＣ−ｄＧ^ｔａｃ−３’−ＰＡ
5’-PhSNPPOC-dG^tac 34.0 g 0.0425 mol 1等量
DCI 2.5 g 0.0212 mol 0.5等量
P-試薬 12.4 g 0.0412 mol 0.97等量
ジクロロメタン 500 mL
強く乾燥させた防湿下での反応物の混合物を、室温で一夜撹拌した。ヘキサンをわずかに濁りが残るまで添加した。その粗生成物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中５０％から６５％酢酸エチルまでの勾配を用いて精製する。

【0189】

収量：２４．５ｇの淡い黄色がかった非晶質の泡状物質（５８％）
P-NMR: 144,5 (m) ppm , 純度９８％。
実施例６：
本発明に従うさらなるジアリールスルフィドＰＬＰＧの合成
ａ）５−（ｔ−ブチルフェニル−チオ）−４−エチル−２−ニトロフェニル−２’−プロパン−１’−オール（ｔ−ブチルチオ−ＮＰＰＯＨ）
4-t-Bu-チオフェノール 25.0 g 0.150 mol 1.1等量
BrEt-NPPOH 39.0 g 0.135 mol 1等量
K₂CO₃ 31.1 g 0.225 mol 1.7等量
DMF 200 mL
反応物の混合物を１００℃で３時間撹拌した。ＤＭＦを真空中で蒸留して除いた。その残留物をジクロロメタン中で溶解させ、水で２回洗浄し、真空中で蒸発させて乾燥させた。得られた残留物をヘキサン類中で懸濁し、一夜撹拌し、吸引により濾別した。その結晶を乾燥させた。

【0190】

収量：４３ｇの淡黄色粉末（８５％）
¹H-NMR (300MHz, DMSO):
7.72ppm (s, 1H, ニトロ-Ar-H); 7.50ppm (m, 2H, Ar-H t-Bu-Ph); 7.38ppm (m, 2H, Ar-H t-Bu-Ph); 6.88ppm (s, 1H, ニトロ-Ar-H); 4.67ppm (s, 1H, OH); 3.25- 3.21ppm (m, 3H, Ar-CH(Me)-CH₂-OH); 2.73ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃); 1.29ppm (s, 9H, CH₃t-Bu); 1.20ppm (t, 3H, Ar-CH₂-CH₃; 0.95ppm (d, 3H, Ar-CH(CH₃)-CH₂-OH)。

【0191】

ｂ）ナフチル−チオ−ＮＰＰＯＨ
BrEt-NPPOH 20.6 g 0.0715 mol 1等量
2-チオナフトール(2-Thionaphtol) 11.5 g 0.0715 mol 1等量
炭酸カリウム 14.8 g 0.107 mol 1.5等量
DMF 100 mL
反応物の混合物を１．５時間還流し、室温でさらに一夜撹拌した。その残留物を１．５Ｌの水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。その有機性抽出物を水で２回洗浄し、真空中で蒸発させて乾燥させ、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中酢酸エチル（０〜３０％）を用いて精製した。

【0192】

収量：９．０ｇの黄色の油（３４％）
¹H-NMR (300MHz, DMSO):
8.07ppm (m, 1H, ナフチル-H), 8.00 - 7.90ppm (m, 3H, ナフチル-H); 7.77ppm (s, 1H, ニトロ芳香族-H); 7.61-7.54ppm (m, 2H, ナフチル-H); 7.47-7.41ppm (m, 1H, ナフチル-H); 7.11ppm (s, 1H, ニトロ芳香族-H); 4.65ppm (t, 1H, OH); 3.30-3.15ppm (m, 3H, Ar-CH(CH₃)-CH₂-OH); 2.77ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃); 1.21ppm (t, 3H, Ar-CH₂-CH₃); 0.92ppm (d, Ar-CH(CH₃)-CH₂-OH)。

【0193】

ｃ）ニトロベンズイミダゾール−Ｓ−ＮＰＰＯＨ
BrEt-NPPOH 6.0 g 0.0208 mol 1等量
2-メルカプト-5-ニトロ-ベンズイミダゾール 4.06 g 0.0208 mol 1等量
炭酸カリウム 4.3 g 0.0312 mol 1.5等量
DMF 50 mL
反応物の混合物を３時間還流し、室温でさらに一夜撹拌した。その残留物を０．５Ｌの水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。その有機性抽出物を水で２回洗浄し、真空中で蒸発させて乾燥させ、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中酢酸エチル（０〜３０％）を用いて精製した。

【0194】

収量：５．８ｇの黄色の油（６９％）
¹H-NMR (300MHz, DMSO):
13.35ppm (s, 1H, NH); 8.35ppm (dd, 1H, ニトロベンズイミダゾール-H); 7.95ppm (s, 1H, ニトロ芳香族-H); 7,75ppm (s, 1H, ニトロ芳香族-H); 7.63ppm (1H, d, ニトロベンズイミダゾール-H); 4.71ppm (s, 1H, OH); 3.47ppm (d, 2H, HO-CH₂); 3.19ppm (m, 1H, Ar-CH(CH₃)-CH₂-OH); 2.79ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃), 1.21-1.15ppm (m, 6H, 2 x CH₃)。

【0195】

ｄ）ピリジル−Ｓ−ＮＰＰＯＨ
BrEt-NPPOH 133.5 g 0.463 mol 1等量
2-メルカプトピリジン 51.5 g 0.463 mol 1等量
炭酸カリウム 96.0 g 0.695 mol 1.5等量
DMF 600 mL
反応物の混合物を１４０℃で４時間撹拌した。ＤＭＦを真空中で蒸留して除いた。その残留物をジクロロメタン中で溶解させ、水で２回洗浄し、真空中で蒸発させると油になった。その残留物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中酢酸エチル（０〜３０％）を用いて精製した。

【0196】

収量：８７．９ｇの透明な黄色の油（６０％）
¹H-NMR (300MHz, DMSO):
8.43ppm (m,1H, Py-H); 7.82ppm (s, 1H, ニトロ芳香族-); 7.70ppm (m, 1H, Py-H); 7.65ppm (s, 1H, Py-H), 7.21ppm (m, 1H, Py-H); 4.75ppm (t, 1H, OH); 3.47ppm (t, 2H, HO-CH₂); 3.20ppm (m, 1H, HO-CH₂-CHCH₃); 2.72ppm (q, 1H, CH₂-ベンジル); 1.15 (m, 6H, 2 x CH₃)。

【0197】

ｅ）２，５−ジエチル−４−フェノキシ−ニトロベンゼン
フェノール 8.0 g 0.085 mol 1.1等量
NaH (パラフィン(Parafine)中60%) 3.4 g 0.085 mol 1.1等量
4-ブロモ-2,5-ジエチル-ニトロベンゼン(nitrobenze) 20.0 g 0.078 mol 1等量
DMF 60 ml
強い撹拌の下で、３．４ｇのＮａＨ（パラフィン（ｐａｒａｆｉｎｅ）中６０％）を、８．０ｇのフェノールの６０ｍｌのＤＭＦ中における溶液に注意深く添加した。ガスの放出が終わった時に、２０．０ｇの４−ブロモ−２，５−ジエチル−ニトロベンゼン（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅ）をその混合物に添加した。その反応混合物を１７０℃で１．５時間撹拌した。次いでその反応混合物を周囲温度まで冷却し、６００ｍｌの水の中に注いだ。結果として得られたエマルジョンをヘキサンで抽出した。ヘキサンを蒸留して除き（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｏｆ）、その蒸留残留物を真空中で一夜乾燥させた。その蒸留残留物をヘキサン中で溶解させ、カラムクロマトグラフィー（シリカ／ヘキサン）により精製した。

【0198】

収量：２．２ｇのわずかに色のついた油
¹H-NMR (DMSO):
7.96ppm (s, 1H, Ar-H); 7.48 - 7.40ppm (m, 2H, Ph-H); 7.25-7.18ppm (m, 1H, Ph-H); 7.09-7.03ppm (m, 2H, Ph-H); 6.78ppm (s, 1H, Ar-H); 2.72ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃); 2.68ppm (q, 2H, Ar-CH₂-CH₃); 1.18ppm (t, 3H, Ar-CH₂-CH₃); 1.07ppm (t, 3H, Ar-CH₂-CH₃)。

【0199】

実施例７：
Ｒ３＝Ｈ［式Ｉ］であるジアリールスルフィド−ＰＬＰＧの代替合成
ａ）３−アセトアミド−エチルベンゾール（３−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｌ）
3-エチル-アニリン 550 g 4.54 mol
無水酢酸(Acetanhydride) 1100 mL
おおよそ４時間以内に、５５０ｇの３−エチル−アニリンを無水酢酸（ａｃｅｔａｎｈｙｄｒｉｄｅ）に添加した。その混合物を室温で一夜撹拌した（ＤＣ−対照ヘキサン／ＥｔＯＡｃ１：１）。その反応混合物を真空中で蒸発させて乾燥させた。その蒸留残留物を、高真空中で蒸留した（温度：２１０℃、ヘッド温度（Ｈｅａｄ−Ｔｅｍｐ．）：１４５℃）。

【0200】

収量：７１０ｇの黄色の油（９６％）。
ｂ）３−アセトアミド−６−ニトロ−エチルベンゾール
3-アセトアミド-エチルベンゾール 237.0 g 1.452 mol
濃H₂SO₄ 622 mL
濃HNO₃ 91.0 g
２３７．０ｇの３−アセトアミド−エチルベンゾールを６２２ｍＬの濃Ｈ_２ＳＯ_４に滴加し、ここでその混合物の温度は２０℃を超えなかった。その混合物を−３０℃に冷却した。続いて、９１．０ｇの濃ＨＮＯ_３を滴加し、ここでその混合物の内部温度は−２０℃を超えなかった。その混合物を−１０℃に戻し、１８００ｇの氷の中に注いだ。その水相を分離し、２×２００ｍＬのエーテルで抽出した。３−アセトアミド−６−ニトロ−エチルベンゾールの沈殿をそのエーテル抽出物と組み合わせ、その中で溶解させた。そのエーテル溶液を１００ｍＬの水で洗浄し、蒸発させた。

【0201】

ｃ）３−エチル−４−ニトロ−アニリニウムブロミド
3-アセトアミド-6-ニトロ-エチルベンゾール(粗生成物) おおよそ1.45 mol
臭化水素酸(48%) 400 mL
その粗生成物を４００ｍＬの臭化水素酸（４８％）中で懸濁し、０．５時間加熱して沸騰させた（３−エチル−４−ニトロ−アニリニウムブロミドが結晶し始め、それは反応体積の著しい増大を伴う）。その混合物を撹拌下で室温まで冷却し、続いて氷上で５℃に冷却した。その懸濁液を吸引により除去し、２００ｍＬの冷えた臭化水素酸（４８％）中で再懸濁し、再度濾過し、続いてヌッチェ（ｎｕｔｓｃｈ）フィルター上でおおよそ５０ｍＬの冷えた臭化水素酸（４８％）を用いて洗浄した。

【0202】

収量：４５０ｇの湿った生成物。
ｄ）３−ブロモ−６−ニトロ−エチルベンゾール
3-エチル-4-ニトロ-アニリニウムブロミド約450 g 約1.45 mol
(粗生成物、湿っていた)
臭化水素酸(48%) 250 mL
水 400 mL
NaNO₂ 107.6 g
水 550 mL
前のアプローチの湿った生成物を、２５０ｍＬの臭化水素酸（４８％）の４００ｍＬの水中における溶液中で懸濁した。１０７．６ｇのＮａＮＯ_２の溶液を５５０ｍＬの水に氷上で滴加し、ここでその混合物の温度は１２℃を超えなかった。その混合物を０℃で３０分間撹拌し、濾過した。

【0203】

ザンドマイヤー（Ｓａｎｄｍａｙｅｒ）変換：
ジアゾニウム塩溶液約1.45 mol
銅粉末 84.9 g
CuSO₄x 5H₂O 212.3 g
臭化水素酸(48%) 670 mL
そのジアゾニウム塩溶液を、８４．９ｇの銅粉末、２１２．３ｇのＣｕＳＯ_４ｘ５Ｈ_２Ｏおよび６７０ｍＬの臭化水素酸（４８％）の混合物に氷上で滴加し、ここでその混合物の温度は１５℃を超えなかった。その混合物を室温で一夜撹拌し、濾過し、有機相を分離した。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を合わせてシリカゲルの薄層の使用の下で濾過し、次いで真空中で蒸発させて乾燥させた。１６７．８ｇの粗生成物が得られた。その蒸留残留物を高真空中で蒸留した（温度：１５５℃、ヘッド温度（Ｈｅａｄ−Ｔｅｍｐ．）：８５℃）。収量：１４４．３ｇ、黄色の油（４工程を経て４３％）。

【0204】

ｅ）２−（２−ニトロ−５−ブロモ−フェニル）プロパノール（２−（２−Ｎｉｔｒｏ−５−ｂｒｏｍ−ｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｌ）
3-ブロモ-6-ニトロ-エチルベンゾール 309.6 g 1.346 mol 1等量
パラホルムアルデヒド 42.4 g 1.413 mol 1.05等量
カリウム-tert-ブチレート 37.8 g 0.337 mol 0.25等量
DMSO 900 mL
309.6gの3-ブロモ-6-ニトロ-エチルベンゾールおよび42.4gのパラホルムアルデヒドの300mLのDMSO中における溶液に、37.8gのカリウム-tert-ブチレートを少しずつ添加し、ここでその温度は４０〜５０℃まで上昇した。その混合物を室温で一夜撹拌した。９００ｍＬのトルオールをその混合物に添加し、３×４５０ｍＬの水性ＮａＯＨ（１０％）で、続いて４５０ｍＬの水で洗浄した。その有機相を真空中で蒸発させて乾燥させた。３１９ｇの粗生成物が得られ、次いでそれをクロマトグラフィーを用いて精製した：
カラム：７００ｇシリカゲル、直径８．５ｃｍ、ｎ−ヘキサンで平衡化した。その粗生成物を１００ｍＬのトルオール中で溶解させ、カラム上に装填した（ｌｏａｄｅｄ）。以下の勾配を用いて溶離を実施した：２．５Ｌｎ−ヘキサン、
酢酸エチル／ｎ−ヘキサン１：１００１Ｌ
１：５０１．５Ｌ
１：２０１Ｌ
１：６２Ｌ
１：５１．５Ｌ
収量：２３６．０６ｇの２−（２−ニトロ−５−ブロモ−フェニル）プロパノール（６７％）。

【0205】

ｆ）エチル基を有しないＰｈＳＮＰＰＯＨ
Br-NPPOH 5.0 g 0.0192 mol 1等量
Ph-SH 2.3 g 0.0211 mol 1.1等量
K₂CO₃ 4.5 g 0.0326 mol 1.7等量
DMF 50 mL
上記で列挙した構成要素の混合物を、１２０℃で３時間、次いで７０℃で一夜混合した。その反応混合物を真空中で蒸発させて乾燥させた。ジクロロメタンをその蒸留残留物に添加し、水で、希釈した水酸化ナトリウムで、そして再度水で洗浄した。有機相を蒸発させ、クロマトグラフィーを用いて精製した（固定相：イソヘキサンで平衡化したシリカゲル；勾配：イソヘキサン／５％酢酸エチル〜イソヘキサン／２０％酢酸エチル）。

【0206】

収量：２．７ｇの赤褐色の油（４８％）。

【図1】